JP2004065008A - Microorganism having ability to decompose estrogen and utilization thereof - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a microorganism having an ability to decompose estrogens and to provide a method for simply decomposing the estrogens discharged from domestic wastewater and livestock farms, etc., into the environment utilizing the microorganism. <P>SOLUTION: The microorganism is characterized as belonging to the genus Rhodococcus or Sphingomonas and having the ability to decompose the estrogens. A method for decomposing the estrogens comprises utilizing the microorganism. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００６】
ところで、従来の排水処理施設においては、物理学的処理、化学的処理、生物学的処理の３つの処理方法が行われている。このうち物理学的処理とは、具体的に示すと、遠心分離法、ろ過法、加圧浮上分離法、吸着法などであり、また、化学的処理とは、化学薬品等の添加による有害物質の無害化処理法、電気透析法、イオン交換法などをさす。これに対し、生物学的処理は、微生物を用いて、排水中の有機物質を分解し、除去する方法であり、物理学的処理、化学的処理では処理の困難な物質などの処理にも有効である。
【０００７】
このため、生物学的処理は、近年、多くの排水処理施設で利用されており、一般的に次の３つの段階に別けられる。すなわち、予備処理、生物酸化処理、汚泥の処理である。このうち、予備処理には、スクリーン、沈砂池、沈殿池、浮上槽などが含まれ、これらの装置は、排水に含まれる粒径の大きい固形物や無機性の浮遊物などを除去するとともに、さらに、生物酸化処理施設への有機物質の負荷を減らすために役立っている。
【０００８】
また、生物酸化処理は、微生物を利用するものであるが、その手法としては、微生物を固体支持体表面に付着させ生育させる方法と、微生物群を液中に懸濁させる方法とがある。前者は、通常、散水ろ床法などの固定床式の装置により、また後者は、活性汚泥法などの流動床式の装置により実施される。
【０００９】
上記の活性汚泥処理や散水ろ床処理などは、排水中の汚濁物質を低減するためには非常にすぐれた方法であるため、近年、内分泌攪乱化学物質の分解にあたっても、こうした生物学的処理によるアプローチが各種なされており、更には、処理効率の向上や処理の困難な内分泌攪乱化学物質の分解を目的とした微生物の選別・強化も行われている。例えば、特開２００１−３３３７６７号には、ノニルフェノール分解能を有するスフィンゴモナス属細菌が、特開平１１−３４１９７８号には、ダイオキシン分解能を有するフザリウム属細菌がそれぞれ記載されている。しかしながら、女性ホルモン物質を効果的に分解することのできる微生物については、現在まで全く報告されていなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、女性ホルモン物質分解能を有する微生物の提供と、この微生物を利用して、生活排水および家畜養殖場等から環境中に排出された女性ホルモン物質を簡便に分解する方法の提供を課題とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、女性ホルモン物質を用いた集積培養による多くの微生物をスクリーニングした結果、特異的に優れた女性ホルモン物質の分解能を有する微生物を見出した。また、当該微生物を利用した女性ホルモン物質の分解方法や分解装置により環境中に排出された女性ホルモン物質を分解できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属またはスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属し、女性ホルモン物質分解能を有することを特徴とする微生物を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、上記微生物を使用し、女性ホルモン物質を分解することを特徴とする女性ホルモン物質の分解方法を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、上記微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触させる手段を有する女性ホルモン物質分解用装置を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、分解処理の対象となる女性ホルモン物質は、例えば、前記式（Ｉ）で示される天然あるいは合成女性ホルモンである。このうち、１７β−エストラジオールは、卵巣ろ胞から分泌されるステロイドホルモンで、生理活性が最も高い物質である。その分泌は、脳下垂体の卵胞刺激ホルモン、および、黄体形成ホルモンの支配を受けている。薬剤として、無月経症、月経周期異常、月経困難症、子宮発育不全、更年期障害などに用いられている。また、エストロンは、卵胞ホルモンの一種で、１７β−エストラジオールの代謝産物である。このものは、強いエストロゲン活性を有し、女性ホルモン剤として、女性の性機能不全、更年期障害、および、前立腺ガンなどに使用される。更にエストリオールは、生体内での１７β−エストラジオールの代謝産物で、エストロンを経由して生成され尿中へ出現するものである。一方、エチニルエストラジオールは、人工の女性ホルモン物質で、卵胞ホルモン作用薬として用いられている。１７β−エストラジオールより肝臓で分解されにくく、経口投与で１７β−エストラジオールより有効とされており、子宮発育不全、無月経、不妊症、更年期障害等に経口投与され、また、経口避妊薬「ピル」にも用いられているものである。
【００１６】
これらの女性ホルモン物質を分解する微生物（以下、単に「本発明微生物」という）は、例えば、活性汚泥槽中に存在するロドコッカス属またはスフィンゴモナス属に属する微生物を、前記式（Ｉ）の女性ホルモン物質を用いてスクリーニングすることにより得られる。
【００１７】
より具体的には、下水処理場の活性汚泥槽中から得られた活性汚泥を、女性ホルモン物質を用いた多段階のスクリーニングに付すことにより、本発明微生物を得ることができる。
【００１８】
すなわち、本発明微生物はそれぞれの活性汚泥を、女性ホルモン物質を基質としたカラム集積培養法で長時間（およそ１０週間）培養を行い、女性ホルモン物質の分解能を有する微生物をスクリーニングした後、更に女性ホルモン物質を基質とした培養を行い、数値的にも有意に高い分解能を示す微生物をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００１９】
女性ホルモン物質の分解能を有する微生物のスクリーニングの具体例としては下記のような手順を示すことができる。まず、図１に示すようなカラム、基質導入口および空気導入口を備える培養装置を作成する。この培養装置に、活性汚泥と、例えば、下記に示すＭＤＧ培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＤＯＭＩＮＩＣ　＆　ＧＲＡＨＡＭ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）をカラムに入れ、これに空気導入口から酸素と基質導入口から１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質とを導入し、２５℃程度で、１０週間程度回分培養する。この培養中は、定時に生菌数やｐＨを測定する。培養終了後、ＩＳＰ培地、Ｒ_２Ａ培地、ＹＭ培地等で菌株の選抜および釣菌を行い、女性ホルモン物質分解能を有する微生物を得る。
【００２０】
ＭＤＧ培地の組成：
Ｋ_２ＨＰＯ_４　　　　　　　　　　　　３．５
ＫＨ_２ＰＯ_４　　　　　　　　　　　　１．５
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４　　　　　　　　　　０．５
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　０．５
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　０．１５
Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　０．００５％（ｗ／ｖ）
トレースエレメント^＊　　　　　　　　１．０　　（ｍＬ／Ｌ）
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　７．０
数値の単位はｇ／Ｌ。
【００２１】
＊トレースエレメントの組成：
ＮａＨＣＯ_３・１０Ｈ_２Ｏ　　　　　　　２．０
ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．３
ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．２
（ＮＨ_４）Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ　　　　０．０２
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．１
ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．５
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．０５
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．５
数値の単位はｇ／Ｌ。
【００２２】
次いで、上記スクリーニングにより選抜された微生物を、例えば、女性ホルモン物質を含むＹＭ培地中で培養し、培養後の培地中の女性ホルモン物質の残存量を測定することにより、女性ホルモン物質の分解能の高い微生物のスクリーニングを行うことができる。このスクリーニングを複数回繰り返し行うことで、より女性ホルモン物質の分解能の高い微生物を得ることができる。
【００２３】
かくして得られる本発明微生物は、スクリーニングに用いた１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質の少なくとも１種以上を生物学的に分解可能であり、具体的には女性ホルモン物質として１７β−エストラジオールを１００ｐｐｍ添加した１ＬのＭＤＧ培地において１０^８〜１０^９個程度の本発明微生物を８時間培養した場合に、当該培地中の１７β−エストラジオールを８０％以上分解することができる能力を有するものである。
