【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ハプテン抗原に関する。詳しくは、ジベンゾパラダイオキシン（以下、ダイオキシンと略記する。）類に対する抗体を取得するための新規ハプテン抗原に関する。本発明は又、該ハプテン抗原に対する抗体として取得されたダイオキシン類に対する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いたダイオキシン類の免疫化学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体に極めて重大な影響を及ぼす毒性化学物質であるダイオキシン類による環境汚染が問題となってきており、環境又は生体中などにおけるダイオキシン類を測定し、汚染状況を調査することが急務となってきている。そのため、環境又は生体中などにおけるダイオキシン類を測定するための方法の開発が進められている。
【０００３】
ダイオキシン類の測定方法の一つとして、免疫化学的測定方法がある。免疫化学的測定方法においては、ダイオキシン類の抗体を用いて試料中のダイオキシン類の濃度を測定する。しかしながら、ダイオキシン類は低分子であり、そのままでは抗体産生が起こらないハプテン（免疫原性がない）であるため、ダイオキシン類の抗体を作製するにはハプテンをキャリアータンパク質［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）など］などの高分子化合物と結合させ、免疫原とする必要がある。
【０００４】
この様な方法として、特開昭６３−１４６９１号には、１−アミノ−３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンをキャリアータンパクに結合させて得たハプテン抗原を用いてモノクロナール抗体を取得すること、又、該モノクローナル抗体を用いたダイオキシン類の検出方法が開示されている。
【０００５】
また、特開昭６３−７４４９４号には、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンとキャリアーの免疫複合体を用いて抗体を取得すること、又、該モノクローナル抗体を用いたダイオキシン類の分析方法が開示されている。
【０００６】
また、特開２００２−１１９２７９号には、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンとキャリアーを結合させた抗原を用いて抗体を取得すること、又、該モノクローナル抗体を用いたダイオキシン類の分析方法が開示されている。
【０００７】
これらの方法を含む、従来のダイオキシン類の免疫化学的測定方法で用いられる、ダイオキシン類に対する抗体を取得するために用いられている既知のハプテン−キャリアータンパク質複合体免疫原では、ダイオキシン骨格の炭素に側鎖を導入し、その末端にキャリアータンパク質を結合させている。
【０００８】
ところで、環境中で問題となっているダイオキシン類は、多塩素化ダイオキシンであり、その塩素化されている位置および数が異なる多数の類縁体が存在する。既知のダイオキシンハプテン抗原は、ダイオキシン骨格の塩素の付く位置に側鎖を導入しているため、このようなハプテン−キャリアー複合体免疫原から作製された抗体は、種々の塩素化ダイオキシンの識別性に問題があると考えられる。
【０００９】
また、人体および環境などに対する危険性の点で、ダイオキシン骨格において４個以上の塩素で置換されたダイオキシン抗原を作製することは望ましくないと考えられる。
【００１０】
したがって、安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原の開発が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、上記課題を解決することを目的とし、安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原を提供することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ハプテン部分にダイオキシン骨格ではなくダイオキシン類の類似構造体であるキサンテン骨格を有するハプテン抗原を用いて、塩素化ダイオキシン類に対する抗体を取得することに成功し、発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は上記のようにしてなされたものであり、本発明の要旨は以下の通りである。
（１） 下記の一般式（１）
【００１４】
【化５】
【００１５】
（ただし、一般式（１）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示し、Ｒ２は水酸基、カルボキシルアシルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基を示す。）により表される化合物。
（２） 一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ２が水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基である（１）に記載の化合物。
（３） 一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又は塩素原子である（１）又は（２）に記載の化合物。
（４） 下記の一般式（２）
【００１６】
【化６】
【００１７】
（ただし、一般式（２）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ２は水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基を示す。）により表される化合物。
（５） 一般式（２）のうち、Ｒ３が塩素原子である（４）に記載の化合物。
（６） 下記の式（３）の構造を有する化合物。
【００１８】
【化７】
【００１９】
（７） （１）から（６）のいずれかに記載された化合物と高分子化合物との複合体。
（８） 高分子化合物がタンパク質である（７）に記載の複合体。
（９） 高分子化合物がウシ血清アルブミン又はウシガンマグロブリンである（７）又は（８）に記載の複合体。
（１０） （７）から（９）のいずれかに記載の複合体を抗原として用いることを特徴とする、一般式（４）
【００２０】
【化８】
【００２１】
（ただし、一般式（４）中、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はニトロ基を示す。）で表される化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
（１１） 一般式（４）で表される化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
（１２） 抗体がモノクローナル抗体である（１１）に記載の抗体又はそのフラグメント。
（１３） （１２）に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（１４） 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８２７で寄託されている（１３）に記載のハイブリドーマ。
（１５） （１１）もしくは（１２）に記載の抗体又はそのフラグメントを用いることを特徴とする、一般式（４）で表される化合物の免疫化学的測定方法。
（１６） さらに、（７）から（９）のいずれかに記載の複合体を用いることを特徴とする、（１５）に記載の免疫化学的測定方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のハプテン抗原
本発明のハプテン抗原は、ハプテン部分がダイオキシン骨格ではなく、ダイオキシン類の類似構造体であるキサンテン骨格を有する化合物であり、塩素化ダイオキシン類に対する抗体を取得するための免疫原となる化合物である。本発明のハプテン抗原のハプテン部分はキサンテン骨格を有する化合物であり、ダイオキシン骨格の塩素化されない酸素原子位置に相当する、キサンテン骨格の９位の炭素の位置に側鎖を導入したことに特徴があり、種々の塩素化ダイオキシンの識別性に優れた抗体を取得するための免疫原となり得る。
【００２３】
本発明のハプテンは、 下記の一般式（１）
【００２４】
【化９】
【００２５】
（ただし、一般式（１）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示し、Ｒ２は水酸基、カルボキシルアシルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基を示す。）により表される化合物である。
【００２６】
ｎは、好ましくは２〜１０、より好ましくは４〜８までのいずれかの整数である。
Ｒ１は、それぞれ独立であって、置換基の位置および種類などは特に限定されない。Ｒ１の具体例としては、水素原子、塩素原子、臭素原子、アミノ基、ニトロ基、メチル基などが好ましく例示できる。
Ｒ２のうち、カルボキシルアシルオキシ基の炭素数としては好ましくは３〜６までのいずれかの整数である。Ｒ２の具体例としては、水酸基、カルボキシルプロピオニルオキシ基、カルボキシルバレイルオキシ基、カルボキシル基、アミノ基又はチオール基などが好ましく例示できる。
【００２７】
本発明のハプテンは、好ましくは、一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ２が水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基である化合物である。本発明のハプテンは、好ましくは、一般式（１）のうち、Ｒ１が水素原子又は塩素原子である化合物である。
【００２８】
本発明のハプテンは、好ましくは、下記の一般式（２）
