JP2004051490A - Chemical luminescent compound and its manufacturing method - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a derivative of lucigenin having permeability through a biomembrane. <P>SOLUTION: The chemical luminescent compound having permeability through a biomembrane is represented by formula (1). A chemical luminescent reagent and a kit for measuring active oxygen, both containing the compound, are provided. In formula (1), R<SP>1</SP>and R<SP>2</SP>are each independently a 1-12C alkyl group, a 2-6C alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group; R<SP>3</SP>, R<SP>4</SP>, R<SP>5</SP>and R<SP>6</SP>are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a 1-10C alkyl group, a 1-10C alkoxyl group, an aryl group or an aryloxy group; Q<SP>q-</SP>is a q-valent anion of a carboxylic acid having a ClogP of 0.5-7 and a pKa of 1.5-6; and q is a valence number of the carboxylic acid. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００９】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−１２アルキル基、Ｃ_２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ_１−１０アルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｑ^ｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。］で表される生体膜への透過性を有する化学発光化合物、式（２）
【００１０】
【化８】

【００１１】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−１２アルキル基、Ｃ_２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ_１−１０アルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｚ⁻は、ラウリン酸イオン、安息香酸イオン又はパラシアノ安息香酸イオンを意味する。］で表される化合物、該化合物を含有する化学発光試薬、該化合物を含有する活性酸素測定用キット、　式（３）
【００１２】
【化９】

【００１３】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−１２アルキル基、Ｃ_２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ_１−１０アルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｘ^ｎ−は、ｎ価の陰イオンを意味し、ｎは、１又は２を表す。］で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹ^ｍ＋ _ｑＱ^ｑ− _ｍ（式中、Ｑ^ｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味し、Ｙ^ｍ＋は、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンを意味し、ｍは、Ｙがアルカリ金属の場合１を、アルカリ土類金属の場合２を意味する。）で表される化合物を混合し、加温することを特徴とする式（１）
【００１４】
【化１０】

【００１５】
［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｑ^ｑ−及びｑは前記と同じ意味を表す。］で表される化合物の製造法及び式（４）
【００１６】
【化１１】

【００１７】
［式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立に、Ｃ_１−１２アルキル基、Ｃ_２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ_１−１０アルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味する。］で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類とＨ^＋ _ｑＱ^ｑ−（式中、Ｑ^ｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のイオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。）を酸素の存在下反応させることを特徴とする式（１）
【００１８】
【化１２】

