JP2004075666A - Therapeutic agent of hematopoietic organ tumor, immunosuppressant and molecule-targeting therapeutic agent taking p53 as target molecule - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new therapeutic agent of hematopoietic organ tumor having less adverse effect and an immunosuppressant. <P>SOLUTION: This therapeutic agent of the hematopoietic organ tumor containing a compound capable of activating caspase, or its pharmacologically permissible salts and the immunosuppressant are provided. The molecular-targeting therapeutic agent taking p53 as a target and containing at least one compound selected from a group consisting of capsaicin, caffein, catechin and their derivatives, or its pharmacologically permissible salt is obtained. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

カプサイシンおよびその誘導体としては、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。
【００２０】
【化２】

（式中、Ｒ^１は炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ^２は炭素数１〜１２の炭化水素基である。）
【００２１】
Ｒ^１は、炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基である。炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基としては、Ｃ_６−１１直鎖状または分枝状アルキル、Ｃ_６−１１直鎖状または分枝状アルケニル（例えば、−（ＣＨ_２）_ｎＣＨ＝ＣＨＣＨ（ＣＨ_３）_２（ｎは１〜６の整数）で表される基）を挙げることができる。好ましくは、Ｒ^１は−（ＣＨ_２）_ｎＣＨ＝ＣＨＣＨ（ＣＨ_３）_２（ｎは１〜６の整数）で表される基、アルキル基である。
【００２２】
Ｒ^２は炭素数１〜１２の炭化水素基（例えば、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数６〜１２のシクロアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数２〜１２のアルキニル基、炭素数３〜１２のシクロアルケニル基、炭素数６〜１２のアリール基、炭素数７〜１２のアラルキル基）であり、好ましくは、Ｒ^２は炭素数１〜１２のアルキル基（具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等の低級アルキル基）である。
【００２３】
カプサイシンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、リシン塩、アルギニン塩などを例示することができる。
【００２４】
カプサイシンおよびその誘導体は、下記の文献に記載の方法に従って、製造することができる。Ｓｐａｔｈ，　Ｄａｒｌｉｎｇ，　Ｂｅｒ．　６３，　７３７　（１９３０）；　Ｌ．　Ｃｒｏｍｏｂｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１９５５，　１０２５；　Ｏ．Ｐ．　Ｖｉｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　１７Ｂ，　５５８　（１９７９）
【００２５】
また、カプサイシンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００２６】
カプサイシンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
１’−アセトキシチャビコールアセテートの構造式を以下に示す。
【００２８】
【化３】

【００２９】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＩ）で表される化合物を例示することができる。
【００３０】
【化４】

（式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、低級アルキル基または芳香族環基である。）
【００３１】
Ｒ^１１は、低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等のＣ_１−４のアルキル基など）または芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等のＣ_６−１４芳香族炭化水素残基、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル等の芳香族複素環残基など）である。好ましくは、Ｒ^１１は低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ^１１はメチル基である。
【００３２】
Ｒ^１２は低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等のＣ_１−４のアルキル基など）または芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等のＣ_６−１４芳香族炭化水素残基、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル等の芳香族複素環残基など）である。好ましくは、Ｒ^１２は低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ^１２はメチル基である。
【００３３】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００３４】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、下記の文献に記載の方法に従って、製造することができる。
・Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５７（８），　１３４４−１３４５，　１９９３
・特開２００２−７８４６４
【００３５】
また、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００３６】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
カフェインの構造式を以下に示す。
【００３８】
【化５】

【００３９】
カフェインおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＸＩ）で表されるキサンチン誘導体を例示することができる。
【００４０】
【化６】

（式中、Ｒ^２１は、メチル基または水素原子であり、Ｒ^２２は水素原子または１〜２個のヒドロキシ基もしくは炭素数２〜１０のアルカノイル基が置換してもよい炭素数１〜１２のアルキル基である。）
【００４１】
一般式（ＸＸＩ）で表されるキサンチン誘導体としては、カフェインの他、キサンチン、アミノフィリン、テイフィリン、コリンテオフィリン、テオボブロミン、オクストリフィン、ジプロフィン、プロキシフィリンなどを例示することができる。これらの化合物は市販されており、入手可能である。
【００４２】
カフェインおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００４３】
カフェインおよびその誘導体は市販されており、入手可能である。
【００４４】
また、カフェインおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００４５】
カフェインおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるその塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００４６】
カテキンおよびその誘導体は、一般に、樹木に広く含まれる水溶性の天然多価フェノールを意味するが、本明細書においては、それらの天然多価フェノールのみならず、それらから誘導される化合物も包含する。
。具体的には、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、エピカテキンジガレート及びエピガロカテキンジガレートなどを例示することができ、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンガレート、（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピカテキンジガレート及び（−）−エピガロカテキンジガレートなどの光学異性体が存在する。そのうちのいくつかを以下に示す。
【００４７】
【化７】

【００４８】
カテキンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００４９】
カテキンおよびその誘導体は、茶芽に多く含まれることが知られており、茶芽からの抽出により粗カテキンとして得ることができる。より高純度の粗カテキンを得る方法も公知である。
【００５０】
また、カテキンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００５１】
カテキンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
クルクミンの構造式を以下に示す。
【００５３】
【化８】

【００５４】
クルクミンおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＸＸＩ）で表される化合物を例示することができる。
【００５５】
【化９】

