JP2004073118A

JP2004073118A - Method for synthesizing polynucleotide

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Publication number: JP2004073118A
Application number: JP2002239621A
Authority: JP
Inventors: Masanori Hirano; 平野　雅則
Original assignee: Hubit Genomix Inc
Current assignee: Hubit Genomix Inc
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2022-08-20
Also published as: JP4304350B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for synthesizing a polynucleotide in which a base sequence in a region containing 5' terminal is unknown. <P>SOLUTION: A base sequence which is complementary to 5' end and 3' end of a target polynucleotide is added by using one kind of primer to synthesize the target polynucleotide. The necessary base sequence can readily be added by incubation of a primer, double-stranded DNA and a template-dependent DNA polymerase. A gene having low expression level which could not be obtained by a well-known method can efficiently be obtained by applying the present invention to 5' RACE. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチドの増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリヌクレオチドの単離において、ポリヌクレオチドの増幅方法は重要なステップの一つである。ポリヌクレオチドの増幅方法として最も一般的な手法は、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲ法によるＤＮＡの合成反応は、プライマーから３’方向への相補鎖合成反応の繰り返しで構成されている。ＰＣＲ法においては、新たに合成されたＤＮＡが、変性の後に鋳型として利用されるため、反応生成物は指数的に増加する。ＰＣＲ法に用いられるプライマーは、目的とする塩基配列の５’側の領域に相補的な塩基配列を有する。したがって、少なくともプライマーがアニールする部分の塩基配列は、予めわかっていなければならない。言いかえれば、塩基配列が不明なＤＮＡをＰＣＲ法によって選択的に増幅することはできない。
【０００３】
しかし、塩基配列が不明なＤＮＡについても、選択的な増幅は必要である。たとえば、部分的な塩基配列に基づく遺伝子の全長の取得が、しばしば試みられる。具体的には、ｍＲＮＡの５’側の領域は、ｃＤＮＡとして合成されにくい。そのため、しばしば５’側の塩基配列が不完全なｃＤＮＡがクローニングされる。５’側の塩基配列を欠失した不完全なｃＤＮＡの全長塩基配列を明らかにするためには、未知の塩基配列からなる５’側の塩基配列を含むＤＮＡを選択的に増幅する必要がある。
【０００４】
また、特定の機能を有する遺伝子の取得方法であるディファレンシャルディスプレー法においては、結果として遺伝子の断片塩基配列が得られる。得られた塩基配列が既知の遺伝子に一致しない場合には、その遺伝子の全長塩基配列を明らかにしなければならない。このとき、断片塩基配列に基づく遺伝子の全長の取得が試みられる。
【０００５】
遺伝子を構成する塩基配列の一部のみが明らかな場合に、この部分的な塩基配列に基づいて、遺伝子の全長を取得する方法が知られている。その代表的な方法がＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）法である。ＲＡＣＥ法は、末端の塩基配列が未知の遺伝子を鋳型として、ＰＣＲを利用して未知の塩基配列を含む領域を増幅する方法である。ＰＣＲのためのプライマーは、塩基配列が明らかな部分を利用してデザインされる。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定すれば、未知の塩基配列は明らかになる。ＲＡＣＥ法には、プライマーがアニールするための領域を付加する方法などが異なるいくつかのバリエーションが知られている。
【０００６】
たとえば、ＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　Ａｔ　５’　ｅｎｄ　ｏｆ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）法としてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社が商業的に供給しているＲＡＣＥ法のためのキットは、次のような原理に基づいて、塩基配列が未知の領域を含むｃＤＮＡの合成を実現している（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７／６，１５５８−１５６０，　１９９９）。ＳＭＡＲＴ法は、ｃＤＮＡの第１鎖（ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ）の合成に用いる逆転写酵素の特殊な酵素活性を利用している。ＳＭＡＲＴ法では、ＭＭＬＶＲＴ（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と呼ばれる逆転写酵素の変異体が用いられる。
【０００７】
この逆転写酵素は、相補鎖合成が鋳型となるＲＮＡの５’末端に達した後に、合成したｃＤＮＡの３’末端に同じ塩基を連続して付加する。付加される塩基は、多くの場合ｃである。したがってｃの連鎖（ｃ　ｓｔｒｅｔｃｈ）に相補的な塩基配列であるｇが連続した塩基配列を３’末端に有するオリゴヌクレオチドは、ＭＭＬＶＲＴが合成したｃＤＮＡの３’末端にアニールするプライマーとなる。
【０００８】
ＳＭＡＲＴ法は、ｃＤＮＡ第２鎖（ｓｅｃｏｎｄ　ｓｔｒａｎｄ）合成用のプライマーとして、３’末端にｇの連鎖を備え、５’末端側にはＳＭＡＲＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる特殊な塩基配列を付加したオリゴヌクレオチド「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」を使用する。「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の３’末端に配置されたｇの連鎖がｃＤＮＡのｃの連鎖にアニールすると、逆転写酵素は「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の５’側のＳＭＡＲＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ部分についても相補鎖を合成する。こうして、ｃＤＮＡの末端には、「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の塩基配列が完全な２本鎖として付加される。
【０００９】
一方、「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」そのものは、ｃＤＮＡ第１鎖を鋳型とする相補鎖合成のプライマーとして機能する結果、ｃＤＮＡの第２鎖も合成されて、２本鎖のｃＤＮＡを得ることができる。このｃＤＮＡは、「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の５’側に配置されたＳＭＡＲＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅと、ｃＤＮＡの合成に用いた遺伝子特異プライマーを利用したＰＣＲによって増幅することができる。「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」として、２つのプライマーを設定できる長さを有するオリゴヌクレオチドを用いた場合には、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを応用することも可能である。
【００１０】
ＲＡＣＥ法には、ＳＭＡＲＴ法以外にもいくつかのバリエーションが存在する。たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈ社が商業的に供給しているＲＡＣＥ法用キットであるＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴ法とは異なる原理によって末端への既知塩基配列の付加を実現している。Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」と呼ばれる２本鎖オリゴヌクレオチドを利用する。「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」は、３’末端をブロックされたプライマーとならない短いオリゴヌクレオチドと、このオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を３’末端に有する長いオリゴヌクレオチドで構成されている。
【００１１】
「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」における短いオリゴヌクレオチドの５’側は平滑末端である。「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」の平滑末端をｃＤＮＡの末端にライゲーションすることによって、未知の塩基配列に塩基配列がわかっているＤＮＡが付加される。ライゲーション産物を鋳型として、次のようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行えば、未知の塩基配列を含むＤＮＡを増幅することができる。
−塩基配列が既知の領域にアニールする遺伝子特異プライマー
−「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」を構成する長いオリゴヌクレオチドの５’側塩基配列（短いオリゴヌクレオチドには重ならない領域）に相補的な塩基配列を有するプライマー
【００１２】
ＳＭＡＲＴ法やＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡの原理においては、ｃＤＮＡの両端に同じ塩基配列が付加されてしまう場合がある。これらの方法においては、抑制ＰＣＲ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＰＣＲ；　Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ　Ｌ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　１９９６　Ｊｕｎ，　１１；９３（１２）：６０２５−３０）を利用することによって、両端に同じ塩基配列が付加されたｃＤＮＡの合成を抑制している。
【００１３】
抑制ＰＣＲとは、両端に同じ塩基配列を付加されたｃＤＮＡが、ＰＣＲ法においては合成されにくくなる現象を利用している。同じ塩基配列を付加されたｃＤＮＡは、各鎖の５’末端と３’末端が互いに相補的な塩基配列で構成されている（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）。その結果、１本鎖に変性されて鋳型となるステップにおいて、両端の相補的な塩基配列が互いにハイブリダイズして、フライパン状の構造を取る。同一鎖内のハイブリダイズは、プライマーとのハイブリダイズよりも優先的に起きるため、けっきょく、このような構造を有する鋳型は、ＰＣＲのための鋳型とはなり得ないことになる。これが、抑制ＰＣＲの原理である。
【００１４】
その他にも、ＲＡＣＥ法のバリエーションは知られている。たとえば、末端部分に未知の塩基配列を有するＤＮＡであっても、両端を連結して環化すれば、塩基配列がわかっている部分を利用してＰＣＲのためのプライマーをデザインすることができる。この方法は、ｍＲＮＡの５’末端に対する特異性が無い。そのため、特に５’側が未知の遺伝子の全長を取得しようとする場合には、不向きである。
ｃＤＮＡの第１鎖の３’末端に、塩基配列がわかっているオリゴヌクレオチドを連結する方法も公知である。この方法は、第１鎖を合成後に精製する工程を要する。
したがって、ＳＭＡＲＴ法やＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの５’末端に対する特異性が期待できる有利な方法であると言うことができる。特にＳＭＡＲＴ法は、利用する酵素が少ない上、反応工程も他の方法に比べるとシンプルである。
【００１５】
しかし、ｍＲＮＡの５’末端に対する特性が期待できるとはいえ、転写量が低い遺伝子については、依然として、その全長を取得することは困難であることは事実である。したがって、わずかなｍＲＮＡをもとに、その全長を取得することができる新たなＲＡＣＥ法が提供されれば有用である。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成するための新たな原理の提供を課題とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
ＲＡＣＥ法においては、最終的にはＰＣＲのようなプライマー依存性の相補鎖合成反応を利用して、目的とする遺伝子が合成される。一般に、プライマー依存性の相補鎖合成反応は、合成すべきポリヌクレオチドの塩基配列に基づいてプライマーの塩基配列をデザインしなければならない。一方で、ＲＡＣＥ法の目的は、塩基配列が未知の領域を合成することにある。したがって、プライマーがアニールすべき塩基配列としてどのような塩基配列を選択し、またその塩基配列をどのようにして導入するのかが、ＲＡＣＥ法のパフォーマンスを決定する大きな要因となる。しかし既知のＲＡＣＥ法においては、どのような塩基配列を導入すれば、望ましい結果を得ることができるのかは、十分に検討されていない。また塩基配列の導入方法についても、なお改善の余地があると言える。
【００１８】
これに対して本発明者らは、５’側に未知の塩基配列を含む鋳型ポリヌクレオチドの相補鎖合成において、合成された相補鎖における３’末端に特定の塩基配列を付加することによって、ＲＡＣＥ法のパフォーマンスの向上が期待できることを見出した。更に、この目的のために好適な反応条件を明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成方法。
ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程
ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程、および
ｃ）工程ｂ）で得られた相補鎖を鋳型とし、工程ａ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成する工程、
〔２〕工程ｂ）が、次の要素を相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートする工程からなる〔１〕に記載の方法。
（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（２）工程ａ）で合成したポリヌクレオチド、および
（３）ヌクレオチド基質
〔３〕５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡの第２鎖である〔１〕に記載の方法。
〔４〕ｃＤＮＡが５’末端に前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を含むポリヌクレオチドを付加したｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡである〔３〕に記載の方法。
〔５〕５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを、次の要素を相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートすることによって合成する工程を含む〔３〕に記載の方法。
（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖
（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、および
（ｉｖ）ヌクレオチド基質
〔６〕（ｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いる〔５〕に記載の方法。
〔７〕（ｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、逆転写酵素活性を有する酵素を用いる〔５〕に記載の方法。
〔８〕インキュベートに先だって、ｃＤＮＡの第１鎖の３’にパリンドローム構造を有するオリゴヌクレオチドを付加する工程を含む、〔５〕に記載の方法。
〔９〕５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡの第１鎖である〔１〕に記載の方法。
〔１０〕ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであり、このｃＤＮＡが５’に任意の塩基配列を付加したオリゴｄＴプライマーによって合成されたｃＤＮＡである〔９〕に記載の方法。
〔１１〕〔３〕または〔９〕に記載の方法に基づいて合成された５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドをクローン化する工程を含む、末端塩基配列が未知のポリヌクレオチドの単離方法。
〔１２〕ｃＤＮＡの第１鎖、および／または第２鎖の３’末端にパリンドローム構造を有するｃＤＮＡからなるｃＤＮＡライブラリー。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の工程を含む、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程
ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程、および
ｃ）工程ｂ）で得られた相補鎖を鋳型とし、工程ａ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成する工程、
【００２０】
本発明において、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドとは、相補鎖合成の鋳型とすることが可能なあらゆるポリヌクレオチドが含まれる。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらのハイブリッドポリヌクレオチド、そして各種のヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドを示すことができる。ポリヌクレオチドは、天然由来のみならず、人工的に製造されたポリヌクレオチドであってもよい。あるいは、天然由来のポリヌクレオチドに人為的な変異を導入したポリヌクレオチドを利用することもできる。
本発明において、特に重要なポリヌクレオチドはｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡである。ここでいうｃＤＮＡは、第１鎖並びに第２鎖のいずれをも含む。ｍＲＮＡ、ならびにｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡの５’末端を含む領域は、しばしば塩基配列の決定が必要となる重要なポリヌクレオチドである。
【００２１】
本発明において、５’末端を含む領域の塩基配列が未知とは、前記工程ａ）における相補鎖合成の鋳型となるポリヌクレオチドの５’末端を含む領域の塩基配列が未知であることを言う。したがって、もしも当該ポリヌクレオチドが、他のポリヌクレオチドＸを鋳型として生成された場合には、ポリヌクレオチドＸの３’側の塩基配列が未知である。
さてポリヌクレオチドＸがｍＲＮＡの場合、通常その３’末端はポリ（Ａ）である。本発明においてｍＲＮＡの３’末端を含む領域が未知であるとは、３’末端のポリ（Ａ）ｔａｉｌを除く領域の塩基配列が未知である場合を言う。更に、ｍＲＮＡの３’末端を含む領域を鋳型として合成されたｃＤＮＡにおいては、その５’末端に配置されたｔの連鎖（ｔ　ｓｔｒｅｔｃｈ）の有無に関わらず、５’末端を含む領域のｔの連鎖を除いた塩基配列が未知である場合、当該ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列は未知であると言う。
ただし、工程ｂ）において、所定の塩基配列を付加すべき３’末端とは、ｔの連鎖を鋳型として生成した相補鎖の３’末端であってよい。つまり、未知かどうかの判断においてはポリ（Ａ）が考慮されない。他方、３’末端へ塩基配列を付加する場合には、もしも３’末端にａの連鎖が存在する場合には、ａの連鎖の３’末端に塩基配列を付加することができる。
【００２２】
本発明において、工程ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程は、プライマー依存性の相補鎖合成反応を触媒する任意の酵素によって実施することができる。このような酵素として、たとえばＴａｑ　ポリメラーゼを示すことができる。
【００２３】
一方、工程ａ）においてプライマーとするオリゴヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの任意の領域にアニールして相補鎖合成をプライムし、前記ポリヌクレオチドの５’末端に至る領域に対する相補鎖の合成を可能とするものであれば、その塩基配列や長さは制限されない。一般に、ある程度の特異性を維持して相補鎖合成反応を開始するには、少なくとも１５塩基以上、通常２０〜４０塩基、たとえば２０〜３０塩基からなるオリゴヌクレオチドがプライマーとして利用される。このようなオリゴヌクレオチドの調製方法は公知である。
【００２４】
次にオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列は、前記ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的な塩基配列で構成される。本発明において相補的とは、ワトソン−クリックのルールにしたがってベースペア（相補鎖結合）を形成することができる塩基配列を言う。なお本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、完全に相補的でなくてもよい。すなわち、特異性を維持できるストリンジェンシーのもとで、相補鎖合成を開始することができるオリゴヌクレオチドは、その塩基配列が完全に相補的でなくても本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる。たとえばプライマーの３’末端の塩基は、鋳型に対して相補的であることが重要な条件である。しかし、プライマーの中間部分や５’末端は、必ずしも完全に相補的である必要はない。
【００２５】
本発明においては、前記ポリヌクレオチドの５’末端を含む領域は塩基配列が未知である。しかしその他の領域については塩基配列が明らかな部分もある。したがって本発明のオリゴヌクレオチドは、この、塩基配列が明らかな部分に対して相補的な塩基配列を含むようにデザインすることができる。前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであれば、遺伝子を構成する塩基配列中、塩基配列が明らかな部分にアニールし、塩基配列が未知の領域に向かう相補鎖合成反応をプライムできるようにデザインする。
【００２６】
本発明は、工程ａ）に続いて工程ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程を含む。工程ｂ）は、任意の方法によって実施することができる。本発明における工程ｂ）として、たとえば次の方法を示すことができる。すなわち、次の要素を相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートすることによって、工程ｂ）を実施することができる。
（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（２）工程ａ）で合成したポリヌクレオチド、および
（３）ヌクレオチド基質
【００２７】
前記（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いれば、単一の酵素によって前記要素（１）と（２）を兼ねることができるので望ましい。このような酵素として、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム製）ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴＡＫＡＲＡ　Ｔａｑ（いずれも宝酒造製）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（アプライドバイオシステムズ製）、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ（いずれもプロメガ製）などを示すことができる。
【００２８】
あるいは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する他の酵素を付加的に加えることができる。たとえばλｅｘｏ（λｐｈａｇｅ）は２本鎖特異的５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持っている。上記工程には、鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素が基質として用いることができるヌクレオチド基質が添加される。具体的には、一般にＰＣＲ法や、ｃＤＮＡの合成において利用されているヌクレオチド基質を用いることができる。通常、ａｔｃあるいはｇの天然のデオキシヌクレオチドが用いられる。その他、必要に応じて蛍光分子、放射性同位元素、あるいはビオチン等によって修飾されたヌクレオチド誘導体を用いることもできる。
【００２９】
これらの要素を（３）工程ａ）で合成したポリヌクレオチドとともに、相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートすることにより、工程ａ）で合成したポリヌクレオチドの３’末端に、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を付加することができる。上記要素のインキュベートによって、ＤＮＡの３’末端に目的とする塩基配列を付加する反応は、これまでに報告されていない。本発明者らは、前記のような特定の条件で、ポリヌクレオチドの末端に目的とする塩基配列を付加することができ、更に付加された塩基配列を利用して、末端の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００３０】
要素（１）−（３）のインキュベーションによる前記ポリヌクレオチドの３’末端への塩基配列の付加は、次のようなメカニズム（図４）によって説明することができる。（３）工程ａ）で合成したポリヌクレオチドは、鋳型となったポリヌクレオチドと２本鎖を形成している。線状の２本鎖ＤＮＡは、特に低濃度においては環状となり、両末端が接近する（Ｈｅｆｆｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．　７５：６０１２−６０１６，１９７８）。溶液中のＤＮＡは、環状の形態を取ることによって物理的に安定化すると考えられている。
【００３１】
ＤＮＡが十分に安定な温度にあれば、２本鎖は安定化される。しかし、たとえば耐熱性のＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応を行う条件下では、かなりの高温条件下におかれることになる。たとえばＥｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）による相補鎖合成反応は、７０℃前後の高温が利用される。このような高温の条件下では、２本鎖ＤＮＡの末端部分は２本鎖構造を安定に維持できない。その結果、３’末端が本来ベースペアリングすべき鎖（ｓｔｒａｎｄ）以外の鎖に接近し、更にその鎖を鋳型として相補鎖合成を開始してしまう反応が起こり得る。本発明においては、この現象を、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型の乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）と呼ぶ。
【００３２】
このとき、もっとも鎖の乗換えが起こりやすいのが、環状構造を取ることによって接近している、線状ＤＮＡの両末端である。より具体的には、３’末端が同じ鎖の５’末端に接近し、その塩基配列に相補的な塩基配列を合成してしまう。その結果、３’末端には、自身の５’末端に相補的な塩基配列が付加される。自身の５’末端とは、もともとプライマーである前記オリゴヌクレオチドの塩基配列であるから、結果として３’末端には、前記オリゴヌクレオチドの相補配列が付加される。
【００３３】
本発明において、ポリヌクレオチドの３’末端に目的とする塩基配列を付加するメカニズムは、ここで説明したメカニズムに限定されない。いずれにせよ、ここに述べた条件でインキュベートすることにより、工程ｂ）は達成される。このことは、実施例の結果からも裏付けられている。
【００３４】
