【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検体の測定における共存物質とりわけビリルビンの影響を阻止する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、臨床検査においては、過酸化水素の生成を経由してキノン色素の吸光度を測定するという比色定量分析系がよく利用されている。
また一般に、臨床検査の分野において検体中に含まれる共存物質が分析反応に関与し、測定値に誤差を与える場合があることはよく知られている。事実、実際の臨床検査においては、検体中に存在する共存物質として、例えば、採血時に生じる溶血、肝疾患時に血中濃度を上昇させるビリルビン、ビタミン剤の服用者の血中に多量に存在するアスコルビン酸などの影響がしばしば問題となっている。これら共存物質が検体中に低い濃度で存在するときは実用上大きな問題とはならないが、共存物質が高い濃度で検体中に存在するとき並びに、定量すべき対象物がきわめて低い濃度で存在するため、共存物質の濃度が低くとも相対的に重大な割合になるときは、測定値に多大な誤差を生じさせる場合がある。一般に臨床検査のような生化学的手法による測定においては、定量すべき対象物が１０〜１００μＭ程度の低い濃度（測定法の種類によって異なる。）で存在する検体に対して測定される場合もある一方、測定に影響を与えると思われる共存物質が、定量すべき対象物の濃度の１００倍以上の高濃度にて検体中に存在する場合もあり、従って、臨床検査の測定において、共存物質の作用による対象物の正確な定量の妨害はしばしばみられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
とくに、上記の比色定量分析系にあっては、検体中に含まれうる共存物質（例えばヘモグロビンの代謝産物であるところのビリルビン）の作用により、一旦生成した過酸化水素が消費されてしまい、結果として測定値に負の影響が生じることが知られている。この共存物質のビリルビンは、還元性物質であるため、このような酸化還元反応に基づく分析系の測定値に負の影響を与えるだけでなく、４６０ｎｍ付近に強い吸収を持つ物質であるため、測定波長が４６０ｎｍ付近にある光学測定系にあっては、検体を定量するとき、ビリルビンの光吸収により、その測定値に影響を与える。従って、正確な比色定量分析を達成する上で、検体中に含まれうる共存物質ビリルビンの影響を阻止することが必須とされる。
【０００４】
本発明は、かかる事情に基づいてなされたものであって、その課題とするところは、臨床検査において検体中に含まれうる共存物質ビリルビンの影響を阻止することができる方法、並びに該方法に用いる臨床検査試薬を提供することにある。
また、本発明の他の課題は、過酸化水素の生成反応を分析反応プロセスに含む比色定量分析において、共存物質による過酸化水素の消費を阻止し、正確な定量分析を達成することができる方法、並びに該方法に用いる比色定量分析試薬を提供することにある。
本発明のその他の目的、効果および利点は、以下の記載および特許請求の範囲の記載より導かれる。
【０００５】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、まったく驚くべきことに、有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物を臨床検査に用いる試薬に添加することにより、検体中に含まれうる共存物質ビリルビンの影響を阻止することができるという事実を見出し、ここに本発明を完成するに至った。
また本発明者は、この事実をさらに発展させ、有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物を比色定量分析に用いる試薬に添加することにより、共存物質による過酸化水素の消費を阻止し、過酸化水素の生成反応を含む比色定量分析の測定の正確度を向上させることができるという事実をも見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、臨床検査において、検体中に含まれうる共存物質ビリルビンの影響を阻止するために、有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物を臨床検査に用いる試薬に添加することを特徴とする臨床検査方法に関する。
また、本発明は、臨床検査に用いる試薬であって、検体中の共存物質ビリルビンの影響阻止剤として有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加されていることを特徴とする臨床検査試薬に関する。
また、別の本発明は、過酸化水素の生成反応を分析反応プロセスに含む比色定量分析において、共存物質による過酸化水素の消費を阻止するために有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物を比色定量分析に用いる試薬に添加することを特徴とする比色定量分析方法に関する。
さらに、本発明は、過酸化水素の生成反応を分析反応プロセスに含む比色定量分析に用いる試薬であって、共存物質による過酸化水素の消費の阻止剤として有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加されていることを特徴とする比色定量分析試薬に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