【００１９】
［式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｑ^ｑ−及びｑは前記と同じ意味を表す。］で表される化合物の製造に関するものである。
【００２０】
尚、本明細書中、ｐＫａは、酸性度を意味し、ＣＬｏｇＰは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＡＣＤ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｓｏｌａｒｉｓ　Ｖ４．６７を用いたＬｏｇＰの計算値を意味する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
【００２２】
まず、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７及びＹ^ｍ＋の各置換基における語句について説明する。
【００２３】
尚、本明細書中「ｎ」はノルマルを、「ｉ」はイソを、「ｓ」はセカンダリーを、「ｔ」はターシャリーを、「ｃ」はシクロを、「ｏ」はオルトを、「ｍ」はメタを、「ｐ」はパラを意味する。
【００２４】
Ｃ_１−１０アルキル基としては、直鎖、分枝及び環状のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｃ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｃ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｃ−オクチル基、ｎ−ノニル基及びｎ−デシル基等が挙げられ、Ｃ_１−１２アルキル基としては、これらに加え、ｎ−ウンデシル基及びｎ−ドデシル基等が挙げられる。
【００２５】
Ｃ_２−６アルケニル基としては、直鎖、分枝及び環状のアルケニル基が含まれ、ビニル基、アリル基、２−プロぺニル基、１−メチルビニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−メチル−１−プロぺニル基、１−メチル−２−プロぺニル基、２−メチル−２−プロぺニル基、１−エチル−２−ビニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１，２−ジメチル−１−プロぺニル基、１，２−ジメチル−２−プロぺニル基、１−エチル−１−プロぺニル基、１−エチル−２−プロぺニル基、１−メチル−１−ブテニル基、１−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−１−ブテニル基、１−ｉ−プロピルビニル基、２，４−ペンタジエニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、５−ヘキセニル基、２，４−ヘキサジエニル基、１−メチル−１−ペンテニル基、１−ｃ−ペンテニル基及び１−ｃ−ヘキセニル基等が挙げられる。
【００２６】
Ｃ_１−１０アルコキシ基としては、直鎖、分枝及び環状のアルコキシ基が含まれ、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｃ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｃ−ブトキシ基、ｎ−ペントキシ基、ｃ−ペントキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｃ−ヘキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基、ｃ−ヘプチルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｃ−オクチルオキシ基、ｎ−ノニルオキシ基及びｎ−デシルオキシ基等が挙げられる。
【００２７】
アリール基としては、フェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルフェニル基、ｐ−メチルフェニル基、α−ナフチル基及びβ−ナフチル基等が挙げられる。
【００２８】
ハロゲン化アリール基としては、ｏ−フルオロフェニル基、ｍ−フルオロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−クロロフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｏ−ブロモフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−ブロモフェニル基、ｏ−ヨードフェニル基、ｍ−ヨードフェニル基及びｐ−ヨードフェニル基等が挙げられる。
【００２９】
アリーロキシ基としては、フェノキシ基、ｏ−メチルフェノキシ基、ｍ−メチルフェノキシ基、ｐ−メチルフェノキシ基、α−ナフトキシ基及びβ−ナフトキシ基等が挙げられる。
【００３０】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。
【００３１】
アルカリ金属イオンのとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオン等が挙げられる。
【００３２】
アルカリ土類金属イオンとしては、カルシウムイオン及びマグネシウムイオン等が挙げられる。
【００３３】
次に、好ましいＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６及びＲ^７の具体例について説明する。
【００３４】
好ましいＲ^１の具体例としてはメチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ドデシル基、アリル基及びベンジル基等が挙げられ、より好ましくはメチル基が挙げられる。
【００３５】
好ましいＲ^２の具体例としてはメチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ドデシル基、アリル基及びベンジル基等が挙げられ、より好ましくはメチル基が挙げられる。
【００３６】
好ましいＲ^３の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３７】
好ましいＲ^４の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３８】
好ましいＲ^５の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３９】
好ましいＲ^６の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００４０】
好ましいＲ^７の具体例としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｃ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基及びｃ−ヘキシル基等が挙げられ、又、例えば、メチル等が挙げられる。
【００４１】
式（１）で表される化合物のうち、好ましい化合物を以下に示す。
１．Ｒ^１及びＲ^２がメチル基である式（１）で表される化合物。
２．Ｒ^１及びＲ^２がメチル基であり、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６が水素原子である式（１）で表される化合物。
３．Ｒ^１及びＲ^２がメチル基であり、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６が水素原子であり、Ｑ^ｑ−がラウリン酸イオン、安息香酸イオン又はパラシアノ安息香酸イオンである式（１）で表される化合物。
【００４２】
Ｘ^ｎ−の具体例としては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、ＮＯ_３ ⁻、ＣｌＯ_４ ⁻、ＮＣＳ⁻、ＳＯ_４ ^２−及びＣＯ_３ ^２−等の無機イオン並びにＣＨ_３ＣＯＯ⁻、ＣＨ_３ＳＯ_４ ⁻、Ｃ_２Ｈ_５ＳＯ_４ ⁻及びｐ−トルエンスルホン酸イオン等の有機イオンを挙げることができ、好ましくは無機イオンを挙げることができ、より好ましくは、ヨウ化物イオン、ＮＯ_３ ⁻、ＣｌＯ_４ ⁻及びＮＣＳ⁻等を挙げることができ、更に好ましくは、ＮＯ_３ ⁻を挙げることができる。
【００４３】
Ｙ^ｍ＋の具体例としては、リチウムイオン（Ｌｉ^＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）及びカリウムイオン（Ｋ^＋）等のアルカリ金属イオン並びにカルシウムイオン（１／２Ｃａ^２＋）及びマグネシウムイオン（１／２Ｍｇ^２＋）等のアルカリ土類金属イオンが挙げられ、好ましくは、アルカリ金属イオンが挙げられ、より好ましくは、ナトリウムイオン及びカリウムイオン等が挙げられ、更に好ましくは、カリウムイオンが挙げられる。
【００４４】
生体膜とは、生体内に存在する、原形質に接する表面膜及びそれに類する膜を意味し、具体的には、細胞膜及び細胞内小器官の限界膜等を意味する。
【００４５】
式（１）中で、Ｑ^ｑ−は、カルボン酸のｑ価の陰イオンを意味しているが、該カルボン酸の脂溶性が低すぎると、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類として生体膜を透過する事ができず、高すぎると水に溶解しなくなるため、使用できなくなる。
【００４６】
上記カルボン酸の脂溶性を、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＡＣＤ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｓｏｌａｒｉｓ　Ｖ４．６７を用いたＬｏｇ　Ｐの計算値（ＣＬｏｇＰ）で表すと、通常、０．５〜７の範囲であり、好ましくは、例えば、１〜７の範囲、例えば、１〜６の範囲、例えば、１．５〜５．５の範囲を挙げることができる。
【００４７】
ここで、ＣＬｏｇＰ　値とは、化学物質の１−オクタノール／水分配係数の１０を底とする対数（ＬｏｇＰ）をｆ値法（疎水性フラグメント定数法）により計算で求めた値をいう。具体的には化学物質をその構成要素に分解し、各フラグメントの有する疎水性フラグメント定数（ｆ値）を積算することにより求めることができるが、本願記載のＣＬｏｇＰ　値は、上記のようにＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＡＣＤ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｓｏｌａｒｉｓ　Ｖ４．６７を用いた値を使用した。
【００４８】
又、上記カルボン酸の酸性度も生体膜の透過性には重要であり、酸性度をｐＫａで表すと、通常、１．５〜６の範囲であり、好ましくは、例えば、２〜６の範囲、例えば、２〜５．５の範囲、例えば、３〜５の範囲を挙げることができる。
【００４９】
上記カルボン酸のｑ価の陰イオンである、Ｑ^ｑ−の具体例としては、２−メチル−３−エチルペンタン酸イオン、２，２−ジメチルヘキサン酸イオン、３−メチルヘプタン酸イオン、カプリル酸イオン、ペラルゴン酸イオン、カプリン酸イオン、ウンデカン酸イオン及びラウリン酸イオン等の脂肪族カルボン酸イオン、安息香酸イオン、オルトフルオロ安息香酸イオン、メタフルオロ安息香酸イオン、パラフルオロ安息香酸イオン、オルトクロロ安息香酸イオン、メタクロロ安息香酸イオン、パラクロロ安息香酸イオン、オルトブロモ安息香酸イオン、メタブロモ安息香酸イオン、パラブロモ安息香酸イオン、オルトシアノ安息香酸イオン、メタシアノ安息香酸イオン、パラシアノ安息香酸イオン、オルトフタル酸イオン、メタフタル酸イオン及びテレフタル酸イオン等の芳香族カルボン酸イオンが挙げられ、好ましくは、ラウリン酸イオン、安息香酸イオン及びパラシアノ安息香酸イオン等が挙げられる。
【００５０】
次に、式（１）で表される化合物の製造法について説明する。
【００５１】
式（１）で表される化合物の製造法をスキーム１に示した。
スキーム１
【００５２】
【化１３】

【００５３】
即ち、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹ^{ｍ ＋} _ｑＱ^ｑ− _ｍで表されるカルボン酸塩を溶媒中加温して塩交換を行うことにより、式（１）で表される化合物を製造する事ができる。
【００５４】
式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、合成品を用いることができるが、市販品を用いてもよい。
【００５５】
Ｙ^ｍ＋ _ｑＱ^ｑ− _ｍで表されるカルボン酸塩の使用量としては、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して、通常、２当量以上を使用することができ、好ましくは、４〜１２当量の範囲である。
【００５６】
式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹ^ｍ＋ _ｑＱ^ｑ− _ｍで表されるカルボン酸塩を混合する際の温度は、特に限定はしないが、通常０℃〜溶媒の沸点が使用され、好ましくは２０〜１１０℃の範囲である。
【００５７】
加温する際の温度は、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類及びＹ^ｍ＋ _ｑＱ^ｑ− _ｍで表されるカルボン酸塩が完全に溶解する温度であれば特に限定はしないが、通常２０〜１００℃の範囲を使用することができ、好ましくは、５０℃〜１００℃の範囲である。
【００５８】
加温する時間は、加温する際の温度等により変化するため、一概に決定できないが、例えば加温する際の温度が９０℃の場合、０．１時間以上の範囲を使用することができ、好ましくは、０．５〜５時間加温すれば充分である。
【００５９】
本反応で使用する溶媒としては、反応に関与せず、且つＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類及びＹ^ｍ＋ _ｑＱ^ｑ− _ｍで表されるカルボン酸塩を溶解しうるものであれば特に限定はしないが、例えばメタノール及びエタノール等のアルコール系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒及び水等が挙げられ、好ましい溶媒としては、水が挙げられる。
【００６０】
更に、これらの反応溶媒は、単独又は組み合わせて使用することもできる。
【００６１】
次に、式（１）で表される化合物の別の製造法について説明する。
【００６２】
式（１）で表される化合物の別の製造法をスキーム２に示した。
スキーム２
【００６３】
【化１４】