【００２９】
【化１０】
【００３０】
（ただし、一般式（２）中、ｎは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｒ３はハロゲン原子を示し、Ｒ２は水酸基又はカルボキシルアシルオキシ基を示す。）により表される化合物である。
ｎは、好ましくは２〜１０、より好ましくは４〜８までのいずれかの整数である。
Ｒ３の具体例としては、塩素原子、臭素原子などが好ましく例示できる。
Ｒ２のうち、カルボキシルアシルオキシ基の炭素数としては好ましくは３〜６までのいずれかの整数である。Ｒ２の具体例としては、水酸基、カルボキシルプロピオニルオキシ基、カルボキシルバレイルオキシ基などが好ましく例示できる。
本発明のハプテンは、好ましくは、一般式（２）のうち、Ｒ３が塩素原子である化合物である。
【００３１】
本発明のハプテンの具体例としては、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル、アジピン酸モノ８−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）オクチルなどが好ましく例示できる。
【００３２】
本発明のハプテンは、常法（［医薬品の開発、第１０巻診断薬、第３章、廣川書店］、［生化学実験法１１−エンザイムイムノアッセイ、１２章、東京化学同人］等）に従って、高分子化合物と結合させ、塩素化ダイオキシン類に対する抗体を取得するための免疫原とすることができる。高分子化合物としては、タンパク質が好ましく例示できる。このようにハプテンと結合させて免疫原を作製するためのタンパク質をキャリアータンパク質と称する。キャリアータンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンなどが好ましく例示できる。
【００３３】
本発明のハプテン抗原は、ダイオキシン類に対する抗体の免疫原となるにも関わらず、ハプテン部分にダイオキシン骨格を有しない化合物を用いた新規なハプテン抗原である。
【００３４】
（２）本発明のハプテン抗原の製造方法
本発明のハプテン抗原のハプテン部分は、キサンテン骨格を有し、ダイオキシン類の有するダイオキシン骨格において塩素化されない酸素原子位置に相当する、キサンテン骨格の９位の炭素の位置に側鎖が導入されていることを特徴とする。
【００３５】
本発明のハプテンは、例えば、下記の方法により得られる。式（Ａ）で表される化合物
【００３６】
【化１１】
【００３７】
（Ｒ５は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基又はメチル基を示す。）（ただしアミノ基の場合は保護基をつける。）及び式（Ｂ）で表される化合物
【００３８】
【化１２】
【００３９】
（Ｒ６は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はメチル基を示す。）（ただしアミノ基の場合は保護基をつける。）とを、有機溶媒中、炭酸カリウム、銅粉および沃化銅存在下、加温下で反応させ、式（Ｃ）で表される化合物を得る。
【００４０】
【化１３】
【００４１】
（Ｒ５およびＲ６は、前記と同義である。）（ただしアミノ基の場合は保護基をつける。）
【００４２】
式（Ｃ）で表される化合物に、塩化チオニル、次いで塩化アルミニウムを反応させ、式（Ｄ）で表される化合物を得る。
【００４３】
【化１４】
【００４４】
（Ｒ５およびＲ６は前記と同義である。）
【００４５】
式（Ｄ）で表される化合物に、式（Ｅ）で表される化合物
【００４６】
【化１５】
【００４７】
（ａは１〜２０までのいずれかの整数を示し、Ｘは保護基を示す。）
【００４８】
を有機溶媒中で反応後、脱保護し、式（Ｆ）で表される化合物を得る。なお、Ｘで示される保護基として、テトラヒドロピランが好ましく挙げられる。
【００４９】
【化１６】
【００５０】
（Ｒ５、Ｒ６およびａは前記と同義である。）
【００５１】
式（Ｆ）で表される化合物に、式（Ｇ）で表される大過剰の公知の化合物
【００５２】
【化１７】
【００５３】
（ｂは１〜４までのいずれかの整数を示す。）
【００５４】
を炭酸カリウム存在下で反応させ、次いで酸クロリドを加水分解し、式（Ｈ）で表される化合物
【００５５】
【化１８】
【００５６】
（Ｒ５、Ｒ６、ａおよびｂは前記と同義である。）
【００５７】
を得る。
必要に応じて、式（Ｈ）で表される化合物の側鎖の部分に、常法に従って、高分子化合物を結合させる。
【００５８】
（３）本発明の抗体の製造方法
本発明の抗体は、抗原として本発明のハプテン抗原を用い、一般式（４）に示す化合物に反応性を示す抗体を得ること以外は、当業者によく知られた通常の方法を採用することができる。具体的には、本発明の抗体は、例えば、下記のようにして製造することができる。
【００５９】
ポリクローナル抗体を取得する場合は、前記のハプテン−キャリアタンパク質複合体を抗原として、例えば、マウスを常法にしたがって免疫する。使用するマウスの種類は特に限定されないが、一般にはＢＡＬＢ／ｃ系のマウスが用いられる。マウス１匹当たり抗原５０〜１００μｇの割合で、フロイントの完全アジュバント若しくは不完全アジュバントと共に腹腔内若しくは皮下に、又はアジュバントを加えずに静脈内若しくは直接脾臓に免疫する。初回免疫２〜３週間後に同一の方法により追加免疫を行う。
【００６０】
免疫成立の確認は、マウスから採血し、公知のＥＬＩＳＡ法により血中の抗体価を測定することにより実施することができる。
【００６１】
モノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の作製に用いられる方法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．： Ｎａｔｕｒｅ， ２５６ ： ４９５−４９７， １９７５）と同様に調製できる。具体的には、前記ポリクローナル抗体を取得する場合と同様の方法で、マウスを免疫する。使用するマウスの種類、抗原の量もポリクローナル抗体を取得する場合と同様である。
ポリクローナル抗体を取得する場合と同様に免疫成立の確認を実施することができる。なお、細胞融合の３日前に抗原を免疫動物に静脈注射することにより、抗体産生活性を有するハイブリドーマを得る確率を高くすることが可能である。
【００６２】
次に前記のようにして免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞とを融合させる。ミエローマ細胞としては、ＰＡＩミエローマ細胞（Ｓｔｏｃｋｅｒ， Ｊ． Ｗ．， Ｆｏｒｓｔｅｒ， Ｈ．Ｋ．， Ｍｉｇｇｉａｎｏ， Ｍ．， Ｓｔａｈｌｉ， Ｃ．， Ｓｔａｉｇｅｒ， Ｇ．， Ｔａｋａｃｓ， Ｂ．， ａｎｄ Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ， Ｔ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ２ ｎｅｗ ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ’ＰＡＩ’ ａｎｄ ’ＰＡＩ−０’ ｆｏｒｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｒｅｓ． Ｄｉｓｃｌｏｓ．， ２１７： １５５−１５７， １９８２．）を例示することができる。
【００６３】
細胞融合及びハイブリドーマの選択方法を、例示すれば下記のとおりである。脾細胞及びミエローマ細胞を、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（以下「ＨＡＴ培地」と記載する。例えば、シグマ社から購入可能。）中で培養する。ミエローマ細胞として、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼ遺伝子が変異した変異株を用い、融合処理後の細胞をこの培地で培養すると、融合しない細胞は死滅し、融合した細胞のみが増殖するので、融合細胞を選別することができる。次に、ＥＬＩＳＡ法により目的とするハプテン抗原に対する抗体を産生しているハイブリドーマの選択を下記のとおり行う。
【００６４】
固相ＥＬＩＳＡ法に使用するイムノプレートに、本発明のハプテン抗原をコーティングし、ハイブリドーマ培養上清を適当に希釈して添加し、未吸着物を洗浄除去し、アルカリフォスファターゼ又はパーオキシダーゼを結合させた２次抗体を添加する。未吸着の２次抗体を洗浄して除去し、発色基質としてパラニトロフェニルリン酸（カペル社製）、オルトフェニレンジアミン又は２，２−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸を、使用した酵素に応じて添加し、目的とする抗体を産生している細胞の培養上清を加えた穴を発色させる。このようにして目的とするハイブリドーマが得られ、公知の限界希釈法によりクローニングを行い、ハイブリドーマ・クローンを確立することができる。
【００６５】
本発明のモノクローナル抗体は、上記のようにして得られたハイブリドーマの培養上清から、公知のアフィニティクロマトグラフィー、硫安塩析などによって分離精製することができるが、同系のマウス腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を生成させることにより、１０００〜１００００倍程度に濃縮されたモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００６６】
本発明の抗体は、上記のようにして得ることができる。また、本発明のハプテン抗原の好ましい一形態であるコハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル複合体を免疫原として作製されたハイブリドーマＤｘ−αは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１ 中央第６）に、平成１４年４月１９日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８２７として寄託されているため、これを用いて本発明の抗体の好ましい一形態を得ることもできる。
