【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機膜が基板上にマトリクス状に配置された有機デバイスの製造工程における各工程の品質管理およびそのための分析および検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のいわゆるバイオチップに代表される有機デバイスはゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの目的に利用されるようになってきており、また、それらの解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
バイオチップの作製方法にはいくつかの方法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、基板上にフォトリソグラフィーを用いてＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、あらかじめ合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１−１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２７０，４６７，１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製である。
【０００４】
一般的には、これらいずれかの方法によってバイオチップが作製されるが、これらバイオチップの使用目的を考慮した際に、製品の品質保証が極めて重要となる。品質保証の観点からは、バイオチップ製造の各工程において、それまでのプロセスにおいて作成されている状態を分析、検査することは重要であり、かつプロセス過程での不良品の初期発見は、無駄な商品を作製しないことにもなる。最終的な商品として、これらバイオチップの全てのサンプルに対して全数検査することが望ましいが、全てのプロセスにおいて毎回全数検査を行なうことは困難である。
【０００５】
チップ上のプローブは原理的に単分子膜レベルで存在するので、これらの分析はきわめて高感度な分析手法の適用が必要である。一般的な高感度表面分析手段としてはＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等が挙げられる。
【０００６】
しかしながら工程管理の用途を考えた場合、ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）法はバイオチップ表面にプリズム等を接着するため表面を汚染してしまう可能性があり適さない場合がある。またＸＰＳは高真空中で分析を行なう必要があるために、試料導入等に時間を要し、単位時間あたりに評価できるサンプル数が限られてしまい、極めてスループットが低い。また両者ともに製造工程においてインラインの使用には適さない。
【０００７】
さらにその他の手法としてＸ線反射率法が知られている。Ｘ線反射率法は、超薄膜や多層膜試料の解析を行なう方法の１つとしてよく用いられている。Ｘ線反射率測定は大気中にて非破壊、非接触で評価できるので、インラインで用いる分析方法としては非常に有効である。
【０００８】
具体的には、波長が０．１ｎｍ（１Å）程度のＸ線を用いて、光学的な反射（鏡面反射）を行なわせ、複素屈折率とフレネルの式を基礎とし、解析を行なう手法である。物質が薄膜を持っている場合には、Ｘ線反射率曲線は、Ｘ線の入射角度θが大きくなるに従って、Ｘ線は次第に物質中へ深く入りこむために、理想的な平面をもった物質では、臨界角度θＣ（物質の電子密度に依存する）以上の角度で、Ｘ線反射率がθ−４（θはＸ線入射角）に比例して急激に減少する。また界面からの反射Ｘ線が干渉することになり、反射率に層の厚さを反映した干渉効果が現れる。加えて、表面や界面にラフネス（ミクロな凹凸）がある場合には、それも反射率に影響することになる。従ってこれらの効果を取込んだ反射率の表式等を用いることで、薄膜の厚さや、密度、界面のラフネス等を求めることができる。
【０００９】
現在、一般的に行われている、Ｘ線反射率の測定方法と装置の一例として、［Ｔ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ，Ｗ．Ｐａｒｒｉｓｈ，Ａｄｖ．Ｘ−ｒａｙ Ａｎａｌ．３５，１３７（１９９２）］に記載されているものを図１の模式図を用いて説明する。１１は回転対陰極等のＸ線源、１２はスリット、１３はＸ線の単色化と平行化を行なうためのチャネルカットモノクロメーター、１４はスリット、１５は試料、１６はスリット、１７は散乱Ｘ線や蛍光Ｘ線を除去するためのチャネルカットモノクロメーター、１８はスリット、１９はシンチレーションカウンター等のＸ線検出器である。
【００１０】
Ｘ線源１１から放射されたＸ線がスリット１２とモノクロメーター１３等によって単色化され、さらにスリット１４を通過して表面が平坦な試料１５の表面スレスレに低角度ωからＸ線を入射させると、全反射臨界角度以下では全反射を生じる。
【００１１】
試料１５で反射されたＸ線は、スリット１６、モノクロメーター１７等で、不要なＸ線を除去した上で、Ｘ線検出器１９で強度をモニターする。その強度を用いて、反射率を計算する。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら一般的なＸ線反射率測定を用いてバイオチップの製品品質保証を行なうためには、単に従来のＸ線反射率測定を行なうだけでは、高いスループットで処理するには必ずしも適していなかった。
【００１３】
つまり、反射率の観測に際してはＸ線の試料への入射角ωを数度以下に設定するために精密な位置合わせを行なう必要があり時間を要する。小数のサンプル測定の場合には問題にならないが、複数の試料を検査するという目的のためには、本測定以外に要する余分な時間を可能な限り減らすことはスループット向上のために必要不可欠である。
【００１４】
本発明はこのような問題点を克服し、基板上に形成された有機膜、例えば基板上にマトリクス状に配置された有機デバイス中の該有機膜（バイオチップなど）の膜質を、Ｘ線反射率法を用いて評価するにあたり、効率よく分析することを可能にし、製造工程で実施するにあたり、可能な限りスループットの高い分析、検査方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の有機デバイスの製造工程におけるデバイスの表面状態の検査方法の特徴とするところは、
