【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は可溶性フィブリンの高度精製法、特に高回収率及び高純度で、可溶性フィブリンを調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
可溶性フィブリンの調製方法は、一般的に血漿からエタノール分画法（Ｂｌａｍｂｅａｃｋ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ａｒｋ．Ｋｅｍｉ，１９５６； １０： ４１５−４３ ）などによってフィブリノゲンを精製し、１０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下、トロンビンあるいはバトロキソビン蛇毒により凝固させ、遠心分離操作により沈殿物を３．３Ｍ尿素溶液に溶解させ、可溶化したフィブリン溶液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）で透析する方法が用いられる。（ＭｃＣａｒｒｏｎ ＢＩ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９９； ８２： １４５−８ または Ｓｏｅ Ｇ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １９９６； ８８：２１０９−１７） または、さらに３．３Ｍ尿素溶液に生理的濃度の塩化ナトリウムを加えて可溶性フィブリンを重合させ、再度、３．３Ｍ尿素溶液で溶解させたのち、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）で透析する方法が用いられる。
【０００３】
この方法では、トロンビンまたはバトロキソビンによるフィブリンクロット形成の際にフィブリノゲン以外の夾雑タンパク質を抱き込み、純度の悪い可溶性フィブリンを得ることが欠点である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、可溶性フィブリンを高純度にそして高回収率で調製する方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、従来技術に対して、さらにグリシンによる分画操作を加えることで本発明の課題を解決出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、
１．フィブリンの調製工程において、可溶性フィブリンをグリシンと接触させ沈殿・回収することを特徴とする可溶性フィブリンの調製方法。
２．蛋白変性剤によって可溶化された可溶性フィブリンがグリシンで処理される前項１に記載の方法。
３．グリシン添加量が、２〜１０℃の温度下で、１〜３Ｍの濃度に調整される前項１または２に記載の方法。
４．処理ｐＨが４〜６に調整された前項３に記載の方法。
５．塩濃度を２５〜８０ｍＭに調整され前項３又は４に記載の方法。
６．原料血漿から精製したフィブリノゲンに１０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下、トロンビンあるいはバトロキソビン蛇毒を作用させてフィブリンを生成させ、分画操作で得た沈殿物を４〜１０Ｍ尿素溶液で溶解させ、ついでこれを緩衝液（ｐＨ４〜６）で調整し、この溶液に２５〜８０ｍＭの塩化ナトリウムを添加し、さらにグリシンを１〜３Ｍの濃度になるように添加して可溶性フィブリンを沈殿させ、その後回収する可溶性フィブリンの製造方法。
７．前項６の方法で調製されたｄｅｓＡＡＢＢフィブリン又はｄｅｓＡＡフィブリン。
８．前項７に記載の試料を構成試薬として含む検査用試薬。
からなる。
【０００７】
【発明の実施の態様】
本発明において”可溶性フィブリン”とは、フィブリン凝固が起こったフィブリン重合体を蛋白変性剤によって、架橋が切断され、さらに架橋形成による強固な凝固が制御された状態にあり、酸性ｐＨ（例えば３．５〜５．５）の条件下で水に実質的に可溶なフィブリンをいう。この可溶化状態のフィブリンに対して、さらに分画操作を本発明ではおこなう。分画は、グリシンと接触させ沈殿・回収する。この分画処理が施される可溶性フィブリンは、従前の技術によって調製されてもよい。その一般的な方法は、血漿からコーンのエタノール分画法（Ｃｏｈｎ ＥＪ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ １９４６： ６８； ４５９）でフィブリノゲン画分を回収し、これにトロンビン、バトロキソビンのような水解酵素処理でフィブリン化する。フィブリンは、そのまま放置すると血液凝固第１３因子、カルシウムイオンの作用で交差架橋反応を受け、重合化・凝固がおこりフィブリンクロットとなる。このクロット化したフィブリンを原料とする場合は、まず蛋白変性剤例えば尿素等で溶解、或はプラスミンのような酵素で溶解を行う。尿素処理の場合は、４〜１０Ｍ，好ましくは５〜８、より好ましくは５．５〜６．５Ｍの濃度で使用される。フィブリノゲン画分を精製し、トロンビンの作用でフィブリンを生成させたのち、凝固の制御下（抑制条件）で、本発明の以下のグリシン処理分画を行うことも可能である。
【０００８】