【００６７】
（４）本発明の抗体
本発明の抗体は、一般式（４）
【００６８】
【化１９】
【００６９】
（ただし、一般式（４）中、Ｒ４は水素原子、ハロゲン原子、アミノ基又はニトロ基を示す。）で表される化合物のうちの一つ又は複数と反応性を示す抗体又はそのフラグメントである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
本発明の抗体のフラグメントとは、抗原に結合するのに十分な抗体の部分領域のことをいい、例えば、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２などが挙げられる。
本明細書においては、単に「抗体」というときは、「抗体又はそのフラグメント」のことを意味することがある。
【００７０】
本発明の抗体は、公知の免疫クロマト法などにより、抗体のアイソタイプを決定することができる。
【００７１】
既知のダイオキシン類の中で、２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンがその毒性が最強であり、最も問題視されている。本発明の新規ハプテン抗原の好ましい一形態であるコハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルタンパク質複合体のハプテン部分は、２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンのダイオキシン骨格における塩素の置換数、置換位置が、キサンテン骨格において同じであるダイオキシン類似体である。このハプテン抗原を免疫原として取得された本発明の抗体が、２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンの２位の塩素をアミノ基又はニトロ基に置換したダイオキシンを認識したことから、本抗体は２，３，７，８−テトラクロロダイオキシンを認識する可能性が高いと考えられる。
【００７２】
既知のダイオキシン類−タンパク質複合体抗原では、人体および環境に対する危険性の点で、４個以上の塩素で置換されたダイオキシン類の抗原を作製することは望ましくないと考えられるが、本発明の新規ハプテン抗原は、１，２，３，４，５，６，７，８の任意の位置に塩素を有していても毒性は報告されておらず、安全性に優れている。
【００７３】
（５）本発明の免疫化学的測定方法
本発明の免疫化学的測定方法は、本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて免疫化学的に測定することを特徴とする、ダイオキシン類の免疫化学的測定方法である。本発明の方法は、抗原及び抗体として本発明のハプテン抗原及び本発明の抗体を用いる以外は、当業者によく知られている通常の免疫学的測定方法を適用することができる。本発明の免疫化学的測定方法の具体的な形態は、本発明のハプテン抗原を固相に固定化し、測定するダイオキシン類と本発明の抗体を添加し、固定化されたハプテン抗原に対して結合した抗体を検出することによって、前記ダイオキシン類を免疫学的に検出又は定量する方法である。本発明の免疫化学的測定方法の他の形態は、本発明のモノクローナル抗体を固相に固定化し、測定するダイオキシン類と本発明のハプテン抗原を添加し、固定化された抗体に対して結合したハプテン抗原を検出することによって、または、測定するダイオキシン類と標識物質で標識化したダイオキシン類（標識化ダイオキシン類）を添加し、固定化された抗体に対して結合した標識化ダイオキシン類を検出することによって、前記ダイオキシン類を免疫学的に検出又は定量する方法である。
【００７４】
ハプテン抗原を固定化し、モノクローナル抗体との反応において、固定化ハプテン抗原とダイオキシン類とを競合させる間接競合法では、固定化されたハプテン抗原に結合したモノクローナル抗体を検出することによって、試料中のダイオキシン類を測定することができる。固定化されたハプテン抗原に結合したモノクローナル抗体の検出は、モノクローナル抗体として標識物質で標識化した標識化モノクローナル抗体を用い、この標識物質を検出することによって行うことができる。また、固相に非標識モノクローナル抗体を添加した後、さらに、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した２次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出することによっても、固定化されたハプテン抗原に結合したモノクローナル抗体を間接的に検出することができる。
【００７５】
２次抗体は、モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体であり、マウスモノクローナル抗体に対しては抗マウスイムノグロブリン抗体が用いられる。また、モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧであれば、２次抗体としては抗ＩｇＧ抗体が好ましいが、抗ＩｇＧ抗体を含んでいれば、他のクラスのイムノグロブリンに対する抗体を含んでいても差し支えない。
【００７６】
ハプテン抗原を固定化する固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロンなどのイムノプレートが挙げられる。これらの固相にハプテン抗原を含有する試料を含む緩衝液を入れるか、又はハプテン抗原を溶解した緩衝液に固相を浸漬することによって、ハプテン抗原を固相に固定化することができる。また、ドットブロット又はウェスタンブロットによっても、ニトロセルロースフィルターやナイロンメンブレンにハプテン抗原を固定化することができる。
【００７７】
モノクローナル抗体を標識する標識物質としては、酵素、ビオチン、ケイ光物質、発光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素の検出は、酵素反応により発色する色素を基質として用いることにより行うことができる。このような酵素及び基質については後述する。ビオチンの検出は、アビジンもしくはストレプトアビジンで標識した酵素をさらにビオチンに結合させることにより、又はアビジンもしくはストレプトアビジンを介してビオチニル化した酵素を結合させることにより、酵素の検出と同様にして行うことができる。
【００７８】
モノクローナル抗体を固定化し、モノクローナル抗体との反応において、ダイオキシン類と標識物質で標識化したダイオキシン類を競合させる直接競合法では、固定化されたモノクローナル抗体に結合した標識化ダイオキシン類を検出することによって、試料中のダイオキシン類を測定することができる。
モノクローナル抗体を固定化する固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロンなどのイムノプレートが挙げられる。これらの固相にモノクローナル抗体を含有する試料を含む緩衝液を入れるか、又はモノクローナル抗体を溶解した緩衝液に固相を浸漬することによって、モノクローナル抗体を固相に固定化することができる。また、ドットブロット又はウェスタンブロットによっても、ニトロセルロースフィルターやナイロンメンブレンにモノクローナル抗体を固定化することができる。
ダイオキシンを標識する標識物質としては、酵素、ビオチン、ケイ光物質、発光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素の検出は、酵素反応により発色する色素を基質として用いることにより行うことができる。このような酵素及び基質については後述する。ビオチンの検出は、アビジンもしくはストレプトアビジンで標識した酵素をさらにビオチンに結合させることにより、又はアビジンもしくはストレプトアビジンを介してビオチニル化した酵素を結合させることにより、酵素の検出と同様にして行うことができる。
【００７９】
また、モノクローナル抗体を固定化し、固定化したモノクローナル抗体との反応において、ハプテン抗原とダイオキシン類とを競合させる直接競合法では、固定化されたモノクローナル抗体に結合したハプテン抗原を検出し、試料中のダイオキシン類を測定することができる。固定化されたモノクローナル抗体に結合したハプテン抗原の検出は、ハプテン抗原として標識物質で標識化した標識化ハプテン抗原を用い、この標識物質を検出することによって行うことができる。
【００８０】
モノクローナル抗体を固定化する固相としては、間接競合法に用いたものと同様のものを用いることができる。
ハプテン抗原を標識する標識物質および酵素の検出などは、間接競合法に用いたものと同様のものを用いることができる。
【００８１】
本発明の方法の一形態である間接競合法によるダイオキシン類を測定する具体的な方法を例示する。
９６穴イムノプレートの穴に、リン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と記載する）などのバッファで希釈したハプテン抗原を入れ、４℃で１晩吸着させ、のちイムノプレートをＰＢＳを用いて洗浄する。
【００８２】
この後、モノクローナル抗体などの非特異的吸着を防止するために、ブロックエース（雪印乳業社製）などのブロック溶液を各穴に添加して３７℃で１時間又は４℃で１晩ブロッキングした。
【００８３】