有機物質からなる膜（以下、有機膜と略す）が基板上に形成された有機デバイスの製造工程における該有機デバイスの膜質を検査、分析する方法において、有機デバイスを配置する試料保持台を有し、かつ該試料保持台を移動させる機構を有し、試料保持台上の測定位置を中心として回転移動するＸ線源と、試料保持台上の測定位置を中心として特定の角度に反射されるＸ線を検出するＸ線検出器を備え、該機構を用いて有機デバイスの製造工程の有機膜を分析することを特徴とする。
【００１６】
特に、前記試料保持台中に、複数個の有機デバイスを固定配置できる領域が設けてあること、前記有機膜が、有機物質からなる積層膜であること、さらには、前記有機膜として複数の生体関連物質を含有し、基板上にマトリクス状に配置された、いわゆるバイオチップであることが本発明の好ましい形態である。
【００１７】
さらには、前記バイオチップ上の前記積層膜の各膜の製造工程において繰り返し積層膜の分析を行なうことを特徴とする前記有機デバイスの表面状態の検査方法である。
【００１８】
以下、図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、基板上に形成された有機膜に対してその製造工程における表面状態の検査方法として用いることが可能であるが、ここでは複数の生体関連物質が基板上にマトリクス状に配置された、いわゆる、バイオチップの工程管理を行なうための分析、検査方法を一例として取り上げて説明する。バイオチップは、その外形サイズが一般的には１ｃｍ×１ｃｍ、１インチ×１インチ（２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ）、あるいはスライドグラスサイズ（例えば、２６ｍｍ×７６ｍｍ）であり、マトリクスはその内部に配置されている。
【００２０】
図２は、本発明のバイオチップの分析を行なうための検査装置の概略図である。本概略図では試料２６の位置が水平に固定された状態でＸ線源２０と入射光学系２１を備えた入射側アーム２２を試料を中心として時計周りにθ回転させたときに、受光光学系２３とＸ線検出器２４を備えた受光側アーム２５も試料を中心として反時計周りにθ回転させながら測定する、いわゆるθ−θゴニオの装置である。本タイプでは、測定に際して試料を動かさないことに加えて、プロセスのラインとして移動してきた試料をそのまま測定できるので、このタイプの装置を用いている。
【００２１】
同図において、２０は一般的な封入管式Ｘ線管や回転対陰極式Ｘ線管等のＸ線源、２１はＸ線源２０から放射されるＸ線の発散角を抑え、入射ビームサイズを決定するための入射光学系である。スリットや多層膜ミラーや結晶モノクロメーター等が用いられる。入射光学系２１から取り出されたＸ線は入射角度ωで試料２６に照射される。２４は入射角度ωと等しい角度で反射してくるＸ線を検出するためのＸ線検出器である。２３の受光光学系には、不要な散乱Ｘ線等が検出器に入るのを防ぐために設置されており、通常はスリットやモノクロメーター等が用いられる。Ｘ線検出器２４は、取り込んだＸ線を電気信号として出力する。通常はシンチレーションカウンター（ＳＣ）や比例計数管（ＰＣ）が用いられる。２８は試料２６へのＸ線の最大照射幅を決定するためのビームナイフである。ビーム照射幅制限手段２８を試料表面から数十ミクロン程度に配置することで、入射角度ωが小さい場合にもＸ線が試料２６からはみでてしまうことを防ぐ役割を果たす。試料保持台２７は不図示の駆動機構によって、Ｚ方向、Ｘ方向への移動ならびに入射Ｘ線と検出器からなる平面（図２のＹＺ平面）に垂直な平面（ＸＺ平面）における、試料位置を中心とした回転（ψ軸回転）が可能となっている。
【００２２】
次に図３を用いて、本発明で用いるバイオチップ用試料保持台２７の説明をする。本試料保持台はバイオチップの形状に合わせた切り込みが設けられており、複数の試料を１度に保持できるようになっている。図３では＃１から＃５までの５つの領域が設けられた図を示してあるが、この個数は５つに限定されるもののではない。また本試料保持台２７は、ライン工程の中で搬送できるような構造にすることも可能であり、通常のラインではそのようになっている方が好ましい。
【００２３】
次に図４を用いて、実際の検査工程の処理手順について説明する。
【００２４】
本工程は、バイオチップの作成後、あるいは作成工程の途中の検査工程いずれでも用いることが可能である。
【００２５】
まず検査を行なう試料を図３に示した試料保持台２７にセットする。その後図２の検査装置の測定位置に移動しセットさせる（４０１）。測定位置にセットされた試料は測定前にＸ線ビームと試料面が平行で、かつダイレクトＸ線の強度が半分になるように試料位置の調整（いわゆる半割調整）を行なう。この手順は通常の方法と同様なので省略する（４０２）。
【００２６】
光学系調整が終了すると、実際の測定を行なう。ここでの測定は通常のＸ線反射率測定と同様の方法で行われる（４０３）。その測定結果を用いて検査終了した製品が良品か否かが判定される（４０４）。
【００２７】
通常の反射率測定では、例えばωを３度程度まで測定することで行われるが、検査するポイントとして、良品と比較判定することに限定すれば、判定基準としては良品試料とのデータ比較、あるいは全反射臨界角近傍だけの測定でも構わない。この判定で良品でないと判断されたものについては、不良品であるという情報が何らかの方法で外部に出力される。１つの試料が測定終了した時点で試料保持台に複数個試料がセットされている場合には次の領域の測定が実行される（４０５）。次の試料の測定にあたっては、測定位置を外部から指定することで所望の位置に移動して測定が行なわれる。この際にＸ軸、Ｚ軸、ψ軸を駆動させることで２つ目以降の試料は位置調整が行われる。これら軸の駆動だけで正確な半割調整等は省略することもできる。
【００２８】
なお、上記バイオチップに搭載され生体関連物質は、特に限定されるものではなく、どのような物質であってもよいが、核酸、あるいは蛋白質ないしその類似化合物であれば好適に分析し得る。核酸の例としてはオリゴデオキシヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）等のＤＮＡ、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ、または骨格がペプチドで構成されるＰＮＡ（ペプチド核酸）で代表される核酸アナログがあげられる。蛋白質ないしその類似化合物の例としてはオリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、抗体等を例としてあげることができる。
【００２９】
