【０００１】
【発明の属する技術分野】
組織治癒を補助・促進するために用いる特定の溶解性半減期である水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを含有する癒着防止材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースを水に可溶性としたセルロース誘導体として、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース等が知られている。その中でカルボキシメチル基が導入されたカルボキシメチルセルロース（以後、一般的呼称に準じてカルボキシメチルセルロースはカルボキシメチルセルロースナトリウムを指す）は代表的なものであり、その増粘剤としての機能に加え、分散性，保型性，耐酵素性，耐酸性，ゲル化等の機能を有することから、食品分野や医薬化粧品，飼料，繊維等で広く利用されている。
【０００３】
医療分野へのカルボキシメチルセルロースの応用に関しては、カルボキシメチルセルロース水溶液やそれを乾燥させて成形したものを用いた癒着防止材としての効果確認に関する報告がなされているが、十分な効果は得られていない（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｖｏｌ． １６９， １５４−１５９（１９９５））。特開平１−３０１６２４号や米国特許第５９０６９９７号等には化学的架橋剤又は化学的修飾剤を用いたカルボキシメチルセルロース組成物の癒着防止材が開示されており、また特表平５−５０８１６１号、特表平６−５０８１６９号を基に開発されたヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースをカルボジイミドで修飾したものからなる組成物でフィルム状の癒着防止剤「セプラフィルム」（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）が市販されている。一方架橋剤又は修飾剤を用いない、すなわち実質的に改質されていないカルボキシメチルセルロースを癒着防止材に用いる例は米国特許第 ５，９０６，９９７号，同第６，０１７，３０１号や同第６，０３４，１４０号、国際公開特許第０１／３４２１４号に開示されている。
【０００４】
体表面に適用する創傷被覆剤について見てみると、特開平１１−３２２６１５号にはカルボキシメチルセルロースとフィブリン、特開平７−１０９２２０号にはカルボキシメチルセルロースと各種消毒剤、独国特許第１３９７８９３号にはカルボキシメチルセルロースと抗炎症剤からなる創傷治癒剤が開示されている。また、特表平８−５０５２５８号や欧州特許第４７６４７号では架橋されたカルボキシメチルセルロースを用いた創傷被覆剤が開示されている。これらはいずれも可溶性であるカルボキシメチルセルロース又は化学的架橋剤等で架橋されたカルボキシメチルセルロースを用いており、癒着防止材への適用を試みた場合にもその安全性が懸念されていた。
【０００５】
癒着は６つのステップにより形成されると考えられている（人工臓器， １９９４−９５， ２８２−２８５）。すなわち、まず開腹手術等による損傷や炎症などによる異常をきたした部位へ体液，血液等の漏出が起き、フィブリノーゲンが滲出してフィブリンが形成されフィブリン網が形成される。この過程は分単位で進行する。次に時間単位でこのフィブリン網に白血球等の炎症細胞、マクロファージ、線維芽細胞が侵入し、これらの細胞から出される種々の酵素によりフィブリン網が溶解される。続いてこれらの細胞が出す種々の成長因子により繊維芽細胞の侵入が活発となり、細胞周囲のフィブリン網がコラーゲン繊維に置換される。この過程は日単位で進行するが、癒着組織の基本的構造が形成されるために不可逆的なものとなる。さらに週単位で複雑なコラーゲン走行の構築を持つ細胞線維性組織が形成され、これらの細胞の栄養要求性のために無数の毛細血管が侵入し、肉芽組織が形成される。その後月単位で一部の組織は創傷治癒の過程をたどるが、残存する組織はコラーゲン組織が大半を占めることになり、非常に強固な、丈夫な組織である瘢痕組織と称される状態となる。そして年単位で瘢痕組織のコラーゲン量の減少により周囲組織に ”引きつり” 現象を生じさせることになる。
【０００６】
癒着を防止するためには癒着する可能性のある組織，器官の間隙を隔絶させておくこと、上述の不可逆的状態に進む前の段階でフィブリン析出，細胞侵入，コラーゲン繊維産出などの過程を抑えること、位置的に癒着しそうな組織をたびたび動かして接触状態を維持させないことなどが考えられる。一般に漿膜損傷後の中皮細胞再生には５〜８日間必要とされており、この期間損傷を受けた組織と周辺組織とを物理的に隔離して接触を遮断すれば、癒着の形成を防止・軽減することが期待できる。一方整形外科領域での手術により組織が損傷を受けた場合にも同様に、一定期間損傷部位と他の組織とを隔離することにより癒着を防止することができる。
【０００７】
癒着は組織修復という生理的現象の一つであるため、癒着を希望しない部位のみの癒着を防止することが必要である。そのためには癒着する可能性のある組織、器官の間隙を隔絶させておくことが望ましい。これまで、例えばカルボキシメチルセルロースの粘弾性等の材料特性を向上させるために特開平１０−２５１４４７号記載のグリオキサールによる化学架橋カルボキシメチルセルロース、特開昭６３−３７１４３号記載の多価金属イオンとの混合をおこなったカルボキシメチルセルロースゲル、特開平７−０９０１２１号記載の二価、又は三価金属塩によるカルボキシメチルセルロースゲル、さらには特開平１１−１０６５６１号記載の塩基性酢酸アルミニウムの添加によるカルボキシメチルセルロースゲルなどが考案されている。しかし、こうした修飾カルボキシメチルセルロースは、化学架橋剤の使用や金属イオンが添加がされており、医療品として用いる場合には安全性の観点からこれらを含まない材料が望ましい。
【０００８】
実質的に改質されていないカルボキシメチルセルロースを用いた癒着防止材としては、上述の米国特許５，９０６，９９７号、同６，０１７，３０１号や同６，０３４，１４０号に基づいて開発されたカルボキシメチルセルロースとポリエチレンオキサイドからなるフィルム状のオキシプレックス（Ｏｘｉｐｌｅｘ；ＦｉｚｉｏＭｅｄ 社）が市販されている。オキシプレックスはカルボキシメチルセルロースとポリエチレンオキサイド間の水素結合がその構造と考えられており、水素結合の数及び強さにより体内での貯留性が異なることが予想されるが、生体外すなわち ｉｎ ｖｉｔｒｏ での溶解性と癒着防止効果との関係は開示されていない。
【０００９】
カルボキシメチルセルロースを水難溶性化する技術は特開昭５８−１０４９０１号、特開昭５４−３６３８８号や特表昭５５−５００７８５号において既に公開されているが、これらの方法により得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを癒着防止材に適用した例、ＷＯ０１／３４２１４号に開示されている。
【００１０】
一方、手術現場での医療用具の適用を見てみると、適用部位識別のために着色されているものが見受けられる。縫合糸はその代表的なものであり、例えばジョンソン・エンド・ジョンソン社のコーテッドバイクリルやサージカルシルクには紫色や黒色、青色といった着色がなされており、血液や体液の存在下でも縫合部位の識別を容易なものとしている。特表平３−５０２７０４号にはヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースをカルボジイミドで修飾しブリリアントブルーＲで着色されたフィルムが開示されているが、市販されている癒着防止材で着色されているものは見あたらず適用部位の識別が容易なものが望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記目的を達成するために、カルボキシメチルセルロース自体の物理化学的性質と生体に対する効果を鋭意検討してきた。その結果、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの ｉｎ ｖｉｔｒｏ の溶解性と癒着防止に相関があることを見出した。さらにフィルム状以外の形状の物についても同様の相関があることを発見し本発明を完成させるに至った。また水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを着色することにより、本発明品の手術部位への適用状態の観察を容易なものとすることが可能となった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、（１）溶解性半減期が５時間〜３０時間である水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを含有することを特徴とする癒着防止材、（２）更に、他の生体適合性高分子化合物を配合することを特徴とする（１）記載の癒着防止材、（３）水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの形態がシート状、フィルム状、スポンジ状、紐状、懸濁液状、及び粉末状からなる群から選ばれた１種であることを特徴とする（１）又は（２）記載の癒着防止材、（４）癒着防止材の適用部位の識別を容易にするために着色されていることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項記載の癒着防止材である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する
本発明でいう癒着防止材とは、生体内の粘膜、血管、骨、腱のような組織や胃あるいは腸のような消化器官、または子宮の表面に貼付したり体表付近に生じた創傷部位及びその周辺に留置することにより、外科的な手術により手術部位やその周辺等に生ずる癒着の程度を軽減あるいは癒着を防止するものを意味する。例えば、一般的な手術の際に引き起こされる外科的損傷、手術部位の縫合部、骨折やアキレス腱断裂等に見られる物理的損傷に対して適用することを指す。さらに体表あるいは体内に適用されるものであることから生体適合性のあるものであることを意味する。
【００１４】
本発明に用いられるカルボキシメチルセルロースの分子量は、特に規定されるものではないが、約１×１０４ 〜約５×１０５ ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから、加水分解処理等をして得た低分子量のものでも同様に好ましく使用できる。
また、カルボキシメチルセルロースのもうひとつのパラメーターであるエーテル化度については、水難溶性化が起こる範囲のものであればその利用に関し何ら制限されない。尚、本発明にいうカルボキシメチルセルロースは、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム等の塩をも包含する概念で使用される。
【００１５】
水難溶性化したカルボキシメチルセルロースは、カルボキシメチルセルロースの酸性溶液の凍結・解凍を用いる方法、カルボキシメチルセルロース濃度を５質量％以上になるように酸溶液と混和し非凍結温度下で放置する方法、カルボキシメチルセルロースの酸性溶液を静置する方法、カルボキシメチルセルロースの酸性溶液と極性有機溶媒を混合する方法、陽イオン交換カラムにカルボキシメチルセルロースを通液させる方法、カルボキシメチルセルロースの酸性溶液を濃縮する方法等により得ることが可能である。このうち酸性溶液の凍結・解凍を用いる方法及び非凍結温度下で放置する方法は簡便で多量の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの取得が可能である。これらの方法では用いるカルボキシメチルセルロースの分子量、酸性溶液中のカルボキシメチルセルロース濃度、凍結時間あるいは放置時間等の条件を適宜選択することにより水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの溶解率を制御することが可能であり、さらに得られる水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを種々の形態に形成しやすいという利点を有する。
【００１６】
本発明で用いられるリン酸緩衝生理食塩水とは、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースが生体に適用されることを考慮し、生体適合性のある溶液が好ましく、具体的には細胞培養の際に一般的に用いられるカリウム−ナトリウム系リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）が好ましい。
【００１７】