【００２４】
上記のスクリーニングにより、伏見下水処理場（京都府京都市）の活性汚泥槽、等々力水処理センター（神奈川県川崎市）の活性汚泥槽、多摩川上流処理場（東京都昭島市）の活性汚泥槽、森ヶ崎水処理センター（東京都大田区）の活性汚泥槽より得られた微生物中から選抜された女性ホルモン物質を分解することができる微生物として、下記５株を得た。なお、これらの微生物の菌種同定は微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列を用いて文献記載（Ｃａｒｌ　Ｒ．　Ｗｏｅｓｅ，　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ．，　５１：２２１−２７１（１９８７）およびＥ．　Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ　ａｎｄ　Ｂ．　Ｍ．　Ｇｏｅｂｅｌ，　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｎｏｔｅ：　Ａ　Ｐｌａｃｅ　ｆｏｒ　ＤＮＡ−ＤＮＡ　Ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｓｅｎｔ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　４４，　（４）：　８４６−８４９　（１９９４））の分子進化系統解析に基づき行った。分子進化系統解析により５株の微生物は次のように同定された。
【００２５】
・ロドコッカス・ゾフィイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｐｆｉｉ）　Ｄ−Ｉ７
・スフィンゴモナス・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）　Ｃ−Ｉ２
・ロドコッカス・イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）　Ａ−Ｙ２
・ロドコッカス・イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）　Ｄ−Ｙ４
・ロドコッカス・イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）　Ｅ−Ｙ５
【００２６】
これら５株のうちＤ−Ｉ７株およびＣ−Ｉ２株については、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に４月２６日付でそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８３９およびＦＥＲＭ　Ｐ−１８８３８で寄託されている。一方、Ａ−２Ｙ株、Ｄ−Ｙ４株およびＥ−Ｙ５株については上記特許生物寄託センターにおいて、分類学上の問題から受託を拒否されたため寄託を行っていないが、本株は特許法施行規則第２７条の３の条件を満足する分譲の請求があった場合は、出願人株式会社ヤクルト本社において、同条の条件に従って分譲することを保証する。
【００２７】
本発明の微生物であるロドコッカス・イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）およびロドコッカス・ゾフィイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｐｆｉｉ）を含むロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）は（日本放射菌学会編、「放射菌の分類と同定」、日本学会事務センター、１８７−１８８（２００１））、Ｈｉｇｈ−ＧＣグラム陽性球菌であるコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）グループに含まれる。これまでは、マイコバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）とノカルディア・スピーシーズ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．）の中間的な性状を示すことでまとめられたロドクロス・コンプレックス（Ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ）のグループであったが、１８９１年にゾフ（Ｚｏｐｆ）が提案した属名を当てて再定義された（Ｔｓｕｋａｍｕｒａ，　Ｍ．　Ａ　Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　ｇｒｏｕｐ，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１８，　３７−４４　（１９７４））。本発明の微生物は、好気性であり、非運動性である。また、抗酸性は示さないか、あっても極めて弱い。更に、菌糸状の生育をするものから、擬球菌状の細胞のものまであるが、気菌糸を持つものはない。また更に、菌糸状あるいは分枝状の桿菌は一般に長時間の培養によって細胞が断裂して、短桿菌状あるいは擬球菌状となる。更にまた、生育至適温度は２０℃から３７℃と広い。また、橙色から赤色のコロニーを形成し、その表面はラフ、スムース共に存在する。更に、細胞壁ペプチドグリカンは、Ａ１γ−タイプ、グリコリル型、アラビノースとガラクトースを含む。また更に、呼吸鎖キノンの主要成分はＭＫ−８（Ｈ_２）である。更にまた、菌体脂肪酸は直鎖−モノ不飽和型で１０Ｍｅ−１８：０を含む０１０メチル脂肪酸の含量は、種または株によって異なる。また、リン脂質としてはＰＥが検出されるほか、ＤＰＧ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＩＭｓと、いくらかの糖脂質がみられる。本スピーシーズの多くは土壌由来であるが、動植物にも幅広く分布している。
【００２８】
本発明のもう一方の微生物であるスフィンゴモナス・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）はグラム陰性菌であり、α−プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　α−ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）に含まれる（坂崎利一監訳、「グラム陰性、好気性および通性嫌気性桿菌の同定」、近代出版、３０２−３０３（１９９３））。また、比較的長い桿菌のものが多くあり、運動性があるものも含まれる。更に、好気性で黄色の不溶性な色素を産生する。また更に、通常、マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）寒天に非発育で、グルコース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マルトースを利用する。更にまた、マンニットは非利用で、硝酸塩に対しては非還元である。また、リシンデカルボキシラーゼに陰性、アルギニンジヒドロラーゼに陰性という特徴を持つ微生物である。
【００２９】
かくして得られた本発明微生物について、これらの大量培養に好適な条件を検討したところ、至適培養温度が３０℃、ｐＨが全般的に６．０から７．０であった。また、至適培地の検討には、ＩＳＰ培地を基本に、その成分量を増減させ、無機塩の添加等を行った下記に示す改変培地１および改変培地２を使用し、増殖に与える影響を検討した。この結果、上記５株のうち、Ｃ−Ｉ２株を除いては改変培地１においてよく増殖しており、Ｃ−Ｉ２株が最も低栄養な微生物であることが明らかになった。
【００３０】
改変培地１の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　　　５ｇ
Ｐｅｐｔｏｎｅ　　　　　　　　　　　１０ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　　５ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４　　　　　　　　　　　　　１ｇ
Ｋ_２ＨＰＯ_４　　　　　　　　　　　　　２ｇ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　　　　　　　　　０．５ｇ
【００３１】
改変培地２の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　　　２ｇ
Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　　　１０ｇ
Ｄｅｘｔｏｒｏｓｅ　　　　　　　　　　４ｇ
【００３２】
以上説明した本発明微生物は、単独あるいはこれらを組合わせて排水中または土壌中の女性ホルモン物質を分解するのに使用することができる。また、これらの微生物は、例えば活性汚泥法などによる場合はそのまま使用しても良いが、これらの微生物を固体支持体に付着生育させて使用することが女性ホルモン物質の分解の点から好ましい。
【００３３】
固体支持体に付着生育させる場合には、微生物を固定化する方法として、共有結合、イオン結合、水素結合、物理的な吸着などにより不溶性の担体に微生物を付着させる結合固定化方法と、低分子化合物を重合または会合させるか、または高分子化合物を可溶の状態から不溶の状態に変化させることによって生じる高分子ゲルに微生物を包み込んでしまう包括固定化方法があるが、いずれを採用しても良い。しかしながら、微生物の保持能力の点で結合固定化法が好ましく、微生物を付着させる固体支持体としては多孔性セルロース、ＰＶＡ、微粉末活性炭コート顆粒ポリビニルアルコール担体（ＡＣＰ担体：三好ら、「染色排水に対する脱色細菌の適用」、下水道協会誌、３９、１２３−１３２（２００２））等が挙げられるが、特にＡＣＰ担体の使用が好ましい。
【００３４】
具体的に排水中の女性ホルモン物質を分解するにあたって、例えば活性汚泥法を採用する場合は、一般的には、被処理液１Ｌ当たり１０^８から１０^９個程度の本発明微生物を用い、５から１０時間程度好気的に培養処理すれば良い。また、固体支持体を用いる方法を採用する場合は、固体支持体上の本発明微生物と被処理液を５から１０時間程度好気的な培養条件下で接触させれば良い。
【００３５】
また、土壌中の女性ホルモン物質を分解するにあたっては、例えば、必要により緩衝溶液または生理食塩水に懸濁させた本発明微生物を、処理すべき土壌表面あるいは掘り起こした土壌に、１ｍ^３当たり１０^９から１０^１０個程度散布すればよい。
【００３６】
なお、本発明微生物を用いて、効率よく女性ホルモン物質を分解するには、本発明の微生物を利用した女性ホルモン物質を分解するための、本発明微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触する手段を有する装置の利用が挙げられる。具体的には、完全混合タイプ、エアーリフトタイプ、カラム充填タイプ、ラグフロータイプ等のバイオリアクター装置を用いることができる。このような装置は生物酸化処理中の２次処理工程で使用することができ、その際には、微生物群を排水中に懸濁させる方式よりも固体支持体表面に付着生育させて用いる方式の方が、好適である。これは、微生物を支持体表面に付着させることにより、バイオリアクターから外部への微生物の流出を防ぐことができ、より濃厚な菌液を得られることが出来るため、排水中の女性ホルモン物質を効率よく分解することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例について本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