【実施例】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが。本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の目的が達成される範囲内での各要素の置換や設計変更がなされたものをも包含する。また、実施例内で用いている符号は、図２、図３で記述してある符号と同一である。
【００３０】
（実施例１） （ｄＴ４０プローブによる核酸プローブアレイの作製）
特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に準じて核酸プローブアレイを作製した。
【００３１】
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行なった。次に、予め８０℃に加温した１ｍｏｌ／Ｌ（１Ｎ）水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行なって、そのまま次工程に供した。
【００３２】
（２）表面処理１
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００３３】
（３）検査
基板上のシランカップリング剤表面処理が正常に形成されているかを確認するために、本発明の検査を行なった。試料保持台としては１０ｃｍ×３ｃｍのＴａ製の基板上に２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍの大きさの基板が４枚配置できる試料配置領域３１が設けられたものを採用した。
【００３４】
Ｘ線源２０としては、Ｃｕを対陰極とする回転対陰極Ｘ線管を使用した。回転対陰極Ｘ線管を管電圧５０ｋＶ、管電流３００ｍＡで駆動した。Ｘ線焦点はラインフォーカスとした。入射光学系２１としては、放物面形状の多層膜ミラーを用いた。ここでの入射Ｘ線の発散角は約０．０４°であった。試料表面で反射されたＸ線は開口角０．２５°のソーラースリット（多数の箔が紙面に垂直方向に並んでいる）からなる受光光学系２３を通して、Ｘ線検出器２４で検出した。Ｘ線検出器としてはシンチレーション検出器を用いた。
【００３５】
不図示の駆動機構を用いて、試料保持台２７のアドレス＃３を測定位置へ移動し、試料保持台を−Ｚ方向へ、入射Ｘ線が試料２６によってさえぎられないように移動した。
【００３６】
その後θｉとθｓを０°にセットして、θｓの走査を行い零点位置の調整を行った。その後、試料保持台を＋Ｚ方向に移動してＸ線強度が半分になる位置に固定した。その後θｉを走査してθｉの零点調整を実行。その後再度試料保持台２６のＺ方向移動を行い、試料位置を決定した。引き続きψ軸を微小変化させて同様の操作を行い試料位置を決定した。最後は入射角ω＝０．２度、θｓ＝０．４度の位置にＸ線検出器をセットして角度の補正を行なった。
【００３７】
続いて、ビーム照射幅制限手段２８を試料表面から２０μｍの位置にセットした。その後、入射側を時計周りに一定角度回転させる毎に、検出側を反時計周りに同一角度走査して反射Ｘ線強度を測定した。この測定を繰り返すことにより反射Ｘ線の角度分布を得た。
【００３８】
良品、不良品の判断は、反射率曲線の臨界角、得られた反射Ｘ線強度曲線とあらかじめ測定してあった基板の反射Ｘ線強度の比較、良品の反射率曲線を総合してシランカップリング剤表面処理が正常に形成されているか否かの判断を行なった。
【００３９】
引き続き次の試料の測定を行なうために、図３のパターンから計算される値を用いて、試料保持台２６に接続されている不図示のＸ方向移動機構、Ｚ方向移動機構、ψ軸駆動機構を用いて、次の試料の測定位置の正確な位置決めを行なった。
【００４０】
その後同様の方法で測定を行い、全４サンプルに対して検査工程を行なった。この段階で不良品と判断された基板は次工程処理をとりやめた。
【００４１】
（４）表面処理２
あらかじめＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなる様に溶解した溶液を準備した。検査工程で良品と判断された基板に対して、このＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
【００４２】
（５）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して配列番号１の一本鎖核酸（Ｔの４０量体）を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行なった。
配列番号：１
５’ ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ３’
（６）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号１の一本鎖ＤＮＡを８μｍｍｏｌ／Ｌの濃度でグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び上記一般式（Ｉ）で示されるアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液を溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数百μＬの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数百μＬ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐＬ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００４３】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。
【００４４】
（実施例２）
実施例１に示した手順（１）→（２）→（４）の手順で作成した基板を本発明の検査装置を用いて検査した。１００サンプルの検査を行なったところ、１サンプルのみ不良品と判断された。検査で合格した基板に対して、実施例１の（５）→（６）の処理を施した。
【００４５】
（７）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるチップの確認
配列番号１のＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡと実施例２で合格品と判断されたプローブアレイをハイブリダイゼーションさせ、特開２００１−０６６３０５号公報に開示したハイブリダイゼーション後の蛍光強度のばらつきの確認を行なった。