本発明における水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの溶解性半減期とは、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを６０℃のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に静置し、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースから溶出したカルボキシメチルセルロースの量が水難溶性化したカルボキシメチルセルロース量の５０％になるまでの時間のことである。
溶解性半減期が短い場合には適用部位における貯留性が短く、癒着の形成ステップのうちの不可逆的状態に進む前の段階での組織あるいは器官の間隙の隔絶が困難となるため、癒着防止効果は期待できない。
一方、溶解性半減期が長すぎる場合には、炎症細胞、マクロファージや繊維芽細胞が水難溶性化したカルボキシメチルセルロース組成物内に侵入し、癒着組織の基本的構造が形成される不可逆的状態を維持することになるため、逆に癒着形成を助長することとなる。
【００１８】
好ましい癒着防止効果を得るための溶解性半減期は、好ましくは５時間以上であり、より好ましくは５時間〜３０時間、更に好ましくは１０時間〜２０時間である。
【００１９】
更に水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに、他の生体適合性高分子合化物を配合して用いることも可能である。高分子化合物は、天然高分子化合物、合成高分子化合物、水溶性高分子化合物、非水溶性高分子化合物を問わず用いることができ、組織への炎症性や障害性等の有害作用を有さないものであれば何ら制限されるものではない。
【００２０】
配合して用いられる高分子化合物の代表例としては、多糖類、蛋白質、核酸類、及び合成高分子類からなる群から選択されるがこれにより何ら制限されないものである。多糖類の例としては、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン類（ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸等）、コンドロイチン硫酸塩（コンドロイチン−６−硫酸等）、ケラチン硫酸塩、アルギン酸及びその生物学的に受容な塩、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、澱粉、アミロース、ポリ乳酸、カラギーナン等が挙げられる。
【００２１】
また、蛋白質の例としては、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、エラスチン、種々のグロブリン、カゼイン、グルテン等、及びそれらの生物学的に受容な合成誘導体等が挙げられる。
【００２２】
また、合成高分子の例としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリグルコール酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ乳酸、それらのコポリマー、及びアクリル酸もしくはメタクリル酸ポリ（ヒドロキシエチル）エステル、ポリアクリルアミド等、ポリビニルアルコール、マレイン酸やフマール酸のコポリマー等のような誘導体等が挙げられる。尚、本発明は、これらの高分子化合物に何ら制限されないものである。
【００２３】
本発明の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの形態は、シート状、フィルム状、スポンジ状、糸状、懸濁液状、粉末状等で外科手術に用いることができる。用いられる形態としては、例えば内臓表面にシート状、フィルム状又はスポンジ状として直接貼付したり、懸濁液状又は粉末状として創傷表面及びその周辺に適用したりすることが好ましい。貼付する場合にはシート、フィルム又はスポンジの大きさは創傷の形状や大きさ等により適宜選択することができる。
貼付が困難な平面の少ない組織に対しては懸濁液状又は粉末状がさらに有効である。また懸濁液状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースは注射器等で腹腔鏡手術に用いることができる。さらに手指における腱裂断時の手術の際には、これらの形状に加えて紐状とした水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを用いることが可能である。このように本発明で用いられる水難溶性化したカルボキシメチルセルロースは適用部位により形状を選択することができ、また複数の形状のものを組み合わせて使用しても何ら問題はない。
【００２４】
次に、医療用具として必要な滅菌処理について述べる。カルボキシメチルセルロースの糖鎖構造は熱や放射線等に比較的安定であるために、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースからなる組織被覆性医療材料にはγ線滅菌、電子線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマガス滅菌あるいはオートクレーブ滅菌などの種々の滅菌方法が採用できる。例えばシート状あるいはスポンジ状といった固形形状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースにはγ線滅菌やエチレンオキサイド滅菌等が有効であり、懸濁液状のような液体形状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの場合にはオートクレーブ滅菌や乾熱滅菌を用いることができる。こうした滅菌という過酷な処理により水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの ｉｎ ｖｉｔｒｏ での溶解性ひいては生体内貯留性が変化する現象が確認されるが、製造条件を変化させてあらかじめより安定な、すなわちより溶解性半減期の長い水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを製造しておき、滅菌処理後の生体内貯留性を制御することも可能である。
【００２５】
本発明品を着色する場合には、非経口的に投与された場合での安全性が確認されている色素を用いることが必要である。例えば医薬品添加物事典（日本医薬品添加剤協会編集）に記載されているカンゾウエキス、三二酸化鉄、銅クロロフィリンナトリウム、パーマネントバイオレット−Ｒ−スペシャル、ベンガラ、薬用炭等による着色が可能であり、色については適用部位や適用方法によって任意に決められ何ら制限されるものではない。
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
２５℃での１％粘度が１５０〜２５０ｍＰａ・ｓのカルボキシメチルセルロースナトリウム（エーテル化度０．６２〜０．６８、換算分子量１．２８×１０５〜１．３５×１０５ダルトン、第一工業製薬社製）を蒸留水に１質量％になるように溶解した。こうして調製された水溶液のｐＨを１Ｎ硝酸で１．５に調整し、酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌのポリスチレン製容器に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。３日間静置した後、２５℃で解凍した。その後水及び１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により中和を行い、スポンジ状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。
【００２８】
実施例２
実施例１における−２０℃での静置期間を５日間とし、スポンジ状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。
【００２９】
実施例３
２５℃での１％粘度１０００〜２８００ｍＰａ・ｓのカルボキシメチルセルロースナトリウム（エーテル化度０．６５〜０．９５、換算分子量約３．０×１０５ダルトン、ハーキュレス社製）を蒸留水に１質量％になるように溶解した。こうして調製された水溶液のｐＨを１Ｎ硝酸で１．５に調整し、酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌのポリスチレン製容器に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１日間放置した後、２５℃で解凍した。その後水及び１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により中和を行い、スポンジ状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。
【００３０】
実施例４
実施例３における−２０℃での静置期間を３日間とし、スポンジ状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。
【００３１】
実施例５
実施例１で用いたカルボキシメチルセルロースを２０質量％になるように１Ｎ硝酸と室温で混和した後、３日間４℃の冷蔵庫で保管した。その後、水及び１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により中和を行い、塊状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。
【００３２】
実施例６ 水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの溶解性試験
次の組成からなるｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水
塩化カリウム ０．０２質量％
リン酸一カリウム ０．０２質量％
リン酸二ナトリウム１２水和物 ０．２９質量％
塩化ナトリウム ０．８１質量％
得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを、乾燥重量で５０ｍｇのカルボキシメチルセルロースを含む水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対して５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水の割合で、リン酸緩衝生理食塩水中に浸漬した。６０℃の静置下でリン酸緩衝生理食塩水中に溶出するカルボキシメチルセルロースの割合を、リン酸緩衝生理的食塩水中のカルボキシメチルセルロース濃度から求めた。
従って、中性の６０℃の水溶液中での水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの溶解性は、上記試験により規定されるものである。
【００３３】
カルボキシメチルセルロース濃度の測定
リン酸緩衝生理食塩水中のカルボキシメチルセルロースの濃度は、ゲルろ過クロマトグラフ法（ＧＰＣ）を使って示差屈折率検出器のピーク面積から求めた。
すなわち、経時的に採取したリン酸緩衝生理食塩水を０．４５μｍのフィルターでろ過後ＧＰＣに注入し、得られたピーク面積と既知量のＣＭＣのピーク面積を比較することにより算出した。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１より、例えば、実験Ｎｏ．１の実施例１で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースについては、カルボキシメチルセルロースの溶解率が３時間後では２５質量％、５時間後では３５質量％、１０時間後では５８質量％であった。
すなわち３時間後においては７５質量％が、５時間後においても６５質量％が水難溶性化したカルボキシメチルセルロースとして残存していた。他の実施例で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースについても同様であり、これらの溶解率より実施例１〜実施例５で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの溶解性半減期はそれぞれ約７時間、約１２時間、約１５時間、約１８時間及び約８時間であった。
【００３６】
さらに実験Ｎｏ．１と実験Ｎｏ．２の比較、実験Ｎｏ．３と実験Ｎｏ．４の比較からカルボキシメチルセルロースの分子量が同じ場合でも製造条件により溶解性半減期が制御できることが明らかとなった。また実験Ｎｏ．１と実験Ｎｏ．５の比較ではほぼ同等の溶解性半減期が得られており、異なる製造方法においても用いる条件により溶解性半減期を制御できることが判明した。
【００３７】
実施例７