一般に、分析プロセスの中で過酸化水素が生成し最終的にキノン色素が形成される比色定量分析系においては、特にビリルビンの影響が問題になる。この比色定量分析系では、検体（試料）中の測定すべき対象物はオキシダーゼにより酸化され、そしてこの反応により生成した過酸化水素の作用によりカップラーともう一方のカップラーとが縮合し、キノン色素が生成する。このキノン色素の生成量をその吸収波長での吸光度にて測定することにより、対象物の定量が可能となる。しかし、もし試料液中に還元物質のビリルビンが存在すると、生成した過酸化水素がビリルビンによって消費され、その分キノン色素の生成量が減少し、結果として対象物の定量値が本来検出されるべき値より低い値になる。すなわち、試料（検体）中にビリルビンが共存した場合、測定値に負の影響を受け、正確に定量できないことになる。本発明に従い、分析に用いる試薬にポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物を添加すると、これが分析反応プロセスにおいてビリルビンと過酸化水素の反応を阻止する。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物は、反応液中でミセルを形成し、その中にビリルビンを取り込むことで、ビリルビンが分析反応系に関与するのを防止するものと推量される。しかして、ビリルビンと過酸化水素の反応が阻止されることにより、本来生成されるべき量のキノン色素が生成され、これにより、対象物の正確な定量が達成される。
【０００８】
さらに、クレアチニン測定試薬を用いた比色定量分析を例に説明すると、本試薬は、対象物のクレアチニンが相対的に低い濃度で存在する場合にも適用される試薬であって、その分析反応プロセスは次のとおりである。
【化１】
採取された検体の試料中にクレアチニンが存在するとき、試薬の添加により試料中のクレアチニンはクレアチニナーゼの触媒作用により開環し、クレアチンが生成する。次いで、生成したクレアチンはクレアチナーゼの作用によりザルコシンと尿素とに分解され、さらにザルコシンはザルコシンオキシダーゼの作用によりグリシンとホルムアルデヒドと過酸化水素とに分解される。この過酸化水素によってペルオキシダーゼの存在下カップラーのＮ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリンと４−アミノアンチピリンとが縮合し、キノン色素が生成する。つまり、２分子のクレアチニンから１分子のキノン色素が生成されるため、キノン色素の生成量を、その吸収波長域を含む波長５００ｎｍ〜６００ｎｍにおける吸光度スペクトルにて測定することにより、クレアチニンの存在量（濃度）を定量することができる。
ここで、ビリルビンが検体中に共存すると、生成した過酸化水素がビリルビンによって消費され、その分キノン色素の生成量が減少し、結果としてクレアチニンの定量値が本来測定されるべき値より低い値になる。しかし、有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が予めクレアチニン測定試薬に添加されていると、これがビリルビンと過酸化水素の反応を阻止し、本来生成されるべき量のキノン色素が生成され、これによりクレアチニンの正確な定量が達成されることになる。
なお、下記に述べる実施例は、斯様なクレアチニン測定試薬を用いた比色定量分析の例である。
【０００９】
本発明に使用されるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物は、ノニルフェノール、オクチルフェノール等のアルキルフェノールより作られるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの縮合物であって、例えばポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル縮合物などが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ＡＰＥ）は、代表的な非イオン系界面活性剤であり、医薬品における乳化剤・分散剤、農薬の展着剤、家庭用洗浄剤などに広く使用されている。本発明では、ＡＰＥより誘導された縮合物が分析に用いる試薬に添加して使用される。
分析に用いる試薬が第一試薬と第二試薬の組合せのように複数種の試薬から構成されるときは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物は、本来の分析反応に影響を与えない限りにおいて、いずれの試薬にも、場合によって第一試薬と第二試薬の双方にも、添加することができる。また、試薬中の緩衝液などの他の成分、あるいは、この種の分析に用いられる緩衝液などは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の作用、つまりミセルを形成しビリルビンをその内に取り込む作用に影響を与えないものである限りにおいて、通常使用されているものが適用されうる。
また、本発明に用いるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物は、分析に用いる試薬に、ビリルビンと過酸化水素の反応を阻止するのに有効な量添加されていればよく、その適当な添加量は、測定すべき検体中のビリルビンの含有量の多少、分析における試薬の使用量と試料の使用量との比などにより、つまり分析反応液中に含まれるビリルビンの存在量により異なる。例えば、検体中に濃度およそ５０ｍｇ／ｄＬのビリルビンが共存し、検体の使用量と試薬の使用量との比がおよそ１：６０である場合、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物は、分析反応液中の終濃度として概ね０．１％〜２．４％（Ｗ／Ｖ）の量が含まれていることが望ましい。