実　施　例　１
連続集積培養による女性ホルモン物質の分解能を有する微生物の
スクリーニング：
長さ５０ｃｍ×直径８ｃｍの円筒形カラムの上部に基質導入口および下部に空気導入口を設け、これらにチューブを接続した後、ゴム栓にて蓋をし、培養装置を作製した（図１）。この培養装置中に前記したＭＤＧ培地と表１に示す場所より採取した活性汚泥２０ｍＬを加えた。次いで、上部流出入口より、０．１ｍｇ／Ｌの１７β−エストラジオール水溶液を、６０〜１００ｍＬ／時間で、また下部流出入口より酸素を５０〜１００ｍＬ／分で吹き込んだ。この状態で、およそ１０週間連続的に回分培養をし、０、５、２４、７２時間、その後は１週間毎に生菌数およびｐＨを調べた。再現性の確認のため、培養は３回行った。３回とも、微生物の増殖が確認された１０週間目（等々力水処理センターのみ９週間目）の培養液より、特徴的な集落を、それぞれＩＳＰ分離培地、Ｒ_２Ａ分離培地およびＹＭ培地で菌株を選択・釣菌した。表１に各培地で得られた集落の数およびそこから釣菌された菌株数を示す。
【００３９】
【表１】

【００４０】
この結果に示すように、連続集積培養により伏見下水処理場からは１４株、等々力水処理センターからは１０株、多摩川上流処理場からは１６株、森ヶ崎処理センターからは１６株の合計５６株の女性ホルモン物質分解微生物が得られた。
【００４１】
実　施　例　２
女性ホルモン物質の高分解能を有する微生物のスクリーニング：
（１）一次スクリーニング
実施例１において得られた５６株の微生物を、１７β−エストラジオールを基質とする培地を用い、下記に示す方法で培養し、増殖速度が高い菌株を選抜した。まず、１７β−エストラジオールをＤＭＳＯ溶液に溶解し、０．２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。この溶液をＭＤＧ培地中に、１７β−エストラジオール濃度が１００ｐｐｍとなるように添加した。
【００４２】
２５℃に保存している実施例１で得られた各微生物を、ＹＭ平板培地に線引き植菌した後、流動パラフィンを重層して画線培養を行った。３〜１０日後、この１白金耳をかきとり、上記で調製した培地が入った試験管に植菌した。植菌した試験管を２５℃にて激しく振とうさせ、１０日間培養した。植菌していない基質の入った試験管をコントロールとして、植菌した試験管の基質の濁度を観察した。微生物の増殖の度合いの判定は以下の基準で行った。その結果を表２および表３に示す。
【００４３】
＜判定基準＞
−　：　コントロールと比較して全く同じである。
＋　：　コントロールと比較して多少の濁りが観察され、菌の増殖があると
予測される。
＋＋：　コントロールと比較して明らかに濁っており、活発な菌の増殖が
推測される。
【００４４】
【表２】

【００４５】
【表３】

【００４６】
一次スクリーニングの結果、＋以上の判定が得られたのは、５６株中、２５株であった。
【００４７】
（２）二次スクリーニング
一次スクリーニングで選択した微生物２５株について、下記に示す方法で菌株を選定した。まず、一次スクリーニングで＋以上の増殖を示した２５株をＹＭ平板培地に画線培養し、一次スクリーニングと同様の手法で培養した。１０日後、増殖した培地の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）で固相抽出し、抽出物１０μＬを薄層クロマトグラフにスポッティングし、ベンゼン−メタノール（９：１）混液を展開溶媒として展開させて、１７β−エストラジオールの減少を確認した。この結果、有効に１７β−エストラジオールを分解する９株を選択した。
【００４８】
（３）三次スクリーニング
二次スクリーニングで選択した微生物９株について、より強く１７β−エストラジオールを分解する菌株を選定するとともに、他の女性ホルモン物質（エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール）についてもその分解能を検討した。材料および方法は以下の手順に従った。まず、女性ホルモン物質（１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール）をそれぞれＤＭＳＯ溶液に溶解し、０．２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌したものを用意し、これをＭＤＧ培地中で濃度１００ｐｐｍとなるように調製し、培養培地とした。
【００４９】
この培養培地を試験管に取り、上記微生物を二次スクリーニングと同様植菌した後、所定時間培養した。培養開始５時間後、８時間後、２４時間後の女性ホルモン物質の濃度を測定し、減少量を確認した。女性ホルモン物質量の測定は、培養後の培地の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）に保持させ、その後、酢酸メチルで溶出させ、分析することにより行った。より具体的には、次のようにして分析した。すなわち、まず溶出液を適当量分取し、これにサロゲート物質（１７β−エストラジオール−ｄ４）を添加した。次いで、窒素気流により乾固させた後、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）によりＴＭＳ化体を誘導し、再び乾固させ、ｎ−ヘキサンに溶解させ、その検液を下記条件のガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５０】
＜ガスクロマトグラフィーの測定条件＞
ガスクロマトグラフ装置：ＧＣ−１７Ａ（（株）島津製作所製）
キャピラリーカラム　　：ＨＰ−１（ヒューレットパッカード株式会社製）
（１５ｍ×０．２５ｍｍ；ｄｆ＝０．２５μｍ）カラム温度　　　　　　：１５０℃→（２０℃／ｍｉｎ）→２１０℃→
（１０℃／ｍｉｎ）→３００℃キャリアーガス　　　　：ヘリウム
インジェクター　　　　：スプリットレス　Ｔ＝２５０℃
検出器　　　　　　　　：ＦＩＤ・Ｔ＝３００℃
サンプル注入量　　　　：１μＬ
分析時間　　　　　　　：２０分
【００５１】
三次スクリーニングの結果、８時間で１７β−エストラジオールを８０％以上分解する微生物として５株（Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）を選択した。その選択した微生物による１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオールの分解による残存量の経時変化を図２〜図５に示した。
【００５２】
実　施　例　３
女性ホルモン物質分解能を有する微生物の同定：
女性ホルモン物質分解能を有する微生物（以下、「女性ホルモン物質分解菌」という）の５菌株（Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）について、１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた菌種同定を、以下の手順に従って行い、１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた系統樹図を作製した（図６および図７）。
【００５３】
（１）菌体からのＤＮＡ抽出
上記の５菌株の各純培養菌体から、以下に示す塩化ベンジル法を用いてＤＮＡを抽出した。すなわち、ＹＭ斜面寒天培地を用いて３日間、３０℃で培養した。培養後、集菌した菌体に２５０μＬのＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、４０ｍＭのＥＤＴＡの混合液：ｐＨ９．０）、２００μＬのベンジルクロライドおよび５０μＬの１０％ＳＤＳを加え、５０℃で、激しく３０分間振とうした。３Ｍの酢酸ナトリウムを１５０ｍＬ加えた後、遠心し、上清を別のチューブに移し、イソプロパノール沈殿、７０％エタノール洗浄を順に行い、風乾した後、これを１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解して各菌体のＤＮＡとした。
【００５４】
（２）１６ＳｒＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応
増幅プライマーには下記の二つのプライマーを使用した。
８Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
１５Ｒ：５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＲＣＣＧＣＡ−３’
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＬのｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ、１Ｕ　ＴａｑのＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ｎｇの菌体ＤＮＡおよび増幅プライマー８Ｆと１５Ｒをそれぞれ０．４μＭ含む反応液（総量５０μＬ）について、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）により、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、９４℃で２０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１８０秒で２５サイクル行った。ＰＣＲ反応後、得られた増幅産物は、マイクロコン−ＰＣＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて精製した。
【００５５】
（３）１６ＳｒＤＮＡ配列の決定
１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の解読は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）により、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７３Ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）を使用して行った。使用したｐｒｉｍｅｒは下記に示した。配列のアライメントには、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。
８Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
９３０Ｆ：５’−ＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
８００Ｒ：５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＱ−３’
１５Ｒ：５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＲＣＣＧＣＡ−３’
