JP2004057152A

JP2004057152A - Recombinant myosin

Info

Publication number: JP2004057152A
Application number: JP2002223707A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Kohama; 小濱　一弘; Akio Nakamura; 中村　彰男; Hozumi Kawamichi; 川道　穂津美; Hideyuki Tanaka; 田中　秀幸
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2022-07-31
Also published as: JP4367825B2; WO2004011649A1; AU2003254788A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a Ca<SP>2+</SP>-bond recombinant myosin. <P>SOLUTION: The recombinant myosin is an expression product of a polynucleotide encoding each of the heavy chain of a Ca<SP>2+</SP>-bond myosin, a Ca<SP>2+</SP>-bond light chain and a phosphorylated light chain and has a function essentially same as the function of a wild-type Ca<SP>2+</SP>-bond myosin. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、Ｃａ^２＋結合型の組換えミオシンに関するものである。さらに詳しくは、この出願は、マイクロマシンにおけるアクチュエーターや、微少電子回路におけるスイッチ素子等としての有用性が期待されるＣａ^２＋結合型組換えミオシンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年のナノテクノロジーの発展に伴って、分子サイズの大きさで機械的な動きをするマイクロマシンの開発が注目されている。このマイクロマシンの作成には、個々の要素デバイスや、それらの組立方法（マイクロマシニング）に至るまで、様々な技術開発が必要とされている。特に、マイクロマシン駆動部であるマイクロアクチュエーターの開発は、マシンの自律運動等にとって不可欠であり、様々な微細加工技術を利用したモーターデバイスの開発が進められている。しかしながら微細加工技術を応用した方法で作成できるマイクロアクチュエーターは、小さいものでも１００μｍ程度であり、ナノスケールのマイクロマシンに装備するには、その更なる微少化が求められている。
【０００３】
そこで、微細加工技術によってモーター装置を構築するのではなく、運動能を有する単一分子をモーターとして利用することが提案されている。
【０００４】
一般に、モーターとして利用できる分子は、外部エネルギーを運動に変換する動力機構があること、および１方向の運動を実現できることの２点を満たすことが求められている。そして、このような条件を満たす低分子有機化合物としては、（３Ｒ，３’Ｒ）−（Ｐ，Ｐ）−ｔｒａｎｓ−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−３，３’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４，４’−ｂｉｐｈｅａｎｔｈｒｙｄｉｅｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ　４０１：１５２−１５５，　１９９９）やＴｒｉｐｔｙｃｙｌ（４）ｈｅｌｉｃｅｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ　４０１：１５０−１５２，　１９９９）が知られている。しかしながら、これらの有機化合物は、速度が極めて低速であったり、駆動力が極力であったり、繰り返し回転ができないなどといった、マイクロマシンにおけるアクチュエーターとしての致命的な欠陥を有しており、実用化の目途は立っていないのが現状である。
【０００５】
一方、前記のような有機化合物とは別の単一分子モーターとしては、鞭毛モーター（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６：１−１８，　１９６７；　Ｎａｔｕｒｅ　２４５：３８０−３８２，　１９７３）、ＡＴＰ合成酵素（Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２９９−３０２，　１９９７）、ミオシンモーター（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　１９９：１０５７−１０６３，　１９９４；　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　７：　８９−９３，　１９９５）、微小管系モーター（Ｃｅｌｌ　４２：３９−５０，　１９８５）、核酸合成酵素の運動タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ　４０９：　１１３−１１９，　２００１）等の生体分子が知られている。
【０００６】
これらの生体分子も、もちろんマイクロマシンのアクチュエーター等に利用するためには、様々な技術開発を必要とするが、その安定的な駆動力等によって、将来のマイクロマシンにおける極めて有力なデバイスとなり得るものと期待されている。また、これらの生体分子は、電子回路のスイッチ素子等としても利用可能であることが提案されている。
【０００７】
これらの生体分子モーターの候補のうち、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）は分子量約４８０ｋＤａの筋タンパク質であり、分子量約２２０ｋＤａのミオシン重鎖２本と、それぞれ２本ずつの２種のミオシン軽鎖で構成されている。ミオシン重鎖のＮ末端側はヘビーメロミオシン（ＨＭＭ）と呼ばれる機能的部位であり、ＡＴＰの分解によりアクチンとの間に「力」を発生するモータータンパク質として機能する。
【０００８】
ミオシンの制御には、（ａ）骨格筋ミオシンのように外部制御を受けないタイプと、（ｂ）平滑筋や細胞性粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍミオシンのようにリン酸化によって制御を受けるタイプ、そして（ｃ）真性粘菌Ｐｈｙｓａｒｕｍ（フィザルム）やホタテガイ（ｓｃａｌｌｏｐ）のミオシンのようにカルシウム（Ｃａ^２＋）を結合することによって制御を受けるタイプが存在する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、マイクロマシンのアクチュエーター（分子モーター）や電子回路のスイッチ素子としての生体分子の有用性が指摘されている。そしてそれぞれの生体分子は、個々の特性（回転、駆動メカニズムの違い等）によって、様々な適用や組み合わせが可能である。
【００１０】
一方、これらの生体分子をアクチュエーターやスイッチ素子等の機械的構成要素として使用するためには、他のデバイスとの機械的、電気的結合を可能とするような様々な改変（各種の修飾）が必要である。そして、そのような改変を確実に行うための最も有効な手段は、遺伝子工学的に生体分子を改変することである。
【００１１】
この点について、ミオシンの場合には、前記のタイプ（ａ）および（ｂ）については組換えミオシンの作成が報告されている（例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９２：７０４−７０８，　１９９５；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：６５６−６５８，　１９８９）。しかしながら、タイプ（ｃ）のＣａ^２＋結合型ミオシンについては、組換え体の作成は成功していない。
【００１２】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、Ｃａ^２＋結合型の組換えミオシンを提供することを課題としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、Ｃａ^２＋結合型ミオシンの重鎖、Ｃａ^２＋結合軽鎖、およびリン酸化軽鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現産物であって、野性型のＣａ^２＋結合型ミオシンと実質的に同一の機能を有することを特徴とする組換えミオシンを提供する。
【００１４】
この発明における別の態様は、ミオシン重鎖、Ｃａ^２＋結合軽鎖および／またはリン酸化軽鎖のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換、１以上のアミノ酸残基が欠失、または１以上のアミノ酸残基が付加している組換えミオシンである。
【００１５】
また、この発明の組換えミオシンにおいては、各々のポリヌクレオチドが、真性粘菌フィザルム由来であることを好ましい態様としている。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明の組換えミオシンは、Ｃａ^２＋結合型ミオシンの重鎖（約２２０ｋＤａ）、Ｃａ^２＋結合軽鎖（約１６ｋＤａ）、およびリン酸化軽鎖（約１８ｋＤａ）のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現産物である。
【００１７】
「Ｃａ^２＋結合型ミオシン」とは、Ｃａ^２＋を結合することによって制御を受けるミオシンであり、具体的には、例えば真性粘菌Ｐｈｙｓａｒｕｍ（フィザルム）やホタテガイ（ｓｃａｌｌｏｐ）のミオシンである。また、「野性型のＣａ^２＋結合型ミオシンと実質的に同一の機能を有する」とは、具体的には、ミオシンがＡＴＰを分解し、アクチンと結合して機械的エネルギーを発生することにＣａ^２＋が変化を与えることを意味する。ただし、フィザルム由来の組換えミオシンは、Ｃａ^２＋結合によってＡＴＰ分解および機械的エネルギーの発生を低下し、ホタテガイ由来の組換えミオシンはＣａ^２＋結合によってＡＴＰ分解および機械的エネルギーの発生を増加せせることを意味する。
【００１８】
この発明の組換えミオシンは、前記のポリヌクレオチドをｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系または適当な宿主―ベクター系において発現させることによって作成することができる。
【００１９】