実施例１で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、マイクロホモジナイザー（ＮＩＳＳＥＩ ＥＸＣＥＬ ＡＵＴＯ ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＡＥＲ）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。このスラリーを印刷用スクリーン上に展開し、約４０℃での乾燥により水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムとした。得られたフィルムの溶解性半減期は約６時間であった。
【００３８】
実施例８
実施例３で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、マイクロホモジナイザー（ＮＩＳＳＥＩ ＥＸＣＥＬ ＡＵＴＯ ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＡＥＲ）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。このスラリーを印刷用スクリーン上に展開し、約４０℃での乾燥により水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムとした。得られたフィルムの溶解性半減期は約１３時間であった。
【００３９】
比較例１
実施例１において、−２０℃での静置時間を変更し実施例６の溶解性試験で溶解性半減期が約３時間である水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、マイクロホモジナイザー（ＮＩＳＳＥＩ ＥＸＣＥＬ ＡＵＴＯ ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＡＥＲ）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。このスラリーを印刷用スクリーン上に展開し、約４０℃での乾燥により水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムとした。得られたフィルムの溶解性半減期は約２時間であった。
【００４０】
比較例２
実施例３において、−２０℃での静置時間を変更し実施例６の溶解性試験で溶解性半減期が約５時間である水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、マイクロホモジナイザー（ＮＩＳＳＥＩ ＥＸＣＥＬ ＡＵＴＯ ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＡＥＲ）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。このスラリーを印刷用スクリーン上に展開し、約４０℃での乾燥により水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムとした。得られたフィルムの溶解性半減期は約４時間であった。
【００４１】
実施例９ ラット盲腸擦過モデルのおける癒着防止試験
癒着誘導法
ラット（ＳＤ、メス、９週齢以上）に麻酔剤（ケラタン溶液）を筋注し麻酔後、仰向けに固定してイソジンにて腹部皮膚を消毒後、剪毛を行った。ラット腹筋を正中線に沿って開腹し、盲腸を腹腔内から取りだし、盲腸を有孔（φ１６ｍｍ）ポリテトラフルオロエチレンシートで固定した。孔から露出した盲腸部分にガーゼをかぶせた回転棒（φ１３ｍｍ）を押し当て約１２０回擦過した（片面２カ所）。擦過部に実施例７、実施例８、比較例１及び比較例２で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約４ｃｍ×４ｃｍ片をあて、盲腸を元に戻して縫合を行った。
また、癒着防止材を処置せず、そのまま盲腸を戻したものをコントロールとした。こうした処置はコントロールを含めた各実験で１０〜１６匹づつのラットを用いた。術後一週間程度で剖検し、以下の判定基準（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ６６， ５， ８１４−８２１）によりスコアリングを行い、平均癒着スコアとして癒着防止効果を評価した。結果を表２に示す。
＜判定基準＞
０：癒着無し
１：容易に確認できる面を持つフィルム状の癒着
２：自由に剥離できる面を有する軽い癒着
３：面の剥離が困難な中程度の癒着
４：剥離不可能な面を有する密集した癒着
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２より、溶解性半減期が約６時間及び約１３時間である実施例７及び実施例８のフィルムでは、コントロールと比較して癒着スコアが半分以下であり、また癒着の発生率も低く優れた癒着防止効果が認められた。これに対し溶解性半減期の短い、すなわち溶解性半減期が４時間以下であるフィルムについては癒着防止効果が認められなかった。
【００４４】
実施例１０
実施例３において得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、超高圧式ホモジナイザー（ＳＭＴ社製ＬＡＢ１０００）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。このスラリーを印刷用スクリーン上に展開し、約４０℃での乾燥により水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムとした。得られたフィルムは実施例６の溶解性試験で溶解性半減期が約１２時間であった。
【００４５】
実施例１１
実施例３において−２０℃での静置時間を変更し、また実施例１０と同様の操作を行い溶解性半減期が約２０時間である水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムを得た。
【００４６】
実施例１２
実施例３において−２０℃での静置時間を変更し、また実施例１０と同様の操作を行い溶解性半減期が約３０時間である水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムを得た。
【００４７】
比較例３
実施例３において−２０℃での静置時間を変更し、また実施例１０と同様の操作を行い溶解性半減期が約４０時間である水難溶性化したカルボキシメチルセルロース約２ｍｇ／ｃｍ２を含むフィルムを得た。
【００４８】
実施例１３
実施例１０、実施例１１、実施例１２及び比較例３について、実施例９に記載したラット盲腸擦過モデルのおける癒着防止試験を行った。結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
表３より、実施例１０（実験Ｎｏ．１１）と実施例８（実験Ｎｏ．７）を比較すると、得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの破砕条件が異なっていたが、溶解性半減期がほぼ同等であり癒着防止効果も同等であることが明らかとなった。また溶解性半減期が長い水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを用いた場合でも癒着防止効果を有することが判明した。しかしながら実験Ｎｏ．１４の結果のように長すぎる溶解性半減期のフィルムには効果が認められなかった。
従って、癒着防止効果発現のためには適切な溶解性半減期の範囲が存在することが明らかとなった。
【００５１】
実施例１４
実施例５において得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、マイクロホモジナイザー（ＮＩＳＳＥＩ ＥＸＣＥＬ ＡＵＴＯ ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＡＥＲ）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００５２】
実施例１５
実施例１０において、得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースをスラリーのままとし、フィルム化を行わなかった。
【００５３】
実施例１６
実施例１１において、得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースをスラリーのままとし、フィルム化を行わなかった。
【００５４】
実施例１７
実施例１２において、得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースをスラリーのままとし、フィルム化を行わなかった。
【００５５】
実施例１８
実施例１５で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーに対し、分子量約２×１０６ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業社製）を水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し質量比で５分の１となるように添加して溶解し、ヒアルロン酸ナトリウムを含有する水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００５６】
実施例１９
実施例１５で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーに対し、アルギン酸ナトリウム（フナコシ社製）を水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し質量比で等量となるように添加して溶解し、アルギン酸ナトリウムを含有する水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００５７】
実施例２０
実施例１５で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーに対し、キトサン（和光純薬社製）を水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し質量比で１０分の１となるように添加して溶解し、キトサンを含有する水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００５８】
実施例２１
実施例１５で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーに対し、重合度１５００のポリビニルアルコール（和光純薬社製）を水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し質量比で等量となるように添加して溶解し、ポリビニルアルコールを含有する水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００５９】
実施例２２
実施例１５で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーに対し、重合度１５００のポリビニルアルコール（和光純薬社製）を水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し質量比で２分の１となるように添加して溶解し、ポリビニルアルコールを含有する水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００６０】
実施例２３
実施例３において−２０℃での静置時間を変更し、実施例６の溶解性試験における溶解性半減期が約４０時間の水難溶性化したカルボキシメチルセルを得た。得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに生理食塩水をカルボキシメチルセルロース濃度が１質量％となるように加えた後、マイクロホモジナイザー（ＮＩＳＳＥＩ ＥＸＣＥＬ ＡＵＴＯ ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＡＥＲ）による破砕を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。このスラリー１００ｍｌを２００ｍｌの細胞培養用メディウムビンに入れ、
オートクレーブで１２１℃，２０分間の滅菌処理を行った。滅菌処理後再度実施例６の溶解性試験を行い、溶解性半減期が約１８時間の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーを得た。
【００６１】
実施例２４
