【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシドホスホリラーゼを用いたヌクレオシド化合物の製造法に関する。各種のヌクレオシド及びそのアナログ化合物は、抗ウイルス医薬品、抗ガン医薬品やアンチセンス医薬品などの原料または原体として使用される。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分解できる酵素の総称であり、次式で表される反応を触媒する。
ヌクレオシド＋リン酸（塩）→塩基＋１−リン酸化糖誘導体
プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンホスホリラーゼに大別される該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平０１−１０４１９０号）、２´−デオキシアデノシン（特開平１１−１３７２９０号）または２´−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号）を製造する方法が開示されている。
【０００３】
更に、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０（１），ＰＰ．１２１〜１２６，（１９８６）では、イノシンをリン酸存在下で、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた反応により、リボース１−リン酸とヒポキサンチンに分解した後、イオン交換樹脂で単離したリボース１−リン酸と１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドより、同じくＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、抗ウイルス剤であるリバビリンを製造する技術が報告されている。
【０００４】
しかしながら、該酵素の逆反応を利用して、ペントース−１−リン酸またはその塩と核酸塩基よりヌクレオシド化合物を生成させる反応は平衡反応であるため、転化率が向上しないという技術的欠点を有していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体からヌクレオシドホスホリラーゼの作用により汎用性の高いヌクレオシド誘導体の製造方法を提供することであり、さらに、同反応におけるヌクレオシドの転化率の向上方法を提供し、低コストで高純度のヌクレオシド誘導体の製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、課題を達成するべく鋭意検討を行い、１−リン酸化糖誘導体をヌクレオシドホスホリラーゼ存在下、リン酸基と核酸塩基誘導体の交換反応によりヌクレオシド誘導体を製造する方法において、塩基性アニオン交換樹脂等のイオン交換樹脂にリン酸塘誘導体を吸着させ、ヌクレオシドホスホリラーゼと核酸塩基誘導体を加えることにより、高い転化率でヌクレオシド誘導体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］一般式（１）［化４］
【０００８】
【化４】
【０００９】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素原子、メチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ３はアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは１から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｐおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｐ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｐ＋＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｐ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｐ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｐ＋ｒ）を満たす。）〕で示される１−リン酸化糖誘導体をヌクレオシドホスホリラーゼ存在下、リン酸基と核酸塩基誘導体の交換反応により、一般式（２）［化５］
【００１０】
【化５】
【００１１】
（式中、Ｂは、独立してそれぞれピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒは請求項３記載の一般式（１）と同義である。）で示されるヌクレオシド誘導体を製造する方法において、イオン交換樹脂の存在下に該交換反応を行うことを特徴とする一般式（２）で示されるヌクレオシド誘導体の製造法。
［２］ イオン交換樹脂が強塩基性アニオン交換樹脂、弱塩基性アニオン交換樹脂、中塩基性アニオン交換樹脂である請求項１記載の製造法。
［３］ 一般式（１）で示される１−リン酸化糖誘導体が式（３）［化６］
【００１２】
【化６】
【００１３】
で示される１−リン酸化糖およびその塩であることを特徴とする請求項１記載の製造法。
［４］ １−リン酸化塘誘導体と反応させる核酸塩基誘導体がアデニン、グアニン、シトシン、チミンである請求項１に記載のヌクレオシド誘導体の製造方法、［５］ ヌクレオシドホスホリラーゼが、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のヌクレオシドの製造法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる１−リン酸化糖類としては、好ましくはフコース、ラムノース、ジギトキソース、オレアンドロース、キノボースのような６−デオキシ糖類、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースのようなヘキソース類、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースのようなペントース類、エリトロース、トレオースのようなテトロース類、グルコサミン、ダウノサミンのようなアミノ糖類、グルクロン酸、ガラクツロン酸のようなウロン酸類、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、ペンツロースのようなケトース類、２−デオキシリボースのようなデオキシ糖類といったＤ系列もしくはＬ系列よりなる天然型単糖由来の残基、ピラノース型あるいはフラノース型の非天然糖由来の残基、並びにそれらが有する水酸基および／またはアミノ基が保護もしくはアシル化された糖残基誘導体、またはそれらが有する水酸基がフッ素などのハロゲン原子で置換されたハロゲン化糖残基を有する天然型単糖由来もしくは非天然糖由来の残基のうち、１位水酸基がリン酸化された糖の誘導体を示す。
Ｒ１又はＲ２で表される保護されたヒドロキシメチル基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、ホルミル基、アシル基、シリル基、アルキル基、アラルキル基、カルボニル基があり、中でも好ましくは、ホルミル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基、アルコキシアルキル基、ハロゲン化アルキル基、アラルキル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００１５】
脂肪族アシル基としては、アルキルカルボニル基またはハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基が挙げられる。
【００１６】
上記のアルキルカルボニル基の具体例として、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノニルカルボニル基、デシルカルボニル基、３−メチルノニルカルボニル基、８−メチルノニルカルボニル基、３−エチルオクチルカルボニル基、３，７−ジメチルオクチルカルボニル基、ウンデシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、トリデシルカルボニル基、テトラデシルカルボニル基、ペンタデシルカルボニル基、ヘキサデシルカルボニル基、１−メチルペンタデシルカルボニル基、１４−メチルペンタデシルカルボニル基、１３，１３−ジメチルテトラデシルカルボニル基、ヘプタデシルカルボニル基、１５−メチルヘキサデシルカルボニル基、オクタデシルカルボニル基などを例示することができる。
【００１７】
また、ハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基の具体例として、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基などを例示することができる。
【００１８】
芳香族アシル基としては、アリールカルボニル基、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシアリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、アリール化アリールカルボニル基を挙げることができる。
【００１９】
上記のアリールカルボニル基の具体例として、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基などを例示することができる。
【００２０】
また、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基の具体例として、２−フルオロベンゾイル基、３−フルオロベンゾイル基、４−フルオロベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、２，４−ジクロロベンゾイル基、２，６−ジクロロベンゾイル基、３，４−ジクロロベンゾイル基、３，５−ジクロロベンゾイル基などを例示することができる。
【００２１】
また、低級アルキル化アリールカルボニル基の具体例として、２−トルオイル基、３−トルオイル基、４−トルオイル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル基などを例示することができる。
【００２２】
さらに、低級アルコキシアリールカルボニル基の具体例として、２−アニソイル基、３−アニソイル基、４−アニソイル基などを例示することができる。
【００２３】
ニトロ化アリールカルボニル基の具体例として、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、３，５−ジニトロベンゾイル基などを例示することができる。
【００２４】
さらに、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基の具体例として、２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基などを、アリール化アリールカルボニル基の具体例として、４−フェニルベンゾイル基などを例示することができる。
【００２５】
シリル基としては、低級アルキルシリル基、アリール基で置換された低級アルキルシリル基を挙げることができる。
【００２６】
低級アルキルシリル基の具体例として、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、トリイソプロピルシリル基を例示することができる。
【００２７】
アリール基で置換された低級アルキルシリル基の具体例として、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基などを例示することができる。
【００２８】
アラルキル基としては、低級アルキル基で置換されたアラルキル基、低級アルコキシ基で置換されたアラルキル基、ニトロ基で置換されたアラルキル基、ハロゲン置換されたアラルキル基、シアノ基で置換されたアラルキル基を挙げることができる。
【００２９】
これらの具体的な基を例示すると、２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基、２−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、２−クロロベンジル基、３−クロロベンジル基、４−クロロベンジル基、２−ブロモベンジル基、３−ブロモベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−シアノベンジル基、３−シアノベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。
【００３０】