【００１０】
【実施例】
以下、本発明の最良の実施形態と思われる実施例を説明することにより、本発明をより明らかにする。
【００１１】
実施例１
まず、以下の組成よりなる試薬１及び試薬２を準備した。試薬１には、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（商標名：Ｒ−１０２０（日光ケミカルズ株式会社製））が０．２％〜３．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加されている。
そして、試料として、ビリルビンＦまたはビリルビンＣが５０ｍｇ／ｄＬの濃度で添加された２種類のヒト血清検体及びこれらビリルビンが添加されていないヒト血清検体を準備した。いずれの試料も、クレアチニン濃度が０．８ｍｇ／ｄＬとなるように調整されている。
次いで、測定法としてエンドポイント法に従い、自動分析装置Ｈ７１７０形（株式会社日立製作所製）を用いて比色定量分析を行なった。すなわち、試料５μＬに試薬１を２４０μＬ添加し、続いて３７℃で５分間加温し、その後さらに試薬２を８０μＬ添加し、そして得られた溶液について波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
また比較のため、試薬１として、上記組成においてポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）を含まない試薬を準備し、上記と同様の手順、条件にて試料溶液の波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
しかして、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）の終濃度が異なる種々の試薬を用いたそれぞれの場合について、ビリルビンＦが添加された試料（ヒト血清検体）につき測定された吸光度値の、ビリルビンＦが添加されていない試料についての吸光度値に対する相対感度を求め、その結果を図１に示した。また同様にして、ビリルビンＣが添加された試料（ヒト血清検体）につき測定された吸光度値の、ビリルビンＣが添加されていない試料についての吸光度値に対する相対感度を求め、その結果を図２に示した。
【００１２】
図１に示されるように、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加されていない対照の試薬においては、共存物質ビリルビンＦにより吸光度の測定値が−１９％低減するという負の影響がはっきりと認められたが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加された試薬においては、吸光度の測定値に対するビリルビンＦによる負の影響が軽減され、特にポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が２．４％添加された試薬にあっては、−６％の負の影響にとどまるものであった。
また図２に示されるように、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加されていない対照の試薬においては、共存物質ビリルビンＣにより吸光度の測定値が−５２％低減するという負の大きな影響がはっきりと認められたが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加された試薬においては、吸光度の測定値に対するビリルビンＣによる負の影響が顕著に軽減され、特にポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が２．４％添加された試薬にあっては、−６％という大変小さな負の影響にとどまるものであった。以上のように、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加により、共存物質ビリルビンＦまたはビリルビンＣの影響を阻止する効果が得られる点が判明した。
【００１３】
実施例２
まず、以下の組成よりなる試薬１及び試薬２を準備した。試薬２には、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（商標名：Ｒ−１０２０（日光ケミカルズ株式会社製））が０．２％〜３．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加されている。
そして、試料として、ビリルビンＦまたはビリルビンＣが５０ｍｇ／ｄＬの濃度で添加された２種類のヒト血清検体及びこれらビリルビンが添加されていないヒト血清検体を準備した。いずれの試料も、クレアチニン濃度が０．８ｍｇ／ｄＬとなるように調整されている。
次いで、測定法としてエンドポイント法に従い、自動分析装置Ｈ７１７０形（株式会社日立製作所製）を用いて比色定量分析を行なった。すなわち、試料５μＬに試薬１を２４０μＬ添加し、続いて３７℃で５分間加温し、その後さらに試薬２を８０μＬ添加し、そして得られた溶液について波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
また比較のため、試薬２として、上記組成においてポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）を含まない試薬を準備し、上記と同様の手順、条件にて試料溶液の波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。