本発明において、前記ポリヌクレオチドとして、ｃＤＮＡを用いる場合、ｃＤＮＡは第２鎖あるいは第１鎖のいずれをも、利用することができる。ｃＤＮＡの第１鎖は、ｍＲＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡである。また第２鎖は、ｃＤＮＡの第１鎖を鋳型として合成されたＤＮＡを言う。第２鎖をテンプレートにする場合はｍＲＮＡの５’方向へとＤＮＡ合成が進行するので５’ＲＡＣＥを実現できる。逆に第１鎖をテンプレートにする場合はｍＲＮＡの３’側へとＤＮＡ合成が進行するので、３’ＲＡＣＥを行うことができる。第２鎖をテンプレートにするためには、第２鎖に相補的な塩基配列を有するプライマーをデザインする。また第１鎖がテンプレートであれば、プライマーの塩基配列は第１鎖に相補的な塩基配列とする。ｃＤＮＡ第２鎖の５’側（すなわちｍＲＮＡの５’側）は、翻訳開始コドンを含む。したがって、第２鎖の５’側の領域は、ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて翻訳アミノ酸配列を推定する上で重要である。そのためこの領域の塩基配列を決定することは、遺伝子の単離や機能解析において、しばしば重要な課題となる。
【００３５】
ｃＤＮＡの第２鎖を本発明における前記ポリヌクレオチドとして用いる場合、第２鎖は次の要素（ｉ）−（ｉｖ）を相補鎖合成が可能な条件でインキュベートすることによって合成することができる。
（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖
（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、および
（ｉｖ）ヌクレオチド基質
【００３６】
本発明において、（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖は、ｍＲＮＡの任意の領域に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、逆転写酵素活性を有する酵素により合成することができる。第１鎖を合成するためのプライマーは、前記工程ａ）で用いるオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるのが望ましい。一般的なｃＤＮＡの合成方法においては、第１鎖を合成した後に鋳型となったｍＲＮＡは分解される。ｍＲＮＡは、アルカリ変性やＲＮＡｓｅＨなどの酵素作用によって容易に分解できる。ｍＲＮＡが分解されると、ｃＤＮＡの第１鎖は１本鎖となる。本発明において、第１鎖の合成のための逆転写酵素として、第２鎖の合成や工程ｂ）に用いる鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素を用いることもできる。Ｔｆｌ、あるいはＴｔｈのように、逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが公知である。これらのＤＮＡポリメラーゼは、市販されている（プロメガ）。このような酵素を用いることにより、反応系を構成する酵素の数を減らすことができる。
【００３７】
ｃＤＮＡの第２鎖は、こうして合成された第１鎖を鋳型として合成されたＤＮＡである。鋳型依存性の相補鎖合成反応は、通常はプライマーの３’末端からの相補鎖合成反応が利用される。プライマーの塩基配列特異的なアニールにより、合成すべき塩基配列を特異的に合成することができる。しかしプライマーは、相補鎖合成のための必須の条件ではない。たとえば上記要素（ｉ）−（ｉｖ）を相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートするとき、ｃＤＮＡの第１鎖を鋳型とする相補鎖合成反応が達成される。ここで言う相補鎖合成が可能な条件とは、上記要素（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素がその活性を維持できる条件を言う。用いる酵素に応じた酵素活性の維持に必要な条件は、当業者が適宜設定することができる。
【００３８】
上記要素（ｉ）−（ｉｖ）のインキュベートによるｃＤＮＡ第２鎖の合成メカニズムは、例えば次のように説明することができる。まず、ｃＤＮＡの第１鎖の３’末端が、自身に接近して、自身を鋳型とする相補鎖合成反応を開始する。第１鎖の３’末端には、必ずしも自己相補的な塩基配列を有しているとは限らない。しかし、数塩基であっても自身を鋳型とする相補鎖合成反応が起きれば、３’末端は自己相補的な塩基配列を獲得する。その結果、自身へのベースペアリングがより安定化され、やがて３’末端は完全なステムループ構造を取る。ステムループ構造が実現できれば、自身を鋳型とする相補鎖合成反応が進行してｃＤＮＡの第２鎖の合成は完成する。
【００３９】
３’末端の自身への接近によって、自身を鋳型とする相補鎖合成反応を開始する現象はたとえばテトラヒメナにおいても観察されている。あるいは第１鎖の３’末端からの自身を鋳型とする相補鎖合成反応は、ｃＤＮＡの合成においても利用されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．　”Ｅｎｚｙｍｉｃ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅｓ”　Ｃｅｌｌ　７：２７９−２８８，　１９７６）。
したがって、上記要素（ｉ）−（ｉｖ）のインキュベートによって、自身を鋳型とする相補鎖合成反応開始することは可能である。実際にこの条件によってｃＤＮＡの第２鎖を合成する反応を実施例に記載した。
【００４０】
さて、このようなメカニズムに基づけば、第２鎖の完成によって、第１鎖と第２鎖が同一の鎖上に連続したｃＤＮＡが合成されることになる。このようなｃＤＮＡは、両者がアニールした２本鎖部分と、ステムループを構成するヒンジ部分とを有する。ここで上記要素（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ｃＤＮＡの２本鎖部分を構成している第１鎖を５’末端から消化する。ｃＤＮＡの消化は２本鎖のＤＮＡに作用するので、けっきょく第１鎖はヒンジ部分に至るその全長を消化されることになる。こうして、最終的に、１本鎖の第２鎖を生成する。生成した第２鎖は、５’末端を含む塩基配列が未知であり、かつその３’末端に第１鎖の合成に用いたプライマーに相補的な塩基配列を有するから、上記工程ａ）におけるポリヌクレオチドとして利用することができる。
【００４１】
本発明における工程ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程として、次のような方法を示すこともできる。すなわち、５’末端に前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を含むポリヌクレオチドを付加したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ第１鎖を合成するのである。こうして合成された第１鎖３’末端には、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列が配置される。つまりこのｃＤＮＡ第１鎖は、工程ｂ）の目的とするポリヌクレオチドに他ならない。
【００４２】
ｍＲＮＡの５’末端に任意のオリゴヌクレオチドを連結する方法は公知である。たとえば、全長ｃＤＮＡの合成方法であるオリゴキャップ法は、オリゴキャップリンカーと呼ばれるオリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡの５’末端に特異的に結合するための方法である（Ｍｕｒａｙａｍａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｓｕｇａｎｏ，　Ｓ．　（１９９４）　Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐｐｉｎｇ：　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄｔｏ　ｒｅｐｌａｃｅ　ｔｈｅ　ｃａｐ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ　ｍＲＮＡｓ　ｗｉｔｈ　ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．　Ｇｅｎｅ　１３８，　１７１−１７４．）。オリゴキャップ法は、真核細胞生物のｍＲＮＡの５’末端にあるキャッピング構造をターゲットにリンカーを結合する。したがって、５’末端のキャッピング構造を持たない不完全なｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの混入を防ぐことができる。
【００４３】
オリゴキャップ法を本発明に応用するには、オリゴキャップリンカーの塩基配列を、前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列とすればよい。通常、オリゴキャップ法では、全長ｃＤＮＡが特異的に増幅されるように、オリゴキャップリンカーの塩基配列は、遺伝子中に見出しにくい塩基配列の利用が有利である。遺伝子中に見出される塩基配列を用いた場合は、全長ｃＤＮＡではなく遺伝子の断片が増幅される可能性を否定できないためである。一方本発明においては、３’’末端には前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を導入するため、リンカーの塩基配列はむしろ遺伝子中に見出される塩基配列となる。本発明においては、リンカーの塩基配列が異なるほかは、オリゴキャップ法と同様の操作により、ｍＲＮＡの５’末端へオリゴヌクレオチドが付加される。
【００４４】
本発明において、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの第１鎖を用いることもできる。ｃＤＮＡの第１鎖は通常、オリゴｄＴプライマーを用いて合成される。次に、遺伝子中の塩基配列が明らかな領域に対するオリゴヌクレオチドを用いて第１鎖を鋳型として第２鎖を合成する。その結果、第２鎖の３’末端は、ａの連続した塩基配列で構成されることになる。同じ塩基の連続は、前記要素（１）−（３）のインキュベートによる工程ｂ）には不向きである。第２鎖の５’末端を構成する前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、通常ｔの連鎖のような単調な塩基配列とはならない。そのため、先に説明した前記要素（１）−（３）のインキュベートによる工程ｂ）が起こりにくくなる。このような不都合は、第２鎖の３’末端の塩基配列に適当な塩基配列を付加することによって避けることができる。
【００４５】
たとえばオリゴｄＴプライマーの５’末端に適当な塩基配列を付加しておくことによって、第２鎖の３’末端に任意の塩基配列を与えることができる。たとえば、６〜８塩基の制限酵素の認識配列をオリゴｄＴプライマーの５’末端に付加することができる。このようなオリゴｄＴプライマーは、その３’末端への適当な塩基配列の付加を可能とするとともに、クローニング用ベクターへのｃＤＮＡのライゲーションにおいても有用である。あるいは、オリゴｄＴプライマーの５’末端に、前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を付加することによって、前記工程ｂ）を実施することもできる。
【００４６】
本発明において、上記要素（ｉ）−（ｉｖ）のインキュベートに先だって、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にパリンドローム構造を有するオリゴヌクレオチドを付加することができる。パリンドローム構造とは、末端においてヘアピンループを構成しうる自己相補配列を含む塩基配列を言う。自己相補配列を構成する塩基の数は、制限されない。より具体的には２−２０塩基、たとえば２−４塩基の自己相補配列を示すことができる。具体的には、５’−ａａｇｃｔｔ−３’は、本発明のパリンドローム構造として利用することができる。
【００４７】
このような付加的な塩基配列は、たとえば前記オリゴヌクレオチドの５’末端への自己相補配列の付加によって実現することもできる。このとき、自己相補配列の付加とプライマーの５’末端への制限酵素サイトの付加を兼ねることもできる。たとえば先に例示した塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’も、制限酵素認識配列の一つである。パリンドローム構造は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に付加することもできる。たとえば、前記ポリヌクレオチドの合成にあたり、鋳型となるポリヌクレオチドの５’末端に付加すべき塩基配列の相補配列を付加しておけばよいのである。たとえば、先に述べたオリゴキャップ法のように、ｍＲＮＡの５’末端に人為的な塩基配列を付加する反応は公知である。この反応を利用すれば、パリンドローム構造に必要な自己相補配列をｍＲＮＡの５’末端に付加することができる。そして目的とする塩基配列を導入されたｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡは、その３’末端にパリンドローム構造を有する。
【００４８】
第２鎖であれ、第１鎖であれ、いずれにせよ上記のような反応によって、塩基配列が未知である領域の３’末端に、前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列が付加されたポリヌクレオチドとすることができる。
このようにして得られた末端にパリンドローム構造を付加されたポリヌクレオチドの集合体は、本発明によるポリヌクレオチドの合成方法のためのｃＤＮＡライブラリーとして有用である。このｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、単一の遺伝子特異的プライマーを使って５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥのいずれをも実施することができる。つまり、ｃＤＮＡの第２鎖にアニールするプライマーによって５’ＲＡＣＥが、第１鎖にアニールするプライマーによって３’ＲＡＣＥが可能となる。パリンドローム構造を末端に配置されたｃＤＮＡからなるｃＤＮＡライブラリーが構築されれば、同じライブラリーを用いて、本発明に基づいて、様々な遺伝子の未知塩基配列を容易に取得することができる。本発明のポリヌクレオチドの合成方法において、３’末端へのパリンドローム構造の付加は必須ではない。しかし遺伝子特異プライマーの伸長産物の、自己を鋳型とする相補鎖合成（セルフプライム）を促進するためには、パリンドローム配列の付加は有効である。
【００４９】
本発明のｃＤＮＡライブラリーを用いれば、ゲノムプロジェクトによって同定された未知の遺伝子の塩基配列をもとにしてｃＤＮＡを単離することができる。一旦ｃＤＮＡがクローニングされれば、ｃＤＮＡに基づいてタンパク質の解析も可能となる。また本発明のｃＤＮＡライブラリーは、既知の遺伝子の、発現量の少ないスプライシングバリアントの単離に利用することができる。本発明に基づいて、いろいろな組織由来のｃＤＮＡライブラリーを合成しておけば、遺伝子やスプライシングバリアントの単離において利用価値は高い。
【００５０】
末端にパリンドローム構造を付加されたポリヌクレオチドは、工程ｃ）において前記オリゴヌクレオチドをプライマーとするポリヌクレオチドの合成方法によって増幅することができる。増幅すべき塩基配列の末端領域に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、目的とする塩基配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法は公知である。
【００５１】
本発明において、工程ｃ）は、たとえばＰＣＲ法によって実施することができる。具体的には、まず工程ｂ）で得たポリヌクレオチドを変性して１本鎖とする。ＰＣＲ法においては、鋳型ポリヌクレオチドは、一般に加熱によって変性される。変性されたポリヌクレオチドは、プライマーとなるオリゴヌクレオチドとともに、このプライマーからの相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートされる。当業者は、プライマーの塩基配列や反応液の組成に応じて、相補鎖合成が可能な条件を設定することができる。変性と相補鎖合成反応とを繰り返すことにより、ＰＣＲ法に基づいて目的とするポリヌクレオチドを連続的に生成することができる。
【００５２】
相補鎖合成を触媒するＤＮＡポリメラーゼには、ポリヌクレオチドの変性温度においても活性を失わない耐熱性の酵素を利用するのが有利である。先に用いた（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素、あるいは（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として用いたＤＮＡポリメラーゼが耐熱性を有していれば、そのまま工程ｃ）に利用することもできる。
工程ｃ）において合成されたポリヌクレオチドは、エタノール沈殿などの公知の方法によって分離することができる。あるいは、電気泳動などの手法を用いて、目的とするサイズのポリヌクレオチドを分取することもできる。
【００５３】
既知のＲＡＣＥ法のうち、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡという商品名で実用化されているＲＡＣＥ法においては、抑制ＰＣＲ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＰＣＲ）と呼ばれる方法が応用されていることは既に述べた。一方、本発明に基づくＲＡＣＥ法においては、ｃＤＮＡの両端に相互に相補的な塩基配列が配置されることになる。つまり本発明に基づくＲＡＣＥにおいて最終的に鋳型となるｃＤＮＡは、逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）を有する。ｃＤＮＡのこのような構造は、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡにおいては抑制ＰＣＲの原理によって合成が抑制されるべき構造であると言える。ところが実際には、本発明に基づくＲＡＣＥ法は可能であり、目的とするｃＤＮＡの合成が効率的に行われることは実施例に示したとおりである。
【００５４】
本発明において、ｃＤＮＡが逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）を有するのにもかかわらず、目的とするｃＤＮＡの合成が可能な理由として、たとえば次のようなメカニズムが考えられる。
既に述べたように、抑制ＰＣＲにおいて、逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）が鋳型として利用されにくい理由は、同一鎖上の相補配列のハイブリダイズが、プライマーのアニールと競合するためである。ところが、遺伝子に由来する塩基配列が十分に長い場合には、同一鎖内のハイブリダイズが起きにくくなる場合が考えられる。その結果、プライマーのアニールを十分に阻害できない、つまり抑制ＰＣＲが作用しない状況が生じる。ＲＡＣＥにおいては、遺伝子部分の塩基配列が長いものが、取得すべきｃＤＮＡである可能性が高い。したがって、逆位反復配列を有するｃＤＮＡを鋳型とすることによって、より長い塩基配列を選択的に合成するメカニズムが実現できたことになる。
【００５５】
また、鋳型となるｃＤＮＡとプライマーの比も重要な要素である。つまり、プライマーをｃＤＮＡに対して大過剰で用いることにより、同一ＤＮＡ分子（ｉｎｔｒａ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）上の相補鎖のハイブリダイズよりも、プライマーとのアニールの機会を大きくすることができる。具体的には、予測される鋳型の量に対してモル比で、約５倍〜２０倍、好ましくは１０倍以上のプライマーを用いるのが有利である。たとえば、長さ１ｋｂ　の２本鎖ｃＤＮＡ１μｇ（約９．１２ｘ１０^１１　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に対して１０ｐｍｏｌ　（約７８ｎｇ：約５．９ｘ１０^１２　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）から２０ｐｍｏｌの２４ｍｅｒプライマーを用いることができる。
【００５６】
本発明によるポリヌクレオチドの合成方法は、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドのクローン化に有用である。すなわち本発明は、本発明の記載の方法に基づいて合成された５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドをクローン化する工程を含む、末端塩基配列が未知のポリヌクレオチドの単離方法に関する。
合成されたポリヌクレオチドをクローン化する方法は、公知である。一般的には、適当なクローニングベクターに合成されたポリヌクレオチドを組み込んで、クローン化することができる。ポリヌクレオチドの合成に用いられるプライマーにクローニング用の制限酵素認識配列を付加しておくと、合成されたポリヌクレオチドを容易にクローニングベクターへ挿入することができる。あるいは、合成されたポリヌクレオチドを平滑末端のままクローニングベクターにライゲーションすることもできる。
【００５７】
クローニングされたポリヌクレオチドは、その塩基配列を決定することができる。挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列は、ベクターの塩基配列等に相補的な塩基配列を有するプライマーを利用して決定される。以上の工程により、たとえば第２鎖の５’末端を含む領域の塩基配列が未知である場合には５’ＲＡＣＥが、また第１鎖の５’末端を含む領域の塩基配列が未知である場合には３’ＲＡＣＥが可能となる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドの合成方法の用途は、ＲＡＣＥに限定されない。たとえば本発明の方法に基づいて、テロメラーゼ活性を測定することができる。テロメラーゼは、特定の塩基配列を有するＤＮＡを基質として、その３’末端にテロメアリピートと呼ばれる特定の塩基配列の繰り返しからなる塩基配列を付加する。テロメアリピートは、種ごとに決まった塩基配列で構成されている。たとえばヒトのテロメアリピートは（ＴＴＡＧＧＧ）　ｎである。付加されたテロメアリピートの長さに基づいてテロメラーゼの活性を評価することができる。本発明に基づいてテロメラーゼの活性を測定するには、基質ＤＮＡにテロメラーゼを作用させた後、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを作用させる。先に述べたメカニズムに基づいて、基質ＤＮＡの３’末端は自身にアニールして相補鎖が合成され、更に鋳型となった基質ＤＮＡの伸長産物自身は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって消化される。
【００５９】
ここで合成された相補鎖は基質ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するので、基質ＤＮＡと同じ塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖合成が可能である（工程ａ））。反応液中に残った基質ＤＮＡをそのままプライマーとして用いることもできる。相補鎖合成が５’末端に達すると２本鎖ＤＮＡの環状化と鋳型乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ａｃｔｉｏｎ）によって、３’末端に基質ＤＮＡに相補的な塩基配列が付加される（工程ｂ））。最終的に、基質ＤＮＡと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、テロメラーゼの作用によって伸長した基質ＤＮＡの３’末端側の未知塩基配列を増幅することができる。
【００６０】
なおテロメラーゼの作用によって付加される塩基配列がテロメアリピートであることは明らかである。しかしその長さや末端のテロメアリピートが繰り返し単位のどこまでを有しているかは不明である。したがって、テロメラーゼの作用によって伸長した基質ＤＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡは、本発明における５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドに含まれる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドの合成方法に必要な要素を組み合わせて、未知の塩基配列を含むポリヌクレオチドの合成用キットとすることができる。本発明に基づくキットは、たとえば次の要素で構成することができる。
−５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
−前記ＤＮＡポリメラーゼの活性を維持することができる緩衝液、および
−相補鎖合成のためのヌクレオチド基質
【００６２】
本発明における各要素の具体的な構成は、既に述べたとおりである。本発明のキットには、上記要素の他に、更に付加的な要素を追加することができる。たとえば、ｃＤＮＡ第１鎖を合成するための逆転写酵素や３’ＲＡＣＥを実施するためのオリゴｄＴプライマーを組み合わせることができる。あるいは、目的とするポリヌクレオチドの塩基配列が明らかな領域に対してデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを予め添付することもできる
【００６３】
また、ｍＲＮＡの５’末端にリンカーを導入する場合には、リンカーとするオリゴヌクレオチドやＲＮＡリガーゼを組み合せることができる。更に、ｍＲＮＡの５’末端へのリンカーの結合にオリゴキャップ法を応用する場合には、オリゴキャップ法に必要な各種の酵素が組み合せられる。たとえば、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）やタバコ酸性ピロフォスファターゼ（ＴＡＰ）を組み合せることができる。
【００６４】
本発明のキットには、実験材料や操作が適切であったかどうかを判定するためにコントロールを組み合せることができる。本発明におけるコントロールには、たとえば、どのようなｃＤＮＡライブラリーであっても、一定の大きさのｃＤＮＡの合成が期待できるプライマーを用いることができる。このようなｃＤＮＡを与えるプライマーとして、たとえばβアクチン遺伝子の合成を可能とするプライマーを示すことができる。
以下に実施例に基づいて更に具体的に本発明を説明する。
【００６５】
【実施例】
比較例．公知のＲＡＣＥ法と本発明のＲＡＣＥ法
公知のＲＡＣＥ法として、Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（クロンテク社製）を利用し、遺伝子の５’側の未知塩基配列の単離を試みた。遺伝子にはマウスＭｓｈ４を選択した。Ｍｓｈ４は、ＭｕｔＳミスマッチ修復遺伝子ファミリーの一員であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、マウス及びヒトで同定されている（Ｒｏｓｓ−Ｍａｃｄｏｎａｌｄ　ａｎｄ　Ｒｏｅｄｅｒ，　Ｃｅｌｌ　７９：　１０６９−８０　（１９９４）；　Ｚａｌｅｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１５３：　１２７１−８３　（１９９９）；　Ｋｎｅｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１４：　１０８５−９７　（２０００）；　Ｐａｑｕｉｓ−Ｆｌｕｃｋｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４４：　１８８−９４　（１９９７））Ｍｓｈ４の塩基配列は既に公知だが、今回はそのスプライシングバリアントの取得を目的とした。マウス（８週齢）の睾丸からｍＲＮＡを抽出し、常法にしたがってｃＤＮＡを合成した。次にｃＤＮＡの両端にアダプターをライゲーションした。以上の工程は、クロンテク社のマニュアルにしたがった。得られたアダプター付加ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＭｓｈ４のスプライシングバリアントγ（Ｍｓｈ４−γ）およびβアクチンに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応シーケンスと反応液の組成を次に示す。
［９４℃／３０秒→６０℃／１分→６８℃／３分］×３５サイクル
２μＬ　　　　１０ｘ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ
１μＬ　　　　２．５ｍＭ　４ｄＮＴＰｓ
１μＬ　　　　睾丸ｃＤＮＡ（アダプター付加済み）
０．２μＬ　　Ｅｘ−Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ
０．４μＬ　　各遺伝子特異プライマー（１０μＭ）
０．４μＬ　　アダプタープライマー（１０μＭ）
１５μＬ　　蒸留水（ｔｏｔａｌ　２０μＬ）
実験に用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。＃１８と＃２０がマウスＭｓｈ４の塩基配列に基づいてデザインされた遺伝子特異プライマー（ＧＳＰ）である。
＃１８：５’−ＧＧＣＡＴＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：１）
＃２０：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号：２）
β−ａｃｔｉｎ　１：　５’−ＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：３）
β−ａｃｔｉｎ　２：　５’−ＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号：４）
反応後の反応液の一部を取り、アガロースゲルで電気泳動した。エチジウムブロマイド染色により、アガロースゲル中のＤＮＡを検出した。Ｍｓｈ４の結果を図２に、βアクチンの結果を図３に示した。
【００６６】
Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔでは、図１に示すようにアダプタープライマーがアダプターの５’オーバーハングした１本鎖部分と同じ配列を持つようにデザインされている。アダプターを構成するオリゴヌクレオチドの３’末端はＮＨ_２基でブロッキングされているので、これを起点とする相補鎖合成は抑止されている。したがって、原理上は、遺伝子特異プライマー（ｇｅｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ；ＧＳＰ）からの相補鎖合成が起きない限り、アダプタープライマーからの相補鎖合成は起きない。
【００６７】
しかし実際には、非特異的な産物が合成されてスメアなバックグランドが出現した（図２、図２、レーン１）。非特異的な反応の産物と思われるこれらのスメアなバンドは、アダプタープライマーの塩基配列やその他の現象が原因によって生成されたと考えられた。クロンテク社のマニュアルには、次のような非特異反応が生じる可能性が指摘されている。たとえばｃＤＮＡに連結したアダプターのオーバーハング部分に相補鎖が合成されてしまい、遺伝子特異プライマーからの相補鎖合成無しでもｃＤＮＡが増幅される場合があることが記載されている。
【００６８】
そこで、上記のような非特異反応に起因する産物の合成を抑制するために、アダプタープライマーの量を制限してＰＣＲを試みた。すなわちｃＤＮＡとの連結に用いるアダプタープライマーの量を、１／１０〜１／１０００、およびアダプタープライマー無しの条件で、ＰＣＲを実施した。その結果、１／１０ではバックグランドが見られた（図２および図３のレーン２）。１／１００〜１／１０００に制限した場合には非特異的な産物の合成はほとんど見られなくなった（（図２および図３のレーン３−４）。更にアダプタープライマーを加えない場合にも、増幅産物が観察された（図３のレーン５）。すなわち遺伝子特異プライマーのみによるＰＣＲにおいても、増幅産物が検出された。
【００６９】
合成されたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した結果、１つを除いていずれも目的とするＤＮＡが合成されていることが確認された。これらの結果に基づいて、アダプタープライマーを使わず、遺伝子特異プライマーのみで増幅することが可能な未知の構造を有するｃＤＮＡが合成されていることが示された。
【００７０】
たとえば図４に示すメカニズムによって、アダプタープライマーを用いないＤＮＡの合成が可能となると考えられた。
サイクル１：
通常のＰＣＲと同じように、遺伝子特異プライマー（ｇｅｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ）から２本鎖ＤＮＡが合成される。
サイクル２：
ある頻度で１本鎖の３’末端付近がヘアピン構造を形成し、この部分をプライマーとして自身を鋳型として２本鎖ＤＮＡが合成される。ヘアピン構造をプライマーとするＤＮＡの複製は、テトラヒメナのｒＤＮＡの合成においても観察されている現象である。合成された２本鎖ＤＮＡのほとんどは、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの２本鎖ＤＮＡ特異的な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって１本鎖に分解される。このとき、もしも５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の作用を受けない場合には、サイクル３−ｎｏ　ｅｘｏ　ａｔｔａｃｋｅｄで示した構造のＤＮＡを生成する。ただし、このような構造を有するＤＮＡが合成される可能性は低いと考えられる。
【００７１】
サイクル３：
サイクル２で生成した１本鎖ＤＮＡを鋳型にして２本鎖ＤＮＡが合成される。ＤＮＡ合成は６８℃という高温で行われるので、先に合成された２本鎖の末端は一部が２本鎖構造を維持できなくなっている。その結果、鋳型の５’末端まで合成を終えたＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは、自身が合成した新しい相補鎖を鋳型として更に合成を続け、プライマーの塩基配列に相補的なＤＮＡをも合成する。このような反応を、鋳型乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ａｃｔｉｏｎ）と呼ぶことは既に述べた。プライマーの塩基配列に相補的な塩基配列は、新たに合成された相補鎖の３’末端に位置する。
サイクル４：
以降のサイクルでは、通常のＰＣＲと同様にＤＮＡが増幅される。ただし、ＤＮＡの３’末端には常にプライマーの相補配列が位置するので、ＰＣＲに必要なプライマーは１種類である。
【００７２】
実施例
図４に示したように、アダプターを用いず未知の塩基配列の増幅が可能であることを確認するために、次の実験を行った。すなわち、上記比較例と同じｃＤＮＡ、またはＥ１２．５マウス胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーを対象として、遺伝子特異プライマーのみを用いて５’ＲＡＣＥを行った。ｃＤＮＡへのアダプターのライゲーションの工程を省き、ＰＣＲにおいてアダプタープライマーを加えない他は、上記比較例と同じ条件でＤＮＡを合成した。実験に用いた遺伝子特異プライマーの塩基配列を以下に示す。
＃６　：５’−ＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号：５）
＃１８：５’−ＧＧＣＡＴＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：１）
＃２０：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号：２）
＃２１：　５’−ＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号：６）
＃２６：　５’−ＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＧ−３’（配列番号：７）
＃２７：　５’−ＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡ−３’（配列番号：８）
β−ａｃｔｉｎ　１：　５’−ＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：３）
β−ａｃｔｉｎ　２：　５’−ＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号：４）
上記プライマーのうち、＃６、＃２０、＃２１はＭｓｈ４−γの塩基配列に基づいてデザインされたプライマーである。各プライマーがアニールする領域は、それぞれＭｓｈ４−γのｃＤＮＡの３’側から、＃６、＃２０、＃２１の順に並んでいる。一方＃２６と＃２７は、Ｍｓｈ４のスプライシングバリアントε（Ｍｓｈ４−ε）の塩基配列に基づいてデザインされたプライマーである。各プライマーがアニールする領域は、それぞれＭｓｈ４−εのｃＤＮＡの３’側から＃２６、および＃２７の順に並んでいる。したがって、これらのプライマーを組み合せることによってｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行うことができる。
【００７３】
遺伝子特異プライマーとして＃２６、＃２７、または＃１８を用いた結果の一部を図５に示す。図５は、各プライマーについて３連、または６連で反応させた結果を示している。鋳型には、マウス胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用いた。１種類のプライマーによって、目的とする増幅産物が増幅されていることが確認された。
【００７４】
更に増幅されたＤＮＡの塩基配列の末端部分の塩基配列を決定し、その３’末端にプライマーに相補的な塩基配列が付加されていることを確認した。決定された末端部分の構造を図６および図７に示した。図中、四角で囲んだ塩基配列はプライマー由来の塩基配列、アンダーラインを付けた部分がプライマー以外の相補的な塩基配列を示す。アンダーラインを付けた部分の塩基配列が相補的であることは、ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇによって相補的な配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）が合成されたことを裏付けている。
【００７５】
この実験によって、Ｍｓｈ４の各スプライシングバリアントについて、以下のようなサイズのｃＤＮＡの増幅が確認された。本発明によって、未知の塩基配列を含む領域を単一のプライマーによって十分な長さにわたって増幅することができることが示された。なお実験にはバリアントγとεのプライマーしか用いていない。この実験で合成されたバリアントは、いずれもバリアントγまたはεと同じエキソンを含んでいる。そのため、バリアントγとεのためのプライマーによって、各種のバリアントが合成された。たとえばバリアントαβθおよびιは、いずれも＃２０、＃２１のプライマーがアニールする塩基配列を含んでいる。
α：約２ｋｂ
β：約２ｋｂおよび約１．５ｋｂ
δ：約１ｋｂ
ε：約２ｋｂ
θ：約１．５ｋｂ
ι：約１．５ｋｂ
【００７６】
図２および図３のゲルの写真から明らかなように、ｔａｒｇｅｔが存在していてＰＣＲの条件が至適であれば、本発明の方法によって非常にきれいな一本のバンドとしてｃＤＮＡが増幅される。本発明によるポリヌクレオチドの合成方法は、非常にユニークな方法でしかも信頼性も高い。本発明の方法が高い信頼性を有することは、全てのＭｓｈ４バリアントについてゲノムＤＮＡのｓｅｑｕｅｎｃｅと比較したところ、末端の塩基配列に特に異常は認められなかった、という事実によって裏付けられている。本発明の方法によれば、αδεのようにｃＤＮＡライブラリーに極めて僅かしか含まれていないｕｎｕｓｕａｌな構造を持つものも単離することが可能である。本発明の方法を利用して、ゲノムプロジェクトの情報をもとにして、ｕｎｕｓｕａｌ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙなるものの構築ができるかもしれない。
【００７７】
【発明の効果】
本発明によって、５’末端を含む領域の塩基配列が未知なポリヌクレオチドの合成方法が提供された。本発明の方法を、ｃＤＮＡの第２鎖に適用した場合には、５’ＲＡＣＥを実現できる。本発明に基づく５’ＲＡＣＥは、既知の方法では取得できなかった、より５’側に長いｃＤＮＡの取得を可能とした。また本発明の方法は、ｃＤＮＡの第１鎖に適用した場合に３’ＲＡＣＥを可能とする。本発明においては、同様の原理を、５’ＲＡＣＥと３’ＲＡＣＥのいずれにも応用することができる。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドの合成方法によれば、逆転写酵素、１つのプライマー、そして特定のＤＮＡポリメラーゼの利用によって、簡単な操作で５’末端を含む領域の塩基配列が未知なポリヌクレオチドの合成方法を可能とする。つまり本発明によって、安価で簡便な手法によって目的とするポリヌクレオチドの合成が可能となった。一方、既知の方法は、特殊なプライマーの利用を必須とし、更に複数の酵素を組み合せた複雑な反応に基づいて実施されていた。
【００７９】
本発明の方法は、目的とするポリヌクレオチドを効率的に合成することができる。効率的とは、次のような特徴を期待できることを言う。
−未知の塩基配列部分がより長い状態で取得できること
−非特異反応が抑制されること
ここで言う非特異反応は、目的とするポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを合成する反応を言う。具体的には、プライマーダイマーや、複数のｃＤＮＡ断片が連結された構造を有するポリヌクレオチドなどを生成する反応が非特異反応に含まれる。
この特徴により、本発明に基づく５’ＲＡＣＥや３’ＲＡＣＥは、目的とするｃＤＮＡの確実な取得を可能とする。
【００８０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に用いたＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔの反応原理を示す図である。図中、１はアダプタープライマーのアニール位置、２はｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲのためのアダプタープライマーがアニールする位置を示した。ｄｓ　ｃＤＮＡは２本鎖ｃＤＮＡを示し、またＮＮＴ３０は、ｃＤＮＡの合成に用いられたプライマーを示す。
【図２】マウスＭｓｈ４遺伝子に５’ＲＡＣＥ法を応用して得られたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。１ｓｔは５’側のプライマーを用いた場合の結果を、２ｎｄａｒｙは３’側のプライマーを用いた場合の結果を示す。
【図３】マウスβアクチン遺伝子に５’ＲＡＣＥ法を応用して得られたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図４】アダプタープライマーを用いないＤＮＡ合成のメカニズムを示す図。
【図５】アダプタープライマーを用いないＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図６】本発明によって増幅されたＤＮＡの末端部分の塩基配列を決定した結果を示す図である。図中、プライマーの塩基配列を四角で囲んで示した。また末端部分に付加されたプライマーに由来しに相補的な塩基配列にアンダーラインを付けた。各塩基配列はスプライシングバリアントごとに記載され、上が５’末端の、下が３’末端の塩基配列を示す。各塩基配列の左側にスプライシングバリアントの名前と、増幅産物の長さを示した。
【図７】本発明によって増幅されたＤＮＡの末端部分の塩基配列を決定した結果を示す図である（図６の続き）。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for amplifying a polynucleotide.
[0002]
[Prior art]
In the isolation of a polynucleotide, the method of amplifying the polynucleotide is one of the important steps. The most common technique for amplifying a polynucleotide is the PCR method (Polymerase Chain Reaction). The DNA synthesis reaction by the PCR method is constituted by repeating a complementary strand synthesis reaction in the 3 ′ direction from the primer. In the PCR method, newly synthesized DNA is used as a template after denaturation, so that reaction products increase exponentially. The primer used in the PCR method has a nucleotide sequence complementary to a region 5 'of the target nucleotide sequence. Therefore, at least the base sequence of the portion where the primer anneals must be known in advance. In other words, DNA whose base sequence is unknown cannot be selectively amplified by the PCR method.
[0003]
However, selective amplification is necessary even for DNA whose base sequence is unknown. For example, it is often attempted to obtain the full length of a gene based on a partial nucleotide sequence. Specifically, the region on the 5 'side of mRNA is not easily synthesized as cDNA. Therefore, a cDNA whose nucleotide sequence at the 5 ′ side is incomplete is often cloned. In order to clarify the full-length nucleotide sequence of an incomplete cDNA in which the 5 'nucleotide sequence has been deleted, it is necessary to selectively amplify a DNA containing an unknown nucleotide sequence containing the 5' nucleotide sequence. .
[0004]
In the differential display method, which is a method for obtaining a gene having a specific function, a fragment base sequence of the gene is obtained as a result. If the obtained nucleotide sequence does not match a known gene, the full-length nucleotide sequence of the gene must be determined. At this time, an attempt is made to obtain the full length of the gene based on the fragment base sequence.
[0005]
When only a part of the base sequence constituting a gene is known, a method for obtaining the full length of the gene based on the partial base sequence is known. A representative method is the RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) method. The RACE method is a method of amplifying a region containing an unknown base sequence by using PCR with a gene whose base sequence at the end is unknown as a template. Primers for PCR are designed using a portion whose nucleotide sequence is clear. If the base sequence of the obtained PCR product is determined, the unknown base sequence will be revealed. Several variations of the RACE method are known, such as a method of adding a region for annealing a primer.
[0006]
For example, a kit for the RACE method commercially supplied by Clonetech as the SMART (Switching Mechanism At 5 'end of RNA Transcript) method is based on the following principle. The synthesis of cDNA containing the nucleic acid has been realized (Nucleic Acids Res. 27/6, 1558-1560, 1999). The SMART method utilizes a special enzyme activity of a reverse transcriptase used for the synthesis of a first strand of cDNA. In the SMART method, a mutant of a reverse transcriptase called MMLVRT (Moloney leukemia virus reverse transcriptase) is used.
[0007]
This reverse transcriptase continuously adds the same base to the 3 ′ end of the synthesized cDNA after the complementary strand reaches the 5 ′ end of the RNA used as a template. The base added is often c. Therefore, an oligonucleotide having at the 3 ′ end a nucleotide sequence having a sequence of g, which is a nucleotide sequence complementary to the chain of c (c stretch), becomes a primer that anneals to the 3 ′ end of cDNA synthesized by MMLVRT.
[0008]
In the SMART method, an oligonucleotide "SMART oligo" which has a chain of g at the 3 'end as a primer for cDNA second strand (second strand) synthesis and which has a special base sequence called SMART sequence added to the 5' end side is used. To use. When the chain of g arranged at the 3 ′ end of “SMART oligo” anneals to the chain of c of cDNA, reverse transcriptase also synthesizes a complementary chain for the SMART sequence portion on the 5 ′ side of “SMART oligo”. Thus, the base sequence of “SMART oligo” is added as a complete double strand to the end of the cDNA.
[0009]
On the other hand, “SMART oligo” itself functions as a primer for complementary strand synthesis using the first strand of cDNA as a template. As a result, the second strand of cDNA is also synthesized, and a double-stranded cDNA can be obtained. This cDNA can be amplified by PCR using the SMART sequence located on the 5 ′ side of “SMART oligo” and the gene-specific primers used for cDNA synthesis. When an oligonucleotide having a length that can set two primers is used as “SMART oligo”, nested PCR can be applied.
[0010]
There are several variations of the RACE method other than the SMART method. For example, Marathon-ready cDNA, which is a RACE kit commercially supplied by Clontech, realizes the addition of a known base sequence to the end by a principle different from that of the SMART method. Marathon-ready cDNA utilizes a double-stranded oligonucleotide called "Marathon adapter". "Marathon adapter" is composed of a short oligonucleotide having a 3 'end blocked and not serving as a primer, and a long oligonucleotide having a base sequence complementary to this oligonucleotide at the 3' end.
[0011]
The short oligonucleotide 5 ′ in “Marathon adapter” is blunt-ended. By ligating the blunt end of "Marathon adapter" to the end of cDNA, a DNA whose base sequence is known is added to the unknown base sequence. By performing PCR using the ligation product as a template and the following primer set, DNA containing an unknown base sequence can be amplified.
-A gene-specific primer that anneals to a region with a known base sequence
-A primer having a nucleotide sequence complementary to the 5'-side nucleotide sequence of the long oligonucleotide constituting "Marathon adapter" (a region not overlapping with the short oligonucleotide)
[0012]
According to the principle of the SMART method or Marathon-ready cDNA, the same base sequence may be added to both ends of the cDNA in some cases. In these methods, the same base is used at both ends by using suppression PCR (suppression PCR; Diatchenko L, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996 Jun, 11; 93 (12): 6025-30). It suppresses the synthesis of cDNA to which the sequence has been added.
[0013]
Suppression PCR utilizes a phenomenon in which cDNAs having the same base sequence added to both ends are less likely to be synthesized by the PCR method. The cDNA to which the same nucleotide sequence is added is composed of nucleotide sequences whose 5 ′ end and 3 ′ end of each chain are complementary to each other (inverted repeat). As a result, in the step of being denatured into a single strand and becoming a template, the complementary base sequences at both ends hybridize with each other to form a frying pan-like structure. Since hybridization within the same strand occurs preferentially over hybridization with a primer, a template having such a structure may not be a template for PCR at all. This is the principle of suppressed PCR.
[0014]