（式中、式中、Ｒ^３１、Ｒ^３２、Ｒ^３３およびＲ^３４は、同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ基または低級アルコキシ基である。）
【００５６】
Ｒ^３１、Ｒ^３２、Ｒ^３３およびＲ^３４の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等があげられる。具体的なアルコキシ基としては、炭素数１〜２のメトキシ基、エトキシ基が好ましい。式（ＸＸＸＩ）において、Ｒ^３２およびＲ^３４がヒドロキシ基である化合物が好ましい。
【００５７】
一般式（ＸＸＸＩ）で表される化合物としては、Ｕ１［ジフェルロイルメタン（ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン、以下単にクルクミンというときもある］、Ｕ２［ジメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシシンナモイル）メタン］、Ｕ３［ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビス（４−ヒドロキシシンナモイル）メタン］、ＤＭＵ１［（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］、ＤＨＵ１［（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］等のクルクミン類化合物があげられ、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３およびＤＨＵ１が好ましく用いられ、Ｕ１が特に好ましく用いられる。
【００５８】
クルクミンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００５９】
クルクミン類は、熱帯性の生姜科植物ターメリック（Ｃｕｒｃｕｍａ　ｌｏｎｇａ　Ｌ．）に含まれる黄色色素であり、ターメリックの根茎の乾燥粉末およびそれから精製したクルクミンが市販されている。
【００６０】
また、クルクミンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００６１】
クルクミンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるその塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００６２】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容されるその塩は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内への注射、直腸投与などにより非経口投与することもできる。
【００６３】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容される塩の製剤化は、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、ＣＭＣ・Ｎａ、ＣＭＣ・Ｃａ、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェノール、塩化ベンザルコニウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート８０、２０など）、緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行われる。
【００６４】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容されるその塩のヒトへの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。例えば、成人に対して、カプサイシンおよびその誘導体については、１日あたり約０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、カフェインおよびその誘導体については、１日あたり約０．１〜２０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約１〜１０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、カテキンおよびその誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、クルクミン及びそれらの誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００　ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて静脈注射により投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【００６５】
本発明の分子標的治療薬は、ｐ５３が関与する疾患、例えば、造血器腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫など）、皮膚癌、大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍などの治療に利用することができる。
【００６６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６７】
〔実施例１〕
１．材料と方法
（１）材料
・カプサイシン：Ｗａｋｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌ．　Ｃｏ．　（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４　Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ　Ｈｏｓｐｉｔａ．，　Ｐａｒｉｓ，　Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｋ５６２、ＫＵ８１２、Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
・ワートマニン：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手
・ピフィスリンα：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手
・ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手
・ＢＳＯ（ブチオニンスルフォキシド）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手・ＤＮＡマイクロアレイ：ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏ．Ｌｔｄより入手
・白血病患者サンプル：慶応義塾大学病院入院患者及び外来患者より、文書と同意のもと末梢血または骨髄血を入手
・正常者サンプル：有志より説明と同意のもと入手
ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手
【００６８】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：カプサイシン１００μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０^４／ｍｌ）に対しカプサイシン１００μＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【００６９】
細胞周期を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０^５の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【００７０】
ＤＮＡラダー形成を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０^５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して０、２４、４８、７２時間培養後に、ＤＮＡを採取し、２％　アガロースゲルにて電気泳動しラダー形成の有無につき検討する。
【００７１】
細胞形態を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０^４　個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０^４倍）観察する。
【００７２】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０^５の細胞を採取し、アネキシンＶ　（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【００７３】
カスパーゼ３活性を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【００７４】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　解析）（プロカスパーゼ３とカスパーゼ３ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ、アポトーシス関連蛋白、チトクロームｃ及びβ−アクチン、細胞周期関連蛋白、ｐ５３関連蛋白、Ｓｅｒ　６，９，２０，３７のリン酸化ｐ５３、β−アクチンとｐ５３）カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン　１５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【００７５】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度　１０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【００７６】
活性酸素の解析：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度　１０μＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【００７７】
ＭＴＴ　アッセイ：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ）　１０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　１００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ_４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【００７８】
２．結果
各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するカプサイシンの効果を図１に示す。カプサイシン（以下、「ＣＡＰ」という）１００μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０^４／ｍｌ）に対し強い増殖抑制効果が認められた。
【００７９】
ＮＢ４細胞に対し、各種濃度のＣＡＰ及び各種培養時間での細胞周期とアポト−シスの検討を行った結果を図２〜５に示す。
【００８０】
図２から、ＣＡＰ　１００μＭ添加培養によりコントロール（ｂａｓｅ：エタノール０．０１％）に対し、優位に細胞の増殖抑制効果を認めることがわかる。
【００８１】
図３から、ＣＡＰが濃度依存性にアポトーシスを誘導することがわかる。
【００８２】
図４から、ＣＡＰ　１００μＭ添加培養が時間依存性に細胞周期をＧ１期に止め、アポトーシスに相当する　ｐｒｅ−Ｇ１期が増加させることがわかる。
【００８３】
図５から、ＣＡＰが濃度依存性に細胞周期のＧ１期への停止とアポトーシスを増加させることがわかる。
【００８４】
図２〜５の結果から、ＣＡＰが濃度依存的　及び時間依存的にアポト−シスを誘導し・Ｇ１期に細胞周期を停止させる（Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ）ことが分かった。
【００８５】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０^５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して０、２４、４８、７２時間培養後に、ＤＮＡラダー形成を調べた結果を図６に示すＣＡＰ添加培養後（１００μＭ　２４時間）のＮＢ４細胞株はＤＮＡラダー形成を認めた。
【００８６】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０^５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して２４時間培養して、細胞の形態を観察した結果を図７に示す。ＣＡＰ添加培養後（１００μＭ　２４時間）のＮＢ４細胞株は、アポト−シスに典型的な核の濃縮、断片化を認めた。
【００８７】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０^４／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して２４時間培養して、細胞周期を解析した結果を図８に示す。細胞周期の解析では、Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ・Ｓ期の減少とともにＣＡＰ　１００ｕＭ投与２４時間後にアポト−シスを示す、Ｓｕｂ　Ｇ１分画の増加を認めた。
【００８８】
さらに、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いたアネキシンＶ　，　ＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を図９に示す。ＣＡＰ投与後、経時的にアネキシンＶ陽性細胞の増加を認めた。以上の結果からＣＡＰはＮＢ４細胞の細胞周期をＧ１期に停止させ、アポトーシス誘導を介して増殖を抑制することが示された。
【００８９】
次に、ＣＡＰによるアポートシス誘導機構に関する解析を行った。まず、ＦＡＣＳを用いてカスパーゼ３の活性化を検討した。結果を図１０に示す。ＣＡＰ　１００μＭ投与３時間後よりカスハ゜ーセ゛３の活性化を認めた。経時的な増加を認めた。
【００９０】
種々のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤）を用いて検討した。結果を図１１および１２に示す。カスハ゜ーセ゛３，　９阻害剤投与にてＣＡＰによるアポトーシスが解除された（図１１）。また、４８時間後よりＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ解析で１７ｋＤのカスパーゼ　３のａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍを認めた（図１２）。一方、カスパーゼ　３及びｐａｎ‐カスパーゼ阻害剤投与時は、細胞増殖抑制は解除されないものの、ＦＡＣＳ解析にてアポト−シスの減少を認めた（図３８）。以上の結果から、ＮＢ４におけるアポト−シスにカスパーゼ‐３，９が関与することが示された。
【００９１】
次に、アポト−シス関連蛋白について検討を行った結果を図１３に示す。Ｂｃｌ−２，　Ｂｃｌ−ｘＬは発現変化を認めなかったが、図１７に示すように、アポト−シス誘導を促進するＢａｘの経時的な発現増加を認めた。また、カスパーゼ　３　ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍの出現も認めた。（図１２）
以上の結果より、カプサイシンがＢａｘ　蛋白を介して、カスハ゜ーセ゛９を活性化し、カスハ゜ーセ゛３が活性化されアポトーシスが誘導されることが示された。
【００９２】
ＣＡＰ→Ｂａｘ→カスパーゼ９→カスパーゼ３→アポト−シス
【００９３】
ミトコンドリア膜電位の変化を検討した結果を図１４に示す。ＣＡＰ　１００μＭ投与９時間後よりミトコンドリア膜電位の低下を認め、さらに細胞質分画のチトクロームｃの経時的な発現増加を認めた（図１５）。以上の結果より、ＣＡＰによるアポト−シスはＢａｘを介するミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームｃの遊離、カスパーゼ　９、カスパーゼ　３を介すると示唆された。
【００９４】
次に、細胞周期関連蛋白について検討を行った結果を図１６に示す。ＣＡＰ　１００μＭ投与時にｐ２１の経時的な増加およびｃｙｃｌｉｎＤ１の経時的な減少を認めた。一方、ｐ２７、ｃｙｃｌｉｎ　Ａ，Ｂ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｅには経時的な発現の変化は認められなかった。また、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）蛋白のリン酸化の低下も認めた。（データは示さず）
以上の結果より、ＣＡＰはｐ２１の増加、ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１の減少、Ｒｂ蛋白の脱リン酸化を介してＧ１　ａｒｒｅｓｔを起こす事が示唆された。
【００９５】
ＣＡＰ→ｐ２１↑，ｃｙｃｌｉｎＤ１↓→Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ
【００９６】
前記のようにＮＢ４細胞と比較し、ＡＰＬ細胞株であるＨＬ−６０，ＵＦ−１やＣＭＬ細胞株であるＫ５６２，ＫＵ８１２では、ＣＡＰに対する感受性が低い。Ｋ５６２・ＨＬ６０
では、ｐ５３の欠損や機能異常が報告されている（Ｔｒｅｐｅｌ　Ｍ，　Ｓｃｈｅｄｉｎｇ　Ｓ，　Ｇｒｏｓｃｕｒｔｈ　Ｐ，　Ｈｏｒｎｙ　ＨＰ，　Ｍｌｉｐｉｅｒｏ　Ｕ，　Ｂｒｕｇｇｅｒ　Ｗ，　Ｄｉｃｈｇａｎｓ　Ｊ，　Ｗｅｌｌｅｒ　Ｍ．　Ａ　ｎｅｗ　ｌｏｏｋ　ａｔ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐ５３　ｉｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１９９７；１１（１１）：１８４２−９．　　Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｔ，　Ｐｏｍｍｉｅｒ　Ｙ．　Ｃａｍｐｔｏｔｅｎｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｐ５３−ｎｕｌｌ　ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ＨＬ６０　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｎｕｃｌｅｉ：　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ　ａｎｄ　ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｏｕｍａｒｉｎ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ａｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖｏｔｈ　ｃａｓｐａｓｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１９９７；１１（８）：１２３８−４４）。そこで、本発明者らは、ＮＢ４，ＵＦ−１，　ＫＵ８１２のｐ５３の発現を解析したところ、ＫＵ８１２ではｍＲＮＡの発現が見られなかった（データは示さず）。また、ＨＬ−６０、ＵＦ−１、Ｕ２６６においてｐ５３の蛋白の発現は認められなかった（データは示さず）。また、細胞周期関連蛋白の解析の際に認めたｐ２１の増加及びｃｙｃｌｉｎＤ１の経時的な減少とｐ５３の関連性が以前から報告されている（Ｌｉ　Ｙ，　Ｊｅｎｋｉｎｓ　ＣＷ，　Ｎｉｃｈｏｌｓ　ＭＡ，　Ｘｉｏｎｇ　Ｙ．　Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐ５３　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐ２１．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９９４；９（８）：２２６１−８））。以上の結果から、我々はＣＡＰにおけるＮＢ４細胞のアポトーシスにおいてｐ５３の関連の可能性につき検討を進めることとした。一方ＮＢ４細胞では、野生型のｐ５３のｍＲＮＡ及び蛋白の発現を認めた（データは示さず）。
【００９７】
まず、本発明者らはＣＡＰ　１００μＭ投与時のＮＢ４細胞におけるｐ５３及びその関連蛋白の発現解析をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ解析にて行った。結果を図１７に示す。ＣＡＰ　１００μＭ投与にて、ｐ５３　蛋白の経時的な増加を認めた。一方ＭＤＭ２、ｐ７３には発現の変化は認められなかった。
【００９８】
ｐ５３の活性化のメカニズムとして以前よりセリン残基（Ｓｅｒ）のリン酸化が知られている（Ｂａｎｉｎ，　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｂｙ　ＡＴＭ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８１，　１６７４−１６７７））。ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅや放射線照射、各種抗がん剤（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａなど）投与時のｐ５３の活性化にセリン残基リン酸化が関与すると報告されている。（Ｂａｎｉｎ，　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｂｙ　ＡＴＭ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８１，　１６７４−１６７７Ｃａｎｍａｎ，　ｅｔ　ａｌ（１９９８）　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡＴＭ　ｋｉｎａｓｅ　ｂｙ　ｉｏｎｉｓｉｎｇ　ｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８１，１６７７−１６７９）。そこで、本発明者らは、ＣＡＰ　１００μＭ投与時のｐ５３のリン酸化につき解析を行った。結果を図１８に示す。ＣＡＰ　１００μＭ投与時Ｓｅｒ　１５のリン酸化の経時的な増加を認めた。一方、Ｓｅｒ　６，９，２０，３７のリン酸化に経時的な変化は認められなかった。
【００９９】
以上の結果より、カプサイシン投与により、ｐ５３蛋白のセリン１５残基がリン酸化され、ｐ５３蛋白が増加し、ｐ２１の増加・ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１の減少が生じ、Ｇ１期に細胞周期が停止することが示唆された。
【０１００】
ｐ５３の阻害剤として最近ピフィスリンα（ＰＦＴα）が報告されている。（Ｋｏｍａｒｏｖ　ＰＧ．　Ｋｏｍａｒｏｖａ　ＥＡ．　Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ　ＲＶ．　Ｃｈｒｉｓｔｏｖ−Ｔｓｅｌｋｏｖ　Ｋ．　Ｃｏｏｎ　ＪＳ．　Ｃｈｅｒｎｏｖ　ＭＶ．　Ｇｕｄｋｏｖ　ＡＶ．　Ａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｐ５３　ｔｈａｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｍｉｃｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｉｄｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｈｒａｐｙ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９９；２８５（５４３４）：１７３３−７）ＰＦＴαはｐ５３の発現そのものは変化させないものの、その下流の分子であるｐ２１やＢａｘなどの発現を抑制することにより、ｐ５３の作用を阻害するといわれている。そこで、本発明者らは、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シスにおけるｐ５３の関連性を解析するためにＰＦＴαを用いてその抑制ができるかを検討した。結果を図２０及び２１に示す。Ｐ５３　阻害剤であるＰＦＴα　（１００ｎＭ　３時間前投与）を投与したところ、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス及びＧ１　ａｒｒｅｓｔを抑制した。以上の結果より、ＣＡＰによるＮＢ４細胞への影響において、ｐ５３が重要な役割を果たしていることが示された。また、ＰＦＴα投与時の発現蛋白を調べたところｐ２１，　Ｂａｘの発現低下および、ＣＡＰ投与時の、発現増加の抑制を認めた（データは示さず）。
【０１０１】
さらに、本発明者らは、ｐ５３のアンチセンスを用いて、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のＧ１　ａｒｒｅｓｔ及びアポト−シスが抑制できるかを検討した。ｐ５３のアンチセンス，　コントロールセンス，　ミスマッチセンス（アンチセンスとは６０％　ミスマッチ）を以下のように作成し、各々１μＭ　２４時間前投与し、アンチセンスの分解を少なくするために、培養液をＲＰＭＩ＋５％ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭとし実験を行った。
１）　アンチセンス　オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
２）　コントロール　オリゴヌクレオチド
５’−ＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２）
３）　ミスマッチ　オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＴＡＧＴ−３’（配列番号３）
【０１０２】
結果を図２２及び２３に示す。アンチセンスを前投与した細胞では、ＣＡＰによるＮＢ４細胞の、Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ及びアポト−シスが抑制することが分かった。以上の結果より、ＣＡＰにＮＢ４細胞へのアポト−シス及び細胞周期の停止にｐ５３が重要な役割をしていることが分かった。
【０１０３】
ｐ５３の活性化のメカニズムの一つとして活性酸素の産生が知られている（Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ，　Ｒ．Ｅ．，Ｉｎｎｅｓ，　Ｃ．Ｌ．，Ｓｉｅｖｅｒ，　Ｓ．Ｏ．，　Ｈｅｉｎｌｏｔｈ，　Ａ．Ｎ．，　Ｌｅａｄｏｎ，　Ｓ．Ａ．，　ａｎｄＰａｕｌｅｓ，　Ｒ．Ｓ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２７６，２１９５１−２１９５９）。また、抗癌剤、放射線による種々の癌細胞のアポト−シス誘導や亜ヒ酸によるＡＰＬや多発性骨髄腫細胞のアポト−シス誘導に活性酸素が重要な役割を果たしていることが報告されている（Ｄａｉ　Ｊ，　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ＲＳ，　Ｗａｘｍａｎ　Ｓ，　Ｊｉｎｇ　Ｙ．　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ　ｔｏ　ｕｎｄｅｒｇｏ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｏｒｉｏｘｉｄｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｒｅｄｏｘ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ　１９９９　；９３（１）２６８−９７）。また、ＮＢ４細胞はク゛ルタチオンが他の白血病細胞株と比較し、少ないことが知られている（（Ｄａｉ　Ｊ，　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ＲＳ，　Ｗａｘｍａｎ　Ｓ，　Ｊｉｎｇ　Ｙ．　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ　ｔｏ　ｕｎｄｅｒｇｏ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｏｒｉｏｘｉｄｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｒｅｄｏｘ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ　１９９９　；９３（１）２６８−９７）。そこで、本発明者らは、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス誘導における活性酸素の解析を行った。結果を図２４に示す。ＮＢ４細胞では、ＣＡＰ　１００μＭ投与４時間後に、細胞内活性酸素濃度の増加が認められた。一般に細胞内には有害な活性酸素を除去するＳＯＤ、ク゛ルタチオン、カタラーセ゛、チオレト゛キシンなどの抗酸化物質が存在する。
本発明者らは、ク゛ルタチオン前駆体であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＣＡＰによるアポートシスを抑制することができるか、また、ク゛ルタチオン阻害作用を有するフ゛チオニンスルフォキシト゛（ＢＳＯ）を用いて（１ｍＭ　８時間前投与）アポト−シスが増強されるかを解析することによりク゛ルタチオン（ＧＳＨ）とＣＡＰによるアポト−シスとの関連を検討した。結果を図２５及び２６に示す。ク゛ルタチオン前駆体であるＮＡＣ（１００μＭ　１時間前投与）を前投与し活性酸素を除去すると、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス誘導、細胞周期のＧ１　ａｒｒｅｓｔが抑制されることがわかった。
【０１０４】
以上の結果より、カプサイシンによる白血病細胞のアポトーシス誘導および細胞周期Ｇ１期への停止の機序として、ｐ５３セリン１５残基のリン酸化において、ＡＴＲ／ＡＴＭ等のリン酸化酵素の重要性が示唆された。また、そのリン酸化酵素の活性化に対し活性酸素の産生の関与も示された。
【０１０５】
以上よりカプサイシン投与により、活性酸素・ＡＴＲ／ＡＴＭなどを介し、ｐ５３セリン残基がリン酸化されＢａｘ蛋白・ミトコンドリア膜電位の低下・チトクローム　ｃ遊離を介し、カスハ゜ーセ゛の系が活性化され、アポトーシスが誘導されることが示唆された。
【０１０６】
ＣＡＰ→活性酸素産生→ＡＴＲ→ｐ５３　Ｓｅｒ　１５　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ→ｐ５３↑→Ｂａｘ→ミトコント゛リア膜電位低下→チトクローム　ｃ　遊離→カスパーゼ　９→カスパーゼ　３→アポトーシス→ｐ２１↑、ｃｙｃｌｉｎＤ１↓→Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ
【０１０７】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプルでのＣＡＰの効果につき検討を行った。計１１検体（急性骨髄性白血病・急性リンパ急性白血病・慢性骨髄性白血病・骨髄腫等含む）につき、ＭＴＴ　アッセイ，　アネキシン　Ｖ−ＰＩ解析を含め、ＣＡＰの効果につき検討を行った。１１検体のうち１０検体にＣＡＰの効果を認めた。
【０１０８】
患者検体のｐ５３の発現につき検討を行った結果を図２７に示す。ＣＡＰの効果のあった１０検体にはｐ５３のｍＲＮＡの発現を認めたが、効果の見られなかった１検体にはｐ５３の発現は見られなかった。以上の結果より、実際の患者検体においてもｐ５３とＣＡＰの効果の関連性が示唆された。
【０１０９】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプル（Ｊ．Ｕ氏）でのＣＡＰの効果につき検討を行った。フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病の骨髄を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０^７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％　ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間・４８時間後のＣＡＰ　１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ　各濃度の効果を検討した。
【０１１０】
まず、ＭＴＴ　アッセイ及びｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔを用いて細胞増殖抑制につき検討を行ったところ、濃度依存性に細胞増殖が抑制された（図２８）。
【０１１１】
次に、この患者サンプルでのＣＡＰによるアポト−シス及び細胞周期についての検討を行った。結果を図２９〜３１に示す。ＣＡＰ　１００μＭ投与２４時間後にアネキシンＶ陽性細胞の著明な増加を認めた。また、ＣＡＰ投与後、濃度及び時間依存性にアネキシンＶ（＋）の増加を認めた（図２９）。培養４８時間の条件下での、ＣＡＰ濃度とアネキシンＶ−ＰＩ染色によるアポトーシスの検討結果を図３１に、ＣＡＰ濃度とアポト−シス（％）の関係を図３２に示す。
【０１１２】
この患者サンプルを用いて、ｐ５３の発現の有無につき検討したところ、正常なｐ５３の発現を認めた（データは示さず）。
【０１１３】
次に、本発明者らは、実際の慢性骨髄性白血病　慢性期の患者サンプルでのＣＡＰの効果につき検討を行った。患者の末梢血を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０^７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％　ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間・４８時間・７２時間後のＣＡＰ　１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ　各濃度の効果を検討した。結果を図３３に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的・時間依存的にアネキシンＶ（＋）の増加が認められた。
【０１１４】
次に我々は、急性前骨髄球性白血病の患者の末梢血を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０^７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％　ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間後のＣＡＰ　１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ　各濃度の効果を検討した。
【０１１５】
まず、ＭＴＴ　アッセイ及びアネキシンＶ−ＰＩ　染色法を用いて細胞増殖抑制及びアポト−シス誘導につき検討を行ったところ、細胞増殖抑制およびアポト−シスの誘導は起こらなかった（図３４）。
【０１１６】
本検体のｐ５３の発現につき検討したところ、ｐ５３　ｍＲＮＡの発現を認めなかった（データは示さず）。
【０１１７】
また、急性骨髄性白血病および急性前骨髄球性白血病患者サンプルへのカプサイシンの効果（アポトーシス誘導）を図３９に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的にアネキシンＶ（＋）の増加が認められた。
【０１１８】
さらに、多発性骨髄腫患者サンプルへのカプサイシンの効果を図４０に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的に細胞増殖が抑制された。
【０１１９】
次に、正常者末梢血単核球でのＣＡＰ１０μＭおよび１００μＭによる細胞増殖抑制についての検討を行った。結果を図３５に示す。ＣＡＰ投与による細胞増殖抑制効果は認めなかった。
【０１２０】
正常のヒト末梢血より単核球を分離し、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激し、活性化したリンパ球（主にＴ細胞）１×１０^６／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して２４時間培養した時のＭＴＴアッセイの結果を図３５に示す。ＭＴＴアッセイで細胞増殖が抑制され、また、図３６に示すようにアポトーシス分画が増加していることが確認された。このことは、ＣＡＰが活性化されたＴ細胞を抑制することを示している。また、活性化されていない正常リンパ球には影響を与えなかった（データは示さず）。これらのことは、ＣＡＰが免疫抑制剤として利用可能であることを示している。
【０１２１】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・唐辛子の成分ＣＡＰは、ＮＢ４細胞をはじめｐ５３を正常発現する種々の白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍細胞の細胞周期の停止を誘導した。
・その誘導には、ｐ５３の活性化を介したｐ２１／ｃｙｃｌｉｎＤ１の経路による細胞周期の停止および、ＢＡＸ／チトクロームｃ／カスパーゼ−３によるアポトーシス誘導の経路が重要な働きをしていることが示唆された。
【０１２２】
以上の結果より、ｐ５３はＮＢ４細胞をはじめｐ５３を正常発現する種々の白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍細胞のアポト−シス誘導の標的分子として重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１２３】
以上の結果から予測される、ＣＡＰの作用機序を図３７にまとめた。ＮＢ４細胞においてＣＡＰは活性酸素を細胞内（あるいはミトコンドリアで）産生し、ＡＴＲなどを介してｐ５３のＳｅｒ１５残基のリン酸化を起こすことにより、ＭＤＭ２との会合を抑制しｐ５３を安定化させる一方で転写を活性化する。そのことにより、一方でｐ２１の発現の上昇・ｃｙｃｌｉｎＤ１の低下等を開始、細胞周期をＧ１期で停止させる。また、一方でＢＡＸを介しミトコンドリア膜電位を低下させ、ミトコンドリアから細胞質内にチトクロームＣ遊離が起こり、その後カスパーゼ９及び３あるいは８を活性化することによりアポト−シスを誘導すると考えられる。
【０１２４】
〔実施例２〕
１．材料と方法
（１）材料
・１’−アセトキシチャビコールアセテート：京都大学農学部大東先生、村上先生より供与
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４　Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ　Ｈｏｓｐｉｔａ．，　Ｐａｒｉｓ，　Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｋ５６２、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ、Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
・抗Ｆａｓ抗体、抗Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ（Ｆａｓ−Ｌ）抗体：ＭＢＬより入手
・ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手
・ＢＳＯ（ブチオニンスルフォキシド）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手・カスパーゼ８および９活性キット：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手
・白血病患者サンプル：慶応義塾大学病院入院患者及び外来患者より、文書による同意のもと末梢血または骨髄血を入手
・正常者サンプル：有志より説明と同意のもと入手
・ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）　より入手
【０１２５】
（２）実験方法
・各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０^５／ｍｌ）に対し１’−アセトキシチャビコールアセテート　１０μＭ（または０−２０μＭ）の添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１２６】
・細胞形態を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０^４　個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０^４倍）観察する。
・アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０^５の細胞を採取し、　アネキシンＶ　（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１２７】
・カスパーゼ３活性を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテート　１０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１２８】
・細胞周期を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテートを各濃度で添加培養２４時間後、１Ｘ１０^５の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１２９】
・発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　解析）（カスパーゼ３、カスパーゼ８、Ｂａｘ、チトクロームｃ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ及びβ−アクチン）１’−アセトキシチャビコールアセテート１０μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン　１５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。チトクローム　ｃ，　Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＲＯ，　Ｂａｘでは細胞質分画およびミトコンドリア分画を採取し、同様に泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１３０】
・ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテート　１０μＭ添加培養１２時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度　１０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３１】
・活性酸素の解析：１’−アセトキシチャビコールアセテート　１０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度　１０ｕＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３２】
・Ｆａｓ発現解析：１’−アセトキシチャビコールアセテート　１０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０^５の細胞を採取し、抗Ｆａｓ／ＣＤ９５抗体（ＺＢ４　ＭＢＬ）（最終濃度　１０ｕｇ／ｍｌ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３３】
・ＭＴＴ　アッセイ：１’−アセトキシチャビコールアセテート　を各濃度で添加培養各時間後、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ）　１０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　１００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ_４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【０１３４】
２．結果
各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対する１’−アセトキシチャビコールアセテートの効果を図４１に示す。１’−アセトキシチャビコールアセテート（以下、「ＡＣＡ」という）１０μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０^５／ｍｌ）に対し濃度および時間依存性に増殖抑制効果を認めた。
【０１３５】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加し、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎでは４時間・ＮＢ４では１２時間培養して、細胞の形態を観察した結果を図４２に示す。ＡＣＡ添加培養後のＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞株およびＮＢ４細胞株は、アポト−シスに典型的な核の濃縮、断片化を認めた。
【０１３６】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いたアネキシンＶ　，　ＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を図４３に示す。ＡＣＡ投与後、経時的にアネキシンＶ陽性細胞の増加を認めた。以上の結果からＡＣＡはＮＢ４細胞およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞に、アポトーシス誘導を介して増殖を抑制することが示された。
【０１３７】
次に、種々のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛８、カスハ゜ーセ゛９阻害剤）を用いて検討した。結果を図４４に示す。カスハ゜ーセ゛３，８，９阻害剤投与にてＡＣＡによるアポトーシスが解除された。また、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ解析でカスパーゼ　３および８のａｃｔｉｖｅｆｏｒｍをの出現を確認した（図４５）。以上の結果から、ＮＢ４におけるアポト−シスにカスパーゼ‐３，８，９が関与することが示された。
【０１３８】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０^４／ｍｌにＡＣＡ　１、５または１０μＭ添加して２４時間培養して、細胞周期を解析した結果を図５４に示す。細胞周期の解析では、Ｇ１　ａｒｒｅｓｔ・Ｓ期の減少とともにＡＣＡ　５μＭ投与２４時間後にアポト−シスを示す、Ｓｕｂ−Ｇ１分画の増加を認めた。
【０１３９】
ＡＣＡによるアポト−シス誘導における活性酸素の産生の解析を行った。結果を図４７に示す（図４７はＨＳ−ｓｕｌｔａｎにおける結果であるがＮＢ４に関しても同様の結果が得られている。データは示さず）。ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞では、ＡＣＡ　１０μＭ投与１時間後に、細胞内活性酸素濃度の増加が認められた。一般に細胞内には有害な活性酸素を除去するＳＯＤ、ク゛ルタチオン、カタラーセ゛、チオレト゛キシンなどの抗酸化物質が存在する。
本発明者らは、ク゛ルタチオン前駆体であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＡＣＡによるアポートシスを抑制することができるか、また、ク゛ルタチオン阻害作用を有するフ゛チオニンスルフォキシト゛（ＢＳＯ）を用いて（１ｍＭ　８時間前投与）アポト−シスが増強されるかを解析することによりク゛ルタチオン（ＧＳＨ）とＡＣＡによるアポト−シスとの関連を検討した。結果を図４８に示す。ク゛ルタチオン前駆体であるＮＡＣ（１ｍＭ　１時間前）を前投与し活性酸素を除去すると、ＡＣＡによるＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞のアポト−シス誘導が抑制されることがわかった。（ＮＢ４細胞においてもＮＡＣ　１００μＭ　１時間前投与にてアポトーシスの誘導の抑制が得られた。データは示さず）
【０１４０】
また、ＢＳＯ投与にてアポトーシスが促進されること、ＡＣＡ投与にてＧＳＨが低下することも確認した。（データは示さず）
【０１４１】
活性酸素の産生によるミトコンドリア膜電位の変化には、Ｂａｘ蛋白の重要性が多数報告されている。そこで我々は、Ｂａｘ蛋白の変化につきＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析を用いて解析を行った。結果を図４６に示す。総Ｂａｘ蛋白には大きな変動は認められなかった。しかし、ミトコンドリア分画、細胞質分画をそれぞれ採取し、Ｂａｘ蛋白の発現につき検討を行ったところ、時間依存性に細胞質分画での減少とミトコンドリア分画での増加を認めた。以上の結果より、ＡＣＡによるアポトーシスの誘導にＢａｘ蛋白の関与が考えられた。また、細胞質分画においてチトクローム　ｃ，
Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白の発現の増加も認めた。
以上の結果より、Ｂａｘが細胞質からミトコンドリアに転送され、ミトコンドリア膜電位が変化、チトクローム　ｃの遊離が生じ、アポトーシスが誘導されると考えられた。
ＡＣＡ→ＲＯＳ→Ｂａｘ→カスパーゼ　９→カスパーゼ　３→アポト−シス
【０１４２】
ミトコンドリア膜電位の変化を検討した結果を図５５に示す。ＡＣＡ　１０μＭ投与９時間後よりミトコンドリア膜電位の低下を認めた。以上の結果より、ＡＣＡによるアポト−シスはＢａｘを介するミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームｃの遊離、カスパーゼ　９、カスパーゼ　３を介することが示された。
【０１４３】
以上の結果より、ＡＣＡによる造血器腫瘍細胞のアポトーシス誘導の機序として、活性酸素の産生、Ｂａｘ蛋白のミトコンドリアへの移行、ミトコンドリア膜電位の低下、カスハ゜ーセ゛９活性化の重要性が示された。
ＡＣＡ→活性酸素産生→Ｂａｘ→ミトコント゛リア膜電位低下→チトクローム　ｃ　遊離→カスパーゼ　９→カスパーゼ　３→アポトーシス
【０１４４】
カスハ゜ーセ゛８の活性化に関しては、以前よりＦａｓ（ＣＤ９５）をはじめとする死受容体（Ｄｅａｔｈ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の関与が報告されている。今回我々は、Ｆａｓ／Ｆａｓ−Ｌの関与につき抗Ｆａｓ　抗体（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ａｎｄ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　２種類）、蛋白の発現につきＦＡＣＳを用いて検討を行った。
【０１４５】
ＮＢ４においてａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｆａｓ抗体（ＣＨ１１）にて、アポトーシスの誘導、ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｆａｓ抗体（ＺＢ４）にて、アポトーシスの抑制を認めた（図５０）。また、ＮＢ４における、ＡＣＡ　１０μＭ投与時のａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ抗体によるアポトーシスの抑制につき検討を行ったところ、ＡＣＡによるアポトーシスをほほ完全に抑制した（図５０）。また、ＦＡＣＳにてＡＣＡ投与時のＦａｓおよびＦａｓ−Ｌの発現誘導を認めた（図４９）。以上の結果より、ＡＣＡによるアポトーシスの誘導には、Ｆａｓの系が関与していることが示された。
【０１４６】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプルでのＡＣＡの効果につき検討を行った。計２検体（急性骨髄性白血病・骨髄腫）につき、ＭＴＴ　アッセイにてＡＣＡの効果につき検討を行った。図５１に示したように、２検体ともにＡＣＡの濃度依存性の細胞増殖抑制効果を認めた。また、アネキシンＶをマーカーとしてアポトーシスの誘導についての検討も行い、ＡＣＡにてアポトーシスが誘導されていることを確認した（データは示さず）。また、ＦＡＣＳを用いてＦａｓの誘導についての検討も行い、ＡＣＡ添加培養にてＦａｓが誘導されていることも確認した。以上の結果より、実際の患者検体においてもＦａｓとＡＣＡの効果の関連性が示唆された。
【０１４７】
正常のヒト末梢血より単核球を分離し、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激し、活性化したリンパ球（主にＴ細胞）１×１０^６／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して２４時間培養した時のＭＴＴアッセイの結果を図５２に示す。ＭＴＴアッセイで細胞増殖が抑制され、また、アネキシン−Ｖを用いたアッセイでアポトーシス分画が増加していることを確認した。（データは示さず）このことは、ＡＣＡが活性化されたＴ細胞を抑制することを示している。これらのことは、ＡＣＡが免疫抑制剤として利用可能であることを示している。
【０１４８】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・食用生姜の成分１’−アセトキシチャビコールアセテートは、ＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞に対し、アポト−シスと細胞周期の停止を誘導した。
・その誘導には、活性酸素の産生の経路によるカスハ゜ーセ゛９及び３の活性化および、Ｆａｓの系を介したカスハ゜ーセ゛８及び３の活性化によるアポトーシス誘導の経路が重要な働きをしていることが示唆された。
【０１４９】
以上の結果より、Ｆａｓおよび活性酸素はＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞のアポト−シス誘導の標的分子として重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１５０】
以上の結果から予測される、ＡＣＡの作用機序を図５３にまとめた。ＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞においてＡＣＡは活性酸素を細胞内（あるいはミトコンドリアで）産生し、ＢＡＸを細胞質からミトコンドリアに移行させることにより、ミトコンドリアの膜電位を低下させる。その後、チトクローム　ｃがミトコンドリアから細胞質に放出され、カスハ゜ーセ゛９を活性化し、カスハ゜ーセ゛３が活性化しアポトーシスが誘導される。
一方で、Ｆａｓの系を介し、カスハ゜ーセ゛８を活性化させ、カスハ゜ーセ゛３を活性化し、双方の系を介し非常に早期にアポト−シスを誘導すると考えられる。
【０１５１】
〔実施例３〕
１．材料と方法
（１）材料
・カフェイン：Ｓｉｇｍａより入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４　Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ　Ｈｏｓｐｉｔａ．，　Ｐａｒｉｓ，　Ｆｒａｎｃｅ）より供与
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
【０１５２】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：造血器腫瘍細胞株ＮＢ４（１Ｘ１０^４／ｍｌ）に対しカフェイン４　ｍＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１５３】
細胞周期を調べる実験：カフェイン４　ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０^６の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１５４】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０^５の細胞を採取し、アネキシンＶ　（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１５５】
カスパーゼ３活性を調べる実験：カフェイン４　ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０^５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１５６】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　解析）（ｐ５３、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２５ｃ、Ｂａｘ、ｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ}、ｃｙｃｌｉｎ　Ｂ１及びＳｅｒ　１５のリン酸化ｐ５３）（ｐＴｙｒ−ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２５ｃ、ｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ}及びｃｙｃｌｉｎ　Ｂ１は、細胞周期関連蛋白である）カフェイン４　ｍＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン　１５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１５７】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：カフェイン４　ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０^５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度　１０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１５８】
２．結果
結果を図５６〜５９に示す。
【０１５９】
カフェインは時間（０−９６　時間）（濃度は４　ｍＭ）および濃度（０−８　ｍＭ）依存性に白血病細胞株ＮＢ４の増殖を抑制した（図５６Ａ）。さらに、その際の細胞周期を検討すると、Ｇ２／Ｍ期に細胞周期は停止した（図５６Ｂ）。
【０１６０】
カフェインは、カスパーゼ３の活性を増加させ（図５７Ａ）、アネキシンＶによる検討では、カフェインン　４　ｍＭ，　７２　時間処理でアネキシンＶ陽性細胞が５６．９％と増加し、アポトーシスが誘導された（図５７Ｂ）。さらに、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（２０　μＭ）により、カフェイン（４　ｍＭ）によるアポトーシス誘導は阻害され（図５７Ｂ）、カフェインによるアポトーシス誘導は、カスパーゼ依存性であった。また、同時にミトコンドリアの膜電位が低下し、チトクロームｃが誘導されることより（図５７Ｃ）、ミトコンドリアを介するアポトーシス誘導であることが明らかになった。
【０１６１】
アポトーシスおよび細胞周期関連タンパクを検討すると、カフェイン処理にて、ｐ５３の増加、リン酸化ｃｄｃ２の増加、Ｂａｘ，　ｐ２１の誘導が認められた（図５８Ａ）。
さらに、興味あることにｐ５３のセリン１５残基のリン酸化が誘導された（図５８Ｂ）。
【０１６２】
カフェインによる白血病細胞の細胞周期停止、アポトーシス誘導におけるｐ５３の意義を検討するために、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）を作製し、細胞内のｐ５３をノックアウトした状態にてカフェインの効果を検討した（図５９）。操作手順は実施例１の記載に従った。但しカプサイシン５０μＭの代わりにカフェイン４ｍＭを用いた。また、ＮＢ４細胞にカフェイン及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチチドを添加して、２４時間培養した時のｐ５３、β−アクチン、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ　２及びｃｄｃ　２の発現も調べた。ＡＳによりｐ５３をノックアウトすると、カフェインによる白血病細胞のアポトーシス誘導はキャンセルされた（図５９Ｂ）。以上より、カフェインは白血病細胞のｐ５３を標的とし、そのセリン１５残基をリン酸化することにより、白血病細胞の細胞周期停止およびアポトーシスを誘導すると考えられた。
【０１６３】
〔実施例４〕
１．材料と方法
（１）材料
・（−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ（以下、「ＥＧＣＧ」と記す）：和光純薬より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４　Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ　Ｈｏｓｐｉｔａ．，　Ｐａｒｉｓ，　Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｕ９３７：理研細胞バンクより入手
Ｋａｓｕｍｉ−１：広島大学原医研　麻生博也先生より供与
ＴＨＰ−１：理研細胞バンクより入手
・各種抗酸化剤
カタラーゼ：Ｓｉｇｍａより入手
ｓｕｐｅｒ　ｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（以下、「ＳＯＤ」と記す）：和光純薬より入手
・各種カスパーゼ阻害剤
カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
カスハ゜ーセ゛３阻害剤：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）より入手
・ＤＮＡマイクロアレイ：ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏ．Ｌｔｄより入手
【０１６４】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（２Ｘ１０^４／ｍｌ）に対しＥＧＣＧの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１６５】
細胞周期を調べる実験：ＥＧＣＧ　２０　μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０^４の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１６６】
ＤＮＡラダー形成を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株２Ｘ１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０　μＭを添加して３時間培養後に、ＤＮＡを採取し、２％　アガロースゲルにて電気泳動しラダー形成の有無につき検討する。
【０１６７】
細胞形態を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株２Ｘ１０^４　個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０^４倍）観察する。
【０１６８】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：２Ｘ１０^４の細胞を採取し、アネキシンＶ　（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１６９】
カスパーゼ３活性を調べる実験：ＥＧＣＧ　２０　μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０^４の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１７０】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　解析）（ｐ５３、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２５ｃ、Ｂａｘ、ｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ}、ｃｙｃｌｉｎ　Ｂ１及びＳｅｒ　１５のリン酸化ｐ５３）（ｐＴｙｒ−ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２５ｃ、ｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ}及びｃｙｃｌｉｎ　Ｂ１は、細胞周期関連蛋白である。）ＥＧＣＧ　２０　μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン　１５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１７１】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：ＥＧＣＧ　２０　μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０^４の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度　１０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１７２】
活性酸素の解析：ＥＧＣＧ　２０　μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０^４の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度　１０　μＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１７３】
２．結果
結果を図６１〜７４に示す。なお、緑茶成分カテキンには種々の誘導体が存在するが、最も活性が高いとされるＥＧＣＧを実験に用いた（図６０）。
【０１７４】
ＥＧＣＧは種々の白血病細胞株（ＮＢ４，　Ｕ９３７，　Ｋａｓｕｍｉ−１，　ＵＦ−１，　ＨＬ６０，　ＴＨＰ−１）の増殖を濃度および時間依存的に抑制した（図６１）。特に、ＮＢ４細胞への効果が著しかった。
【０１７５】
ＥＧＣＧ　１０，　２０　μＭ、２４時間処理にて、種々の白血病細胞株ではアネキシンＶ陽性細胞が誘導され、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導が確認された（図６２）。さらに、ギムザ染色により形態学的に検討するとＥＧＣＧ処理により、白血病細胞は核の濃染、分断化、アポトーシス小体の出現などアポトーシスに特異的な所見が認められた（図６３）。同時に、ゲノムＤＮＡを抽出してゲル上で泳動すると、アポトーシスに典型的なラダー形成が認められた（図６４）。以上より、種々の方法により、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導が確認された。
【０１７６】
細胞周期はＥＧＣＧ処理にてＧ１期に停止した（図６５）。
【０１７７】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導は抗酸化剤、カタラーゼ，　ＳＯＤ　（ｓｕｐｅｒ　ｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）によりキャンセルされた（図６６）。また、ＥＧＣＧによるラダー形成もカタラーゼによりキャンセルされた（図６４）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導は活性酸素（ＲＯＳ）を介する可能性が示唆された。
【０１７８】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導では、カスパーゼ　３の活性が誘導された（図６７）。また、阻害剤による実験ではカスパーゼ３，　カスパーゼ９に特異的な阻害剤でアポトーシス誘導は阻害されたが、カスパーゼ８特異的阻害剤では抑制されなかった（図６８）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導はミトコンドリアを介するものと考えられた。
【０１７９】
ＥＧＣＧ処理にて種々の白血病細胞ではＲＯＳの産生、ＭＭＰ（ミトコンドリア膜電位）の低下が認められた（図６９）。ＮＢ４細胞で詳細に検討したところ、ＥＧＣＧ　２０　μＭ処理にて時間依存的にＲＯＳ産生、ミトコンドリア膜電位の低下が認められた（図７０）。
【０１８０】
ＥＧＣＧ処理した際のアポトーシス、細胞周期関連タンパクについてＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて発現を検討した。ＥＧＣＧ処理にてアポトーシス誘導に関与するＢａｘが誘導されたが、抗酸化剤カタラーゼ処理にて発現は抑制された（図７１）。ｐ５３の誘導も認められたが、やはりカタラーゼで発現は抑制された（図７２）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導の引き金になるＲＯＳはＢａｘ，　ｐ５３の誘導に直接関与するものと考えられる。ＥＧＣＧ処理によって、ミトコンドリアの膜電位が低下するが、その際にミトコンドリアから細胞質にチトクロームｃが放出されることが明らかになり、またこの放出はカタラーゼで抑制された（図７３）。
【０１８１】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導機構のまとめを図７４に示す。ＥＧＣＧは活性酸素（ＲＯＳ；　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ）を産生し、ＲＯＳがＢａｘを誘導することで、ミトコンドリアの膜電位を低下させ、ミトコンドリアからのチトクロームｃの細胞質への放出を促進する。チトクロームｃはカスパーゼ９，　カスパーゼ３を活性化し、白血病細胞のアポトーシスを誘導する。また、同時にＥＧＣＧはｐ５３の発現も誘導するが、このことによっても細胞周期停止、アポトーシス誘導シグナルが入るものと思われるが、直接的な証明はしていない。カプサイシン、カフェインではｐ５３のセリン１５残基のリン酸化が証明され、それらの誘導に関与することが明らかとなった。
【０１８２】
〔実施例５〕
１．材料と方法
（１）材料
・クルクミン：和光純薬より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ：理研細胞バンクより入手
ＲＰＭＩ１６４０：理研細胞バンクより入手
ＩＭ９：理研細胞バンクより入手
【０１８３】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０^５／ｍｌ）に対しクルクミン　５、１０、２０μＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１８４】
細胞周期を調べる実験：クルクミン　５、１０、２０μＭの添加培養１２時間後、１Ｘ１０^５の細胞を採取し、アネキシンＶ（最終濃度　５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１８５】
細胞形態を調べる実験：ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞１Ｘ１０^５　個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０^４倍）観察する。
【０１８６】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０^５個の細胞を採取し、アネキシンＶ　（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度　０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１８７】
カスパーゼ３活性を調べる実験：クルクミン１０μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０^５個の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１８８】
カスパーゼ８活性を調べる実験：クルクミン１０μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０^５個の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛８活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１８９】
ＭＴＴアッセイ：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０^５／ｍｌ）に対しクルクミン　５、１０、２０μＭの添加培養を４８時間行い、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ）　１０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　１００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ_４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【０１９０】
２．結果
結果を図７６〜８１に示す。
【０１９１】
ウコン成分クルクミンの構造式を図７５に示す。
【０１９２】
種々の濃度のクルクミンを骨髄腫細胞（ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ，　ＲＰＭＩ１６４０，　Ｕ２６６，　ＩＭ９）に添加し、４８時間後に細胞増殖をＭＴＴ　アッセイにて検討すると、クルクミンは濃度依存性に骨髄腫細胞の増殖を抑制した（図７６）。
【０１９３】
ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞を用いてアネキシンＶにより検討したところクルクミンは濃度依存性にアネキシンＶ陽性細胞を誘導した（図７７）。また、ギムザ染色による形態学的観察においても、アポトーシスに特異的な所見が得られた（図７８）。
【０１９４】
クルクミンは時間依存的にカスパーゼ３，　カスパーゼ８活性を誘導した（図７９，８０）。
【０１９５】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・クルクミンは各種骨髄腫細胞株のアポトーシスを早期に誘導した。
・クルクミンによるＨＳ−ｓｕｌｔａｎのアポトーシス誘導はカスパーゼ−８／カスパーゼ−３経路を介していると考えられた。
・ミトコンドリア膜電位の低下、カスパーゼ−９活性化を認めず、ミトコンドリア非依存性のアポトーシス経路が考えられた。
・活性酸素濃度の上昇を認めたが、アポトーシス誘導の直接の原因ではないと考えられた。
・カスパーゼ−８の活性化を認めるが、Ｆａｓ非依存性であり、他のカスパーゼ−８活性化経路の関与が示唆された。
【０１９６】
以上のことから予測される、クルクミンによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導機構のまとめを図８１に示す。
【０１９７】
【発明の効果】
従来の抗癌剤を主体とした治療法に対し抵抗性の造血器腫瘍患者や、副作用の強い症例に対し、食品成分でもある唐辛子成分カプサイシン、食用生姜成分１’−アセトキシチャビコールアセテート、コーヒー成分カフェイン、緑茶成分カテキン及びウコン成分クルクミンおよびそれらの誘導体は抗腫瘍効果を有し、有効な副作用の少ない治療法となる。また、造血器腫瘍の治療成績の向上が期待できる。さらに、免疫抑制剤としても有用である。また、カプサイシン、カフェイン、カテキンおよびそれらの誘導体は、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても有用である。
【０１９８】
【配列表】