しかして、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）の終濃度が異なる種々の試薬を用いたそれぞれの場合について、ビリルビンＦが添加された試料（ヒト血清検体）につき測定された吸光度値の、ビリルビンＦが添加されていない試料についての吸光度値に対する相対感度を求め、その結果を図３に示した。また同様にして、ビリルビンＣが添加された試料（ヒト血清検体）につき測定された吸光度値の、ビリルビンＣが添加されていない試料についての吸光度値に対する相対感度を求め、その結果を図４に示した。
【００１４】
図３に示されるように、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加されていない対照の試薬においては、共存物質ビリルビンＦにより吸光度の測定値が−１９％低減するという負の影響が認められたが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加された試薬においては、吸光度の測定値に対するビリルビンＦによる負の影響が軽減され、特にポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が０．８％添加された試薬にあっては、−１５％の負の影響にとどまるものであった。
また図４に示されるように、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加されていない対照の試薬においては、共存物質ビリルビンＣにより吸光度の測定値が−５２％低減するという負の大きな影響がはっきりと認められたが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が添加された試薬においては、吸光度の測定値に対するビリルビンＣによる負の影響が顕著に軽減され、特にポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物が０．８％添加された試薬にあっては、−２０％という負の影響にとどまるものであった。
以上のように、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物を試薬２に添加した場合も、その添加により、共存物質ビリルビンＦまたはビリルビンＣの影響を阻止する効果が得られる点が判明した。
【００１５】
【発明の効果】
以上の説明よりわかるように、本発明によれば、臨床検査に用いる試薬への有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加により、臨床検査において、検体中に含まれうる共存物質ビリルビンの影響を阻止することができ、正確な測定値が得られる。そして本発明により、かような優れた方法に用いる臨床検査試薬が提供される。
また本発明によれば、比色定量分析に用いる試薬への有効量のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加により、比色定量分析において共存物質による過酸化水素の消費を阻止し、過酸化水素の生成反応を含む比色定量分析における正確な測定を達成することができる。そして本発明により、かような優れた方法に用いる比色定量分析試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加による検体中の共存物質ビリルビンＦの影響の阻止効果を示すグラフである。横軸はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）の終濃度を表わし、縦軸はビリルビンＦ添加のヒト血清検体の吸光度測定における測定値のビリルビンＦ非添加の場合に対する相対感度を表わす。
【図２】実施例１において、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加による検体中の共存物質ビリルビンＣの影響の阻止効果を示すグラフである。横軸はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）の終濃度を表わし、縦軸はビリルビンＣ添加のヒト血清検体の吸光度測定における測定値のビリルビンＣ非添加の場合に対する相対感度を表わす。
【図３】実施例２において、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加による検体中の共存物質ビリルビンＦの影響の阻止効果を示すグラフである。横軸はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）の終濃度を表わし、縦軸はビリルビンＦ添加のヒト血清検体の吸光度測定における測定値のビリルビンＦ非添加の場合に対する相対感度を表わす。
【図４】実施例２において、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物の添加による検体中の共存物質ビリルビンＣの影響の阻止効果を示すグラフである。横軸はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物（Ｒ−１０２０）の終濃度を表わし、縦軸はビリルビンＣ添加のヒト血清検体の吸光度測定における測定値のビリルビンＣ非添加の場合に対する相対感度を表わす。
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for inhibiting the effect of co-existing substances, especially bilirubin, on the measurement of clinical samples.