実施例１４ないし実施例２３で得られたスラリーについて、実施例９に記載したラット盲腸擦過モデルにおける癒着防止試験を行った。各種スラリーを１ｍｌ〜５ｍｌの注射筒に取り、１８Ｇの注射針を装着した後に水難溶性化したカルボキシメチルセルロースがラット当たり１０ｍｇとなるように擦過部位に適用した。結果を表４に示す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
表４より、溶解性半減期が３０時間以内の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを用いたスラリーで癒着防止効果が認められ、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースにヒアルロン酸ナトリウム（実験Ｎｏ．１９）、アルギン酸ナトリウム（実験Ｎｏ．２０）、キトサン（実験Ｎｏ．２１）、ポリビニルアルコール（実験Ｎｏ．２２、２３）等の他の高分子化合物を添加した場合にも効果が確認された。さらに実験Ｎｏ．２４で認められたように、表３の実験Ｎｏ．１４で効果が認められなかった水難溶性化したカルボキシメチルセルロース（比較例３）の溶解性半減期をオートクレーブ処理で約１８時間に調節することにより効果を発現させることが可能であった。
【００６４】
実施例２５
実施例１０において得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーをニトロセルロース膜を用いてろ過し水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを分取した。この水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し水難溶性化したカルボキシメチルセルロースが１質量％となるようにエタノールを加え、ろ過により水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのエタノール洗浄を行った。この洗浄操作をさらに２回繰り返して得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを真空乾燥し、溶解性半減期が約１０時間の粉末状の水難溶性化したカルボキシメチルセルロースを得た。
得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し、１０倍質量の乳糖を添加して乳鉢により混合した。この組成物を日本薬局方記載の１号カプセルに封入し水難溶性化したカルボキシメチルセルロース含有カプセルを得た。
【００６５】
実施例２６
実施例９に記載したラット盲腸擦過モデルにおける癒着防止試験を行い、水難溶性化したカルボキシメチルセルロースがラット当たり１０ｍｇとなるように擦過部位に小型噴霧器を用いて適用した。結果を表５に示す。
【００６６】
【表５】
【００６７】
表５より、粉末状とした水難溶性化したカルボキシメチルセルロースにも癒着防止効果が認められた。一方、分散剤として用いた乳糖には癒着防止効果が認められなかった。
【００６８】
実施例２７
実施例１８において得られたヒアルロン酸ナトリウムを含む水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーをポリスチレン製角シャーレ上に展開し、４０℃にて乾燥し１ｃｍ２当たりヒアルロン酸ナトリウム０．５ｇ、カルボキシメチルセルロース２ｇを含むフィルムを得た。
【００６９】
実施例２８
実施例１８において得られたヒアルロン酸ナトリウムを含む水難溶性化したカルボキシメチルセルロースのスラリーに水難溶性化したカルボキシメチルセルロースに対し質量比で２０分の１となるように銅クロロフィリンナトリウムを添加した。この着色スラリーをポリスチレン製角シャーレ上に展開し、４０℃にて乾燥し１ｃｍ２当たりヒアルロン酸ナトリウム０．５ｇ、カルボキシメチルセルロース２ｇを含む着色フィルムを得た。
【００７０】
実施例２９ ウサギ腹壁欠損モデルにおける癒着防止試験
癒着誘導方法
ウサギ（ニュージーランドホワイト種、雄、１．８〜２．２ｋｇ）をネンブタール（第日本製薬製）麻酔下で仰向けに固定してイソジンにて腹部皮膚を消毒後、剪毛を行った。ウサギ腹筋を正中線に沿って開腹し、左腹壁に３ｃｍ×５ｃｍの範囲で欠損創を作成した。欠損部位の周辺を４−０バイクリルで連続縫合し、さらに欠損創の各辺及び各角に結び目を作成した。盲腸の腹側及び背側の第２膨起から第２０膨起について外科用ブラシによる擦過を行い鬱血を作成した。腹壁欠損部に実施例２７及び実施例２８で得られたフィルム約４ｃｍ×８ｃｍ片をあて縫合を行った。またフィルムを適用せずに閉復したものをコントロールとした。こうした処置はコントロールを含めた各実験で５〜６羽づつのウサギを用いた。術後２週間程度で剖検し、以下の判定基準（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ６６， ５， ８１４−８２１）によりスコアリングを行い、腹壁欠損部が癒着に関与する範囲及び形成された癒着の剥離の容易さにより癒着防止効果を評価した。結果を表６に示す。
＜癒着範囲の判定基準＞
０：癒着無し
１：腹壁欠損部の２５％までの範囲が癒着に関与
２：腹壁欠損部の５０％までの範囲が癒着に関与
３：腹壁欠損部の７５％までの範囲が癒着に関与
４：腹壁欠損部の１００％までの範囲が癒着に関与
＜癒着剥離の容易さの判定基準＞
０：癒着なし
１：容易に剥離可能
２：剥離が困難
３：剥離不可能
【００７１】
【表６】
【００７２】
表６より、実験Ｎｏ．２８と実験Ｎｏ．２９の適用時の状況を比較すると、実施例２８のフィルム（実験Ｎｏ．２９）では着色により血液存在下においても適用箇所の識別が容易であり、適用１５時間後においても適用部位が確認された。また着色の有無によらず癒着防止効果が確認され、着色に用いた色素が癒着形成の助長といった悪作用を引き起こさないことが確認できた。
【００７３】
実施例３０ 水難溶性化したカルボキシメチルセルロースの細胞毒性試験
実施例１〜実施例５、実施例７、実施例８、実施例１１、実施例１２、実施例１８〜実施例２１及び実施例２８で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロース、ならびに水難溶性化したカルボキシメチルセルロース組成物について細胞毒性試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞培養において本発明で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロース類を非接触下で共存させ、細胞増殖挙動の観察によりその細胞毒性を評価した。調製品をリン酸緩衝生理食塩水に浸漬したのち凍結乾燥体とした。その凍結乾燥体を機械的に粉砕したもの２０ｍｇをファルコン社製のセルカルチャーインサート（ポアサイズ：３μｍ）中に入れ、細胞を播種した培地に浸した。また、水難溶性化したカルボキシメチルセルロース非共存下での培養をコントロールとした。
培養条件 プレート ：細胞培養用１２ウェルプレート
培地 ：ＤＭＥＭ培地＋１０％ウシ胎児血清，２ｍｌ／ウェル
温度 ：３７℃（５％ＣＯ２下）
播種細胞数 ：１×１０４個／ウェル
【００７４】
培養開始後２日、５日及び８日後に、細胞密度を倒立顕微鏡を用いて観察した。水難溶性化したカルボキシメチルセルロースが共存していてもコントロールと同様に良好な増殖を示し、本発明で得られた水難溶性化したカルボキシメチルセルロース及びその組成物には細胞毒性作用がないことが見出された。
【００７５】
【発明の効果】
以上、本発明によれば、何ら化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用することなく得られる水難水溶性化したカルボキシメチルセルロースは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ での溶解性を制御することにより癒着防止効果が得られる。化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用することに起因する生体適合性への悪影響が避けられ、さらに形態の制御が容易なため手術時における癒着防止材に有用である。また着色により適用部位の識別が容易となり、外科的手術の最終段階における術者の負担軽減にも有効である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an anti-adhesion material containing carboxymethylcellulose that has been made hardly water-soluble and has a specific solubility half-life, which is used for assisting and promoting tissue healing.
[0002]
[Prior art]
Methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl ethyl cellulose and the like are known as cellulose derivatives in which cellulose is soluble in water. Among them, carboxymethylcellulose into which a carboxymethyl group has been introduced (hereinafter, carboxymethylcellulose refers to sodium carboxymethylcellulose according to a general name) is a typical one, and in addition to its function as a thickener, dispersibility Since it has functions such as shape retention, enzyme resistance, acid resistance, and gelling, it is widely used in the food field, pharmaceutical cosmetics, feed, fiber, and the like.
[0003]
Regarding the application of carboxymethylcellulose to the medical field, reports have been made on the confirmation of the effect as an anti-adhesion material using an aqueous solution of carboxymethylcellulose or a product formed by drying the solution, but a sufficient effect has not been obtained ( American Journal of Surgery, Vol. 169, 154-159 (1995)). JP-A-1-301624 and U.S. Pat. No. 5,906,997 disclose an anti-adhesion material for a carboxymethylcellulose composition using a chemical crosslinking agent or a chemical modifier, and JP-A-5-508161. A film-shaped adhesion preventing agent "Seprafilm" (manufactured by Genzyme) is commercially available, which is a composition comprising hyaluronic acid and carboxymethylcellulose modified with carbodiimide, which is developed based on Japanese Patent Publication No. Hei 6-508169. On the other hand, examples in which a crosslinking agent or a modifying agent is not used, that is, carboxymethylcellulose that is not substantially modified are used as an anti-adhesion material are disclosed in U.S. Patent Nos. 5,906,997, 6,017,301 and No. 6,034,140 and WO 01/34214.
