JP2004067635A - Dgat inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスホン酸ジエステル誘導体を含有するＤＧＡＴ阻害剤（ジアシルグリセリドアシルトランスフェラーゼ（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）阻害剤）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＧＡＴは、トリグリセリド合成の最終段階であるジアシルグリセリドからトリグリセリドへの反応を触媒する酵素（ＥＧ ２．３．１．２０）であり、生体の各種組織に存在するグリセロリン酸経路および小腸に認められるモノグリセリド経路において、食餌由来の脂肪酸からトリグリセリドを再構成する役割を果たしている。
【０００３】
最近、ＤＧＡＴノックアウトマウス（ＤＧＡＴ欠損マウス）を利用した実験において、該マウスは高脂肪食によっても、通常食と殆ど変わらない体重変化を示すこと、即ち肥満に対する抵抗性を示すことが明らかにされた。
【０００４】
このことから、ＤＧＡＴの機能を調節（抑制乃至阻害）できれば、肥満、糖尿病などの病態の改善が可能であると考えられるが、現在、このようなＤＧＡＴの機能に着目した薬剤の研究、開発は皆無であり、ＤＧＡＴ阻害活性を有する薬物の研究も報告された例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記ＤＧＡＴ活性を阻害する作用を奏する物質およびこれを有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００６】
本出願人は、医薬品分野で利用できる有効成分化合物につき鋭意研究、開発を続ける過程において、先に、脂質低下作用、白内障予防および治療作用、血糖降下作用などを有する新規な一連のホスホン酸ジエステル誘導体を開発した（特許２７８７４０７）。
【０００７】
引き続く研究の結果、本出願人は上記ホスホン酸ジエステル誘導体中に、目的に合致するＤＧＡＴ阻害活性を有する化合物が存在することを見出すと共に、新たにＤＧＡＴ阻害活性を有する誘導体の合成に成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記一般式（１）で表されるホスホン酸ジエステル誘導体を有効成分として含有することを特徴とするＤＧＡＴ阻害剤を提供する。
一般式（１）：
【０００９】
【化２】
〔式中、Ｒ１はフェニル基またはハロゲン置換フェニル基を示し、Ｒ２は水素原子、低級アルキル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、シアノ基、低級アルキルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルカルバモイル基またはピロリジノカルボニル基を示し、Ｒ３は低級アルキル基を示す。〕
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明ＤＧＡＴ阻害剤の有効成分であるホスホン酸ジエステル誘導体を表す前記一般式（１）およびその他の本明細書中に用いられている各基は、具体的にはそれぞれ次の通りである。本明細書において炭素を含む各基につき用いられる「低級」なる語は、「炭素数１−６の」なる意味で用いられるものとする。
【００１２】
ハロゲン置換フェニル基としては、４−クロロフェニル、４−ブロモフェニル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、３−ブロモフェニル、２−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、４−ヨードフェニル、２，３−ジクロロフェニル、３，４−ジクロロフェニル、２，４−ジクロロフェニル、２，４，６−トリクロロフェニルなどを例示することができる。
【００１３】
ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示することができる。
【００１４】
低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基などの炭素数１−６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を例示することができる。
【００１５】
低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル基などの炭素数１−６の直鎖状または分岐鎖状のアルコキシ基を有するカルボニル基を例示することができる。
【００１６】
低級アルキルカルバモイル基としては、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、イソプロピルカルバモイル、ブチルカルバモイル、イソブチルカルバモイル、ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル、ペンチルカルバモイル、ヘキシルカルバモイル基などの炭素数１−６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基を有するカルバモイル基を例示することができる。
【００１７】
Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルカルバモイル基としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジプロピルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジブチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジペンチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジヘキシルカルバモイル基などの炭素数１−６の直鎖または分枝鎖状のアルキル基の２個を有するカルバモイル基を例示することができる。
【００１８】
本発明ＤＧＡＴ阻害剤有効成分化合物として特に好適な一般式（１）で表される誘導体としては、以下の各群に属する化合物を挙げることができる。
（ａ）：一般式（１）中、Ｒ１がｐ−ハロゲン置換フェニル基で且つＲ２が低級アルキル基である化合物
（ｂ）：一般式（１）中、Ｒ１がｐ−ハロゲン置換フェニル基で且つＲ２が水素原子である化合物
（ｃ）：一般式（１）中、Ｒ１がｐ−ハロゲン置換フェニル基で且つＲ２が低級アルコキシカルボニル基である化合物
尚、上記ｐ−ハロゲン置換フェニル基とは、４−位にハロゲン原子を置換基として有するフェニル基をいう。
【００１９】
一般式（１）で表される本発明有効成分化合物（以下、本発明化合物ということがある）は、新規化合物および公知化合物の両者を包含する。これらの内の一群は、例えば本出願人の先の特許（特許第２７８７４０７）に記載の方法に従い、適当なアミン類とカルボン酸ハライド誘導体とを反応させることにより製造することができる。この方法の詳細を反応工程式−１を挙げて以下に説明する。また、他の群に属する本発明化合物は、後記反応工程式−２および−３に示す反応を利用して製造することができる。
【００２０】
【化３】
〔各式中、Ｒ１およびＲ３は一般式（１）に同じ。Ｒ２’は水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシカルボニル基またはシアノ基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す。〕
反応工程式−１に示す方法によれば、一部新規化合物を含むアミン類（２）と公知のカルボン酸ハロゲン化物誘導体（３）とを反応させることにより、本発明化合物（１ａ）を得ることができる。尚、アミン類（２）中に含まれる一部の新規な化合物は、類似の公知化合物の製造法と同様にして製造することができる。その詳細は、後記参考例に詳述する。
【００２２】