【００５６】
（４）１６ＳｒＤＮＡ配列の系統解析
得られた１６ＳｒＤＮＡ配列とＤＤＢＪ等の遺伝子データベースより得られた近縁な細菌の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列をもちいて、系統解析ソフト（Ｃｌｕｓｔｕｌ　Ｘ）を使用して分子進化系統解析を行った（図６）。その結果、Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５　株、Ｄ−Ｙ４株はロドコッカス・イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）に属する菌株と、　Ｄ−Ｉ７株はロドコッカス・ゾフィイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｚｏｐｆｉｉ）に即する菌株と　、Ｃ−Ｉ２株スフィンゴモナス・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）であると同定された。
【００５７】
実　施　例　４
女性ホルモン物質分解能を有する微生物を用いた排水処理：
女性ホルモン物質分解菌５菌株（Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）を担体に固定し、排水の処理を行った。
【００５８】
（１）固定化担体の作製
多孔性セルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、微粉末活性炭コート顆粒ポリビニルアルコール（ＡＣＰ）の３種類の担体を用い、結合固定化法により女性ホルモン物質分解菌を次の手順で固定した。まず、固定化する女性ホルモン物質分解菌の各菌体をジャーファーメンターを用いて大量に培養した。この培養において対数増殖期の培養液５００ｍＬを滅菌したフラスコに入れ、次いで、このフラスコに表４に示す３種類の担体を１００ｇずつ入れて良く混合し、固定化担体を作製した。
【００５９】
（２）固定化担体の微生物保持能力の評価
上記（１）で作製した固定化担体から次の手順で菌体を溶出させ、生菌数を測定することで微生物保持能力を評価した。まず、固定化担体を数粒すりつぶし、１０ｇ量り取った。この固定化担体をガラス製試験管の生理食塩水１０ｍＬ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００含有）中に入れ、これを１０分間超音波処理して十分にミキシングした後、再度１０分間超音波処理をした。このようにして得られた溶液を生菌数測定用の溶出液とした。溶出液の生菌数はＣＧＹ培地を用いた希釈平板法により計数した。なお、担体中の生菌数の測定は、担体作成後２４時間および７２時間に、フラスコ中に浸漬した固定化担体の一部を採取することで行った。その結果を表４に示す。この結果、ＡＣＰ担体の微生物保持能力が高いことが示された。
【００６０】
【表４】

【００６１】
（３）回分式曝気法による有効性試験
５株の女性ホルモン物質分解菌の各々を（１）と同様の手順でＡＣＰ担体に固定化し、女性ホルモン物質を添加した合成下水に対する有効性試験を行った。具体的には、５株の女性ホルモン物質分解菌をジャーファーメンターにて大量培養し、得られた培養液を１０５℃で１０分間高圧滅菌した後、滅菌水で洗浄したＡＣＰ担体（培養液５００ｍＬに対して乾燥重量５０ｇのＡＣＰ担体）を２４時間浸漬して固定化した。合成下水は、文献記載（橋本奨著、「バイオテクノロジー活用の高機能型活性汚泥法」、技報堂出版、２６７−２６８（１９８９））の方法により作成した。下水中の女性ホルモン物質の濃度については、平成１２年度都内処理場での実態調査で、流入下水および処理中の１７β−エストラジオール濃度は０．０１７〜０．０６８μｇ／Ｌであり、エストロンの濃度は０．０１４〜０．１４μｇ／Ｌであることが報告されている（東京都下水道局報告書、「平成１２年度下水道における内分泌攪乱化学物質の実態調査結果」）。本有効試験は、作成した合成下水に、１７β−エストラジオールが０．１μｇ／Ｌ、エストロンが０．２μｇ／Ｌとなるように添加して実施した。
【００６２】
合成下水の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｐｅｐｔｏｎｅ　　　　　　　　　１５０ｍｇ
Ｍｅａｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　１００ｍｇ
Ｕｒｅａ　　　　　　　　　　　　　２５ｍｇ
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　７．５ｍｇ
ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　３．５ｍｇ
ＣａＣｌ_２　　　　　　　　　　　　　３．５ｍｇ
ＭｇＳＯ_４　　　　　　　　　　　　　２．５ｍｇ
Ｋ_２ＨＰＯ_４　　　　　　　　　　　２６７ｍｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４　　　　　　　　　　　３３ｍｇ
【００６３】
有効性試験は、図８に示す回分式曝気装置を用いた回分式曝気法により行った。すなわち、回分式曝気装置中におよそ２Ｌの合成下水を入れ、各女性ホルモン物質分解菌を固定化したＡＣＰ担体をおよそ１００ｇ投入し、空気導入口から０．１〜２ＶＶＭの空気を送り、攪拌翼で担体が沈殿しない程度に低速で攪拌した。曝気開始８時間後の１７β−エストラジオールとエストロンの濃度と分解率を表５に示した。ＡＣＰ担体に固定化したそれぞれの微生物は、８時間で１７β−エストラジオールを８０％以上分解する能力を示した。
【００６４】
【表５】

【００６５】
【発明の効果】
本発明の微生物は、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質を分解することが可能な微生物である。
【００６６】
従って、本発明の微生物を利用した女性ホルモン物質を分解する方法および装置により、女性ホルモン物質に汚染された排水や土壌中の女性ホルモン物質を分解し、環境を改善することができる。
【００６７】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】連続集積培養に使用した装置を示す図面である。
【図２】１７β−エストラジオールの経時変化を示す図面である。
【図３】エストロンの経時変化を示す図面である。
【図４】エストリオールの経時変化を示す図面である。
【図５】エチニルエストラジオールの経時変化を示す図面である。
【図６】本発明の（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属）微生物の分子進化系統解析を示す図面である。
【図７】本発明の（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属）微生物の分子進化系統解析を示す図面である。
【図８】回分式曝気培養に使用した装置を示す図面である。
【符号の説明】
１　…　…　培養装置
２　…　…　カラム
３　…　…　基質導入口
４　…　…　空気導入口
５　…　…　回分式曝気装置
６　…　…　ＡＣＰ担体
７　…　…　合成下水
８　…　…　攪拌翼
９　…　…　空気導入口
以　　上[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a microorganism capable of degrading a female hormone substance and use thereof, and more particularly, to a microorganism which specifically degrades a female hormone substance which is discharged into the environment and exists, and a method for degrading a female hormone substance using the same. .
[0002]
[Prior art]
Endocrine disrupting chemicals (so-called environmental hormones), which are thought to disrupt the endocrine system of living organisms, have been a major social problem since the publication of Colborn's "Robbed Future" (Colborn T., "Our Stonen Future" (1996)). Has become. The endocrine system in a living body is a system that normally maintains and regulates the development of living organisms, the development of reproductive organs, and the functions of various internal organs by the action of male hormones, female hormones, thyroid hormones, corticosteroids, and the like. Endocrine disrupting chemicals are a group of substances that cause damage to the endocrine system in living organisms, and are released in large quantities into the natural world by various human activities and the like, and have already caused many abnormalities in wildlife.
[0003]
These endocrine disrupting chemicals include organochlorine pesticides, antibacterials, herbicides, industrial chemicals such as bisphenol A and nonylphenol, and chemicals such as hormonal drugs. Are known. Of these chemical substances, industrial chemical substances are strictly regulated for their use by the Water Pollution Prevention Law and pollution-related laws and regulations due to their toxicity. As a result, the amount of chemicals released into the environment has been decreasing.