原料の可溶化された可溶性フィブリンは、グリシンで処理される。グリシンの添加に先立ち、溶液は塩濃度の調整をしておくことは好ましい。塩は特に限定されないが、一般的な無機塩が好適に利用され、例えば塩化ナトリウムが例示されるが、これに限定されない。塩濃度は、２５〜８０ｍＭ、好ましくは３０〜７０、より好ましくは４０〜６０ｍＭの濃度で使用される。グリシン添加量は、２〜１０℃の温度下で、１〜３Ｍ、好ましくは１．３〜２．５、より好ましくは１．５〜２Ｍの濃度で使用される。処理ｐＨは、４〜６、好ましくは４．２〜５．５、より好ましくは４．３〜５．０の濃度で使用される。
【０００９】
本発明では、原料血漿から精製したフィブリノゲンにトロンビンを作用させてフィブリンを生成させ、分画操作で得た沈殿物を４〜１０Ｍ尿素溶液で溶解させ、ついでこれを緩衝液（ｐＨ４〜６）で調整し、この溶液に２５〜８０ｍＭの塩化ナトリウムを添加し、さらにグリシンを１〜３Ｍの濃度になるように添加して可溶性フィブリンを沈殿させ、その後回収して可溶性フィブリンの製造方法を提供した。グリシンの添加は、低濃度から徐々に濃度を目的範囲まで上げていく方法が好ましく、例えば１．８Ｍまであげていく。この方法で調製されたフィブリンは、ｄｅｓＡＡＢＢフィブリンであった。
【００１０】
かくして提供される可溶性フィブリンの調製法は、高純度に高回収率で可溶性フィブリンを提供する手段であり、得られた可溶性フィブリンは医薬品としても検査用試薬としても極めて有用である。
【００１１】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１２】
【実施例１】
ヒト血漿よりＣｏｈｎの８％エタノール沈殿法に準じて粗フィブリノゲン画分を得る。これをＢｌａｍｂｅａｃｋ Ｂ ｅｔ ａｌ（Ａｒｋｉｖ Ｋｅｍｉ １９５６； １０： ４１５−４３）らの方法に準じてフィブリノゲン分画を得る。精製したフィブリノゲンはさらにリシンセファロースアフィニティーカラムクロマトグラフィーで混在するプラスミノゲンを除去する。なお、別の実施例としてさらにゼラチンセファロースアフィニティークロマトグラフィーでフィブロネクチンを除去した画分を用いることもできる。
この精製した２ｇ／ｌのフィブリノゲン溶液（１０ｍＬ）に１０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下、１００ＮＩＨ単位／ｍｌのヒトトロンビン５００μｌ（別の実施例として５０ＢＵ／ｍｌのバトロキソビン溶液５００μｌ処理でもよい）を作用させて遠心分離操作により凝固したフィブリン沈殿を得る。
これに３．３Ｍ尿素溶液１０ｍｌを混合させてフィブリンを溶解したのち、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）２００ｍｌで透析する。４℃下、透析内液に５０ｍＭ塩化ナトリウム添加し、さらにグリシンを２．０Ｍになるように徐々に添加し、沈査に可溶性フィブリンを得る。これを予め３０℃に加温した２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）１０ｍｌに溶解させる。本発明方法によれば、出発物質であるフィブリノゲンから得た可溶性フィブリンの純度を表１に示す。尚、タンパク質含量は、Ｌｏｗｒｙ法によって測定された値である。
【００１３】
表１ 可溶性フィブリン純度の比較
【００１４】
【実施例２】
本発明方法により得た可溶性フィブリンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のパターンを図１に示す。対象のフィブリノゲン（ｌａｎｅ１）との泳動度を比較すると、Ａα鎖およびＢβ鎖の分子量が少ないことと、ｄｅｓＡＡＢＢフィブリン（ｌａｎｅ２）を生成したことが示された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 泳動条件；
ゲル：７．５％ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ バイオラッド社）
泳動：５０Ｖｏｌｔ（３時間）
緩衝液：１９２ｍＭ Ｔｒｉｓ − ７２ｍＭ Ｇｌｙ − ０．０２ ＳＤＳ
染色：クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）
泳動装置：ＭＩＮＩ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＩ （バイオラッド社）
【００１５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により可溶性フィブリンを高純度に効率的に回収可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】還元処理されたフィブリノゲンと可溶性フィブリンを示す。還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ の図である。矢印は、上からα鎖、β鎖、γ鎖を意味する。
【符号の説明】
１： ＭＷ（分子量マーカー）
２： フィブリノゲン
３：本発明法
４：既存法[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for highly purifying soluble fibrin, particularly to a method for preparing soluble fibrin with high recovery and high purity.