In addition, other variations of the RACE method are known. For example, even for DNA having an unknown base sequence at its terminal portion, if both ends are ligated and cyclized, primers for PCR can be designed using the portion whose base sequence is known. This method has no specificity for the 5 'end of the mRNA. Therefore, it is unsuitable especially when the 5 ′ side attempts to obtain the full length of an unknown gene.
A method of linking an oligonucleotide whose base sequence is known to the 3 ′ end of the first strand of cDNA is also known. This method requires a step of purifying the first strand after synthesis.
Therefore, it can be said that the SMART method and Marathon-ready cDNA are advantageous methods that can expect specificity to the 5 'end of mRNA. In particular, the SMART method uses fewer enzymes and the reaction steps are simpler than other methods.
[0015]
However, although properties for the 5 'end of mRNA can be expected, it is still difficult to obtain the full length of a gene whose transcription amount is low. Therefore, it would be useful if a new RACE method capable of obtaining its full length based on a small amount of mRNA was provided.
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a new principle for synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
In the RACE method, a target gene is finally synthesized using a primer-dependent complementary strand synthesis reaction such as PCR. Generally, in the primer-dependent complementary strand synthesis reaction, the base sequence of the primer must be designed based on the base sequence of the polynucleotide to be synthesized. On the other hand, the purpose of the RACE method is to synthesize a region whose base sequence is unknown. Therefore, what kind of base sequence is selected as the base sequence to be annealed by the primer and how the base sequence is introduced are major factors that determine the performance of the RACE method. However, in the known RACE method, what kind of nucleotide sequence can be introduced to obtain a desired result has not been sufficiently studied. It can also be said that there is still room for improvement in the method of introducing the nucleotide sequence.
[0018]
On the other hand, the present inventors have found that in the complementary strand synthesis of a template polynucleotide containing an unknown nucleotide sequence on the 5 ′ side, by adding a specific nucleotide sequence to the 3 ′ end of the synthesized complementary strand, RACE It was found that the performance of the law could be improved. Further, the present invention was completed by clarifying the reaction conditions suitable for this purpose. That is, the present invention relates to the following method.
[1] A method for synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end contains the following steps:
a) a step of synthesizing a complementary strand using an oligonucleotide that anneals to an arbitrary region of the polynucleotide as a primer
b) adding a nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide of step a) to the 3 ′ end of the complementary strand synthesized in step a), and
c) using the complementary strand obtained in step b) as a template, and synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region containing the 5 ′ end is unknown using the oligonucleotide of step a) as a primer,
[2] The method according to [1], wherein step b) comprises a step of incubating the following elements under conditions that allow a complementary strand synthesis reaction.
(1) An enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction
(2) the polynucleotide synthesized in step a), and
(3) nucleotide substrate
[3] The method according to [1], wherein the polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown is the second strand of cDNA.
[4] The method according to [3], wherein the cDNA is a cDNA synthesized using, as a template, mRNA having a polynucleotide containing a nucleotide sequence substantially the same as the oligonucleotide at the 5 'end added thereto.
[5] The method according to [3], comprising the step of synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown by incubating the following elements under conditions that allow complementary strand synthesis.
(I) First strand of cDNA
(Ii) an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction
(Iii) an enzyme having 5'-3 'exonuclease activity, and
(Iv) nucleotide substrate
[6] The method according to [5], wherein an enzyme having 5'-3 'exonuclease activity is used as an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction.
[7] The method according to [5], wherein an enzyme having a reverse transcriptase activity is used as the enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction.
[8] The method according to [5], comprising a step of adding an oligonucleotide having a palindromic structure to 3 ′ of the first strand of the cDNA prior to the incubation.
[9] The method according to [1], wherein the polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown is the first strand of cDNA.
[10] The method according to [9], wherein the polynucleotide is a cDNA, and the cDNA is a cDNA synthesized with an oligo dT primer obtained by adding an arbitrary base sequence to 5 ′.
[11] a polynucleotide whose terminal base sequence is unknown, comprising a step of cloning a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 'end synthesized based on the method according to [3] or [9] is unknown. Isolation method.
[12] A cDNA library comprising a cDNA having a palindromic structure at the 3 ′ end of the first strand and / or the second strand of the cDNA.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention provides a method for synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown, comprising the following steps.
a) a step of synthesizing a complementary strand using an oligonucleotide that anneals to an arbitrary region of the polynucleotide as a primer
b) adding a nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide of step a) to the 3 ′ end of the complementary strand synthesized in step a), and
c) using the complementary strand obtained in step b) as a template, and synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region containing the 5 ′ end is unknown using the oligonucleotide of step a) as a primer,
[0020]
In the present invention, the polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown includes any polynucleotide that can be used as a template for complementary strand synthesis. Specifically, DNA, RNA, or hybrid polynucleotides thereof, and polynucleotides containing various nucleotide derivatives can be shown. The polynucleotide may be not only a naturally occurring polynucleotide but also an artificially produced polynucleotide. Alternatively, a polynucleotide obtained by introducing an artificial mutation into a naturally-derived polynucleotide can be used.
In the present invention, particularly important polynucleotides are mRNA and / or cDNA. The cDNA referred to here includes both the first strand and the second strand. The region containing the 5 ′ end of mRNA and cDNA synthesized using mRNA as a template is an important polynucleotide that often needs to be sequenced.
[0021]
In the present invention, the fact that the nucleotide sequence of the region containing the 5 ′ end is unknown means that the nucleotide sequence of the region containing the 5 ′ end of the polynucleotide to be used as the template for complementary strand synthesis in step a) is unknown. Therefore, if the polynucleotide is generated using another polynucleotide X as a template, the 3 ′ base sequence of the polynucleotide X is unknown.
When the polynucleotide X is an mRNA, its 3 ′ end is usually poly (A). In the present invention, the region containing the 3 ′ end of the mRNA is unknown when the base sequence of the region excluding the poly (A) tail at the 3 ′ end is unknown. Furthermore, in a cDNA synthesized using a region including the 3 ′ end of mRNA as a template, regardless of the presence or absence of a t-strand arranged at the 5 ′ end, the t of the region including the 5 ′ end When the base sequence excluding the linkage is unknown, the base sequence at the 5 ′ end of the polynucleotide is said to be unknown.
However, in step b), the 3 ′ end to which a predetermined base sequence is to be added may be the 3 ′ end of a complementary strand generated using the chain of t as a template. That is, poly (A) is not considered in the determination as to whether or not unknown. On the other hand, when a base sequence is added to the 3 ′ end, if a chain is present at the 3 ′ end, the base sequence can be added to the 3 ′ end of the chain a.
[0022]
In the present invention, the step a) of synthesizing a complementary strand using an oligonucleotide that anneals to an arbitrary region of the polynucleotide as a primer may be performed by any enzyme that catalyzes a primer-dependent complementary strand synthesis reaction. it can. Such an enzyme may be, for example, Taq polymerase.
[0023]
On the other hand, the oligonucleotide used as a primer in step a) anneals to an arbitrary region of the polynucleotide to prime complementary strand synthesis, enabling synthesis of a complementary strand to a region reaching the 5 ′ end of the polynucleotide. The base sequence and length are not limited as long as they are those. Generally, in order to start a complementary strand synthesis reaction while maintaining a certain degree of specificity, an oligonucleotide consisting of at least 15 bases or more, usually 20 to 40 bases, for example, 20 to 30 bases is used as a primer. Methods for preparing such oligonucleotides are known.
[0024]
Next, the nucleotide sequence constituting the oligonucleotide is composed of a nucleotide sequence complementary to an arbitrary region of the polynucleotide. In the present invention, the term "complementary" refers to a base sequence capable of forming a base pair (complementary strand bond) according to the Watson-Crick rule. The nucleotide sequence of the oligonucleotide of the present invention may not be completely complementary. That is, an oligonucleotide capable of initiating complementary strand synthesis under stringency that can maintain specificity is included in the oligonucleotide of the present invention even if its base sequence is not completely complementary. For example, it is important that the base at the 3 'end of the primer be complementary to the template. However, the intermediate portion and the 5 'end of the primer need not necessarily be completely complementary.
[0025]
In the present invention, the nucleotide sequence of the region including the 5 ′ end of the polynucleotide is unknown. However, there are portions where the nucleotide sequence is clear in other regions. Therefore, the oligonucleotide of the present invention can be designed so as to include a nucleotide sequence complementary to the portion whose nucleotide sequence is apparent. When the polynucleotide is a cDNA, the polynucleotide is designed so as to anneal to a portion where the nucleotide sequence is obvious in the nucleotide sequence constituting the gene and to prime a complementary strand synthesis reaction toward a region where the nucleotide sequence is unknown.
[0026]
The present invention comprises, after step a), a step of adding a base sequence complementary to the oligonucleotide of step a) to the 3 'end of the complementary strand synthesized in step b) following step b). Step b) can be performed by any method. As the step b) in the present invention, for example, the following method can be shown. That is, step b) can be performed by incubating the next element under conditions that allow a complementary strand synthesis reaction.
(1) An enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction
(2) the polynucleotide synthesized in step a), and
(3) nucleotide substrate
[0027]
If an enzyme having 5'-3 'exonuclease activity is used as the enzyme (1) that catalyzes the template-dependent complementary strand synthesis reaction, a single enzyme can serve as both the elements (1) and (2). It is desirable because it can be. Examples of such enzymes include Taq DNA polymerase (Boehringer Mannheim), ExTaq DNA polymerase, TAKARA Taq (all manufactured by Takara Shuzo), AmpliTaq (manufactured by Applied Biosystems), Tfl and Tth (all manufactured by Promega). .
[0028]
Alternatively, when a DNA polymerase having no 5'-3 'exonuclease activity is used, another enzyme having 5'-3' exonuclease activity can be additionally added. For example, λexo (λphase) has a duplex-specific 5'-3 'exonuclease activity. In the above step, a nucleotide substrate that can be used as a substrate by an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction is added. Specifically, a nucleotide substrate generally used in a PCR method or cDNA synthesis can be used. Usually, atc or g natural deoxynucleotide is used. In addition, a nucleotide derivative modified with a fluorescent molecule, a radioisotope, biotin, or the like can be used as necessary.
[0029]
By incubating these elements together with the polynucleotide synthesized in step (a) under conditions allowing a complementary strand synthesis reaction, the 3 ′ end of the polynucleotide synthesized in step a) is added to the 3 ′ end of the oligonucleotide. A base sequence complementary to the base sequence can be added. A reaction for adding a target base sequence to the 3 'end of DNA by incubating the above elements has not been reported so far. The present inventors can add a target base sequence to the end of the polynucleotide under the specific conditions as described above, and further, using the added base sequence, the base sequence at the end is unknown. The present inventors have found that the synthesis of polynucleotides becomes possible, and completed the present invention.