次いで、０．０２％ツィーン２０ＰＢＳ（ＰＢＳに０．０２％の割合でツィーン２０を混合した液。以下、「ＴＰＢＳ」と記載する。）で洗浄後、予めダイオキシン類を測定する試料と３７℃で２時間反応させた前記本発明のモノクローナル抗体（一次抗体）を加え、３７℃で４５分間反応させ、プレートをＴＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体、又はペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体などの標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、３７℃で４５分間反応させる。前記と同様にプレートを洗浄し、発色基質を添加し、室温で１５分間反応させ、発色基質の極大吸収を示す波長の吸光度により酵素活性を測定する。
【００８４】
アルカリフォスファターゼを用いた場合には、発色基質としてパラニトロフェニルリン酸などを、ペルオキシダーゼを用いた場合には、発色基質としてオルトフェニレンジアミン又は２，２−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸などを例示することができる。
【００８５】
本発明のモノクローナル抗体の力価及び交差性は、ＥＬＩＳＡ法などにより、測定することができる。
【００８６】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨をこえない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
【００８７】
【実施例１】新規ハプテンの合成およびキャリアータンパク質との結合
以下のようにして、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルタンパク質複合体を合成した。
【００８８】
【化２０】
【００８９】
（ｉ）４，５−ジクロロ−２−（３，４−ジクロロフェノキシ）安息香酸（Ｉ）の合成
２，４，５−トリクロロ安息香酸（１．４８ｇ ６．５６ｍｍｏｌ）、３，４−ジクロロフェノール（１．０７ｇ ６．５６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２０ｇ）、銅粉（０．４ｇ）および沃化銅（０．４ｇ）を１００ｍｌのニトロベンゼンに懸濁し、アルゴン雰囲気下で１７５℃ ２．５時間加熱した。ニトロベンゼンの大部分を減圧留去した後、水を加えて共沸により完全に留去した。残留水溶液を塩酸で酸性にした後、析出した結晶を濾取、水洗後乾燥した。このものを酢酸エチル−ヘキサンから再結晶して標題の化合物を白色結晶として得た（得量：０．８５ｇ）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） ６．８７ｐｐｍ（ｄｄ １Ｈ） ７．０８ｐｐｍ（ｓ １Ｈ） ７．１１ｐｐｍ（ｄ １Ｈ） ７．４４ｐｐｍ（ｄ １Ｈ）８．１７ｐｐｍ（ｓ １Ｈ）
【００９０】
（ｉｉ）２，３，６，７−テトラクロロ−９−オキソキサンテン（ＩＩ）の合成
４，５−ジクロロ−２−（３，４−ジクロロフェノキシ）安息香酸（８００ｍｇ ２．２７ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの塩化チオニルに溶解し、３０分間還流した。減圧下で塩化チオニルを留去した後、残渣を塩化メチレンに溶解し、氷水浴上で塩化アルミニウム（５００ｍｇ ３．７５ｍｍｏｌ）を攪拌しながら徐々に加えた。塩化アルミニウム添加後更に１時間攪拌した。反応液を塩酸溶液にあけ、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を、塩酸溶液および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄後、濃縮乾固し、薄褐色固体を得た（約５００ｍｇ）。このものをクロロホルムに溶解後、ヘキサンを徐々に加え副産物である２，３，７，８−テトラクロロ−９−オキソキサンテンを結晶化させ濾別除去した。濾液を濃縮乾固した後、残渣をクロロホルム−メタノールから再結晶し標題の化合物を得た（得量：２００ｍｇ）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） ７．６６ｐｐｍ（ｓ ２Ｈ）， ８．３８ｐｐｍ（ｓ ２Ｈ）
【００９１】
（ｉｉｉ）６−テトラヒドロピラニルオキシヘキシルリチウム（ＩＩＩ）の合成
６−ブロモヘキサノール（４ｍｌ）と２，３−ジヒドロピラン（４ｍｌ）を混合し、室温で３０分間攪拌した。混合物をエバポレーターで濃縮し油状物を得た。油状物（２ｇ ８ｍｍｏｌ）をジエチルエーテルに溶解し、アルゴン雰囲気下、氷水浴上で金属リチウム（１１２ｍｇ １６ｍｍｏｌ）に攪拌しながら徐々に添加した。氷水浴上で２時間攪拌後、反応液の一部をとり、キノリンを指示薬として、２−プロパノールキシレン溶液で滴定し、６−テトラヒドロピラニルオシヘキシルリチウム濃度を算出した。
【００９２】
（ｉｖ）９−ヒドロキシ−９−（６−ヒドロキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテン（ＩＶ）の合成
２，３，６，７−テトラクロロ−９−オキソキサンテン（２００ｍｇ ０．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、アルゴン雰囲気下、氷−メタノール浴上で、攪拌しながら６−テトラヒドロピラニルオキシヘキシルリチウム ジエチルエーテル溶液を１．４当量加えた。氷−メタノール浴上で３０分間攪拌後、希塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、洗浄濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、９−ヒドロキシ−９−（６−テトラヒドロピラノキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテンを得た（１５０ｍｇ）。９−ヒドロキシ−９−（６−テトラヒドロピラノキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテンをメタノールに溶解し、パラトルエンスルホン酸一水和物を耳掻き１杯加え、室温で１．５時間攪拌した。希塩酸を加え酢酸エチルで抽出し、抽出液を洗浄濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、９−ヒドロキシ−９−（６−ヒドロキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテンを得た（得量：７０ｍｇ）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） ０．７４ｐｐｍ（ｍ ２Ｈ） １．１５ｐｐｍ（ｍ ４Ｈ）， １．２６ｐｐｍ（ｔ ２Ｈ）， １．３９ｐｐｍ（ｍ ２Ｈ）， ３．５４ｐｐｍ（ｔ ２Ｈ）， ７．２５ｐｐｍ（ｓ ２Ｈ）， ７．５６ｐｐｍ（ｓ ２Ｈ）
【００９３】
（ｖ）コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル（Ｖ）の合成
塩化メチレンに炭酸カリウム（２００ｍｇ）及び二塩化スクシニル（１ｍｌ）を加え、氷水浴上で攪拌しながら９−ヒドロキシ−９−（６−ヒドロキシヘキシル）−２，３，６，７−テトラクロロキサンテン（７０ｍｇ）塩化メチレン溶液を徐々に滴下した。氷水浴上で１５分間攪拌し、引続き室温で３０分間攪拌した。水およびテトラヒドロフランを加え、更に水酸化ナトリウム溶液を加え室温で１５分間攪拌した。塩酸にて酸性とし酢酸エチルで抽出し、乾燥後濃縮乾固した。残渣を薄層クロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）にて精製して標記の化合物を白色結晶として得た（得量：３０ｍｇ）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） １−２ｐｐｍ（ｍ ６Ｈ）， ２．４９ｐｐｍ（ｑ ２Ｈ）， ４．０１ｐｐｍ（ｍ ４Ｈ）， ４．１２ｐｐｍ（ｔ ２Ｈ）， ５．９２ｐｐｍ（ｔ １Ｈ）， ７．２０ｐｐｍ（ｓ １Ｈ）， ７．２５ｐｐｍ（ｓ １Ｈ）， ７．５５ｐｐｍ（ｓ １Ｈ）， ７．５６ｐｐｍ（ｓ １Ｈ）
【００９４】
（ｖｉ）コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルタンパク質複合体（ＶＩ）の合成
コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル（１０ｍｇ ０．０２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶解し、トリブチルアミン（１０μｌ）およびクロロぎ酸イソブチル（４μｌ）を加え室温で２０分間攪拌し、Ａ液を調製した。
ウシ血清アルブミン（７０ｍｇ）を水３ｍｌに溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．０に調整し、水を加えて６ｍｌとし、更にジメチルホルムアミド６ｍｌを加え、Ｂ液を調製した。
Ｂ液を氷水浴上で攪拌し、ｐＨが８．０〜９．０となる様０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で調整しながら、Ａ液を徐々に滴下した。滴下後、更に３時間氷水浴上で攪拌した。Ａ＋Ｂ混合液を、水に一晩透析後、凍結乾燥を行い白色粉末（７０ｍｇ）を得た。常法に従い、ウシ血清アルブミンのアミノ基を定量したところ、ウシ血清アルブミン１分子当たり、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルが２５．３分子結合していた。
ウシガンマグロブリンについても同様に実施した。ウシガンマグロブリン１分子当たり、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシルが５．４分子結合していた。
【００９５】
【実施例２】新規ハプテン−キャリアータンパク質複合体を抗原としたモノクローナル抗体の作製