アラルキルオキシカルボニル基としては、低級アルキル基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、低級アルコキシ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、ニトロ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基、ハロゲン置換されたアラルキルオキシカルボニル基、シアノ基で置換されたアラルキルオキシカルボニル基を挙げることができる。
【００３１】
これらの具体例として、２−メチルベンジルオキシカルボニル基、３−メチルベンジルオキシカルボニル基、４−メチルベンジルオキシカルボニル基、２，４，６−トリメチルベンジルオキシカルボニル基、２−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３−メトキシベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、３−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボニル基、３−クロロベンジルオキシカルボニル基、４−クロロベンジルオキシカルボニル基、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基、３−ブロモベンジルオキシカルボニル基、４−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２−シアノベンジルオキシカルボニル基、３−シアノベンジルオキシカルボニル基、４−シアノベンジルオキシカルボニル基などを挙げることができる。
【００３２】
アルコキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル化合物、アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルボニル基を挙げることができる。
【００３３】
低級アルコキシカルボニル基の具体例として、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などを例示することができる。
【００３４】
ハロゲン置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基を、低級アルキルシリル基で置換されたアルコキシカルボニル基の具体例として、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などを例示することができる。
【００３５】
アルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−メトキシエトキシメチル基のようなアルコキシアルキル基、２，２，２−トリクロロエチル基のようなハロゲン化アルキル基、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基のようなアリール基で置換された低級アルキル基が挙げられる。
【００３６】
これらの中で、好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アラルキル基であり、さらに好ましくは、４−トルオイル基、４−クロロベンゾイル基、またはベンジル基である。
【００３７】
Ｒ１およびＲ２で表される保護されたカルボキシル基における保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指す。そのような基としては、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基のような低級アルキル基、２−（トリメチルシリル）エチル基、２−（トリエチルシリル）エチル基のようなシリル化された低級アルキル基あるいは前述のアラルキル基、アルコキシアルキル基などを挙げることができる。さらに好ましくは、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、またはベンジル基である。
【００３８】
Ｘで示すハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を示す。
Ｘで表されるアルコキシ基、アルキルチオ基としては、例えば、前述の低級アルキル基、アラルキル基、アルコキシアルキル基を有するアルコキシ基、アルキルチオ基を挙げることができる。さらに好ましくは、メトキシ基、メトキシエトキシ基、メチルチオ基である。
【００３９】
Ｚで表される置換されてよい炭素原子とは、一般式で表した置換基が１つないし２つ置換した炭素原子を表し、置換していない場合には、水素原子で置換されている炭素原子を指す。
【００４０】
Ｒ３で表されるアシル基としては、例えば、前述の脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、さらに、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基のような低級アルカンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基のようなアリールスルホニル基を挙げることができる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルカンスルホニル基であり、具体的には、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基である。
【００４１】
本発明に用いられる核酸塩基誘導体とはＤＮＡやＲＮＡの化合構造形式要素となっている窒素原子を含む複素環式化合物であり、ピリミジン、プリン、あるいは塩基アナログからなる群から選択された天然または非天然型の核酸塩基を示し、それら塩基はハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノオキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。
【００４２】
置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜７のアルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数１〜７のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、アリルなどの炭素数２〜７のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数２〜７のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数２〜７のアルキニル基が例示される。アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数１〜７のアルコキシ基が例示される。アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、エチルメルカプトなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル、エチルフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルを有するアルキルフェニル基；メトキシフェニル、エトキシフェニルなどの炭素数１〜５のアルコキシを有するアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル、ブロモフェニルなどのハロゲノフェニル基などが例示される。
【００４３】
ピリミジンを具体的に例示すれば、シトシン、ウラシル、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨ−ドシトシン、５−ヨ−ドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルシトシン、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２−オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。
【００４４】
プリンを具体的に例示すれば、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−サイクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）などが挙げられる。
【００４５】
塩基アナログを具体的に例示すれば、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。
【００４６】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸存在下でヌクレオシド化合物のＮ−グリコシド結合を分解する酵素の総称であり、本発明においては逆反応を利用することができる。反応に使用する酵素は、相当するペントース−１−リン酸と核酸塩基から目的とするヌクレオシド化合物を生成しうる活性を有していればいかなる種類及び起源のものでもかまわない。該酵素はプリン型とピリミジン型に大別されが、公知なものとしては例えば、プリン型としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジン型としてピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）などが挙げられる。
【００４７】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物とは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物であれば特に限定はされない。
【００４８】
このような微生物の具体例としては、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイヘラ（Ｋｌｕｙｖｅｒｅ）属、ミコバクテリウム（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ミコプラナ（Ｍｉｃｏｐｌａｎａ）属、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、好熱性のバチルス属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ザルチナ（Ｓａｒｔｉｎａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属、ロドコッッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属またはシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に含まれる微生物株を好適な例として挙げることができる。
【００４９】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
【００５０】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼまたは、該酵素活性を有する微生物としては市販の酵素、該酵素活性を有する微生物菌体、及び菌体処理物またはそれらの固定化物などが使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。
【００５１】
原料である１−リン酸化糖誘導体はＳｉｇｍａ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社などの試薬メーカーから購入するか、または
１）１−臭素化糖とリン酸銀塩とを縮合する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１２１，Ｐ４６５（１９３７）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７８，Ｐ８１１（１９５６）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７９，Ｐ５０５７（１９５７））、
２）１−ハロゲン化糖とジベンジルリン酸のトリエチルアミン塩とを縮合する方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．７７，Ｐ３４２３（１９５５）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８０，Ｐ１９９４（１９５８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０６，Ｐ７８５１（１９８４）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５９，Ｐ６９０（１９９４））、
