JP2004057064A

JP2004057064A - Method for preventing degradation of nucleic acid, method for extracting nucleic acid, and method for storing nucleic acid

Info

Publication number: JP2004057064A
Application number: JP2002218884A
Authority: JP
Inventors: Shoji Senoo; 妹尾　昌治
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: JP4076812B2; AU2003252692A1; WO2004011645A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for preventing the degradation of nucleic acid, by which the nucleic acid degradation caused by a nucleic acid-degrading enzyme can surely be prevented, and to provide a method for extracting the nucleic acid, by which the nucleic acid can efficiently be extracted, while preventing the nucleic acid degradation caused by the nucleic acid-degrading enzyme. <P>SOLUTION: This method for preventing the degradation of the nucleic acid is characterized by having a process for cleaving a disulfide bond site in at least a nucleic acid-degrading enzyme to form the sulfohydryl group and a process for selectively modifying the sulfohydryl group. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、細胞から核酸を抽出する際、あるいは細胞から抽出した核酸を保存する際に、溶解液中に含まれる核酸分解酵素により核酸が分解されることを防止するための核酸の分解防止方法に関するものである。また、この出願の発明は、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出する方法と抽出された核酸を保存する方法に関するものである。さらに、この出願の発明は、核酸抽出用キットと核酸保存用キットに関するものである。
【０００２】
【従来技術とその課題】
近年、遺伝子工学の発展とともに、細胞や組織から核酸、とくにＲＮＡを抽出し、解析、診断、変異、増幅等の処理を行う技術が確立されてきている。しかし、細胞や組織には、リボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素が存在するため、しばしば抽出操作中に核酸が分解されるという問題があった。
【０００３】
そこで、核酸の抽出操作においては、グアニジンイソチオシアネートを用いて核酸分解酵素を変性可溶化した後、ラウリルザルコシンナトリウム等の界面活性剤を加え、β−メルカプトエタノールで核酸分解酵素を還元することにより核酸分解酵素を変性させて核酸の分解を防止していた。しかし、このような従来の核酸の抽出方法では、核酸分解酵素の変性が可逆的な還元反応によるため、時間の経過や核酸の精製により核酸分解酵素が再び活性化し、核酸の分解が進行するという問題があった。つまり、時間の経過に伴い、空気中の酸素等の作用により酸化−還元反応が平衡に達したり、精製工程において還元剤等が除去されて還元反応よりも酸化反応が優位となったりするために、核酸分解酵素が再構成され、活性を示すようになって核酸が分解されてしまうのである。
【０００４】
さらに、核酸分解酵素は空気中の細菌、作業者の毛髪や皮膚等からも混入するため、抽出操作には慎重を要し、抽出後は速やかに次工程へと移行することが不可欠であった。したがって、とくに貴重な試料からの核酸抽出操作においては、核酸分解酵素から試料を保護することが最大の課題となっていた。
【０００５】
共存あるいは混入する核酸分解酵素を失活させる方法として、プロテアーゼＫによる消化が知られているものの、プロテアーゼＫも蛋白質であるために、核酸分解酵素と同様に可溶化や還元を受け、失活するという問題があった。そのため、プロテアーゼＫによる消化は、一般に可溶化剤や還元剤を微量のみ含む希釈条件下で行うが、そのような希釈溶液中では核酸分解酵素も活性を示すようになるため、核酸の分解を防止する上で有効な手段とは言い難かったのが実情である。
【０００６】
この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、核酸分解酵素による核酸の分解を確実に防止する簡便な方法を提供することを課題としている。この出願の発明は、また、核酸分解酵素による核酸分解を防止しながら核酸を抽出する効率的な方法や抽出された核酸を保存するための効果的な方法を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、まず、第１には、細胞からの核酸の抽出時および／または保存時に、核酸分解酵素による核酸の分解を防止するための方法であって、少なくとも、核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程を有することを特徴とする核酸の分解防止方法を提供する。
【０００８】
また、この出願の発明は、第２には、核酸分解酵素におけるジスルフィド結合の解裂をβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される試薬を用いて行う前記の核酸分解防止方法を、第３には、スルホヒドリル基の選択的修飾をモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される修飾試薬を用いて行う前記の核酸分解防止方法を、そして第４には、スルホヒドリル基の選択的修飾をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される修飾試薬を用いて行う前記の核酸分解防止方法を提供する。
【０００９】
第５には、この出願の発明は、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出する方法であって、少なくとも、細胞を溶解する工程と、細胞を溶解した溶解液に含まれる核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成する工程と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程
を有することを特徴とする核酸抽出方法を提供する。
【００１０】
この出願の発明は、第６には、核酸分解酵素におけるジスルフィド結合の解裂をβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される試薬を用いて行う前記の核酸抽出方法を、第７には、スルホヒドリル基の選択的修飾をモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される修飾試薬を用いて行う前記いずれかの核酸抽出方法を、そして、第８には、スルホヒドリル基の修飾をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される修飾試薬を用いて行う前記の核酸抽出方法を提供する。
【００１１】
さらに、第９には、この出願の発明は、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から抽出された核酸を保存するための方法であって、少なくとも、核酸溶液中に含まれる核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する修飾試薬を含有する保存液中で核酸を保存することを特徴とする核酸の保存方法を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、第１０には、ジスルフィド結合解裂試薬がβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される前記核酸保存方法を、第１１には、修飾試薬がモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される前記核酸保存方法を、また、第１２には、修飾試薬がヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される前記いずれかの核酸保存方法を提供する。
【００１３】
この出願の発明は、また、第１３には、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出するためのキットであって、少なくとも、核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するためのジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬を含有することを特徴とするキットを、第１４には、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から抽出された核酸を保存するためのキットであって、少なくとも、核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するためのジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬を含有することを特徴とするキットを提供する。
【００１４】
さらに、この出願の発明は、第１５には、ジスルフィド結合解裂試薬がβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される前記いずれかのキットを、第１６には、修飾試薬がモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される前記いずれかのキットを、そして第１７には、修飾試薬がヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される前記いずれかのキットを提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この出願の発明者は、核酸分解酵素を失活させるためには、そのコンホメーションを変化させることが有効である点に着目し、そのようなコンホメーション変化を不可逆的に起こす方法を検討した。そして、蛋白質である核酸分解酵素に作用し、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸には作用しない方法を見出し、本願発明に至ったのである。
【００１６】
核酸分解酵素等の蛋白質は、システイン（Ｃｙｓ）を有する。システインは、側鎖にスルホヒドリル（ＳＨ）基を有するアミノ酸であり、蛋白質配列中に存在する二つのシステインは互いにジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成することにより複雑な立体構造を構築し、安定化させる。また、このような立体構造によって各蛋白質に応じた活性が発現される。
【００１７】
核酸の抽出操作においては、一般的に、核酸分解酵素を還元し、ジスルフィド結合を切断してスルホヒドリル基（ＳＨ）とすることにより立体構造を変化させ、不活性化させている。しかし、前記のとおり、還元によりシステイン側鎖のＳＨが形成されても、反応平衡や還元剤の除去により酸化反応が進行するようになるため、再びジスルフィド結合が形成されて核酸分解酵素が活性を示してしまう。
【００１８】
そこで、この出願の発明の核酸の分解防止方法では、ジスルフィド結合の再形成を阻止することにより、核酸分解酵素を不可逆的に不活性化させる。
【００１９】
すなわち、この出願の発明の核酸の分解防止方法は、少なくとも
（ａ）核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程と、
（ｂ）該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程
を有することを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の核酸の分解防止方法において、ジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程は、各種の試薬により行うことができる。具体的には、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、および水素化ホウ素ナトリウムによりジスルフィド結合を還元し、解裂させる方法や亜硫酸塩によりジスルフィド結合を解裂する方法が例示される。とくに、ジチオスレイトールやジチオエリスリトールはジスルフィド結合を効率よく解裂する。また、β−メルカプトエタノールやβ−メルカプトエチルアミンも効率よくジスルフィド結合を解裂できる。中でもβ−メルカプトエタノールは安価で扱い易いことから好ましい。
【００２１】
また、本発明の核酸分解防止方法では、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための試薬もとくに限定されない。一般に、蛋白質の修飾試薬にはアミノ基を標的とするものが多いが、アミノ基は核酸にも存在することから、この出願の発明の方法においては適さない。また、カルボキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、酸アミド基等も考慮されるが、これらを反応させるとアミノ基も同時に反応してしまうことが多く、さらに、これらの官能基を修飾しても核酸分解酵素の構造に著しい影響を与えて完全に失活させられるとはいい難いため、標的としては好ましくない。一方、蛋白質に含まれるシステイン残基のスルホヒドリル（ＳＨ）基に特異的に作用する修飾試薬の場合、核酸はＳＨ基を有さないことから、核酸に影響を与えることなく核酸分解酵素の立体構造を不可逆的に変性させることが可能であり、好ましい。
【００２２】
このようなＳＨ基に特異的に作用する修飾試薬は特に限定されないが、次の表１に示されるように、アルキル化、二重結合への付加、アリル化反応等を起こす各種の試薬が挙げられる。
【００２３】
【表１】