新規ハプテン−ウシ血清アルブミン複合体を免疫抗原として、常法に従いハイブリドーマ細胞を作製し、モノクローナル抗体を得た。
具体的には、コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル−ウシ血清アルブミン複合体抗原１００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合して６週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス５匹の腹腔内に投与した。さらに３週後に同量の抗原を等量のフロイント不完全アジュバントと混合して同様に腹腔内に投与、１週後に後眼窩静脈より採血して血清を分離し、抗体価の上昇をコハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル−ウシガンマグロブリン複合体抗原を用いたＥＬＩＳＡ法にて確認した。抗体価の上昇したマウスに対して１００μｇの抗原を尾静脈内投与し、３日後に脾臓を摘出した。単離した脾臓細胞とＰＡＩミエローマ細胞をＰＥＧ法にて５：１で細胞融合し、ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ選択にて得た。さらに抗体産生陽性細胞をＥＬＩＳＡ法にて選択した。増殖の後、サブクローニングを行い腹腔内投与して腹水を採取した。腹水から硫安塩析およびプロテインＧアフィニティカラムにて抗体の精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認すると共に抗体のアイソタイプを免疫クロマト法で決定した。
結果として、ＩｇＧ１クラスの抗体Ｄｘ−αおよび５Ｂ−１が得られた。
【００９６】
【実施例３】抗体の力価および既知ダイオキシンハプテン抗原との反応性１）力価
モノクローナル抗体力価の測定
コハク酸モノ６−（２，３，６，７−テトラクロロキサンテン−９−イリデン）ヘキシル−ウシガンマグロブリン複合体を１０μｇ／ｍｌとなるようＰＢＳに溶解した液を、９６穴イムノプレートに１穴当たり１００μｌずつ分注し、冷蔵庫中で一晩インキュベートした。１穴当たり約３００μｌのＰＢＳで３回洗浄後、２５％ブロックエースを１穴当たり２５０μｌ分注し、３７℃で１時間又は冷蔵庫で一晩インキュベートした（抗原固定プレート）。直ぐに使用しない場合は、冷蔵庫中で保管した。
抗原固定プレートを０．０２％ツイーン２０ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３回洗浄後、ＴＰＢＳで種々の濃度に希釈したモノクローナル抗体を５０μｌずつ分注し、３７℃で４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注し、３７℃４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色基質であるパラニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌずつ分注し、室温で１５分間反応させ、波長４０５ｎｍでの吸光度をプレートリーダーにて測定した。
結果を図１に示す。２種類のモノクローナル抗体（Ｄｘ−α，５Ｂ−１）は、共に発色下限濃度は約１５ｎｇ／ｍｌで、５０％発色濃度は約１２０ｎｇ／ｍｌであった。
【００９７】
２）既知ダイオキシンハプテン抗原との反応性
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｇｙ ８２巻２５６−２６３頁（１９８６年）に従い合成した２−アジパミド−３，７，８−トリクロロジベンゾパラダイオキシン−ウシガンマグロブリン複合体を検出用抗原としてモノクローナル抗体力価の測定方法と同様の方法で実施した。
結果を図２に示す。Ｄｘ−ａモノクローナル抗体が既知ダイオキシンハプテンと交差反応を示した。発色下限濃度は約０．５μｇ／ｍｌで、５０％発色濃度は約６０μｇ／ｍｌであった。
【００９８】
【実施例４】間接競合法によるダイオキシン類との交差性の確認
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｇｙ ８２巻２５６−２６３頁（１９８６年）に従い合成した２−アミノ−３，７，８−トリクロロジベンゾパラダイオキシン（Ｄｘ−ＮＨ２）及び２−ニトロ−３，７，８−トリクロロジベンゾパラダイオキシン（Ｄｘ−ＮＯ２）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＰＢＳにて２００倍希釈した液を原液とし、０．５％ＤＭＳＯ ＰＢＳにて種々の濃度に希釈した。ダイオキシン希釈液とモノクローナル抗体（Ｄｘ−α）０．２５μｇ／ｍｌ溶液を等量混合し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００９９】
前記モノクローナル抗体力価の測定の項で作製した抗原固定プレートをＴＰＢＳで３回洗浄後、ダイオキシン−モノクローナル抗体混合液を１００μｌずつ分注し、３７℃で４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注し、３７℃で４５分インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼの発色基質であるパラニトロフェニルリン酸溶液を１００μｌずつ分注し、室温で１５分間反応させ、波長４０５ｎｍでの吸光度をプレートリーダーにて測定した。
結果を図３に示す。モノクローナル抗体Ｄｘ−αは、Ｄｘ−ＮＨ２及びＤｘ−ＮＯ２と交差反応性を示した。５０％競合濃度は、Ｄｘ−ＮＨ２で約４μｇ／ｍｌ、Ｄｘ−ＮＯ２で約１２μｇ／ｍｌであった。
【０１００】
【発明の効果】
本発明により、安全性に優れ、かつ、種々の塩素化ダイオキシン類について識別性の優れた抗体を取得するためのダイオキシン類のハプテン抗原が提供される。
【０１０１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、モノクローナル抗体の力価を示す図である。
【図２】図２は、モノクローナル抗体の既知ダイオキシンハプテンとの交差反応性を示す図である。
【図３】図３は、モノクローナル抗体のダイオキシン誘導体との競合反応性を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to novel hapten antigens. Specifically, the present invention relates to a novel hapten antigen for obtaining an antibody against dibenzoparadioxin (hereinafter abbreviated as dioxin). The present invention also relates to an antibody against dioxins obtained as an antibody against the hapten antigen, a hybridoma producing the antibody, and a method for immunochemical measurement of dioxins using the antibody.
[0002]
[Prior art]
In recent years, environmental pollution by dioxins, which are toxic chemicals that have a very significant effect on living organisms, has become a problem, and it is urgently necessary to measure dioxins in the environment or living organisms and investigate the pollution situation. Is coming. Therefore, development of a method for measuring dioxins in the environment or in a living body has been promoted.
[0003]
One of the methods for measuring dioxins is an immunochemical measurement method. In the immunochemical measurement method, the concentration of dioxins in a sample is measured using dioxin antibodies. However, since dioxins are small molecules and are haptens (which have no immunogenicity) that do not produce antibodies as they are, in order to prepare dioxin antibodies, haptens are converted to a carrier protein [bovine serum albumin (BSA), Such as bovine gamma globulin (BGG)].
[0004]
As such a method, Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-14691 discloses a monoclonal antibody using a hapten antigen obtained by binding 1-amino-3,7,8-trichlorodibenzo-p-dioxin to a carrier protein. And a method for detecting dioxins using the monoclonal antibody.