３）１−アセチル化糖を正リン酸と加熱縮合する方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７，Ｐ１１０７（１９６２）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ１１７（１９６６）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３，Ｐ４６３（１９６７）、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０，Ｐ５７４（１９７２））、
４）１位をイミデート化して活性化した後にジベンジルリン酸と縮合する方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６１，Ｐ１８１（１９７８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２））、
５）１位をタリウムやリチウムアルコラートとして活性化した後にジベンジルリン酸クロリドで処理する方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．９４，Ｐ１６５（１９８１）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３，Ｐ４０５（１９８２））、
６）ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシドの加リン酸分解反応を行って、１−リン酸化糖誘導体を製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８４、Ｐ４３７、１９５０）等を利用して得ることが出来る。
本発明で使用するイオン交換樹脂とは交換基に４級アミンを有する強塩基性アニオン交換樹脂、３級アミンを有する弱塩基性アニオン交換樹脂、脂肪族アミンを有する中塩基性アニオン交換樹脂である。具体的には強塩基性アニオン交換樹脂としてＭＰ５００（レバチッド）、Ｓ６３２８Ａ（レバチッド）、弱塩基性アニオン交換樹脂としてＭＰ６２（レバチッド）、中塩基アニオン交換樹脂としてはＶＰＯＣ１０６５（レバチッド）等が挙げられる。
【００５２】
１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体の反応は、通常、溶媒の存在下に行われる。使用される溶媒としては、反応を阻害しなければ特に限定はないが、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の水性溶媒、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン、アニソールのような芳香族炭化水素類、メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ｎ−ブチル、炭酸ジエチルエステルのようなエステル類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジグリムのようなエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−イミダゾリジノンのようなアミド類、アセトン、２−ブタノン、メチルイソプロピルケトン、メチルイソブチルケトンのようなケトン類、ジメチルホルムアミドが挙げられ、それらから選択される１種ないし２種以上からなる混合溶媒を挙げることができる。好適には水、メタノールである。
塩基性アニオン交換樹脂を用いる反応法としては、樹脂塔内等での循環法、反応槽内等での攪拌法などが挙げられるが特に限定はない。
反応において交換樹脂、１−リン酸化塘誘導体、核酸塩基誘導体、酵素液の添加方法としては一括添加、分割添加、連続添加等の方法があるが特に限定はない。交換樹脂量としては特に限定はないが、通常は１−リン酸化糖類に対して０．１から１０．０当量の交換容量、好適には１．０から３．０当量の交換容量の範囲で行なわれる
溶媒の量としては特に制限はないが、通常は交換樹脂量に対して０．１から１０倍量である。好適には０．５から３．０倍量である。
【００５３】
反応温度は、特に限定はなく、通常、０℃から８０℃、好適には２０℃から７０℃の範囲で行われる。
【００５４】
反応時間は、出発原料、試薬および溶媒の種類、反応温度によって異なるが、通常、１分間から７８時間、好適には０．５時間から２４時間で達成される。
【００５５】
本反応における１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体との比率は特に限定はないが、通常、核酸塩基誘導体の使用量は１−リン酸化糖誘導体に対し０．３から３等量、好適には０．６から２等量である。
【００５６】
このように反応して製造したヌクレオシド化合物は、濾過、活性炭による吸脱着処理、濃縮、晶析、溶解などの常法を適用することにより単離することができる。
【００５７】
【実施例】
以下に実施例により、本発明を更に詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５８】
生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ５１４ ３００×６．０ｍｍＩ．Ｄ．
（ＹＭＣ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）
カラム温度：４０℃
ポンプ流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ、
溶離液：２０ｍＭのリン酸ニ水素カリウム水溶液（２０００ｍｌ）にアセトニトリル４０ｍｌを加え混合、脱気する。
内標準物質：ｐ−アミノ安息香酸
【００５９】
参考例１ 酵素液の調製
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００６０】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社）に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００６１】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。
【００６２】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。
【００６３】
このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０９０５と名づけた。
エシェリヒア・コリ ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。得られた培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、菌体を集めた。菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、超音波により破砕したものを酵素源として用いた。
【００６４】
実施例１
２´−デオキシグアノシンの合成（１）
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００ レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量 ２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、参考例１で調製された酵素液（０．５ｍｌ）とグアニン（２．８７ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応液をＨＰＬＣで分析した結果、所望の２´−デオキシグアノシンを反応収率８３％で得た。
【００６５】
実施例２
２´−デオキシアデノシンの合成
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００ レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量 ２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、参考例１で調製された酵素液（０．５ｍｌ）とアデニン（２．５７ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応マスをＨＰＬＣにて分析した結果、所望の２´−デオキシグアノシンを反応収率８６％で得た。
【００６６】
実施例３
２´−デオキシシチジンの合成
純水２０ｇに強塩基性アニオン交換樹脂（ＭＰ５００ レバチッド：交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２０ｍｌ（総交換容量 ２４ｍｍｏｌ）と２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（４．９６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加え、室温下、３０分間攪拌した。３０分後、参考例１で調製された酵素液（０．５ｍｌ）とシトシン（２．１１ｇ、１９ｍｍｏｌ）加え、攪拌下、５０℃で１０時間反応した。１０時間後に反応マスをＨＰＬＣにて分析した結果、所望の２´−デオキシシチジンを反応収率８０％で得た。
【００６７】
参考例２
２−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩の合成
２−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（１ｇ、２．４２ｍｍｏｌ、ＳＩＧＭＡ製）をメタノール（１０ｇ）に懸濁し、アンモニアガス（０．６２ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を吹き込み、５０℃で２時間攪拌する。得られた反応マスを３０℃でろ過後、メタノール（５ｇ）で２回洗浄、乾燥し、所望の２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（アンモニウム）塩（０．５７ｇ）を収率９５％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ， ２７０ ＭＨｚ） ｄ ５．５６ （ｓ， １ Ｈ）， ４．０３ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．５２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ３．３，１２．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ３．４１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．３， １２．２ Ｈｚ， １ Ｈ）， ２．１７ （ｍ， １ Ｈ） ， １．８７ （ｄ， Ｊ ＝ １３．９ Ｈｚ， １ Ｈ）、 ＭＳ （ＡＰＣＩ） ｍ／ｚ ２１３ （Ｍ−Ｈ）
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、ヌクレオシドホスホリラーゼまたは該酵素活性を有する微生物を用いた１−リン酸化糖誘導体と核酸塩基誘導体からのヌクレオシド誘導体の製造において、イオン交換樹脂を用いて反応することによりことにより、従来技術では達成されなかった反応収率の向上が達成される。更に、イオン交換樹脂を用いた反応ではリン酸トラップ剤としては無期限に使用が可能であり、リン酸の回収方法も簡便である。また目的のリン酸塩として回収も可能である。工業的見地から本発明は大きなコストダウンに繋がり、その意義は大きい。
【００６９】
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a nucleoside compound using nucleoside phosphorylase. Various nucleosides and analog compounds thereof are used as raw materials or drug substances for antiviral drugs, anticancer drugs and antisense drugs.
[0002]
[Prior art]
Nucleoside phosphorylase is a generic term for enzymes capable of phosphorolytically decomposing N-glycoside bonds of nucleosides in the presence of phosphoric acid, and catalyzes a reaction represented by the following formula.