[0004]
However, among pharmaceutical chemicals, female hormonal substances such as 17β-estradiol, estrone, estriol, etc. represented by the following formula (I), and female hormonal substances such as synthetic female hormonal substances such as ethinyl estradiol are humans and animals. It is contained in the urine of humans and is released into the environment, and the amount is increasing as the population increases. As a result, wildlife inhabiting rivers and lakes where a large amount of urban wastewater is flowing has been found to have anomalous feminization (Deborah Cadbury, supervised by Yasumi Iguchi, "Nature to Meshes", Shueisha (1998) It has been suggested that ecological balance could be disrupted due to infertility. Therefore, it is necessary to reduce, for example, female hormone substances in wastewater at a wastewater treatment facility before discharging the wastewater to rivers and the like.
[0005]
Embedded image

[0006]
Incidentally, in a conventional wastewater treatment facility, three treatment methods of physical treatment, chemical treatment, and biological treatment are performed. Among them, the physical treatment is, specifically, a centrifugation method, a filtration method, a pressure flotation method, an adsorption method, and the like, and the chemical treatment is a harmful substance caused by the addition of a chemical agent or the like. Detoxification, electrodialysis, ion exchange, etc. On the other hand, biological treatment is a method of decomposing and removing organic substances in wastewater using microorganisms, and is also effective for treating substances that are difficult to treat by physical treatment or chemical treatment. It is.
[0007]
For this reason, biological treatment has been used in many wastewater treatment facilities in recent years, and is generally divided into the following three stages. That is, pretreatment, biological oxidation treatment, and sludge treatment. Among these, the pretreatment includes screens, sand basins, sedimentation basins, flotation tanks, etc., and these devices remove large-sized solids and inorganic suspended matters contained in the wastewater, In addition, it helps to reduce the load of organic matter on bio-oxidation treatment facilities.
[0008]
The biological oxidation treatment utilizes a microorganism, and there are a method of growing the microorganism by attaching it to the surface of a solid support, and a method of suspending a group of microorganisms in a liquid. The former is usually carried out by a fixed bed apparatus such as a trickling filter method, and the latter is carried out by a fluidized bed apparatus such as an activated sludge method.
[0009]
Activated sludge treatment and sprinkling filter treatment described above are very good methods for reducing pollutants in wastewater, and in recent years, even when decomposing endocrine disrupting chemicals, these biological treatments are used. Various approaches have been taken, and further, microorganisms have been selected and strengthened for the purpose of improving treatment efficiency and decomposing endocrine disrupting chemicals which are difficult to treat. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-333767 describes a sphingomonas genus bacterium having the ability to degrade nonylphenol, and Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-341978 describes a bacterium belonging to the genus Fusarium having a dioxin decomposing ability. However, no microorganisms capable of effectively decomposing female hormone substances have been reported to date.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a microorganism having the ability to degrade female sex hormones and to provide a method for easily decomposing female sex hormones discharged into the environment from domestic wastewater and livestock farms using the microorganisms. It is assumed that.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have screened many microorganisms by enrichment culture using a female hormone substance in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, found a microorganism having a specifically excellent resolution of a female hormone substance. Further, they have found that a female hormone substance discharged into the environment can be degraded by a method and a device for decomposing a female hormone substance using the microorganism, and completed the present invention.
[0012]
That is, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Rhodococcus or the genus Sphingomonas and having the ability to degrade female hormones.
[0013]
Further, the present invention provides a method for decomposing a female hormone substance, which comprises decomposing a female hormone substance using the above microorganism.
[0014]
Further, the present invention provides an apparatus for decomposing female sex hormones, comprising means for supporting the microorganisms and means for bringing the microorganisms into contact with wastewater or soil.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the female hormone substance to be subjected to the decomposition treatment is, for example, a natural or synthetic female hormone represented by the above formula (I). Among them, 17β-estradiol is a steroid hormone secreted from ovarian follicles and is a substance having the highest physiological activity. Its secretion is governed by pituitary follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone. It has been used as a drug for amenorrhea, menstrual cycle abnormalities, dysmenorrhea, uterine insufficiency, menopause and the like. Estrone is a kind of estrogen and is a metabolite of 17β-estradiol. It has strong estrogenic activity and is used as a female hormone agent for female sexual dysfunction, menopause and prostate cancer. Further, estriol is a metabolite of 17β-estradiol in vivo, which is produced via estrone and appears in urine. On the other hand, ethinyl estradiol is an artificial female hormone substance and is used as an estrogen agonist. It is less likely to be degraded in the liver than 17β-estradiol, and is more effective when administered orally than 17β-estradiol, and is orally administered to uterine insufficiency, amenorrhea, infertility, menopause, etc. Is also used.
[0016]
Microorganisms that decompose these female hormone substances (hereinafter simply referred to as "the microorganisms of the present invention") include, for example, a microorganism belonging to the genus Rhodococcus or Sphingomonas which is present in an activated sludge tank, It is obtained by screening using a substance.
[0017]
More specifically, the microorganism of the present invention can be obtained by subjecting activated sludge obtained from an activated sludge tank of a sewage treatment plant to multi-stage screening using a female hormone substance.
[0018]
That is, the microorganism of the present invention is obtained by culturing each activated sludge by a column integrated culture method using a female hormone substance as a substrate for a long period of time (about 10 weeks), screening microorganisms having the ability to degrade female hormone substance, It can be obtained by culturing using a hormonal substance as a substrate and screening microorganisms that exhibit a significantly higher resolution in numerical terms.
[0019]
The following procedure can be shown as a specific example of the screening of a microorganism having the ability to degrade a female hormone substance. First, a culture apparatus having a column, a substrate inlet, and an air inlet as shown in FIG. 1 is prepared. Activated sludge and, for example, an MDG medium (Modified DOMINIC &GRAHAM's medium) shown below are put into a column in this culture apparatus, and oxygen is introduced through an air inlet and 17β-estradiol, estrone, and estriol through a substrate inlet. , And a female hormone substance such as ethinyl estradiol is introduced, and the cells are batch-cultured at about 25 ° C. for about 10 weeks. During this culture, the number of viable cells and the pH are measured at regular intervals. After completion of the culture, the ISP medium, R ₂ A strain is selected and a bacterium is selected on an A medium, a YM medium, or the like, to obtain a microorganism having the ability to degrade a female hormone.
[0020]
Composition of MDG medium:
K ₂ HPO ₄ 3.5
KH ₂ PO ₄ 1.5
(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 0.5
NaCl 0.5
MgSO ₄ ・ 7H ₂ O 0.15
Yeast extract 0.005% (w / v)
Trace element ^* 1.0 (mL / L)
pH 7.0
The unit of the numerical value is g / L.
[0021]
* Trace element composition:
NaHCO ₃ ・ 10H ₂ O 2.0
MnSO ₄ ・ 4H ₂ O 0.3
ZnSO ₄ ・ 7H ₂ O 0.2
(NH ₄ ) Mo ₇ O ₂₄ ・ 4H ₂ O 0.02
CuSO ₄ ・ 5H ₂ O 0.1
CoCl ₂ ・ 6H ₂ O 0.5
CaCl ₂ ・ 2H ₂ O 0.05
FeSO ₄ ・ 7H ₂ O 0.5
The unit of the numerical value is g / L.
[0022]
Subsequently, the microorganisms selected by the above screening are cultured in, for example, a YM medium containing a female hormone substance, and the remaining amount of the female hormone substance in the medium after the culture is measured, whereby the resolution of the female hormone substance is high. Microbial screening can be performed. By repeating this screening a plurality of times, it is possible to obtain a microorganism having a higher resolution of the female hormone substance.
[0023]
The microorganism of the present invention thus obtained is capable of biologically degrading at least one female hormone substance such as 17β-estradiol, estrone, estriol or ethinylestradiol used in the screening. In a 1 L MDG medium supplemented with 100 ppm of 17β-estradiol ⁸ -10 ⁹ When about eighteen microorganisms of the present invention are cultured for 8 hours, they have the ability to degrade 17β-estradiol in the medium by 80% or more.