【０１９９】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０２００】
【配列番号２】
配列番号２は、コントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０２０１】
【配列番号３】
配列番号３は、ミスマッチオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するＣＡＰの効果を示す。
【図２】ＮＢ４細胞１×１０^４／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して培養した時の培養時間と細胞数を示す。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図３】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　０μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１０００μＭを添加して培養した時のＣＡＰ濃度とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図４】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、７２時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図５】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　０μＭ（コントロール）、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１ｍＭを添加して培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図６】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のラダー形成の結果を示す。
【図７】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図８】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞周期の解析結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図９】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図１０】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図１１】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す。
【図１２】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間培養した時のプロカスパーゼ３と活性型カスパーゼ３の発現解析の結果を示す。
【図１３】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のアポトーシス関連タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図１４】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して９時間培養した時のミトコンドリア膜電位（低膜電位の占有率）を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図１５】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、２４時間、４８時間培養した時のチトクロームＣ及びβ−アクチンの発現解析の結果を示す。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図１６】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の細胞周期関連タンパク質の発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す。
【図１７】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のｐ５３関連タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図１８】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＣＡＰ　１００μＭを添加して、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３並びにｐ５３の発現解析の結果を示す。
【図１９】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ワートマニン（ｐ５３リン酸化酵素の阻害剤）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２０】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ピフィスリンα（ｐ５３に対する特異的阻害剤）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２１】ＣＡＰによる細胞周期の停止に対する、ピフィスリンα（ｐ５３に対する特異的阻害剤）の効果を示す（右下）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）（左上）、ＣＡＰ　１００μＭのみ添加（右上）、ピフィスリンα　１００　ｎＭのみ添加（左下）の結果も併せて示してある。
【図２２】ｐ５３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果（アポトーシス、細胞周期の停止）をまとめた。
【図２３】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ｐ５３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す。
【図２４】細胞内活性酸素の産生に対する、ＣＡＰの効果を示す。
【図２５】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（グルタチオン前駆体）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２６】ＣＡＰによる細胞周期の停止に対する、ＮＡＣの効果を示す（右下）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）（左上）、ＣＡＰ　１００μＭのみ添加（左下）、ＮＡＣ　１００　μＭのみ添加（右上）の結果も併せて示してある。
【図２７】白血病および骨髄腫患者の骨髄細胞におけるｐ５３及びβ−アクチンの発現解析の結果を示す。
【図２８】白血病患者の骨髄細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭを添加して、４８時間培養した時の、ＣＡＰ濃度とＭＴＴ　アッセイにおけるＯＤ_４５０値を示す。
【図２９】白血病患者の末梢血細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して培養した時の培養時間とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図３０】白血病患者の骨髄細胞１×１０^７／ｍｌに、ＣＡＰ　１００μＭを添加して、２４時間培養した時の、アネキシンＶ陽性の細胞数を示す（灰色の線）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（黒色の線）。
【図３１】白血病患者の骨髄細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　０μＭ（コントロール）、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して４８時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図３２】白血病患者の骨髄細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　０μＭ（コントロール）、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して４８時間培養した時のアポトーシス（％）の結果を示す。
【図３３】ＣＭＬ　ＣＰ患者の末梢血細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して０時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の培養時間とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図３４】ＰＬＬ患者の末梢血細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して０時間、２４時間、４８時間培養した時の培養時間と細胞生存率（％）を示す。
【図３５】正常者の末梢血細胞１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ　１０μＭ、１００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間培養した時の、培養時間とＭＴＴ　アッセイのＯＤ_４５０値を示す。
【図３６】ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激により活性化したリンパ球　１　ｘ　１０^６／ｍｌにＣＡＰ　１００　μＭを添加し、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。コントロール（上）、ＣＡＰを添加（上から２段目）、ＰＨＡによる活性化リンパ球（上から３段目）、活性化リンパ球にＣＡＰ添加（下段）
【図３７】ＣＡＰの作用機序を説明するスキームである。
【図３８】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す（ＦＡＣＳ解析による）。
【図３９】急性骨髄性白血病および急性前骨髄球性白血病患者サンプルへのカプサイシンの効果（アポトーシス誘導）を示す。
【図４０】多発性骨髄腫患者サンプルへのカプサイシンの効果を示す。
【図４１】各種造血器腫瘍細胞株１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ　０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭを添加して培養した時のＡＣＡ濃度と細胞数を示す（左図）。各種造血器腫瘍細胞株１×１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して、０時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間培養した時の培養時間と細胞数を示す（右図）。
【図４２】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞およびＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して、４時間または１２時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（左　ＮＢ４細胞／右　ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（上）。
【図４３】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して、各種時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。
【図４４】ＡＣＡによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す。
【図４５】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間、１２時間培養した時のカスハ゜ーセ゛３および８タンパクの発現解析の結果を示す。
【図４６】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して、０時間、１時間、３時間培養した時の総Ｂａｘ、ミトコンドリア分画及び細胞質分画のＢａｘ、細胞質分画のチトクローム　ｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの発現解析の結果を示す。
【図４７】細胞内活性酸素の産生に対する、ＡＣＡの効果を示す。
【図４８】ＡＣＡによるアポトーシスに対する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（グルタチオン前駆体）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図４９】ＮＢ４における、ＡＣＡによるＦａｓ発現に対する効果を示す（左図）。また、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎにおける、ＡＣＡによるＦａｓ発現に対する効果を示す（右図）。
【図５０】ＮＢ４における、抗Ｆａｓ抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト）のアポトーシスの誘導／抑制効果を示す。
【図５１】多発性骨髄腫患者の末梢血細胞（左図）および白血病患者の骨髄細胞（右図）１×１０^７／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ　０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭを添加して、２４時間培養した時の、ＡＣＡ濃度とＭＴＴ　アッセイにおけるＯＤ_４５０値を示す。（左図）
【図５２】ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激により活性化したリンパ球１×１０^６／ｍｌに、ＡＣＡ　１０μＭを添加して、２４時間培養した時のＭＴＴ　アッセイにおけるＯＤ_４５０値を示す（右の棒）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図５３】ＡＣＡの作用機序を説明するスキームである。
【図５４】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ　０μＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、１μＭ、５μＭおよび１０μＭを添加して培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図５５】ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにＡＣＡ　１０μＭを添加して１２時間培養した時のミトコンドリア膜電位（低膜電位の占有率）を示す（右）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図５６】カフェインがＮＢ４細胞の増殖能（図５６のＡ）、細胞周期（図５６のＢ）に及ぼす影響を示す。図５６のＢは、ＮＢ４細胞１×１０^６／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭを添加して、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図５７】カフェインによるＮＢ４細胞のアポトーシス誘導がミトコンドリア依存性であることを示す。図５７のＡは、ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭを添加して、７２時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。図５７のＢは、ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭを添加して、７２時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。図５７のＣは、ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭを添加して、７２時間培養した時のミトコンドリア膜電位を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。また、チトクロームｃの発現解析結果を枠で囲って上部に示した。
【図５８】カフェイン処理ＮＢ４細胞におけるアポトーシス、細胞周期関連タンパクの発現解析の結果を示す。
【図５９】カフェインによるＮＢ４細胞のアポトーシス誘導におけるｐ５３の意義を示す。図５９のＡは、ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１　μＭを添加して、２４時間培養した時のｐ５３及びβ−アクチンの発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す（ＭＳ）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（ＣＳ）の結果も併せて示してある。図５９のＢは、ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１　μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す（ＡＳ＋カフェイン）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（カフェイン）の結果も併せて示してある。図５９のＣは、ＮＢ４細胞１×１０^５／ｍｌにカフェイン　４　ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１　μＭを添加して、２４時間培養した時のｐＴｙｒ−ｃｄｃ　２、ｃｄｃ　２及びβ−アクチンの発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す（カフェイン＋ＡＳ）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（カフェイン）の結果も併せて示してある。
【図６０】緑茶に含まれる多価ポリフェノールのうち主なものの構造式を示す。
【図６１】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するＥＧＣＧの効果を示す。左図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌに、それぞれ、ＥＧＣＧ　０、１０、２０及び５０μＭを添加して、２４時間培養した時のＥＧＣＧ濃度とＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。右図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　１０μＭを添加して培養した時の培養日数とＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。
【図６２】各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　１０μＭ又は２０μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある。
【図６３】各種造血器腫瘍細胞株１×１０^５／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある。
【図６４】各種造血器腫瘍細胞株２×１０^５／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、３時間（Ｕ９３７細胞については１２時間）培養した時のラダー形成の結果（ＥＧＣＧ　２０μＭ　３ｈｒ）を示す。ＥＧＣＧの添加なしの結果（コントロール）も併せて示してある。さらに、各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭ及びカタラーゼ　５００Ｕ／ｍｌを添加して、３時間（Ｕ９３７細胞については１２時間）培養した時のラダー形成の結果（ＥＧＣＧ　２０μＭ　＋カタラーゼ）を示す。
【図６５】各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す（右）。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（左）。
【図６６】ＥＧＣＧが誘導するアポトーシスに対する抗酸化剤の効果を示す。各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌに、ＥＧＣＧ　２０μＭ及びカタラーゼ　５００　Ｕ／ｍｌ（ＥＧＣＧ　２０μＭ＋ｃａｔａｌａｓｅ　５００　Ｕ／ｍｌ）又はＳＯＤ　５００　Ｕ／ｍｌ（ＥＧＣＧ　２０μＭ＋ＳＯＤ　５００　Ｕ／ｍｌ）を添加して、２４時間培養した時のＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）、ＥＧＣＧのみ添加（ＥＧＣＧ　２０μＭ）の結果も併せて示してある。
【図６７】各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、６時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図６８】ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭ及びカスパーゼ阻害剤カスパーゼ−３阻害剤　１０　μＭ，　カスパーゼ−８阻害剤　２０　μＭ，　カスパーゼ−９阻害剤　５０　μＭを添加して、２時間培養した時にアポトーシス誘導が見られた細胞の百分率を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）、ＥＧＣＧのみ添加（ＥＧＣＧ　２０μＭ）の結果も併せて示してある。
【図６９】細胞内活性酸素の産生（ＲＯＳ）及びミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）に対する、ＥＧＣＧの効果を示す。左図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、３時間培養した時の活性酸素の産生を示す。右図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、３時間培養した時のミトコンドリア膜電位の低下を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（黒ベタで表示）。
【図７０】細胞内活性酸素の産生及びミトコンドリア膜電位に対する、ＥＧＣＧの効果の経時変化を示す。上図は、ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、３時間、６時間及び１２時間培養した時の活性酸素の産生を示す。下図は、ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、３時間、６時間及び１２時間培養した時のミトコンドリア膜電位の低下を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（黒ベタで表示）。
【図７１】上図は、ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果を示す。下図は、ＵＦ−１細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞またはＵＦ−１細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭ及びカタラーゼ　５００　Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ　２０μＭ　＋　カタラーゼ５００　Ｕ／ｍｌ）も示す（上図及び下図）。
【図７２】ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のｐ５３、ｐ２７、アクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭ及びカタラーゼ　５００　Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時のｐ５３、ｐ２７、アクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ　２０μＭ　＋カタラーゼ　５００　Ｕ／ｍｌ）も示す。
【図７３】上図は、ＮＢ４細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、０時間、３時間培養した時の細胞質（Ｃｙｔｏｃｏｌｉｃ　ｃｙｔ．ｃ）及びミトコンドリア（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｙｔ．ｃ）におけるチトクロームｃならびにアクチンの発現解析の結果を示す。下図は、ＵＦ−１細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭを添加して、０時間、３時間培養した時の細胞質及びミトコンドリアにおけるチトクロームｃ　ならびにアクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞またはＵＦ−１細胞２×１０^４／ｍｌにＥＧＣＧ　２０μＭ及びカタラーゼ　５００　Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時の細胞質及びミトコンドリアにおけるチトクロームｃならびにアクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ　２０μＭ　＋　カタラーゼ５００　Ｕ／ｍｌ）も示す（上図及び下図）。
【図７４】ＥＧＣＧの作用機序を説明するスキームである。
【図７５】クルクミンの構造式を示す。
【図７６】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するクルクミンの効果を示す。各種造血器腫瘍細胞株１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン　０、５、１０及び２０μＭを添加して、４８時間培養した時のＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。
【図７７】上図は、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン　５、１０及び２０μＭを添加して、１２時間培養した時のアネキシン　ＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。下図は、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン　５、１０及び２０μＭを添加して、１２時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。クルクミンの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（上図及び下図）。
【図７８】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌにクルクミン　１０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（右）。クルクミンの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（左）。
【図７９】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌにクルクミン１０　μＭを添加して、０、１，３、６時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図８０】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０^５／ｍｌにクルクミン　１０μＭを添加して、０、１，３、６時間培養した時のカスパーゼ８の活性を示す。
【図８１】クルクミンの作用機序を説明するスキームである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a therapeutic agent for hematopoietic tumors, an immunosuppressant, and a molecular target therapeutic agent targeting p53. More specifically, the present invention relates to a compound capable of activating caspase or a pharmacologically acceptable salt thereof. The present invention relates to a therapeutic agent for hematopoietic tumors, an immunosuppressant, and a molecular target therapeutic agent targeting p53.
[0002]
[Prior art]
Various treatments are currently being applied to hematopoietic tumors such as leukemia, multiple myeloma, and malignant lymphoma, including chemotherapy with anticancer drugs and hematopoietic stem cell transplantation. Due to various problems such as resistance problems and fatal complications such as graft-versus-host disease at the time of hematopoietic stem cell transplantation, the long-term survival rate of patients with the disease is still low. Therefore, it is indispensable to develop a new treatment for hematopoietic tumors with few side effects, which is replaced by hematopoietic stem cell transplantation or treatment with anticancer agents. To date, there have been many reports of chemicals that suppress the growth of tumor cells, but very few have actually been put into practical use, and their molecular mechanisms are still largely unknown. There is also a need for inventions of new molecular targeted therapies that target only the involved molecules.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a new therapeutic agent for hematopoietic tumors with few side effects.
[0004]
Another object of the present invention is to provide a new immunosuppressant having few side effects.
[0005]
It is a further object of the present invention to provide a molecularly targeted therapeutic agent that targets a molecule involved in the growth of new hematopoietic tumor cells with few side effects.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have made intensive efforts to solve the above-mentioned problems, and as a result, a chili pepper component capsaicin, an edible ginger component 1′-acetoxychavicol acetate, a coffee component caffeine, a green tea component catechin, and a turmeric component curcumin are used as hematopoietic tumors. It was found that the proliferation of cells was suppressed. It was also confirmed that these compounds produce active oxygen, activate caspases, and induce apoptosis in cells. The present invention has been completed based on these findings.
[0007]
The gist of the present invention is as follows.
(1) A therapeutic agent for hematopoietic tumors, comprising a compound capable of activating caspase or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(2) The compound capable of activating caspase is at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, 1′-acetoxychavicol acetate, caffeine, catechin, curcumin, and derivatives thereof (1) The therapeutic agent as described.
(3) An immunosuppressant containing a compound capable of activating caspase or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(4) The compound capable of activating caspase is at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, 1′-acetoxychavicol acetate, caffeine, catechin, curcumin and derivatives thereof (3) The immunosuppressant according to any one of the preceding claims.
(5) A molecular targeted therapeutic agent targeting p53, comprising at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, caffeine, catechin and derivatives thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[0008]
Caspases are cysteine proteases that are directly involved in the execution of cell death (apoptosis), which are activated by various stimuli and lead to irreversible cell function. Activation of caspase can be confirmed using, for example, a caspase activity kit (Pharmigen).
[0009]
Capsaicin is a food ingredient contained in chili, so treatment of hematopoietic tumors with capsaicin and its derivatives is considered a safe treatment with fewer side effects, unlike conventional chemotherapy with anticancer drugs . Acute oral toxicity of capsaicin (LD₅₀) Is 60-70 mg / kg for rats. The clinical application of capsaicin and its derivatives as new therapeutic agents for hematopoietic tumors is expected to improve the long-term prognosis of hematopoietic tumors. Similarly, capsaicin and its derivatives can be used as a safe immunosuppressant with few side effects and as a molecular target therapeutic drug targeting p53.
[0010]
1′-acetoxychavicol acetate is a food ingredient contained in edible ginger. Therefore, treatment of hematopoietic tumors using 1′-acetoxychavicol acetate and its derivatives is more difficult than conventional chemotherapy with anticancer drugs. However, it is considered a safe treatment with few side effects. Acute oral toxicity of 1'-acetoxychavicol acetate (LD₅₀) Is 1 g / kg for mice and 50 mg / kg or more for intraperitoneal administration. The clinical application of 1'-acetoxychavicol acetate and its derivatives as a new therapeutic agent for hematopoietic tumors is expected to improve the long-term prognosis of hematopoietic tumors. Similarly, 1'-acetoxychavicol acetate and its derivatives can also be used as safe immunosuppressants with few side effects.
[0011]
Caffeine is a component contained in tea, coffee, etc., and therefore, treatment of hematopoietic tumors using caffeine and its derivatives is a safe treatment with few side effects unlike conventional chemotherapy with anticancer drugs It is considered a law. Acute oral toxicity of caffeine (LD₅₀) Is 174 to 210 mg / kg for rats. The clinical application of caffeine and its derivatives as new therapeutic agents for hematopoietic tumors is expected to improve the long-term prognosis of hematopoietic tumors. Similarly, caffeine and its derivatives can be used as a safe immunosuppressant with few side effects and as a molecular target therapeutic drug targeting p53.
[0012]
Catechin is a component contained in green tea, and thus, treatment of hematopoietic tumors using catechin and its derivatives is considered to be a safe treatment with few side effects unlike chemotherapy with conventional anticancer drugs. Acute Oral Toxicity of Tea Distillate Containing Catechin (LD₅₀) Is set to be 32 g / kg or more for rats. The clinical application of catechin and its derivatives as new therapeutic agents for hematopoietic tumors is expected to improve the long-term prognosis of hematopoietic tumors. Similarly, catechin and its derivatives can be used as a safe immunosuppressant with few side effects and as a molecular target therapeutic drug targeting p53.
[0013]
Curcumin is a pigment component contained in turmeric, so treatment of hematopoietic tumors with curcumin and its derivatives is considered a safe treatment with few side effects unlike conventional chemotherapy with anticancer drugs . Turmeric is a member of the genus Curcuma belonging to the ginger family, and about 50 species are recognized worldwide. Turmeric prefers hot and humid, and is widely distributed and cultivated from tropical to subtropical regions in Asia, Africa, India, and Latin America. In Japan, Okinawa and Kagoshima prefectures are the main production areas, and turmeric grown in Japan includes mainly autumn turmeric (scientific name:Curcuma longa L. ) (Okinawa Uchin), Spring Turmeric (scientific name:Curcuma aromatica Salisb) (Kyo-Oh), Purple Turmeric (Gadz) (scientific name:Curcuma Zedoaria Roscoe) There are three types. Acute oral toxicity of curcumin (LD₅₀) Is 5,000 mg / kg for rats and 2,000 mg / kg or more for mice. Clinical application of curcumin and its derivatives as new therapeutic agents for hematopoietic tumors is expected to improve the long-term prognosis of hematopoietic tumors. Similarly, curcumin and its derivatives can also be used as safe immunosuppressants with few side effects.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention provides a therapeutic agent for hematopoietic tumor containing a compound capable of activating caspase or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0015]
The present invention also provides an immunosuppressant containing a compound capable of activating caspase or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0016]
Furthermore, the present invention provides a molecular targeted therapeutic agent targeting p53, comprising at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, caffeine, catechin and derivatives thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof. provide.
[0017]
Caspases 1 to 11 are known as caspases. The compound used in the present invention may activate any one of the above-mentioned caspases, but it activates any one or more of the caspases 3, 8 or 9 And preferably activates caspase-3.
[0018]
Examples of the compound capable of activating caspase include capsaicin, 1'-acetoxychavicol acetate, caffeine, catechin, curcumin, and derivatives thereof.
The structural formula of capsaicin is shown below.
[0019]
Embedded image