[0004]
Looking at the wound dressing applied to the body surface, JP-A-11-322615 discloses carboxymethylcellulose and fibrin, JP-A-7-109220 discloses carboxymethylcellulose and various disinfectants, and German Patent No. 1397893 discloses A wound healing agent comprising carboxymethyl cellulose and an anti-inflammatory agent has been disclosed. JP-T 8-505258 and EP 47647 disclose wound dressings using cross-linked carboxymethyl cellulose. All of these use soluble carboxymethylcellulose or carboxymethylcellulose cross-linked with a chemical cross-linking agent or the like, and there has been a concern about the safety of the application to an adhesion preventing material.
[0005]
It is believed that adhesions are formed by six steps (artificial organs, 1994-95, 282-285). That is, first, leakage of body fluid, blood, and the like occurs to a site where damage due to laparotomy or the like due to inflammation occurs, fibrinogen exudes, fibrin is formed, and a fibrin network is formed. This process proceeds in minutes. Next, inflammatory cells such as leukocytes, macrophages, and fibroblasts invade the fibrin network in units of time, and the fibrin network is dissolved by various enzymes released from these cells. Subsequently, the invasion of fibroblasts is activated by various growth factors produced by these cells, and the fibrin network surrounding the cells is replaced by collagen fibers. This process proceeds daily, but is irreversible due to the formation of the basic structure of the adherent tissue. In addition, cell-fibrous tissues with complex collagen-running structures are formed weekly, and countless capillaries invade due to the auxotrophy of these cells, forming granulation tissue. After that, some tissues follow the process of wound healing on a monthly basis, but the remaining tissues are dominated by collagen tissue, a condition called scar tissue, which is a very strong and strong tissue . The decrease in the amount of collagen in scar tissue on a yearly basis causes a "pulling" phenomenon in surrounding tissues.
[0006]
In order to prevent adhesions, the gaps between tissues and organs that may adhere to each other should be isolated, and processes such as fibrin deposition, cell invasion, and collagen fiber production should be suppressed before proceeding to the above irreversible state. It is conceivable that the tissue that is likely to adhere to the position is frequently moved and the contact state is not maintained. Regeneration of mesothelial cells after serosal injury is generally required for 5 to 8 days, during which time the physical isolation of the injured tissue from the surrounding tissue and blocking contact prevents the formation of adhesions・ We can expect reduction. On the other hand, when the tissue is damaged by the operation in the orthopedic surgery area, the adhesion can be similarly prevented by isolating the damaged site from other tissues for a certain period of time.
[0007]
Since adhesion is one of the physiological phenomena of tissue repair, it is necessary to prevent adhesion only at a site where adhesion is not desired. For this purpose, it is desirable to isolate gaps between tissues and organs that may adhere to each other. Heretofore, for example, in order to improve the material properties such as viscoelasticity of carboxymethylcellulose, a chemically cross-linked carboxymethylcellulose with glyoxal described in JP-A-10-25147 and a polyvalent metal ion described in JP-A-63-37143 are used. Carboxymethylcellulose gel, carboxymethylcellulose gel prepared by divalent or trivalent metal salt described in JP-A-7-090121, and carboxymethylcellulose gel obtained by adding basic aluminum acetate described in JP-A-11-106561. Have been. However, such a modified carboxymethylcellulose uses a chemical cross-linking agent and is added with metal ions, and when used as a medical product, a material that does not contain these is desirable from the viewpoint of safety.
[0008]
Anti-adhesion materials using substantially unmodified carboxymethyl cellulose have been developed based on the above-mentioned US Pat. Nos. 5,906,997, 6,017,301 and 6,034,140. Oxyplex (FixiMed) comprising carboxymethylcellulose and polyethylene oxide is commercially available. Oxyplex is considered to have a structure in which hydrogen bonds between carboxymethylcellulose and polyethylene oxide are present, and it is expected that the number of hydrogen bonds and the strength of the bonds will differ in the in vivo retention, but in vitro, i.e., in vitro, No relationship between solubility and anti-adhesion effect is disclosed.
[0009]
Techniques for making carboxymethylcellulose insoluble in water have already been disclosed in JP-A-58-104901, JP-A-54-36388 and JP-A-55-500785. An example in which carboxymethylcellulose is applied to an adhesion preventing material is disclosed in WO 01/34214.
[0010]
On the other hand, when looking at the application of the medical device at the operation site, it can be seen that the medical device is colored for application site identification. Sutures are typical examples.For example, Johnson & Johnson Coated Bicyclel and Surgical Silk are colored purple, black, and blue to identify the sutured part even in the presence of blood or body fluid. It is easy. JP-A-3-502704 discloses a film in which hyaluronic acid and carboxymethylcellulose are modified with carbodiimide and colored with brilliant blue R, but no film is colored with a commercially available adhesion preventing material. What was easy to identify the application site was desired.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have diligently studied the physicochemical properties of carboxymethylcellulose itself and its effects on living bodies in order to achieve the above object. As a result, they have found that there is a correlation between the in vitro solubility of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble and the prevention of adhesion. Further, the inventors have found that there is a similar correlation for objects having shapes other than the film shape, and have completed the present invention. In addition, by coloring carboxymethylcellulose made hardly soluble in water, it becomes possible to easily observe the state of application of the product of the present invention to a surgical site.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention provides (1) an anti-adhesion material characterized by containing carboxymethylcellulose made hardly water-soluble having a solubility half-life of 5 hours to 30 hours, and (2) further improving other biocompatibility. (1) the anti-adhesion material according to (1), wherein the carboxymethyl cellulose which is hardly soluble in water is in the form of a sheet, film, sponge, string, suspension, or powder. (1) or (2), which is colored to facilitate identification of an application site of the adhesion preventing material. The adhesion preventing material according to any one of (1) to (3), which is characterized in that:
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The anti-adhesion material referred to in the present invention refers to a tissue such as mucous membranes, blood vessels, bones and tendons in a living body, a digestive organ such as stomach or intestine, or a wound site formed on the surface of the uterus or generated near the body surface. In addition, the indwelling in the vicinity thereof means that the degree of adhesion that occurs at a surgical site or its periphery due to a surgical operation is reduced or prevented. For example, it refers to application to surgical injuries caused during general surgery, sutures at surgical sites, physical injuries such as fractures and Achilles tendon ruptures. Furthermore, since it is applied to the body surface or the body, it means that it is biocompatible.
[0014]
The molecular weight of carboxymethylcellulose used in the present invention is not particularly limited, but may be about 1 × 10 4 ~ 5 × 10 5 Those in the Dalton range are preferred. In addition, as long as it has a molecular weight within the above range, from those having a higher molecular weight to those having a low molecular weight obtained by hydrolysis treatment or the like, it can be similarly preferably used.
The degree of etherification, which is another parameter of carboxymethylcellulose, is not limited at all, as long as it is in a range where poor water solubility is caused. The carboxymethylcellulose referred to in the present invention is used in a concept that includes alkali metal salts such as salts of sodium, potassium, lithium and the like.
[0015]
Carboxymethylcellulose made hardly water-soluble is obtained by a method using freezing and thawing of an acidic solution of carboxymethylcellulose, a method of mixing with an acid solution so that the concentration of carboxymethylcellulose becomes 5% by mass or more, and allowing it to stand at a non-freezing temperature. It can be obtained by a method of allowing an acidic solution to stand, a method of mixing an acidic solution of carboxymethyl cellulose with a polar organic solvent, a method of passing carboxymethyl cellulose through a cation exchange column, a method of concentrating an acidic solution of carboxymethyl cellulose, and the like. It is. Among them, the method using freezing and thawing of the acidic solution and the method of allowing the solution to be left at a non-freezing temperature are simple and can obtain a large amount of carboxymethylcellulose hardly soluble in water. In these methods, the molecular weight of carboxymethylcellulose used, carboxymethylcellulose concentration in the acidic solution, it is possible to control the dissolution rate of carboxymethylcellulose that has become hardly water-soluble by appropriately selecting conditions such as freezing time or standing time, Further, there is an advantage that the obtained water-insoluble carboxymethyl cellulose is easily formed into various forms.
[0016]
The phosphate-buffered saline used in the present invention is preferably a biocompatible solution in consideration of the fact that carboxymethylcellulose made hardly water-soluble is applied to a living body. Potassium-sodium phosphate buffered saline (pH 7.4) is preferably used.