例えば、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）は公知の塩基配列情報（例えば、フィザルムのミオシン重鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＦ３３５５００、Ｃａ^２＋結合軽鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　Ｊ０３４９９、リン酸化軽鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＢ０７６７０５；ホタテガイのミオシン重鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　Ｘ５５７１４、軽鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　Ｍ１７２０８，　Ｍ１７２０１）に基づき合成したオリゴヌクレオチドを用いてそれぞれのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。また公知の塩基配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法によっても、目的とするポリヌクレオチドを取得することができる。
【００２０】
得られたポリヌクレオチドは、それぞれ別個に発現ベクターにクローニングし、それらを共発現させることによって、この発明の組換えミオシンを作成することができる。あるいは、それぞれのポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドとして発現ベクターにクローニングしてもよい。ただし、その場合には、重鎖、Ｃａ^２＋結合軽鎖およびリン酸化軽鎖がそれぞれ成熟タンパク質として発現するように、各ポリヌクレオチドの３’端には停止コドンを設けるようにする。また、各ポリヌクレオチドの５’端にはそれぞれの発現制御配列（プロモーター／エンハンサー）を備えるようにしてもよい。
【００２１】
この発明の組換えミオシンをｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換え、この組換えベクターをプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
【００２２】
また、ポリヌクレオチドを適当な宿主−ベクター系において発現させれば、組換えミオシンを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などで生産することができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的の組換えミオシンを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、組換えミオシンを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドをプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターをトランスフェクトした真核細胞から目的の組換えミオシンを得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。また、バキュロウイルス科に属する核多角体病ウイルスのゲノムＤＮＡとともに前記の発現ベクターを昆虫細胞にトランスフェクションすれば、昆虫細胞から目的の組換えミオシンを得ることができる。昆虫細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５などを使用することができる。
【００２３】
発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２４】
この発明の別の態様は、ミオシン重鎖、Ｃａ^２＋結合軽鎖および／またはリン酸化軽鎖のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換、１以上のアミノ酸残基が欠失、または１以上のアミノ酸残基が付加している改変型の組換えミオシンである。
【００２５】
この場合の「改変型」とは、前記のアミノ酸配列の変異によって、組換えミオシンの活性（例えば、Ｃａ２＋結合能、ＡＴＰ分解能、機械的エネルギー発生能など）が増加または低下することを意味する。あるいはまた、他の分子や化合物等との結合性を増加または低下させるようなアミン酸変異を意味する。
【００２６】
このようなアミン酸変異は、公知の方法により前記のポリヌクレオチドに変異を導入し、その変異ポリヌクレオチドを前記と同様に発現させることによって行うことができる。例えば、任意のアミノ酸コドンを他のアミノ酸残コドンに置換したポリヌクレオチドを作成する場合には、公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，　Ｔ．　Ａ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：４８８，　１９８５およびＫｕｎｋｅｌ，　Ｔ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５４：３６７，　１９８７）を採用することができる。すなわち、ｄｕｔ⁻、ｕｎｇ⁻の遺伝型で示される大腸菌（ＢＷ３１３、ＣＪ２３６等）は、ｄＵＴＰａｓｅ（Ｄｕｔ）とＵｒａｃｉｌ−ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（Ｕｎｇ）を欠損しているため、ＤＮＡ中のチアミン（Ｔ）の一部がデオキシウラシル（ｄＵ）に置き換わったＤＮＡを合成する。この大腸菌を宿主菌として、変異導入の目標となるポリヌクレオチドに対して、目的残基を他のアミノ酸残基で置換するように設計したオリゴヌクレオチドを試験管内でハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ反応とＤＮＡリガーゼ反応により相補ＤＮＡ鎖を合成する。このＤＮＡをｕｎｇ^＋の大腸菌株（ＤＨ５α等）に導入すると、もとのｄＵの含まれているＤＮＡ鎖はＵｎｇによって分解を受けるが、試験管内で合成された相補ＤＮＡ鎖は分解されずに複製される。このようにして変異を導入した側のＤＮＡ鎖が選択的に増幅され、目的変異を含むミオシンをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。また、変異ポリヌクレオチドは、ミューテーション・キット等を使用する方法や、変異導入型のＰＣＲ法、あるいは公知のポリヌクレオチド合成法（例えば、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ．　２５：３４４０−３４４４，　１９９７等）によっても得ることができる。
【００２７】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
（１）材料と方法
（１−１）化学物質
制限酵素およびその他酵素類は、宝酒造株式会社（京都）のものを使用した。その他の試薬類は全て、市販の特級試薬を用いた。水溶液作成時には、ミリＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。
（１−２）バキュロウイルス導入ベクターの構築
フィザルム由来ミオシン重鎖のサブフラグメント−１重鎖（Ｓ１−ＨＣ；Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ８４１）をコードするｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法（ＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；東洋紡株式会社、東京）により合成した。ＰＣＲプライマーは、既知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＦ３３５５００）を基に設計した以下を使用した。
【００２９】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１）
５’−ＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列番号２）
ＰＣＲ条件は、変性（９４℃１分）、アニーリング（５５℃１分）、伸長（７２℃３分）を１サイクルとし、３５サイクルを行った。
【００３０】
また、組換えミオシンを発現させるために、ヘキサＨｉｓ−タグの配列をＣ末端にＰＣＲによって付した。Ｓ１−ＨＣの終末端の以下のプライマー：
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ−３’（配列番号３）
には、ヘキサＨｉｓタグ配列、停止コドンおよびＳａｌＩ制限サイトを含ませた。
ネストＰＣＲは以下のプライマーを用いて行った。
【００３１】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号４）
以上のより得られたＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。得られたこのプラスミドをｐＢＢ／Ｓ１とした。
【００３２】
ミオシン重鎖のヘビーメロミオシン（ＨＭＭ）重鎖（Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ１１８１）の導入ベクターも上記と同様な方法で構築した。ミオシン重鎖の一部分であるコイルドコイル構造領域をＰＣＲにてＳ１−ＨＣのＣ末端に付与した。ＳｍａＩ制限サイト（ミオシン重鎖の２０４４ｂｐ）を有するプライマー：
５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号５）と、
終末端にＨＭＭ断片（Ｌｙｓ１１８１）を含んだプライマー：
５’−ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号６）
を用いた。ヘキサＨｉｓタグ配列を付与するには、プライマー：
５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号７）と、
ヘキサＨｉｓタグ配列、停止コドン、ＳａｌＩ制限サイトを含んだプライマー：
５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣ−３’（配列番号８）
を用いて、ネストＰＣＲを行った。
【００３３】
得られたＰＣＲ産物は、ｐＢＢ／Ｓ１プラスミドのＳｍａＩ／ＳａｌＩにクローニングし、プラスミドをｐＢＢ／ＨＭＭを構築した。
【００３４】