反応工程式−１に示すアミン類（２）とカルボン酸ハロゲン化物誘導体（３）との反応は、一般に脱酸剤の存在下に、適当な溶媒中で実施される。ここで脱酸剤としては、反応に悪影響を与えない公知の各種のものをいずれも使用できる。その具体例としては、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどの第三級アミン類を好ましく例示できる。これらは１種単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。また溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、石油エーテルなどの芳香族ないし脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサンなどの鎖状ないし環状エーテル類；アセトン、メチルエチルケトン、アセトフェノンなどのケトン類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類など；及びこれらの組合せを例示できる。上記反応におけるカルボン酸ハロゲン化物誘導体（２）とアミン類（３）との使用割合は、特に限定されないが、通常後者に対して前者を等モル量−過剰量用いるのがよい。また、脱酸剤は、通常カルボン酸ハロゲン化物誘導体（２）に対して等モル−過剰量用いられるのが好適である。反応は、冷却下、室温下および加熱下のいずれでも進行するが、通常室温付近−溶媒の還流温度範囲の温度条件を採用して行われるのがよく、一般に約０．５−２４時間程度で終了する。
【００２３】
【化４】
〔各式中、Ｒ１およびＲ３は一般式（１）に同じ。Ｒ４は低級アルキル基を示す。〕
反応工程式−２に示す方法によれば、前記反応工程式−１で得られる、Ｒ２’が低級アルコキシカルボニル基であるホスホン酸ジエステル誘導体（１ａ’）をアルカリ加水分解することにより、対応する基としてカルボキシル基を有する本発明化合物（１ｂ）を得ることができる。
【００２５】
上記反応は、一般に塩基の存在下に、適当な溶媒中で実施される。ここで塩基としては、好ましくは、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物を１種単独でまたは２種以上組み合わせて使用できる。溶媒としては、水、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサンなどの鎖状ないし環状エーテル類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；これらの組合せなどを例示できる。上記反応におけるエステル誘導体（１ａ’）と塩基との使用割合は、特に限定されないが、通常前者に対して後者を等モル−３倍モル量用いるのがよい。反応は、冷却下、室温下および加熱下のいずれでも進行するが、通常氷冷下−室温付近の温度条件を採用して行われるのがよく、一般に約１２−２４時間程度で終了する。
【００２６】
【化５】
〔各式中、Ｒ１およびＲ３は一般式（１）に同じ。Ｒ５およびＲ６は同一または異なって水素原子または低級アルキル基を示すかあるいは両者が結合して基−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を示す。〕
反応工程式−３に示す方法によれば、本発明化合物（１ｂ）と公知のアミン類（４）とを縮合させることにより、本発明化合物（１ｃ）を得ることができる。上記縮合反応は、一般に縮合剤の存在下に、適当な溶媒中で実施される。縮合剤としては、従来公知の各種のものをいずれも使用できる。その具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジエチルリン酸シアニド、ジフェニルリン酸アジドなどを例示できる。これらは一種単独で用いることもでき、２種以上を併用することもできる。特に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとの併用が有利である。溶媒としては、公知の非プロトン性溶媒をいずれも用い得る。特に好ましい溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を例示できる。上記反応における本発明化合物（１ｂ）とアミン類（４）との使用割合は、特に限定されないが、通常前者に対して後者を等モル−３倍モル量用いるのがよい。縮合剤は本発明化合物（１ｂ）に対して等モル量−過剰量、好ましくは少過剰量用いるのが望ましい。反応温度としては、氷冷下−室温付近の温度条件を採用でき、通常約１２−２４時間程度で反応は終了する。
【００２８】
前記各反応工程式に示す反応により得られる目的化合物は、通常の分離、精製手段、例えば、吸着クロマトグラフィー、プレパラティブ薄層クロマトグラフィー、再結晶、溶媒抽出などにより容易に単離、精製できる。
【００２９】
本発明ＤＧＡＴ阻害剤は、一般式（１）で表される化合物とともに、製剤学的に許容される担体を用いて、一般的な医薬組成物の形態に調製されて実用される。
【００３０】
本発明医薬組成物に利用される製剤学的に許容される担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される希釈剤または賦形剤、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などを例示できる。これらは調整される医薬製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００３１】
医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて適宜選択できる。その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、軟膏剤などが挙げられる。
【００３２】
錠剤の形態に成形するに際しては、製剤学的に許容される担体として、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ナミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、デンプンなどの保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベンナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。更に、錠剤は、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠または二重錠、多層錠とすることができる。
【００３３】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤学的に許容される担体として、例えば、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【００３４】
坐剤の形態に形成するに際しては、製剤学的に許容される担体として、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライドなどを使用できる。
【００３５】
カプセル剤は、常法に従い、通常本発明化合物を上記で例示した各種の製剤学的に許容される担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質ゼラチンカプセルなどの充填して調製される。
【００３６】
液剤、乳剤、懸濁剤などの注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましい。これらの形態にするに際しては、希釈剤として、例えば、水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどを使用できる。尚、この場合、等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖またはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。
【００３７】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に調製するに際しては、希釈剤として、例えば、白色ワセリン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベンナイトなどを使用できる。
【００３８】