[0002]
[Prior art]
BACKGROUND ART Conventionally, in a clinical test, a colorimetric quantitative analysis system that measures the absorbance of a quinone dye via generation of hydrogen peroxide has been often used.
In general, it is well known that in the field of clinical examination, coexisting substances contained in a sample are involved in an analysis reaction and may give an error to a measured value. In fact, in actual clinical tests, coexisting substances present in a sample include, for example, hemolysis occurring during blood collection, bilirubin which increases blood concentration during liver disease, and ascorbin which is present in a large amount in the blood of a person taking a vitamin preparation. The effects of acids and the like are often problematic. When these coexisting substances are present in the sample at a low concentration, this does not pose a significant problem in practice, but when the coexisting substance is present in the sample at a high concentration and because the target substance to be quantified is present at an extremely low concentration. However, when the concentration of the coexisting substance becomes a relatively significant ratio even if the concentration is low, a large error may be caused in the measured value. In general, in a measurement by a biochemical method such as a clinical test, there is a case where an object to be quantified is measured with respect to a sample existing at a low concentration of about 10 to 100 μM (depending on the type of measurement method). On the other hand, coexisting substances that may affect the measurement may be present in the sample at a concentration 100 times or more higher than the concentration of the target substance to be quantified. The effect often interferes with accurate quantification of an object.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In particular, in the above colorimetric analysis system, once produced hydrogen peroxide is consumed by the action of a coexisting substance (for example, bilirubin which is a metabolite of hemoglobin) that can be contained in the sample, It is known that the result has a negative effect on the measured values. Since bilirubin, which is a coexisting substance, is a reducing substance, it not only has a negative effect on the measurement value of the analytical system based on such a redox reaction, but also has a strong absorption around 460 nm. In an optical measurement system having a wavelength near 460 nm, when a sample is quantified, the measured value is affected by light absorption of bilirubin. Therefore, in order to achieve accurate colorimetric analysis, it is essential to prevent the influence of co-existing substance bilirubin, which may be contained in the sample.
[0004]
The present invention has been made based on such circumstances, and an object of the present invention is to provide a method capable of preventing the effect of a coexisting substance bilirubin which may be contained in a sample in a clinical test, and a method used in the method. It is to provide a clinical test reagent.
Another object of the present invention is to provide a colorimetric quantitative analysis including a reaction for producing hydrogen peroxide in an analytical reaction process, thereby preventing consumption of hydrogen peroxide by a coexisting substance and achieving accurate quantitative analysis. It is another object of the present invention to provide a method and a colorimetric reagent for use in the method.
Other objects, effects and advantages of the present invention will be derived from the following description and the appended claims.
[0005]
The present inventor has conducted intensive studies, and as a result, quite surprisingly, by adding an effective amount of a polyoxyethylene alkyl phenyl ether condensate to a reagent used for a clinical test, a coexisting substance bilirubin which may be contained in a sample is added. The present inventors have found that the effects of the present invention can be prevented, and have now completed the present invention.
The present inventor further developed this fact, and by adding an effective amount of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate to a reagent used for colorimetric analysis, prevented consumption of hydrogen peroxide by a coexisting substance, The present inventors have also found that the accuracy of the colorimetric analysis including the reaction for producing hydrogen peroxide can be improved in accuracy, and have completed the present invention.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present invention is characterized in that in a clinical test, an effective amount of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate is added to a reagent used for a clinical test in order to prevent the effect of a coexisting substance bilirubin that may be contained in a sample. And a clinical test method.
Further, the present invention relates to a reagent used for a clinical test, wherein an effective amount of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate is added as an inhibitor for an effect of a coexisting substance bilirubin in a sample, the reagent being used for a clinical test. About.
Another aspect of the present invention is a colorimetric analysis including a reaction for producing hydrogen peroxide in an analytical reaction process, wherein an effective amount of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate is used to prevent consumption of hydrogen peroxide by a coexisting substance. To a reagent used for colorimetric analysis.