[0005]
JP-A-63-744494 discloses a method for obtaining an antibody using an immune complex of chlorinated dibenzo-p-dioxin and a carrier, and a method for analyzing dioxins using the monoclonal antibody. ing.
[0006]
JP-A-2002-119279 discloses a method for obtaining an antibody using an antigen obtained by binding a chlorinated dibenzo-p-dioxin and a carrier, and a method for analyzing dioxins using the monoclonal antibody. ing.
[0007]
These methods include the conventional hapten-carrier protein complex immunogens used to obtain antibodies against dioxins, which are used in conventional methods for immunochemical measurement of dioxins. A side chain is introduced, and a carrier protein is bound to the end.
[0008]
By the way, dioxins that pose a problem in the environment are polychlorinated dioxins, and there are many analogs having different chlorinated positions and numbers. Since the known dioxin hapten antigen has a side chain introduced at the position of the dioxin skeleton to which chlorine is attached, an antibody produced from such a hapten-carrier complex immunogen has an ability to discriminate various chlorinated dioxins. It seems that there is a problem.
[0009]
In addition, it is considered undesirable to prepare a dioxin antigen in which the dioxin skeleton is substituted with four or more chlorine atoms in terms of danger to the human body and the environment.
[0010]
Therefore, there has been a demand for the development of dioxin hapten antigens which are excellent in safety and obtain antibodies having excellent discrimination with respect to various chlorinated dioxins.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a dioxin hapten antigen which is excellent in safety and aims to obtain antibodies having excellent discrimination with respect to various chlorinated dioxins. And
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, using a hapten antigen having a xanthene skeleton which is a dioxin analogous structure instead of a dioxin skeleton in the hapten portion, an antibody against chlorinated dioxins And succeeded in completing the invention.
[0013]
The present invention has been made as described above, and the gist of the present invention is as follows.
(1) The following general formula (1)
[0014]
Embedded image
(However, in the general formula (1), n represents any integer from 1 to 20, R1 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group, a nitro group or a methyl group, R2 represents a hydroxyl group, A carboxylacyloxy group, a carboxyl group, an amino group or a thiol group).
(2) The compound according to (1), wherein, in the general formula (1), R1 is a hydrogen atom or a halogen atom, and R2 is a hydroxyl group or a carboxylacyloxy group.
(3) The compound according to (1) or (2), wherein R1 is a hydrogen atom or a chlorine atom in the general formula (1).
(4) The following general formula (2)
[0016]
Embedded image
(However, in the general formula (2), n represents any integer from 1 to 20, R3 represents a halogen atom, and R2 represents a hydroxyl group or a carboxylacyloxy group.)
(5) The compound according to (4), wherein R3 is a chlorine atom in the general formula (2).
(6) A compound having the structure of the following formula (3).
[0018]
Embedded image
(7) A complex of the compound according to any one of (1) to (6) and a polymer compound.
(8) The complex according to (7), wherein the polymer compound is a protein.
(9) The complex according to (7) or (8), wherein the polymer compound is bovine serum albumin or bovine gamma globulin.
(10) A general formula (4), wherein the complex according to any one of (7) to (9) is used as an antigen.
[0020]
Embedded image
(However, in the general formula (4), R4 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group or a nitro group.) A method for producing an antibody or a fragment thereof, which is reactive with a compound represented by the formula:
(11) An antibody or a fragment thereof that is reactive with the compound represented by the general formula (4).
(12) The antibody or fragment thereof according to (11), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(13) A hybridoma that produces the antibody according to (12).
(14) The hybridoma according to (13), which has been deposited under accession number FERM P-18827.