【００６４】
即ち、式（４）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類とＨ^＋ _ｑＱ^ｑ−で表されるカルボン酸を酸素の存在下で、溶媒中反応させることにより、式（１）で表される化合物を製造する事ができる。
【００６５】
Ｈ^＋ _ｑＱ^ｑ−で表されるカルボン酸の使用量としては、式（４）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類に対して、通常、０．５〜１０当量を使用することができ、好ましくは、０．８〜３当量の範囲である。
【００６６】
酸素源としては、酸素ガス、酸素と不活性ガスとの混合ガス及び空気等を使用することができるが、簡便性から空気が好ましい。
【００６７】
酸素圧は、常圧下で反応を行うことができるが、加圧条件下でも反応を行うことができる。
【００６８】
反応する際の温度は、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類及びＨ^＋ _ｑＱ^ｑ−で表されるカルボン酸が完全に溶解する温度であれば特に限定はしないが、通常０〜１００℃の範囲を使用することができ、好ましくは、２０℃〜５０℃の範囲である。
【００６９】
反応する時間は、加温する際の温度等により変化するため、一概に決定できないが、例えば反応する際の温度が室温の場合、１０〜１００時間反応させれば充分である。
【００７０】
本反応で使用する溶媒としては、反応に関与せず、且つＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類及びＨ^＋ _ｑＱ^ｑ−で表されるカルボン酸を溶解しうるものであれば特に限定はしないが、通常、水と有機溶剤の混合溶媒系で行うのが好ましい。この際に使用する有機溶剤としては例えばジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒が好ましい。
【００７１】
更に、これらの反応溶媒は、単独又は組み合わせて使用することもできる。
【００７２】
反応終了後、冷却による結晶化、クロマトグラフィー（担体としては、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０等を用いることができ、溶離液としては、例えば、メタノール等を用いることができる。）による精製、再結晶による精製等により、純度の高い式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００７３】
次に、式（１）で表される化合物を含有する化学発光試薬について説明する。
【００７４】
式（１）で表される化合物を化学発光試薬として使用する場合、結晶状態及び適当な溶剤に溶解した溶液状態を使用する事ができ、溶剤としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、緩衝溶液及びそれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００７５】
次に、式（１）で表される化合物を含有する活性酸素測定用キットについて説明する。
【００７６】
式（１）で表される化合物を活性酸素測定用キットに使用する場合、結晶状態及び適当な溶剤に溶解した溶液状態等で使用する事ができる。
【００７７】
活性酸素測定用キットの構成としては、本発明の化合物の結晶及び結晶に類する状態のもののみでも使用できるが、これに溶剤として適当な溶媒を加えてもよく、又、適当な溶剤に溶解した溶液のみの構成でもよい。
【００７８】
又、更に発光増強剤や添加剤を加えることもできる。
【００７９】
溶剤としては、生体膜に損傷を与えないものであれば特に限定はしないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、緩衝溶液及びそれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００８０】
緩衝溶液としては、通常塩基性緩衝液が用いられ、具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００８１】
発光増強剤としては、フェノール性化合物等が挙げられ、具体的には、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール及びホタルルシフェリン等が挙げられ、好ましくは、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾール等が挙げられる。
【００８２】
上記発光増強剤は、単独で使用してもよく、又二種以上の発光増強剤を組み合わせて使用することもできる。
【００８３】
添加剤としては、界面活性剤やキレート剤を挙げることができる。
【００８４】
次に、式（１）で表される化合物の原料である、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の製造法について説明する。
【００８５】
式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類のうち、硝酸塩である化合物（３−ａ）の製造法をスキーム３に示した。
スキーム３
【００８６】
【化１５】

【００８７】
即ち、化合物（４）を希硝酸（ｄｉｌ．ＨＮＯ_３）で処理することにより目的の（３−ａ）を製造することができる。
【００８８】
尚、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類のうち、硝酸塩以外の塩は、（３−ａ）の塩交換により製造することができる。
【００８９】
次に、原料である化合物（４）の製造法を説明する。
【００９０】
式（４）で表される化合物のうち、アクリジン環の４つの置換基のうち、（４−ａ）及び（４−ｂ）で表される化合物の製造法をスキーム４に示した。
スキーム４
【００９１】
【化１６】

【００９２】
即ち、酸化第１銅（Ｃｕ_２Ｏ）及び炭酸カリウム（Ｋ_２ＣＯ_３）の存在下、化合物（５）と化合物を（６）をカップリングさせ、化合物（７）とした後、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）で閉環してアクリドン誘導体（８）とし、窒素原子上に置換基を導入して、（９）とした後、亜鉛−塩酸（Ｚｎ／ＨＣｌ）で、（９）の２分子を還元的にカップリングさせることにより、目的の（４−ａ）及び（４−ｂ）を製造することができる。
【００９３】
尚、式（４）で表される化合物のうち、（４−ａ）及び（４−ｂ）で表される化合物以外の化合物は、それぞれ置換基の異なる２種類の（９）をカップリングさせることにより製造することができる。
【００９４】
本願発明の化合物は、活性酸素で発光し、且つ生体膜への透過性を有するため、その発光強度を測定することにより、細胞内や組織内における活性酸素量を直接測定することを可能とする。
【００９５】
本願発明の化合物は、大型の装置を用いることなく細胞内や組織内における活性酸素量を直接測定することを可能とするため、簡便で安価な測定方法を提供しうる。
【００９６】
本願発明の化合物は、細胞や組織における活性酸素量と相関が深いとされる疾患、例えば癌、虚血性臓器障害、動脈硬化、炎症、老化等の機序解明のためのツールとして、新規探索化合物の評価用ツールとして、又、該疾患の検査薬として利用することが可能である。
【００９７】
【実施例】
以下、実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９８】
参考例１（Ｎ−メチルアクリドンの合成）
【００９９】
【化１７】