【００２４】
これらの試薬による反応は、すべてがスルホヒドリル基に特異的なものではないが、ｐＨ、温度、試薬濃度等の条件を適宜設定することによりスルホヒドリル基に特異的に反応させることができる。一般に、核酸の抽出は通常ｐＨ　８〜９で室温下で行われることから、同様の条件下でスルホヒドリル基に対して特異的にアルキル化反応するアルキル化剤、具体的には、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、およびそれらのアミド、Ｎ−（４−ヨードフェニル）ヨードアセトアミド、４−ブロモアセトアミド−２−ニトロフェノール、２，２’−ジカルボキシ−４’−ヨードアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、β−ブロモエチルアミン、ヨウ化メチル、エチレンイミン、ω−クロロアセトフェノン、メチル−ｐ−ニトロベンゼンスルホン酸、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）（ＴＡＰ２−Ｂｒ）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド（ＴＡＰ−Ｂｒ）、およびブロモコハク酸等の試薬が好ましい。以上の各種試薬の中でも、室温、ｐＨ　８付近でＳＨ基と反応するヨード酢酸やシステインプロテアーゼインヒビターとして知られるヨードアセトアミドがとくに好ましい。酸は溶液のｐＨに影響されやすいことから、入手や取扱いも比較的容易なα−ヨードアセトアミドが好ましく例示される。また、α−ヨードプロピオンアミドもＳＨ基への反応特異性が高いが、反応速度はα−ヨードアセトアミドの方が速い。
【００２５】
このようなアルキル化剤は、前記のとおり核酸の抽出条件においてＳＨ基に対する特異性を示すため好適である。例えば、モノヨード酢酸とそのアミドの反応は、高濃度の試薬および高温といった過酷な条件下ではメチオニン、ヒスチジン、あるいはリジンの側鎖とも反応するが、室温、ｐＨ　９前後では主にＳＨ基と反応することが知られている。（例えば、Ａｎｆｉｎｓｅｎらは、ｐＨ　８．５、室温下、２時間の反応では、モノヨード酢酸塩がポリリジンのアミノ基やヒスチジンのイミダゾール基をアルキル化しないことを確認している（Ａｎｆｉｎｓｅｎ，　Ｃ．Ｂ．　（１９５８）　”Ｓｙｍｏｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”　ｅｄ．　ｂｙ　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，　Ａ．　ｐ．２２３，　Ｍａｔｈｕｅｎ，　Ｌｏｎｄｏｎ；　Ｓｅｌａ，　Ｍ．，　Ｗｈｉｔｅ，　Ｆ．Ｈ．　ａｎｄ　Ａｎｆｉｎｓｅｎ，　Ｃ．Ｂ．　（１９５９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　３１，　４１７）。）さらに、α−ヨードプロピオン酸およびα−ヨードプロピオンアミドはモノハロゲン化酸の中では最もスルホヒドリル基に対する特異性が高い。アミドは酸に比べて反応が４０倍遅くなるが、特異性は２倍になることが知られている（Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｅｉｓｅｌｅ，　Ｂ．　（１９６８）　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　４１，　４７１）。
【００２６】
ＳＨ基を修飾する方法としては、表１に示されるように、上記のとおりのアルキル化剤を用いるアルキル化反応以外にも、有機水銀化合物を用いるメルカプチド形成、Ｎ−エチルマレイミドによる二重結合への付加反応等が挙げられる。しかし前者は試薬の多くが水銀や砒素を含有するため安全性の面で配慮を要し、後者はｐＨ　８〜９の範囲でアミノ基とも反応するためＳＨ基特異性が低い（Ｋａｌａｎ，　Ｓ．Ｂ．，　Ｎｅｉｓｔａｄｔ，　Ａ．　ａｎｄ　Ｗｅｉｌ，　Ｌ．　（１９６５）　Ｆｅｄ．　Ｐｒｏｃ．　２４，　２２５）という問題点を有する。さらに、アリル化、酸化、チオール−ジスルフィド交換反応、スルフェニル化などの反応は可逆的である場合が多い。しかし、本発明では、核酸抽出とＳＨ基に対する特異的修飾が同様の条件下で進行するような最適条件が見出せれば、これらの試薬も十分に利用可能である。
【００２７】
本発明の核酸の分解防止方法は、以上のとおりの（ａ）および（ｂ）で示される工程を有するものであればよいが、これら以外にも、洗浄工程、培養工程、攪拌工程、遠心工程、ろ過工程、吸着工程、溶出工程、分別工程、クロマトグラフィー工程等を有していてもよい。また、上記の（ａ）と（ｂ）は別々の操作として、連続的に行ってもよいし、核酸溶液を含有する容器中にジスルフィド結合解裂試薬と修飾試薬の両方を同時に添加し、核酸分解酵素の解裂反応と形成されたＳＨ基の修飾反応が同一容器内でほぼ同時に進行するようにしてもよい。
【００２８】
この出願の発明では、以上のとおりの核酸の分解防止方法に基づき、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出したり、抽出された核酸を保存したりする方法も提供する。すなわち、核酸分解酵素のジスルフィド結合を予め解裂させ、スルホヒドリル基を形成させるためのジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬を少なくとも１種ずつ核酸溶液中に共存させることにより、精製工程により除去しきれずに共存している核酸分解酵素や周辺環境から混入した核酸分解酵素による核酸の分解を防止することが可能となり、抽出操作中や保存期間中に貴重な核酸が分解することがなくなる。
【００２９】
もちろん、本発明の核酸の抽出操作においては、細胞を溶解し、含有される蛋白質を可溶化する工程等の通常の操作が含まれていてもよい。また、本発明の核酸の保存方法は、予め通常の操作により核酸の精製等を行った後、得られた核酸溶液に対して実施されるものであってよい。
【００３０】
この出願の発明は、さらに、以上のとおりの方法により核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら核酸を抽出するための核酸抽出用キットと、抽出された核酸が核酸分解酵素により分解されることを防止しながら該核酸を保存するための核酸保存用キットをも提供する。これらのキットは、核酸分解酵素の作用を不可逆的に抑制するために、少なくとも
（ａ）核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基とすることのできるジスルフィド結合解裂試薬と
（ｂ）該スルホヒドリル基を選択的に修飾できる修飾試薬
を含有するものであればよく、その他の構成成分はとくに限定されない。例えば、抽出用キットの場合には、細胞を溶解させ、細胞内の蛋白質を可溶化するための可溶化剤を始めとする細胞溶解液や界面活性剤、ｐＨ調製のための緩衝液、溶媒としての滅菌水やアルコール等を含有していてもよい。また、保存用キットは、例えば安定化のための緩衝液や塩類、溶媒としての滅菌水やアルコール等を含むものであってもよい。さらに、これらのキットは、抽出操作のための容器やピペッター、あるいは保存のためのバイアル瓶や蓋等を含んでいてもよい。
【００３１】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明する。もちろん、この出願の発明は、以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３２】
【実施例】
＜実施例１＞
（１）膵臓組織からのＲＮＡ抽出
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雄）から膵臓を摘出し、液体窒素にて凍結した後、なるべく融解しない状態で膵臓を約３０　ｍｇの大きさに刻み、以下の組成を有する溶解液Ａを加えて組織片をホモジナイザーにより粉砕した。
【００３３】
〔溶解液Ａ〕
４　Ｍ　　グアニジンイソチオシアネート
５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．０
１０　ｍＭ　　エチレンジアミン四酢酸
０．５　％（ｗ／ｖ）　ラウリルザルコシンナトリウム
０．１４　Ｍ　β−メルカプトエタノール
得られたＲＮＡ溶液に等量の７０％エタノールを加え、シリカマトリックス（ＱＩＡＧＥＮ社　Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐ（登録商標））に吸着させ、洗浄して溶出した。
【００３４】
溶出液中のＲＮＡは、２６０　ｎｍおよび２８０　ｎｍにおける吸光度測定により定量した。
（２）ＲＮＡの静置処理
回収したＲＮＡ２０μｇに〔２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　８．４）、２　ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、５０　ｍＭ　ＫＣｌ、２０　ｕｎｉｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ〕（１００μｌ）を加え、室温下で１５分間、または３７℃で１時間静置して混入している染色体由来のＤＮＡを消化した。
【００３５】
さらに２５　ｍＭエチレンジアミン四酢酸（１１μｌ）を加えて反応を停止し、６５℃で１０分間静置することによりＤＮａｓｅ　Ｉを失活させた。３　Ｍ酢酸ナトリウム（１１μｌ）を加え、さらに２．５倍量のエタノールを加えた後、ドライアイス中に１５分置いてＲＮＡを沈殿させた。
【００３６】
遠心により沈殿を回収し、該沈殿をジエチルピロ炭酸処理した超純水２０μｌに溶解した。これを一部採取して２６０　ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの定量を行った。
（３）ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動
ＲＮＡを〔３−［Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）、４　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）１．６　ｍＭエチレンジアミン四酢酸、６％ホルムアミド、０．１８　Ｍホルムアルデヒド、４％グリセロール〕（１６　ｍＭ）中に溶解し、６５℃で５分間処理して変性させた後、〔２０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、５　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）、１　ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．２２　Ｍホルムアルデヒド、１００　ｎｇ／ｍＬエチジウムブロマイド〕を含有する１．２％のアガロースゲルを用いて、５　Ｖ／ｃｍで２時間電気泳動を行い、泳動パターンの解析を行った。
【００３７】