さらに、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用い、Ｃａ２＋結合軽鎖（ＣａＬＣ）とリン酸化軽鎖（ＰＬＣ）のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの導入ベクターを構築した。なお、ＰＬＣおよびＣａＬＣの５’端にはＢａｍＨＩまたはＫｐｎＩ制限酵素サイトをに付与した。また、ＰＬＣおよびＣａＬＣの３’端にはＫｐｎＩまたはＥｃｏＲＩサイトを付与した。得られたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ａ　のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩおよびＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ制限サイトに各々サブクローニングし、プラスミドｐＢＢ／ＰＬＣおよびｐＢＢ／ＣａＬＣを構築した。
（１−３）組換えウイルスの感染および選択
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ−９）細胞を７５ｃｍ^２のフラスコで、２７℃で培養した。培養液（ＴＮＭ−ＦＨ）は、Ｇｒａｃｅ’ｓ昆虫細胞培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）および１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ）を加えた。Ｓｆ−９細胞に、核多角病ウイルスＡｕｔｏ−ｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの直鎖状ＤＮＡ（Ｂａｃ−Ｍ−Ｂｌｕｅ^ＴＭ　ＤＮＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、導入ベクターｐＢＢ／Ｓ１、ｐＢＢ／ＨＭＭ、ｐＢＢ／ＰＬＣおよびｐＢＢ／ＣａＬＣのいずれか一つとを感染導入した。感染導入の効率を高めるため、ＩｎｓｅｃｔｉｎＰｌｕｓ^ＴＭリポソーム試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。７日後、Ｘ−ｇａｌ含有プレート上でプラークアッセイを行い、組換えバキュロウイルスを単離した。青いプラークを拾い上げ、Ｓｆ−９細胞（２５ｃｍ^２の培養容器）に感染させ、組換えバキュロウイルスを増幅させた。４日後、上清中にある組換えバキュロウイルスを前記の７５ｃｍ^２フラスコで１１日間培養したＳｆ−９細胞に感染させ、高いウイルス力価を有するストックを調製した。組換えバキュロウイルスに組込んだ各種の導入ｃＤＮＡは、ＰＣＲにて確認し、続いて塩基配列解析機においても確認した。得られたこの組換えバキュロウイルスを、再び上記の方法によって増殖させた。
（１−４）組換えＳ１およびＨＭＭの精製
７２ｃｍ^２の培養容器（１０個）のそれぞれに、１×１０^７個のＳｆ−９細胞を播種した。Ｓｆ−９細胞に、Ｓ１−重鎖またはＨＭＭ−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ^２＋結合軽鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを導入したバキュロウイルスを各々個別に共感染させた。いずれの場合においても、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）は５であった。感染させたＳｆ−９細胞は、２７℃で３日間成長させた後、４℃で１０分、１５００ｒｐｍの速度で遠心し、細胞を回収した。回収した細胞はペレット状のため、７ｍｌホモゲナイズ緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、タンパク質分解酵素阻害因子１ｍＭ　ｐ−ＡＢＳＦ（和光純薬化学工業株式会社）、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよびＨｉｓタグタンパク質分解酵素阻害因子混合液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ）］で懸濁し、均質化した。均質化の後、内在性アクチンから組換えミオシンを放出するため０．２Ｍ　ＮａＣｌと１ｍＭ　ＡＴＰに合わせて調節し、細胞の破片や破砕されていない細胞を取り除くたに１５０００×ｇで１５分、遠心分離を行った。上清を０．２ｍｇ／ｍｌウサギ骨格筋アクチン（ウサギ骨格筋アセトン粉から精製）と混合し、緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．３ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ｐ−ＡＢＳＦおよび１μｇ／ｍｌロイペプチン）で、２４時間透析を行った。アクチン組換えＨＭＭは透析中に形成され沈殿し、１０００００×ｇで１時間、遠心分離を行い回収した。沈殿物より分離されたＳ１／ＨＭＭの沈殿物を、緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００μＭ　ｐ−ＡＢＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍＭ　ＡＴＰ］を用いてホゲナイズし、１０００００×ｇで９０分間遠心分離を行い、得られた上清をＮｉ−ＮＴＡスパーフロー（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）カラムに添加した。このカラム内でＨｉｓタグ融合組換えＳ１またはＨＭＭをトラップし、抽出液［２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、４０ｍＭ　ＫＣｌ、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１００ｍＭ　イミダゾール］で抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、組換えＳ１／ＨＭＭを含む泳動バンド部分を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）を用いて蓄積および濃縮した。次いで、組換えミオシンを緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、４０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、２０μＭ　ｐ−ＡＢＳＦおよび０．６μｇ／ｍｌロイペプチン］で透析した。タンパク質の精製は４℃以下の温度条件で行った。典型的な組換えＳ１／ＨＭＭを０．１ｍｇを採取し、ＢＳＡを標準値として用いてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質測定液で定量した結果、１×１０^８個のＳｆ−９細胞が得られた。
（１−５）ゲル電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、文献（Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　６４：１４７−１５５，　１９７２）の記載に従い、文献（Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５，　１９７０）記載の緩衝液システムを用いて調製した１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。ＳＤＳ−サンプル緩衝液は、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　６．８）、５０ｍＭ　ＤＴＴ、１％　ＳＤＳ、７．５％グリセロール、０．００２％　ブロモフェノールブルーにて構成した。
（１−６）電子顕微鏡による観察
精製したＨＭＭ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を雲母シートに載置し、これを３０％グリセロール含有０．１Ｍ酢酸アンモニウムで３回洗浄し、２％酢酸ウラニル水溶液で染色し、３回洗浄した。この雲母シートに別の分割した雲母シートを被覆し、押し付け、剥離して、ＢＡＦ　０６０ロータリー影像システムにおいて低角度でプラチナにロータリー複製し、この複製した試料を試料台固定し、ＪＥＭ−１０１０電子顕微鏡で観察した。
（１−７）ＡＴＰａｓｅ活性による解析
Ｓ１／ＨＭＭにおけるＡＴＰａｓｅ活性測定は、文献（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２９３：２１２−２１５，　２００１）の記載に従って行った。全ての解析は、２５℃で行った。基本的なＭｇ^２＋−ＡＴＰａｓｅ活性は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、ウサギ骨格筋由来の重合型アクチンおよび０．５μＭ組換えＳ１／ＨＭＭで解析を行った。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。
（１−８）Ｃａ^２＋結合の測定
Ｃａ^２＋の結合範囲は、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３９：３８２７−３８３４，　２０００）の記載に従い、３．５μＭ　ＨＭＭ、５０μＭの組換えＣａ^２＋軽鎖または５０μＭの組換えリン酸化軽鎖の存在下で、ＣａＣｌ_２（Ｄｕ−Ｐｏｎｔ−ＮＥＮ）を含む０．１ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２およびＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を用いた流動透析法を利用して２５℃下で測定した。リン酸化軽鎖またはＣａ^２＋軽鎖それぞれのＯＲＦの５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３’末端にＢａｍＨＩサイトをＰＣＲによって付与した。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで酵素処理をして、ｐＥＴ１９ｂ発現ベクターシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ＵＳＡ）の同じサイトに挿入した。メーカーの説明書に従い、ｐＥＴ１９ｂ／ＰＬＣまたはｐＥＴ１９ｂ／ＣａＬＣを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にて発現および精製した。全てのデータは、Ａｄｉａｒの式に適合させることによって分析した。
（１−９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおける運動力の解析
Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおける運動力の解析は、文献（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１０６：９５５−９５７，　１９８９）の記載に従って行った。すなわち、ガラス表面に組換えＨＭＭをコーティングした。重合型アクチン（０．１２５ｍｇ／ｍｌ）をローダミンファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ、ＵＳＡ）でラベルし、運動解析用培地［１０ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ　イミダゾール（ｐＨ　７．５）、１４ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭ　ＥＧＴＡまたは０．１ｍＭ　ＣａＣｌ_２］上に乗せた。ＡＴＰ依存性の運動は、蛍光顕微鏡で観察し、またビデオカメラに撮影し記録した。アクチン運動の速度は、動いた距離とその動きをビデオカメラ撮影で収めた時間経過から算出した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。
（２）結果
Ｓ１−重鎖の組換えバキュロウイルスをＳｆ−９細胞に感染させた。培養３日後、これら細胞を回収し、ホモゲナイズし、遠心分離を行った。発現産物は沈殿物中にあることから（図１）、Ｓ１−重鎖は不溶性であることが示された。同様に、Ｓ１−重鎖のバキュロウイルスとＣａ^２＋結合軽鎖のバキュロウイルスとの共感染導入に発現産物を不溶性物質として得られた。しかしながら、このＳ１−重鎖の組換えバキュロウイルスとリン酸化軽鎖の組換えバキュロウイルスおよびＣａ^２＋結合軽鎖の組換えバキュロウイルスとの共感染導入では、Ｓｆ−９細胞内で可溶性のＳ１−重鎖が生産された（図２）。ＨＭＭ−重鎖の場合も同様に、リン酸化軽鎖およびＣａ^２＋結合軽鎖の組換えバキュロウイルスとの共感染を行うと、可溶性産物が得られた（図３）。
【００３５】
Ｓ１−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ^２＋結合軽鎖の組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ−９細胞の未加工抽出物から、可溶性Ｓ１−重鎖を回収するために、多量のアクチンをこの抽出物と混合し、遠心分離を行った。得られたペレットをＡＴＰ含有の緩衝液で懸濁し、Ｓ１−重鎖をペレットから放出させた。再度遠心分離を行うことによって、残存アクチンを除去し、得られた上清をＮｉ−ＮＴＡスパーフローカラムに注入した。図２に示したように、抽出物は、９８ｋＤａ（Ｓ１−重鎖）、１８ｋＤａ（リン酸化軽鎖）、１６ｋＤａ（Ｃａ^２＋結合軽鎖）の３つの大きなバンドで構成されている。これにより、抽出物にＳ１が含まれていることが分かる。ＨＭＭは、ＨＭＭ−重鎖のペプチド１３５ｋＤａ、リン酸化軽鎖のペプチド１８ｋＤａおよびＣａ^２＋結合軽鎖のペプチド１６ｋＤａの複合体（図３）と類似している。双頭のＨＭＭが、電子顕微鏡による観察で示された（図４）。Ｓ１およびＨＭＭのＡＴＰａｓｅ活性を、少量のサンプルでも数量化が可能な高速液体クロマトグラフィーによって解析した。組換えＳ１において、ＡＴＰａｓｅ活性が確認でき、この活性は次のとおり、アクチンによって活性化された。すなわち、０．１２±０．０１（ｓ^−１ｈｅａｄ^−１）（ｎ＝３）（ｍ±ＳＥＭ）のＭｇ^２＋−ＡＴＰａｓｅ活性（図５）；また種々の濃度のアクチン存在下では、その活性がＫ_ｍ＝２．５μＭと共にＶ_ｍａｘ＝０．６１（ｓ^−１ｈｅａｄ^−１）に上昇した（図６）。このように、Ｓ１はアクチンによって約５倍まで活性化され、機能性Ｓ１が発現されたことが確認された。ＨＭＭも同様に、０．２１±０．０２（ｓ^−１ｈｅａｄ^−１）（ｎ＝３）（ｍ±ＳＥＭ）のＭｇ^２＋−ＡＴＰａｓｅ活性を示した（図７）。アクチンは、Ｋ_ｍ＝１．８μＭによって活性をＶ_ｍａｘ＝１．２７（ｓ^−１ｈｅａｄ^−１）に増加させ（図８）、ＨＭＭがアクチンによって約６倍まで活性化されたことが確認された。
【００３６】
Ｓ１のＡＴＰａｓｅ活性におけるＣａ^２＋の効果は、アクチンによる最大限の活性化状態の下で試験した。Ｃａ^２＋のキレート剤であるＥＧＴＡの存在下では、活性は０．４９±０．０７（ｓ^−１ｈｅａｄ^−１）（ｎ＝３）であった。０．１ｍＭ　Ｃａ^２＋が存在した場合、活性は０．４５±０．０４（ｓ^−１ｈｅａｄ^−１）（ｎ＝３）にわずかに減少した（図５）。しかし、この減少は統計学的には有意ではなかった。Ｃａ^２＋の効果をＨＭＭで同様に試験した。しかし、その効果は、たとえあったとしても極わずかなものであった（図７）。
【００３７】
Ｃａ^２＋の効果が検出されなかったことから、Ｓ１およびＨＭＭがＣａ^２＋に結合するか否かという疑問が発生する。そのため、ＨＭＭによるＣａ^２＋結合を流動透析法によって確認した。図９に示したとおり、リン酸化軽鎖はＣａ^２＋と結合しなかった。しかしＣａ^２＋結合軽鎖はＣａ^２＋結合活性が確認された。ＨＭＭの結合活性は劇的に増加した；最大結合活性は、２ｍｏｌ／ｍｏｌ　ＨＭＭに対して、Ｋ_ｄが１０μＭレベルであった。
【００３８】
組換えＨＭＭに対するＣａ^２＋結合の効果を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ運動力解析を用いて調べた。すなわち、ＨＭＭをコーティングしたガラス表面上でアクチンのＡＴＰ依存性運動を観察した（図１０）。ＥＧＴＡ存在下での平均速度は０．６１±０．１６μｍ／ｓｅｃ（ｎ＝２５）であるのに対し、Ｃａ^２＋存在下では０．３２±０．２１μｍ／ｓｅｃ（ｎ＝２５）に減少した。この結果から、組換えＨＭＭがＣａ^２＋結合活性を有することと、Ｃａ^２＋が組換えＨＭＭの運動機能活性に作用することが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、Ｃａ^２＋結合型の組換えミオシンが提供される。この組換えミオシンは、マイクロマシンにおけるアクチュエーターや電子回路のスイッチ素子等として有用である。
【００４０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓｆ−９細胞で発現させた組換えＳ１−重鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は非感染Ｓｆ−９細胞のホモジネート、レーン３は感染Ｓｆ−９細胞ホモジネートの沈殿物、レーン４は感染Ｓｆ−９細胞ホモジネートの上清である。
【図２】Ｓ１精製過程でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は分離量マーカー、レーン２はホモジナイズし、遠心分離した非感染Ｓｆ−９細胞の上清、レーン３は同細胞の沈殿物、レーン４はＳ１−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ^２＋結合軽鎖を感染させたＳｆ−９細胞をホモジナイズし、遠心分離した上清、レーン５は同細胞の沈殿物、レーン６はＳ１とアクチンとの複合体から精製したＳ１、レーン７はＮｉ−ＮＴＮカラムにより精製したＳ１である。
【図３】組換えＨＭＭ精製過程でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は非感染Ｓｆ−９細胞ホモジネートの遠心分離上清、レーン３はその沈殿、レーン４はＳ１−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ^２＋結合軽鎖を感染させたＳｆ−９細胞ホモジネートの上清、レーン５は同感染細胞の沈殿、レーン６はＮｉ−ＮＴＡカラム前のサンプル、レーン７はＮｉ−ＮＴＮカラムから溶出した精製ＨＭＭである。
【図４】図３の工程で精製した組換えＨＭＭの電子顕微鏡写真である。
【図５】Ｓ１のＡＴＰａｓｅ活性の測定結果である。１は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ存在下での基準Ｍｇ^２＋−ＡＴＰａｓｅ活性、２は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび５μＭアクチン存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性、３は０．１ｍＭ　Ｃａ^２＋存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性である。値は３回の測定の平均±ＳＥＭである。
【図６】様々な濃度のアクチン存在下におけるＳ１のＡＴＰａｓｅ活性測定結果である。Ｓ１およびＥＧＴＡの濃度はそれぞれ０．５μＭおよび０．１ｍＭに固定した。他の測定条件は図５と同様とした。
【図７】組換えＨＭＭのＡＴＰａｓｅ活性の測定結果である。１は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ存在下での基準Ｍｇ^２＋−ＡＴＰａｓｅ活性、２は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび５μＭアクチン存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性、３は０．１ｍＭ　Ｃａ^２＋および５μＭアクチン存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性である。値は３回の測定の平均±ＳＥＭである。
【図８】様々な濃度のアクチン存在下における組換えＨＭＭのＡＴＰａｓｅ活性測定結果である。
【図９】組換えＨＭＭのカルシウム結合活性の測定結果である。黒丸はＨＭＭ、白丸はＣａＬＣ、黒菱型はＰＬＣである。
【図１０】ＨＭＭの運動活性に対するＣａ^２＋の効果を測定した結果である。Ａは０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ存在下での測定結果、Ｂは０．１ｍＭ　Ｃａ^２＋存在下での測定結果である。矢印はアクチンのＡＴＰ依存性運動の平均速度を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application is based on Ca ²⁺ The present invention relates to a conjugated recombinant myosin. More specifically, this application is expected to be useful as an actuator in a micromachine or a switch element in a microelectronic circuit. ²⁺ The present invention relates to a conjugated recombinant myosin.