[0017]
In the present invention, the solubility half-life of carboxymethylcellulose made poorly water-soluble is defined as the carboxymethylcellulose made poorly water-soluble, which is allowed to stand in phosphate buffered saline (pH 7.4) at 60 ° C. Is the time required for the amount of carboxymethylcellulose eluted from to become 50% of the amount of carboxymethylcellulose made hardly soluble in water.
If the solubility half-life is short, the retention at the application site is short, and it is difficult to isolate the gap between tissues or organs before proceeding to the irreversible state of the adhesion formation step, so that the adhesion prevention effect Can not expect.
On the other hand, if the solubility half-life is too long, the irreversible state in which inflammatory cells, macrophages and fibroblasts enter the carboxymethylcellulose composition that has become poorly water-soluble, and the basic structure of the adhesion tissue is formed Conversely, it promotes adhesion formation.
[0018]
The solubility half-life for obtaining a preferable adhesion preventing effect is preferably 5 hours or more, more preferably 5 hours to 30 hours, and even more preferably 10 hours to 20 hours.
[0019]
Furthermore, it is also possible to mix and use other biocompatible polymer compound with carboxymethylcellulose made hardly soluble in water. The polymer compound can be used regardless of a natural polymer compound, a synthetic polymer compound, a water-soluble polymer compound, or a water-insoluble polymer compound, and has a harmful effect such as inflammatory or impaired tissue. There is no restriction if it is not.
[0020]
Representative examples of the polymer compound used by blending are selected from the group consisting of polysaccharides, proteins, nucleic acids, and synthetic polymers, but are not limited thereto. Examples of polysaccharides include hyaluronic acid, glycosaminoglycans (heparin, heparan sulfate, dermatan sulfate, etc.), chondroitin sulfate (chondroitin-6-sulfate, etc.), keratin sulfate, alginic acid and biologically acceptable salts thereof. Salt, cellulose, chitin, chitosan, dextran, starch, amylose, polylactic acid, carrageenan and the like.
[0021]
Examples of proteins include collagen, gelatin, albumin, elastin, various globulins, casein, gluten, and the like, and biologically acceptable synthetic derivatives thereof.
[0022]
Examples of the synthetic polymer include polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyglycolic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polylactic acid, copolymers thereof, and acrylic or methacrylic acid poly (hydroxyethyl) ester and polyacrylamide. And derivatives such as polyvinyl alcohol, copolymers of maleic acid and fumaric acid, and the like. The present invention is not limited to these polymer compounds.
[0023]
The water-insoluble carboxymethylcellulose of the present invention can be used in a surgical operation in the form of a sheet, a film, a sponge, a thread, a suspension, a powder, or the like. As a form to be used, for example, it is preferable to apply directly to the internal organ surface as a sheet, a film or a sponge, or to apply the suspension or the powder to the wound surface and its periphery. When affixing, the size of the sheet, film or sponge can be appropriately selected depending on the shape and size of the wound.
Suspension or powder is more effective for tissues with few flat surfaces that are difficult to apply. In addition, carboxymethylcellulose in the form of a suspension which has been made hardly water-soluble can be used for laparoscopic surgery using a syringe or the like. In addition, in the case of an operation at the time of a tendon rupture in a finger, it is possible to use, in addition to these shapes, carboxymethylcellulose made in a string form and made hardly water-soluble. As described above, the carboxymethylcellulose made hardly water-soluble used in the present invention can be selected in shape depending on an application site, and there is no problem even if a plurality of shapes are used in combination.
[0024]
Next, a sterilization process required as a medical device will be described. Since the sugar chain structure of carboxymethyl cellulose is relatively stable to heat and radiation, γ-ray sterilization, electron beam sterilization, ethylene oxide gas sterilization, plasma gas Various sterilization methods such as sterilization or autoclave sterilization can be adopted. For example, γ-ray sterilization or ethylene oxide sterilization is effective for carboxymethylcellulose in solid form such as sheet or sponge which is hardly water-soluble, and in the case of carboxymethylcellulose in hardly water-soluble liquid such as suspension, Autoclave sterilization or dry heat sterilization can be used. The in vitro solubility of carboxymethylcellulose, which has become poorly water-soluble due to the harsh treatment of sterilization, and eventually the phenomenon that the in vivo storage property changes, are confirmed. It is also possible to produce carboxymethyl cellulose which has a long half-life and is hardly soluble in water, and to control the in vivo retention after sterilization.
[0025]
When coloring the product of the present invention, it is necessary to use a dye whose safety has been confirmed when administered parenterally. For example, it can be colored with licorice extract, iron sesquioxide, copper chlorophyllin sodium, permanent violet-R-special, bengalara, medicinal charcoal, etc. described in the Pharmaceutical Excipients Dictionary (edited by the Japan Pharmaceutical Excipients Association). Is arbitrarily determined by the application site and application method, and is not limited at all.
[0026]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited by these.
[0027]
Example 1
Sodium carboxymethyl cellulose having a 1% viscosity at 25 ° C of 150 to 250 mPa · s (degree of etherification: 0.62 to 0.68, reduced molecular weight: 1.28 × 10 5 ~ 1.35 × 10 5 Dalton, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) was dissolved in distilled water to a concentration of 1% by mass. The pH of the aqueous solution thus prepared was adjusted to 1.5 with 1N nitric acid, 15 ml of the acidic aqueous solution was placed in a 30 ml polystyrene container, and then placed in a freezer set at -20 ° C. After allowing to stand for 3 days, it was thawed at 25 ° C. Thereafter, neutralization was performed with water and a phosphate buffer (pH 6.8) having a concentration of 100 mM to obtain carboxymethylcellulose in a sponge form, which was made hardly soluble in water.
[0028]
Example 2
The standing period at −20 ° C. in Example 1 was set to 5 days to obtain a carboxymethyl cellulose in the form of a sponge which was made hardly soluble in water.
[0029]
Example 3
Sodium carboxymethyl cellulose having a 1% viscosity of 1000 to 2800 mPa · s at 25 ° C. (degree of etherification: 0.65 to 0.95, reduced molecular weight: about 3.0 × 10 5 (Dalton, Hercules) was dissolved in distilled water to a concentration of 1% by mass. The pH of the aqueous solution thus prepared was adjusted to 1.5 with 1N nitric acid, 15 ml of the acidic aqueous solution was placed in a 30 ml polystyrene container, and then placed in a freezer set at -20 ° C. After allowing to stand for one day, it was thawed at 25 ° C. Thereafter, neutralization was performed with water and a phosphate buffer (pH 6.8) having a concentration of 100 mM to obtain carboxymethylcellulose in a sponge form, which was made hardly soluble in water.
[0030]
Example 4
The standing period at −20 ° C. in Example 3 was set to 3 days to obtain a carboxymethyl cellulose in a sponge form, which was made hardly soluble in water.
[0031]
Example 5
The carboxymethylcellulose used in Example 1 was mixed with 1N nitric acid at room temperature so as to be 20% by mass, and then stored in a refrigerator at 4 ° C for 3 days. Thereafter, neutralization was performed with water and a phosphate buffer solution (pH 6.8) having a concentration of 100 mM to obtain carboxymethylcellulose in the form of hardly water-soluble lumps.
[0032]
Example 6 Solubility test of carboxymethylcellulose made hardly soluble in water
A phosphate buffered saline of pH 7.4 having the following composition was prepared.
Phosphate buffered saline
Potassium chloride 0.02% by mass
Monopotassium phosphate 0.02% by mass
Disodium phosphate dodecahydrate 0.29% by mass
0.81% by mass of sodium chloride
The obtained water-insoluble carboxymethylcellulose was immersed in phosphate-buffered saline at a ratio of 50 ml of phosphate-buffered saline to water-solubilized carboxymethylcellulose containing 50 mg of carboxymethylcellulose by dry weight. . The ratio of carboxymethylcellulose eluted in phosphate buffered saline at 60 ° C. was determined from the concentration of carboxymethylcellulose in phosphate buffered saline.
Therefore, the solubility of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble in a neutral 60 ° C. aqueous solution is defined by the above test.
[0033]
Measurement of carboxymethylcellulose concentration
The concentration of carboxymethylcellulose in phosphate buffered saline was determined from the peak area of a differential refractive index detector using gel filtration chromatography (GPC).
That is, phosphate buffered saline collected over time was filtered through a 0.45 μm filter, injected into GPC, and calculated by comparing the obtained peak area with the peak area of a known amount of CMC. Table 1 shows the results.
[0034]
[Table 1]
[0035]
From Table 1, for example, Experiment No. Regarding the carboxymethylcellulose made poorly soluble in water obtained in Example 1, the dissolution rate of carboxymethylcellulose was 25% by mass after 3 hours, 35% by mass after 5 hours, and 58% by mass after 10 hours. .