更に、本発明医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有させることもできる。
【００３９】
本発明医薬組成物中に配合される本発明化合物の量は、特に限定されず広範囲より適宜選択される。通常医薬組成物中に、約０．５−９０重量％、好ましくは約１−８５重量％程度配合されるのがよい。
【００４０】
本発明医薬製剤の投与方法は特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖、アミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内に、或いは筋肉内、皮内、皮下または腹腔内に投与され、坐剤は直腸内投与される。
【００４１】
本発明医薬製剤の投与量は、その用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などにより適宜選択される。通常有効成分である本発明化合物の量が１日成人１人当たり体重１ｋｇ当たり約０．５−２０ｍｇ程度、好ましくは１−１０ｍｇ程度とするのがよい。該製剤は１日に１回または２−４回に分けて投与することができる。
【００４２】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明化合物の製造例を参考例として挙げ、次いで本発明化合物につき行われた薬理試験例および本発明化合物を有効成分とする医薬の製剤例を挙げる。
【００４３】
【参考例１】ジイソプロピル ４−［（４−（４−フルオロフェニル）−５−メチルチアゾール−２−イル）カルバモイル］ベンジルホスホナートの製造
（１） ２−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−５−メチルチアゾールの製造
４−フルオロプロピオフェノン１７９ｇと塩化アルミニウム（ＩＩＩ）１ｇとをクロロホルム１０００ｍＬに溶解させ、氷冷撹拌下にこの混合物中に臭素１９７ｇをゆっくりと滴下した。氷冷下で１時間撹拌後、反応混合物を氷水５００ｍＬ中に注ぎ込んだ。クロロホルム層を分液し、飽和重曹水５００ｍＬおよび飽和食塩水５００ｍＬで順次洗浄した後、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧留去して、４’−フルオロ−２−ブロモプロピオフェノンを得た。このものを精製することなく、エタノール６００ｍＬとチオ尿素８６ｇを加え、７０℃で１２時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、得られた反応混合物中に酢酸エチル１０００ｍＬと２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液８００ｍＬを加えて分液した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウム上で乾燥し減圧下に溶媒を留去し、得られた粗結晶を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンより再結晶して、表１に示す化合物番号１の化合物の製造のための原料である標記化合物１７２ｇを得た。
【００４４】
同様にして、表１に示す化合物番号２−１１の各化合物の製造原料であるアミン類を製造した。
（２） ジイソプロピル ４−［（４−（４−フルオロフェニル）−５−メチルチアゾール−２−イル）カルバモイル］ベンジルホスホナートの製造
４−［（ジイソプロポキシホスホリル）メチル］ベンゾイル クロリド１１１．６ｇの塩化メチレン３５０ｍＬ溶液を氷冷撹拌し、このものに、上記（１）で得た２−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−５−メチルチアゾール７２．９ｇのピリジン溶液４００ｍＬをゆっくりと滴下した。混合物を室温で１２時間撹拌後、これに水５００ｍＬを加え、減圧下に塩化メチレンを留去した。得られた粗結晶をエタノール−水より再結晶して、標記化合物の無色結晶１４６ｇを得た。得られた化合物の構造および物性を表１に「化合物番号１」として示す。
【００４５】
【参考例２−１１】
参考例１の（１）と同様にして得た原料アミン類を用いて、参考例１の（２）と同様にして、表１−２に化合物番号２−１１として示す各化合物を製造した。得られた化合物の構造および物性を表１−２に並記する。
【００４６】
【参考例１２】ジイソプロピル ４−［（５−カルボキシ−４−フェニルチアゾール−２−イル）カルバモイル］ベンジルホスホナートの製造
参考例１０で製造したエステル（化合物番号１０）３．２ｇをエタノール２５ｍＬに溶解させ、氷冷撹拌下、このものに２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液６ｍＬをゆっくりと滴下した。混合物を室温で１２時間撹拌後、これに１０％塩酸水溶液を加えてｐＨを２とし、析出した結晶を濾取して、標記化合物の無色結晶２．０ｇを得た。得られた化合物の構造および物性を表２に「化合物番号１２」として示す。
【００４７】
【参考例１３】ジイソプロピル ４−［（５−ブチルカルバモイル−４−フェニルチアゾール−２−イル）カルバモイル］ベンジルホスホナートの製造
参考例１２で製造したカルボン酸（化合物番号１２）２．０ｇ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドの塩酸塩１．３ｇおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．５４ｇをＤＭＦ １０ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌した。続いて、ブチルアミン０．５９ｇを加えて更に室温で２０時間撹拌した。
【００４８】
反応混合物に水を加えて析出した結晶を濾取し、得られた粗結晶を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン再結晶して、標記化合物の無色結晶１．０ｇを得た。得られた化合物の構造および物性を表２に「化合物番号１３」として示す。
【００４９】
【参考例１４−１８】
参考例１３と同様にして、表２に化合物番号１４−１８として示す各化合物を得た。得られた化合物の構造および物性を表２に併記する。
【００５０】
尚、表中、略号による基の表示は次のことを示す。
Ｍｅ：メチル基、Ｅｔ：エチル基、ｉ−Ｐｒ：イソプロピル基
【００５１】
【表１】
【表２】
尚、表中、参考例１２の物性におけるＮＭＲ（１）は、次の通りである。
ＮＭＲ（１）：（δ：ｐｐｍ， ＤＭＳＯ−ｄ６， 内部標準＝ＴＭＳ）
１．１４（ｄ， Ｊ＝６．２Ｈｚ， ６Ｈ）， １．２２（ｄ， Ｊ＝６．２Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．３０（ｄ， Ｊ＝２２．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４８−４．５６（ｍ， ２Ｈ）， ７．４５（ｍ， ５Ｈ）， ７．７５（ｍ， ２Ｈ）， ８．０８（ｄ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， ２Ｈ）， １３．０２（ｂｒｓ， １Ｈ）
以下、上記参考例１−１８で得た各化合物（表１および２参照、参考例に対応させて化合物番号１−１８という）および下記表３に記載の各化合物を被験物質として、それらのＤＧＡＴ阻害活性を試験した例を挙げる。
【００５４】
【表３】
【薬理試験例１】ラットＤＧＡＴ阻害作用試験
（１） 試薬
ＤＧＡＴ酵素活性の測定には、以下の試薬を用いた。
・ホモゲナイゼーションバッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）， ２５０ｍＭシュークロースおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む
・アッセイバッファー：１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）， ６ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ （ＦＦＡ
不含）および２ｍＭ ＤＴＴを含む