[0002]
[Prior art]
With the development of nanotechnology in recent years, attention has been paid to the development of micromachines that perform mechanical movement with a molecular size. In order to create such a micromachine, various technical developments are required up to individual element devices and a method of assembling them (micromachining). In particular, the development of a microactuator, which is a micromachine driving unit, is indispensable for autonomous movement of a machine and the like, and the development of motor devices using various micromachining technologies is being advanced. However, the size of a microactuator that can be formed by a method using microfabrication technology is about 100 μm even if it is small, and further miniaturization is required in order to mount it on a nanoscale micromachine.
[0003]
Therefore, it has been proposed to use a single molecule having a motility as a motor instead of constructing a motor device by a fine processing technique.
[0004]
In general, molecules that can be used as motors are required to satisfy two points, that is, there is a power mechanism that converts external energy into motion, and that one-way motion can be realized. And, as the low molecular weight organic compound satisfying such conditions, (3R, 3′R)-(P, P) -trans-1,1 ′, 2,2 ′, 3,3 ′, 4,4 ′ -Octahydro-3,3'-dimethyl-4,4'-biphenanthridiene (Nature 401: 152-155,1999) and Triptycyl (4) helicene (Nature 401: 150-152,1999) are known. However, these organic compounds have fatal defects as actuators in micromachines, such as extremely low speed, extremely low driving force, and the inability to rotate repeatedly. Is not standing.
[0005]
On the other hand, as a single-molecule motor other than the organic compound as described above, a flagellar motor (Microbiol. 6: 1-18, 1967; Nature 245: 380-382, 1973) and an ATP synthase (Nature 386: 299) -302, 1997), myosin motor (Biochem. Biophys. Res. Comm. 199: 1057-1063, 1994; Curr. Opin. Cell Biol. 7: 89-93, 1995), microtubule-based motor (Cell 42:39). -50, 1985), and biomolecules such as a motor protein of a nucleic acid synthase (Nature 409: 113-119, 2001).
[0006]
Of course, these biomolecules require various technological developments in order to be used for micromachine actuators, etc., but their stable driving force is expected to make them extremely powerful devices in future micromachines. Have been. In addition, it has been proposed that these biomolecules can also be used as switching elements of electronic circuits.
[0007]
Among these biomolecular motor candidates, myosin is a muscle protein having a molecular weight of about 480 kDa, and is composed of two myosin heavy chains having a molecular weight of about 220 kDa and two types of myosin light chains, each of which is two. I have. The N-terminal side of the myosin heavy chain is a functional site called heavy meromyosin (HMM), which functions as a motor protein that generates "force" between actin and actin by the degradation of ATP.
[0008]
There are two types of myosin control: (a) a type that is not externally controlled, such as skeletal muscle myosin; (b) a type that is controlled by phosphorylation, such as smooth muscle or cellular slime mold Dictyostelium myosin; and (c) Calcium (Ca) like myosin of the slime mold Physarum and scallop scallop ²⁺ ) Are controlled by combining them.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the usefulness of biomolecules as actuators (molecular motors) of micromachines and switching elements of electronic circuits has been pointed out. Each biomolecule can be applied or combined in various ways depending on its individual characteristics (difference in rotation, driving mechanism, etc.).
[0010]
On the other hand, in order to use these biomolecules as mechanical components such as actuators and switching elements, various modifications (various modifications) that enable mechanical and electrical coupling with other devices are required. is necessary. The most effective means for reliably performing such modification is to modify biomolecules by genetic engineering.
[0011]
In this regard, in the case of myosin, the production of recombinant myosin for the types (a) and (b) has been reported (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 704-708, 1995). Science 246: 656-658, 1989). However, type (c) Ca ²⁺ Recombinant recombinant myosin has not been successfully produced.
[0012]
The invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and ²⁺ It is an object of the present invention to provide a conjugated recombinant myosin.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
This application discloses Ca as an invention for solving the above-mentioned problem. ²⁺ Heavy chain of bound myosin, Ca ²⁺ An expression product of a polynucleotide encoding each of the binding light chain and the phosphorylated light chain, wherein the wild-type Ca ²⁺ A recombinant myosin characterized by having substantially the same function as a conjugated myosin is provided.
[0014]
Another aspect of the invention is a myosin heavy chain, Ca ²⁺ One or more amino acid residues in the amino acid sequence of the binding light chain and / or phosphorylated light chain are replaced with other amino acid residues, one or more amino acid residues are deleted, or one or more amino acid residues are added. Is a recombinant myosin.
[0015]
In a preferred embodiment of the recombinant myosin of the present invention, each polynucleotide is derived from a true slime mold Physalum.
[0016]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The recombinant myosin of the present invention comprises Ca ²⁺ Heavy chain of bound myosin (about 220 kDa), Ca ²⁺ Expression products of polynucleotides encoding the binding light chain (about 16 kDa) and the phosphorylated light chain (about 18 kDa).
[0017]
"Ca ²⁺ "Bound myosin" refers to Ca ²⁺ Is a myosin that is controlled by binding to, for example, myosin of the true slime mold Physarum or scallop. In addition, "wild type Ca ²⁺ "Has substantially the same function as conjugated myosin""specifically means that myosin degrades ATP and binds to actin to generate mechanical energy. ²⁺ Means change. However, the recombinant myosin derived from physalm is Ca ²⁺ The binding reduces ATP degradation and the generation of mechanical energy, and recombinant myosin from scallop is Ca ²⁺ It means that binding increases ATP degradation and the generation of mechanical energy.
[0018]
The recombinant myosin of the present invention can be prepared by expressing the above-mentioned polynucleotide in an in vitro translation system or a suitable host-vector system.
[0019]
For example, the polynucleotide (cDNA) may be obtained from known base sequence information (eg, myosin heavy chain of Physalum: GenBank No. AF335500, Ca ²⁺ Binding light chain: GenBank No. J03499, phosphorylated light chain: GenBank No. AB076705; Scallop myosin heavy chain: GenBank No. X55714, light chain: GenBank No. M17208, M17201) can be obtained by screening each cDNA library using oligonucleotides synthesized based on the same. The target polynucleotide can also be obtained by PCR or RT-PCR using oligonucleotide primers prepared based on known base sequence information.
[0020]
The obtained polynucleotides can be cloned separately into expression vectors and co-expressed to prepare the recombinant myosin of the present invention. Alternatively, the respective polynucleotides may be cloned into an expression vector as a fused polynucleotide. However, in that case, heavy chain, Ca ²⁺ A stop codon is provided at the 3 'end of each polynucleotide so that the associated light chain and the phosphorylated light chain are each expressed as a mature protein. The 5 'end of each polynucleotide may be provided with a respective expression control sequence (promoter / enhancer).