図１に膵臓細胞から抽出した直後のＲＮＡ（ａ）、室温下１５分のＤＮａｓｅ　Ｉ処理を行った後（ｂ）、および３７℃下１時間のＤＮａｓｅ　Ｉ処理を行った後（ｃ）の電気泳動結果を示した。また、図１（ａ）〜（ｃ）では、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｐｒｅｐ（登録商標）キットを用いて精製したＲＮＡをスタンダードとして〔＋〕で表し、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡを〔−〕として比較した。さらに、溶解液Ａを用いた抽出後にヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を１０、５０、１００μＭ添加して調整したＲＮＡの電気泳動パターンを比較した。
【００３８】
膵臓細胞から抽出した直後のＲＮＡでは、市販のキットを用いて抽出した場合と溶解液Ａを用いて抽出した場合、さらに、溶解液Ａを用いて抽出した後各濃度のＩＡＭを添加した場合とで、いずれも同等の電気泳動パターンが得られた。（図１ａ）
一方、ＲＮＡを室温下１５分のＤＮａｓｅ　Ｉ処理した場合では、市販のキットで精製したＲＮＡの電気泳動パターンにおいて低分子の位置が明るく染色され、若干の断片化が進行していることが確認された。また、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡの電気泳動パターンにおいて、ＩＡＭを添加しなかったものでは分解がかなり進んでいることが確認された。しかし、１０　ｍＭのＩＭＡを加えたものでは市販のキットを用いて抽出したＲＮＡと同程度に分解が抑えられ、ＩＭＡを５０　ｍＭおよび１００　ｍＭ加えた場合では市販のキットで抽出したＲＮＡよりも高分子量の位置のバンドがはっきりと認められた。（図１ｂ）
さらに、ＲＮＡを３７℃で１時間静置してＤＮａｓｅ　Ｉ処理した場合には、市販のキットを用いて抽出したＲＮＡにかなりの分解が見られた。また、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡでも、ＩＡＭを添加しなかった場合にＲＮＡが著しく分解し、低分子のみとなった。ＩＡＭを１０　ｍＭを加えた場合には、市販のキットを用いて抽出したＲＮＡと同等の分解が見られた。しかし、ＩＡＭを５０　ｍＭおよび１００　ｍＭ添加した場合には、３７℃で１時間静置した後も分解がほとんど見られなかった。（図１ｃ）
膵臓のようにリボヌクレアーゼの豊富な臓器の細胞からＲＮＡを調製しようとする場合、最終調製票品にリボヌクレアーゼが非常に混入しやすく、混入したリボヌクレアーゼは抽出操作直後には活性を示さないものの、保存期間中に徐々に活性を表し、抽出したＲＮＡを損なう恐れがある。
【００３９】
以上の実施例より、この出願の発明のＲＮＡの抽出方法を適用することにより、混入するリボヌクレアーゼを完全に除去できない場合でも、リボヌクレアーゼを不可逆的に失活させることが可能となり、３７℃においても抽出されたＲＮＡを安定に保存できることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
以上、詳しく説明したとおり、この出願の発明により、核酸分解酵素による核酸の分解を不可逆的に阻止する簡便な方法が提供される。また、この出願の発明により、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら核酸を抽出する方法や抽出された核酸を保存する有効な方法が提供される。
【００４１】
この出願の発明の核酸の分解防止方法では、核酸分解酵素に含まれ、核酸中には存在しないＳＨ基を特異的に修飾して核酸分解酵素を不可逆的に失活させるため、抽出された核酸中に微量の核酸分解酵素が残存していたり、外部環境から核酸分解酵素が混入したりしても、抽出操作後や保存期間中の核酸分解が効果的に防止される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の実施例において、本願発明の核酸の分解防止方法を用いて膵臓からＲＮＡを抽出した際の電気泳動結果を示した図である。（ａ：抽出直後、ｂ：ＤＮａｓｅ　Ｉにより室温下で１５分間処理後、ｃ：ＤＮａｓｅ　Ｉにより３７℃下で１時間処理後；＋：スタンダード、−：溶解液Ａ使用）[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application relates to the decomposition of a nucleic acid for preventing the nucleic acid from being decomposed by a nuclease contained in a lysate when extracting a nucleic acid from a cell or storing a nucleic acid extracted from a cell. It concerns prevention methods. In addition, the invention of this application relates to a method for extracting nucleic acids from cells while preventing the degradation of nucleic acids by a nuclease, and a method for storing the extracted nucleic acids. Furthermore, the invention of this application relates to a kit for extracting nucleic acids and a kit for storing nucleic acids.
[0002]
[Prior art and its problems]
In recent years, with the development of genetic engineering, techniques for extracting nucleic acids, particularly RNA from cells and tissues, and performing processes such as analysis, diagnosis, mutation, and amplification have been established. However, since cells and tissues contain nucleases such as ribonuclease, there has been a problem that nucleic acids are often decomposed during the extraction operation.
[0003]
Therefore, in the nucleic acid extraction operation, after denaturing and solubilizing the nuclease using guanidine isothiocyanate, a surfactant such as sodium lauryl sarcosine is added, and the nuclease is reduced with β-mercaptoethanol. Nucleolytic enzymes were denatured to prevent nucleic acid degradation. However, in such a conventional nucleic acid extraction method, since the denaturation of the nuclease is caused by a reversible reduction reaction, the nuclease is reactivated by elapse of time or purification of the nucleic acid, and the decomposition of the nucleic acid proceeds. There was a problem. In other words, over time, the oxidation-reduction reaction reaches an equilibrium due to the action of oxygen or the like in the air, or the oxidation reaction becomes superior to the reduction reaction because the reducing agent or the like is removed in the purification step. Then, the nuclease is reconstituted and becomes active, and the nucleic acid is decomposed.
[0004]
Furthermore, since nucleases are also contaminated by bacteria in the air, hair and skin of workers, etc., the extraction operation must be carefully performed, and it is essential to promptly move to the next step after extraction. . Therefore, in the operation of extracting a nucleic acid from a precious sample, protecting the sample from the nuclease has been the biggest problem.
[0005]
Digestion with protease K is known as a method for inactivating coexisting or contaminating nucleases, but protease K is also a protein, so it undergoes solubilization and reduction and is inactivated in the same manner as nucleolytic enzymes. There was a problem. For this reason, digestion with protease K is generally performed under a dilution condition containing only a trace amount of a solubilizing agent or a reducing agent. In such a diluted solution, the nuclease is also active, thus preventing the degradation of the nucleic acid. It is difficult to say that it is an effective means for doing so.
[0006]
The invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and has as its object to solve the problems of the prior art and to provide a simple method for reliably preventing the degradation of nucleic acids by nucleases. And Another object of the invention of this application is to provide an efficient method for extracting nucleic acids while preventing nucleic acid degradation by a nuclease and an effective method for storing the extracted nucleic acids.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The invention of this application solves the problems as described above. First, a method for preventing the degradation of nucleic acids by a nuclease during the extraction and / or storage of nucleic acids from cells. A method for preventing nucleic acid degradation, comprising at least a step of cleaving a disulfide bond in a nucleolytic enzyme to form a sulfohydryl group, and a step of selectively modifying the sulfohydryl group. .
[0008]
Secondly, the invention of this application relates to the cleavage of a disulfide bond in a nuclease by β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphate, hydrogen Thirdly, the method for preventing nucleic acid degradation performed using a reagent selected from sodium borohydride and sulfite is described below. The third method is to selectively modify a sulfohydryl group with a modifying reagent selected from a monohalogenated acid and an acid amide thereof. And fourthly, the selective modification of the sulfhydryl group can be carried out using iodoacetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ', N', N'-pentame Le -1,3 propanedioic (ammonium bromide), provides (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, and the prevention methods of nucleic acid degradation performed using a modified reagent selected from the group consisting of bromosuccinimide.
[0009]
Fifth, the invention of this application is a method for extracting nucleic acids from cells while preventing the degradation of nucleic acids by nucleases, the method comprising at least a step of lysing the cells and a method for lysing the cells. Cleaving a disulfide bond of the nuclease to be formed to form a sulfhydryl group, and selectively modifying the sulfhydryl group
There is provided a nucleic acid extraction method characterized by having the following.
[0010]
Sixth, the invention of this application is based on the invention that the cleavage of disulfide bond in nuclease is carried out by β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphate, borohydride Seventh, the nucleic acid extraction method described above is performed using a reagent selected from sodium and sulfite. Seventh, the selective modification of a sulfhydryl group is performed using a modifying reagent selected from a monohalogenated acid and an acid amide thereof. Either of the nucleic acid extraction methods described above, and eighthly, the modification of the sulfhydryl group can be performed by modifying iodoacetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3- Bromopropyl) -N, N, N ', N', N'-pentamethyl-1, - propanedioic (ammonium bromide), to provide the method for nucleic acid extraction performed by using a modifying reagent selected from the group consisting of (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, and bromosuccinimide.
[0011]
Ninth, the invention of the present application is a method for preserving nucleic acids extracted from cells while preventing the degradation of nucleic acids by a nuclease, and at least a method for decomposing nucleic acids contained in a nucleic acid solution. A nucleic acid characterized in that the nucleic acid is stored in a storage solution containing a disulfide bond-cleaving reagent that cleaves a disulfide bond of an enzyme to form a sulfhydryl group and a modifying reagent that selectively modifies the sulfhydryl group. Provide a storage method.
[0012]
Tenthly, the invention of this application is directed to a method wherein the disulfide bond-cleaving reagent is β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphoric acid, sodium borohydride and sulfite. Eleventh, the nucleic acid storage method wherein the modifying reagent is selected from monohalogenated acids and acid amides, and twelfth, the modifying reagent is iodoacetic acid, iodoacetic acid. Acetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′, N′-pentamethyl-1,3-propanedi ( Ammonium bromide), (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, Wherein it is selected from the group consisting of finely bromosuccinimide to provide any of the nucleic acid preservation method.
[0013]