【００４６】
（比較例１）
実施例２で不良品と判断された試料に対して実施例２の（７）と同様の方法で確認したところ、部分的に蛍光強度が弱い領域が確認された。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の有機デバイスの製造工程におけるデバイスの表面状態の検査方法によれば、バイオチップ等の有機デバイス作成工程における品質検査方法として、複数個のバイオチップ基板を大気中にて非破壊、非接触にて検査を行なうことが可能となると同時に、作製過程の初期において不良基板等を発見することが可能となった。
【００４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＸ線反射率測定装置の一例を示す模式図である。
【図２】本発明のバイオチップの分析を行なうための検査装置の概略図である。
【図３】（ａ）図２の検査装置で用いるバイオチップ用試料ホルダの模式図である。
（ｂ）図３（ａ）のＡ−Ａ’の断面図である。
【図４】本発明で説明する検査装置を用いた検査工程の処理手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
１１：Ｘ線源
１２：スリット
１３：チャネルカットモノクロメーター
１４：スリット
１５：試料
１６：スリット
１７：チャネルカットモノクロメーター
１８：スリット
１９：Ｘ線検出器
２０：Ｘ線源
２１：入射光学系
２２：入射側アーム
２３：受光光学系
２４：Ｘ線検出器
２５：受光側アーム
２６：試料
２７：試料保持台
２８：ビーム照射幅制限手段
３１：試料配置領域
＃１〜＃５：各配置領域[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to quality control of each step in a manufacturing process of an organic device in which an organic film is arranged in a matrix on a substrate, and an analysis and inspection method therefor.
[0002]
[Prior art]
Organic devices typified by so-called biochips, such as DNA chips and protein chips, have come to be used for the purpose of genomic analysis or gene expression analysis, and the results of those analyzes are It is expected to provide important indices for diagnosis, prognosis prediction, treatment policy determination, and the like of genetic diseases, lifestyle diseases, infectious diseases, and the like.
[0003]
Several methods are known for producing biochips. Taking a DNA chip as an example, a method of sequentially synthesizing a DNA probe on a substrate by using photolithography (US Pat. No. 5,405,783 or the like), or a DNA or cDNA (complementary DNA) synthesized in advance. ) On a substrate and bonding them (US Pat. No. 5,601,980, JP-A-11-187900, Science Vol. 270, 467, 1995, etc.) is a typical method for producing a DNA chip.
[0004]
In general, biochips are produced by any of these methods, but in consideration of the purpose of use of these biochips, quality assurance of products is extremely important. From the viewpoint of quality assurance, in each step of biochip manufacturing, it is important to analyze and inspect the state created in the previous process, and early detection of defective products in the process is useless. It also means that no product is made. As a final product, it is desirable to perform a 100% inspection on all samples of these biochips, but it is difficult to perform a 100% inspection every time in every process.
[0005]
Since the probes on the chip exist in principle at the monolayer level, these analyzes require the application of extremely sensitive analytical methods. Examples of general high-sensitivity surface analysis means include an ATR method using an FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy) method, an XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) method, and the like.