[0021]
When the recombinant myosin of the present invention is expressed in an in vitro translation system, the polynucleotide is recombined into an expression vector having an RNA polymerase promoter, and the recombinant vector is subjected to a rabbit reticulocyte lysate containing an RNA polymerase corresponding to the promoter. And an in vitro translation system such as wheat germ extract. Examples of the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like. Examples of vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, and pBluescript II.
[0022]
In addition, if the polynucleotide is expressed in a suitable host-vector system, recombinant myosin can be produced in prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells, mammalian cells, and plant cells. can do. For example, when expressed in a microorganism such as Escherichia coli, an expression vector is prepared by recombining a polynucleotide into an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a DNA cloning site, a terminator, and the like that can be replicated in the microorganism, By transforming a host cell with this expression vector and culturing the transformant, the target recombinant myosin can be mass-produced from the culture. Examples of the expression vector for Escherichia coli include a pUC system, pBluescript II, a pET expression system, and a pGEX expression system. Furthermore, when the recombinant myosin is expressed in eukaryotic cells, the polynucleotide is inserted into an expression vector for eukaryotic cells having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like, to produce a recombinant vector. The desired recombinant myosin can be obtained from eukaryotic cells transfected with this vector. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pYES2 and the like. As eukaryotic cells, cultured mammalian cells such as human embryonic kidney cells HEK293, monkey kidney cells COS7, Chinese hamster ovary cells CHO, and primary cultured cells isolated from human organs can be used. Budding yeast, fission yeast, silkworm cells, Xenopus egg cells and the like can also be used. In addition, if the above expression vector is transfected into insect cells together with the genomic DNA of nuclear polyhedrosis virus belonging to the baculovirus family, the desired recombinant myosin can be obtained from insect cells. Sf9, Sf21, Tn5 and the like can be used as insect cells.
[0023]
To introduce the expression vector into cells, known methods such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, and a DEAE dextran method can be used. In order to isolate and purify the polypeptide expressed in the transformed cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with a denaturant or a surfactant such as urea, ultrasonic treatment, enzymatic digestion, salting out or solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like.
[0024]
Another aspect of the invention is a myosin heavy chain, Ca ²⁺ One or more amino acid residues in the amino acid sequence of the binding light chain and / or phosphorylated light chain are replaced with other amino acid residues, one or more amino acid residues are deleted, or one or more amino acid residues are added. Modified myosin.
[0025]
In this case, the “modified type” means that the activity of the recombinant myosin (for example, Ca2 + binding ability, ATP decomposability, mechanical energy generating ability, etc.) increases or decreases due to the mutation of the amino acid sequence. Alternatively, it means an amino acid mutation that increases or decreases the binding to another molecule or compound.
[0026]
Such an amino acid mutation can be performed by introducing a mutation into the aforementioned polynucleotide by a known method, and expressing the mutant polynucleotide in the same manner as described above. For example, when preparing a polynucleotide in which an arbitrary amino acid codon is replaced with another amino acid residue codon, the known Kunkel method (Kunkel, TA Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985, and Kunkel, TA, et al. (Methods Enzymology 154: 367, 1987). That is, dut ⁻ , Ung ⁻ E. coli (BW313, CJ236, etc.) represented by the genotype of (1) lacks dUTPase (Dut) and Uracil-DNA glycosylase (Ung). Is synthesized. Using this Escherichia coli as a host bacterium, an oligonucleotide designed to replace the target residue with another amino acid residue is hybridized in a test tube to a target polynucleotide for mutagenesis, and DNA polymerase reaction and DNA A complementary DNA strand is synthesized by a ligase reaction. Hang this DNA ⁺ , The original DNA strand containing dU is degraded by Ung, but the complementary DNA strand synthesized in the test tube is replicated without degradation. In this manner, the DNA strand into which the mutation has been introduced is selectively amplified, and a polynucleotide encoding myosin containing the target mutation can be obtained. The mutant polynucleotide can also be obtained by a method using a mutation kit or the like, a mutation-introduced PCR method, or a known polynucleotide synthesis method (for example, Nucleic Acid Res. 25: 3440-3444, 1997, etc.). be able to.
[0027]
Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the invention of this application is not limited to the following examples.
[0028]
【Example】
(1) Materials and methods
(1-1) Chemical substances
Restriction enzymes and other enzymes were from Takara Shuzo Co., Ltd. (Kyoto). All other reagents were commercially available special grade reagents. Milli-Q water (Millipore, Bedford, MA, USA) was used when preparing the aqueous solution.
(1-2) Construction of baculovirus introduction vector
CDNA encoding the subfragment-1 heavy chain (S1-HC; Met1-Gly841) of the myosin heavy chain derived from phyzalum was synthesized by RT-PCR (KOD DNA polymerase; Toyobo Co., Ltd., Tokyo). The following PCR primers were used, which were designed based on known sequence information (GenBank No. AF335500).
[0029]
5'-CGGGATCCATGGCAAGCGAAAGGCAAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-ATGGTGCTTGTCGTGCGTCGTCGCCAACCAATAAGGGACGCG-3 '(SEQ ID NO: 2)
The PCR conditions were 35 cycles with denaturation (94 ° C. for 1 minute), annealing (55 ° C. for 1 minute), and extension (72 ° C. for 3 minutes) as one cycle.
[0030]
To express recombinant myosin, a hexa-His-tag sequence was added to the C-terminus by PCR. The following primers at the end of S1-HC:
5'-CCGCGGCCGCATGATGATGATGATGGTGCTTGTCGTCGTTCGTCGCTC-3 '(SEQ ID NO: 3)
Contained a hexa-His tag sequence, a stop codon and a SalI restriction site.
Nest PCR was performed using the following primers.
[0031]
5'-CGGGATCCATGGCAAGCGAAAGGCAAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
The PCR product obtained above was cloned into the BamHI / SalI site of pBlueBac4.5a (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and the DNA sequence was confirmed. The obtained plasmid was designated as pBB / S1.
[0032]
A vector for introducing the heavy meromyosin (HMM) heavy chain (Met1-Lys1181) of the myosin heavy chain was constructed in the same manner as described above. A coiled coil structure region, which is a part of the myosin heavy chain, was added to the C-terminus of S1-HC by PCR. Primer with SmaI restriction site (2044 bp of myosin heavy chain):
5′-CAGAAGCCCGGGTACCTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 5);
Primers containing an HMM fragment (Lys1181) at the end:
5′-ATGATGATGGTGCTTGAGCTCCTCCTACCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
Was used. To add a hexa-His tag sequence, use a primer:
5′-CAGAAGCCCGGGTACCTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 7);
Primers containing hexa-His tag sequence, stop codon, SalI restriction site:
5′-GGACTAGTGCGACTTAATGATGATGATGATGGTGC-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
Was used to perform nested PCR.
[0033]
The obtained PCR product was cloned into SmaI / SalI of the pBB / S1 plasmid, and the plasmid was constructed as pBB / HMM.
[0034]
Furthermore, using primers designed based on known sequence information, vectors for introducing polynucleotides encoding the Ca2 + binding light chain (CaLC) and the phosphorylated light chain (PLC) were constructed. In addition, a BamHI or KpnI restriction enzyme site was added to the 5 ′ end of PLC and CaLC. In addition, a KpnI or EcoRI site was added to the 3 ′ end of PLC and CaLC. The obtained PCR product was subcloned into BamHI / KpnI and KpnI / EcoRI restriction sites of pBlueBac4.5a, respectively, to construct plasmids pBB / PLC and pBB / CaLC.