【０１００】
アクリドン（８．２０ｇ，４２ｍｍｏｌ）（市販品）に水酸化ナトリウムのエタノール溶液（２．７２ｇ，６８ｍｍｏｌ／１００ｍＬ）を加え、８０℃で１．５時間加熱還流し、減圧下溶媒を留去した後、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、８０ｍＬ）を加えて溶液とした。ヨウ化メチル（４．３２ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１時間加熱した後、反応用液を水に注ぎ入れた。析出した固体を濾取し、エタノールから再結晶することにより、目的物７．８５ｇを８９．５％の収率で得た。
【０１０１】
参考例２（Ｎ，Ｎ’−ジメチルビアクリデンの合成）
【０１０２】
【化１８】

【０１０３】
Ｎ−メチルアクリドン（９００ｍｇ，４．３１ｍｍｏｌ）をエタノール５０ｍＬに溶解し、そこに活性亜鉛（２．８ｇ，４３ｍｍｏｌ）を添加し、激しく攪拌した。そこに３５％塩酸−エタノール溶液（１０／５０ｍＬ）をゆっくり滴下した。２時間加熱した後、反応用液を水に注ぎ入れた。析出した固体を濾取し、エタノールから再結晶することにより、目的物を４５％の収率で得た。
【０１０４】
実施例１（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩の合成）
【０１０５】
【化１９】

【０１０６】
Ｎ，Ｎ’−ジメチルビアクリデン（２１ｍｇ，０．０５３ｍｍｏｌ）及びパラシアノ安息香酸（１４．７ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに加え、溶解するまで攪拌した。水２０ｍＬを加え、空気存在下、室温で数日間激しく攪拌した。水層を分取し、更に有機相を水で抽出した。得られた水層を減圧下で水を留去する事により、目的の１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩の粗物３４ｍｇ（収率９４．５％）を得た。得られた粗物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
外観：黄土色固体、融点：１４２℃〜黄土色から茶色に分解
【０１０７】
実施例２（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩の合成）
【０１０８】
【化２０】

【０１０９】
パラシアノ安息香酸の代わりに安息香酸を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行うことにより、目的の１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩の粗物を収率２４％で得た。得られた粗物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
外観：深緑色固体、融点：１３７℃〜深緑色から黒色に分解
【０１１０】
実施例３（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩の合成）
【０１１１】
【化２１】

【０１１２】
パラシアノ安息香酸の代わりにラウリン酸を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行うことにより、目的の１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩の粗物を得た。得られた粗物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
外観：黄土色固体、融点：１３４℃〜黄土色から茶色に分解
【０１１３】
実施例４（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩の膜透過性試験）
マウスの腹腔から採取した好中球のＰＢＳ希釈液に、１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩のジメチルスルホキシド溶液を添加し、３７℃で２０分培養後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞内での蛍光が観測されたため、膜透過性を示すことが確認された。
【０１１４】
実施例５（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩の膜透過性試験）
マウスの腹腔から採取した好中球のＰＢＳ希釈液に、１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩のジメチルスルホキシド溶液を添加し、３７℃で２０分培養後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞内での蛍光が観測されたため、膜透過性を示すことが確認された。
【０１１５】
実施例６（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩の膜透過性試験）
マウスの腹腔から採取した好中球のＰＢＳ希釈液に、１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩のジメチルスルホキシド溶液を添加し、３７℃で２０分培養後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞内での蛍光が観測されたため、膜透過性を示すことが確認された。
【０１１６】
比較例１
１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩をルシゲニンに替えた以外は、実施例４と同様の操作を行った結果、細胞内での蛍光は観測されず、膜透過性を示さなかった。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明のルシゲニンの誘導体は、生体膜に対する透過性を有するため、例えば細胞内の活性酸素測定用の化学発光試薬として有用であり、又、有用な細胞内の活性酸素測定用キットを提供する。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel chemiluminescent compound having permeability to a biological membrane, a chemiluminescent reagent containing the compound, a kit for analyzing active oxygen containing the compound, and a method for producing the compound.
[0002]
Problems to be solved by the prior art and the invention
Lucigenin (N, N'-dimethyl-9,9'-bisacridinium dinitrate) is known to exhibit low light in an alkaline aqueous solution, and to emit strong light when hydrogen peroxide is added. Has been used as a chemiluminescent reagent.
[0003]
Utilizing the above properties, lucigenin has been used in a method for quantifying active oxygen released from cells and a luminescence immunoassay, and its usefulness has been expanded.
[0004]
However, among lucigenin and its derivatives (N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts), compounds having permeability to biological membranes (mainly cell membranes) have not been found. Therefore, it cannot be used for a measurement method in a cell, such as quantification of active oxygen in the cell.
[0005]
Therefore, a lucigenin derivative having permeability to a biological membrane is desired.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to overcome the above problems, and as a result, have found a compound having a permeability to a biological membrane among organic acid salts of lucigenin, and have completed the present invention.
[0007]
That is, the present invention relates to formula (1)
[0008]
Embedded image

[0009]
[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group, and Q ^q− represents a ClogP of 0.5 to 7 means a q-valent anion of a carboxylic acid having a pKa of 1.5 to 6, and q means a valence of the carboxylic acid. A chemiluminescent compound having a permeability to a biological membrane represented by the formula (2):
[0010]
Embedded image

[0011]
[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group, and Z ⁻ represents a laurate ion, a benzoate ion Or paracyanobenzoate ion. A chemiluminescent reagent containing the compound, a kit for measuring active oxygen containing the compound, formula (3)
[0012]
Embedded image

[0013]
[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group, and X ^n- represents an n-valent anion. And n represents 1 or 2. N represented by], N'-disubstituted-9,9'-bis acridinium salt and ^Y _m + ^{q Q q-} _m ^{(wherein, Q q-} is, CLogP is 0.5 to 7 and pKa means a valent anion of a carboxylic acid having a valence of 1.5 to 6, q means the valence of the carboxylic acid, and Y ^{m +} means an alkali metal ion or an alkaline earth metal ion. , M means 1 when Y is an alkali metal and 2 when Y is an alkaline earth metal), and heats the mixture.
[0014]
Embedded image

[0015]
[Wherein, R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , Q ^q- and q represent the same meaning as described above. And a compound represented by the formula (4):
[0016]
Embedded image