(15) A method for immunochemically measuring a compound represented by the general formula (4), comprising using the antibody or the fragment thereof according to (11) or (12).
(16) The immunochemical measurement method according to (15), further comprising using the complex according to any one of (7) to (9).
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Hapten antigen of the present invention
The hapten antigen of the present invention is a compound in which the hapten moiety has a xanthene skeleton, which is a dioxin-like structure, instead of a dioxin skeleton, and is a compound serving as an immunogen for obtaining an antibody against chlorinated dioxins. The hapten portion of the hapten antigen of the present invention is a compound having a xanthene skeleton, and is characterized in that a side chain is introduced at the position of the carbon at the 9-position of the xanthene skeleton, which corresponds to the unchlorinated oxygen atom position of the dioxin skeleton. It can be an immunogen for obtaining antibodies excellent in discrimination of various chlorinated dioxins.
[0023]
The hapten of the present invention has the following general formula (1)
[0024]
Embedded image
(However, in the general formula (1), n represents any integer from 1 to 20, R1 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group, a nitro group or a methyl group, R2 represents a hydroxyl group, A carboxylacyloxy group, a carboxyl group, an amino group or a thiol group).
[0026]
n is preferably any integer from 2 to 10, more preferably from 4 to 8.
R1 is independent of each other, and the position and type of the substituent are not particularly limited. Preferred examples of R1 include a hydrogen atom, a chlorine atom, a bromine atom, an amino group, a nitro group, and a methyl group.
Among R2, the carbon number of the carboxylacyloxy group is preferably any integer from 3 to 6. Specific examples of R2 are preferably a hydroxyl group, a carboxyl propionyloxy group, a carboxyl valyloxy group, a carboxyl group, an amino group or a thiol group.
[0027]
The hapten of the present invention is preferably a compound of the formula (1), wherein R1 is a hydrogen atom or a halogen atom, and R2 is a hydroxyl group or a carboxylacyloxy group. The hapten of the present invention is preferably a compound of the formula (1) wherein R1 is a hydrogen atom or a chlorine atom.
[0028]
The hapten of the present invention preferably has the following general formula (2)
[0029]
Embedded image
(However, in the general formula (2), n represents any integer from 1 to 20, R3 represents a halogen atom, and R2 represents a hydroxyl group or a carboxylacyloxy group.)
n is preferably any integer from 2 to 10, more preferably from 4 to 8.
Preferred examples of R3 include a chlorine atom and a bromine atom.
Among R2, the carbon number of the carboxylacyloxy group is preferably any integer from 3 to 6. Specific examples of R2 are preferably a hydroxyl group, a carboxylpropionyloxy group, a carboxylvaleyloxy group and the like.
The hapten of the present invention is preferably a compound of the formula (2) wherein R3 is a chlorine atom.
[0031]
Specific examples of the hapten of the present invention include mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl succinate and mono 8- (2,3,6,7-tetrachloro adipate). Xanthene-9-ylidene) octyl and the like can be preferably exemplified.
[0032]
The hapten of the present invention can be prepared according to a conventional method ([Development of Pharmaceuticals, Vol. By binding to a molecular compound, it can be used as an immunogen for obtaining antibodies against chlorinated dioxins. A preferred example of the polymer compound is a protein. Such a protein for preparing an immunogen by binding to a hapten is referred to as a carrier protein. Preferred examples of the carrier protein include bovine serum albumin and bovine gamma globulin.
[0033]
The hapten antigen of the present invention is a novel hapten antigen using a compound that does not have a dioxin skeleton in the hapten portion, despite being an immunogen of an antibody against dioxins.
[0034]
(2) Method for producing hapten antigen of the present invention
The hapten portion of the hapten antigen of the present invention has a xanthene skeleton, and a side chain is introduced at the 9-position carbon position of the xanthene skeleton, which corresponds to the unchlorinated oxygen atom position in the dioxin skeleton of the dioxins. It is characterized by the following.
[0035]
The hapten of the present invention can be obtained, for example, by the following method. Compound represented by formula (A)
[0036]
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(R5 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group, a nitro group or a methyl group.) (However, in the case of an amino group, a protecting group is provided.)
[0038]
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(R6 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group or a methyl group.) (However, in the case of an amino group, a protecting group is provided.) And potassium carbonate, copper powder and iodide in an organic solvent. The reaction is performed under heating in the presence of copper to obtain a compound represented by the formula (C).
[0040]
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(R5 and R6 are as defined above.) (However, in the case of an amino group, a protecting group is provided.)
[0042]
The compound represented by the formula (C) is reacted with thionyl chloride and then with aluminum chloride to obtain a compound represented by the formula (D).
[0043]
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(R5 and R6 are as defined above.)
[0045]
A compound represented by the formula (E) is added to a compound represented by the formula (D)
[0046]
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(A represents any integer from 1 to 20, and X represents a protecting group.)
[0048]
Is reacted in an organic solvent and then deprotected to obtain a compound represented by the formula (F). In addition, as a protective group represented by X, tetrahydropyran is preferably exemplified.
[0049]
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(R5, R6 and a are as defined above.)
[0051]
A large excess of the known compound represented by the formula (G) to the compound represented by the formula (F)
[0052]
Embedded image
(B represents any integer from 1 to 4.)
[0054]
Is reacted in the presence of potassium carbonate, and then the acid chloride is hydrolyzed to give the compound represented by the formula (H)
[0055]
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(R5, R6, a and b are as defined above.)
[0057]
Get.
If necessary, a polymer compound is bonded to the side chain of the compound represented by the formula (H) according to a conventional method.
[0058]
(3) Method for producing the antibody of the present invention
The antibody of the present invention employs a usual method well known to those skilled in the art, except that the hapten antigen of the present invention is used as the antigen and an antibody that is reactive with the compound represented by the general formula (4) is obtained. Can be. Specifically, the antibody of the present invention can be produced, for example, as follows.
[0059]
In the case of obtaining a polyclonal antibody, for example, a mouse is immunized according to a conventional method using the hapten-carrier protein complex as an antigen. The type of mouse to be used is not particularly limited, but a BALB / c mouse is generally used. The mice are immunized intraperitoneally or subcutaneously with complete or incomplete Freund's adjuvant, or intravenously or directly into the spleen without adjuvant at a rate of 50-100 μg of antigen per mouse. A booster immunization is performed by the same method 2 to 3 weeks after the initial immunization.
[0060]
Confirmation of immunization can be performed by collecting blood from the mouse and measuring the antibody titer in the blood by a known ELISA method.
[0061]
Monoclonal antibodies can be prepared in the same manner as in the method used for preparing ordinary monoclonal antibodies (Kohler, G. & Milstein, C .: Nature, 256: 495-497, 1975). Specifically, a mouse is immunized in the same manner as in the case of obtaining the polyclonal antibody. The type of mouse to be used and the amount of antigen are the same as in the case of obtaining a polyclonal antibody.
Confirmation of immunization can be performed in the same manner as in the case of obtaining a polyclonal antibody. By intravenously injecting the antigen into the immunized animal three days before the cell fusion, it is possible to increase the probability of obtaining a hybridoma having an antibody-producing activity.