Nucleoside + phosphoric acid (salt) → base + 1-phosphorylated sugar derivative
The enzyme, which is roughly classified into purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine phosphorylase, is widely distributed in the living world, and is present in tissues such as mammals, birds, fish, yeast, and bacteria. This enzymatic reaction is reversible, and the synthesis of various nucleosides using the reverse reaction has been known for some time. For example, from 2'-deoxyribose 1-phosphate and a nucleic acid base (thymine, adenine or guanine) to thymidine (JP-A-01-104190), 2'-deoxyadenosine (JP-A-11-137290) or 2'-deoxy A method for producing guanosine (JP-A-11-137290) is disclosed.
[0003]
Further, Agric. Biol. Chem. , Vol. 50 (1), PP. 121-126, (1986), inosine was decomposed into ribose 1-phosphate and hypoxanthine by a reaction using a purine nucleoside phosphorylase derived from Enterobacter aerogenes in the presence of phosphoric acid, and then isolated with an ion exchange resin. A technique for producing ribavirin, an antiviral agent, from ribose 1-phosphate and 1,2,4-triazole-3-carboxamide using a purine nucleoside phosphorylase also derived from Enterobacter aerogenes has been reported.
[0004]
However, since the reaction for producing a nucleoside compound from pentose-1-phosphate or a salt thereof and a nucleobase using the reverse reaction of the enzyme is an equilibrium reaction, it has a technical disadvantage that the conversion is not improved. I was
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for producing a versatile nucleoside derivative by the action of a nucleoside phosphorylase from a 1-phosphorylated sugar derivative and a nucleobase derivative, and further provide a method for improving the conversion rate of a nucleoside in the same reaction. Another object of the present invention is to provide a method for producing a nucleoside derivative of high purity at low cost.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the object, and in a method for producing a nucleoside derivative by exchanging a 1-phosphorylated saccharide derivative with a phosphate group and a nucleobase derivative in the presence of nucleoside phosphorylase, The present inventors have found that a nucleoside derivative can be obtained at a high conversion rate by adsorbing a phosphate derivative on an ion exchange resin such as an exchange resin and adding a nucleoside phosphorylase and a nucleobase derivative, thereby completing the present invention.
[0007]
That is, the present invention is as follows.
[1] General formula (1)
[0008]
Embedded image
[Wherein, R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a methyl group, a protected hydroxymethyl group or a protected carboxyl group; 3 Represents an acyl group, X represents a halogen atom, an alkoxy group or an alkylthio group, W represents an oxygen atom or a sulfur atom, Z represents an oxygen atom, a sulfur atom or an optionally substituted carbon atom, and m represents 1 Represents an integer from 0 to 3, n represents 0 or 1, p and q represent an integer from 0 to 4, and r represents 0 or 1. (However, p, q, r, and n are p ++ r ≦ n + 1, q ≦ 2 × (n + 1) −2 × (p + r) when Z is an oxygen atom or a sulfur atom, and when Z is a carbon atom, p + r ≦ n + 2, q ≦ 2 × (n + 2) −2 × (p + r) are satisfied.) A 1-phosphorylated saccharide derivative represented by the following formula is generally subjected to an exchange reaction between a phosphate group and a nucleobase derivative in the presence of nucleoside phosphorylase. Formula (2)
[0010]
Embedded image
[0011]
(Wherein B independently represents a base selected from the group consisting of pyrimidine, purine, azapurine and deazapurine, which are a halogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, an alkenyl group, a haloalkenyl group, an alkynyl group, It may be substituted by an amino group, an alkylamino group, a hydroxyl group, a hydroxyamino group, an aminoxy group, an alkoxy group, a mercapto group, an alkylmercapto group, an aryl group, an aryloxy group or a cyano group. 1 , R 2 , R 3 , X, W, Z, m, n, p, q, and r have the same meanings as in the general formula (1). A method for producing a nucleoside derivative represented by the general formula (2), wherein the exchange reaction is carried out in the presence of an ion exchange resin.
[2] The method according to claim 1, wherein the ion exchange resin is a strongly basic anion exchange resin, a weakly basic anion exchange resin, or a medium basic anion exchange resin.
[3] The 1-phosphorylated saccharide derivative represented by the general formula (1) is a compound represented by the formula (3):
[0012]
Embedded image
[0013]
2. The method according to claim 1, which is a 1-phosphorylated saccharide represented by the formula: or a salt thereof.
[4] The method for producing a nucleoside derivative according to claim 1, wherein the nucleobase derivative to be reacted with the 1-phosphorylated tang derivative is adenine, guanine, cytosine, or thymine, [5] the nucleoside phosphorylase is a purine nucleoside phosphorylase (EC2. 4.2.1), guanosine phosphorylase (EC 2.4.2.15), pyrimidine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.2), uridine phosphorylase (EC 2.4.2.3), thymidine phosphorylase (EC 2.4). 4.2.4), and one or more enzymes selected from the group consisting of deoxyuridine phosphorylase (EC 2.4.2.23). A method for producing the nucleoside according to claim 1.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
As the 1-phosphorylated saccharide used in the present invention, preferably, 6-deoxy saccharides such as fucose, rhamnose, digitoxose, oleandrose, quinobose, allose, altrose, glucose, mannose, growth, idose, galactose, talose Hexoses such as riboses, arabinose, xylose, pentoses such as lyxose, erythrose, tetroses such as threose, glucosamine, amino sugars such as daunosamine, glucuronic acid, uronic acids such as galacturonic acid, psicose, Ketoses such as fructose, sorbose, tagatose and pentulose, residues derived from natural monosaccharides composed of D series or L series such as deoxysaccharides such as 2-deoxyribose, pyranose type or Residues derived from unnatural sugars of the lanose type, sugar residue derivatives in which the hydroxyl group and / or amino group contained therein are protected or acylated, or halogenated in which the hydroxyl group contained therein is substituted by a halogen atom such as fluorine It shows a sugar derivative in which the hydroxyl group at position 1 is phosphorylated at a residue derived from a natural monosaccharide or a non-natural sugar having a sugar residue.
The protecting group in the protected hydroxymethyl group represented by R1 or R2 refers to a protecting group removed by a chemical method such as hydrogenolysis, hydrolysis, or photolysis. Examples of such a group include a formyl group, an acyl group, a silyl group, an alkyl group, an aralkyl group, and a carbonyl group. Among them, a formyl group, an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, a silyl group, and an alkoxyalkyl group are preferable. , A halogenated alkyl group, an aralkyl group, an alkoxycarbonyl group, and an aralkyloxycarbonyl group.
[0015]
Examples of the aliphatic acyl group include an alkylcarbonyl group and a halogen-substituted lower alkylcarbonyl group.