・ＤＧＡＴ基質液：０．１ｍＭ ［１−１４Ｃ］オレオイル補酵素Ａ （［１−１４Ｃ］Ｏｌｅｏｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ， 比活性：４．０Ｃｉ／ｍｏｌ）を含むアッセイバッファー
（２） ＤＧＡＴ酵素液の調製
ＳＤ系雄性ラット（６０頭）より副腎を摘出し、摘出した副腎（ｃａ．４ｇ）にホモゲナイゼーションバッファー２０ｍＬを加え、ガラステフロン（登録商標）ホモジナイザーでホモジナイズした。得られたホモジネートを８００×ｇで１０分間、４℃下に遠心し、上清を採取した。これを次に１０，０００×ｇで１０分間、４℃下に遠心し、ペレットを除去した。上清をさらに、１０５，０００×ｇで６０分間、４℃下で遠心し、ペレット（ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。これを２０ｍＬのホモゲナイゼーションバッファーで洗浄後、１０ｍＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭシュークロースおよび２ｍＭ ＤＤＴに懸濁させた。この懸濁液の蛋白量を定量した後、−８０℃で保存した。使用直前に１ Ａｓｓａｙ（ ２００μＬ）あたり７５μｇ蛋白の濃度になるようにアッセイバッファーを用いて調製して、この調製液をＤＧＡＴ酵素液とした。
（３） ＤＧＡＴ阻害活性の測定
被験物質は、１×１０−２ｍｏｌ／Ｌの濃度となるようＤＭＳＯで溶解した。
【００５６】
１０ｍＬネジ口試験管に被験物質溶液２．５μＬをとり、これにＤＧＡＴ酵素液２００μＬおよびＤＧＡＴ酵素基質液５０μＬを加え、３７℃で１０分間インキュベーションした。ｎ−ヘキサン４．０ｍＬおよびエタノール１．０ｍＬを加えて反応を停止させた。５分間振盪後、遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、上層のヘキサン層２ｍＬをガラス試験管に移した。窒素ガス気流下でｎ−ヘキサンを除去し、得られた脂質抽出物をクロロホルム／メタノール（２：１）１００μＬで再溶解し、ＴＬＣプレートへスポットした。ＴＬＣプレートを、ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７３：２５：２）で展開し、オートラジオグラフィーによりトリグリセリド画分の１４Ｃを定量した。
【００５７】
被験物質無添加のコントロールの場合に比べて、被験物質添加時に減少するトリグリセライド量を、パーセント表示したものを、ＤＧＡＴ阻害率として求めた。
（４） 結果
得られた結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
（５） 考察
表４に示される結果より、本発明において有効成分とする一般式（１）に属する各化合物は、いずれもＤＧＡＴ阻害活性を有することが明らかである。
【００６０】
【薬理試験例２】ヒト白色脂肪細胞ＤＧＡＴ阻害作用試験
（１）試験方法
ヒト皮下脂肪組織由来白色脂肪培養細胞（２４ウエルプレート、Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社）を１７日間分化させた。１８日目に、［１−１４Ｃ］ｏｌｅａｔｅ−ＢＳＡ ｃｏｍｐｌｅｘおよび終濃度１×１０−５ｍｏｌ／Ｌの被験物質を加えた培地に交換し、更に１８時間ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。培養後、培地を抜き、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄後、これにｎ−ヘキサン／イソプロパノール（３：２）混液０．６ｍｌを加えて、室温で３０分間放置して抽出を行った。その後、抽出液をガラス試験管へ回収し、ｎ−ヘキサン／イソプロパノール（３：２）混液０．４ｍｌを加え、更に室温で３０分間抽出し、抽出液を再度同じガラス試験管に回収した。窒素ガス気流下で溶媒を除去し、得られた脂質抽出物をクロロホルム／メタノール（２：１）１００μＬで再溶解し、ＴＬＣプレートへスポットした。ＴＬＣプレートを、ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７３：２５：２）で展開し、オートラジオグラフィーによりトリグリセリド画分の１４Ｃを定量した。
【００６１】
被験物質無添加のコントロールの場合に比べて、被験物質添加時に減少するトリグリセライド量を、パーセント表示したものを、ＤＧＡＴ阻害率として求めた。
（２） 結果
得られた結果を、表５に示す。
【００６２】
【表５】
（３） 考察
表５に示される結果より、本発明において有効成分とする一般式（１）に属する各化合物は、いずれもＤＧＡＴ阻害活性を有することが明らかである。
【００６４】
【製剤例１】
有効成分として、参考例１で得た本発明化合物を用いて、１錠当りその３００ｍｇを含有する錠剤（２０００錠）を、次の処方により調製した。
参考例１で得た本発明化合物 ６００ｇ
乳糖（日本薬局方品） ６７ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品） ３３ｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム（日本薬局方品） ２５ｇ
メチルセルロース（日本薬局方品） １２ｇ
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） ３ｇ
即ち、上記処方に従い、参考例１で得た本発明化合物、乳糖、コーンスターチおよびカルボキシメチルセルロースカルシウムを充分混合し、メチルセルロース水溶液を用いて混合物を顆粒化し、２４メッシュの篩を通し、これをステアリン酸マグネシウムと混合して、錠剤にプレスして、目的の錠剤を得た。
【００６５】
【製剤例２】
有効成分として、参考例１で得た本発明化合物を用いて、１カプセル当りその２００ｍｇを含有する硬質ゼラチンカプセル剤（２０００カプセル）を、次の処方により調製した。
参考例１で得た本発明化合物 ４００ｇ
結晶セルロース（日本薬局方品） ６０ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品） ３４ｇ
タルク（日本薬局方品） ４ｇ
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） ２ｇ
即ち、上記処方に従い、各成分を細かく粉末にし、均一な混合物となるように混和した後、所望の寸法を有する経口投与用ゼラチンカプセルに充填して、目的のカプセル剤を得た。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a DGAT inhibitor (a diacylglyceryl acyltransferase inhibitor) containing a phosphonic acid diester derivative.
[0002]
[Prior art]
DGAT is an enzyme (EG 2.3.1.20) that catalyzes the reaction from diacylglyceride to triglyceride, which is the final stage of triglyceride synthesis, and is a glycerophosphate pathway found in various tissues of a living body and a monoglyceride found in the small intestine. In the pathway, it plays a role in reconstituting triglycerides from dietary fatty acids.
[0003]
Recently, an experiment using a DGAT knockout mouse (DGAT-deficient mouse) revealed that the mouse showed a weight change that was almost the same as that of a normal diet even with a high-fat diet, that is, showed resistance to obesity. .