[0002]
[Prior art]
In general, soluble fibrin is prepared by purifying fibrinogen from plasma by an ethanol fractionation method (Blambeak B et al. Ark. Kemi, 1956; 10: 415-43) and the like, and thrombin or batroxobin snake venom in the presence of 10 mM EDTA. And dissolving the precipitate in a 3.3 M urea solution by centrifugation, and dialyzing the solubilized fibrin solution with a 20 mM acetate buffer (pH 4.6). (McCarron BI et al. Thromb Haemost 1999; 82: 145-8 or Soe G et al. Blood 1996; 88: 2109-17) Alternatively, a 3.3 M urea solution is added with a physiological concentration of sodium chloride to dissolve soluble fibrin. Is polymerized, dissolved again with a 3.3 M urea solution, and then dialyzed against a 20 mM acetate buffer (pH 4.6).
[0003]
The disadvantage of this method is that when fibrin clots are formed by thrombin or batroxobin, contaminant proteins other than fibrinogen are entrapped to obtain poorly pure soluble fibrin.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for preparing soluble fibrin with high purity and high recovery.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that the subject of the present invention can be solved by adding a fractionation operation using glycine to the conventional technique, and have completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention
1. A method for preparing soluble fibrin, which comprises contacting soluble fibrin with glycine to precipitate and collect the fibrin in a fibrin preparation step.
2. 2. The method according to the above item 1, wherein the soluble fibrin solubilized by the protein denaturant is treated with glycine.
3. 3. The method according to item 1 or 2, wherein the amount of glycine added is adjusted to a concentration of 1 to 3 M at a temperature of 2 to 10 ° C.
4. 4. The method according to the above item 3, wherein the treatment pH is adjusted to 4 to 6.
5. 5. The method according to the above item 3 or 4, wherein the salt concentration is adjusted to 25 to 80 mM.
6. In the presence of 10 mM EDTA, thrombin or batroxobin snake venom is allowed to act on fibrinogen purified from the raw plasma to generate fibrin, and the precipitate obtained by the fractionation operation is dissolved in a 4 to 10 M urea solution. ６6), 25-80 mM sodium chloride is added to this solution, and glycine is further added to a concentration of 1 to 3 M to precipitate soluble fibrin, and thereafter, the soluble fibrin is recovered.
7. DesAABB fibrin or desAA fibrin prepared by the method described in 6 above.
8. A test reagent comprising the sample according to the preceding clause 7 as a constituent reagent.
Consists of
[0007]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
In the present invention, the term "soluble fibrin" refers to a fibrin polymer in which fibrin coagulation has occurred, in which crosslinks are cleaved by a protein denaturing agent, and further, solid coagulation due to crosslink formation is controlled. It refers to fibrin that is substantially soluble in water under the conditions of 5-5.5). In the present invention, a fractionation operation is further performed on the solubilized fibrin. The fraction is brought into contact with glycine to precipitate and collect. The soluble fibrin subjected to this fractionation may be prepared by conventional techniques. The general method is to collect the fibrinogen fraction from plasma by the ethanol fractionation method of corn (Cohn EJ et al. J. Am. Chem 1946: 68; 459), and to add it to a hydrolase such as thrombin or batroxobin. Fibrinated by processing. When left alone, fibrin undergoes a cross-linking reaction due to the action of blood coagulation factor 13 and calcium ions, causing polymerization and coagulation to form a fibrin clot. When the clotted fibrin is used as a raw material, the fibrin is first dissolved with a protein denaturing agent such as urea or with an enzyme such as plasmin. In the case of urea treatment, it is used at a concentration of 4 to 10M, preferably 5 to 8, more preferably 5.5 to 6.5M. After purifying the fibrinogen fraction and generating fibrin by the action of thrombin, the following glycine-treated fraction of the present invention can be performed under the control of coagulation (suppression conditions).