Further, the present invention relates to a reagent used for colorimetric analysis including a reaction for producing hydrogen peroxide in an analytical reaction process, wherein an effective amount of polyoxyethylene alkyl phenyl ether as an inhibitor for consumption of hydrogen peroxide by a coexisting substance is provided. The present invention relates to a reagent for colorimetric analysis characterized by adding a condensate.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In general, in a colorimetric analysis system in which hydrogen peroxide is generated in the analysis process and a quinone dye is finally formed, the effect of bilirubin is particularly problematic. In this colorimetric quantitative analysis system, an object to be measured in a sample (sample) is oxidized by oxidase, and the coupler and the other coupler are condensed by the action of hydrogen peroxide generated by this reaction, resulting in a quinone dye. Is generated. By measuring the amount of the quinone dye produced by the absorbance at the absorption wavelength, the quantity of the target substance can be determined. However, if the reducing substance bilirubin is present in the sample solution, the generated hydrogen peroxide will be consumed by bilirubin, and the amount of quinone dye produced will decrease accordingly.As a result, the quantitative value of the target substance should be originally detected. It will be lower than the value. That is, when bilirubin coexists in a sample (analyte), the measurement value is negatively affected and cannot be accurately quantified. According to the present invention, the addition of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate to the reagents used in the analysis prevents the reaction of bilirubin with hydrogen peroxide in the analytical reaction process. It is presumed that the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate forms micelles in the reaction solution and incorporates bilirubin therein, thereby preventing bilirubin from participating in the analytical reaction system. Thus, by inhibiting the reaction between bilirubin and hydrogen peroxide, the amount of the quinone dye that should be produced is produced, whereby accurate quantification of the target object is achieved.
[0008]
Further, taking colorimetric analysis using a creatinine measurement reagent as an example, the present reagent is a reagent that is applied even when creatinine of a target substance is present at a relatively low concentration, and the analysis reaction process Is as follows.
Embedded image
When creatinine is present in the sample of the collected sample, creatinine in the sample is opened by the addition of a reagent by the catalytic action of creatininase, and creatine is produced. Next, the produced creatine is decomposed into sarcosine and urea by the action of creatinase, and sarcosine is further decomposed into glycine, formaldehyde and hydrogen peroxide by the action of sarcosine oxidase. The hydrogen peroxide condenses N, N-bis (4-sulfobutyl) -3-methylaniline and 4-aminoantipyrine in the presence of peroxidase to produce a quinone dye. That is, since one molecule of a quinone dye is generated from two molecules of creatinine, the amount of the creatinine is determined by measuring the amount of the quinone dye by an absorbance spectrum at a wavelength of 500 nm to 600 nm including the absorption wavelength range. Concentration).
Here, when bilirubin coexists in the sample, the generated hydrogen peroxide is consumed by bilirubin, and the amount of quinone dye produced decreases accordingly.As a result, the quantitative value of creatinine becomes lower than the value that should be measured. Become. However, if an effective amount of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate has been added to the creatinine measurement reagent in advance, this prevents the reaction between bilirubin and hydrogen peroxide, and the amount of the quinone dye that should be generated is generated, This will achieve an accurate quantification of creatinine.
The examples described below are examples of colorimetric quantitative analysis using such a creatinine measurement reagent.
[0009]
The polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate used in the present invention is a condensate of polyoxyethylene alkylphenyl ether formed from alkylphenols such as nonylphenol and octylphenol. And ethylene octyl phenyl ether condensate. Polyoxyethylene alkyl phenyl ether (APE) is a typical nonionic surfactant, and is widely used as an emulsifier / dispersant in pharmaceuticals, an agricultural chemical spreader, a household detergent, and the like. In the present invention, a condensate derived from APE is used by being added to a reagent used for analysis.