The invention of this application is also thirteenth, a kit for extracting nucleic acids from cells while preventing the degradation of nucleic acids by nucleases, which at least cleaves disulfide bonds of the nucleases, A kit comprising a disulfide bond cleavage reagent for forming a sulfohydryl group and a modification reagent for selectively modifying the sulfohydryl group. A kit for preserving nucleic acids extracted from cells while preventing the dissociation, at least a disulfide bond cleavage reagent for cleaving a disulfide bond of a nuclease and forming a sulfohydryl group, and the sulfohydryl group And a kit comprising a modifying reagent for selectively modifying a kit.
[0014]
Further, the invention of the present application is based on the fifteenth aspect, wherein the disulfide bond-cleaving reagent is β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphoric acid, sodium borohydride and Any one of the kits selected from sulfites, sixteenth, any one of the kits wherein the modifying reagent is selected from monohalogenated acids and acid amides thereof, and seventeenth, the modifying reagent is iodine. Acetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′, N′-pentamethyl-1,3 -Propanedi (ammonium bromide), (3-bromopropyl) trimethylammonium Muburomido, and is selected from the group consisting of bromosuccinimide to provide any of the above kit.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The inventor of the present application has focused on the point that it is effective to change the conformation in order to inactivate the nuclease, and studied a method for irreversibly causing such a conformational change. did. Then, they found a method that acts on nuclease, which is a protein, and does not act on nucleic acids such as DNA and RNA, and has reached the present invention.
[0016]
Proteins such as nucleases have cysteine (Cys). Cysteine is an amino acid having a sulfohydryl (SH) group in the side chain. Two cysteines existing in the protein sequence form a disulfide (SS) bond with each other to form a complex steric structure and stabilize. Let it. In addition, an activity corresponding to each protein is expressed by such a three-dimensional structure.
[0017]
In a nucleic acid extraction operation, generally, a nuclease is reduced, and a disulfide bond is cleaved to form a sulfhydryl group (SH), thereby changing a steric structure and inactivating the same. However, as described above, even if SH is formed on the cysteine side chain by reduction, the oxidation reaction proceeds due to reaction equilibrium and removal of the reducing agent, so that a disulfide bond is formed again and the nuclease is activated. I will show you.
[0018]
Therefore, in the method for preventing nucleic acid degradation of the invention of this application, nuclease is inactivated irreversibly by preventing re-formation of disulfide bonds.
[0019]
That is, the method for preventing nucleic acid degradation of the invention of this application
(A) cleaving a disulfide bond in a nuclease to form a sulfhydryl group;
(B) a step of selectively modifying the sulfhydryl group
Which is characterized by having
[0020]
In the method for preventing decomposition of a nucleic acid according to the present invention, the step of cleaving disulfide bonds to form a sulfhydryl group can be performed using various reagents. Specifically, a method of reducing and cleaving disulfide bonds with β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphoric acid, and sodium borohydride, and sulfites Exemplifies a method for cleaving a disulfide bond. In particular, dithiothreitol and dithioerythritol efficiently cleave disulfide bonds. Further, β-mercaptoethanol and β-mercaptoethylamine can also efficiently cleave disulfide bonds. Among them, β-mercaptoethanol is preferred because it is inexpensive and easy to handle.
[0021]
In the method for preventing nucleic acid degradation of the present invention, the reagent for selectively modifying the sulfohydryl group is not particularly limited. In general, many protein modification reagents target an amino group, but the amino group is also present in nucleic acids, and thus is not suitable for the method of the present invention. In addition, carboxyl groups, guanidyl groups, imidazole groups, acid amide groups, etc. are also considered, but when these are reacted, amino groups often react simultaneously, and further, even if these functional groups are modified, nucleic acids may be modified. Since it is difficult to say that the enzyme is significantly inactivated by significantly affecting the structure of the degrading enzyme, it is not preferable as a target. On the other hand, in the case of a modification reagent which specifically acts on the sulfhydryl (SH) group of a cysteine residue contained in a protein, since the nucleic acid has no SH group, the three-dimensional structure of the nuclease is not affected without affecting the nucleic acid. Can be irreversibly denatured, which is preferable.
[0022]
There are no particular limitations on the modifying reagents that specifically act on such SH groups, and as shown in Table 1 below, various reagents that cause alkylation, addition to a double bond, allylation reaction, and the like are listed. Can be
[0023]
[Table 1]