[0024]
As a result of the above screening, the activated sludge tank at the Fushimi Sewage Treatment Plant (Kyoto, Kyoto), the activated sludge tank at the Todoroki Water Treatment Center (Kawasaki, Kanagawa), the activated sludge tank at the Tamagawa Upstream Treatment Plant (Akishima, Tokyo), The following five strains were obtained as microorganisms capable of decomposing female hormone substances selected from microorganisms obtained from an activated sludge tank at Morigasaki Water Treatment Center (Ota-ku, Tokyo). The species of these microorganisms was identified using the 16S rDNA sequence of the microorganism as described in the literature (Carl R. Woese, Bacterial Evolution., Microbiological Reviews., 51: 221-271 (1987) and E. Stackebrand. Goebel, Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Presence Strategy, Agreement on Biotechnology, Pharmaceuticals and Pharmaceuticals. ) Was performed based on the molecular evolution phylogenetic analysis. Five strains of microorganisms were identified as follows by molecular evolutionary phylogenetic analysis.
[0025]
・ Rhodococcus zoffii D-I7
・ Sphingomonas sp. C-I2
・ Rhodococcus equi A-Y2
・ Rhodococcus equi D-Y4
・ Rhodococcus equi E-Y5
[0026]
Among these five strains, the DI7 strain and the CI2 strain were obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan; )) Was deposited on April 26 under accession numbers FERM P-18839 and FERM P-18838, respectively. On the other hand, A-2Y strain, DY4 strain and EY5 strain were not deposited at the above-mentioned Patent Organism Depository Center because they were refused accession due to taxonomic problems. If there is a request for a sale that satisfies the conditions of Article 27-3, the applicant will guarantee that the sale will be made at Yakult Honsha Co., Ltd. in accordance with the conditions of the same article.
[0027]
The microorganisms of the present invention, Rhodococcus equi, and Rhodococcus zoffii, which include Rhodococcus zoffii, are described in "Classification of Radioactive Bacteria," by The Japanese Society for Radiobiology. Secretariat, 187-188 (2001)), which are included in the Corynebacterium group, which is a High-GC gram-positive cocci. Until now, it was a group of the Rhodochrous complex grouped by showing intermediate properties between Mycobacterium sp. And Nocardia sp. It was redefined with the genus name proposed by Zopf in 1891 (Tsukamura, M.A. Further numerical taxonomic study of the rhodochrous group, Jpn. . The microorganisms of the present invention are aerobic and non-motile. In addition, it does not show acid resistance or is very weak. Furthermore, there are cells having a mycelial growth and cells having a pseudococcoid form, but none have aerial hyphae. Furthermore, mycelial or branched bacilli generally break cells after prolonged cultivation to form short bacilli or pseudococci. Furthermore, the optimal growth temperature is as wide as 20 ° C to 37 ° C. In addition, an orange to red colony is formed, and the surface thereof is both rough and smooth. In addition, cell wall peptidoglycans include A1γ-type, glycolyl type, arabinose and galactose. Furthermore, the main component of the respiratory chain quinone is MK-8 (H ₂ ). Furthermore, the content of 010 methyl fatty acid containing 10 Me-18: 0 in the linear-monounsaturated form is different depending on the species or strain. In addition, PE is detected as a phospholipid, and DPG, PG, PI, PIMs and some glycolipids are also found. Most of these species are derived from soil, but are widely distributed in animals and plants.
[0028]
Sphingomonas sp., Another microorganism of the present invention, is a gram-negative bacterium and is contained in α-proteobacteria (Proteobacteria α-subdivision) (translated by Riichi Sakazaki, “Gram-negative, aerobic”). And identification of facultative anaerobic bacilli ", Kindai Shuppan, 302-303 (1993)). In addition, there are many relatively long bacilli, including those with mobility. In addition, it produces an aerobic yellow insoluble pigment. Still further, glucose, xylose, lactose, sucrose, and maltose are usually used without growth on MacConkey agar. Furthermore, mannitol is unused and non-reducing to nitrates. In addition, it is a microorganism that is negative for lysine decarboxylase and negative for arginine dihydrolase.
[0029]
When the conditions suitable for these large-scale cultures of the microorganism of the present invention thus obtained were examined, the optimum culture temperature was 30 ° C., and the pH was generally 6.0 to 7.0. In addition, in order to examine the optimal medium, based on the ISP medium, the amount of the components was increased or decreased, and the following modified mediums 1 and 2 to which inorganic salts were added were used. investigated. As a result, among the above five strains, except for the C-I2 strain, they grew well in the modified medium 1, and it was revealed that the C-I2 strain was the lowest-nutrient microorganism.
[0030]
Composition of modified medium 1 (in 1 L of distilled water):
Yeast Extract 5g
Peptone 10g
Glucose 5g
KH ₂ PO ₄ 1g
K ₂ HPO ₄ 2g
MgSO ₄ ・ 7H ₂ O 0.5g
[0031]
Composition of modified medium 2 (in 1 L of distilled water):
Yeast Extract 2g
Malt Extract 10g
Dextrose 4g
[0032]
The microorganisms of the present invention described above can be used alone or in combination thereof to decompose female sex hormone substances in wastewater or soil. These microorganisms may be used as they are, for example, in the case of the activated sludge method, but it is preferable to use these microorganisms by attaching and growing them on a solid support from the viewpoint of decomposing the female hormone substance.
[0033]
When growing on a solid support, a method for immobilizing microorganisms includes a method for immobilizing microorganisms by covalent bonding, ionic bonding, hydrogen bonding, physical adsorption, etc. There is an entrapment immobilization method in which microorganisms are encapsulated in a polymer gel produced by polymerizing or associating a compound or changing a polymer compound from a soluble state to an insoluble state. good. However, the binding and immobilization method is preferable in terms of the ability to retain microorganisms, and porous cellulose, PVA, fine powdered activated carbon-coated granule polyvinyl alcohol carrier (ACP carrier: Miyoshi et al., Application of Decolorizing Bacteria ", Journal of the Japan Sewage Works Association, 39, 123-132 (2002)) and the like, and the use of ACP carriers is particularly preferred.
[0034]
For example, when the activated sludge method is used to decompose the female sex hormone substance in the wastewater, generally 10 l / l of the liquid to be treated is used. ⁸ From 10 ⁹ About 5 to 10 hours of aerobic culture treatment may be performed using about the present microorganism. When a method using a solid support is employed, the microorganism of the present invention on the solid support may be contacted with the liquid to be treated under aerobic culture conditions for about 5 to 10 hours.
[0035]
In decomposing the female sex hormone substance in the soil, for example, the microorganism of the present invention suspended as necessary in a buffer solution or physiological saline may be applied to the soil surface to be treated or excavated soil for 1 m. ³ 10 per ⁹ From 10 ¹⁰ You only need to spray about pieces.
[0036]
In order to efficiently decompose the female hormone substance using the microorganism of the present invention, a means for supporting the microorganism of the present invention for decomposing the female hormone substance using the microorganism of the present invention, and draining the microorganism into drainage or soil Use of a device having means for contacting the Specifically, bioreactors such as a complete mixing type, an air lift type, a column packed type, and a lag flow type can be used. Such a device can be used in the secondary treatment step during the biological oxidation treatment. In this case, a method of attaching and growing microorganisms on the surface of a solid support rather than suspending the microorganisms in wastewater is used. Is more preferred. This makes it possible to prevent the outflow of microorganisms from the bioreactor to the outside by attaching the microorganisms to the surface of the support, and to obtain a more concentrated bacterial solution. Can be decomposed well.