[0017]
[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group. ], And N ⁺ N'-disubstituted-9,9'-biacridene and H ⁺ _q Q ^q- (wherein Q ^q- has a CLogP of 0.5 to 7 and a pKa of 1. (5) means an ion of a carboxylic acid which is 5 to 6, and q means a valence of the carboxylic acid) in the presence of oxygen.
[0018]
Embedded image

[0019]
[Wherein, R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , Q ^q- and q represent the same meaning as described above. ] The production of the compound represented by the formula:
[0020]
In this specification, pKa means acidity, and CLogP means Advanced Chemistry Development (ACD) Software. It means the calculated value of LogP using Solaris V4.67.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[0022]
First, the terms in the substituents R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ and Y ^{m +} will be described.
[0023]
In this specification, "n" is normal, "i" is iso, "s" is secondary, "t" is tertiary, "c" is cyclo, "o" is ortho, ""m" means meta and "p" means para.
[0024]
The C _1-10 alkyl group includes a linear, branched and cyclic alkyl group, and includes a methyl group, an ethyl group, a n-propyl group, an i-propyl group, a c-propyl group, an n-butyl group, -Butyl group, s-butyl group, t-butyl group, c-butyl group, n-pentyl group, c-pentyl group, n-hexyl group, c-hexyl group, n-heptyl group, c-heptyl group, n -Octyl group, c-octyl group, n-nonyl group, n-decyl group and the like. Examples of the _C1-12 alkyl group include n-undecyl group and n-dodecyl group.
[0025]
The C _2-6 alkenyl group includes linear, branched and cyclic alkenyl groups, and includes a vinyl group, an allyl group, a 2-propenyl group, a 1-methylvinyl group, a 1-butenyl group, and a 2-butenyl. Group, 3-butenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl-2-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-ethyl-2-vinyl group, 1 -Pentenyl group, 2-pentenyl group, 3-pentenyl group, 4-pentenyl group, 1,2-dimethyl-1-propenyl group, 1,2-dimethyl-2-propenyl group, 1-ethyl-1 -Propenyl group, 1-ethyl-2-propenyl group, 1-methyl-1-butenyl group, 1-methyl-2-butenyl group, 2-methyl-1-butenyl group, 1-i-propylvinyl Group, 2,4-pentadienyl group, 1-hexenyl group, 2-hexenyl Group, 3-hexenyl group, 4-hexenyl group, 5-hexenyl group, 2,4-hexadienyl group, 1-methyl-1-pentenyl group, 1-c-pentenyl group, 1-c-hexenyl group and the like. .
[0026]
The C _1-10 alkoxy group includes a linear, branched and cyclic alkoxy group, and includes a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an i-propoxy group, a c-propoxy group, an n-butoxy group, -Butoxy, s-butoxy, t-butoxy, c-butoxy, n-pentoxy, c-pentoxy, n-hexyloxy, c-hexyloxy, n-heptyloxy, c-heptyl Examples thereof include an oxy group, an n-octyloxy group, a c-octyloxy group, an n-nonyloxy group, and an n-decyloxy group.
[0027]
Examples of the aryl group include a phenyl group, an o-methylphenyl group, an m-methylphenyl group, a p-methylphenyl group, an α-naphthyl group and a β-naphthyl group.
[0028]
Examples of the halogenated aryl group include o-fluorophenyl, m-fluorophenyl, p-fluorophenyl, o-chlorophenyl, m-chlorophenyl, p-chlorophenyl, o-bromophenyl, and m-bromophenyl. Group, p-bromophenyl group, o-iodophenyl group, m-iodophenyl group, p-iodophenyl group and the like.
[0029]
Examples of the aryloxy group include a phenoxy group, an o-methylphenoxy group, an m-methylphenoxy group, a p-methylphenoxy group, an α-naphthoxy group and a β-naphthoxy group.
[0030]
Halogen atoms include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
[0031]
Examples of the alkali metal ion include a lithium ion, a sodium ion and a potassium ion.
[0032]
Examples of the alkaline earth metal ion include a calcium ion and a magnesium ion.
[0033]
Next, specific examples of preferable R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ and R ⁷ will be described.
[0034]
Specific examples of preferred R ¹ include a methyl group, an ethyl group, an n-butyl group, an n-octyl group, an n-dodecyl group, an allyl group, and a benzyl group, and more preferably a methyl group.
[0035]
Preferred methyl group Specific examples of R ^2, ethyl group, n- butyl group, n- octyl group, n- dodecyl group, an allyl group and benzyl group, and more preferably methyl group.
[0036]
Specific examples of preferred R ³ include a hydrogen atom and a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
[0037]
Specific examples of preferable R ⁴ include a hydrogen atom and a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
[0038]
Specific examples of preferred R ⁵ include a hydrogen atom and a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
[0039]
Specific examples of preferred R ⁶ include a hydrogen atom and a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
[0040]
Specific examples of preferred R ⁷ include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, c-propyl group, n-butyl group, i-butyl group, s-butyl group, t-butyl group , C-butyl group, n-pentyl group, c-pentyl group, n-hexyl group, c-hexyl group and the like, and for example, methyl and the like.
[0041]
Preferred compounds among the compounds represented by the formula (1) are shown below.
1. A compound represented by the formula (1), wherein R ¹ and R ² are methyl groups.
2. A compound represented by the formula (1), wherein R ¹ and R ² are methyl groups, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are hydrogen atoms.
3. Formula (1) in which R ¹ and R ² are a methyl group, R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are a hydrogen atom, and Q ^q- is a laurate ion, a benzoate ion or a paracyanobenzoate ion. A compound represented by the formula:
[0042]
Specific examples of X ⁿ⁻ include inorganic ions such as fluoride ion, chloride ion, bromide ion, iodide ion, NO ₃ ⁻ , ClO ₄ ⁻ , NCS ⁻ , SO ₄ ²⁻ and CO ₃ ²⁻ and CH ^{2 −} . Organic ions such as ₃ COO ⁻ , CH ₃ SO ₄ ⁻ , C ₂ H ₅ SO ₄ ⁻ and p-toluenesulfonic acid ion can be mentioned, preferably an inorganic ion can be mentioned, and more preferably iodide. _ion, ^NO 3 ^_-, ClO ₄ - and NCS ^-, etc. can be mentioned, more preferably, NO ₃ ^- and the like.
[0043]
Specific examples of Y ^{m +} include alkali metal ions such as lithium ion (Li ⁺ ), sodium ion (Na ⁺ ) and potassium ion (K ⁺ ), and calcium ion (1 / 2Ca ²⁺ ) and magnesium ion (1 / 2Mg ^2+). ) And the like, preferably an alkali metal ion, more preferably a sodium ion and a potassium ion, and still more preferably a potassium ion.
[0044]
The biological membrane means a surface membrane in contact with the plasma and a membrane similar thereto, which is present in a living body, and specifically refers to a cell membrane and a limiting membrane of an intracellular organelle.
[0045]
In the formula (1), Q ^q- means a q-valent anion of the carboxylic acid. If the carboxylic acid has too low fat solubility, N, N′-disubstituted -9,9 ′ is used. -It cannot pass through biological membranes as bisacridinium salts, and if it is too high, it will not dissolve in water and cannot be used.
[0046]
The lipophilicity of the carboxylic acid was determined by using Advanced Chemistry Development (ACD) Software. Expressed as a calculated value of Log P (CLogP) using Solaris V4.67, it is usually in the range of 0.5 to 7, preferably in the range of 1 to 7, for example, in the range of 1 to 6, For example, the range is 1.5 to 5.5.
[0047]
Here, the CLogP value refers to a value obtained by calculating a logarithm (LogP) having a base of 10 of a 1-octanol / water partition coefficient of a chemical substance by an f-value method (hydrophobic fragment constant method). Specifically, it can be determined by decomposing a chemical substance into its constituent elements and integrating the hydrophobic fragment constant (f value) of each fragment. The CLogP value described in the present application is, as described above, Advanced Chemistry. Development (ACD) Software. Values using Solaris V4.67 were used.
[0048]
The acidity of the carboxylic acid is also important for the permeability of the biological membrane. When the acidity is expressed in pKa, it is usually in the range of 1.5 to 6, preferably in the range of 2 to 6, for example. For example, a range of 2 to 5.5, for example, a range of 3 to 5 can be mentioned.
[0049]
Specific examples of Q ^q- which is a q-valent anion of the carboxylic acid include 2-methyl-3-ethylpentanoate ion, 2,2-dimethylhexanoate ion, 3-methylheptanoate ion, and caprylic acid. Ions, aliphatic carboxylate ions such as pelargonate ion, caprate ion, undecanoate ion and laurate ion, benzoate ion, orthofluorobenzoate ion, metafluorobenzoate ion, parafluorobenzoate ion, orthochlorobenzoate Ion, metachlorobenzoate ion, parachlorobenzoate ion, orthobromobenzoate ion, metabromobenzoate ion, parabromobenzoate ion, orthocyanobenzoate ion, metacyanobenzoate ion, paracyanobenzoate ion, orthophthalate ion, metaphthalate ion And aromatic carboxylate ions such as terephthalate ion, preferably laurate ion, benzoate ion and paracyanobenzoate ion.
[0050]
Next, a method for producing the compound represented by the formula (1) will be described.
[0051]
The method for producing the compound represented by the formula (1) is shown in Scheme 1.
Scheme 1
[0052]
Embedded image