Examples of capsaicin and derivatives thereof include compounds represented by the following general formula (I).
[0020]
Embedded image

(Where R¹Is an alkyl or alkenyl group having 6 to 11 carbon atoms;²Is a hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms. )
[0021]
R¹Is an alkyl or alkenyl group having 6 to 11 carbon atoms. Examples of the alkyl or alkenyl group having 6 to 11 carbon atoms include C_6-11Linear or branched alkyl, C_6-11Linear or branched alkenyl (e.g.,-(CH₂)_nCH = CHCH (CH₃)₂(N is an integer of 1 to 6). Preferably, R¹Is-(CH₂)_nCH = CHCH (CH₃)₂(N is an integer of 1 to 6) or an alkyl group.
[0022]
R²Is a hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms (for example, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, a cycloalkyl group having 6 to 12 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 12 carbon atoms, an alkynyl group having 2 to 12 carbon atoms, A cycloalkenyl group having 3 to 12 carbon atoms, an aryl group having 6 to 12 carbon atoms, and an aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms);²Is an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms (specifically, a lower alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, s-butyl, t-butyl). .
[0023]
Examples of pharmacologically acceptable salts of capsaicin and its derivatives include sodium salts, calcium salts, potassium salts, magnesium salts, ammonium salts, lysine salts, arginine salts and the like.
[0024]
Capsaicin and its derivatives can be produced according to the method described in the following literature. Path, @Darling, @Ber. {63, {737} (1930); {Cromovie et al. , J. et al. {Chem. {Soc. $ 1955, $ 1025; P. {Vig et al. , {Indian} J. {Chem. {17B, {558} (1979)
[0025]
In addition, capsaicin and its derivatives can be converted into pharmacologically acceptable salts with acids or bases by conventional methods.
[0026]
Capsaicin and its derivatives and pharmacologically acceptable salts thereof are effective as therapeutics for hematopoietic tumors such as leukemia, multiple myeloma and malignant lymphoma, immunosuppressants, and molecular target therapeutics targeting p53 as a target molecule. is there. These compounds may be used alone or in combination with other agents (eg, chemotherapeutic agents).
[0027]
The structural formula of 1'-acetoxychavicol acetate is shown below.
[0028]
Embedded image

[0029]
Examples of 1'-acetoxychavicol acetate and derivatives thereof include compounds represented by the following general formula (XI).
[0030]
Embedded image

(Where R¹¹And R¹²Is each independently a lower alkyl group or an aromatic ring group. )
[0031]
R¹¹Is a lower alkyl group (e.g., methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, s-butyl, t-butyl, etc._1-4Alkyl group) or an aromatic ring group (for example, C such as phenyl, naphthyl, anthryl, etc.)_6-14An aromatic hydrocarbon residue, an aromatic heterocyclic residue such as pyridyl, furyl, thienyl, imidazolyl, and thiazolyl). Preferably, R¹¹Is a lower alkyl group. More preferably, R¹¹Is a methyl group.
[0032]
R¹²Is a lower alkyl group (e.g., C, such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, s-butyl, t-butyl, etc.)._1-4Alkyl group) or an aromatic ring group (for example, C such as phenyl, naphthyl, anthryl, etc.)_6-14An aromatic hydrocarbon residue, an aromatic heterocyclic residue such as pyridyl, furyl, thienyl, imidazolyl, and thiazolyl). Preferably, R¹²Is a lower alkyl group. More preferably, R¹²Is a methyl group.
[0033]
Examples of the pharmacologically acceptable salts of 1′-acetoxychavicol acetate and its derivatives include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and basic or acidic amino acids. And the like. Preferable examples of the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt. Preferred examples of the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, and the like. Preferred examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like. Preferred examples of salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- Salts with toluenesulfonic acid and the like can be mentioned. Preferred examples of the salt with a basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like. Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. .
[0034]
1'-acetoxychavicol acetate and its derivatives can be produced according to the method described in the following literature.
-Biosci. ＴｅBiotech. Biochem. , $ 57 (8), $ 1344-1345, $ 1993
-JP-A-2002-78464
[0035]
In addition, 1'-acetoxychavicol acetate and its derivative can be converted into a pharmacologically acceptable salt with an acid or base by a conventional method.
[0036]
1'-acetoxychavicol acetate and its derivatives and pharmacologically acceptable salts thereof are effective as therapeutic agents for hematopoietic tumors such as leukemia, multiple myeloma, and malignant lymphoma, and immunosuppressants. These compounds may be used alone or in combination with other agents (eg, chemotherapeutic agents).
[0037]
The structural formula of caffeine is shown below.
[0038]
Embedded image