[0006]
However, considering the use of process control, the FT-IR (ATR) method is not suitable because the surface may be contaminated because a prism or the like is adhered to the biochip surface. In addition, since XPS requires analysis in a high vacuum, time is required for sample introduction and the like, the number of samples that can be evaluated per unit time is limited, and the throughput is extremely low. Neither is suitable for in-line use in the manufacturing process.
[0007]
As another method, an X-ray reflectivity method is known. The X-ray reflectivity method is often used as one of methods for analyzing an ultra-thin film or a multilayer film sample. Since the X-ray reflectivity measurement can be evaluated in the air in a non-destructive and non-contact manner, it is very effective as an in-line analysis method.
[0008]
Specifically, this method is to perform optical reflection (specular reflection) using X-rays having a wavelength of about 0.1 nm (1 °), and to perform analysis based on the complex refractive index and the Fresnel equation. . When the substance has a thin film, the X-ray reflectivity curve shows that an X-ray gradually penetrates deeper into the substance as the incident angle θ of the X-ray becomes larger. At an angle equal to or greater than the critical angle θ C (depending on the electron density of the substance), the X-ray reflectance sharply decreases in proportion to θ −4 (θ is the X-ray incident angle). In addition, the reflected X-rays from the interface interfere, and an interference effect that reflects the thickness of the layer on the reflectivity appears. In addition, if there is roughness (microscopic unevenness) on the surface or interface, it also affects the reflectance. Therefore, the thickness, the density, the interface roughness, and the like of the thin film can be obtained by using a reflectance expression incorporating these effects.
[0009]
As an example of a method and an apparatus for measuring the X-ray reflectivity, which are currently generally performed, [T. C. Huang, W.C. Parrish, Adv. X-ray Anal. 35, 137 (1992)] will be described with reference to the schematic diagram of FIG. 11 is an X-ray source such as a rotating anti-cathode, 12 is a slit, 13 is a channel cut monochromator for making X-ray monochromatic and parallel, 14 is a slit, 15 is a sample, 16 is a slit, and 17 is a scattered X-ray. A channel cut monochromator for removing X-rays and fluorescent X-rays, 18 is a slit, and 19 is an X-ray detector such as a scintillation counter.
[0010]
When the X-rays emitted from the X-ray source 11 are monochromatized by the slit 12 and the monochromator 13 and the like, and further passed through the slit 14, the X-rays are incident from a low angle ω onto the surface thread of the sample 15 having a flat surface. When the total reflection angle is less than the critical angle, total reflection occurs.
[0011]
The X-rays reflected by the sample 15 are monitored by an X-ray detector 19 after removing unnecessary X-rays with a slit 16, a monochromator 17 or the like. The reflectance is calculated using the intensity.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
However, in order to assure product quality of a biochip using general X-ray reflectivity measurement, simply performing conventional X-ray reflectivity measurement is not necessarily suitable for processing at high throughput.
[0013]
In other words, when observing the reflectivity, it is necessary to perform precise positioning in order to set the incident angle ω of the X-ray to the sample to several degrees or less, which requires time. This is not a problem when measuring a small number of samples, but for the purpose of testing multiple samples, it is essential to reduce the extra time required outside of the main measurement as much as possible to improve throughput. .
[0014]
The present invention overcomes the above-mentioned problems and reduces the quality of an organic film formed on a substrate, for example, an organic device (eg, a biochip) in an organic device arranged in a matrix on the substrate by X-ray reflection. An object of the present invention is to provide an analysis / inspection method which enables efficient analysis in the evaluation using the rate method and has as high a throughput as possible in the production process.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The feature of the inspection method of the surface state of the device in the manufacturing process of the organic device of the present invention,
In a method of inspecting and analyzing the film quality of an organic device in a manufacturing process of an organic device in which a film made of an organic substance (hereinafter, abbreviated as an organic film) is formed on a substrate, the method includes a sample holding table on which the organic device is arranged. And an X-ray source having a mechanism for moving the sample holder, the X-ray source rotating around a measurement position on the sample holder, and an X-ray reflected at a specific angle around the measurement position on the sample holder. An X-ray detector for detecting a line is provided, and an organic film in an organic device manufacturing process is analyzed using the mechanism.
[0016]
In particular, in the sample holder, a region in which a plurality of organic devices can be fixedly arranged is provided, the organic film is a laminated film made of an organic substance, and further, a plurality of biologically related organic films are used as the organic film. A preferred embodiment of the present invention is a so-called biochip which contains a substance and is arranged in a matrix on a substrate.
[0017]
Further, there is provided a method for inspecting a surface state of the organic device, wherein the laminated film is repeatedly analyzed in a process of manufacturing each of the laminated films on the biochip.