[0030]
The addition of a base sequence to the 3 ′ end of the polynucleotide by incubation of elements (1) to (3) can be explained by the following mechanism (FIG. 4). (3) The polynucleotide synthesized in step a) forms a double strand with the polynucleotide used as the template. The linear double-stranded DNA becomes circular at particularly low concentrations, and both ends are close to each other (Heffron et al., In vitro mutagenesis of circular DNA molecular by using synthetic restriction site. Proc. 75: 6012-6016, 1978). It is believed that DNA in solution is physically stabilized by taking a circular form.
[0031]
If the DNA is at a sufficiently stable temperature, the duplex will be stabilized. However, for example, under a condition in which a complementary strand synthesis reaction is performed by a thermostable DNA polymerase, a considerably high temperature condition is required. For example, in a complementary strand synthesis reaction using Ex-Taq (manufactured by Takara Shuzo), a high temperature of about 70 ° C. is used. Under such high temperature conditions, the terminal portion of the double-stranded DNA cannot stably maintain the double-stranded structure. As a result, a reaction may occur in which the 3 'end approaches a strand other than the strand to be base-paired (strand), and further starts synthesis of a complementary strand using that strand as a template. In the present invention, this phenomenon is called template switching of a DNA polymerase.
[0032]
At this time, it is the two ends of the linear DNA that are most likely to undergo crossover between the linear DNAs by approaching each other by taking a circular structure. More specifically, the 3 ′ end approaches the 5 ′ end of the same strand, and a base sequence complementary to the base sequence is synthesized. As a result, a base sequence complementary to its own 5 'end is added to the 3' end. Since the 5 'end of itself is originally the base sequence of the oligonucleotide which is a primer, a complementary sequence of the oligonucleotide is added to the 3' end as a result.
[0033]
In the present invention, the mechanism for adding the target base sequence to the 3 ′ end of the polynucleotide is not limited to the mechanism described here. In any case, step b) is achieved by incubating under the conditions described herein. This is supported by the results of the examples.
[0034]
In the present invention, when cDNA is used as the polynucleotide, the cDNA can use either the second strand or the first strand. The first strand of cDNA is DNA synthesized using mRNA as a template. The second strand refers to DNA synthesized using the first strand of cDNA as a template. When the second strand is used as a template, DNA synthesis proceeds in the 5 ′ direction of mRNA, so that 5 ′ RACE can be realized. Conversely, when the first strand is used as a template, DNA synthesis proceeds to the 3 ′ side of the mRNA, so that 3 ′ RACE can be performed. In order to use the second strand as a template, a primer having a nucleotide sequence complementary to the second strand is designed. If the first strand is a template, the base sequence of the primer is a base sequence complementary to the first strand. The 5 'end of the second strand of the cDNA (ie, the 5' end of the mRNA) contains the translation initiation codon. Therefore, the region on the 5 ′ side of the second strand is important for estimating the translated amino acid sequence based on the nucleotide sequence of cDNA. Therefore, determining the nucleotide sequence of this region is often an important issue in gene isolation and functional analysis.
[0035]
When the second strand of cDNA is used as the polynucleotide in the present invention, the second strand can be synthesized by incubating the following elements (i) to (iv) under conditions that allow complementary strand synthesis.
(I) First strand of cDNA
(Ii) an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction
(Iii) an enzyme having 5'-3 'exonuclease activity, and
(Iv) nucleotide substrate
[0036]
In the present invention, (i) the first strand of cDNA can be synthesized by an enzyme having reverse transcriptase activity, using an oligonucleotide having a base sequence complementary to an arbitrary region of mRNA as a primer. The primer for synthesizing the first strand is preferably an oligonucleotide having the same base sequence as the oligonucleotide used in the step a). In a general method for synthesizing cDNA, the mRNA used as a template after the synthesis of the first strand is degraded. mRNA can be easily degraded by alkali denaturation or enzymatic action such as RNAseH. When the mRNA is degraded, the first strand of the cDNA becomes single-stranded. In the present invention, an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction used in the synthesis of the second strand or in step b) can be used as the reverse transcriptase for the synthesis of the first strand. DNA polymerases having a reverse transcriptase activity, such as Tfl or Tth, are known. These DNA polymerases are commercially available (Promega). By using such an enzyme, the number of enzymes constituting the reaction system can be reduced.
[0037]
The second strand of the cDNA is a DNA synthesized using the thus synthesized first strand as a template. As the template-dependent complementary strand synthesis reaction, a complementary strand synthesis reaction from the 3 ′ end of the primer is usually used. The base sequence to be synthesized can be specifically synthesized by annealing the primer in a base sequence-specific manner. However, primers are not an essential condition for complementary strand synthesis. For example, when the above elements (i) to (iv) are incubated under conditions that allow complementary strand synthesis, a complementary strand synthesis reaction using the first strand of cDNA as a template is achieved. The conditions under which complementary strand synthesis is possible are conditions under which the enzyme that catalyzes the element (ii) template-dependent complementary strand synthesis reaction can maintain its activity. Those skilled in the art can appropriately set the conditions necessary for maintaining the enzyme activity according to the enzyme used.
[0038]
The mechanism of cDNA second strand synthesis by incubation of the above elements (i) to (iv) can be explained, for example, as follows. First, the 3 ′ end of the first strand of the cDNA approaches itself and initiates a complementary strand synthesis reaction using itself as a template. The 3 'end of the first strand does not always have a self-complementary base sequence. However, if a complementary strand synthesis reaction occurs using itself as a template even at a few bases, the 3 ′ end acquires a self-complementary base sequence. As a result, the base pairing to itself becomes more stable, and the 3 ′ end eventually adopts a complete stem-loop structure. If the stem-loop structure can be realized, the complementary strand synthesis reaction using itself as a template proceeds, and the synthesis of the second strand of cDNA is completed.
[0039]
The phenomenon of initiating a complementary strand synthesis reaction using itself as a template by approaching the 3 'end to itself has also been observed in, for example, Tetrahymena. Alternatively, a complementary strand synthesis reaction using itself as a template from the 3 'end of the first strand is also used in cDNA synthesis (Maniatis T. "Enzymic in vitro synthesis of globin genes" Cell 7: 279-288, 1976).
Therefore, by incubating the above elements (i) to (iv), it is possible to initiate a complementary strand synthesis reaction using itself as a template. The reaction for actually synthesizing the second strand of cDNA under these conditions is described in Examples.
[0040]
Now, based on such a mechanism, the completion of the second strand results in the synthesis of a cDNA in which the first and second strands are continuous on the same strand. Such a cDNA has a double-stranded portion where both are annealed, and a hinge portion constituting a stem loop. Here, the enzyme having the element (iii) 5′-3 ′ exonuclease activity digests the first strand constituting the double-stranded portion of the cDNA from the 5 ′ end. Since digestion of the cDNA acts on double-stranded DNA, the first strand will eventually be digested the entire length up to the hinge. Thus, a single-stranded second strand is finally produced. Since the base sequence including the 5 ′ end of the generated second strand is unknown and has a base sequence complementary to the primer used for the synthesis of the first strand at the 3 ′ end thereof, the polysaccharide in the above step a) is used. It can be used as a nucleotide.
[0041]
As the step of adding a nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide of step a) to the 3 ′ end of the complementary strand synthesized in step b) in step a) of the present invention, the following method can also be shown. That is, the first strand of cDNA is synthesized using an mRNA to which a polynucleotide having substantially the same base sequence as the oligonucleotide is added at the 5 ′ end as a template. At the 3 ′ end of the first strand synthesized in this way, a base sequence complementary to the base sequence of the oligonucleotide is arranged. That is, the first strand of the cDNA is nothing but the target polynucleotide of step b).
[0042]
A method for linking an arbitrary oligonucleotide to the 5 'end of mRNA is known. For example, the oligocap method, which is a method for synthesizing a full-length cDNA, is a method for specifically binding an oligonucleotide called an oligocap linker to the 5 ′ end of mRNA (Murayama, K. and Sugano, S. et al. 1994) Oligo-capping: a simple method to replace the cap structure of eucaryotic mRNAs with oligoribonucleides. Gene 138, 171-174). In the oligocap method, a linker is bound to a capping structure at the 5 'end of eukaryotic mRNA. Accordingly, contamination of cDNA derived from incomplete mRNA having no capping structure at the 5 ′ end can be prevented.
[0043]
In order to apply the oligocap method to the present invention, the base sequence of the oligocap linker may be substantially the same as the oligonucleotide. Usually, in the oligocap method, it is advantageous to use a base sequence of an oligocap linker that is difficult to find in a gene so that a full-length cDNA is specifically amplified. This is because when a base sequence found in a gene is used, the possibility of amplifying not a full-length cDNA but a gene fragment cannot be denied. On the other hand, in the present invention, since a nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide is introduced into the 3 ″ end, the nucleotide sequence of the linker is rather the nucleotide sequence found in the gene. In the present invention, an oligonucleotide is added to the 5 'end of mRNA by the same operation as the oligocap method except that the base sequence of the linker is different.
[0044]
In the present invention, the first strand of cDNA can be used for a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown. The first strand of the cDNA is usually synthesized using an oligo dT primer. Next, a second strand is synthesized using the first strand as a template by using an oligonucleotide corresponding to a region having a known base sequence in the gene. As a result, the 3 ′ end of the second strand is composed of a continuous base sequence of a. A sequence of the same bases is not suitable for step b) by incubating the elements (1)-(3). The nucleotide sequence of the oligonucleotide constituting the 5 ′ end of the second strand is not usually a monotonous nucleotide sequence such as the t chain. Therefore, the step b) of incubating the elements (1) to (3) described above is less likely to occur. Such inconvenience can be avoided by adding an appropriate base sequence to the base sequence at the 3 ′ end of the second strand.
[0045]
For example, by adding an appropriate base sequence to the 5 ′ end of the oligo dT primer, an arbitrary base sequence can be given to the 3 ′ end of the second strand. For example, a 6-8 base restriction enzyme recognition sequence can be added to the 5 'end of the oligo dT primer. Such an oligo dT primer enables an appropriate base sequence to be added to its 3 ′ end, and is also useful for ligation of cDNA to a cloning vector. Alternatively, step b) can be carried out by adding substantially the same nucleotide sequence as that of the oligonucleotide to the 5 ′ end of the oligo dT primer.
[0046]
In the present invention, prior to incubation of the above elements (i) to (iv), an oligonucleotide having a palindromic structure at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown Can be added. The palindromic structure refers to a base sequence containing a self-complementary sequence capable of forming a hairpin loop at the end. The number of bases constituting the self-complementary sequence is not limited. More specifically, a self-complementary sequence of 2 to 20 bases, for example, 2 to 4 bases can be shown. Specifically, 5′-aagctt-3 ′ can be used as the palindromic structure of the present invention.
[0047]