[0039]
Examples of caffeine and its derivatives include a xanthine derivative represented by the following general formula (XXI).
[0040]
Embedded image

(Where R²¹Is a methyl group or a hydrogen atom;²²Is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may be substituted by one or two hydroxy groups or an alkanoyl group having 2 to 10 carbon atoms. )
[0041]
Examples of the xanthine derivative represented by the general formula (XXI) include, in addition to caffeine, xanthine, aminophylline, tephylline, choline theophylline, theovobromine, oxtrifin, diprofin, proxyphilin, and the like. These compounds are commercially available and available.
[0042]
Examples of pharmacologically acceptable salts of caffeine and its derivatives include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. Can be Preferable examples of the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt. Preferred examples of the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, and the like. Preferred examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like. Preferred examples of salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- Salts with toluenesulfonic acid and the like can be mentioned. Preferred examples of the salt with a basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like. Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. .
[0043]
Caffeine and its derivatives are commercially available and available.
[0044]
Caffeine and its derivatives can be converted into pharmacologically acceptable salts with acids or bases by a conventional method.
[0045]
Caffeine and its derivatives and pharmacologically acceptable salts thereof are effective as therapeutics for hematopoietic tumors such as leukemia, multiple myeloma, and malignant lymphoma, immunosuppressants, and molecular target therapeutics targeting p53 as target molecules. is there. These compounds may be used alone or in combination with other agents (eg, chemotherapeutic agents).
[0046]
Catechin and its derivatives generally mean water-soluble natural polyphenols widely contained in trees, but the present specification includes not only those natural polyphenols but also compounds derived therefrom. .
. Specifically, epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, catechin, gallocatechin, epicatechin digallate, epigallocatechin digallate and the like can be exemplified, and (-)-epicatechin, (-)-Epigallocatechin, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin gallate, (+)-catechin, (+)-gallocatechin, (-)-epicatechin digallate and (-)- Optical isomers such as epigallocatechin digallate exist. Some of them are shown below.
[0047]
Embedded image

[0048]
Pharmacologically acceptable salts of catechin and its derivatives include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. . Preferable examples of the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt. Preferred examples of the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, and the like. Preferred examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like. Preferred examples of salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- Salts with toluenesulfonic acid and the like can be mentioned. Preferred examples of the salt with a basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like. Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. .
[0049]
Catechin and its derivatives are known to be contained in tea buds in large amounts, and can be obtained as crude catechins by extraction from tea buds. Methods for obtaining higher purity crude catechins are also known.
[0050]
In addition, catechin and its derivatives can be converted to pharmacologically acceptable salts with acids or bases by a conventional method.
[0051]
Catechin and its derivatives and pharmacologically acceptable salts thereof are effective as therapeutic agents for hematopoietic tumors such as leukemia, multiple myeloma, and malignant lymphoma, immunosuppressants, and molecular target therapeutics targeting p53 as target molecules. is there. These compounds may be used alone or in combination with other agents (eg, chemotherapeutic agents).
[0052]
The structural formula of curcumin is shown below.
[0053]
Embedded image