[0018]
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention can be used as an inspection method of a surface state in a manufacturing process for an organic film formed on a substrate, but here, a plurality of bio-related substances are arranged in a matrix on the substrate. A so-called analysis and inspection method for controlling the process of a biochip will be described as an example. The biochip generally has an outer size of 1 cm × 1 cm, 1 inch × 1 inch (25.4 mm × 25.4 mm), or a slide glass size (for example, 26 mm × 76 mm), and a matrix is provided inside the biochip. Are located.
[0020]
FIG. 2 is a schematic diagram of a testing device for analyzing a biochip of the present invention. In this schematic diagram, when the incident side arm 22 provided with the X-ray source 20 and the incident optical system 21 is rotated clockwise θ around the sample while the position of the sample 26 is fixed horizontally, the light receiving optical system The light-receiving side arm 25 provided with the X-ray detector 23 and the X-ray detector 24 is also a so-called θ-θ gonio apparatus that measures while rotating θ counterclockwise around the sample. This type uses an apparatus of this type because, in addition to not moving the sample at the time of measurement, the sample moving as a process line can be measured as it is.
[0021]
In the figure, reference numeral 20 denotes an X-ray source such as a general sealed tube type X-ray tube or a rotating anti-cathode type X-ray tube; 21, a divergence angle of X-rays radiated from the X-ray source 20 is suppressed; Is an incident optical system for determining A slit, a multilayer mirror, a crystal monochromator, or the like is used. The X-rays extracted from the incident optical system 21 are irradiated on the sample 26 at an incident angle ω. Reference numeral 24 denotes an X-ray detector for detecting X-rays reflected at an angle equal to the incident angle ω. The light receiving optical system 23 is provided to prevent unnecessary scattered X-rays and the like from entering the detector, and usually includes a slit, a monochromator, and the like. The X-ray detector 24 outputs the captured X-rays as an electric signal. Usually, a scintillation counter (SC) or a proportional counter (PC) is used. Reference numeral 28 denotes a beam knife for determining the maximum irradiation width of the sample 26 with X-rays. By arranging the beam irradiation width limiting means 28 at about several tens of microns from the sample surface, it plays a role in preventing X-rays from protruding from the sample 26 even when the incident angle ω is small. The sample holder 27 is moved by a drive mechanism (not shown) in the Z and X directions, and moves the sample position on a plane (XZ plane) perpendicular to a plane (YZ plane in FIG. 2) formed by the incident X-rays and the detector. Rotation around the center (ψ axis rotation) is possible.
[0022]
Next, the biochip sample holder 27 used in the present invention will be described with reference to FIG. The sample holding table is provided with cuts corresponding to the shape of the biochip, so that a plurality of samples can be held at one time. FIG. 3 shows a diagram in which five regions from # 1 to # 5 are provided, but the number is not limited to five. In addition, the sample holding table 27 can be configured to be able to be transported in a line process, and it is preferable that the sample holding table be configured as such in a normal line.
[0023]
Next, a processing procedure of an actual inspection process will be described with reference to FIG.
[0024]
This step can be used either after the preparation of the biochip or in the inspection step during the preparation step.
[0025]
First, a sample to be inspected is set on the sample holder 27 shown in FIG. Thereafter, it is moved to the measurement position of the inspection apparatus of FIG. 2 and set (401). Before the measurement, the sample set at the measurement position is adjusted (so-called half-adjustment) so that the X-ray beam and the sample surface are parallel and the intensity of the direct X-ray becomes half. This procedure is the same as the ordinary method, and thus will not be described (402).
[0026]
When the optical system adjustment is completed, an actual measurement is performed. The measurement here is performed by the same method as the usual X-ray reflectivity measurement (403). Using the measurement result, it is determined whether or not the inspected product is non-defective (404).
[0027]
In the ordinary reflectance measurement, for example, measurement is performed by measuring ω to about 3 degrees. However, if the point to be inspected is limited to comparison and determination with non-defective products, data comparison with non-defective samples, or The measurement may be performed only near the critical angle of total reflection. Information that is determined to be non-defective in this determination is defective, and is output to the outside by some method. If a plurality of samples are set on the sample holding table at the time when the measurement of one sample is completed, the measurement of the next area is executed (405). In the next measurement of the sample, the measurement is performed by designating the measurement position from the outside and moving to a desired position. At this time, by driving the X axis, the Z axis, and the ψ axis, the second and subsequent samples are adjusted in position. Accurate half-adjustment or the like can be omitted only by driving these shafts.