[0016]
Specific examples of the above alkylcarbonyl group include acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pentanoyl, pivaloyl, valeryl, isovaleryl, octanoyl, nonylcarbonyl, decylcarbonyl, and 3-methylnonylcarbonyl. Group, 8-methylnonylcarbonyl group, 3-ethyloctylcarbonyl group, 3,7-dimethyloctylcarbonyl group, undecylcarbonyl group, dodecylcarbonyl group, tridecylcarbonyl group, tetradecylcarbonyl group, pentadecylcarbonyl group, hexa Decylcarbonyl group, 1-methylpentadecylcarbonyl group, 14-methylpentadecylcarbonyl group, 13,13-dimethyltetradecylcarbonyl group, heptadecylcarbonyl group, 15-methylhexadecylcarbo Group, and octadecyl group can be exemplified.
[0017]
Specific examples of the halogen-substituted lower alkylcarbonyl group include a chloroacetyl group, a dichloroacetyl group, a trichloroacetyl group, and a trifluoroacetyl group.
[0018]
Examples of the aromatic acyl group include an arylcarbonyl group, a halogen-substituted arylcarbonyl group, a lower alkylated arylcarbonyl group, a lower alkoxyarylcarbonyl group, a nitrated arylcarbonyl group, a lower alkoxycarbonylated arylcarbonyl group, and an arylated arylcarbonyl. Groups can be mentioned.
[0019]
Specific examples of the above arylcarbonyl group include a benzoyl group, an α-naphthoyl group, and a β-naphthoyl group.
[0020]
Specific examples of the halogen-substituted arylcarbonyl group include a 2-fluorobenzoyl group, a 3-fluorobenzoyl group, a 4-fluorobenzoyl group, a 2-chlorobenzoyl group, a 3-chlorobenzoyl group, a 4-chlorobenzoyl group, 2-bromobenzoyl group, 3-bromobenzoyl group, 4-bromobenzoyl group, 2,4-dichlorobenzoyl group, 2,6-dichlorobenzoyl group, 3,4-dichlorobenzoyl group, 3,5-dichlorobenzoyl group, etc. Can be exemplified.
[0021]
Further, specific examples of the lower alkylated arylcarbonyl group include a 2-toluoyl group, a 3-toluoyl group, a 4-toluoyl group, and a 2,4,6-trimethylbenzoyl group.
[0022]
Further, specific examples of the lower alkoxyarylcarbonyl group include a 2-anisoyl group, a 3-anisoyl group, and a 4-anisoyl group.
[0023]
Specific examples of the nitrated arylcarbonyl group include a 2-nitrobenzoyl group, a 3-nitrobenzoyl group, a 4-nitrobenzoyl group, and a 3,5-dinitrobenzoyl group.
[0024]
Furthermore, specific examples of the lower alkoxycarbonylated arylcarbonyl group include a 2- (methoxycarbonyl) benzoyl group, and specific examples of the arylated arylcarbonyl group include a 4-phenylbenzoyl group.
[0025]
Examples of the silyl group include a lower alkylsilyl group and a lower alkylsilyl group substituted with an aryl group.
[0026]
Specific examples of the lower alkylsilyl group include a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, an isopropyldimethylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a methyldiisopropylsilyl group, and a triisopropylsilyl group.
[0027]
Specific examples of the lower alkylsilyl group substituted with an aryl group include a diphenylmethylsilyl group, a diphenylisopropylsilyl group, and a phenyldiisopropylsilyl group.
[0028]
Examples of the aralkyl group include an aralkyl group substituted with a lower alkyl group, an aralkyl group substituted with a lower alkoxy group, an aralkyl group substituted with a nitro group, an aralkyl group substituted with a halogen, and an aralkyl group substituted with a cyano group. Can be mentioned.
[0029]
Illustrative of these groups are 2-methylbenzyl, 3-methylbenzyl, 4-methylbenzyl, 2,4,6-trimethylbenzyl, 2-methoxybenzyl, 3-methoxybenzyl, 4-methoxybenzyl group, 2-nitrobenzyl group, 3-nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group, 2-chlorobenzyl group, 3-chlorobenzyl group, 4-chlorobenzyl group, 2-bromobenzyl group, 3- Examples thereof include a bromobenzyl group, a 4-bromobenzyl group, a 2-cyanobenzyl group, a 3-cyanobenzyl group, and a 4-cyanobenzyl group.
[0030]
Examples of the aralkyloxycarbonyl group include an aralkyloxycarbonyl group substituted with a lower alkyl group, an aralkyloxycarbonyl group substituted with a lower alkoxy group, an aralkyloxycarbonyl group substituted with a nitro group, and an aralkyloxycarbonyl group substituted with a halogen atom. And an aralkyloxycarbonyl group substituted with a cyano group.
[0031]
Specific examples thereof include a 2-methylbenzyloxycarbonyl group, a 3-methylbenzyloxycarbonyl group, a 4-methylbenzyloxycarbonyl group, a 2,4,6-trimethylbenzyloxycarbonyl group, a 2-methoxybenzyloxycarbonyl group, 3-methoxybenzyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 2-nitrobenzyloxycarbonyl group, 3-nitrobenzyloxycarbonyl group, 4-nitrobenzyloxycarbonyl group, 2-chlorobenzyloxycarbonyl group, 3- Chlorobenzyloxycarbonyl group, 4-chlorobenzyloxycarbonyl group, 2-bromobenzyloxycarbonyl group, 3-bromobenzyloxycarbonyl group, 4-bromobenzyloxycarbonyl group, 2-cyanobenzyl Alkoxycarbonyl group, 3-cyano-benzyloxycarbonyl group, a 4-cyano-benzyloxycarbonyl group can be exemplified.
[0032]
Examples of the alkoxycarbonyl group include a lower alkoxycarbonyl group, a halogen-substituted alkoxycarbonyl compound, and an alkoxycarbonyl group substituted with an alkylsilyl group.
[0033]
Specific examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, a butoxycarbonyl group, a sec-butoxycarbonyl group, and a tert-butoxycarbonyl group.
[0034]
Specific examples of the halogen-substituted alkoxycarbonyl group include a 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group, and specific examples of the alkoxycarbonyl group substituted by a lower alkylsilyl group include a 2-trimethylsilylethoxycarbonyl group. be able to.
[0035]
Examples of the alkyl group include an alkoxyalkyl group such as a methoxymethyl group, an ethoxymethyl group, a 2-methoxyethyl group, and a 2-methoxyethoxymethyl group; a halogenated alkyl group such as a 2,2,2-trichloroethyl group; And lower alkyl groups substituted with aryl groups such as α-naphthylmethyl group, β-naphthylmethyl group, diphenylmethyl group and triphenylmethyl group.
[0036]
Of these, preferred are an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group and an aralkyl group, and more preferred are a 4-toluoyl group, a 4-chlorobenzoyl group and a benzyl group.
[0037]
The protecting group in the protected carboxyl group represented by R1 and R2 refers to a protecting group that is removed by a chemical method such as hydrogenolysis, hydrolysis, or photolysis. As such a group, a lower alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group and a tert-butyl group, Examples thereof include a silylated lower alkyl group such as a (trimethylsilyl) ethyl group and a 2- (triethylsilyl) ethyl group, and the aforementioned aralkyl group and alkoxyalkyl group. More preferably, they are a methyl group, a tert-butyl group, or a benzyl group.