[0037]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0038]
Example 1
Microorganisms with the ability to degrade female hormones by continuous enrichment culture
screening:
A substrate inlet was provided on the upper part of a cylindrical column having a length of 50 cm × diameter of 8 cm, and an air inlet was provided on the lower part, and a tube was connected thereto. Then, a lid was provided with a rubber stopper to prepare a culture apparatus (FIG. 1). . The above-mentioned MDG medium and 20 mL of activated sludge collected from the locations shown in Table 1 were added to this culture apparatus. Then, a 0.1 mg / L aqueous solution of 17β-estradiol was blown in from the upper outlet at 60 to 100 mL / hour, and oxygen was blown from the lower outlet at 50 to 100 mL / min. In this state, batch culture was performed continuously for about 10 weeks, and the viable cell count and pH were examined for 0, 5, 24, and 72 hours, and thereafter every week. Culture was performed three times to confirm reproducibility. In all three times, the characteristic colonies were separated from the culture medium at the 10th week (only 9 weeks at the Todoroki Water Treatment Center) where the growth of the microorganism was confirmed, respectively, using the ISP separation medium and R ₂ Strains were selected and picked with the A separation medium and the YM medium. Table 1 shows the number of colonies obtained in each medium and the number of strains picked therefrom.
[0039]
[Table 1]

[0040]
As shown in the results, a total of 56 strains, 14 from the Fushimi Sewage Treatment Plant, 10 from the Todoroki Water Treatment Center, 16 from the Tamagawa Upstream Treatment Plant, and 16 from the Morigasaki Treatment Center, were obtained by continuous enrichment culture. A strain of female sex hormone-degrading microorganisms was obtained.
[0041]
Example 2
Screening for microorganisms with high resolution of female hormones:
(1) Primary screening
The 56 microorganisms obtained in Example 1 were cultured in the following manner using a medium using 17β-estradiol as a substrate, and strains having a high growth rate were selected. First, 17β-estradiol was dissolved in a DMSO solution and sterilized by filtration using a 0.22 μm membrane filter. This solution was added to the MDG medium so that the 17β-estradiol concentration became 100 ppm.
[0042]
Each of the microorganisms obtained in Example 1 stored at 25 ° C. was drawn and inoculated on a YM plate medium, and then liquid paraffin was overlaid and streaked. After 3 to 10 days, the platinum loop was scraped off and inoculated into a test tube containing the medium prepared above. The inoculated test tube was shaken vigorously at 25 ° C. and cultured for 10 days. Using the test tube containing the uninoculated substrate as a control, the turbidity of the substrate in the inoculated test tube was observed. The determination of the degree of microbial growth was made according to the following criteria. The results are shown in Tables 2 and 3.
[0043]
<Judgment criteria>
-: Exactly the same as the control.
+: Some turbidity was observed compared to the control, and there was bacterial growth
is expected.
++: apparently turbid compared to control, vigorous bacterial growth
Guessed.
[0044]
[Table 2]

[0045]
[Table 3]

[0046]
As a result of the primary screening, 25 or more out of 56 strains obtained a judgment of + or more.
[0047]
(2) Secondary screening
For the 25 microorganisms selected in the primary screening, bacterial strains were selected by the following method. First, 25 strains showing growth of + or more in the primary screening were streaked on a YM plate medium and cultured in the same manner as in the primary screening. Ten days later, the whole amount of the grown medium was subjected to solid-phase extraction using a C18 solid-phase column (manufactured by Waters), 10 μL of the extract was spotted on a thin-layer chromatograph, and a benzene-methanol (9: 1) mixed solution was used as a developing solvent. When developed, a decrease in 17β-estradiol was confirmed. As a result, 9 strains which effectively decompose 17β-estradiol were selected.
[0048]
(3) Tertiary screening
Among the nine microorganisms selected in the secondary screening, strains that strongly degrade 17β-estradiol were selected, and the resolution of other female hormone substances (estrone, estriol, ethinylestradiol) was examined. Materials and methods followed the following procedure. First, female hormone substances (17β-estradiol, estrone, estriol, ethinylestradiol) were each dissolved in a DMSO solution, and sterilized by filtration using a 0.22 μm membrane filter. It was adjusted to 100 ppm and used as a culture medium.
[0049]
The culture medium was placed in a test tube, and the microorganism was inoculated in the same manner as in the secondary screening, and then cultured for a predetermined time. Five, eight and twenty-four hours after the start of the culture, the concentrations of the female hormone substances were measured, and the decrease was confirmed. The measurement of the amount of the female hormone substance was carried out by keeping the whole amount of the culture medium after culturing on a C18 solid phase column (manufactured by Waters), and then eluting with methyl acetate for analysis. More specifically, the analysis was performed as follows. That is, first, an appropriate amount of the eluate was collected, and a surrogate substance (17β-estradiol-d4) was added thereto. Then, after drying to dryness with a nitrogen stream, a TMS compound is induced with N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA), dried again, dissolved in n-hexane, and the test solution is described below. It was analyzed by gas chromatography under the conditions.
[0050]
<Measurement conditions for gas chromatography>
Gas chromatograph: GC-17A (manufactured by Shimadzu Corporation)
Capillary column: HP-1 (Hewlett Packard Co., Ltd.)
(15 m × 0.25 mm; df = 0.25 μm) Column temperature: 150 ° C. → (20 ° C./min)→210° C. →
(10 ° C / min) → 300 ° C Carrier gas: helium
Injector: splitless T = 250 ° C
Detector: FID ・ T = 300 ℃
Sample injection volume: 1 μL
Analysis time: 20 minutes
[0051]
As a result of the tertiary screening, 5 strains (AY2 strain, EY5 strain, DY4 strain, DI7 strain, CI12 strain) were selected as microorganisms that decompose 17β-estradiol by 80% or more in 8 hours. . The change over time of the remaining amount due to the decomposition of 17β-estradiol, estrone, estriol, and ethinylestradiol by the selected microorganism is shown in FIGS. 2 to 5.
[0052]
Example 3
Identification of microorganisms capable of degrading female hormones:
Regarding five strains (hereinafter referred to as “female hormone substance-degrading bacteria”) having the ability to degrade female hormone substances (hereinafter referred to as “female hormone substance-degrading bacteria”) (AY2 strain, EY5 strain, DY4 strain, DI17 strain, CI12 strain) Bacterial species identification using the 16S rDNA sequence was performed according to the following procedure, and a phylogenetic tree using the 16S rDNA sequence was prepared (FIGS. 6 and 7).
[0053]
(1) DNA extraction from cells
DNA was extracted from each of the purely cultured cells of the above five strains using the benzyl chloride method shown below. That is, the cells were cultured at 30 ° C. for 3 days using a YM slant agar medium. After the culture, 250 μL of a DNA extraction buffer (a mixture of 100 mM Tris-HCL and 40 mM EDTA: pH 9.0), 200 μL of benzyl chloride and 50 μL of 10% SDS were added to the collected cells, and the mixture was added at 50 ° C. Shake vigorously for 30 minutes. After 150 mL of 3M sodium acetate was added, the mixture was centrifuged, the supernatant was transferred to another tube, isopropanol precipitation, 70% ethanol washing were performed in this order, and the resultant was air-dried, and then 100 μL of TE buffer (10 mM Tris-HCl ( (pH 8.0), 1 mM EDTA) to obtain DNA of each cell.
[0054]
(2) 16S rDNA amplification PCR reaction
The following two primers were used as amplification primers.
8F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '
15R: 5'-AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3 '
10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 200 μL of dNTPmixture, 1 U Taq of DNA polymerase (manufactured by Takara), 50 ng of bacterial DNA and 0.4 μM of each of amplification primers 8F and 15R (50 μL in total) were subjected to DNA thermal cycler PTC200 (manufactured by MJ Research). ), A PCR reaction was performed. This PCR reaction was performed at 94 ° C. for 20 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 180 seconds for 25 cycles. After the PCR reaction, the obtained amplification product was purified using Microcon-PCR (manufactured by Millipore).