(1-3) Infection and selection of recombinant virus
Spodoptera frugiperda (Sf-9) cells 75 cm ² And cultured at 27 ° C. in a flask. The culture solution (TNM-FH) was prepared by adding 10% fetal calf serum (FCS) and 10 μg / ml gentamicin (Sigma-Aldrich, USA) to Grace's insect cell culture solution (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Was. In Sf-9 cells, linear DNA (Bac-M-Blue) of nuclear-polynucleosis virus Auto-graphica californica was added to Sf-9 cells. ^TM DNA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and any one of the transfer vectors pBB / S1, pBB / HMM, pBB / PLC and pBB / CaLC. To increase the efficiency of infection introduction, InsectinPlus ^TM Liposomal reagents (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were used. Seven days later, plaque assays were performed on X-gal containing plates to isolate recombinant baculovirus. Pick up the blue plaque and use Sf-9 cells (25cm ² Of the culture vessel) to amplify the recombinant baculovirus. Four days later, the recombinant baculovirus in the supernatant was removed from the 75 cm ² Sf-9 cells cultured in flasks for 11 days were infected to prepare stocks with high virus titers. Various introduced cDNAs incorporated into the recombinant baculovirus were confirmed by PCR, and subsequently also confirmed by a nucleotide sequence analyzer. The obtained recombinant baculovirus was propagated again by the method described above.
(1-4) Purification of recombinant S1 and HMM

72cm

² 1 × 10 ⁷ Sf-9 cells were seeded. In Sf-9 cells, S1-heavy chain or HMM-heavy chain, phosphorylated light chain and Ca ²⁺ Baculoviruses transfected with polynucleotides each encoding a binding light chain were individually co-infected. In each case, the multiplicity of infection (moi) was 5. The infected Sf-9 cells were grown at 27 ° C. for 3 days, and then centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes at a speed of 1500 rpm to collect the cells. Since the collected cells are in a pellet form, 7 ml of a homogenizing buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl ₂ 1 mM EGTA, 5 mM 2-mercaptoethanol, protease inhibitor 1 mM p-ABSF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 μg / ml leupeptin and His-tag protease inhibitor mixture (Sigma-Aldrich, USA) )] And homogenized. After homogenization, adjust to 0.2 M NaCl and 1 mM ATP to release recombinant myosin from endogenous actin and centrifuge at 15000 xg for 15 min to remove cell debris and undisrupted cells. Separation was performed. The supernatant was mixed with 0.2 mg / ml rabbit skeletal muscle actin (purified from rabbit skeletal muscle acetone powder) and buffered (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM KCl, 10 mM MgCl 2). ₂ , 0.3 mM DTT, 1 mM p-ABSF and 1 μg / ml leupeptin) for 24 hours. Actin recombinant HMM was formed and precipitated during dialysis, and collected by centrifugation at 100,000 × g for 1 hour. The S1 / HMM precipitate separated from the precipitate was buffered [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM KCl, 10 mM MgCl ₂ , 7 mM 2-mercaptoethanol, 100 μM p-ABSF, 1 μg / ml leupeptin and 1 mM ATP], centrifuged at 100,000 × g for 90 minutes, and the resulting supernatant was subjected to Ni-NTA superflow (Qiagen). (Germany, Germany). The His-tagged recombinant S1 or HMM was trapped in this column and extracted with an extract [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 40 mM KCl, 7 mM 2-mercaptoethanol, 1 μg / ml leupeptin and 100 mM imidazole]. After SDS-PAGE, the electrophoretic band containing the recombinant S1 / HMM was accumulated and concentrated using Centriprep-30 concentrator (Millipore, USA). Then, the recombinant myosin was buffered [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.1 mM DTT, 20 μM p-ABSF and 0.6 μg / ml leupeptin]. The protein was purified at a temperature of 4 ° C. or lower. 0.1 mg of a typical recombinant S1 / HMM was collected and quantified with a Bio-Rad protein measurement solution using BSA as a standard value. ⁸ Sf-9 cells were obtained.
(1-5) Gel electrophoresis
SDS-PAGE is a 12.5% polyacrylamide gel prepared using the buffer system described in the literature (Nature 227: 680-685, 1970) according to the description in the literature (J. Chromatogr 64: 147-155, 1972). This was performed using The SDS-sample buffer consisted of 40 mM Tris-HCl (pH 6.8), 50 mM DTT, 1% SDS, 7.5% glycerol, 0.002% bromophenol blue.
(1-6) Observation by electron microscope
The purified HMM (0.5 mg / ml) was mounted on a mica sheet, washed three times with 0.1 M ammonium acetate containing 30% glycerol, stained with a 2% aqueous uranyl acetate solution, and washed three times. The mica sheet was coated with another split mica sheet, pressed, peeled and rotary replicated on platinum at low angle in a BAF 060 rotary imaging system, the replicated sample was fixed on a sample stage, and JEM-1010 electron microscope. Was observed.
(1-7) Analysis by ATPase activity
The measurement of the ATPase activity in the S1 / HMM was performed according to the description in the literature (Anal Biochem. 293: 212-215, 2001). All analyzes were performed at 25 ° C. Basic Mg ²⁺ -ATPase activity was determined by measuring 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 0.5 mM ATP, polymerized actin from rabbit skeletal muscle and 0.5 μM recombinant S1 / HMM. Was analyzed. Statistical analysis was performed using Student's t-test, and P <0.05 was regarded as statistically significant.
(1-8) Ca ²⁺ Measuring binding
Ca ²⁺ Is 3.5 μM HMM and 50 μM recombinant Ca according to the description in the literature (Biochemistry 39: 3827-3834, 2000). ²⁺ CaCl in the presence of light chain or 50 μM recombinant phosphorylated light chain ₂ 0.1 mM NaCl, 5 mM MgCl containing (Du-Pont-NEN) ₂ And at 25 ° C. using a fluid dialysis method using MOPS / NaOH (pH 7.0). Phosphorylated light chain or Ca ²⁺ An NdeI restriction enzyme site was added to the 5 'end of each ORF of each light chain, and a BamHI site was added to the 3' end by PCR. This PCR product was treated with NdeI and BamHI, and inserted into the same site of the pET19b expression vector system (Novagen, USA). According to the manufacturer's instructions, pET19b / PLC or pET19b / CaLC was expressed and purified in Escherichia coli strain BL21 (DE3). All data were analyzed by fitting to the Adiar equation.
(1-9) Analysis of exercise force in in vitro
The analysis of the in-vitro motor force was performed according to the description of the literature (J. Biochem. 106: 955-957, 1989). That is, the glass surface was coated with recombinant HMM. Polymerized actin (0.125 mg / ml) was labeled with rhodamine phalloidin (Molecular Probe, USA), and the medium for kinetic analysis [10 mM KCl, 2 mM ATP, 1 mM MgCl ₂ 10 mM imidazole (pH 7.5), 14 mM 2-mercaptoethanol and 0.1 mM EGTA or 0.1 mM CaCl ₂ ]. ATP-dependent movement was observed with a fluorescence microscope and photographed and recorded with a video camera. The speed of the actin movement was calculated from the distance moved and the time elapsed when the movement was captured with a video camera. Statistical analysis was performed using Student's t-test, and P <0.05 was regarded as statistically significant.
(2) Result
Sf-9 cells were infected with S1-heavy chain recombinant baculovirus. After 3 days of culture, these cells were collected, homogenized, and centrifuged. The expression product was in the precipitate (FIG. 1), indicating that the S1-heavy chain was insoluble. Similarly, S1-heavy chain baculovirus and Ca ²⁺ The expression product was obtained as an insoluble substance upon co-infection introduction of the bound light chain with baculovirus. However, this S1-heavy chain recombinant baculovirus and the phosphorylated light chain recombinant baculovirus and Ca ²⁺ Co-infection of the bound light chain with the recombinant baculovirus produced soluble S1-heavy chain in Sf-9 cells (FIG. 2). Similarly for HMM-heavy chain, phosphorylated light chain and Ca ²⁺ Co-infection of the bound light chain with the recombinant baculovirus resulted in a soluble product (FIG. 3).