[0024]
The reaction with these reagents is not all specific to sulfhydryl groups, but can be caused to react specifically with sulfhydryl groups by appropriately setting conditions such as pH, temperature, and reagent concentration. In general, nucleic acid extraction is usually performed at room temperature at a pH of 8 to 9, and therefore, an alkylating agent specifically alkylating a sulfohydryl group under the same conditions, specifically, iodoacetic acid, bromoacetic acid, and the like. Acetic acid, chloroacetic acid and their amides, N- (4-iodophenyl) iodoacetamide, 4-bromoacetamido-2-nitrophenol, 2,2′-dicarboxy-4′-iodoacetamide, α-iodopropionic acid , Α-iodopropionamide, β-bromoethylamine, methyl iodide, ethyleneimine, ω-chloroacetophenone, methyl-p-nitrobenzenesulfonic acid, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′ , N'-Pentamethyl-1,3-propanedi (ammonium bromide) (TAP2-Br), (3-bromopropyl) Trimethyl ammonium bromide (TAP-Br), and a reagent such as bromosuccinimide is preferred. Among the various reagents described above, iodoacetic acid which reacts with SH groups at room temperature and around pH 8 and iodoacetamide known as a cysteine protease inhibitor are particularly preferable. Since the acid is easily affected by the pH of the solution, α-iodoacetamide, which is relatively easy to obtain and handle, is preferably exemplified. Also, α-iodopropionamide has a high reaction specificity for SH groups, but α-iodoacetamide has a higher reaction rate.
[0025]
Such an alkylating agent is suitable because it exhibits specificity to SH groups under the conditions for extracting nucleic acids as described above. For example, the reaction of monoiodoacetic acid and its amide reacts with methionine, histidine, or lysine side chains under severe conditions such as high concentration of reagents and high temperature, but mainly reacts with SH groups at room temperature and around pH 9. It is known. (For example, Anfinsen et al. Have confirmed that monoiodoacetate does not alkylate the amino group of polylysine or the imidazole group of histidine in a reaction at pH 8.5 and room temperature for 2 hours (Anfinsen, CB). (1958) "Symoposium on Protein Structure" ed. By Neuberger, Ap.223, Mathhuen, London; Sela, M., White, F.H.B.i.B.B.C. Acta, 31, 417)) Furthermore, α-iodopropionic acid and α-iodopropionamide have the highest specificity for sulfohydryl groups among monohalogenated acids. Amides are known to be 40 times slower in reaction than acids, but twice as specific (Wallenfelds, K. and Eisele, B. (1968) Eur. J. Biochem. 41, 471). .
[0026]
As a method for modifying the SH group, as shown in Table 1, in addition to the alkylation reaction using an alkylating agent as described above, mercaptide formation using an organic mercury compound, double bond formation by N-ethylmaleimide, And the like. However, the former requires much attention in terms of safety because many of the reagents contain mercury and arsenic, and the latter has low SH group specificity because it also reacts with amino groups in the pH range of 8-9 (Kalan, S. et al. B., Neistadt, A. and Weil, L. (1965) Fed. Proc. 24, 225). Further, reactions such as allylation, oxidation, thiol-disulfide exchange reaction, and sulfenylation are often reversible. However, in the present invention, these reagents can also be used sufficiently if optimal conditions can be found under which the nucleic acid extraction and the specific modification to the SH group proceed under similar conditions.
[0027]
The method for preventing nucleic acid degradation of the present invention may be any method having the steps (a) and (b) as described above. In addition to these, a washing step, a culture step, a stirring step, a centrifugation step , A filtration step, an adsorption step, an elution step, a fractionation step, a chromatography step, and the like. Further, the above (a) and (b) may be performed continuously as separate operations, or both the disulfide bond-cleaving reagent and the modifying reagent may be simultaneously added to a container containing a nucleic acid solution, and The cleavage reaction of the degrading enzyme and the modification reaction of the formed SH group may proceed almost simultaneously in the same container.
[0028]
In the invention of this application, based on the above-described method for preventing nucleic acid degradation, a method for extracting nucleic acids from cells while preventing the degradation of nucleic acids by nucleases and for storing the extracted nucleic acids is also provided. . That is, a disulfide bond of a nuclease is previously cleaved, and a disulfide bond-cleaving reagent for forming a sulfohydryl group and at least one modification reagent for selectively modifying the sulfohydryl group are contained in a nucleic acid solution. By coexisting, it is possible to prevent the degradation of nucleic acids by coexisting nucleases and nucleolytic enzymes contaminated from the surrounding environment that cannot be completely removed by the purification process, and are valuable during the extraction operation and during the storage period. The nucleic acid is not degraded.
[0029]
Of course, the extraction operation of the nucleic acid of the present invention may include a normal operation such as a step of lysing the cells and solubilizing the contained protein. In addition, the method for storing a nucleic acid of the present invention may be a method for purifying a nucleic acid by a usual operation in advance, and then performing the method on the obtained nucleic acid solution.
[0030]
The invention of this application further provides a nucleic acid extraction kit for extracting a nucleic acid while preventing the nucleic acid from being decomposed by the nuclease by the method described above, and the extracted nucleic acid being decomposed by the nuclease. Also provided is a nucleic acid storage kit for storing the nucleic acid while preventing the nucleic acid. These kits are designed to at least irreversibly inhibit the action of nucleases,
(A) a disulfide bond cleavage reagent capable of cleaving a disulfide bond in a nuclease to form a sulfohydryl group;
(B) a modifying reagent capable of selectively modifying the sulfhydryl group
And any other constituents are not particularly limited. For example, in the case of an extraction kit, cells are lysed and cell lysates and surfactants such as solubilizers for solubilizing intracellular proteins, surfactants, buffers for pH adjustment, and solvents are used. Sterilized water or alcohol. The storage kit may contain, for example, a buffer or salt for stabilization, sterilized water or alcohol as a solvent, and the like. Further, these kits may include a container or pipettor for an extraction operation, or a vial or a lid for storage.