[0053]
That is, Equation (3) N represented by the carboxylate warmed solvent represented by N'- disubstituted-9,9'-bis acridinium salt and Y m + q Q q- m By performing the salt exchange, the compound represented by the formula (1) can be produced.
[0054]
As the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt represented by the formula (3), a synthetic product can be used, but a commercial product may be used.
[0055]
The amount of carboxylic acid salt represented by Y m + q Q q- m, N of the formula (3), with respect N'- disubstituted-9,9'-bis acridinium salts, Usually, 2 or more equivalents can be used, preferably in the range of 4 to 12 equivalents.
[0056]
Temperature in mixing N, carboxylate represented by N'- disubstituted-9,9'-bis acridinium salt and Y m + q Q q- m of formula (3) are, in particular Although not limited, a boiling point of 0 ° C. to the solvent is usually used, and preferably in the range of 20 to 110 ° C.
[0057]
Temperature for heating is, N of the formula (3), a carboxylic acid salt represented by N'- disubstituted-9,9'-bis acridinium salts and Y m + q Q q- m The temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which it completely dissolves. Usually, a temperature in the range of 20 to 100 ° C can be used, and the temperature is preferably in the range of 50 to 100 ° C.
[0058]
The heating time varies depending on the temperature at the time of heating, etc., and thus cannot be unconditionally determined. For example, when the temperature at the time of heating is 90 ° C., a range of 0.1 hour or more can be used. Preferably, heating for 0.5 to 5 hours is sufficient.
[0059]
Examples of the solvent used in this reaction include N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts which do not participate in the reaction and carboxylate salts represented by Y m + q Qq - m. There is no particular limitation as long as it can be dissolved, but examples thereof include alcohol solvents such as methanol and ethanol, amide solvents such as N, N-dimethylformamide, and water. Preferred solvents include water. .
[0060]
Further, these reaction solvents can be used alone or in combination.
[0061]
Next, another method for producing the compound represented by the formula (1) will be described.
[0062]
Another method for producing the compound represented by the formula (1) is shown in Scheme 2.
Scheme 2
[0063]
Embedded image