[0008]
The raw solubilized soluble fibrin is treated with glycine. Prior to the addition of glycine, the solution is preferably adjusted for salt concentration. The salt is not particularly limited, but a common inorganic salt is suitably used, and examples thereof include sodium chloride, but are not limited thereto. The salt concentration is used at a concentration of 25 to 80 mM, preferably 30 to 70, more preferably 40 to 60 mM. Glycine is used at a temperature of 2 to 10 ° C and a concentration of 1 to 3M, preferably 1.3 to 2.5, more preferably 1.5 to 2M. The treatment pH is used at a concentration of 4 to 6, preferably 4.2 to 5.5, more preferably 4.3 to 5.0.
[0009]
In the present invention, thrombin is caused to act on fibrinogen purified from the raw plasma to generate fibrin, and the precipitate obtained by the fractionation operation is dissolved in a 4 to 10 M urea solution, and then this is dissolved in a buffer solution (pH 4 to 6). The solution was adjusted, 25-80 mM sodium chloride was added to the solution, and glycine was further added to a concentration of 1 to 3 M to precipitate soluble fibrin, and then recovered to provide a method for producing soluble fibrin. Glycine is preferably added by a method of gradually increasing the concentration from a low concentration to a target range, for example, increasing the concentration to 1.8 M. The fibrin prepared in this way was desAABB fibrin.
[0010]
The method for preparing soluble fibrin thus provided is a means for providing soluble fibrin with high purity and high recovery, and the obtained soluble fibrin is extremely useful both as a pharmaceutical and a test reagent.
[0011]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
[0012]
Embodiment 1
A crude fibrinogen fraction is obtained from human plasma according to the Cohn 8% ethanol precipitation method. The fibrinogen fraction is obtained from this according to the method of Blambeek B et al (Arkiv Kemi 1956; 10: 415-43). Purified fibrinogen is further removed by lysine Sepharose affinity column chromatography to remove mixed plasminogen. As another example, a fraction from which fibronectin has been removed by gelatin-sepharose affinity chromatography can also be used.
The purified 2 g / l fibrinogen solution (10 mL) is allowed to act with 500 μl of 100 NIH units / ml human thrombin (in another example, 500 ul of a 50 BU / ml batroxobin solution may be treated) in the presence of 10 mM EDTA, followed by centrifugation. To obtain a solidified fibrin precipitate.
After mixing 10 ml of a 3.3 M urea solution to dissolve the fibrin, the mixture is dialyzed against 200 ml of a 20 mM acetate buffer (pH 4.6). At 4 ° C., 50 mM sodium chloride is added to the inner dialysis solution, and glycine is gradually added to 2.0 M to obtain soluble fibrin by sedimentation. This is dissolved in 10 ml of a 20 mM acetate buffer (pH 4.6) which has been heated to 30 ° C. in advance. According to the method of the present invention, the purity of soluble fibrin obtained from fibrinogen as a starting material is shown in Table 1. The protein content is a value measured by the Lowry method.
[0013]
Table 1 Comparison of soluble fibrin purity
[0014]
Embodiment 2
FIG. 1 shows a pattern of SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of soluble fibrin obtained by the method of the present invention. Comparison of the electrophoretic mobility with the subject fibrinogen (lane 1) indicated that the molecular weights of the Aα and Bβ chains were small and that desAABB fibrin (lane 2) was produced.
SDS-PAGE electrophoresis conditions;
Gel: 7.5% polyacrylamide gel (Bio-Rad)
Electrophoresis: 50 Volts (3 hours)
Buffer: 192 mM Tris-72 mM Gly-0.02 SDS
Staining: Coomassie Brilliant Blue (CBB)
Electrophoresis device: MINI-PROTEAN II (Bio-Rad)
[0015]
【The invention's effect】
As described above, soluble fibrin can be efficiently recovered with high purity by the method of the present invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows reduced fibrinogen and soluble fibrin. FIG. 4 is a diagram of SDS-PAGE under reducing. Arrows indicate α chain, β chain, and γ chain from the top.
[Explanation of symbols]
1: MW (molecular weight marker)
2: Fibrinogen 3: Present method 4: Existing method