[0031]
Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail with reference to examples. Needless to say, the invention of this application is not limited to the following embodiments.
[0032]
【Example】
<Example 1>
(1) RNA extraction from pancreatic tissue
The pancreas was excised from a BALB / c mouse (6 weeks old, male), frozen in liquid nitrogen, and the pancreas was chopped to a size of about 30 mg without melting as much as possible. In addition, the tissue pieces were ground with a homogenizer.
[0033]
[Solution A]
4M guanidine isothiocyanate
50 mM Tris-HCl pH 8.0
10 mM ethylenediaminetetraacetic acid
0.5% (w / v) lauryl sarcosine sodium
0.14 M β-mercaptoethanol
An equal amount of 70% ethanol was added to the obtained RNA solution, and the RNA solution was adsorbed on a silica matrix (Reasy Mini prep (registered trademark), QIAGEN), washed and eluted.
[0034]
RNA in the eluate was quantified by measuring absorbance at 260 nm and 280 nm.
(2) Static treatment of RNA
To 20 μg of the recovered RNA, add [20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2 mM MgCl 2 ₂ , 50 mM KCl, 20 unit DNase I] (100 μl), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes or at 37 ° C. for 1 hour to digest the contaminating chromosome-derived DNA.
[0035]
Further, 25 mM ethylenediaminetetraacetic acid (11 μl) was added to stop the reaction, and DNase I was inactivated by leaving still at 65 ° C. for 10 minutes. After adding 3 M sodium acetate (11 μl) and further adding 2.5-fold amount of ethanol, the RNA was precipitated on dry ice for 15 minutes.
[0036]
The precipitate was recovered by centrifugation, and the precipitate was dissolved in 20 μl of ultrapure water treated with diethylpyrocarbonate. A portion of this was collected and the absorbance at 260 nm was measured to quantify RNA.
(3) Agarose gel electrophoresis of RNA
RNA was converted to [3- [N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS), 4 mM sodium acetate (pH 7.0), 1.6 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 6% formamide, 0.18 M formaldehyde, 4% glycerol] (16 mM, 5 mM sodium acetate (pH 7.0), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.22 M formaldehyde, 100 ng / ML ethidium bromide], electrophoresis was performed at 5 V / cm for 2 hours using a 1.2% agarose gel, and the migration pattern was analyzed.
[0037]
In FIG. 1, the RNA immediately after extraction from pancreatic cells (a), the DNase I treatment at room temperature for 15 minutes (b), and the electricity after DNase I treatment at 37 ° C. for 1 hour (c) The electrophoresis results are shown. In addition, in FIGS. 1A to 1C, RNA purified using RNeasy Mini Prep (registered trademark) kit of QIAGEN is represented by [+] as a standard, and RNA extracted using the lysis solution A is represented by [ −]. Furthermore, after extraction using the lysis solution A, the electrophoresis patterns of RNA prepared by adding 10, 50, and 100 μM of iodoacetamide (IAM) were compared.
[0038]
RNA immediately after extraction from pancreatic cells was extracted using a commercially available kit, extracted using lysate A, and further extracted with lysate A and then added with each concentration of IAM. In each case, the same electrophoresis pattern was obtained. (FIG. 1a)
On the other hand, when the RNA was treated with DNase I for 15 minutes at room temperature, low molecular positions were brightly stained in the electrophoresis pattern of RNA purified with a commercially available kit, and it was confirmed that some fragmentation had progressed. Was. In addition, in the electrophoresis pattern of the RNA extracted using the lysis solution A, it was confirmed that degradation was considerably advanced in the case where IAM was not added. However, when IMA at 10 mM was added, degradation was suppressed to the same degree as RNA extracted using a commercially available kit. When IMA was added at 50 mM and 100 mM, RNA was higher than that at RNA extracted with a commercial kit. A band at the molecular weight position was clearly observed. (FIG. 1b)
Furthermore, when the RNA was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour and treated with DNase I, considerable degradation was observed in the RNA extracted using a commercially available kit. In addition, even in the case of RNA extracted using the lysis solution A, the RNA was significantly degraded when IAM was not added, and only RNA was reduced. When 10 mM of IAM was added, degradation equivalent to that of RNA extracted using a commercially available kit was observed. However, when IAM was added at 50 mM and 100 mM, almost no degradation was observed even after the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. (FIG. 1c)
When RNA is to be prepared from cells of a ribonuclease-rich organ such as the pancreas, ribonuclease is very easily contaminated in the final preparation, and the contaminated ribonuclease does not show activity immediately after the extraction operation, but the storage period There is a risk that the RNA gradually becomes active during the process and damages the extracted RNA.
[0039]
From the above examples, it is possible to irreversibly inactivate ribonuclease even when contaminating ribonuclease cannot be completely removed by applying the method for extracting RNA of the present invention of the present application. It was confirmed that the prepared RNA could be stably stored.
[0040]
【The invention's effect】
As described in detail above, the invention of this application provides a simple method for irreversibly inhibiting the degradation of nucleic acids by nucleases. Further, the invention of the present application provides a method for extracting a nucleic acid while preventing the nucleic acid from being decomposed by a nuclease, and an effective method for storing the extracted nucleic acid.
[0041]
In the method for preventing degradation of a nucleic acid of the invention of the present application, since the SH group contained in the nuclease and not present in the nucleic acid is specifically modified to inactivate the nuclease, the extracted nucleic acid is Even if a trace amount of nucleolytic enzyme remains therein or nuclease is mixed in from the external environment, nucleolytic degradation after the extraction operation or during the storage period is effectively prevented.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of electrophoresis when RNA was extracted from pancreas using the method for preventing nucleic acid degradation of the present invention in the examples of the present invention. (A: Immediately after extraction, b: After treatment with DNase I at room temperature for 15 minutes, c: After treatment with DNase I at 37 ° C. for 1 hour; +: Standard, −: Use solution A)