[0055]
(3) Determination of 16S rDNA sequence
Decoding of the 16S rDNA base sequence was carried out using ABI PRISM 373A sequencer (ABI) with ABI PRISM Dye Terminator Kit (Perkin Elmer). The primers used are shown below. AutoAssembler (Perkin Elmer) was used for sequence alignment.
8F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '
520F: 5'-CAGGAGTGCCAGCAGCCGCGGG-3 '
930F: 5′-CAAGCGGTGGAGCATGTGG-3 ′
1100F: 5'-CAGGAGCAACGAGCCGCAACCC-3 '
520R: 5'-ACCGCGGCTGCTGGCC-3 '
800R: 5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3 '
1100R: 5'-AGGGTTGCGCCTCGTTQ-3 '
15R: 5'-AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3 '
[0056]
(4) Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence
Using the obtained 16S rDNA sequence and the 16S rDNA base sequence of a closely related bacterium obtained from a gene database such as DDBJ, molecular evolution phylogenetic analysis was performed using phylogenetic analysis software (Clustul X) (FIG. 6). As a result, the AY2 strain, the E-Y5 strain, and the D-Y4 strain were strains belonging to Rhodococcus equi, and the D-I7 strain was a strain corresponding to Rhodococcus zoffii and C- strain. It was identified as I2 strain Sphingomonas sp.
[0057]
Example 4
Wastewater treatment using microorganisms capable of degrading female hormones:
Five female sex hormone-degrading bacteria (AY2, EY5, DY4, DI17, CI12) were immobilized on a carrier, and the wastewater was treated.
[0058]
(1) Preparation of immobilized carrier
Using three types of carriers, porous cellulose, polyvinyl alcohol (PVA), and fine powdered activated carbon-coated granule polyvinyl alcohol (ACP), the female hormone-degrading bacteria were immobilized by the binding immobilization method according to the following procedure. First, the cells of the female hormone-degrading bacteria to be immobilized were cultured in large quantities using a jar fermenter. In this culture, 500 mL of the culture solution in the logarithmic growth phase was placed in a sterilized flask, and then 100 g of each of the three types of carriers shown in Table 4 was added to the flask and mixed well to prepare an immobilized carrier.
[0059]
(2) Evaluation of the ability of the immobilized carrier to retain microorganisms
The cells were eluted from the immobilized carrier prepared in the above (1) by the following procedure, and the viable cell count was measured to evaluate the ability to retain microorganisms. First, several immobilized carriers were ground and weighed at 10 g. This immobilized carrier is placed in 10 mL of physiological saline (containing 0.1% Triton X-100) in a glass test tube, sonicated for 10 minutes and sufficiently mixed, and then sonicated again for 10 minutes. Did. The solution thus obtained was used as an eluate for viable cell count measurement. The viable cell count of the eluate was counted by a dilution plate method using a CGY medium. The number of viable bacteria in the carrier was measured by collecting a part of the immobilized carrier immersed in the flask 24 hours and 72 hours after the preparation of the carrier. Table 4 shows the results. As a result, it was shown that the ACP carrier has a high ability to retain microorganisms.
[0060]
[Table 4]

[0061]
(3) Effectiveness test by batch aeration method
Each of the five strains of female hormone substance-degrading bacteria was immobilized on an ACP carrier in the same procedure as in (1), and an efficacy test was performed on synthetic sewage to which a female hormone substance was added. Specifically, five female sex hormone-degrading bacteria were cultured in large amounts in a jar fermenter, and the resulting culture was autoclaved at 105 ° C. for 10 minutes, and then washed with sterilized water on an ACP carrier (500 mL of culture solution). (ACP carrier having a dry weight of 50 g) was immersed for 24 hours to be immobilized. Synthetic sewage was prepared according to the method described in the literature (Sho Hashimoto, "Highly-functional activated sludge method utilizing biotechnology", Gihodo Shuppan, 267-268 (1989)). Regarding the concentration of female sex hormones in sewage, according to a fact-finding survey at a wastewater treatment plant in Tokyo in 2000, the concentration of 17β-estradiol during inflow sewage and treatment was 0.017 to 0.068 μg / L, and the concentration of estrone was It is reported to be 0.014 to 0.14 µg / L (Tokyo Metropolitan Sewer Bureau report, “Results of 2000 Survey of Endocrine Disrupting Chemicals in Sewers”). This effective test was carried out by adding 17β-estradiol to the prepared synthetic sewage so as to be 0.1 μg / L and estrone to be 0.2 μg / L.
[0062]
Composition of synthetic sewage (in 1 L of distilled water):
Peptone 150mg
Meat Extract 100mg
Urea 25mg
7.5 mg of NaCl
3.5mg of KCl
CaCl ₂ 3.5mg
MgSO ₄ 2.5mg
K ₂ HPO ₄ 267mg
KH ₂ PO ₄ 33mg
[0063]
The effectiveness test was performed by a batch aeration method using a batch aeration apparatus shown in FIG. That is, about 2 L of synthetic sewage was put into a batch type aeration apparatus, about 100 g of an ACP carrier on which each female hormone-decomposing bacterium was immobilized was put, and 0.1 to 2 VVM air was sent from an air inlet, and a stirring blade was used. And the mixture was stirred at a low speed so that the carrier did not precipitate. Table 5 shows the concentrations and decomposition rates of 17β-estradiol and estrone 8 hours after the start of aeration. Each of the microorganisms immobilized on the ACP carrier showed an ability to degrade 17β-estradiol by 80% or more in 8 hours.
[0064]
[Table 5]

[0065]
【The invention's effect】
The microorganism of the present invention is a microorganism capable of degrading a female hormone substance such as 17β-estradiol, estrone, estriol or ethinylestradiol.
[0066]
Therefore, the method and apparatus for decomposing female sex hormones using microorganisms of the present invention can decompose female sex hormones in wastewater and soil contaminated with female sex hormones, and improve the environment.
[0067]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a drawing showing an apparatus used for continuous enrichment culture.
FIG. 2 is a drawing showing changes over time of 17β-estradiol.
FIG. 3 is a drawing showing changes over time of estrone.
FIG. 4 is a drawing showing a change over time of estriol.
FIG. 5 is a drawing showing changes over time of ethinylestradiol.
FIG. 6 is a diagram showing a molecular evolution phylogenetic analysis of a microorganism of the genus (Rhodococcus) of the present invention.
FIG. 7 is a drawing showing the molecular evolution phylogenetic analysis of the microorganism of the present invention (genus Sphingomonas).
FIG. 8 is a drawing showing an apparatus used for batch aeration culture.
[Explanation of symbols]
1…… Culture device
2…… Column
3…… Substrate inlet
4…… Air inlet
5…… Batch aeration device
6 ... ACP carrier
7 ... Synthetic sewage
8…… stirring blade
9…… Air inlet
that's all

Claims (8)

A microorganism belonging to the genus Rhodococcus or the genus Sphingomonas and having the ability to degrade female hormones. The microorganism according to claim 1, wherein the female hormone substance is 17β-estradiol, estrone, estriol, or ethinylestradiol. The microorganism according to claim 1 or 2, wherein the microorganism is selected from Rhodococcus equi, Rhodococcus zofii, and Sphingomonas sph. Rhodococcus equi. A-Y2, Rhodococcus equi. D-Y4, Rhodococcus equi. E-Y5, Rhodococcus zofii D.I.7 (FERM P.18839) or Sphingomonas sp. Item 4. The microorganism according to any one of Items 1 to 3. A method for decomposing a female hormone substance, which comprises decomposing a female hormone substance using the microorganism according to any one of claims 1 to 4. 6. The method for decomposing a female hormone substance according to claim 5, wherein the method decomposes a female hormone substance in wastewater or soil. 7. The method for decomposing a female hormone substance according to claim 5 or 6, wherein the microorganism is grown on the surface of the solid support. An apparatus for decomposing female sex hormones, comprising: means for carrying the microorganism belonging to the genus Rhodococcus or Sphingomonas according to any one of claims 1 to 4, and means for bringing the microorganism into contact with wastewater or soil.

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