[0064]
Ie, N is represented by the formula (4), N'disubstituted-9,9' Biakuriden compound with ^H ₊ q ^Q carboxylic acid represented by ^q- in the presence of oxygen, reacting in a solvent As a result, the compound represented by the formula (1) can be produced.
[0065]
The amount of H ⁺ _q Q ^q- represented by carboxylic acid, N of the formula (4), with respect N'- disubstituted-9,9' Biakuriden acids, usually, 0.5 10 to 10 equivalents can be used, preferably in the range of 0.8 to 3 equivalents.
[0066]
As the oxygen source, an oxygen gas, a mixed gas of oxygen and an inert gas, air, and the like can be used, but air is preferred from the viewpoint of simplicity.
[0067]
The reaction can be carried out under an oxygen pressure at normal pressure, but the reaction can also be carried out under pressurized conditions.
[0068]
Temperature for the reaction, at a temperature N of the formula (3), is N'- disubstituted-9,9' Biakuriden acids and ^H ₊ q ^{Q q-} carboxylic acid represented completely dissolved There is no particular limitation as long as it is present, but usually a range of 0 to 100 ° C can be used, and preferably a range of 20 ° C to 50 ° C.
[0069]
The reaction time varies depending on the temperature at the time of heating and the like, and thus cannot be unconditionally determined. For example, when the temperature at the time of the reaction is room temperature, it is sufficient to carry out the reaction for 10 to 100 hours.
[0070]
The solvent used in this reaction, does not participate in the reaction, those and N, capable of dissolving N'- disubstituted-9,9' Biakuriden acids and H ⁺ _q Q carboxylic acid represented by ^q- There is no particular limitation as long as it is present, but it is usually preferable to use a mixed solvent system of water and an organic solvent. As the organic solvent used at this time, for example, a halogen-based solvent such as dichloromethane, chloroform and dichloroethane is preferable.
[0071]
Further, these reaction solvents can be used alone or in combination.
[0072]
After completion of the reaction, crystallization by cooling, purification by chromatography (for example, Sephadex LH20 or the like can be used as a carrier, and methanol or the like can be used as an eluent), or purification by recrystallization Thus, a highly pure compound represented by the formula (1) can be obtained.
[0073]
Next, a chemiluminescent reagent containing the compound represented by the formula (1) will be described.
[0074]
When the compound represented by the formula (1) is used as a chemiluminescent reagent, it can be used in a crystalline state or in a solution state dissolved in an appropriate solvent. Examples of the solvent include water, dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol, Examples include buffer solutions and mixed solvents thereof.
[0075]
Next, a kit for measuring active oxygen containing the compound represented by the formula (1) will be described.
[0076]
When the compound represented by the formula (1) is used in a kit for measuring active oxygen, it can be used in a crystalline state, a solution state dissolved in an appropriate solvent, or the like.
[0077]
As a configuration of the kit for measuring active oxygen, only the crystals of the compound of the present invention and those in a state similar to the crystals can be used, but a suitable solvent may be added as a solvent thereto, or the compound may be dissolved in a suitable solvent. A configuration using only a solution may be used.
[0078]
Further, a luminescence enhancer and an additive may be further added.
[0079]
The solvent is not particularly limited as long as it does not damage the biological membrane, and examples thereof include water, dimethylsulfoxide (DMSO), ethanol, a buffer solution, and a mixed solvent thereof.
[0080]
As the buffer solution, a basic buffer is usually used, and specific examples include Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, carbonate buffer, and glycine-sodium hydroxide buffer.
[0081]
Examples of the luminescence enhancer include phenolic compounds and the like. Specifically, p-hydroxycinnamic acid, p-phenylphenol, p- (4-chlorophenyl) phenol, p- (4-bromophenyl) phenol, p- -(Iodophenyl) phenol, p-iodophenol, p-bromophenol, p-chlorophenol, 6-hydroxybenzothiazole, 2-naphthol, firefly luciferin and the like, preferably p-phenylphenol, p-iodo Examples include phenol and 6-hydroxybenzothiazole.
[0082]
The above-mentioned luminescence enhancers may be used alone, or two or more luminescence enhancers may be used in combination.
[0083]
Examples of the additive include a surfactant and a chelating agent.
[0084]
Next, a method for producing an N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt represented by the formula (3), which is a raw material of the compound represented by the formula (1), will be described.
[0085]
Among the N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the formula (3), a method for producing a compound (3-a) which is a nitrate is shown in Scheme 3.
Scheme 3
[0086]
Embedded image

[0087]
That is, the target compound (3-a) can be produced by treating the compound (4) with dilute nitric acid (dil. HNO ₃ ).
[0088]
Among the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts represented by the formula (3), salts other than nitrates can be produced by the salt exchange of (3-a). it can.
[0089]
Next, a method for producing compound (4) as a raw material will be described.
[0090]
Scheme 4 shows a method for producing the compounds represented by (4-a) and (4-b) among the four substituents on the acridine ring among the compounds represented by the formula (4).
Scheme 4
[0091]
Embedded image