Claims

A method for preventing degradation of a nucleic acid by a nuclease at the time of extraction and / or storage of a nucleic acid from a cell, wherein at least a step of cleaving a disulfide bond in the nuclease to form a sulfhydryl group,
A method for preventing nucleic acid degradation, comprising a step of selectively modifying the sulfohydryl group.

Cleavage of a disulfide bond in a nuclease is performed by using a reagent selected from β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphate, sodium borohydride and sulfite. 2. The method for preventing decomposition of a nucleic acid according to claim 1, wherein the method is performed using the method.

3. The method for preventing degradation of a nucleic acid according to claim 1, wherein the selective modification of the sulfhydryl group is performed using a modifying reagent selected from a monohalogenated acid and an acid amide thereof.

Selective modification of the sulfhydryl group can be performed by using iodoacetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′. 3. The method according to claim 1, wherein the modification is performed using a modifying reagent selected from the group consisting of N, N'-pentamethyl-1,3-propanedi (ammonium bromide), (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, and bromosuccinic acid. For preventing the decomposition of nucleic acids.

A method for extracting nucleic acids from cells while preventing the degradation of nucleic acids by a nuclease, at least,
Lysing the cells,
Cleaving the disulfide bond of the nuclease contained in the lysate obtained by lysing the cells, and forming a sulfhydryl group,
A method for extracting a nucleic acid, comprising a step of selectively modifying the sulfohydryl group.

Cleavage of a disulfide bond in a nuclease is performed by using a reagent selected from β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphate, sodium borohydride and sulfite. The method for extracting nucleic acid according to claim 5, wherein the method is performed using the method.

7. The nucleic acid extraction method according to claim 5, wherein the selective modification of the sulfhydryl group is performed using a modifying reagent selected from a monohalogenated acid and an acid amide thereof.

Selective modification of the sulfhydryl group can be performed by using iodoacetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′. 7. The method according to claim 5, wherein the modification is performed using a modifying reagent selected from the group consisting of N, N'-pentamethyl-1,3-propanedi (ammonium bromide), (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, and bromosuccinic acid. Nucleic acid extraction method.

A method for storing nucleic acids extracted from cells while preventing the degradation of nucleic acids by nucleases, which cleaves at least the disulfide bonds of the nucleases contained in the nucleic acid solution to form sulfohydryl groups A disulfide bond cleavage reagent;
A method for storing a nucleic acid, comprising storing the nucleic acid in a storage solution containing a modification reagent for selectively modifying the sulfhydryl group.

The nucleic acid storage according to claim 9, wherein the disulfide bond cleavage reagent is selected from β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphoric acid, sodium borohydride and sulfite. Method.

11. The method according to claim 9, wherein the modifying reagent is selected from a monohalogenated acid and an acid amide thereof.

Modification reagents include iodoacetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′, N′- The nucleic acid storage method according to claim 9 or 10, wherein the method is selected from the group consisting of pentamethyl-1,3-propanedi (ammonium bromide), (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, and bromosuccinic acid.

A kit for extracting nucleic acids from cells while preventing the degradation of nucleic acids by nucleases, which cleaves at least the disulfide bonds of the nucleases, and a disulfide bond cleavage reagent for forming a sulfhydryl group,
A kit comprising a modification reagent for selectively modifying the sulfohydryl group.

A kit for storing nucleic acids extracted from cells while preventing the degradation of nucleic acids by nucleases, which cleaves at least the disulphide bonds of the nucleases and disulfide bond cleavage to form sulfohydryl groups. Reagents,
A kit comprising a modification reagent for selectively modifying the sulfohydryl group.

The disulfide bond cleavage reagent is selected from β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, dithiothreitol, dithioerythritol, reduced glutathione, cysteine, monothiophosphoric acid, sodium borohydride and sulfite. Any kit.

The kit according to any one of claims 13 to 15, wherein the modifying reagent is selected from a monohalogenated acid and an acid amide thereof.

Modification reagents include iodoacetic acid, iodoacetamide, chloroacetic acid, chloroacetamide, α-iodopropionic acid, α-iodopropionamide, N- (3-bromopropyl) -N, N, N ′, N ′, N′- The kit according to any one of claims 13 to 15, wherein the kit is selected from the group consisting of pentamethyl-1,3-propanedi (ammonium bromide), (3-bromopropyl) trimethylammonium bromide, and bromosuccinic acid.