[0038]
The halogen atom represented by X represents a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
Examples of the alkoxy group and alkylthio group represented by X include the aforementioned lower alkyl group, aralkyl group, alkoxy group having an alkoxyalkyl group, and alkylthio group. More preferred are a methoxy group, a methoxyethoxy group and a methylthio group.
[0039]
The optionally substituted carbon atom represented by Z represents a carbon atom substituted by one or two substituents represented by the general formula, and when not substituted, a carbon atom substituted by a hydrogen atom Refers to an atom.
[0040]
R 3 As the acyl group represented by, for example, the above-mentioned aliphatic acyl group, aromatic acyl group, alkoxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group, further, methanesulfonyl group, lower alkanesulfonyl group such as trifluoromethanesulfonyl group, An arylsulfonyl group such as a benzenesulfonyl group and a p-toluenesulfonyl group can be exemplified. Preferably, they are an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, and a lower alkanesulfonyl group, and specifically, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, a benzoyl group, and a methanesulfonyl group.
[0041]
The nucleobase derivative used in the present invention is a heterocyclic compound containing a nitrogen atom which is a chemical structural element of DNA or RNA, and is a natural or non-cyclic compound selected from the group consisting of pyrimidine, purine, and base analog. Shows natural nucleic acid bases, which are halogen atoms, alkyl groups, haloalkyl groups, alkenyl groups, haloalkenyl groups, alkynyl groups, amino groups, alkylamino groups, hydroxyl groups, hydroxyamino groups, aminooxy groups, alkoxy groups, It may be substituted by a mercapto group, an alkylmercapto group, an aryl group, an aryloxy group or a cyano group.
[0042]
Examples of the halogen atom as a substituent include chlorine, fluorine, iodine, and bromine. Examples of the alkyl group include an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. Examples of the haloalkyl group include haloalkyl groups having an alkyl having 1 to 7 carbon atoms, such as fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, bromomethyl, and bromoethyl. Examples of the alkenyl group include alkenyl groups having 2 to 7 carbon atoms such as vinyl and allyl. Examples of the haloalkenyl group include haloalkenyl groups having 2 to 7 carbon atoms, such as bromovinyl and chlorovinyl. Examples of the alkynyl group include alkynyl groups having 2 to 7 carbon atoms, such as ethynyl and propynyl. Examples of the alkylamino group include alkylamino groups having 1 to 7 carbon atoms such as methylamino and ethylamino. Examples of the alkoxy group include an alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms such as methoxy and ethoxy. Examples of the alkyl mercapto group include alkyl mercapto groups having alkyl having 1 to 7 carbon atoms, such as methyl mercapto and ethyl mercapto. Examples of the aryl group include a phenyl group; an alkylphenyl group having 1 to 5 carbon atoms such as methylphenyl and ethylphenyl; an alkoxyphenyl group having 1 to 5 carbon atoms such as methoxyphenyl and ethoxyphenyl; dimethylamino Examples thereof include an alkylaminophenyl group having an alkylamino having 1 to 5 carbon atoms such as phenyl and diethylaminophenyl; and a halogenophenyl group such as chlorophenyl and bromophenyl.
[0043]
Specific examples of pyrimidines include cytosine, uracil, 5-fluorocytosine, 5-fluorouracil, 5-chlorocytosine, 5-chlorouracil, 5-bromocytosine, 5-bromouracil, 5-iodocytosine, and 5-iodocytosine. Iodouracil, 5-methylcytosine, 5-methyluracil (thymine), 5-ethylcytosine, 5-ethyluracil, 5-fluoromethylcytosine, 5-fluorouracil, 5-trifluorocytosine, 5-trifluorouracil, 5- Vinyluracil, 5-bromovinyluracil, 5-chlorovinyluracil, 5-ethynylcytosine, 5-ethynyluracil, 5-propynyluracil, pyrimidin-2-one, 4-hydroxyaminopyrimidin-2-one, 4-aminooxy Pyrimidin-2-one, 4-methoxypyri 2-one, 4-acetoxy-2-one, 4-fluoro-2-one, and 5-fluoro-pyrimidin-2-one and the like.
[0044]
Specific examples of purines include purine, 6-aminopurine (adenine), 6-hydroxypurine, 6-fluoropurine, 6-chloropurine, 6-methylaminopurine, 6-dimethylaminopurine, and 6-trifluoro. Methylaminopurine, 6-benzoylaminopurine, 6-acetylaminopurine, 6-hydroxyaminopurine, 6-aminooxypurine, 6-methoxypurine, 6-acetoxypurine, 6-benzoyloxypurine, 6-methylpurine, 6 -Ethylpurine, 6-trifluoromethylpurine, 6-phenylpurine, 6-mercaptopurine, 6-methylmercaptopurine, 6-aminopurine-1-oxide, 6-hydroxypurine-1-oxide, 2-amino-6 -Hydroxypurine (guanine), 2,6-diaminopurine, 2- Mino-6-chloropurine, 2-amino-6-iodopurine, 2-aminopurine, 2-amino-6-mercaptopurine, 2-amino-6-methylmercaptopurine, 2-amino-6-hydroxyaminopurine 2-amino-6-methoxypurine, 2-amino-6-benzoyloxypurine, 2-amino-6-acetoxypurine, 2-amino-6-methylpurine, 2-amino-6-cyclopropylaminomethylpurine, 2-amino-6-phenylpurine, 2-amino-8-bromopurine, 6-cyanopurine, 6-amino-2-chloropurine (2-chloroadenine), 6-amino-2-fluoropurine (2-fluoro Adenine) and the like.
[0045]
Specific examples of base analogs include 6-amino-3-deazapurine, 6-amino-8-azapurine, 2-amino-6-hydroxy-8-azapurine, 6-amino-7-deazapurine, and 6-amino- Examples thereof include 1-deazapurine and 6-amino-2-azapurine.
[0046]
The nucleoside phosphorylase in the present invention is a general term for enzymes that decompose N-glycoside bonds of nucleoside compounds in the presence of phosphoric acid, and a reverse reaction can be used in the present invention. The enzyme used in the reaction may be of any type and origin as long as it has an activity capable of producing a target nucleoside compound from the corresponding pentose-1-phosphate and a nucleobase. The enzymes are roughly classified into purine-type and pyrimidine-type, and known ones include, for example, purine-type purine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.1), guanosine phosphorylase (EC 2.4.2.15), and pyrimidine. Pyrimidine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.2), uridine phosphorylase (EC 2.4.2.3), thymidine phosphorylase (EC 2.4.2.4) and deoxyuridine phosphorylase (EC 2.4.2.23) as types. ).
[0047]
In the present invention, microorganisms having nucleoside phosphorylase activity include purine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.1), guanosine phosphorylase (EC 2.4.2.15), pyrimidine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.2), One or more nucleoside phosphorylases selected from the group consisting of uridine phosphorylase (EC 2.4.2.3), thymidine phosphorylase (EC 2.4.2.4), and deoxyuridine phosphorylase (EC 2.4.2.23) The microorganism is not particularly limited as long as it is an expressing microorganism.