[0054]
Examples of curcumin and derivatives thereof include compounds represented by the following general formula (XXXI).
[0055]
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(Wherein, where R³¹, R³², R³³And R³⁴Are the same or different and are a hydrogen atom, a hydroxy group or a lower alkoxy group. )
[0056]
R³¹, R³², R³³And R³⁴The alkyl moiety of the lower alkoxy is a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl and the like. As specific alkoxy groups, methoxy groups and ethoxy groups having 1 to 2 carbon atoms are preferable. In the formula (XXXI), R³²And R³⁴Is preferably a hydroxy group.
[0057]
Examples of the compound represented by the general formula (XXXI) include U1 [diferuloylmethane, (E, E) -1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1,6-heptadiene. -3,5-dione, hereinafter sometimes simply referred to as curcumin], U2 [dimethoxycurcumin, bis (4-hydroxy-3-methoxycinnamoyl) methane], U3 [bisdemethoxycurcumin, bis (4-hydroxycinnamoyl) methane], DMU1 [(E, E) -1,7-bis (3,4-dimethoxyphenyl) -1,6-heptadiene-3,5-dione], DHU1 [(E, E) -1,7-bis (3,4-dihydroxyphenyl) 1,6-heptadiene-3,5-dione] curcumin analogue compound of the like, U1, U2, U3 and DHU1 are preferably used, U1 is particularly preferably used.
[0058]
The pharmacologically acceptable salts of curcumin and its derivatives include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. . Preferable examples of the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt. Preferred examples of the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, and the like. Preferred examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like. Preferred examples of salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- Salts with toluenesulfonic acid and the like can be mentioned. Preferred examples of the salt with a basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like. Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. .
[0059]
Curcumin is a tropical ginger turmeric (Curcuma longaL. ), A dry pigment of turmeric rhizome and curcumin purified therefrom are commercially available.
[0060]
Curcumin and its derivatives can be converted into pharmacologically acceptable salts with acids or bases by a conventional method.
[0061]
Curcumin and its derivatives and pharmacologically acceptable salts thereof are effective as therapeutic agents for hematopoietic tumors such as leukemia, multiple myeloma, and malignant lymphoma, and immunosuppressants. These compounds may be used alone or in combination with other agents (eg, chemotherapeutic agents).
[0062]
Compounds capable of activating caspases and pharmacologically acceptable salts thereof may be orally administered in the form of tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like, or may be administered as injections, suppositories. And parenteral administration by intraperitoneal or intravenous injection, rectal administration and the like.
[0063]
Formulation of a compound capable of activating caspase and a pharmacologically acceptable salt includes excipients (sugars such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, starch such as potato, wheat, corn, calcium carbonate, calcium sulfate). , Inorganic substances such as sodium bicarbonate, crystalline cellulose, etc.), binders (starch paste, gum arabic, gelatin, sodium alginate, methylcellulose, ethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol, hydroxypropylcellulose, carmellose, etc.), lubricants ( Magnesium stearate, talc, hydrogenated vegetable oil, macrogol, silicone oil), disintegrant (starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, CMC · Na, CMC · Ca, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate Sodium alginate), flavoring agents (lactose, sucrose, glucose, mannitol, aromatic essential oils, etc.), solvents (water for injection, sterile purified water, sesame oil, soybean oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil, etc.), stabilizers ( Inert gases such as nitrogen and carbon dioxide, chelating agents such as EDTA and thioglycolic acid, reducing substances such as sodium bisulfite, sodium thiosulfate, L-ascorbic acid, Rongalit, etc.), preservatives (paraoxybenzoate, chloroform) Butanol, benzyl alcohol, phenol, benzalkonium chloride, etc., surfactants (hydrogenated castor oil, polysorbate 80, 20, etc.), buffers (citric acid, acetic acid, sodium salt of phosphoric acid, boric acid, etc.), dilution It is carried out by a known method using a pharmaceutical additive such as an agent.
[0064]
Administration of a compound capable of activating caspase and a pharmacologically acceptable salt thereof to a human depends on the severity of the disease state and the responsiveness of the living body. The dose, administration method and frequency may be adjusted appropriately over the period until the alleviation of the condition is achieved. For example, for adults, capsaicin and its derivatives can be administered at a dose of about 0.1-2000 mg / kg (body weight) per day, preferably about 1-1000 mg / kg (body weight) per day. -For acetoxychavicol acetate and its derivatives at a dose of about 0.01 to 2000 mg / kg (body weight) per day, preferably about 0.1 to 1000 mg / kg (body weight) per day, For catechins and their derivatives, at doses of about 0.1 to 2000 mg / kg (body weight) per day, preferably about 1 to 1000 mg / kg (body weight) per day. About 0.01 to 2000 mg / kg (body weight) per day, preferably about 0.1 to 1000 mg / kg (body weight) per day. In terms of amount, for curcumin and their derivatives, a dose of about 0.01 to 2000 mg / kg (body weight) per day, preferably about 0.1 to 1000 mg / kg (body weight) per day. It may be administered once or several times by intravenous injection, and the dose and frequency of administration may be appropriately changed depending on symptoms, age, administration method and the like.
[0065]
The molecular target therapeutic agent of the present invention includes p53-related diseases, for example, hematopoietic tumors (eg, leukemia, multiple myeloma, malignant lymphoma, etc.), skin cancer, colon cancer, gastric cancer, liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, It can be used for the treatment of thyroid cancer, kidney cancer, prostate cancer, bladder cancer, brain tumor and the like.
[0066]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples. These examples are for explaining the present invention, but do not limit the scope of the present invention.
[0067]
[Example 1]
1. Materials and methods
(1) Material
-Capsaicin: Wako @ chemical. Co. Available from よ り (Tokyo, Japan)
・ Various hematopoietic tumor cell lines:
NB4 @ Dr. M. Courtesy of Lanotte (St. Louis Hospita., Paris, France)
HL-60: obtained from American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD)
UF-1: cell line established in our laboratory
K562, KU812, U266: obtained from RIKEN Cell Bank
・ Caspase inhibitors
Z-VAD, Kasbase 9 inhibitor, Kasbase 8 inhibitor: obtained from MBL
・ Wortmannin: obtained from Sigma @ Chemical (St. Louis, MO)
・ Pifithrin α: obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)}
NAC (N-acetylcysteine): obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)}
BSO (buthionine sulfoxide): obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)} DNA microarray: TOYOBO {Co. Obtained from Ltd
・ Leukemia patient sample: Peripheral blood or bone marrow blood obtained from inpatients and outpatients of Keio University Hospital with written consent
・ Normal sample: obtained from volunteers with explanation and consent
PHA (phytohemagglutinin): obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)}
[0068]
(2) Experimental method
Experiment to investigate the growth inhibitory effect and induction of apoptosis on various hematopoietic tumor cell lines: By adding 100 μM of capsaicin, various hematopoietic tumor cell lines (1 × 10⁴/ Ml), capsaicin is added and cultured at 100 μM, and the number of cells is calculated using trypan blue staining.
[0069]
Experiment for examining cell cycle: 1 hour after 1 hour of culture with addition of capsaicin 100 μM⁵Are collected and the cell cycle is analyzed by FACS using PI (final concentration 0.5 μg / ml) as a marker using ModiFIT (registered trademark) (Beckman Coulter).
[0070]
Experiment to examine DNA ladder formation: NB4 cells 1 × 10⁵After adding 0, 24, 48, and 72 hours, 100 µM of CAP was added to the DNA / ml, DNA was collected, electrophoresed on a 2% agarose gel, and examined for ladder formation.
[0071]
Experiment to examine cell morphology: NB4 cell 1X10⁴The cells were centrifuged on a slide glass by cytospin, stained with Giemsa and stained with an optical microscope (1 × 10⁴X) Observe.
[0072]
Experiment of Annexin V, PI (Propium Iodide) staining: 1 × 10⁵Are collected and analyzed by FACS using Annexin V (Pharmingen) and PI (final concentration 0.5 μg / ml) as markers to measure the proportion of Annexin V positive cells.
[0073]
Experiment for investigating caspase 3 activity: After each hour of culture with addition of capsaicin 100 μM, 5 × 10⁵Are collected, and the activity is measured by FACS using a Kasperase 3 activity kit (Pharmingen).
[0074]
Expression analysis (Western blot analysis) (procaspase 3 and caspase 3 active form, apoptosis-related proteins, cytochrome c and β-actin, cell cycle-related proteins, p53-related proteins, phosphorylated p53, β of Ser９6,9,20,37 -Actin and p53) After each hour of culture with the addition of capsaicin (100 µM), proteins are collected, and proteins in each lane (15 µg) are electrophoresed and analyzed using various antibodies.
[0075]
Experiment for examining changes in mitochondrial membrane potential: 5 x 10⁵Of the cells, rhodamine 123 (final concentration: 10 μM) is administered, and the mixture is left at 37 ° C. for 15 minutes. After centrifugation at 1500 g for 5 minutes, the supernatant is discarded, the precipitate is suspended in PBS, PI (final concentration 10 μM) is added, and analysis is performed by FACS.
[0076]
Analysis of active oxygen: After each hour of culture with addition of capsaicin 100 μM, 5 × 10⁵Are collected and analyzed by FACS using dihydroethidium (final concentration 10 μM) as a marker.
[0077]
MTT assay: After each hour of culture with addition of capsaicin 100 μM, 100 μl of the culture solution was transferred to a 96-well plate, and 10 μl of MTT labeling reagent (1X) was added according to the experimental method of “MTT cell proliferation kit (Roche)” and allowed to stand at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, 100 μl of MTT lysis buffer was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C.₄₅₀The values are analyzed on a plate reader (BioRad).
[0078]
2. result
The effect of capsaicin on the growth of various hematopoietic tumor cell lines is shown in FIG. By adding 100 μM capsaicin (hereinafter referred to as “CAP”) to culture, various hematopoietic tumor cell lines (1 × 10⁴/ Ml), a strong growth inhibitory effect was observed.
[0079]
The results of examining the cell cycle and apoptosis of NB4 cells at various concentrations of CAP and various culture times are shown in FIGS.
[0080]
From FIG. 2, it can be seen that the culture with CAP @ 100 μM added has a superior cell growth inhibitory effect as compared to the control (base: ethanol 0.01%).
[0081]
FIG. 3 shows that CAP induces apoptosis in a concentration-dependent manner.
[0082]
FIG. 4 shows that the culture supplemented with CAP @ 100 μM stops the cell cycle at the G1 phase in a time-dependent manner and increases the pre-G1 phase corresponding to apoptosis.
[0083]
FIG. 5 shows that CAP increases cell cycle arrest to G1 phase and apoptosis in a concentration-dependent manner.
[0084]
2 to 5, it was found that CAP induces apoptosis in a concentration-dependent manner and in a time-dependent manner, and arrests the cell cycle in the G1 phase (G1１arrest).
[0085]
NB4 cell 1X10⁵The results of examining the DNA ladder formation after 0, 24, 48, and 72 hours after adding 100 μM of CAP / ml to FIG. 6 are shown in FIG. Was.
[0086]
NB4 cell 1X10⁵FIG. 7 shows the results of observing the cell morphology after adding CAP at 100 μM / ml and culturing for 24 hours. The NB4 cell line after the culture with the addition of CAP (100 μM for 24 hours) showed nuclear enrichment and fragmentation typical of apoptosis.
[0087]
NB4 cell 1X10⁴FIG. 8 shows the results of analyzing the cell cycle by adding CAP 100 μM / ml and culturing for 24 hours. Analysis of the cell cycle showed an increase in the Sub @ G1 fraction showing apoptosis 24 hours after administration of CAP @ 100 uM with a decrease in the G1@arrest.S phase.
[0088]
Further, FIG. 9 shows the results of examination of early apoptosis by Annexin V and ΔPI staining using flow cytometry (FACS). After CAP administration, an increase in Annexin V positive cells was observed over time. The above results indicate that CAP arrests the cell cycle of NB4 cells in the G1 phase and suppresses proliferation through induction of apoptosis.
[0089]
Next, an analysis on the mechanism of apoptosis induction by CAP was performed. First, activation of caspase 3 was examined using FACS. The results are shown in FIG. 3 hours after the administration of CAP @ 100 μM, activation of Kaposase-3 was observed. An increase over time was observed.
[0090]
The study was conducted using various caspase inhibitors (Z-VAD, Kasbase 9 inhibitor). The results are shown in FIGS. Apoptosis caused by CAP was released by the administration of the Kasperase # 3 and # 9 inhibitors (FIG. 11). Also, after 48 hours, an active form of 17 kD caspase 3 was recognized by Western blot analysis (FIG. 12). On the other hand, when caspase # 3 and pan-caspase inhibitors were administered, apoptosis was reduced by FACS analysis although cell growth inhibition was not released (FIG. 38). The above results indicate that caspase-3, 9 is involved in apoptosis in NB4.
[0091]
Next, FIG. 13 shows the results obtained by examining apoptosis-related proteins. Bcl-2 and ΔBcl-xL did not show any change in expression, but as shown in FIG. 17, an increase in the expression of Bax that promotes apoptosis induction over time was observed. The appearance of caspase-3 active form was also observed. (FIG. 12)
From the above results, it was shown that capsaicin activates caspersase 9 via Bax protein, activates caspersase 3, and induces apoptosis.
[0092]
CAP → Bax → Caspase 9 → Caspase 3 → Apoptosis
[0093]
FIG. 14 shows the results of examining the change in mitochondrial membrane potential. Nine hours after administration of CAP @ 100 μM, a decrease in mitochondrial membrane potential was observed, and an increase in the expression of cytochrome c in the cytoplasmic fraction over time was observed (FIG. 15). From the above results, it was suggested that apoptosis by CAP is mediated by a decrease in mitochondrial membrane potential via Bax, release of cytochrome c, and caspase # 9 and caspase # 3.
[0094]
Next, the results of examining cell cycle-related proteins are shown in FIG. When CAP @ 100 μM was administered, p21 increased over time and cyclinD1 decreased over time. On the other hand, p27 and cyclinΔA, B1, D2, D3, and E did not show any change in expression over time. In addition, reduction in phosphorylation of Rb (retinoblastoma) protein was also observed. (Data not shown)
The above results suggested that CAP causes G1 @ arrest through increase in p21, decrease in cyclin @ D1, and dephosphorylation of Rb protein.
[0095]
CAP → p21 ↑, cyclinD1 ↓ → G1 arrest
[0096]
As described above, HL-60 and UF-1 which are APL cell lines and K562 and KU812 which are CML cell lines are less sensitive to CAP than NB4 cells. K562 ・ HL60
In p53, deficiency and dysfunction of p53 have been reported (Trepel @ M, @ Scheding @ S, @ Glossurth @ P, @ Hornary @ HP, @ Mlipiero @ U, @ Brugger @ W, @ Dichgans @ J, @ Weller @ M @@@@@@@@@@@@@@@. Leukemia 1997; 11 (11): 1842-9. Shimiz T, Pommier Y. . I: effects of the protease inhibitors Z-VAD-fmk and dichloroisocoumarin suggest an involvement of voth caspases and serine proteases Leukemia 1997; 11 (8): 1238-44). Thus, the present inventors analyzed the expression of p53 in NB4, UF-1, and KU812, and found that mRNA expression was not observed in KU812 (data not shown). In HL-60, UF-1, and U266, the expression of p53 protein was not observed (data not shown). In addition, an increase in p21 and a decrease in cyclinD1 over time observed in the analysis of cell cycle-related proteins and a relationship between p53 and p53 have been reported previously (Li Y, Jenkins CW, Nichols MA, Xiong Y. Cell cycle). expression @ and @ p53 @ regulation @ the @ cyclin-dependent @ kinase @ inhibitor @ p21. @ Oncogene @ 1994; 9 (8): 2261-8). Based on the above results, we decided to proceed with the investigation of the possibility of p53 being involved in apoptosis of NB4 cells in CAP. On the other hand, in NB4 cells, expression of mRNA and protein of wild-type p53 was observed (data not shown).
[0097]
First, the present inventors analyzed the expression of p53 and its related proteins in NB4 cells when CAP @ 100 μM was administered by Western blot analysis. The results are shown in FIG. With the administration of CAP {100 μM, an increase in the p53 protein over time was observed. On the other hand, no change in expression was observed in MDM2 and p73.
[0098]
As a mechanism of p53 activation, phosphorylation of a serine residue (Ser) has been known for a long time (Banin, {Set et al. (1998)} Enhanced Phosphorylation of p53 by ATM ATM in response DNA DNA, 74, 28, Science 16-28. 1677)). It has been reported that the phosphorylation of serine residues is involved in the activation of p53 upon DNA damage, irradiation, and administration of various anticancer agents (such as hydroxyurea). (Banin, S et al. (1998) Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in responseto DNA damage. Science, 281, 1674-1677Canman, et al (1998) Activation of the ATM kinase by ionising radiationand phosphorylation of p53, Science, 281, 1677-1679). Thus, the present inventors analyzed the phosphorylation of p53 when CAP @ 100 μM was administered. FIG. 18 shows the results. A time-dependent increase in the phosphorylation of Ser # 15 upon administration of CAP # 100 μM was observed. On the other hand, there was no change over time in the phosphorylation of Ser @ 6, 9, 20, and 37.
[0099]
These results suggest that administration of capsaicin phosphorylates serine 15 residues of p53 protein, increases p53 protein, increases p21, decreases cyclinｌD1, and arrests the cell cycle in the G1 phase. Was.
[0100]
Recently, pifithrin α (PFTα) has been reported as an inhibitor of p53. ....... (Komarov PG Komarova EA Kondratov RV Christov-Tselkov K. Coon JS Chernov MV Gudkov AV A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer thrapy Science 1999; 285 (5434): 1733- 7) Although PFTα does not change the expression of p53 itself, it is said to inhibit the action of p53 by suppressing the expression of downstream molecules such as p21 and Bax. Thus, the present inventors examined whether PFTα could be used to suppress the association of p53 in apoptosis of NB4 cells by CAP. The results are shown in FIGS. Administration of P53α inhibitor PFTα (100 nM 3 hours before administration) inhibited CAP-induced apoptosis of NB4 cells and G1 arrest. The above results indicate that p53 plays an important role in the effect of CAP on NB4 cells. In addition, when the expressed protein upon administration of PFTα was examined, it was found that the expression of p21, ΔBax was reduced and the increase in expression was suppressed upon administration of CAP (data not shown).
[0101]
Furthermore, the present inventors investigated whether CAP-induced G1 arrest and apoptosis of NB4 cells could be suppressed using p53 antisense. A p53 antisense, a control sense, and a mismatch sense (60% mismatch with antisense) were prepared as follows, and each was administered 1 μM 24 hours before, and the culture was supplemented with RPMI + 5% to reduce the degradation of the antisense. The experiment was performed with FBS + PC / SM.
1) Antisense oligonucleotide
5'-CGGCTCCTCCATGGCAGT-3 '(SEQ ID NO: 1)
2) Control oligonucleotides
5'-CTGAGGCTCTACCGCTGC-3 '(SEQ ID NO: 2)
3) "Mismatch" oligonucleotide
5'-CGGGTCCTCTACGCTAGT-3 '(SEQ ID NO: 3)
[0102]
The results are shown in FIGS. It was found that G1 arrest and apoptosis of NB4 cells by CAP were suppressed in the cells to which antisense was pre-administered. From the above results, it was found that p53 plays an important role in CAP apoptosis to NB4 cells and cell cycle arrest.
[0103]
Production of active oxygen is known as one of the mechanisms of p53 activation (Shackelford, RE, Innes, CL, Siever, SO, Heinloth, AN, Leadon, SA, and Paules, RS (2001) J. Biol.Chem. 276, 21951-21959). In addition, it has been reported that active oxygen plays an important role in inducing apoptosis of various cancer cells by anticancer drugs and radiation and in inducing apoptosis of APL and multiple myeloma cells by arsenite (Dai). J, Weinberg RS, Waxman S, Jing Y. Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arsenic torioxide through modulation of the glutathione redox system.Blood 1999; 93 (1) 268-97). It is also known that NB4 cells have less quaterthione than other leukemia cell lines ((Dai J, Weinberg RS, Waxman S, Jing Y. trioxide | through | modulation | of | the | glutathione | redox | system | Blood | 1999 | 93 (1) 268-97] Therefore, the present inventors analyzed the active oxygen in the apoptotic induction of NB4 cells by CAP. This is shown in Fig. 24. In NB4 cells, CAP @ 100 μM administration 4 After during, increase in intracellular reactive oxygen concentration was observed. Generally SOD in the cell to remove harmful active oxygen, click Bu glutathione, Katarase Bu, there are antioxidants such as Chioreto Bu Xing.
The present inventors have investigated whether apoptosis by CAP can be suppressed by N-acetylcysteine (NAC), which is a qualtathione precursor, or using phythionine sulfoxide (BSO) having qualtathione inhibitory activity (1 mM The relationship between quartathione (GSH) and CAP-induced apoptosis was examined by analyzing whether apoptosis was enhanced. The results are shown in FIGS. It was found that pre-administration of NAC (100 μM for 1 hour before administration), which is a qualtathione precursor, and removal of active oxygen suppressed the induction of apoptosis of NB4 cells by CAP and G1 周期 arrest of the cell cycle.
[0104]
From the above results, the importance of ATR / ATM and other phosphorylating enzymes in the phosphorylation of p53 serine 15 residues was suggested as a mechanism of capsaicin-induced apoptosis of leukemia cells and arrest in the G1 phase of the cell cycle. . In addition, it was shown that the production of active oxygen is involved in the activation of the kinase.
[0105]
As described above, by administration of capsaicin, the p53 serine residue is phosphorylated via active oxygen, ATR / ATM, etc., the Bax protein, the mitochondrial membrane potential is reduced, and the cytosolic system is activated via cytochrome ゜ c release, and apoptosis is induced. It was suggested to be.
[0106]
CAP → reactive oxygen production → ATR → p53 Ser 15 phosphorylation → p53 ↑ → Bax → mitochondrial membrane potential decrease → cytochrome c release → caspase 9 → caspase 3 → apoptosis → p21 ↑, cyclinD1 ↓ → G1 arrest
[0107]
Next, the present inventors examined the effects of CAP on actual patient samples. A total of 11 specimens (including acute myeloid leukemia / acute lymphatic acute leukemia / chronic myelogenous leukemia / myeloma, etc.) were examined for the effects of CAP, including the MTT assay and the annexin V-PI analysis. The effect of CAP was observed in 10 out of 11 samples.
[0108]
FIG. 27 shows the results obtained by examining the expression of p53 in patient samples. Expression of p53 mRNA was observed in 10 samples with the CAP effect, but no expression of p53 was observed in one sample with no effect. From the above results, the relevance of the effect of p53 and CAP was suggested even in actual patient samples.
[0109]
Next, the present inventors examined the effect of CAP on an actual patient sample (Mr. JU). After collecting bone marrow of Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia, it was separated by Ficoll and⁷/ ML with RPMI (+ 20% {FBS + PC / SM), and the effect of each concentration of CAP {10 μM, 50 μM and 100 μM} 24 hours and 48 hours after the day of collection was examined.
[0110]
First, when cell growth inhibition was examined using the MTT assay and cell count, cell growth was inhibited in a concentration-dependent manner (FIG. 28).
[0111]
Next, apoptosis and cell cycle by CAP in this patient sample were examined. The results are shown in FIGS. 24 hours after administration of CAP @ 100 μM, a marked increase in Annexin V-positive cells was observed. After CAP administration, annexin V (+) increased in a concentration- and time-dependent manner (FIG. 29). FIG. 31 shows the results of examination of apoptosis by CAP concentration and Annexin V-PI staining under the conditions of 48 hours of culture, and FIG. 32 shows the relationship between CAP concentration and apoptosis (%).
[0112]
When the presence or absence of p53 expression was examined using this patient sample, normal p53 expression was observed (data not shown).
[0113]
Next, the present inventors examined the effect of CAP in a patient sample of actual chronic myeloid leukemia chronic phase. After collecting the patient's peripheral blood, it was separated by Ficoll and⁷The concentration of CAP (10 μM, 50 μM, and 100 μM) at 24, 48, and 72 hours from the day of collection was examined. The results are shown in FIG. By CAP administration, annexin V (+) was increased in a concentration-dependent and time-dependent manner.
[0114]
Next, we collected peripheral blood of patients with acute promyelocytic leukemia, separated them by Ficoll,⁷/ Ml was diluted with RPMI (+ 20% {FBS + PC / SM), and the effect of each concentration of CAP {10 μM, 50 μM and 100 μM} 24 hours after the day of collection was examined.
[0115]
First, cell growth suppression and apoptosis induction were examined using the MTT assay and annexin V-PI staining method. As a result, no cell growth suppression and no induction of apoptosis occurred (FIG. 34).
[0116]
Examination of the expression of p53 in this sample revealed no expression of p53 mRNA (data not shown).
[0117]
FIG. 39 shows the effect (induction of apoptosis) of capsaicin on acute myeloid leukemia and acute promyelocytic leukemia patient samples. By CAP administration, annexin V (+) was increased in a concentration-dependent manner.
[0118]
Further, the effect of capsaicin on multiple myeloma patient samples is shown in FIG. CAP administration suppressed cell proliferation in a concentration-dependent manner.
[0119]
Next, suppression of cell proliferation by CAP 10 μM and 100 μM in normal peripheral blood mononuclear cells was examined. The results are shown in FIG. No cell growth inhibitory effect by CAP administration was observed.
[0120]
Mononuclear cells were isolated from normal human peripheral blood, stimulated with PHA (phytohemagglutinin), and activated lymphocytes (mainly T cells) 1 × 10⁶FIG. 35 shows the results of the MTT assay when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 24 hours. The MTT assay confirmed that cell proliferation was suppressed and that the apoptotic fraction was increased as shown in FIG. This indicates that CAP suppresses activated T cells. It also had no effect on normal lymphocytes that had not been activated (data not shown). These facts indicate that CAP can be used as an immunosuppressant.
[0121]
From the above results, the following conclusions are drawn.
The chili pepper component CAP induced cell cycle arrest of hematopoietic tumor cells such as NB4 cells and various leukemias that normally express p53 and multiple myeloma.
-It is suggested that the cell cycle arrest by the p21 / cyclinD1 pathway through the activation of p53 and the apoptosis induction pathway by BAX / cytochrome c / caspase-3 play important roles in the induction. Was.
[0122]
The above results suggest that p53 plays an important role as a target molecule for inducing apoptosis in hematopoietic tumor cells such as NB4 cells and various leukemias and multiple myeloma that normally express p53. .
[0123]