Such an additional base sequence can also be realized, for example, by adding a self-complementary sequence to the 5 'end of the oligonucleotide. At this time, the addition of the self-complementary sequence and the addition of a restriction enzyme site to the 5 ′ end of the primer can be performed. For example, the base sequence 5′-aagcttt-3 ′ exemplified above is also one of the restriction enzyme recognition sequences. A palindromic structure can also be added to the 3 'end of the polynucleotide. For example, in synthesizing the polynucleotide, a complementary sequence of the base sequence to be added may be added to the 5 ′ end of the polynucleotide as a template. For example, a reaction for adding an artificial base sequence to the 5 ′ end of mRNA as in the oligocap method described above is known. By utilizing this reaction, a self-complementary sequence required for the palindromic structure can be added to the 5 'end of mRNA. The cDNA synthesized using the mRNA into which the target base sequence has been introduced as a template has a palindromic structure at its 3 ′ end.
[0048]
Regardless of whether it is the second strand or the first strand, a polynucleotide having a base sequence complementary to the oligonucleotide added to the 3 ′ end of the region whose base sequence is unknown by the above-described reaction. It can be.
The thus obtained aggregate of polynucleotides having a palindromic structure added to their ends is useful as a cDNA library for the polynucleotide synthesis method according to the present invention. By using this cDNA library, both 5′RACE and 3′RACE can be performed using a single gene-specific primer. That is, a primer that anneals to the second strand of the cDNA enables 5′RACE, and a primer that anneals to the first strand enables 3′RACE. If a cDNA library composed of cDNAs having a palindromic structure at the end is constructed, unknown base sequences of various genes can be easily obtained based on the present invention using the same library. In the polynucleotide synthesis method of the present invention, addition of a palindromic structure to the 3 'end is not essential. However, the addition of a palindromic sequence is effective in promoting the complementary strand synthesis (self-priming) of the extension product of a gene-specific primer using self as a template.
[0049]
By using the cDNA library of the present invention, cDNA can be isolated based on the nucleotide sequence of an unknown gene identified by the genome project. Once the cDNA is cloned, protein analysis can be performed based on the cDNA. Further, the cDNA library of the present invention can be used for isolation of a splicing variant of a known gene that has a low expression level. If cDNA libraries derived from various tissues are synthesized in accordance with the present invention, the utility in isolating genes and splicing variants is high.
[0050]
The polynucleotide having a palindromic structure added to its end can be amplified in step c) by a polynucleotide synthesis method using the oligonucleotide as a primer. A method for synthesizing a polynucleotide having a target base sequence using an oligonucleotide having a base sequence complementary to a terminal region of the base sequence to be amplified as a primer is known.
[0051]
In the present invention, step c) can be performed, for example, by a PCR method. Specifically, the polynucleotide obtained in the step b) is first modified to a single strand. In the PCR method, a template polynucleotide is generally denatured by heating. The denatured polynucleotide is incubated with an oligonucleotide serving as a primer under conditions that allow complementary strand synthesis from the primer. Those skilled in the art can set conditions that enable complementary strand synthesis according to the base sequence of the primer and the composition of the reaction solution. By repeating the denaturation and the complementary strand synthesis reaction, the target polynucleotide can be continuously produced based on the PCR method.
[0052]
As the DNA polymerase that catalyzes the complementary strand synthesis, it is advantageous to use a heat-resistant enzyme that does not lose its activity even at the denaturing temperature of the polynucleotide. If the DNA polymerase used as (1) the enzyme that catalyzes the template-dependent complementary strand synthesis reaction or (ii) the enzyme that catalyzes the template-dependent complementary strand synthesis reaction has heat resistance, Can be used as it is in step c).
The polynucleotide synthesized in step c) can be separated by a known method such as ethanol precipitation. Alternatively, a polynucleotide having a desired size can be fractionated using a technique such as electrophoresis.
[0053]
Among the known RACE methods, it has already been mentioned that the method called suppression PCR (suppression PCR) is applied to the RACE method put to practical use under the trade name of Marathon-ready cDNA. On the other hand, in the RACE method according to the present invention, mutually complementary base sequences are arranged at both ends of cDNA. That is, the cDNA finally used as a template in the RACE of the present invention has an inverted repeat. It can be said that such a structure of cDNA should be a structure whose synthesis should be suppressed by the principle of suppression PCR in Marathon-ready cDNA. Actually, however, the RACE method based on the present invention is possible, and the synthesis of the target cDNA is efficiently performed, as described in Examples.
[0054]
In the present invention, for example, the following mechanism is considered as a reason why the target cDNA can be synthesized despite the fact that the cDNA has an inverted repeat.
As described above, the reason that an inverted repeat is difficult to use as a template in the suppression PCR is that hybridization of a complementary sequence on the same strand competes with annealing of a primer. However, if the nucleotide sequence derived from the gene is sufficiently long, it is conceivable that hybridization within the same strand is unlikely to occur. As a result, a situation occurs in which the annealing of the primer cannot be sufficiently inhibited, that is, the suppression PCR does not act. In RACE, a gene having a long nucleotide sequence in a gene portion is likely to be a cDNA to be obtained. Therefore, by using a cDNA having an inverted repeat sequence as a template, a mechanism for selectively synthesizing a longer base sequence was realized.
[0055]
In addition, the ratio of the cDNA serving as a template to the primer is also an important factor. In other words, by using the primer in a large excess with respect to the cDNA, the chance of annealing with the primer can be increased as compared with the hybridization of the complementary strand on the same DNA molecule (intra DNA molecule). Specifically, it is advantageous to use a primer in a molar ratio of about 5 to 20 times, preferably 10 times or more based on the expected amount of the template. For example, 1 μg of a 1-kb double-stranded cDNA (about 9.12 × 10 ¹¹ 10 pmol (about 78 ng: about 5.9 × 10 5 ¹² 20 pmol of a 24 mer primer can be used.
[0056]
The polynucleotide synthesis method according to the present invention is useful for cloning a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown. That is, the present invention comprises a step of cloning a polynucleotide having an unknown base sequence in the region containing the 5 ′ end synthesized based on the method described in the present invention, comprising isolating a polynucleotide having an unknown base sequence. About the method.
Methods for cloning synthesized polynucleotides are known. In general, the polynucleotide can be cloned by incorporating the synthesized polynucleotide into an appropriate cloning vector. If a cloning restriction enzyme recognition sequence is added to a primer used for polynucleotide synthesis, the synthesized polynucleotide can be easily inserted into a cloning vector. Alternatively, the synthesized polynucleotide can be ligated to a cloning vector with blunt ends.
[0057]
The nucleotide sequence of the cloned polynucleotide can be determined. The base sequence of the inserted polynucleotide is determined using a primer having a base sequence complementary to the base sequence of the vector or the like. According to the above steps, for example, when the base sequence of the region including the 5 ′ end of the second strand is unknown, 5′RACE is obtained, and when the base sequence of the region including the 5 ′ end of the first strand is unknown, 3 'RACE is possible.
[0058]
The use of the polynucleotide synthesis method of the present invention is not limited to RACE. For example, telomerase activity can be measured based on the method of the present invention. Telomerase uses a DNA having a specific base sequence as a substrate and adds a base sequence consisting of a repetition of a specific base sequence called telomere repeat to the 3 ′ end thereof. Telomere repeats are composed of a base sequence determined for each species. For example, the human telomere repeat is (TTAGGG) n. Telomerase activity can be assessed based on the length of the added telomere repeat. In order to measure telomerase activity according to the present invention, telomerase is allowed to act on the substrate DNA, and then a polymerase having 5'-3 'exonuclease activity is acted on. Based on the mechanism described above, the 3 'end of the substrate DNA anneals to itself to synthesize a complementary strand, and the template DNA extension product itself is digested by 5'-3' exonuclease activity. Is done.
[0059]
Since the complementary strand synthesized here has a base sequence complementary to the substrate DNA, complementary strand synthesis can be performed using an oligonucleotide containing the same base sequence as the substrate DNA as a primer (step a)). The substrate DNA remaining in the reaction solution can be used as it is as a primer. When the complementary strand reaches the 5 'end, a base sequence complementary to the substrate DNA is added to the 3' end by circularization of the double-stranded DNA and template switching action (step b)). Finally, using an oligonucleotide having the same base sequence as the substrate DNA, it is possible to amplify the unknown base sequence at the 3 ′ end of the substrate DNA extended by the action of telomerase.
[0060]
It is clear that the base sequence added by the action of telomerase is telomere repeat. However, it is not known how long or how long the terminal telomere repeat has in the repeating unit. Therefore, a DNA synthesized using a substrate DNA elongated by the action of telomerase as a template includes a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end in the present invention is unknown.
[0061]
By combining elements necessary for the polynucleotide synthesis method of the present invention, a kit for synthesizing a polynucleotide containing an unknown base sequence can be obtained. The kit according to the present invention can be composed of, for example, the following components.
DNA polymerase having -5'-3 'exonuclease activity
A buffer capable of maintaining the activity of the DNA polymerase; and
-Nucleotide substrates for complementary strand synthesis
[0062]
The specific configuration of each element in the present invention is as described above. In addition to the above components, additional components can be added to the kit of the present invention. For example, a reverse transcriptase for synthesizing the first strand of cDNA or an oligo dT primer for performing 3′RACE can be combined. Alternatively, an oligonucleotide primer designed for a region where the base sequence of the target polynucleotide is apparent can be attached in advance.
[0063]
When a linker is introduced at the 5 'end of mRNA, an oligonucleotide or RNA ligase serving as a linker can be combined. Further, when the oligocap method is applied to the binding of a linker to the 5 ′ end of mRNA, various enzymes necessary for the oligocap method are combined. For example, alkaline phosphatase (BAP) and tobacco acid pyrophosphatase (TAP) can be combined.
[0064]
Controls can be combined with the kits of the invention to determine whether the experimental materials and procedures were appropriate. For the control in the present invention, for example, a primer that can be expected to synthesize a cDNA of a certain size can be used for any cDNA library. As a primer for providing such cDNA, for example, a primer capable of synthesizing a β-actin gene can be shown.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.
[0065]
【Example】
Comparative example. Known RACE method and RACE method of the present invention
As a known RACE method, Marathon cDNA amplification kit (manufactured by Clontech) was used to attempt to isolate an unknown base sequence at the 5 ′ side of the gene. Mouse Msh4 was selected as the gene. Msh4 is a member of the MutS mismatch repair gene family; cerevisiae, C.I. elegans, mouse and human (Ross-Macdonald and Roeder, Cell 79: 1069-80 (1994); Zalevsky et al., Genetics 153: 1271-83 (1999); Kneitz et al., Gen. et. 14: 1085-97 (2000); Paquis-Flucklinger et al., Genomics 44: 188-94 (1997)) Although the nucleotide sequence of Msh4 is already known, the purpose of this study was to obtain a splicing variant thereof. MRNA was extracted from testes of mice (8 weeks old), and cDNA was synthesized according to a conventional method. Next, adapters were ligated to both ends of the cDNA. The above steps followed the manual of Clontech. Using the obtained adapter-added cDNA as a template, PCR was performed using primers specific for mouse Msh4 splicing variant γ (Msh4-γ) and β-actin. The reaction sequence and the composition of the reaction solution are shown below.