[0028]
The bio-related substance mounted on the biochip is not particularly limited, and may be any substance. However, nucleic acid, protein, or a similar compound can be suitably analyzed. Examples of the nucleic acid include DNA such as oligodeoxynucleotide, polydeoxynucleotide, and cDNA (complementary DNA), RNA such as mRNA, tRNA, and rRNA, or PNA (peptide nucleic acid) whose skeleton is composed of a peptide. Nucleic acid analogs. Examples of proteins or their analogous compounds include oligopeptides, polypeptides, enzymes, antibodies and the like.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to specific examples. The present invention is not limited to these embodiments, but also includes those in which each element is replaced or a design is changed within a range in which the object of the present invention is achieved. The reference numerals used in the embodiments are the same as those described in FIGS.
[0030]
(Example 1) (Preparation of nucleic acid probe array using dT40 probe)
A nucleic acid probe array was prepared according to the method described in JP-A-11-187900.
[0031]
(1) Cleaning of Substrate A synthetic quartz substrate of 25.4 mm × 25.4 mm × 1 mm was put in a rack and immersed overnight in an ultrasonic cleaning detergent (Branson: GPIII) diluted to 10% with pure water. Thereafter, ultrasonic cleaning was performed in a detergent for 20 minutes, and then the detergent was removed by washing with water. After rinsing with pure water, ultrasonic treatment was further performed for 20 minutes in a container containing pure water. Next, the substrate was immersed in a 1 mol / L (1N) aqueous solution of sodium hydroxide preheated to 80 ° C. for 10 minutes. Subsequently, washing with water and washing with pure water were performed, and the resultant was directly used in the next step.
[0032]
(2) Surface treatment 1
A 1 wt% aqueous solution of an amino group-bonded silane coupling agent, N-β- (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane KBM603 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) is stirred at room temperature for 2 hours, and the molecular weight of the silane compound is reduced. The methoxy group in was hydrolyzed. Next, the substrate obtained in the above (1) was immersed in this solution at room temperature for 1 hour, washed with pure water, and dried by spraying nitrogen gas on both sides of the substrate. Next, the substrate was baked for 1 hour in an oven heated to 120 ° C. to finally introduce amino groups on the substrate surface.
[0033]
(3) The inspection of the present invention was performed to confirm whether the surface treatment of the silane coupling agent on the inspection substrate was formed normally. As the sample holding table, a sample holding area 31 in which four 25.4 mm × 25.4 mm substrates can be arranged on a 10 cm × 3 cm Ta substrate was used.
[0034]
As the X-ray source 20, a rotating anti-cathode X-ray tube using Cu as an anti-cathode was used. The rotating anti-cathode X-ray tube was driven at a tube voltage of 50 kV and a tube current of 300 mA. The X-ray focus was a line focus. As the incident optical system 21, a parabolic multilayer mirror was used. Here, the divergence angle of the incident X-ray was about 0.04 °. The X-rays reflected on the sample surface were detected by an X-ray detector 24 through a light receiving optical system 23 composed of a solar slit having an aperture angle of 0.25 ° (a number of foils are arranged in a direction perpendicular to the paper surface). A scintillation detector was used as the X-ray detector.
[0035]
Using a drive mechanism (not shown), the address # 3 of the sample holder 27 was moved to the measurement position, and the sample holder was moved in the −Z direction so that incident X-rays were not blocked by the sample 26.
[0036]
Thereafter, θ i and θ s were set to 0 °, and scanning of θ s was performed to adjust the zero point position. Thereafter, the sample holder was moved in the + Z direction and fixed at a position where the X-ray intensity became half. After that, θ i is scanned and zero adjustment of θ i is performed. Thereafter, the sample holder 26 was moved again in the Z direction, and the sample position was determined. Subsequently, the same operation was performed by slightly changing the ψ axis to determine the sample position. Finally, the X-ray detector was set at a position where the incident angle ω = 0.2 degrees and θ s = 0.4 degrees to correct the angle.
[0037]
Subsequently, the beam irradiation width limiting means 28 was set at a position 20 μm from the sample surface. Thereafter, each time the incident side was rotated clockwise by a certain angle, the detection side was scanned counterclockwise at the same angle to measure the reflected X-ray intensity. By repeating this measurement, the angular distribution of the reflected X-rays was obtained.
[0038]
Non-defective products and defective products are determined by comparing the critical angle of the reflectance curve, the obtained reflected X-ray intensity curve with the measured reflected X-ray intensity of the substrate, and the reflectance curve of the good product. It was determined whether or not the ring agent surface treatment was properly formed.
[0039]
In order to continue the measurement of the next sample, an X-direction moving mechanism (not shown), a Z-direction moving mechanism, and a ψ-axis driving mechanism (not shown) connected to the sample holding table 26 using values calculated from the pattern of FIG. Was used to accurately position the measurement position of the next sample.
[0040]
Thereafter, measurement was performed in the same manner, and an inspection process was performed on all four samples. Substrates determined to be defective at this stage were not processed in the next step.