That is, 75% by mass after 3 hours and 65% by mass after 5 hours remained as carboxymethylcellulose that had been rendered water-insoluble. The same applies to carboxymethylcellulose made poorly water-soluble obtained in other examples, and the solubility half-life of carboxymethylcellulose made poorly water-soluble obtained in Examples 1 to 5 is about 7 hours, 12 hours, 15 hours, 18 hours and 8 hours.
[0036]
Experiment No. 1 and Experiment No. Comparison of Experiment No. 2 3 and Experiment No. From the comparison of No. 4, it became clear that the solubility half-life can be controlled by the production conditions even when the carboxymethyl cellulose has the same molecular weight. Experiment No. 1 and Experiment No. In the comparison of No. 5, almost the same solubility half-life was obtained, and it was found that the solubility half-life can be controlled by the conditions used in different production methods.
[0037]
Example 7
After adding physiological saline to the water-insoluble carboxymethylcellulose obtained in Example 1 so that the carboxymethylcellulose concentration becomes 1% by mass, the mixture was crushed with a microhomogenizer (NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER) to make the water poorly water-soluble. A carboxymethyl cellulose slurry was obtained. This slurry is spread on a printing screen, and about 2 mg / cm of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble by drying at about 40 ° C. 2 And a film containing The resulting film had a solubility half-life of about 6 hours.
[0038]
Example 8
After adding physiological saline to the water-insoluble carboxymethylcellulose obtained in Example 3 so that the carboxymethylcellulose concentration becomes 1% by mass, crushing was performed with a microhomogenizer (NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER) to make the water poorly water-soluble. A carboxymethyl cellulose slurry was obtained. This slurry is spread on a printing screen, and about 2 mg / cm of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble by drying at about 40 ° C. 2 And a film containing The resulting film had a solubility half-life of about 13 hours.
[0039]
Comparative Example 1
In Example 1, the quenching time at −20 ° C. was changed to obtain a poorly water-soluble carboxymethyl cellulose having a solubility half-life of about 3 hours in the solubility test of Example 6. After adding physiological saline to the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose so that the carboxymethylcellulose concentration becomes 1% by mass, crushing is performed with a microhomogenizer (NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER), and a slurry of carboxymethylcellulose that is made hardly water-soluble is obtained. Got. This slurry is spread on a printing screen, and about 2 mg / cm of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble by drying at about 40 ° C. 2 And a film containing The resulting film had a solubility half-life of about 2 hours.
[0040]
Comparative Example 2
In Example 3, the standing time at −20 ° C. was changed to obtain a poorly water-soluble carboxymethyl cellulose having a solubility half-life of about 5 hours in the solubility test of Example 6. After adding physiological saline to the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose so that the carboxymethylcellulose concentration becomes 1% by mass, crushing is performed with a microhomogenizer (NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER), and a slurry of carboxymethylcellulose that is made hardly water-soluble is obtained. Got. This slurry is spread on a printing screen, and about 2 mg / cm of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble by drying at about 40 ° C. 2 And a film containing The resulting film had a solubility half-life of about 4 hours.
[0041]
Example 9 Anti-adhesion test in rat cecal scraping model
Adhesion induction method
Rats (SD, female, 9 weeks old or older) were intramuscularly injected with an anesthetic (keratane solution), anesthetized, fixed on their backs, disinfected abdominal skin with isodine, and then shaved. The abdominal muscle of the rat was opened along the midline, the cecum was removed from the abdominal cavity, and the cecum was fixed with a perforated (φ16 mm) polytetrafluoroethylene sheet. A rotating rod (φ13 mm) covered with gauze was pressed against the cecum exposed from the hole, and rubbed about 120 times (two places on one side). About 4 cm × 4 cm pieces of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble obtained in Example 7, Example 8, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 obtained in Example 7, Example 8, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were put back, and the cecum was returned to the original place for suturing.
A control in which the cecum was returned without treatment with the adhesion preventing material was used as a control. These treatments used 10-16 rats in each experiment, including controls. Necropsy was performed about one week after the operation, and the following criteria (fertility and sterility) were used. 66 , 5, 814-821), and the adhesion prevention effect was evaluated as an average adhesion score. Table 2 shows the results.
<Judgment criteria>
0: No adhesion
1: film-like adhesion with a surface that can be easily confirmed
2: Light adhesion with freely peelable surface
3: Medium adhesion with difficult surface peeling
4: dense adhesion with non-peelable surface
[0042]
[Table 2]
[0043]
From Table 2, it can be seen that the films of Examples 7 and 8 having a solubility half-life of about 6 hours and about 13 hours have an adhesion score of less than half compared to the control, and have a low occurrence rate of adhesion. An anti-adhesion effect was observed. On the other hand, a film having a short solubility half-life, that is, a film having a solubility half-life of 4 hours or less, did not show an adhesion preventing effect.
[0044]
Example 10
A physiological saline solution was added to the carboxymethylcellulose obtained in Example 3 in which the carboxymethylcellulose was hardly soluble in water, so that the concentration of carboxymethylcellulose was 1% by mass. A carboxymethylcellulose slurry was obtained. This slurry is spread on a printing screen, and about 2 mg / cm of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble by drying at about 40 ° C. 2 And a film containing The resulting film had a solubility half-life of about 12 hours in the solubility test of Example 6.
[0045]
Example 11
In Example 3, the standing time at −20 ° C. was changed, and the same operation as in Example 10 was performed to make the water-insoluble carboxymethyl cellulose having a solubility half-life of about 20 hours about 2 mg / cm. 2 Was obtained.
[0046]
Example 12
In Example 3, the standing time at −20 ° C. was changed, and the same operation as in Example 10 was performed to make the water-insoluble carboxymethyl cellulose having a solubility half-life of about 30 hours about 2 mg / cm. 2 Was obtained.
[0047]
Comparative Example 3
In Example 3, the standing time at −20 ° C. was changed, and the same operation as in Example 10 was performed to make the water-insoluble carboxymethyl cellulose having a solubility half-life of about 40 hours about 2 mg / cm. 2 Was obtained.
[0048]
Example 13
Example 10, Example 11, Example 12, and Comparative Example 3 were subjected to an adhesion prevention test in the rat cecal abrasion model described in Example 9. Table 3 shows the results.
[0049]
[Table 3]
[0050]
From Table 3, when Example 10 (Experiment No. 11) and Example 8 (Experiment No. 7) were compared, the crushing conditions of the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose were different, but the solubility half-life was low. It became clear that the adhesion prevention effect was almost the same. In addition, it was found that the use of carboxymethyl cellulose which had a long solubility half-life and was hardly soluble in water had an adhesion preventing effect. However, in Experiment No. No effect was observed for films with too long a solubility half-life, such as the result of 14.
Therefore, it was clarified that there was an appropriate range of the solubility half-life for the expression of the adhesion preventing effect.
[0051]
Example 14
After adding physiological saline to the water-insoluble carboxymethylcellulose obtained in Example 5 so that the carboxymethylcellulose concentration becomes 1% by mass, the mixture was crushed with a microhomogenizer (NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER) to make the water poorly water-soluble. A carboxymethyl cellulose slurry was obtained.
[0052]
Example 15
In Example 10, the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose was used as a slurry, and a film was not formed.
[0053]
Example 16
In Example 11, the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose was used as a slurry, and a film was not formed.
[0054]
Example 17
In Example 12, the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose was used as a slurry, and a film was not formed.
[0055]
Example 18
With respect to the slurry of carboxymethyl cellulose made hardly soluble in water obtained in Example 15, a molecular weight of about 2 × 10 6 Sodium hyaluronate of Dalton (manufactured by Denki Kagaku Kogyo Co., Ltd.) was added and dissolved in water-insoluble carboxymethylcellulose at a mass ratio of 1/5, and the water-insoluble carboxymethylcellulose containing sodium hyaluronate was dissolved. Was obtained.
[0056]
Example 19
Sodium alginate (manufactured by Funakoshi) was added to the slurry of carboxymethylcellulose made poorly water-soluble obtained in Example 15 so as to have an equal mass ratio to carboxymethylcellulose made hardly water-soluble, and dissolved. A slurry of carboxymethylcellulose made of sodium and hardly soluble in water was obtained.
[0057]
Example 20
Chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the slurry of carboxymethyl cellulose made hardly soluble in water obtained in Example 15 so as to have a mass ratio of 1/10 and dissolved in carboxymethyl cellulose made hardly soluble in water. Then, a slurry of carboxymethylcellulose containing chitosan and made hardly soluble in water was obtained.
[0058]
Example 21
Polyvinyl alcohol having a polymerization degree of 1500 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the slurry of carboxymethyl cellulose made hardly soluble in water obtained in Example 15 so as to have an equivalent weight ratio to carboxymethyl cellulose made hardly soluble in water. To obtain a slurry of carboxymethylcellulose containing polyvinyl alcohol and made hardly soluble in water.