[0092]
That is, in the presence of cuprous oxide (Cu ₂ O) and potassium carbonate (K ₂ CO ₃ ), compound (5) and compound (6) are coupled to form compound (7), and then sulfuric acid (H) ₂ SO ₄ ) to form an acridone derivative (8), a substituent is introduced on a nitrogen atom to obtain (9), and zinc-hydrochloric acid (Zn / HCl) is used to convert two molecules of (9). The desired (4-a) and (4-b) can be produced by reductive coupling.
[0093]
In addition, among the compounds represented by the formula (4), compounds other than the compounds represented by (4-a) and (4-b) couple two kinds of (9) having different substituents. It can be manufactured by the following.
[0094]
Since the compound of the present invention emits light with active oxygen and has permeability to biological membranes, it is possible to directly measure the amount of active oxygen in cells and tissues by measuring the emission intensity. .
[0095]
Since the compound of the present invention enables direct measurement of the amount of active oxygen in cells and tissues without using a large-sized device, it can provide a simple and inexpensive measurement method.
[0096]
The compound of the present invention is a novel search compound as a tool for elucidating the mechanism of diseases that are deeply correlated with the amount of active oxygen in cells and tissues, such as cancer, ischemic organ damage, arteriosclerosis, inflammation, and aging. It can be used as a tool for evaluation of the disease or as a test drug for the disease.
[0097]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0098]
Reference Example 1 (Synthesis of N-methylacridone)
[0099]
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[0100]
To an acridone (8.20 g, 42 mmol) (commercially available) was added an ethanol solution of sodium hydroxide (2.72 g, 68 mmol / 100 mL), and the mixture was heated under reflux at 80 ° C. for 1.5 hours, and the solvent was distilled off under reduced pressure. , DMF (dimethylformamide, 80 mL) was added to obtain a solution. After adding methyl iodide (4.32 mL, 40 mmol) and heating at 100 ° C. for 1 hour, the reaction solution was poured into water. The precipitated solid was collected by filtration and recrystallized from ethanol to give 7.85 g of the desired product in a yield of 89.5%.
[0101]
Reference Example 2 (Synthesis of N, N'-dimethylbiacridene)
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[0103]
N-methylacridone (900 mg, 4.31 mmol) was dissolved in 50 mL of ethanol, and active zinc (2.8 g, 43 mmol) was added thereto, followed by vigorous stirring. A 35% hydrochloric acid-ethanol solution (10/50 mL) was slowly added dropwise thereto. After heating for 2 hours, the reaction solution was poured into water. The precipitated solid was collected by filtration and recrystallized from ethanol to give the desired product in a yield of 45%.
[0104]
Example 1 (Synthesis of 10,10'-dimethyl-9,9'-bisacridinium paracyanobenzoate)
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[0106]
N, N'-dimethylbiacridene (21 mg, 0.053 mmol) and paracyanobenzoic acid (14.7 mg, 0.1 mmol) were added to 20 mL of dichloromethane and stirred until dissolved. 20 mL of water was added, followed by vigorous stirring at room temperature for several days in the presence of air. The aqueous layer was separated, and the organic phase was extracted with water. Water was distilled off from the obtained aqueous layer under reduced pressure to obtain 34 mg of the desired 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium paracyanobenzoate (94.5% yield). ) Got. The obtained crude product was purified by column chromatography on Sephadex LH-20.
Appearance: ocher solid, melting point: 142 ° C-decomposed from ocher to brown
Example 2 (Synthesis of 10,10'-dimethyl-9,9'-bisacridinium benzoate)
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[0109]
The same procedure as in Example 1 was carried out, except that benzoic acid was used instead of paracyanobenzoic acid, to give a crude product of the desired 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium benzoate. Was obtained with a yield of 24%. The obtained crude product was purified by column chromatography on Sephadex LH-20.
Appearance: dark green solid, melting point: 137 ° C.-Decomposed from dark green to black
Example 3 (Synthesis of 10,10'-dimethyl-9,9'-bisacridinium laurate)
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[0112]
The same procedure as in Example 1 was carried out, except that lauric acid was used instead of paracyanobenzoic acid, to obtain a crude product of the target 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium laurate. Got. The obtained crude product was purified by column chromatography on Sephadex LH-20.
Appearance: ocher solid, melting point: 134 ° C-decomposed from ocher to brown
Example 4 (Membrane permeability test of 10,10'-dimethyl-9,9'-bisacridinium paracyanobenzoate)
A dimethylsulfoxide solution of 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium paracyanobenzoate was added to a PBS diluted solution of neutrophils collected from the abdominal cavity of the mouse, and cultured at 37 ° C. for 20 minutes. As a result of observation with a fluorescence microscope, intracellular fluorescence was observed, and it was confirmed that the cells exhibited membrane permeability.
[0114]
Example 5 (Membrane permeability test of 10,10'-dimethyl-9,9'-bisacridinium benzoate)
A dimethylsulfoxide solution of 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium benzoate was added to a PBS diluted solution of neutrophils collected from the abdominal cavity of the mouse, and cultured at 37 ° C. for 20 minutes. As a result of observation with a fluorescence microscope, intracellular fluorescence was observed, and it was confirmed that the cells exhibited membrane permeability.
[0115]
Example 6 (Membrane permeability test of 10,10'-dimethyl-9,9'-bisacridinium laurate)
A dimethylsulfoxide solution of 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium laurate was added to a PBS diluted solution of neutrophils collected from the abdominal cavity of the mouse, and cultured at 37 ° C. for 20 minutes. As a result of observation with a fluorescence microscope, intracellular fluorescence was observed, and it was confirmed that the cells exhibited membrane permeability.
[0116]
Comparative Example 1
As a result of performing the same operation as in Example 4 except that lucigenin was used instead of 10,10′-dimethyl-9,9′-bisacridinium paracyanobenzoate, no fluorescence in the cells was observed. It did not show membrane permeability.
[0117]
【The invention's effect】
Since the lucigenin derivative of the present invention has permeability to biological membranes, it is useful, for example, as a chemiluminescent reagent for measuring intracellular active oxygen, and provides a useful kit for measuring intracellular active oxygen.

Claims (17)

Equation (1)

[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group, and Q ^q− represents a ClogP of 0.5 to 7 means a q-valent anion of a carboxylic acid having a pKa of 1.5 to 6, and q means a valence of the carboxylic acid. ] A chemiluminescent compound having permeability to a biological membrane represented by the formula: The chemiluminescent compound having permeability to a biological membrane according to claim 1, wherein R ¹ and R ² are methyl groups, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are hydrogen atoms. Equation (2)

[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group, and Z ⁻ represents a laurate ion, a benzoate ion Or paracyanobenzoate ion. ] The compound represented by these. The compound according to claim 1, wherein R ¹ and R ² are a methyl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are a hydrogen atom. The chemiluminescent compound according to claim 3 or 4. A chemiluminescent compound having permeability to a biological membrane according to claim 3 or 4. A chemiluminescent reagent comprising the compound according to claim 1, 2, 3, or 4. A kit for measuring active oxygen, comprising the compound according to claim 1, 2, 3, or 4. Equation (3)

[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group, and X ^n- represents an n-valent anion. And n represents 1 or 2. N represented by], N'-disubstituted-9,9'-bis acridinium salt and ^Y _m + ^{q Q q-} _m ^{(wherein, Q q-} is, CLogP is 0.5 to 7 and pKa means a valent anion of a carboxylic acid having a valence of 1.5 to 6, q means the valence of the carboxylic acid, and Y ^{m +} means an alkali metal ion or an alkaline earth metal ion. , M means 1 when Y is an alkali metal and 2 when Y is an alkaline earth metal), and heats the mixture.

[Wherein, R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , Q ^q- and q represent the same meaning as described above. ] The manufacturing method of the compound represented by this. The amount of Y _m ⁺ _{q Q} ^q- m The production method of compound of claim 9 is 2 equivalents or more relative to the compound represented by formula (3). The method for producing a compound according to claim 10, wherein the heating temperature is in the range of 50C to 100C. 2 / ^{nX n-is} 2NO ₃ ^- a is claim 9, preparation of a compound according to claim 10 or claim 11. The method for producing a compound according to claim 12, wherein Y ^{m +} is an alkali metal ion. Equation (4)

[Wherein, R ¹ and R ² each independently represent a C _1-12 alkyl group, a C _2-6 alkenyl group, a benzyl group, an aryl group or a halogenated aryl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a C _1-10 alkyl group, a C _1-10 alkoxy group, an aryl group or an aryloxy group. ], And N ⁺ N'-disubstituted-9,9'-biacridene and H ⁺ _q Q ^q- (wherein Q ^q- has a CLogP of 0.5 to 7 and a pKa of 1. (5) means an ion of a carboxylic acid which is 5 to 6, and q means a valence of the carboxylic acid) in the presence of oxygen.

[Wherein, R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , Q ^q- and q represent the same meaning as described above. ] The manufacturing method of the compound represented by this. The method for producing a compound according to claim 14, wherein air is used as oxygen. R ¹ and R ² are a methyl group, and R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are a hydrogen atom, claim 9, claim 10, claim 11, claim 12, claim 13, and claim 14. Or a method for producing the compound according to claim 15. The method according to claim 16, wherein Q ^q- is laurate ion, benzoate ion or paracyanobenzoate ion.