When the reagent used for the analysis is composed of a plurality of types of reagents such as a combination of the first reagent and the second reagent, the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate is not affected as long as the original analytical reaction is not affected. Any of the reagents, and optionally both the first reagent and the second reagent, can be added. In addition, other components such as a buffer in the reagent, or a buffer used for this type of analysis, act as a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate, that is, form micelles and take in bilirubin therein. Normally used ones can be applied as long as they do not affect the above.
Further, the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate used in the present invention may be added to the reagent used for analysis in an amount effective to prevent the reaction between bilirubin and hydrogen peroxide. The amount of bilirubin in the sample to be measured depends on the amount of the reagent used in the analysis and the ratio of the amount of the sample used, that is, the amount of the bilirubin contained in the analysis reaction solution. For example, when bilirubin having a concentration of about 50 mg / dL coexists in a sample and the ratio between the amount of the sample used and the amount of the reagent used is approximately 1:60, the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate is used as an analytical reaction solution. It is desirable that the final concentration in the medium contains approximately 0.1% to 2.4% (W / V).
[0010]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be clarified by describing examples which are considered to be the best embodiments of the present invention.
[0011]
Example 1
First, a reagent 1 and a reagent 2 having the following compositions were prepared. To the reagent 1, a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (trade name: R-1020 (manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.)) is added at a concentration of 0.2% to 3.2% (W / V). .
As samples, two types of human serum samples to which bilirubin F or bilirubin C was added at a concentration of 50 mg / dL and a human serum sample to which no bilirubin was added were prepared. All samples were adjusted so that the creatinine concentration was 0.8 mg / dL.
Next, colorimetric quantitative analysis was performed using an automatic analyzer H7170 (manufactured by Hitachi, Ltd.) according to the endpoint method as a measuring method. That is, 240 μL of Reagent 1 was added to 5 μL of the sample, followed by heating at 37 ° C. for 5 minutes, and then 80 μL of Reagent 2 was further added. The resulting solution was measured for absorbance at a wavelength of 546 nm.
For comparison, a reagent containing no polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020) in the above composition was prepared as reagent 1, and the absorbance at a wavelength of 546 nm of the sample solution was measured under the same procedure and under the same conditions as above. It was measured.
Thus, in each case using various reagents having different final concentrations of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020), the absorbance value measured for the sample (human serum sample) to which bilirubin F was added Of the sample to which no bilirubin F was added, the relative sensitivity to the absorbance value was determined. The result is shown in FIG. Similarly, the relative sensitivity of the absorbance value measured for the sample to which bilirubin C was added (human serum sample) to the absorbance value for the sample to which bilirubin C was not added was determined, and the results are shown in FIG. Was.
[0012]
As shown in FIG. 1, in the control reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was not added, the negative effect that the measured absorbance was reduced by -19% due to the coexisting substance bilirubin F was clearly recognized. However, in the reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added, the negative influence of bilirubin F on the measured absorbance was reduced, and in particular, 2.4% of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added. For the reagents used, the negative effect was only -6%.
Further, as shown in FIG. 2, in the control reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was not added, the coexisting substance bilirubin C clearly showed a significant negative effect of reducing the measured value of the absorbance by -52%. However, in the reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added, the negative influence of the bilirubin C on the measured absorbance was remarkably reduced. In the case of the reagent added with 0.4%, the influence was very small, that is, -6%. As described above, it has been found that the addition of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate has an effect of preventing the effect of the coexisting substance bilirubin F or bilirubin C.
[0013]
Example 2
First, a reagent 1 and a reagent 2 having the following compositions were prepared. To the reagent 2, a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (trade name: R-1020 (manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.)) is added at a concentration of 0.2% to 3.2% (W / V). .
As samples, two types of human serum samples to which bilirubin F or bilirubin C was added at a concentration of 50 mg / dL and a human serum sample to which no bilirubin was added were prepared. All samples were adjusted so that the creatinine concentration was 0.8 mg / dL.