[0035]
S1-heavy chain, phosphorylated light chain and Ca ²⁺ To recover soluble S1-heavy chain from raw extracts of Sf-9 cells infected with the recombinant baculovirus of bound light chain, a large amount of actin was mixed with this extract and centrifuged. . The resulting pellet was suspended in a buffer containing ATP and the S1-heavy chain was released from the pellet. The remaining actin was removed by performing centrifugation again, and the obtained supernatant was injected into a Ni-NTA superflow column. As shown in FIG. 2, the extracts were 98 kDa (S1-heavy chain), 18 kDa (phosphorylated light chain), 16 kDa (Ca ²⁺ (Bound light chain). Thereby, it turns out that S1 is contained in the extract. HMM is HMM-heavy chain peptide 135 kDa, phosphorylated light chain peptide 18 kDa and Ca ²⁺ It is similar to the complex of the peptide 16 kDa of the binding light chain (FIG. 3). Double-headed HMMs were shown by electron microscopy (FIG. 4). The ATPase activity of S1 and HMM was analyzed by high performance liquid chromatography which allows quantification of even small samples. ATPase activity was confirmed in the recombinant S1, and this activity was activated by actin as follows. That is, 0.12 ± 0.01 (s ^-1 head ^-1 ) (N = 3) (m ± SEM) Mg ²⁺ -ATPase activity (FIG. 5); in the presence of various concentrations of actin, _m = 2.5 μM and V _max = 0.61 (s ^-1 head ^-1 ) (FIG. 6). Thus, it was confirmed that S1 was activated by actin up to about 5-fold, and that functional S1 was expressed. Similarly, the HMM is 0.21 ± 0.02 (s ^-1 head ^-1 ) (N = 3) (m ± SEM) Mg ²⁺ -Showed ATPase activity (FIG. 7). Actin is K _m = 1.8 μM to V _max = 1.27 (s ^-1 head ^-1 ) (FIG. 8), confirming that HMM was activated by actin up to about 6-fold.
[0036]
Ca in ATPase activity of S1 ²⁺ Was tested under maximal activation by actin. Ca ²⁺ In the presence of EGTA, a chelating agent, the activity was 0.49 ± 0.07 (s ^-1 head ^-1 ) (N = 3). 0.1 mM Ca ²⁺ , The activity was 0.45 ± 0.04 (s ^-1 head ^-1 ) (N = 3) (Figure 5). However, this reduction was not statistically significant. Ca ²⁺ Was similarly tested on the HMM. However, the effect was negligible, if any (FIG. 7).
[0037]
Ca ²⁺ S1 and HMM were Ca ²⁺ The question arises as to whether or not to join. Therefore, Ca by HMM ²⁺ Binding was confirmed by flow dialysis. As shown in FIG. 9, the phosphorylated light chain is Ca ²⁺ And did not bind. But Ca ²⁺ The binding light chain is Ca ²⁺ Binding activity was confirmed. The binding activity of HMM increased dramatically; the maximum binding activity was 2 K / mol HMM versus K _d Was at the 10 μM level.
[0038]
Ca against recombinant HMM ²⁺ The effect of binding was examined using in vitro motor analysis. That is, ATP-dependent movement of actin was observed on the HMM-coated glass surface (FIG. 10). The average velocity in the presence of EGTA is 0.61 ± 0.16 μm / sec (n = 25), whereas Ca ²⁺ In the presence, it decreased to 0.32 ± 0.21 μm / sec (n = 25). From this result, the recombinant HMM was Ca ²⁺ Having binding activity and Ca ²⁺ Acts on the motor function activity of the recombinant HMM.
[0039]
【The invention's effect】
As described in detail above, according to the invention of this application, Ca ²⁺ A conjugated recombinant myosin is provided. This recombinant myosin is useful as an actuator in a micromachine, a switching element in an electronic circuit, or the like.
[0040]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE of recombinant S1-heavy chain expressed in Sf-9 cells. Lane 1 is the molecular weight marker, lane 2 is the homogenate of uninfected Sf-9 cells, lane 3 is the precipitate of infected Sf-9 cell homogenate, and lane 4 is the supernatant of infected Sf-9 cell homogenate.
FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE during the S1 purification process. Lane 1 is the separation amount marker, Lane 2 is the supernatant of uninfected Sf-9 cells homogenized and centrifuged, Lane 3 is the sediment of the same cells, Lane 4 is S1-heavy chain, phosphorylated light chain and Ca ²⁺ Sf-9 cells infected with the bound light chain were homogenized and centrifuged. The supernatant was centrifuged, lane 5 was a precipitate of the cells, lane 6 was S1 purified from a complex of S1 and actin, and lane 7 was Ni- This is S1 purified by an NTN column.
FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE in a recombinant HMM purification process. Lane 1 is the molecular weight marker, Lane 2 is the centrifuged supernatant of uninfected Sf-9 cell homogenate, Lane 3 is its precipitate, Lane 4 is S1-heavy chain, phosphorylated light chain and Ca ²⁺ Supernatant of Sf-9 cell homogenate infected with the bound light chain, lane 5 is a precipitate of the infected cells, lane 6 is a sample before Ni-NTA column, and lane 7 is purified HMM eluted from Ni-NTN column. .
FIG. 4 is an electron micrograph of the recombinant HMM purified in the step of FIG.
FIG. 5 shows the results of measuring the ATPase activity of S1. 1 is a reference Mg in the presence of 0.1 mM EGTA. ²⁺ -ATPase activity, 2 is actin-activating ATPase activity in the presence of 0.1 mM EGTA and 5 μM actin, 3 is 0.1 mM Ca ²⁺ Actin-activated ATPase activity in the presence. Values are means ± SEM of three measurements.
FIG. 6 shows the results of measuring the ATPase activity of S1 in the presence of various concentrations of actin. The concentrations of S1 and EGTA were fixed at 0.5 μM and 0.1 mM, respectively. Other measurement conditions were the same as in FIG.
FIG. 7 shows the results of measuring the ATPase activity of the recombinant HMM. 1 is a reference Mg in the presence of 0.1 mM EGTA. ²⁺ -ATPase activity, 2 is actin-activating ATPase activity in the presence of 0.1 mM EGTA and 5 μM actin, 3 is 0.1 mM Ca ²⁺ And actin-activated ATPase activity in the presence of 5 μM actin. Values are means ± SEM of three measurements.
FIG. 8 shows ATPase activity measurement results of recombinant HMM in the presence of various concentrations of actin.
FIG. 9 shows the results of measuring the calcium binding activity of recombinant HMM. The closed circle is HMM, the open circle is CaLC, and the closed diamond is PLC.
FIG. 10. Ca against motor activity of HMM ²⁺ It is the result of having measured the effect of. A is the measurement result in the presence of 0.1 mM EGTA, B is 0.1 mM Ca ²⁺ It is a measurement result in the presence. Arrows indicate the average rate of ATP-dependent movement of actin.

Claims

The heavy chain of Ca ²⁺ binding myosin, Ca ²⁺ binding light chain and an expression product of a polynucleotide encoding the respective phosphorylation light chain, the wild-type Ca ²⁺ binding myosin substantially the same function A recombinant myosin, comprising:

Replacing one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the myosin heavy chain, Ca ²⁺ binding light chain and / or phosphorylated light chain with another amino acid residue, deleting one or more amino acid residues, or one or more amino acids 2. The recombinant myosin of claim 1, wherein a residue is added.

3. The recombinant myosin of claim 1 or 2, wherein each polynucleotide is derived from a true slime mold physalum.