[94 ° C / 30 seconds → 60 ° C / 1 minute → 68 ° C / 3 minutes] × 35 cycles
2μL 10x reaction buffer
1 μL 2.5 mM 4dNTPs
1 μL testis cDNA (with adapter added)
0.2 μL Ex-Taq DNA polymerase
0.4 μL each gene-specific primer (10 μM)
0.4 μL Adapter primer (10 μM)
15 μL distilled water (total 20 μL)
The nucleotide sequences of the primers used in the experiment are as follows. # 18 and # 20 are gene-specific primers (GSP) designed based on the nucleotide sequence of mouse Msh4.
# 18: 5′-GGCATAGTTCCAGGAAATGGGGTAG-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
# 20: 5'-GGTATTGTTGGCGACAGGTTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 2)
β-actin 1: 5′-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
β-actin 2: 5′-AGGGGCCGACTCATCGGTACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
A part of the reaction solution after the reaction was taken and electrophoresed on an agarose gel. DNA in the agarose gel was detected by ethidium bromide staining. The result of Msh4 is shown in FIG. 2, and the result of β-actin is shown in FIG.
[0066]
In the Marathon cDNA amplification kit, as shown in FIG. 1, the adapter primer is designed to have the same sequence as the 5 'overhanging single-stranded portion of the adapter. The 3 ′ end of the oligonucleotide constituting the adapter is NH 3 ₂ Since it is blocked by a group, synthesis of a complementary strand starting from this is suppressed. Therefore, in principle, unless the complementary strand synthesis from the gene specific primer (GSP) occurs, the complementary strand synthesis from the adapter primer does not occur.
[0067]
However, in practice, a non-specific product was synthesized and a smeared background appeared (FIG. 2, FIG. 2, lane 1). These smearing bands, which are considered to be products of non-specific reactions, were considered to have been generated due to the base sequence of the adapter primer or other phenomena. The Clontech manual points out the possibility of the following non-specific reactions: For example, it is described that a complementary strand is synthesized at an overhang portion of an adapter linked to cDNA, and the cDNA may be amplified without complementary strand synthesis from a gene-specific primer.
[0068]
Therefore, in order to suppress the synthesis of a product resulting from the non-specific reaction as described above, PCR was attempted with limiting the amount of the adapter primer. That is, PCR was performed under the conditions that the amount of the adapter primer used for ligation with cDNA was 1/10 to 1/1000, and no adapter primer was used. As a result, a background was observed in 1/10 (lane 2 in FIGS. 2 and 3). When the ratio was limited to 1/100 to 1/1000, the synthesis of non-specific products was hardly observed ((lanes 3-4 in FIGS. 2 and 3). An amplification product was observed (lane 5 in FIG. 3), that is, the amplification product was also detected by PCR using only gene-specific primers.
[0069]
As a result of analyzing the nucleotide sequence of the synthesized PCR product, it was confirmed that the target DNA was synthesized except for one. Based on these results, it was shown that cDNA having an unknown structure capable of being amplified only with gene-specific primers without using an adapter primer was synthesized.
[0070]
For example, it was considered that the mechanism shown in FIG. 4 enables the synthesis of DNA without using an adapter primer.
Cycle 1:
As in ordinary PCR, double-stranded DNA is synthesized from gene specific primers.
Cycle 2:
At a certain frequency, the vicinity of the 3 ′ end of a single strand forms a hairpin structure, and a double-stranded DNA is synthesized using this portion as a primer and itself as a template. DNA replication using a hairpin structure as a primer is a phenomenon that has been observed in the synthesis of rDNA of Tetrahymena. Most of the synthesized double-stranded DNA is decomposed into single-stranded by the double-stranded DNA-specific 5'-3 'exonuclease activity of Taq DNA polymerase. At this time, if the 5′-3 ′ exonuclease activity is not applied, a DNA having the structure shown in cycle 3-no exo attached is generated. However, it is considered that the possibility that a DNA having such a structure is synthesized is low.
[0071]
Cycle 3:
Double-stranded DNA is synthesized using the single-stranded DNA generated in cycle 2 as a template. Since DNA synthesis is performed at a high temperature of 68 ° C., a part of the previously synthesized double-stranded terminal cannot maintain a double-stranded structure. As a result, the Taq DNA polymerase that has completed the synthesis up to the 5 ′ end of the template further continues to synthesize using the new complementary strand synthesized by itself as a template, and also synthesizes a DNA complementary to the base sequence of the primer. It has already been mentioned that such a reaction is called a template switching action. The base sequence complementary to the base sequence of the primer is located at the 3 ′ end of the newly synthesized complementary strand.
Cycle 4:
In the subsequent cycles, DNA is amplified in the same manner as in normal PCR. However, since the complementary sequence of the primer is always located at the 3 ′ end of the DNA, only one kind of primer is required for PCR.
[0072]
Example
As shown in FIG. 4, the following experiment was performed to confirm that amplification of an unknown base sequence was possible without using an adapter. That is, 5′RACE was performed using only the gene-specific primers for the same cDNA as in the above comparative example or a cDNA library derived from the E12.5 mouse fetal brain. DNA was synthesized under the same conditions as in the above comparative example, except that the step of ligation of the adapter to the cDNA was omitted and no adapter primer was added in the PCR. The nucleotide sequence of the gene-specific primer used in the experiment is shown below.
# 6: 5′-GTGGACTTTCCGCTCCATATTTGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
# 18: 5′-GGCATAGTTCCAGGAAATGGGGTAG-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
# 20: 5'-GGTATTGTTGGCGACAGGTTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 2)
# 21: 5′-GGGATGCCATCCCTTGTTTGATTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
# 26: 5′-AAAGACTCTTCAGGGCATGGTAGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
# 27: 5'-TAATCCCAGCACTCAGGAGGCAGA-3 '(SEQ ID NO: 8)
β-actin 1: 5′-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
β-actin 2: 5′-AGGGGCCGACTCATCGGTACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
Among the above primers, # 6, # 20, and # 21 are primers designed based on the base sequence of Msh4-γ. The regions to which each primer anneals are arranged in the order of # 6, # 20, and # 21 from the 3 'side of the Msh4-γ cDNA. On the other hand, # 26 and # 27 are primers designed based on the base sequence of Msh4 splicing variant ε (Msh4-ε). The regions to which each primer anneals are arranged in the order of # 26 and # 27 from the 3 ′ side of the Msh4-ε cDNA. Therefore, nested PCR can be performed by combining these primers.
[0073]
FIG. 5 shows a part of the results obtained when # 26, # 27, or # 18 was used as the gene-specific primer. FIG. 5 shows the results of reacting each primer in triplicate or in triplicate. As a template, a cDNA library derived from mouse fetal brain was used. It was confirmed that the target amplification product was amplified by one kind of primer.
[0074]
Furthermore, the base sequence of the terminal portion of the base sequence of the amplified DNA was determined, and it was confirmed that a base sequence complementary to the primer was added to the 3 ′ end. The determined structure of the terminal portion is shown in FIGS. 6 and 7. In the figure, the base sequence surrounded by a square indicates the base sequence derived from the primer, and the underlined portion indicates the complementary base sequence other than the primer. The fact that the base sequence in the underlined portion is complementary supports that a complementary sequence (inverted repeat) was synthesized by template switching.
[0075]
By this experiment, amplification of cDNA having the following sizes was confirmed for each splicing variant of Msh4. The present invention has shown that a region containing an unknown nucleotide sequence can be amplified over a sufficient length by a single primer. Note that only primers for variants γ and ε were used in the experiment. Both variants synthesized in this experiment contain the same exons as variants γ or ε. Therefore, various variants were synthesized with primers for variants γ and ε. For example, variants αβθ and ι each contain a base sequence to which primers # 20 and # 21 anneal.
α: about 2 kb
β: about 2 kb and about 1.5 kb
δ: about 1 kb
ε: about 2 kb
θ: about 1.5 kb
ι: about 1.5kb
[0076]
As can be seen from the gel photographs of FIGS. 2 and 3, if the target is present and the PCR conditions are optimal, the method of the present invention will amplify the cDNA as a very clean single band. The method for synthesizing a polynucleotide according to the present invention is a very unique method and has high reliability. The high reliability of the method of the present invention is supported by the fact that, as compared with the genomic DNA sequences for all Msh4 variants, no particular abnormality was found in the terminal nucleotide sequence. According to the method of the present invention, it is possible to isolate those having an unusual structure such as αδε which is contained very little in the cDNA library. Utilizing the method of the present invention, it may be possible to construct an unusual cDNA library based on information of a genome project.
[0077]
【The invention's effect】
According to the present invention, a method for synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown is provided. When the method of the present invention is applied to the second strand of cDNA, 5′RACE can be achieved. The 5′RACE based on the present invention has made it possible to obtain a longer 5 ′ cDNA which could not be obtained by a known method. The method of the present invention also allows for 3′RACE when applied to the first strand of cDNA. In the present invention, the same principle can be applied to both 5′RACE and 3′RACE.
[0078]
According to the method for synthesizing a polynucleotide of the present invention, a method for synthesizing a polynucleotide whose base sequence of the region including the 5 ′ end is unknown by a simple operation by using a reverse transcriptase, one primer and a specific DNA polymerase. Is possible. That is, the present invention makes it possible to synthesize a target polynucleotide by an inexpensive and simple method. On the other hand, known methods have required the use of special primers and have been practiced based on complicated reactions in which a plurality of enzymes are combined.
[0079]
The method of the present invention can efficiently synthesize a target polynucleotide. Efficiency means that the following features can be expected.
-The unknown base sequence can be obtained in a longer state.
-Suppression of non-specific reactions
Here, the non-specific reaction refers to a reaction for synthesizing a polynucleotide other than the target polynucleotide. Specifically, non-specific reactions include reactions that generate primer dimers, polynucleotides having a structure in which a plurality of cDNA fragments are linked, and the like.
Due to this feature, 5′RACE or 3′RACE based on the present invention enables reliable acquisition of a target cDNA.
[0080]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the reaction principle of Marathon cDNA amplification kit used in Examples. In the figure, 1 indicates the annealing position of the adapter primer, and 2 indicates the annealing position of the adapter primer for nested PCR. ds cDNA indicates a double-stranded cDNA, and NNT30 indicates a primer used for cDNA synthesis.
FIG. 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of a PCR product obtained by applying the 5′RACE method to the mouse Msh4 gene. 1st shows the result when the 5'-side primer was used, and 2ndary shows the result when the 3'-side primer was used.
FIG. 3 is a photograph showing the results of electrophoresis of a PCR product obtained by applying the 5 ′ RACE method to the mouse β-actin gene.
FIG. 4 is a diagram showing a mechanism of DNA synthesis without using an adapter primer.
FIG. 5 is a photograph showing the results of electrophoresis of a PCR product without using an adapter primer.
FIG. 6 is a diagram showing the result of determining the nucleotide sequence of the terminal portion of DNA amplified by the present invention. In the figure, the base sequence of the primer is shown by a box. The base sequence complementary to that derived from the primer added to the terminal portion is underlined. Each nucleotide sequence is described for each splicing variant, and the nucleotide sequence at the top is the 5 'end and the nucleotide at the bottom is the 3' end. On the left side of each nucleotide sequence, the name of the splicing variant and the length of the amplification product are shown.
FIG. 7 is a view showing the result of determining the base sequence of the terminal portion of DNA amplified by the present invention (continuation of FIG. 6).