[0048]
Specific examples of such microorganisms include the genus Nocardia, the genus Microbacterium, the genus Corynebacterium, the genus Brevibacterium, the genus Cellulomonas, and the flavobacteria. Genus Flabobacterium, genus Kluyvere, genus Mycobacterium, genus Haemophilus, genus Mycoplana, genus Protaminobacterium, Candida, Candida, Candida, Candida Saccharomyces, Bacillus Thermophilic Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Hafnia, Proteus, Vibrio, Staphylococcus, Propionibacterium, Propionibacterium Propionobacterium, Sartina, Planococcus, Escherichia, Kurthia, Rhodococcus, Rhodococcus, Acinetobacter, Acintobacto, Xacion bacterium, Acinetobacter Myces (Streptomyces) genus, Rhizobium ( genus hizobium, genus Salmonella, genus Klebsiella, genus Enterobacter, genus Erwinia, genus Aeromonas, genus Citrobacter, acrobacta, acrobacter, acrobacta Microorganism strains contained in the genus Agrobacterium, the genus Arthrobacter or the genus Pseudonocardia can be mentioned as preferred examples.
[0049]
Due to recent advances in molecular biology and genetic engineering, by analyzing the molecular biological properties and amino acid sequence of the nucleoside phosphorylase of the above-mentioned microorganism strain, the gene for the protein is obtained from the microorganism strain, And constructing a recombinant plasmid into which a control region required for expression has been inserted, introducing the recombinant plasmid into an arbitrary host, and producing a genetically modified bacterium expressing the protein. It also became. In view of the state of the art, genetically modified bacteria in which such a nucleoside phosphorylase gene has been introduced into an arbitrary host are also included in the microorganism expressing the nucleoside phosphorylase of the present invention.
[0050]
As the nucleoside phosphorylase or the microorganism having the enzymatic activity in the present invention, a commercially available enzyme, a microbial cell having the enzymatic activity, a treated bacterial cell, or an immobilized product thereof can be used. The treated bacterial cells are, for example, acetone-dried bacterial cells and bacteria prepared by mechanical disruption, ultrasonic crushing, freeze-thawing, pressurized and reduced pressure treatment, osmotic pressure treatment, autolysis, cell wall decomposition treatment, surfactant treatment, etc. It may be a crushed body or the like, and may be used after repeated purification by ammonium sulfate precipitation, acetone precipitation or column chromatography, if necessary.
[0051]
The raw material 1-phosphorylated saccharide derivative is purchased from a reagent manufacturer such as Sigma, Aldrich, or
1) Method of condensing 1-brominated sugar and silver phosphate (J. Biol. Chem., Vol. 121, P465 (1937), J. Am. Chem. Soc., Vol. 78, P811 (1956) ), J. Am. Chem. Soc., Vol. 79, P5057 (1957)),
2) Method of condensing 1-halogenated sugar and triethylamine salt of dibenzylphosphoric acid (J. Am. Chem. Soc., Vol. 77, P3423 (1955), J. Am. Chem. Soc., Vol. 80, P1994 (1958), J. Am. Chem. Soc., Vol. 106, P7851 (1984), J. Org. Chem., Vol. 59, P690 (1994)),
3) A method of heat-condensing 1-acetylated sugar with orthophosphoric acid (J. Org. Chem., Vol. 27, P1107 (1962), Carbohydrate Res., Vol. 3, P117 (1966), Carbohydrate Res., Vol. 3, P463 (1967), Can. J. Biochem., Vol. 50, P574 (1972)),
4) A method of condensing with dibenzyl phosphate after activating by imidating the 1-position (Carbohydrate Res., Vol. 61, P181 (1978), Tetrahedron Lett., Vol. 23, P405 (1982)),
5) A method of activating the 1-position as thallium or lithium alcoholate, followed by treatment with dibenzyl phosphate chloride (Carbohydrate Res., Vol. 94, P165 (1981), Chem. Lett., Vol. 23, P405 (1982)),
6) A method for producing a 1-phosphorylated saccharide derivative by performing a phosphorolysis reaction of a nucleoside by the action of nucleoside phosphorylase (J. Biol. Chem., Vol. 184, P437, 1950) or the like. I can do it.
The ion exchange resin used in the present invention is a strong basic anion exchange resin having a quaternary amine as an exchange group, a weak basic anion exchange resin having a tertiary amine, and a medium basic anion exchange resin having an aliphatic amine. . Specifically, MP500 (Levatide) and S6328A (Levatide) are used as the strongly basic anion exchange resin, MP62 (Levatide) is used as the weakly basic anion exchange resin, and VPOC1065 (Levatide) is used as the medium base anion exchange resin.
[0052]
The reaction between the 1-phosphorylated sugar derivative and the nucleobase derivative is usually performed in the presence of a solvent. The solvent used is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction.For example, water, aqueous solvents such as methanol, ethanol and isopropanol, hexane and aliphatic hydrocarbons such as heptane, benzene, toluene and xylene , Aromatic hydrocarbons such as anisole, methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, chlorobenzene, halogenated hydrocarbons such as dichlorobenzene, ethyl formate, ethyl acetate, propyl acetate, propyl acetate, n-butyl acetate, carbonic acid Esters such as diethyl ester, ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane, diglyme, nitriles such as acetonitrile, propionitrile, isobutyronitrile, formamide, N, N Amides such as dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, N-methylpyrrolidinone, N, N-dimethyl-2-imidazolidinone, acetone, 2-butanone, methyl isopropyl ketone, Examples thereof include ketones such as methyl isobutyl ketone and dimethylformamide, and a mixed solvent of one or more selected from them. Preferably, it is water or methanol.
Examples of the reaction method using a basic anion exchange resin include a circulation method in a resin tower or the like and a stirring method in a reaction tank or the like, but are not particularly limited.
In the reaction, the method of adding the exchange resin, the 1-phosphorylated tang derivative, the nucleic acid base derivative, and the enzyme solution includes batch addition, divided addition, continuous addition, and the like, but is not particularly limited. The amount of the exchange resin is not particularly limited, but is usually in the range of 0.1 to 10.0 equivalent exchange capacity, preferably 1.0 to 3.0 equivalent exchange capacity with respect to 1-phosphorylated saccharide. Done
The amount of the solvent is not particularly limited, but is usually 0.1 to 10 times the amount of the exchange resin. Preferably, the amount is 0.5 to 3.0 times.
[0053]
The reaction temperature is not particularly limited, and is usually in the range of 0 ° C to 80 ° C, preferably 20 ° C to 70 ° C.
[0054]
The reaction time varies depending on the types of starting materials, reagents and solvents, and the reaction temperature, but is usually achieved in the range of 1 minute to 78 hours, preferably 0.5 hour to 24 hours.