[0004]
From this, it is considered that if the function of DGAT can be regulated (suppressed or inhibited), pathological conditions such as obesity and diabetes can be improved. Currently, research and development of a drug focusing on such a function of DGAT are in progress. There is no report, and there are no reports of studies on drugs having DGAT inhibitory activity.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a substance having an action of inhibiting the above DGAT activity and a DGAT inhibitor containing the substance as an active ingredient.
[0006]
In the process of continuing intensive research and development on active ingredient compounds that can be used in the pharmaceutical field, the present applicant has first developed a series of novel phosphonic acid diester derivatives having lipid lowering action, cataract prevention and treatment action, hypoglycemic action, etc. Was developed (Japanese Patent No. 2787407).
[0007]
As a result of the subsequent research, the present applicant found that a compound having a DGAT inhibitory activity meeting the purpose was present in the phosphonic acid diester derivative, and succeeded in synthesizing a new derivative having a DGAT inhibitory activity. Thus, the present invention has been completed.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a DGAT inhibitor comprising, as an active ingredient, a phosphonic acid diester derivative represented by the following general formula (1).
General formula (1):
[0009]
Embedded image
[Wherein, R 1 represents a phenyl group or a halogen-substituted phenyl group; R 2 represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a cyano group, a lower alkylcarbamoyl group, an N, N-di-lower alkyl group; It represents a carbamoyl group or a pyrrolidinocarbonyl group, and R 3 represents a lower alkyl group. ]
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The general formula (1) representing the phosphonic acid diester derivative which is an active ingredient of the DGAT inhibitor of the present invention and the other groups used in the present specification are specifically as follows. As used herein, the term "lower" used for each group containing carbon is intended to mean "having 1 to 6 carbon atoms".
[0012]
Examples of the halogen-substituted phenyl group include 4-chlorophenyl, 4-bromophenyl, 2-chlorophenyl, 3-chlorophenyl, 3-bromophenyl, 2-fluorophenyl, 4-fluorophenyl, 4-iodophenyl, 2,3-dichlorophenyl, Examples include 3,4-dichlorophenyl, 2,4-dichlorophenyl, 2,4,6-trichlorophenyl and the like.
[0013]
Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
[0014]
Examples of the lower alkyl group include linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, and hexyl groups. .
[0015]
Examples of the lower alkoxycarbonyl group include straight-chain carbon atoms having 1 to 6 carbon atoms such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, butoxycarbonyl, isobutoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, and hexyloxycarbonyl. And a carbonyl group having a branched or branched alkoxy group.
[0016]
Examples of the lower alkylcarbamoyl group include straight-chain or branched chains having 1 to 6 carbon atoms such as methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, propylcarbamoyl, isopropylcarbamoyl, butylcarbamoyl, isobutylcarbamoyl, tert-butylcarbamoyl, pentylcarbamoyl, and hexylcarbamoyl. And a carbamoyl group having an alkyl group.
[0017]
Examples of the N, N-di-lower alkylcarbamoyl group include N, N-dimethylcarbamoyl, N, N-diethylcarbamoyl, N, N-dipropylcarbamoyl, N, N-dibutylcarbamoyl, N, N-dipentylcarbamoyl, A carbamoyl group having two straight-chain or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as an N-dihexylcarbamoyl group can be exemplified.
[0018]
The derivatives represented by the general formula (1) which are particularly suitable as the DGAT inhibitor active ingredient compound of the present invention include compounds belonging to the following groups.
(A): a compound in which R 1 is a p-halogen-substituted phenyl group and R 2 is a lower alkyl group in the general formula (1) (b): R 1 is a p-halogen-substituted phenyl in the general formula (1) and R 2 is a hydrogen atom in the group (c): general formula (1), compound and R 2 in R 1 is p- halogen-substituted phenyl group is a lower alkoxycarbonyl group MonoSho, the p- halogenated A phenyl group refers to a phenyl group having a halogen atom at the 4-position as a substituent.
[0019]
The active ingredient compound of the present invention represented by the general formula (1) (hereinafter, sometimes referred to as the present compound) includes both novel compounds and known compounds. One group of these can be produced by reacting a suitable amine with a carboxylic acid halide derivative, for example, according to the method described in the applicant's earlier patent (Japanese Patent No. 2787407). The details of this method will be described below with reference to Reaction Scheme 1. In addition, the compounds of the present invention belonging to another group can be produced by utilizing the reactions shown in the following reaction schemes -2 and -3.
[0020]
Embedded image
[In each formula, R 1 and R 3 are the same as in the general formula (1). R 2 ′ represents a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxycarbonyl group or a cyano group, and X represents a halogen atom. ]
According to the method shown in the reaction step formula-1, the compound (1a) of the present invention is obtained by reacting the amines (2) containing partially novel compounds with the known carboxylic acid halide derivatives (3). Can be. Some of the novel compounds contained in the amines (2) can be produced in the same manner as in the production of similar known compounds. The details will be described later in Reference Examples.
[0022]
The reaction between the amines (2) shown in the reaction step formula-1 and the carboxylic acid halide derivative (3) is generally carried out in the presence of a deoxidizing agent in a suitable solvent. Here, as the deoxidizing agent, any known various agents that do not adversely affect the reaction can be used. Specific examples thereof include preferably tertiary amines such as triethylamine, N, N-diethylaniline, N-methylmorpholine, pyridine and 4-dimethylaminopyridine. These can be used alone or in combination of two or more. Examples of the solvent include aromatic or aliphatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene and petroleum ether; linear or cyclic such as diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran (THF) and 1,4-dioxane. Ethers; ketones such as acetone, methyl ethyl ketone and acetophenone; halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride and 1,2-dichloroethane; and combinations thereof. The ratio of the carboxylic acid halide derivative (2) and the amines (3) used in the above reaction is not particularly limited, but usually the former is preferably used in an equimolar amount-excess amount relative to the latter. Further, it is preferable that the deoxidizing agent is usually used in an equimolar excess amount relative to the carboxylic acid halide derivative (2). The reaction proceeds under cooling, at room temperature, or under heating, but it is usually preferable to employ a temperature condition of around room temperature to the reflux temperature of the solvent, and generally about 0.5 to 24 hours. finish.