Next, colorimetric quantitative analysis was performed using an automatic analyzer H7170 (manufactured by Hitachi, Ltd.) according to the endpoint method as a measuring method. That is, 240 μL of Reagent 1 was added to 5 μL of the sample, followed by heating at 37 ° C. for 5 minutes, and then 80 μL of Reagent 2 was further added. The resulting solution was measured for absorbance at a wavelength of 546 nm.
For comparison, a reagent not containing the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020) in the above composition was prepared as the reagent 2, and the absorbance at a wavelength of 546 nm of the sample solution was measured under the same procedure and conditions as described above. It was measured.
Thus, in each case using various reagents having different final concentrations of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020), the absorbance value measured for the sample (human serum sample) to which bilirubin F was added Of the sample to which no bilirubin F was added, the relative sensitivity to the absorbance value was determined. The result is shown in FIG. Similarly, the relative sensitivity of the absorbance value measured for the sample to which bilirubin C was added (human serum sample) to the absorbance value for the sample to which bilirubin C was not added was determined, and the results are shown in FIG. Was.
[0014]
As shown in FIG. 3, in the control reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was not added, a negative effect of reducing the measured value of the absorbance by −19% due to the coexisting substance bilirubin F was recognized. However, in the reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added, the negative effect of bilirubin F on the measured absorbance was reduced, and in particular, 0.8% of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added. The reagent had only a negative effect of -15%.
In addition, as shown in FIG. 4, in the control reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was not added, a significant negative effect that the measured value of the absorbance was reduced by -52% due to the coexisting substance bilirubin C was clearly observed. However, in the reagent to which the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added, the negative effect of bilirubin C on the measured absorbance was remarkably reduced. In the case of the reagent added with 0.8%, the negative effect was -20%.
As described above, it was found that, even when the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate was added to the reagent 2, the effect of inhibiting the effect of the coexisting substance bilirubin F or bilirubin C was obtained by the addition.
[0015]
【The invention's effect】
As can be seen from the above description, according to the present invention, by adding an effective amount of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate to a reagent used in a clinical test, a co-existing substance bilirubin that may be contained in a sample in a clinical test is added. The effects can be prevented and accurate measurements can be obtained. According to the present invention, a clinical test reagent used for such an excellent method is provided.
Further, according to the present invention, the addition of an effective amount of a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate to a reagent used for colorimetric analysis prevents consumption of hydrogen peroxide by coexisting substances in the colorimetric analysis, Accurate measurements in colorimetric analysis, including hydrogen production reactions, can be achieved. According to the present invention, there is provided a colorimetric reagent for use in such an excellent method.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the effect of adding a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate in Example 1 to prevent the effect of coexisting substance bilirubin F in a sample. The horizontal axis represents the final concentration of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020), and the vertical axis represents the relative sensitivity of the measured value in the absorbance measurement of a human serum sample with bilirubin F added to the case without bilirubin F added. .
FIG. 2 is a graph showing the effect of adding a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate in Example 1 to prevent the effect of coexisting substance bilirubin C in a sample. The horizontal axis represents the final concentration of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020), and the vertical axis represents the relative sensitivity of the measured value in the absorbance measurement of a human serum sample with bilirubin C added thereto to the case without bilirubin C added. .
FIG. 3 is a graph showing the effect of adding a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate in Example 2 to prevent the effect of coexisting substance bilirubin F in a sample. The horizontal axis represents the final concentration of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020), and the vertical axis represents the relative sensitivity of the measured value in the absorbance measurement of a human serum sample with bilirubin F added to the case without bilirubin F added. .
FIG. 4 is a graph showing the effect of adding a polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate in Example 2 to inhibit the effect of coexisting substance bilirubin C in a sample. The horizontal axis represents the final concentration of the polyoxyethylene alkylphenyl ether condensate (R-1020), and the vertical axis represents the relative sensitivity of the measured value in the absorbance measurement of a human serum sample with bilirubin C added to that without bilirubin C added. .