[0055]
The ratio of the 1-phosphorylated saccharide derivative to the nucleobase derivative in this reaction is not particularly limited, but the amount of the nucleobase derivative used is usually 0.3 to 3 equivalents, preferably 3 to 1-phosphorylated saccharide derivative. Is 0.6 to 2 equivalents.
[0056]
The nucleoside compound produced by such a reaction can be isolated by applying a conventional method such as filtration, adsorption / desorption treatment with activated carbon, concentration, crystallization, and dissolution.
[0057]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0058]
All the generated nucleoside compounds were quantified by high performance liquid chromatography. The analysis conditions are as follows.
Column: YMC-Pack ODS-A514 300 × 6.0 mmI. D.
(YMC Co., Ltd)
Column temperature: 40 ° C
Pump flow rate: 1 ml / min.
Detection wavelength: UV 254 nm,
Eluent: 40 ml of acetonitrile is added to a 20 mM aqueous solution of potassium dihydrogen phosphate (2000 ml), mixed and degassed.
Internal standard substance: p-aminobenzoic acid
[0059]
Reference Example 1 Preparation of enzyme solution
Escherichia coli K-12 / XL-10 strain (Stratagene) was inoculated into 50 ml of LB medium, cultured at 37 ° C. overnight, collected, and lysed with a lysate containing 1 mg / ml of lysozyme. After the lysate was treated with phenol, DNA was precipitated by ethanol precipitation according to a conventional method. The resulting DNA precipitate was collected by winding it around a glass rod, washed, and used for PCR.
[0060]
The primers for PCR have the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 designed based on the nucleotide sequence of the known deoD gene of Escherichia coli (GenBank accession No. AE000508 (coding region is nucleotide numbers 11531-12250)). Oligonucleotides (synthesized by consignment to Hokkaido System Science Co., Ltd.) were used. These primers have EcoRI and HindIII restriction enzyme recognition sequences near the 5 ′ end and near the 3 ′ end, respectively.
[0061]
Using a 0.1 ml PCR reaction solution containing 6 ng / μl of the E. coli chromosomal DNA and 3 μM of each primer completely digested with the restriction enzyme HindIII, denaturation: 96 ° C. for 1 minute, annealing: 55 ° C. for 1 minute, extension reaction : PCR was performed under the condition of a reaction cycle consisting of 74 ° C. for 1 minute and 30 cycles.
[0062]
The above reaction product and plasmid pUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) are digested with EcoRI and HindIII, ligated using Ligation High (Toyobo Co., Ltd.), and then Escherichia coli using the obtained recombinant plasmid. DH5α was transformed. The transformant was cultured on an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin (Am) and X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside), and was resistant to Am and a white colony. Was obtained.
[0063]
A plasmid was extracted from the thus obtained transformant, and the plasmid into which the target DNA fragment was inserted was named pUC-PNP73. The transformant thus obtained was named Escherichia coli MT-10905.
The Escherichia coli MT-10905 strain was cultured with shaking in 100 mL of an LB medium containing 50 μg / ml of Am at 37 ° C. overnight. The obtained culture solution was centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes to collect cells. The cells were suspended in 10 mL of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and disrupted by ultrasonic waves, and used as an enzyme source.
[0064]
Example 1
Synthesis of 2'-deoxyguanosine (1)
20 ml of strong basic anion exchange resin (MP500 revertid: exchange capacity 1.1 eq / L) in pure water 20 g (total exchange capacity 24 mmol) and di (ammonium) 2-deoxyribose 1-phosphate (4.96 g, 20 mmol) Was added and stirred at room temperature for 30 minutes. Thirty minutes later, the enzyme solution (0.5 ml) prepared in Reference Example 1 and guanine (2.87 g, 19 mmol) were added, and reacted at 50 ° C. for 10 hours with stirring. After 10 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and as a result, the desired 2'-deoxyguanosine was obtained with a reaction yield of 83%.
[0065]
Example 2
Synthesis of 2'-deoxyadenosine
20 ml of strong basic anion exchange resin (MP500 revertid: exchange capacity 1.1 eq / L) in pure water 20 g (total exchange capacity 24 mmol) and di (ammonium) 2-deoxyribose 1-phosphate (4.96 g, 20 mmol) Was added and stirred at room temperature for 30 minutes. Thirty minutes later, the enzyme solution (0.5 ml) prepared in Reference Example 1 and adenine (2.57 g, 19 mmol) were added, and reacted at 50 ° C. for 10 hours with stirring. Ten hours later, the reaction mass was analyzed by HPLC, and as a result, the desired 2'-deoxyguanosine was obtained with a reaction yield of 86%.
[0066]
Example 3
Synthesis of 2'-deoxycytidine
20 ml of strong basic anion exchange resin (MP500 revertid: exchange capacity 1.1 eq / L) in pure water 20 g (total exchange capacity 24 mmol) and di (ammonium) 2-deoxyribose 1-phosphate (4.96 g, 20 mmol) Was added and stirred at room temperature for 30 minutes. Thirty minutes later, the enzyme solution (0.5 ml) prepared in Reference Example 1 and cytosine (2.11 g, 19 mmol) were added, and reacted at 50 ° C. for 10 hours with stirring. After 10 hours, the reaction mass was analyzed by HPLC, and as a result, the desired 2'-deoxycytidine was obtained at a reaction yield of 80%.
[0067]
Reference Example 2
Synthesis of 2-deoxyribose 1-phosphate di (ammonium) salt
2-Deoxyribose 1-phosphate di (monocyclohexylammonium) salt (1 g, 2.42 mmol, manufactured by SIGMA) is suspended in methanol (10 g), and ammonia gas (0.62 g, 36.5 mmol) is blown thereinto. And stir for 2 hours. The obtained reaction mass was filtered at 30 ° C., washed twice with methanol (5 g), and dried to obtain a desired 2′-deoxyribose 1-phosphate di (ammonium) salt (0.57 g) in a yield of 95%. I got it.
1 H NMR (D 2 O, 270 MHz) d 5.56 (s, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.52 (dd, J = 3.3, 12.2 Hz, 1H), 3.41 (Dd, J = 5.3, 12.2 Hz, 1H), 2.17 (m, 1H), 1.87 (d, J = 13.9 Hz, 1H), MS (APCI) m / Z 213 (MH)
[0068]
【The invention's effect】
According to the present invention, in the production of a nucleoside derivative from a 1-phosphorylated sugar derivative and a nucleobase derivative using a nucleoside phosphorylase or a microorganism having the enzyme activity, a conventional method is used by reacting with an ion exchange resin. An improvement in the reaction yield not achieved with the technology is achieved. Furthermore, in the reaction using an ion exchange resin, the phosphoric acid trapping agent can be used indefinitely, and the method for recovering phosphoric acid is simple. It can also be recovered as the target phosphate. From an industrial point of view, the present invention leads to significant cost reduction, and its significance is great.
[0069]