[0023]
Embedded image
[In each formula, R 1 and R 3 are the same as in the general formula (1). R 4 represents a lower alkyl group. ]
According to the method shown in Reaction Scheme 2, the corresponding phosphonic acid diester derivative (1a ′) in which R 2 ′ is a lower alkoxycarbonyl group obtained in the above Reaction Scheme 1 is alkali-hydrolyzed. The compound (1b) of the present invention having a carboxyl group as a group can be obtained.
[0025]
The above reaction is generally performed in a suitable solvent in the presence of a base. Here, as the base, preferably, alkali metal hydroxides such as potassium hydroxide and sodium hydroxide can be used alone or in combination of two or more. As the solvent, linear or cyclic ethers such as water, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran (THF) and 1,4-dioxane; alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; combinations thereof And the like. The ratio of the ester derivative (1a ') and the base used in the above reaction is not particularly limited, but it is usually preferable to use the latter in an equimolar to 3-fold molar amount with respect to the former. The reaction proceeds under cooling, at room temperature, or under heating, but it is usually preferable to employ a temperature condition of about ice-cooling to about room temperature, and generally completes in about 12 to 24 hours.
[0026]
Embedded image
[In each formula, R 1 and R 3 are the same as in the general formula (1). R 5 and R 6 are the same or different and each represent a hydrogen atom or a lower alkyl group, or both are bonded to each other to represent a group —CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 —. ]
According to the method shown in the reaction step formula-3, the compound (1c) of the present invention can be obtained by condensing the compound (1b) of the present invention with the known amines (4). The above condensation reaction is generally carried out in the presence of a condensing agent in a suitable solvent. As the condensing agent, any conventionally known various agents can be used. Specific examples thereof include N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide, 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinimide, cyanide diethylphosphate, Examples include diphenylphosphoric azide. These can be used alone or in combination of two or more. In particular, a combination of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole is advantageous. As the solvent, any known aprotic solvent can be used. As a particularly preferred solvent, N, N-dimethylformamide (DMF) can be exemplified. The proportion of the compound of the present invention (1b) and the amines (4) in the above reaction is not particularly limited, but it is usually preferable to use the latter in an equimolar to 3 molar amount to the former. The condensing agent is preferably used in an equimolar amount-excess amount, preferably a small excess amount, relative to the compound (1b) of the present invention. As the reaction temperature, a temperature condition of under ice-cooling-around room temperature can be adopted, and the reaction is usually completed in about 12 to 24 hours.
[0028]
The target compound obtained by the reaction shown in each of the above reaction schemes can be easily isolated and purified by ordinary separation and purification means such as adsorption chromatography, preparative thin-layer chromatography, recrystallization, and solvent extraction.
[0029]
The DGAT inhibitor of the present invention is prepared and used in the form of a general pharmaceutical composition using a compound represented by the general formula (1) and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0030]
Pharmaceutically acceptable carriers used in the pharmaceutical composition of the present invention include diluents or excipients usually used depending on the use form of the preparation, such as fillers, extenders, binders, moisturizers. Agents, disintegrants, surfactants, lubricants and the like. These are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the pharmaceutical preparation to be adjusted.
[0031]
As the dosage unit form of the pharmaceutical preparation, various forms can be appropriately selected according to the purpose of treatment. Representative examples include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections (solutions, suspensions, etc.), ointments and the like.
[0032]
When formed into tablets, pharmaceutically acceptable carriers include, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, potassium phosphate and the like. Excipients; binders such as water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone; sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, low-substituted hydroxy Disintegrators such as propylcellulose, dried starch, sodium alginate, agar powder, naminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate; polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, Surfactants such as sodium rill sulfate and stearic acid monoglyceride; disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, and hydrogenated oil; absorption promoters such as quaternary ammonium base and sodium lauryl sulfate; moisturizing glycerin and starch Agents; adsorbents such as starch, lactose, kaolin, benite, and colloidal silicic acid; lubricating agents such as purified talc, stearates, boric acid powder, and polyethylene glycol; Further, the tablet can be a tablet coated with a usual coating, if necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet or a double tablet, or a multilayer tablet.
[0033]
When formed into pill form, as a pharmaceutically acceptable carrier, for example, excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc; gum arabic powder, tragacanth powder, Binders such as gelatin and ethanol; disintegrants such as laminaran and agar can be used.
[0034]
In forming a suppository, pharmaceutically acceptable carriers such as polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, higher alcohol esters, gelatin, and semi-synthetic glyceride can be used.
[0035]
Capsules are prepared according to a conventional method, usually by mixing the compound of the present invention with the various pharmaceutically acceptable carriers exemplified above and filling in hard gelatin capsules, soft gelatin capsules and the like.
[0036]
When prepared as injections such as solutions, emulsions and suspensions, these are preferably sterilized and isotonic with blood. In making these forms, for example, water, ethanol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and the like can be used as the diluent. In this case, a sufficient amount of salt, glucose or glycerin for preparing an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and ordinary dissolution aids, buffers, soothing agents and the like are added. May be.
[0037]
When preparing the composition in the form of an ointment such as a paste, cream, or gel, as a diluent, for example, white petrolatum, paraffin, glycerin, a cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, benite, or the like can be used.
[0038]
Further, the pharmaceutical composition of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals as necessary.
[0039]
The amount of the compound of the present invention to be incorporated into the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is appropriately selected from a wide range. Usually, about 0.5-90% by weight, preferably about 1-85% by weight is added to the pharmaceutical composition.
[0040]
The method of administration of the pharmaceutical preparation of the present invention is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like. For example, tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules, and capsules are administered orally, and injections are used alone or mixed with normal replenishers such as glucose and amino acids for intravenous or intramuscular use It is administered intradermally, subcutaneously or intraperitoneally, and suppositories are rectal.