The mechanism of action of CAP, predicted from the above results, is summarized in FIG. In NB4 cells, CAP produces active oxygen intracellularly (or in mitochondria) and phosphorylates the Ser15 residue of p53 through ATR and the like, thereby suppressing association with MDM2 and stabilizing p53. Activates transcription. Thereby, on the other hand, an increase in p21 expression, a decrease in cyclinD1, etc. are started, and the cell cycle is stopped in the G1 phase. On the other hand, it is considered that mitochondrial membrane potential is reduced via BAX, cytochrome C is released from the mitochondria into the cytoplasm, and then apoptosis is induced by activating caspases 9 and 3 or 8.
[0124]
[Example 2]
1. Materials and methods
(1) Material
・ 1'-acetoxychavicol acetate: provided by Professors Daito and Murakami, Faculty of Agriculture, Kyoto University
・ Various hematopoietic tumor cell lines:
NB4 @ Dr. M. Courtesy of Lanotte (St. Louis Hospita., Paris, France)
HL-60: Available from American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD)
UF-1: cell line established in our laboratory
K562, HS-sultan, U266: obtained from RIKEN Cell Bank
・ Caspase inhibitors
Z-VAD, Kasbase 9 inhibitor, Kasbase 8 inhibitor: obtained from MBL
-Anti-Fas antibody, anti-Fas-ligand (Fas-L) antibody: obtained from MBL
NAC (N-acetylcysteine): obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)}
-BSO (buthionine sulfoxide): obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)}-caspase 8 and 9 activity kit: obtained from Pharmingen
・ Leukemia patient sample: Obtain peripheral blood or bone marrow blood from inpatients and outpatients of Keio University Hospital with written consent
・ Normal sample: obtained from volunteers with explanation and consent
-PHA (phytohemagglutinin): obtained from Sigma {Chemical (St. Louis, MO)}
[0125]
(2) Experimental method
-An experiment to examine the growth inhibitory effect and induction of apoptosis on various hematopoietic tumor cell lines: various hematopoietic tumor cell lines (1X10⁵Per ml), 1'-acetoxychavicol acetate 10 μM (or 0-20 μM) is added, and the number of cells is calculated using trypan blue staining.
[0126]
・ Experiment for examining cell morphology: NB4 cell 1 × 10⁴The cells were centrifuged on a slide glass by cytospin, stained with Giemsa and stained with an optical microscope (1 × 10⁴X) Observe.
・ Annexin V, PI (Propium Iodide) staining experiment: 1 × 10⁵Are collected and analyzed by FACS using {Annexin V} (Pharmingen) and PI (final concentration: 0.5 μg / ml) as markers to measure the proportion of Annexin V positive cells.
[0127]
・ Experiment for examining caspase 3 activity: 1 × -acetoxychavicol acetate 10 μM After each culture, 5 × 10 5⁵Are collected, and the activity is measured by FACS using a Kasperase 3 activity kit (Pharmingen).
[0128]
・ Experiment for examining cell cycle: 1'-acetoxychavicol acetate was added at each concentration.⁵Are collected and the cell cycle is analyzed by FACS using PI (final concentration 0.5 μg / ml) as a marker using ModiFIT (registered trademark) (Beckman Coulter).
[0129]
Expression analysis (Western blot analysis) (caspase 3, caspase 8, Bax, cytochrome c, Smac / DIABLO and β-actin) 1′-acetoxychavicol acetate After addition of 10 μM of each culture, the protein was collected and each lane (15 μg) was collected. The protein is electrophoresed and analyzed using various antibodies. For cytochrome c, Smac / DIABRO, Bax, cytoplasmic fractions and mitochondrial fractions are collected, electrophoresed in the same manner, and analyzed using various antibodies.
[0130]
・ Experiment for examining changes in mitochondrial membrane potential: 5 × 10 after 12 hours of culture with addition of 1′-acetoxychavicol acetate 10 μM⁵Of the cells, rhodamine 123 (final concentration: 10 μM) is administered, and the mixture is left at 37 ° C. for 15 minutes. After centrifugation at 1500 g for 5 minutes, the supernatant is discarded, the precipitate is suspended in PBS, PI (final concentration 10 μM) is added, and analysis is performed by FACS.
[0131]
-Analysis of active oxygen: 1X-acetoxychavicol acetate @ 10 μM After each hour of culture, 5X10⁵Are collected and analyzed by FACS using dihydroethidium (final concentration 10 uM) as a marker.
[0132]
-Fas expression analysis: 5X10 after each hour of culture with 1'-acetoxychavicol acetate @ 10 [mu] M⁵, And anti-Fas / CD95 antibody (ZB4 MBL) (final concentration 10 ug / ml) is added and analyzed by FACS.
[0133]
-MTT assay: Addition of 1'-acetoxychavicol acetate at each concentration After each cultivation, 100 µl of the culture solution was transferred to a 96-well plate, and MTT labeling reagent (1X) according to the experimental method of “MTT cell proliferation kit (Roche)”. After adding 10 μl and leaving at 37 ° C. for 4 hours, adding 100 μl of MTT lysis buffer and leaving at 37 ° C.₄₅₀The values are analyzed on a plate reader (BioRad).
[0134]
2. result
FIG. 41 shows the effect of 1'-acetoxychavicol acetate on the growth of various hematopoietic tumor cell lines. By adding 10 μM of 1′-acetoxychavicol acetate (hereinafter referred to as “ACA”), various hematopoietic tumor cell lines (1 × 10 5⁵/ Ml), a growth inhibitory effect was observed in a concentration- and time-dependent manner.
[0135]
NB4 cell 1X10⁵ACA / 10 μM / ml was added, and the cells were cultured for 4 hours in HS-sultan and 12 hours in NB4, and the results of observing the cell morphology are shown in FIG. The HS-sultan cell line and the NB4 cell line after culturing with ACA showed nuclear enrichment and fragmentation typical of apoptosis.
[0136]
FIG. 43 shows the results of examining early apoptosis by Annexin V and PI staining using flow cytometry (FACS). After administration of ACA, an increase in Annexin V positive cells was observed over time. The above results indicate that ACA suppresses proliferation of NB4 cells and HS-sultan cells through induction of apoptosis.
[0137]
Next, various caspase inhibitors (Z-VAD, Kasperase # 8, Kasperase # 9 inhibitor) were examined. The results are shown in FIG. Apoptosis caused by ACA was canceled by the administration of Kasperase 3,8,9 inhibitor. In addition, the appearance of active forms of caspases # 3 and 8 was confirmed by Western blot analysis (FIG. 45). From the above results, it was shown that caspase-3, 8, 9 is involved in apoptosis in NB4.
[0138]
NB4 cell 1X10⁴FIG. 54 shows the results of cell cycle analysis after adding ACA ま た は 1, 5 or 10 μM / ml and culturing for 24 hours. Analysis of the cell cycle revealed an increase in the Sub-G1 fraction showing apoptosis 24 hours after administration of 5 μM of ACA along with a decrease in G1@arrest.S phase.
[0139]
The analysis of the production of active oxygen in the induction of apoptosis by ACA was performed. The results are shown in FIG. 47 (FIG. 47 shows the results for HS-sultan, but similar results were obtained for NB4; data not shown). In the HS-sultan cells, an increase in intracellular active oxygen concentration was observed 1 hour after administration of ACA 10 μM. Generally, cells contain antioxidants such as SOD, quartathione, catalase, and thioretoxin that remove harmful active oxygen.
The present inventors have studied whether apoptosis due to ACA can be suppressed by N-acetylcysteine (NAC), a quaterthione precursor, or using phythionine sulfoxide (BSO) having qualtathione inhibitory activity (1 mM The relationship between quartathione (GSH) and ACA-induced apoptosis was examined by analyzing whether apoptosis was enhanced. The results are shown in FIG. It was found that pre-administration of NAC (1 mM 1 hour before), which is a qualtathione precursor, and removal of active oxygen suppressed the induction of apoptosis of HS-sultan cells by ACA. (Even in NB4 cells, suppression of apoptosis was also obtained by administration of NAC at 100 μM for 1 hour before administration. Data not shown.)
[0140]
It was also confirmed that apoptosis was promoted by BSO administration and that GSH was decreased by ACA administration. (Data not shown)
[0141]
The importance of the Bax protein has been reported for the change in mitochondrial membrane potential due to the production of active oxygen. Therefore, we analyzed Western Blot analysis for changes in Bax protein. The results are shown in FIG. No significant variation was observed in total Bax protein. However, when the mitochondrial fraction and the cytoplasmic fraction were collected and examined for Bax protein expression, a decrease in the cytoplasmic fraction and an increase in the mitochondrial fraction were observed in a time-dependent manner. From the above results, the involvement of the Bax protein in the induction of apoptosis by ACA was considered. In addition, cytochrome チ c,
Increased expression of Smac / DIABLO protein was also observed.
From the above results, it was considered that Bax was transferred from the cytoplasm to mitochondria, mitochondrial membrane potential was changed, cytochrome Δc was released, and apoptosis was induced.
ACA → ROS → Bax → caspase 9 → caspase 3 → apoptosis
[0142]
FIG. 55 shows the result of examining the change in mitochondrial membrane potential. A decrease in mitochondrial membrane potential was observed 9 hours after administration of ACA 10 μM. From the above results, it was shown that apoptosis by ACA is mediated by a decrease in mitochondrial membrane potential via Bax, release of cytochrome c, and caspase # 9 and caspase # 3.
[0143]
From the above results, the importance of production of active oxygen, transfer of Bax protein to mitochondria, reduction of mitochondrial membrane potential, and activation of casaspase-9 were shown as the mechanism of induction of apoptosis of hematopoietic tumor cells by ACA.
ACA → reactive oxygen production → Bax → mitochondrial membrane potential decrease → cytochrome c release → caspase 9 → caspase 3 → apoptosis
[0144]
Concerning the activation of Kaposase-8, the involvement of death receptors (Death receptor) including Fas (CD95) has been reported before. This time, we examined the involvement of Fas / Fas-L using anti-Fas antibodies (agonistic and and antigonist two types) and protein expression using FACS.
[0145]
In NB4, induction of apoptosis was observed with the agonistic Fas antibody (CH11), and inhibition of apoptosis was observed in the antigenic Fas antibody (ZB4) (FIG. 50). In addition, when the suppression of apoptosis by an antigenic antibody in NB4 when ACA @ 10 μM was administered was examined, apoptosis by ACA was almost completely suppressed (FIG. 50). Further, FACS showed that Fas and Fas-L were induced to be expressed upon administration of ACA (FIG. 49). These results indicate that the induction of apoptosis by ACA involves the Fas system.
[0146]
Next, the present inventors examined the effects of ACA on actual patient samples. A total of two samples (acute myeloid leukemia / myeloma) were examined for the effect of ACA by MTT assay. As shown in FIG. 51, both of the two samples showed an ACA concentration-dependent cell growth inhibitory effect. In addition, the induction of apoptosis was examined using Annexin V as a marker, and it was confirmed that apoptosis was induced by ACA (data not shown). In addition, the induction of Fas was also examined using FACS, and it was also confirmed that Fas was induced by the ACA-added culture. From the above results, the relevance between the effects of Fas and ACA was suggested even in actual patient samples.
[0147]
Mononuclear cells were isolated from normal human peripheral blood, stimulated with PHA (phytohemagglutinin), and activated lymphocytes (mainly T cells) 1 × 10⁶FIG. 52 shows the result of the MTT assay when ACA @ 10 μM was added to / ml and cultured for 24 hours. It was confirmed that the cell proliferation was suppressed by the MTT assay, and the apoptotic fraction was increased by the assay using Annexin-V. (Data not shown) This indicates that ACA suppresses activated T cells. These facts indicate that ACA can be used as an immunosuppressant.
[0148]
From the above results, the following conclusions are drawn.
-Ingredient 1'-acetoxychavicol acetate of edible ginger induced apoptosis and cell cycle arrest in NB4 and HS-sultan cells.
・ For the induction, activation of cascades 9 and 3 by the active oxygen production pathway and the apoptosis induction pathway by activation of casbases 8 and 3 through the Fas system play important roles. It was suggested.
[0149]
The above results suggest that Fas and active oxygen play important roles as target molecules for inducing apoptosis in NB4 and HS-sultan cells.
[0150]
The mechanism of action of ACA, predicted from the above results, is summarized in FIG. In NB4 and HS-sultan cells, ACA reduces the mitochondrial membrane potential by producing active oxygen intracellularly (or in mitochondria) and transferring BAX from the cytoplasm to mitochondria. Thereafter, cytochrome c is released from the mitochondria into the cytoplasm, activating casaspase-9, activating casaspase-3, and inducing apoptosis.
On the other hand, it is considered that Kasupase 8 is activated through the Fas system, Kasupase 3 is activated, and apoptosis is induced very early through both systems.
[0151]
[Example 3]
1. Materials and methods
(1) Material
・ Caffeine: obtained from Sigma
・ Various hematopoietic tumor cell lines:
NB4 @ Dr. M. Courtesy of Lanotte (St. Louis Hospita., Paris, France)
・ Caspase inhibitors
Z-VAD, Kasbase 9 inhibitor, Kasbase 8 inhibitor: obtained from MBL
[0152]
(2) Experimental method
An experiment to examine the growth inhibitory effect and induction of apoptosis on various hematopoietic tumor cell lines: hematopoietic tumor cell line NB4 (1 × 10⁴/ Ml), and culture with addition of 4 mM of caffeine, and the number of cells is calculated using trypan blue staining.
[0153]
Experiment for examining cell cycle: 1 x 10⁶Are collected and the cell cycle is analyzed by FACS using PI (final concentration 0.5 μg / ml) as a marker using ModiFIT (registered trademark) (Beckman Coulter).
[0154]
Experiment of Annexin V, PI (Propium Iodide) staining: 1 × 10⁵Are collected and analyzed by FACS using Annexin V (Pharmingen) and PI (final concentration 0.5 μg / ml) as markers to measure the proportion of Annexin V positive cells.
[0155]
Experiment for examining caspase 3 activity: After each hour of culture with addition of 4 mM caffeine, 1 × 10⁵Are collected, and the activity is measured by FACS using a Kasperase 3 activity kit (Pharmingen).
[0156]
Expression analysis (Western blot analysis) (p53, pTyr-cdc2, cdc2, cdc25c, Bax, p21^{WAF1 / CIPI}, Phosphorylated p53 of cyclinｌB1 and Ser 15) (pTyr-cdc 2, cdc 2, cdc 25c, p21^{WAF1 / CIPI}(Cyclin @ B1 is a cell cycle-related protein.) Caffeine is added at 4 mM each time after cultivation, and the protein is collected.
[0157]
Experiment for examining changes in mitochondrial membrane potential: 1 × 10⁵Of the cells, rhodamine 123 (final concentration: 10 μM) is administered, and the mixture is left at 37 ° C. for 15 minutes. After centrifugation at 1500 g for 5 minutes, the supernatant is discarded, the precipitate is suspended in PBS, PI (final concentration 10 μM) is added, and analysis is performed by FACS.
[0158]
2. result
The results are shown in FIGS.
[0159]
Caffeine inhibited the growth of the leukemia cell line NB4 in a time-dependent manner (0-96 hours) (concentration: 4 mM) and concentration (0-8 mM) (FIG. 56A). Further, when examining the cell cycle at that time, the cell cycle was stopped in the G2 / M phase (FIG. 56B).
[0160]
Caffeine increased the activity of caspase 3 (FIG. 57A), and when examined with annexin V, treatment with caffeine {4 mM, {72} hours increased annexin V positive cells to 56.9% and induced apoptosis (FIG. 57B). Furthermore, the caspase inhibitor Z-VAD (20 μM) inhibited the induction of apoptosis by caffeine (4 μmM) (FIG. 57B), and the induction of apoptosis by caffeine was caspase-dependent. Simultaneously, the mitochondrial membrane potential decreased, and cytochrome c was induced (FIG. 57C), which revealed that apoptosis was induced through mitochondria.
[0161]
Examination of apoptosis and cell cycle-related proteins revealed that caffeine treatment increased p53, increased phosphorylated cdc2, and induced Bax and Δp21 (FIG. 58A).
Furthermore, interestingly, phosphorylation of serine 15 residue of p53 was induced (FIG. 58B).
[0162]
In order to examine the significance of p53 in cell cycle arrest and induction of apoptosis of leukemia cells by caffeine, antisense oligonucleotide (AS) against p53 was prepared, and the effect of caffeine in a state where p53 in the cell was knocked out was examined. (FIG. 59). The operating procedure was as described in Example 1. However, caffeine 4 mM was used instead of capsaicin 50 μM. In addition, antisense oligonucleotides to caffeine and p53 were added to NB4 cells, and the expression of p53, β-actin, pTyr-cdc 2 and cdc 2 when cultured for 24 hours was examined. Knockout of p53 by AS canceled the induction of apoptosis of leukemia cells by caffeine (FIG. 59B). From the above, it was considered that caffeine targets p53 of leukemia cells and induces cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells by phosphorylating the serine 15 residue.
[0163]
[Example 4]
1. Materials and methods
(1) Material
-(-)-Epigallocatechin-3-gallate (hereinafter referred to as "EGCG"): obtained from Wako Pure Chemical Industries
・ Various hematopoietic tumor cell lines:
NB4 @ Dr. M. Courtesy of Lanotte (St. Louis Hospita., Paris, France)
HL-60: Available from American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD)
UF-1: cell line established in our laboratory
U937: Obtained from RIKEN Cell Bank
Kasumi-1: Provided by Dr. Hiroya Aso, Hara Medical Research Institute, Hiroshima University
THP-1: obtained from RIKEN Cell Bank
・ Various antioxidants
Catalase: obtained from Sigma
superoxide dismutase (hereinafter referred to as "SOD"): obtained from Wako Pure Chemical
・ Caspase inhibitors
Kasbase 9 inhibitor, Kasbase 8 inhibitor: obtained from MBL
Caspase-3 inhibitor: obtained from Calbiochem (La Jolla, CA)
DNA microarray: TOYOBO @ Co. Obtained from Ltd
[0164]
(2) Experimental method
An experiment to investigate the growth inhibitory effect and induction of apoptosis on various hematopoietic tumor cell lines: various hematopoietic tumor cell lines (2 × 10⁴/ Ml), and culture with addition of EGCG is performed, and the number of cells is calculated using trypan blue staining.
[0165]
Experiment for examining the cell cycle: 2 × 10⁴Are collected and the cell cycle is analyzed by FACS using PI (final concentration 0.5 μg / ml) as a marker using ModiFIT (registered trademark) (Beckman Coulter).
[0166]
Experiment to examine DNA ladder formation: various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴After adding EGCG {20} μM / ml and culturing for 3 hours, DNA is collected and electrophoresed on a 2% agarose gel to examine the presence or absence of ladder formation.
[0167]
Experiments examining cell morphology: various hematopoietic tumor cell lines 2X10⁴The cells were centrifuged on a slide glass by cytospin, stained with Giemsa and stained with an optical microscope (1 × 10⁴X) Observe.
[0168]
Experiment of Annexin V, PI (Propium Iodide) staining: 2 × 10⁴Are collected and analyzed by FACS using Annexin V (Pharmingen) and PI (final concentration 0.5 μg / ml) as markers to measure the proportion of Annexin V positive cells.
[0169]
Experiment for examining caspase 3 activity: EGCG {20} μM added, after each hour, 2 × 10⁴Are collected, and the activity is measured by FACS using a Kasperase 3 activity kit (Pharmingen).
[0170]
Expression analysis (Western blot analysis) (p53, pTyr-cdc2, cdc2, cdc25c, Bax, p21^{WAF1 / CIPI}, Phosphorylated p53 of cyclinｌB1 and Ser 15) (pTyr-cdc 2, cdc 2, cdc 25c, p21^{WAF1 / CIPI}And cyclinΔB1 are cell cycle related proteins. ) Addition of EGCG {20} μM After each culture, the protein is collected, and the protein in each lane # 15 μg is electrophoresed and analyzed using various antibodies.
[0171]
Experiment for examining the change in mitochondrial membrane potential: 2 × 10⁴Of the cells, rhodamine 123 (final concentration: 10 μM) is administered, and the mixture is left at 37 ° C. for 15 minutes. After centrifugation at 1500 g for 5 minutes, the supernatant is discarded, the precipitate is suspended in PBS, PI (final concentration 10 μM) is added, and analysis is performed by FACS.
[0172]
Analysis of active oxygen: After each hour of culture with EGCG {20} μM added, 2 × 10⁴Are collected and analyzed by FACS using dihydroethidium (final concentration {10} μM) as a marker.
[0173]
2. result
The results are shown in FIGS. Although various derivatives are present in the green tea component catechin, EGCG, which is considered to have the highest activity, was used in the experiment (FIG. 60).
[0174]
EGCG inhibited the proliferation of various leukemia cell lines (NB4, U937, Kasumi-1, UF-1, HL60, THP-1) in a concentration- and time-dependent manner (FIG. 61). In particular, the effect on NB4 cells was remarkable.
[0175]
Treatment with EGCG {10, {20} μM for 24 hours induced annexin V-positive cells in various leukemia cell lines, confirming the induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG (FIG. 62). Furthermore, when examined morphologically by Giemsa staining, leukemia cells were found to have apoptosis-specific findings such as dense nuclear staining, fragmentation, and appearance of apoptotic bodies by EGCG treatment (FIG. 63). At the same time, when genomic DNA was extracted and run on a gel, ladder formation typical of apoptosis was observed (FIG. 64). As described above, induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG was confirmed by various methods.
[0176]
The cell cycle was stopped in the G1 phase by EGCG treatment (FIG. 65).
[0177]
The induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG was canceled by an antioxidant, catalase, {superoxide} dismutase (FIG. 66). The ladder formation by EGCG was also canceled by catalase (FIG. 64). Therefore, it was suggested that the induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG may be mediated by reactive oxygen species (ROS).
[0178]
Induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG induced caspase # 3 activity (FIG. 67). In addition, in the experiment using the inhibitor, apoptosis induction was inhibited by an inhibitor specific to caspase 3 and caspase 9, but was not suppressed by an inhibitor specific to caspase 8 (FIG. 68). Therefore, it was considered that the induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG was mediated by mitochondria.
[0179]
EGCG treatment resulted in the production of ROS and a decrease in MMP (mitochondrial membrane potential) in various leukemia cells (FIG. 69). When the NB4 cells were examined in detail, ROS production and a decrease in mitochondrial membrane potential were observed in a time-dependent manner with EGCG {20} μM treatment (FIG. 70).
[0180]
Expression of apoptosis and cell cycle-related proteins upon EGCG treatment was examined in Western blot. Bax involved in apoptosis induction was induced by EGCG treatment, but expression was suppressed by antioxidant catalase treatment (FIG. 71). Although p53 induction was also observed, expression was also suppressed by catalase (FIG. 72). Therefore, ROS, which triggers the induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG, is considered to be directly involved in the induction of Bax, Δp53. EGCG treatment lowered the mitochondrial membrane potential, which revealed that cytochrome c was released from the mitochondria into the cytoplasm, and this release was suppressed by catalase (FIG. 73).
[0181]
FIG. 74 shows a summary of the mechanism of induction of apoptosis of leukemia cells by EGCG. EGCG produces reactive oxygen (ROS; \ reactive \ oxygen \ species), and ROS induces Bax, which lowers the mitochondrial membrane potential and promotes the release of cytochrome c from mitochondria into the cytoplasm. Cytochrome c activates caspase 9, caspase 3 and induces apoptosis of leukemic cells. At the same time, EGCG also induces the expression of p53, which may cause cell cycle arrest and apoptosis-inducing signals, but this has not been directly demonstrated. In capsaicin and caffeine, phosphorylation of serine 15 residue of p53 was proved, and it was clarified to be involved in their induction.
[0182]
[Example 5]
1. Materials and methods
(1) Material
-Curcumin: obtained from Wako Pure Chemical
・ Various hematopoietic tumor cell lines:
U266: Obtained from RIKEN Cell Bank
HS-Sultan: obtained from RIKEN Cell Bank
RPMI1640: obtained from RIKEN Cell Bank
IM9: Obtained from RIKEN Cell Bank
[0183]
(2) Experimental method
An experiment to investigate the growth inhibitory effect and induction of apoptosis on various hematopoietic tumor cell lines: various hematopoietic tumor cell lines (1 × 10⁵/ Ml), and add and culture with curcumin # 5, 10, and 20 μM, and calculate the number of cells using trypan blue staining.
[0184]
Experiment for examining cell cycle: Curcumin # 5, 10 and 20 μM, 1 hour after 1 hour⁵Are collected, and the cell cycle is analyzed by FACS using Annexin V (final concentration 5 μg / ml) as a marker using ModFIT (registered trademark) (Beckman Coulter).
[0185]
Experiment for examining cell morphology: HS-Sultan cell 1 × 10⁵The cells were centrifuged on a slide glass by cytospin, stained with Giemsa and stained with an optical microscope (1 × 10⁴X) Observe.
[0186]
Experiment of Annexin V, PI (Propium Iodide) staining: 1 × 10⁵Individual cells are collected and analyzed by FACS using Annexin V (Pharmingen) and PI (final concentration 0.5 μg / ml) as markers to measure the proportion of Annexin V positive cells.
[0187]
Experiment for examining caspase 3 activity: After each hour of culture with addition of 10 μM curcumin, 1 × 10⁵Individual cells are collected, and the activity is measured by FACS using a Kasperase 3 activity kit (Pharmingen).
[0188]
Experiment for examining caspase 8 activity: After each hour of culture with the addition of 10 μM curcumin, 1 × 10⁵Individual cells are collected, and the activity is measured by FACS using a Kasperase 8 activity kit (Pharmingen).
[0189]
MTT assay: various hematopoietic tumor cell lines (1 × 10⁵/ Ml), culture medium with curcumin # 5, 10, and 20 μM was added for 48 hours, 100 μl of the culture solution was transferred to a 96-well plate, and MTT labeling reagent (1X) @ 10 μl was added according to the experimental method of “MTT cell proliferation kit” (Roche). After adding at 37 ° C. for 4 hours, 100 μl of MTT lysis buffer was added.₄₅₀The values are analyzed on a plate reader (BioRad).
[0190]
2. result
The results are shown in FIGS.
[0191]
FIG. 75 shows the structural formula of the turmeric component curcumin.
[0192]
Curcumin was added at various concentrations to myeloma cells (HS-Sultan, RPMI1640, U266, IM9), and cell proliferation was examined 48 hours later by MTT assay. Curcumin inhibited myeloma cell growth in a concentration-dependent manner. (FIG. 76).
[0193]
Curcumin induced annexin V-positive cells in a concentration-dependent manner when examined using annexin V using HS-Sultan cells (FIG. 77). In addition, morphological observation by Giemsa staining also revealed specific findings for apoptosis (FIG. 78).
[0194]
Curcumin induced caspase-3, caspase-8 activity in a time-dependent manner (FIGS. 79 and 80).
[0195]
From the above results, the following conclusions are drawn.
Curcumin induced early apoptosis of various myeloma cell lines.
Induction of apoptosis of HS-sultan by curcumin was thought to be via the caspase-8 / caspase-3 pathway.
-No decrease in mitochondrial membrane potential and caspase-9 activation were observed, suggesting a mitochondrial-independent apoptotic pathway.
・ Elevation of active oxygen concentration was observed, but it was considered that this was not a direct cause of apoptosis induction.
-Activation of caspase-8 was observed, but it was independent of Fas, suggesting the involvement of other caspase-8 activation pathways.
[0196]
FIG. 81 shows a summary of the mechanism of induction of apoptosis of myeloma cells by curcumin, which is predicted from the above.
[0197]
【The invention's effect】
For patients with hematopoietic tumors resistant to conventional anticancer drug-based therapies, and for cases with strong side effects, pepper component capsaicin, edible ginger component 1'-acetoxychavicol acetate, coffee component caffeine are also used as food components Green tea component catechin and turmeric component curcumin and their derivatives have an antitumor effect, and are effective treatments with few side effects. In addition, an improvement in the therapeutic results of hematopoietic tumors can be expected. Furthermore, it is also useful as an immunosuppressant. In addition, capsaicin, caffeine, catechin and derivatives thereof are also useful as molecular targeted therapeutics targeting p53.
[0198]
[Sequence list]