[0059]
Example 22
With respect to the slurry of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble obtained in Example 15, polyvinyl alcohol having a polymerization degree of 1500 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is reduced to one half in mass ratio to carboxymethylcellulose made hardly water-soluble. Was added and dissolved to obtain a slurry of carboxymethylcellulose containing water-insoluble water containing polyvinyl alcohol.
[0060]
Example 23
In Example 3, the standing time at −20 ° C. was changed to obtain a water-insoluble carboxymethyl cell having a solubility half-life of about 40 hours in the solubility test of Example 6. After adding physiological saline to the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose so that the carboxymethylcellulose concentration becomes 1% by mass, crushing is performed with a microhomogenizer (NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER), and a slurry of carboxymethylcellulose that is made hardly water-soluble is obtained. Got. 100 ml of this slurry is placed in a 200 ml medium bottle for cell culture,
Sterilization was performed in an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. After the sterilization treatment, the solubility test of Example 6 was carried out again to obtain a slurry of carboxymethylcellulose that had been rendered hardly water-soluble with a solubility half-life of about 18 hours.
[0061]
Example 24
The slurries obtained in Examples 14 to 23 were subjected to an adhesion prevention test in a rat cecal scraping model described in Example 9. The various slurries were placed in 1 ml to 5 ml syringes, and a carboxymethylcellulose made hardly water-soluble was attached to the abrasion site so that the amount became 10 mg per rat after attaching an 18G injection needle. Table 4 shows the results.
[0062]
[Table 4]
[0063]
From Table 4, the anti-adhesion effect was observed in the slurry using carboxymethylcellulose made hardly water-soluble with a solubility half-life of 30 hours or less, and sodium hyaluronate (Experiment No. 19) and sodium alginate were added to the carboxymethylcellulose made hardly water-soluble. The effect was also confirmed when other polymer compounds such as (Experiment No. 20), chitosan (Experiment No. 21), and polyvinyl alcohol (Experiment Nos. 22 and 23) were added. Experiment No. 24, the experiment no. The effect was able to be exhibited by adjusting the solubility half-life of the poorly water-soluble carboxymethylcellulose (Comparative Example 3), for which no effect was observed in No. 14, to about 18 hours by autoclave treatment.
[0064]
Example 25
The slurry of carboxymethylcellulose made hardly water-soluble obtained in Example 10 was filtered using a nitrocellulose membrane, and carboxymethylcellulose made hardly water-soluble was fractionated. Ethanol was added to the water-insoluble carboxymethylcellulose so that the water-insoluble water-soluble carboxymethylcellulose was 1% by mass, and the water-insoluble water-soluble carboxymethylcellulose was filtered and washed with ethanol. This washing operation was further repeated twice, and the water-insoluble carboxymethylcellulose obtained was dried in vacuo to obtain a powdery water-insoluble carboxymethylcellulose having a solubility half-life of about 10 hours.
Lactose of 10 times mass was added to the obtained water-insoluble carboxymethylcellulose and mixed with a mortar. This composition was encapsulated in a No. 1 capsule described in the Japanese Pharmacopoeia to obtain a carboxymethylcellulose-containing capsule made hardly water-soluble.
[0065]
Example 26
An adhesion prevention test was performed in a rat caecal abrasion model described in Example 9, and carboxymethylcellulose made hardly water-soluble was applied to the abrasion site using a small atomizer so as to be 10 mg per rat. Table 5 shows the results.
[0066]
[Table 5]
[0067]
From Table 5, it was confirmed that the powdery water-insoluble carboxymethyl cellulose had an adhesion preventing effect. On the other hand, lactose used as a dispersant did not show any adhesion preventing effect.
[0068]
Example 27
The slurry of carboxymethylcellulose insolubilized in water containing sodium hyaluronate obtained in Example 18 was spread on a square petri dish made of polystyrene, dried at 40 ° C., and dried for 1 cm. 2 Thus, a film containing 0.5 g of sodium hyaluronate and 2 g of carboxymethylcellulose was obtained.
[0069]
Example 28
Sodium chlorophyllin sodium was added to the poorly water-soluble carboxymethylcellulose slurry containing sodium hyaluronate obtained in Example 18 so that the mass ratio of the poorly water-soluble carboxymethylcellulose was 1/20. This colored slurry is spread on a polystyrene square petri dish, dried at 40 ° C. and 1 cm 2 Thus, a colored film containing 0.5 g of sodium hyaluronate and 2 g of carboxymethyl cellulose was obtained.
[0070]
Example 29 Antiadhesion test in rabbit abdominal wall defect model
Adhesion induction method
A rabbit (New Zealand White, male, 1.8 to 2.2 kg) was fixed on the back under anesthesia with Nembutal (manufactured by Dainippon Pharmaceutical), and the abdominal skin was disinfected with isodine, followed by shaving. The rabbit abdominal muscle was opened along the midline, and a defect wound was created on the left abdominal wall in an area of 3 cm × 5 cm. The periphery of the defect site was continuously sutured with 4-0 bicryl, and knots were formed on each side and each corner of the defect wound. The second to twentieth bulges on the ventral and dorsal sides of the cecum were scraped with a surgical brush to create congestion. About 4 cm x 8 cm pieces of the film obtained in Example 27 and Example 28 were applied to the abdominal wall defect and sutured. In addition, a control that was reopened without applying a film was used as a control. Such treatments used 5-6 rabbits in each experiment, including controls. Necropsy was performed about 2 weeks after the operation, and the following criteria (fertility and sterility) were used. 66 , 5, 814-821), and the adhesion preventing effect was evaluated based on the range in which the abdominal wall defect was involved in adhesion and the ease with which the formed adhesion was released. Table 6 shows the results.
<Criteria of adhesion range>
0: No adhesion
1: Up to 25% of the abdominal wall defect is involved in adhesions
2: Up to 50% of the abdominal wall defect is involved in adhesions
3: Up to 75% of the abdominal wall defect is involved in adhesions
4: Up to 100% of the abdominal wall defect is involved in adhesion
<Judgment criteria for ease of adhesion peeling>
0: No adhesion
1: Easy peeling
2: Difficult to peel
3: Cannot be peeled
[0071]
[Table 6]
[0072]
From Table 6, Experiment No. 28 and Experiment No. Comparing the situation at the time of application of No. 29, in the film of Example 28 (Experiment No. 29), it was easy to identify the application site even in the presence of blood due to coloring, and the application site was confirmed even 15 hours after application. . In addition, the effect of preventing adhesion was confirmed irrespective of the presence or absence of coloring, and it was confirmed that the pigment used for coloring did not cause adverse effects such as promoting adhesion formation.
[0073]
Example 30 Cytotoxicity test of carboxymethyl cellulose made hardly soluble in water
Water-insoluble carboxymethyl cellulose obtained in Examples 1 to 5, Example 7, Example 8, Example 11, Example 12, Example 18, Examples 18 to 21 and Example 28, and water-insoluble A cytotoxicity test was performed on the carboxymethylcellulose composition thus obtained.
In a normal human skin-derived fibroblast culture, the water-insoluble carboxymethylcellulose obtained in the present invention was allowed to coexist without contact, and the cytotoxicity was evaluated by observing the cell growth behavior. The preparation was immersed in a phosphate buffered saline and then freeze-dried. 20 mg of the freeze-dried product was mechanically pulverized and placed in a cell culture insert (pore size: 3 μm) manufactured by Falcon and immersed in a medium in which cells were seeded. In addition, culture in the absence of carboxymethylcellulose, which was made hardly water-soluble, was used as a control.
Culture conditions Plate: 12 well plate for cell culture
Medium: DMEM medium + 10% fetal bovine serum, 2 ml / well
Temperature: 37 ° C (5% CO 2 under)
Number of seeded cells: 1 × 10 4 Pieces / well
[0074]
Two days, five days and eight days after the start of the culture, the cell density was observed using an inverted microscope. Even when carboxymethylcellulose made hardly water soluble coexisted, it showed good growth like the control, and it was found that the carboxymethylcellulose made hardly water soluble and the composition thereof obtained in the present invention had no cytotoxic effect. Was.
[0075]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, carboxymethylcellulose made poorly water-soluble, which is obtained without using any chemical crosslinking agent or chemical modifier, has an antiadhesion effect by controlling the solubility in vitro. Can be The use of a chemical cross-linking agent or a chemical modifying agent prevents adverse effects on biocompatibility, and furthermore, the form is easily controlled, so that it is useful as an adhesion preventing material at the time of surgery. In addition, coloring makes it easy to identify the application site, and is effective in reducing the burden on the operator in the final stage of the surgical operation.