[0041]
The dose of the pharmaceutical preparation of the present invention is appropriately selected depending on the usage, age, sex and other conditions of the patient, degree of disease and the like. Usually, the amount of the compound of the present invention, which is an active ingredient, is about 0.5 to 20 mg, preferably about 1 to 10 mg per kg of body weight per adult per day. The formulation can be administered once a day or divided into 2-4 times.
[0042]
【Example】
Hereinafter, in order to explain the present invention in more detail, Production Examples of the compound of the present invention will be cited as Reference Examples, followed by pharmacological test examples of the compound of the present invention and pharmaceutical preparations containing the compound of the present invention as an active ingredient.
[0043]
Reference Example 1 Production of diisopropyl 4-[(4- (4-fluorophenyl) -5-methylthiazol-2-yl) carbamoyl] benzylphosphonate (1) 2-amino-4- (4-fluorophenyl) Production of -5-methylthiazole 179 g of 4-fluoropropiophenone and 1 g of aluminum (III) chloride were dissolved in 1000 mL of chloroform, and 197 g of bromine was slowly added dropwise to this mixture under ice-cooling and stirring. After stirring for 1 hour under ice cooling, the reaction mixture was poured into ice water (500 mL). The chloroform layer was separated, washed sequentially with 500 mL of saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and 500 mL of saturated saline, and dried over magnesium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 4'-fluoro-2-bromopropiophenone. Without purification, 600 mL of ethanol and 86 g of thiourea were added, and the mixture was stirred at 70 ° C. for 12 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, 1000 mL of ethyl acetate and 800 mL of a 2N aqueous sodium hydroxide solution were added to the obtained reaction mixture to carry out liquid separation. The ethyl acetate layer was dried over magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the obtained crude crystals were recrystallized from ethyl acetate-n-hexane to produce the compound of Compound No. 1 shown in Table 1. 172 g of the title compound as a starting material was obtained.
[0044]
Similarly, amines, which are raw materials for producing each compound of compound No. 2-11 shown in Table 1, were produced.
(2) Preparation of diisopropyl 4-[(4- (4-fluorophenyl) -5-methylthiazol-2-yl) carbamoyl] benzylphosphonate 111.6 g of 4-[(diisopropoxyphosphoryl) methyl] benzoyl chloride A methylene chloride (350 mL) solution was stirred under ice-cooling, and a pyridine solution (400 mL) of 72.9 g of 2-amino-4- (4-fluorophenyl) -5-methylthiazole obtained in the above (1) was slowly added dropwise thereto. . After stirring the mixture at room temperature for 12 hours, 500 mL of water was added thereto, and methylene chloride was distilled off under reduced pressure. The obtained crude crystals were recrystallized from ethanol-water to give 146 g of the title compound as colorless crystals. The structure and physical properties of the obtained compound are shown in Table 1 as “Compound No. 1”.
[0045]
[Reference Example 2-11]
Using the starting amines obtained in the same manner as in Reference Example 1 (1), each compound shown in Table 1-2 as Compound No. 2-11 was produced in the same manner as in Reference Example 1 (2). The structure and physical properties of the obtained compound are shown in Table 1-2.
[0046]
Reference Example 12 Production of diisopropyl 4-[(5-carboxy-4-phenylthiazol-2-yl) carbamoyl] benzylphosphonate 3.2 g of the ester (Compound No. 10) produced in Reference Example 10 was dissolved in 25 mL of ethanol. Then, under ice-cooling and stirring, 6 mL of a 2N aqueous sodium hydroxide solution was slowly added dropwise thereto. After stirring the mixture at room temperature for 12 hours, a 10% aqueous hydrochloric acid solution was added to adjust the pH to 2, and the precipitated crystals were collected by filtration to obtain 2.0 g of the title compound as colorless crystals. The structure and physical properties of the obtained compound are shown in Table 2 as “Compound No. 12”.
[0047]
Reference Example 13 Production of diisopropyl 4-[(5-butylcarbamoyl-4-phenylthiazol-2-yl) carbamoyl] benzylphosphonate The carboxylic acid (Compound No. 12) produced in Reference Example 12 (2.0 g, 1- 1.3 g of hydrochloride of (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide and 0.54 g of 1-hydroxybenzotriazole were suspended in 10 mL of DMF and stirred at room temperature for 1 hour. Subsequently, 0.59 g of butylamine was added, and the mixture was further stirred at room temperature for 20 hours.
[0048]
Water was added to the reaction mixture, and the precipitated crystals were collected by filtration, and the obtained crude crystals were recrystallized from ethyl acetate-n-hexane to give 1.0 g of the title compound as colorless crystals. The structure and physical properties of the obtained compound are shown in Table 2 as “Compound No. 13”.
[0049]
[Reference Example 14-18]
In the same manner as in Reference Example 13, each compound shown in Table 2 as Compound No. 14-18 was obtained. Table 2 also shows the structure and physical properties of the obtained compound.
[0050]
In the tables, the abbreviations of the groups indicate the following.
Me: methyl group, Et: ethyl group, i-Pr: isopropyl group
[Table 1]
[Table 2]
In the table, NMR (1) of the physical properties of Reference Example 12 is as follows.
NMR (1): (δ: ppm, DMSO-d 6 , internal standard = TMS)
1.14 (d, J = 6.2 Hz, 6H), 1.22 (d, J = 6.2 Hz, 6H), 3.30 (d, J = 22.0 Hz, 2H), 4.48-4 .56 (m, 2H), 7.45 (m, 5H), 7.75 (m, 2H), 8.08 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 13.02 (brs, 1H)
Hereinafter, the DGATs of the compounds obtained in the above Reference Example 1-18 (see Tables 1 and 2 and referred to as Compound No. 1-18 corresponding to the Reference Examples) and the compounds shown in Table 3 below as test substances were used. An example in which the inhibitory activity was tested will be described.
[0054]
[Table 3]
[Pharmacological Test Example 1] Rat DGAT inhibitory activity test (1) Reagents The following reagents were used to measure DGAT enzyme activity.