[0041]
(4) Surface treatment 2
A solution prepared by previously dissolving 2.7 mg of N-maleimidocaproyloxysuccinimide (Dojindo Laboratories: EMCS) in a 1: 1 solution of dimethylsulfoxide (DMSO) / ethanol to a concentration of 0.3 mg / mL. Got ready. Substrates determined to be non-defective in the inspection process were immersed in this EMCS solution at room temperature for 2 hours to react amino groups carried on the substrate surface with succinimide groups in the EMCS solution by silane coupling treatment. At this stage, a maleimide group derived from EMCS exists on the substrate surface. The substrate pulled up from the EMCS solution was sequentially washed with a mixed solvent of DMSO and ethanol and ethanol, and then dried by blowing nitrogen gas.
[0042]
(5) Synthesis of Probe DNA A single-stranded nucleic acid (40-mer of T) was synthesized at the request of a DNA synthesizer (Vex). Note that a thiol (SH) group was introduced into the 5 ′ end of the single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 by using a thiol modifier (Glen Research) during synthesis. In addition, deprotection and recovery of DNA were performed by a conventional method, and HPLC was used for purification. A series of steps from synthesis to purification were all performed by a synthesis company.
SEQ ID NO: 1
5 'HS- (CH 2) 6 -O-PO 2 -O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3'
(6) Discharge of DNA by thermal jet printer and binding to substrate The above single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 was glycerol 7.5 wt%, urea 7.5 wt%, thiodiglycol 7.5 wt% at a concentration of 8 μmmol / L. And a solution containing 1 wt% of acetylene alcohol (trade name: acetylenol EH; manufactured by Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) represented by the above general formula (I) was dissolved. The printer head BC-50 (Canon) for a bubble jet printer BJF-850 (Canon) using the bubble jet method, which is a kind of the thermal jet method, was modified to discharge several hundred μL of a solution, and this head was modified. The apparatus was mounted on a discharge drawing machine modified so as to be able to discharge onto the quartz substrate. Several hundred μL of the above DNA solution was injected into the modified tank section of this head, and an EMCS substrate was mounted on a discharge drawing machine, and spotting was performed here. The discharge amount at the time of spotting was 4 pL / droplet, and the spotting range was 200 dpi, that is, 127 μm pitch, in the range of 10 mm × 10 mm in the center of the substrate. Under these conditions, the spotted dots had a diameter of about 50 μm.
[0043]
After the completion of the spotting, the substrate was allowed to stand in a humidified chamber for 30 minutes to react the maleimide group on the surface of the glass plate with the thiol group at the terminal of the nucleic acid probe. Next, the substrate was washed with pure water and stored in pure water.
[0044]
(Example 2)
The substrate prepared according to the procedure (1) → (2) → (4) shown in Example 1 was inspected using the inspection apparatus of the present invention. When 100 samples were inspected, only one sample was determined to be defective. Substrates that passed the inspection were subjected to the processes (5) → (6) of Example 1.
[0045]
(7) Confirmation of chip by Hybridization A single-stranded DNA having a base sequence complementary to the DNA of SEQ ID NO: 1 was hybridized with a probe array determined to be acceptable in Example 2, and disclosed in JP-A-2001-066305. Of the fluorescence intensity after the hybridization disclosed in (1).
[0046]
(Comparative Example 1)
When the sample determined to be defective in Example 2 was confirmed by the same method as in (7) of Example 2, a region where the fluorescence intensity was weak was partially confirmed.
[0047]
【The invention's effect】
According to the method for inspecting a surface state of a device in a manufacturing process of an organic device of the present invention, a plurality of biochip substrates are non-destructively and non-contacted in the air as a quality inspection method in a process of producing an organic device such as a biochip. In addition, the inspection can be performed at the same time, and a defective substrate or the like can be found at an early stage of the manufacturing process.
[0048]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a conventional X-ray reflectivity measuring device.
FIG. 2 is a schematic diagram of a testing device for analyzing a biochip of the present invention.
3A is a schematic view of a biochip sample holder used in the inspection apparatus of FIG. 2;
(B) It is sectional drawing of AA 'of FIG.3 (a).
FIG. 4 is a flowchart showing a processing procedure of an inspection process using the inspection device described in the present invention.
[Explanation of symbols]
11: X-ray source 12: slit 13: channel cut monochromator 14: slit 15: sample 16: slit 17: channel cut monochromator 18: slit 19: X-ray detector 20: X-ray source 21: incident optical system 22: Incident side arm 23: Receiving optical system 24: X-ray detector 25: Receiving side arm 26: Sample 27: Sample holder 28: Beam irradiation width limiting means 31: Sample placement areas # 1 to # 5: Each placement area