Claims

A method for synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end comprises the following steps:
a) a step of synthesizing a complementary strand using an oligonucleotide that anneals to an arbitrary region of the polynucleotide as a primer b) a step complementary to the oligonucleotide of step a) at the 3 ′ end of the complementary strand synthesized in step a) A step of adding a base sequence, and c) a step of using the complementary strand obtained in step b) as a template and synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 ′ end is unknown using the oligonucleotide of step a) as a primer ,

2. The method according to claim 1, wherein step b) comprises incubating the following elements under conditions allowing a complementary strand synthesis reaction.
(1) an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction (2) a polynucleotide synthesized in step a), and (3) a nucleotide substrate

The method according to claim 1, wherein the polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 'end is unknown is the second strand of cDNA.

4. The method according to claim 3, wherein the cDNA is a cDNA synthesized using, as a template, an mRNA to which a polynucleotide having substantially the same nucleotide sequence as the oligonucleotide is added at the 5 'end.

The method according to claim 3, comprising a step of synthesizing a polynucleotide whose base sequence in the region containing the 5 'end is unknown by incubating the next element under conditions that allow complementary strand synthesis.
(I) First strand of cDNA (ii) Enzyme catalyzing template-dependent complementary strand synthesis reaction (iii) Enzyme having 5′-3 ′ exonuclease activity, and (iv) nucleotide substrate

The method according to claim 5, wherein (i) an enzyme having 5'-3 'exonuclease activity is used as an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction.

The method according to claim 5, wherein (i) an enzyme having reverse transcriptase activity is used as an enzyme that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction.

The method according to claim 5, comprising a step of adding an oligonucleotide having a palindromic structure to 3 'of the first strand of the cDNA prior to the incubation.

The method according to claim 1, wherein the polynucleotide whose base sequence in the region including the 5 'end is unknown is the first strand of cDNA.

The method according to claim 9, wherein the polynucleotide is a cDNA, and the cDNA is a cDNA synthesized with an oligo dT primer obtained by adding an arbitrary base sequence to 5 '.

An isolation of a polynucleotide whose terminal nucleotide sequence is unknown, which comprises a step of cloning a polynucleotide whose nucleotide sequence in the region containing the 5 ′ end synthesized based on the method according to claim 3 or 9 is unknown. Method.

A cDNA library comprising a cDNA having a palindromic structure at the 3 'end of the first strand and / or the second strand of the cDNA.