[0199]
[Sequence List Free Text]
[SEQ ID NO: 1]
SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of an antisense oligonucleotide.
[0200]
[SEQ ID NO: 2]
SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of a control oligonucleotide.
[0201]
[SEQ ID NO: 3]
SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of a mismatch oligonucleotide.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the effect of CAP on the growth of various hematopoietic tumor cell lines.
FIG. 2: NB4 cells 1 × 10⁴The culture time and the number of cells when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured were shown. The results of the control (without addition of CAP) are also shown.
FIG. 3. NB4 cells 1 × 10⁵CAP concentration and% of Annexin V-positive cells when CAP 0 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, and 1000 μM were added to the CAP / ml, respectively.
FIG. 4: 1 × 10 NB4 cells⁵5 shows the results of cell cycle analysis when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 0 hours, 12 hours, 24 hours, and 72 hours.
FIG. 5: NB4 cells 1 × 10⁵The results of cell cycle analysis when CAP 0 μM (control), 1 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, and 1 mM were added to / ml, respectively, are shown.
FIG. 6: NB4 cells 1 × 10⁵5 shows the results of ladder formation when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 0, 24, 48 and 72 hours.
FIG. 7: NB4 cells 1 × 10⁵The results obtained by observing the morphology of cells when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 24 hours are shown (right). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left).
FIG. 8: NB4 cells 1 × 10⁵The results of analysis of the cell cycle when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 24 hours are shown (right). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left).
FIG. 9: NB4 cells 1 × 10⁵The results of examining early apoptosis by Annexin V and PI staining when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 24 hours (right). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left).
FIG. 10: NB4 cells 1 × 10⁵The activity of caspase 3 when CAP @ 100 μM / ml was added and culture was performed for 0 hours, 3 hours, 6 hours, 9 hours, 12 hours, and 24 hours.
FIG. 11 shows the effect of caspase inhibitors on CAP-induced apoptosis.
FIG. 12: NB4 cells 1 × 10⁵The results of the expression analysis of procaspase 3 and activated caspase 3 when CAP @ 100 μM / ml was added and cultured for 0, 24, and 48 hours are shown.
FIG. 13: NB4 cells 1 × 10⁵7 shows the results of expression analysis of apoptosis-related proteins when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 0, 12, 24, 48, or 72 hours.
FIG. 14: NB4 cells 1 × 10⁵The mitochondrial membrane potential (occupation ratio of low membrane potential) when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 9 hours is shown (right). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left).
FIG. 15: NB4 cells 1 × 10⁵The results of expression analysis of cytochrome C and β-actin when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 24 hours and 48 hours are shown. The results of the control (without addition of CAP) are also shown.
FIG. 16: NB4 cells 1 × 10⁵The results of expression analysis (Western blot analysis) of cell cycle-related proteins when 0, 12, 24, 48, and 72 hours were added to CAP @ 100 μM / ml and cultured for 0, 12, 24, 48, and 72 hours.
FIG. 17: NB4 cells 1 × 10⁵The results of expression analysis of p53-related protein when 0, 12, 24, 48, and 72 hours were added to CAP @ 100 μM / ml.
FIG. 18: NB4 cells 1 × 10⁵7 shows the results of expression analysis of Ser15 phosphorylated p53 and p53 when CAP @ 100 μM was added to / ml and cultured for 12, 24, 48, and 72 hours.
FIG. 19 shows the effect of wortmannin (an inhibitor of p53 kinase) on CAP-induced apoptosis (right bar). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left bar).
FIG. 20 shows the effect of Pifithulin α (a specific inhibitor for p53) on CAP-induced apoptosis (right bar). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left bar).
FIG. 21 shows the effect of Pifithulin α (a specific inhibitor for p53) on cell cycle arrest by CAP (lower right). The results of control (without addition of CAP) (upper left), addition of only CAP @ 100 μM (upper right), and addition of only pifithrin α @ 100 nM (lower left) are also shown.
FIG. 22 summarizes the effects of a p53 gene antisense oligonucleotide (apoptosis, cell cycle arrest).
FIG. 23 shows the effect of antisense oligonucleotides of the p53 gene on CAP-induced apoptosis.
FIG. 24 shows the effect of CAP on the production of intracellular active oxygen.
FIG. 25 shows the effect of N-acetylcysteine (NAC), a glutathione precursor, on CAP-induced apoptosis (right bar). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (left bar).
FIG. 26 shows the effect of NAC on cell cycle arrest by CAP (lower right). The results of the control (without addition of CAP) (upper left), the addition of only CAP @ 100 μM (lower left), and the addition of only NAC @ 100 μM (upper right) are also shown.
FIG. 27 shows the results of expression analysis of p53 and β-actin in bone marrow cells of patients with leukemia and myeloma.
FIG. 28. Bone marrow cells 1 × 10 of leukemia patients⁷CAP concentration and OD in the MTT} assay when CAP 0 μM, 10 μM, 50 μM, and 100 μM were added to each / ml and cultured for 48 hours.₄₅₀Indicates a value.
FIG. 29. Peripheral blood cells 1 × 10 of leukemia patients⁷The culture time and% of Annexin V-positive cells when CAP @ 10 μM, 50 μM, and 100 μM were added to each / ml, respectively, are shown.
FIG. 30. 1 × 10 6 bone marrow cells of a leukemia patient⁷The number of Annexin V-positive cells when CAP @ 100 μM / ml was added and cultured for 24 hours (gray line). The results of the control (without addition of CAP) are also shown (black line).
FIG. 31: 1 × 10 bone marrow cells of a leukemia patient⁷2 shows the results of cell cycle analysis when CAP 0 μM (control), 10 μM, 50 μM and 100 μM were added to each / ml and cultured for 48 hours.
FIG. 32. Bone marrow cells 1 × 10 of leukemia patients⁷The results of apoptosis (%) are shown when CAPμ0 μM (control), 10 μM, 50 μM, and 100 μM were added to each / ml and cultured for 48 hours.
FIG. 33: Peripheral blood cells 1 × 10 of CML CP patients⁷The culture time and the% of Annexin V-positive cells when 0, 24, 48, and 72 hours were added to CAP @ 10 μM, 50 μM, and 100 μM, respectively, are shown.
FIG. 34. Peripheral blood cells 1 × 10 of PLL patients⁷The culture time and cell viability (%) when 0, 24, and 48 hours were added to CAP @ 10 μM, 50 μM, and 100 μM, respectively, and cultured at 0, 24, and 48 hours, respectively.
FIG. 35. Peripheral blood cells 1 × 10 of normal subjects⁷/ Ml, and cultivation time and OD of MTT そ れ ぞ れ assay when CAP {10 μM and 100 μM were added, respectively, and culturing was performed for 0, 24 and 48 hours.₄₅₀Indicates a value.
FIG. 36. Lymphocytes {1} × 10 activated by PHA (phytohemagglutinin) stimulation⁶The results of examining early apoptosis by Annexin V and PI staining when CAP {100} μM was added to / ml and cultured for 24 hours are shown. Control (top), CAP added (2nd row from top), PHA activated lymphocytes (3rd row from top), CAP added to activated lymphocytes (bottom row)
FIG. 37 is a scheme illustrating the mechanism of action of CAP.
FIG. 38 shows the effect of caspase inhibitors on CAP-induced apoptosis (by FACS analysis).
FIG. 39 shows the effect of capsaicin (induction of apoptosis) on acute myeloid leukemia and acute promyelocytic leukemia patient samples.
FIG. 40 shows the effect of capsaicin on multiple myeloma patient samples.
FIG. 41. Various hematopoietic tumor cell lines 1 × 10⁵The ACA concentration and cell number when ACAＡＣ0 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, and 20 μM were added to the ACA / ml, respectively, are shown (left figure). Various hematopoietic tumor cell lines 1 × 10⁵The culture time and cell number when 0, 6, 12, 24, and 48 hours were added to ACA @ 10 μM / ml and cultured (right figure).
FIG. 42. HS-sultan cells and NB4 cells 1 × 10⁵The results obtained by observing the morphology of the cells when ACA @ 10 μM was added to / ml and cultured for 4 hours or 12 hours (left NB4 cells / right HS-sultan cells). The results of the control (without addition of ACA) are also shown (top).
FIG. 43. HS-sultan cells 1 × 10⁵10 shows the results of an early apoptosis study by Annexin V and PI staining when ACA @ 10 μM was added to / ml and cultured for various times.
FIG. 44 shows the effect of caspase inhibitors on ACA-induced apoptosis.
FIG. 45. NB4 cells 1 × 10⁵10 shows the results of expression analysis of protein 3 and 8 when 0 μl / ml of ACA 10 μM was added and culture was performed for 0 hours, 3 hours, 6 hours, and 12 hours.
FIG. 46. HS-sultan cells 1 × 10⁵/ Ml of ACA @ 10 μM and cultured for 0 hour, 1 hour, and 3 hours. Results of expression analysis of total Bax, mitochondrial fraction, Bax of cytoplasmic fraction, cytochrome c of cytoplasmic fraction, and Smac / DIABLO. Is shown.
FIG. 47 shows the effect of ACA on the production of intracellular active oxygen.
FIG. 48 shows the effect of N-acetylcysteine (NAC) (glutathione precursor) on ACA-induced apoptosis (right bar). The results of the control (without addition of ACA) are also shown (left bar).
FIG. 49 shows the effect of ACA on Fas expression in NB4 (left panel). In addition, the effect of ACA on Fas expression in HS-sultan is shown (right figure).
FIG. 50 shows the apoptosis-inducing / suppressing effects of anti-Fas antibodies (agonists and antagonists) on NB4.
FIG. 51. Peripheral blood cells of multiple myeloma patients (left panel) and bone marrow cells of leukemia patients (right panel) 1 × 10⁷/ Ml, and ACA concentration of 0 μM, 1 μM, 5 μM, and 10 μM, respectively, and culturing for 24 hours.₄₅₀Indicates a value. (Left figure)
FIG. 52: Lymphocytes 1 × 10 activated by PHA (phytohemagglutinin) stimulation⁶OD in the MTT assay when ACA {10 μM was added to the solution / ml and cultured for 24 hours.₄₅₀Shows the value (right bar). The results of the control (without addition of ACA) are also shown (left bar).
FIG. 53 is a scheme illustrating the mechanism of action of ACA.
FIG. 54. NB4 cells 1 × 10⁵2 shows the results of cell cycle analysis when culturing was performed by adding 0 μM (control), 1 μM, 5 μM, and 10 μM to ACA / ml, respectively.
FIG. 55. NB4 cells 1 × 10⁵The right shows the mitochondrial membrane potential (occupation rate of low membrane potential) when ACA @ 10 μM was added to / ml and cultured for 12 hours. The results of the control (without addition of ACA) are also shown (left).
FIG. 56 shows the effect of caffeine on the proliferative capacity of NB4 cells (FIG. 56A) and cell cycle (FIG. 56B). FIG. 56B shows NB4 cells 1 × 10⁶The results of cell cycle analysis when caffeine {4} mM was added to / ml and cultured for 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours, and 120 hours are shown. The results for the control (without addition of caffeine) are also shown.
FIG. 57 shows that induction of apoptosis of NB4 cells by caffeine is mitochondria-dependent. FIG. 57A shows NB4 cells at 1 × 10⁵4 shows the activity of caspase 3 when caffeine {4} mM was added to the same per ml and cultured for 72 hours. FIG. 57B shows 1 × 10 4 NB4 cells.⁵The results of examining early apoptosis by Annexin V and PI staining when caffeine {4} mM was added to / ml and cultured for 72 hours are shown. The results for the control (without addition of caffeine) are also shown. FIG. 57C shows NB4 cell 1 × 10⁵The mitochondrial membrane potential when caffeine {4} mM was added to / ml and cultured for 72 hours is shown. The results for the control (without addition of caffeine) are also shown. In addition, the results of the expression analysis of cytochrome c are shown in the upper part with a frame.
FIG. 58 shows the results of analysis of expression of apoptosis and cell cycle-related proteins in caffeine-treated NB4 cells.
FIG. 59 shows the significance of p53 in inducing apoptosis of NB4 cells by caffeine. FIG. 59A shows NB4 cell 1 × 10⁵The results of expression analysis (Western blott analysis) of p53 and β-actin when cultured for 24 hours after adding caffeine {4} mM and antisense oligonucleotide 1 μM to p53 to / ml are shown (MS). The results of no addition of caffeine (control), addition of only an antisense oligonucleotide to p53 (AS), and addition of only caffeine (CS) are also shown. FIG. 59B shows NB4 cell 1 × 10⁵The results of examining early apoptosis by Annexin V and PI staining when cultured for 24 hours after adding caffeine {4} mM and antisense oligonucleotide 1 μM against p53 to / ml (AS + caffeine) are shown. The results of no addition of caffeine (control), addition of only an antisense oligonucleotide to p53 (AS), and addition of only caffeine (caffeine) are also shown. FIG. 59C shows NB4 cell 1 × 10⁵2 shows the results of expression analysis (Western blot analysis) of pTyr-cdc2, cdc2 and β-actin after adding 24 μm / ml of caffeine 4 mM and antisense oligonucleotide 1 μM against p53 for 24 hours. (Caffeine + AS). The results of no addition of caffeine (control), addition of only an antisense oligonucleotide to p53 (AS), and addition of only caffeine (caffeine) are also shown.
FIG. 60 shows structural formulas of main polyhydric polyphenols contained in green tea.
FIG. 61 shows the effect of EGCG on the growth of various hematopoietic tumor cell lines. The left figure shows various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴EGCG 0, 10, 20 and 50 μM, respectively, and EGCG concentration and Viability when cultured for 24 hours are shown. The right figure shows various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴7 shows the number of days of culture and viability when EGCG @ 10 μM was added to / ml.
FIG. 62: Various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴The results of examining early apoptosis by Annexin V and PI staining when EGCG @ 10 µM or 20 µM was added to / ml and cultured for 24 hours are shown. The results without the addition of EGCG (control) are also shown.
FIG. 63: Various hematopoietic tumor cell lines 1 × 10⁵The results obtained by observing the morphology of the cells when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 24 hours are shown. The results without the addition of EGCG (control) are also shown.
FIG. 64: Various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁵The results of ladder formation (EGCG @ 20 μM @ 3 hr) when 3 hours (12 hours for U937 cells) were added and EGCG @ 20 .mu.M was added to the solution / ml. The results (control) without addition of EGCG are also shown. Furthermore, various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴The results of ladder formation (EGCG {20 μM} + catalase) when 3 hours (12 hours for U937 cells) were added and EGCG @ 20 μM and catalase @ 500 U / ml were added to the sample / ml.
FIG. 65: Various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴The results of cell cycle analysis when EGCG @ 20 μM was added to the A / ml and cultured for 24 hours are shown (right). The results without the addition of EGCG (control) are also shown (left).
FIG. 66 shows the effect of antioxidants on EGCG-induced apoptosis. Various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴Viability when EGCG @ 20 μM and catalase @ 500 U / ml (EGCG @ 20 μM + catalase @ 500 U / ml) or SOD @ 500 @ U / ml (EGCG @ 20 μM + SOD @ 500 U / ml) was added to the sample and cultured for 24 hours. The results of no addition of EGCG (control) and addition of only EGCG (EGCGμ20 μM) are also shown.
FIG. 67: Various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴2 shows the activity of caspase 3 when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 6 hours.
FIG. 68. NB4 cells 2 × 10⁴EGCG at 20 μM and caspase inhibitor caspase-3 inhibitor at 10 μM, caspase-8 inhibitor at 20 μM, and caspase-9 inhibitor at 50 μM, and cultured for 2 hours. Indicates the percentage. The results of no addition of EGCG (control) and addition of only EGCG (EGCGμ20 μM) are also shown.
FIG. 69 shows the effect of EGCG on intracellular active oxygen production (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP). The left figure shows various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴The figure shows the production of active oxygen when EGCG @ 20 µM was added to / ml and cultured for 3 hours. The right figure shows various hematopoietic tumor cell lines 2 × 10⁴The figure shows a decrease in mitochondrial membrane potential when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 3 hours. The results without the addition of EGCG (control) are also shown (shown in solid black).
FIG. 70 shows the time course of the effect of EGCG on intracellular active oxygen production and mitochondrial membrane potential. The upper panel shows NB4 cells 2 × 10⁴The figure shows the production of active oxygen when EGCG @ 20 μM was added to / ml, and the cells were cultured for 3, 6 and 12 hours. The lower panel shows NB4 cells 2 × 10⁴The figure shows a decrease in mitochondrial membrane potential when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 3, 6 and 12 hours. The results without the addition of EGCG (control) are also shown (shown in solid black).
FIG. 71. The upper panel shows 2 × 10 4 NB4 cells.⁴The results of the expression analysis of Bcl-2, Bcl-XL, Bax, and actin when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 0, 3, and 6 hours are shown. The lower panel shows UF-1 cells 2 × 10⁴The results of the expression analysis of Bcl-2, Bcl-XL, Bax, and actin when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 0, 3, and 6 hours are shown. In addition, NB4 cells or UF-1 cells 2 × 10⁴The results of the expression analysis of Bcl-2, Bcl-XL, Bax, and actin (EGCG {20 μM} +500 catalase 500 U / ml) when EGCG {20 μM and catalase 500 μU / ml were added to 1 ml / ml and cultured for 1 hour are also shown. (Upper and lower figures).
FIG. 72. NB4 cells 2 × 10⁴The results of expression analysis of p53, p27, and actin when 0, 3, and 6 hours were added to EGCG @ 20 μM / ml and cultured for 0, 3, and 6 hours are shown. In addition, 2 × 10 NB4 cells⁴The results of expression analysis of p53, p27, and actin (EGCG {20 μM} + catalase {500} U / ml) when EGCG @ 20 μM and catalase @ 500 U / ml were added to the same and cultured for 1 hour are also shown.
FIG. 73. The upper panel shows 2 × 10 4 NB4 cells.⁴2 shows the results of expression analysis of cytochrome c and actin in cytoplasm (Cytocolic cyt.c) and mitochondria (Mitochondrial cyt.c) when EGCG @ 20 μM was added to / ml and cultured for 0 hour and 3 hours. The lower panel shows UF-1 cells 2 × 10⁴The results of expression analysis of cytochrome c} and actin in the cytoplasm and mitochondria when EGCG {20 μM was added to / ml and cultured for 0 hour and 3 hours are shown. In addition, NB4 cells or UF-1 cells 2 × 10⁴The results of expression analysis of cytochrome c and actin in the cytoplasm and mitochondria when EGCG {20 μM and catalase {500} U / ml were added to L / ml and culturing for 1 hour (EGCG {20 μM} +500 catalase 500 μU / ml) are also shown. And the figure below).
FIG. 74 is a scheme illustrating the mechanism of action of EGCG.
FIG. 75 shows a structural formula of curcumin.
FIG. 76 shows the effect of curcumin on the growth of various hematopoietic tumor cell lines. Various hematopoietic tumor cell lines 1 × 10⁵2 shows the viability when curcumin 0, 5, 10, and 20 μM were added to each / ml and cultured for 48 hours.
FIG. 77. The upper panel shows 1 × 10 HS-sultan cells.⁵The results of examining early apoptosis by Annexin ΔV and PI staining when 12 hours of culture with addition of curcumin Δ5, 10 and 20 μM, respectively, are shown. The lower figure shows HS-sultan cells 1 × 10⁵2 shows the results of cell cycle analysis when culturing was performed for 12 hours after adding curcumin # 5, 10, and 20 μM / ml, respectively. The results without curcumin addition (control) are also shown (upper and lower figures).
FIG. 78: HS-sultan cells 1 × 10⁵The results obtained by observing the morphology of cells obtained by adding curcumin @ 10 μM / ml and culturing for 24 hours are shown (right). The results without curcumin addition (control) are also shown (left).
FIG. 79. HS-sultan cells 1 × 10⁵2 shows the activity of caspase 3 when the culture was incubated for 0, 1, 3, and 6 hours with the addition of 10 μM curcumin / ml.
FIG. 80: HS-sultan cells 1 × 10⁵The activity of caspase 8 when curcumin @ 10 μM / ml was added and cultured for 0, 1, 3, and 6 hours.
FIG. 81 is a scheme illustrating the mechanism of action of curcumin.

Claims (5)

A therapeutic agent for hematopoietic tumors, comprising a compound capable of activating caspase or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The treatment according to claim 1, wherein the compound capable of activating caspase is at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, 1'-acetoxychavicol acetate, caffeine, catechin, curcumin, and derivatives thereof. medicine. An immunosuppressant comprising a compound capable of activating caspase or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The immunosuppression according to claim 3, wherein the compound capable of activating caspase is at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, 1-acetoxychavicol acetate, caffeine, catechin, curcumin, and derivatives thereof. Agent. A molecular targeted therapeutic agent targeting p53, comprising at least one compound selected from the group consisting of capsaicin, caffeine, catechin and derivatives thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof.

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