-Homogenization buffer: contains 10 mM HEPES (pH 7.4), 250 mM sucrose and 1 mM EDTA-Assay buffer: 150 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 6 mg / mL BSA (FFA
Free) and a 2 mM DTT · DGAT substrate solution: 0.1mM [1- 14 C] oleoyl coenzyme A ([1- 14 C] Oleoyl -coenzyme A, specific activity: including 4.0Ci / mol) Assay buffer (2) Preparation of DGAT enzyme solution Adrenal gland was excised from SD male rats (60 rats), 20 mL of homogenization buffer was added to the excised adrenal gland (ca. 4 g), and homogenized with a glass Teflon (registered trademark) homogenizer. did. The obtained homogenate was centrifuged at 800 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. This was then centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. to remove the pellet. The supernatant was further centrifuged at 105,000 × g for 60 minutes at 4 ° C. to obtain a pellet (microsomal fraction). This was washed with 20 mL of homogenization buffer, and then suspended in 10 mL of 10 mM HEPES (pH 7.4), 250 mM sucrose, and 2 mM DDT. After quantifying the protein content of this suspension, it was stored at -80 ° C. Immediately before use, it was prepared using an assay buffer so as to have a concentration of 75 μg protein per 1 assay (200 μL), and this prepared solution was used as a DGAT enzyme solution.
(3) Measurement of DGAT Inhibitory Activity The test substance was dissolved in DMSO to a concentration of 1 × 10 −2 mol / L.
[0056]
2.5 μL of the test substance solution was placed in a 10 mL screw-cap test tube, and 200 μL of DGAT enzyme solution and 50 μL of DGAT enzyme substrate solution were added thereto, followed by incubation at 37 ° C. for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 4.0 mL of n-hexane and 1.0 mL of ethanol. After shaking for 5 minutes, the mixture was centrifuged (3000 rpm, 10 minutes), and 2 mL of the upper hexane layer was transferred to a glass test tube. The n-hexane was removed under a stream of nitrogen gas, and the obtained lipid extract was redissolved in 100 μL of chloroform / methanol (2: 1) and spotted on a TLC plate. The TLC plate was developed with n-hexane / diethyl ether / acetic acid (73: 25: 2), and 14 C of the triglyceride fraction was quantified by autoradiography.
[0057]
The amount of triglyceride that decreased when the test substance was added, as compared with the control without the test substance, expressed as a percentage, was determined as the DGAT inhibition rate.
(4) Results The results obtained are shown in Table 4.
[0058]
[Table 4]
(5) Discussion From the results shown in Table 4, it is clear that each of the compounds belonging to the general formula (1) as active ingredients in the present invention has DGAT inhibitory activity.
[0060]
[Pharmacological Test Example 2] DGAT inhibitory activity test on human white adipocytes (1) Test method Human subcutaneous adipose tissue-derived white adipocytes (24-well plate, Zen-Bio) were differentiated for 17 days. On day 18, [1- 14 C] oleate- BSA complex and a final concentration of 1 × 10 -5 was replaced with medium plus test substance mol / L, further 18 hours in a CO 2 incubator (5% CO 2, (37 ° C.). After the culture, the medium was removed, the cells were washed three times with PBS (-), 0.6 ml of a mixture of n-hexane / isopropanol (3: 2) was added thereto, and the mixture was left at room temperature for 30 minutes to perform extraction. . Thereafter, the extract was collected in a glass test tube, 0.4 ml of a mixed solution of n-hexane / isopropanol (3: 2) was added, extraction was performed at room temperature for 30 minutes, and the extract was collected again in the same glass test tube. The solvent was removed under a stream of nitrogen gas, and the obtained lipid extract was redissolved in 100 μL of chloroform / methanol (2: 1) and spotted on a TLC plate. The TLC plate was developed with n-hexane / diethyl ether / acetic acid (73: 25: 2), and 14 C of the triglyceride fraction was quantified by autoradiography.
[0061]
The amount of triglyceride that decreased when the test substance was added, as compared with the control without the test substance, expressed as a percentage, was determined as the DGAT inhibition rate.
(2) Results Table 5 shows the results.
[0062]
[Table 5]
(3) Discussion From the results shown in Table 5, it is clear that each compound belonging to the general formula (1) as an active ingredient in the present invention has DGAT inhibitory activity.
[0064]
[Formulation Example 1]
Using the compound of the present invention obtained in Reference Example 1 as an active ingredient, tablets (2000 tablets) containing 300 mg per tablet were prepared according to the following formulation.
600 g of the compound of the present invention obtained in Reference Example 1
Lactose (Japanese Pharmacopoeia) 67g
Corn starch (Japanese Pharmacopoeia) 33g
Carboxymethylcellulose calcium (Japanese Pharmacopoeia product) 25g
Methylcellulose (Japanese Pharmacopoeia) 12g
Magnesium stearate (Japanese Pharmacopoeia) 3g
That is, the compound of the present invention, lactose, corn starch, and carboxymethylcellulose calcium obtained in Reference Example 1 were thoroughly mixed according to the above-mentioned formulation, and the mixture was granulated with an aqueous methylcellulose solution, passed through a 24-mesh sieve, and passed through magnesium stearate. And pressed into tablets to obtain the desired tablets.
[0065]
[Formulation Example 2]
Using the compound of the present invention obtained in Reference Example 1 as an active ingredient, a hard gelatin capsule (2000 capsules) containing 200 mg per capsule was prepared according to the following formulation.
400 g of the compound of the present invention obtained in Reference Example 1
Crystalline Cellulose (Japanese Pharmacopoeia) 60g
Corn starch (Japanese Pharmacopoeia) 34g
Talc (Japanese Pharmacopoeia) 4g
Magnesium stearate (Japanese Pharmacopoeia) 2g
That is, each component was finely powdered according to the above formula, mixed into a uniform mixture, and then filled into a gelatin capsule for oral administration having a desired size to obtain a desired capsule.
Claims (2)
で表されるホスホン酸ジエステル誘導体を有効成分として含有することを特徴とするＤＧＡＴ阻害剤。General formula (1):
A DGAT inhibitor comprising, as an active ingredient, a phosphonic acid diester derivative represented by the following formula:
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