[0062]
Next, the spleen cells and the myeloma cells of the mouse immunized as described above are fused. As myeloma cells, PAI myeloma cells (Stocker, JW, Forster, HK, Miggiano, M., Stahli, C., Stager, G., Takacs, B., and Stahehelin, Germany) 2 new mouse myeloma cell lines 'PAI' and 'PAI-0' forhybridoma production. Res. Disclos., 217: 155-157, 1982.).
[0063]
Examples of cell fusion and hybridoma selection methods are as follows. The spleen cells and myeloma cells are cultured in a hypoxanthine / aminopterin / thymidine medium (hereinafter referred to as “HAT medium”, which can be purchased from Sigma, for example). As a myeloma cell, a mutant strain in which the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene or the thymidine kinase gene is mutated is used.When the cells after the fusion treatment are cultured in this medium, non-fused cells die and only the fused cells proliferate. Therefore, the fused cells can be selected. Next, a hybridoma producing an antibody against the target hapten antigen is selected by ELISA as follows.
[0064]
The hapten antigen of the present invention was coated on the immunoplate used for the solid-phase ELISA method, the hybridoma culture supernatant was appropriately diluted and added, unadsorbed substances were washed off, and alkaline phosphatase or peroxidase was bound. Add secondary antibody. The unadsorbed secondary antibody is removed by washing, and paranitrophenyl phosphate (manufactured by Capel), orthophenylenediamine or 2,2-azino-di-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid is used as a coloring substrate. Is added depending on the enzyme used, and the wells to which the culture supernatant of the cells producing the target antibody is added are colored. Thus, the desired hybridoma is obtained, and cloning is performed by a known limiting dilution method to establish a hybridoma clone.
[0065]
The monoclonal antibody of the present invention can be separated and purified from the culture supernatant of the hybridoma obtained as described above by known affinity chromatography, salting out with ammonium sulfate and the like. By generating ascites, it is also possible to obtain a monoclonal antibody concentrated about 1000 to 10000 times.
[0066]
The antibody of the present invention can be obtained as described above. In addition, a hybridoma Dx-α produced using a mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl succinate complex, which is a preferred form of the hapten antigen of the present invention, as an immunogen is At the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Central No. 6, Higashi 1-1-chome, Tsukuba, Ibaraki Prefecture 305-8566, Japan) on April 19, 2002, under the deposit number FERM P-18827. , And can be used to obtain a preferred form of the antibody of the present invention.
[0067]
(4) Antibody of the present invention
The antibody of the present invention has the general formula (4)
[0068]
Embedded image
(However, in the general formula (4), R4 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an amino group or a nitro group.) An antibody or a fragment thereof which is reactive with one or more of the compounds represented by . The antibodies of the present invention are preferably monoclonal antibodies.
The fragment of the antibody of the present invention refers to a partial region of the antibody sufficient to bind to the antigen. For example, Fab, F (ab '), F (ab') 2 And the like.
In the present specification, the term “antibody” may sometimes mean “antibody or fragment thereof”.
[0070]
The antibody of the present invention can determine the isotype of the antibody by a known immunochromatography method or the like.
[0071]
Among known dioxins, 2,3,7,8-tetrachlorodioxin has the strongest toxicity and is regarded as the most problematic. The hapten portion of the mono-6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl protein succinate complex, which is a preferred form of the novel hapten antigen of the present invention, is 2,3,7,8 -A dioxin analog in which the number and position of substitution of chlorine in the dioxin skeleton of tetrachlorodioxin are the same in the xanthene skeleton. Since the antibody of the present invention obtained using this hapten antigen as an immunogen recognized dioxin in which the chlorine at position 2 of 2,3,7,8-tetrachlorodioxin was substituted with an amino group or a nitro group, this antibody was used. Is likely to recognize 2,3,7,8-tetrachlorodioxin.
[0072]
With known dioxin-protein complex antigens, it is considered undesirable to prepare dioxin-substituted antigens substituted with four or more chlorine atoms in terms of danger to the human body and the environment. The hapten antigen is excellent in safety without any toxicity even though it has chlorine at any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 positions.
[0073]
(5) Immunochemical measurement method of the present invention
The immunochemical assay method of the present invention is an immunochemical assay method for dioxins, characterized in that the immunochemical assay is performed using the antibody or a fragment thereof of the present invention. In the method of the present invention, a general immunological measurement method well known to those skilled in the art can be applied, except that the hapten antigen of the present invention and the antibody of the present invention are used as the antigen and the antibody. A specific embodiment of the immunochemical assay method of the present invention is such that the hapten antigen of the present invention is immobilized on a solid phase, and the dioxins to be measured and the antibody of the present invention are added to the immobilized hapten antigen. This is a method for immunologically detecting or quantifying the dioxins by detecting the antibody that has been used. In another embodiment of the immunochemical assay method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a solid phase, the dioxins to be measured and the hapten antigen of the present invention are added, and the antibody is bound to the immobilized antibody. By detecting the hapten antigen, or adding dioxins to be measured and dioxins labeled with a labeling substance (labeled dioxins), and detecting labeled dioxins bound to the immobilized antibody This is a method for immunologically detecting or quantifying the dioxins.
[0074]
In the indirect competition method in which the hapten antigen is immobilized and the immobilized hapten antigen and dioxins compete in the reaction with the monoclonal antibody, the dioxin in the sample is detected by detecting the monoclonal antibody bound to the immobilized hapten antigen. Kind can be measured. Detection of the monoclonal antibody bound to the immobilized hapten antigen can be performed by using a labeled monoclonal antibody labeled with a labeling substance as the monoclonal antibody and detecting the labeling substance. Further, after adding an unlabeled monoclonal antibody to the solid phase, a secondary antibody obtained by labeling an antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used for preparing the monoclonal antibody with a labeling substance is further added to the solid phase. By detecting the labeling substance, the monoclonal antibody bound to the immobilized hapten antigen can also be detected indirectly.
[0075]
The secondary antibody is an antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used for preparing the monoclonal antibody, and an anti-mouse immunoglobulin antibody is used for the mouse monoclonal antibody. When the class of the monoclonal antibody is IgG, an anti-IgG antibody is preferable as the secondary antibody. However, as long as the monoclonal antibody contains an anti-IgG antibody, it may contain an antibody against another class of immunoglobulin.
[0076]
Examples of the solid phase on which the hapten antigen is immobilized include agarose beads, latex particles, and immunoplates such as polystyrene and nylon. The hapten antigen can be immobilized on the solid phase by adding a buffer containing a sample containing a hapten antigen to the solid phase, or by immersing the solid phase in a buffer in which the hapten antigen is dissolved. The hapten antigen can also be immobilized on a nitrocellulose filter or a nylon membrane by dot blot or western blot.
[0077]
Labeling substances for labeling monoclonal antibodies include enzymes, biotin, fluorescent substances, luminescent substances, radioisotopes, and the like. The enzyme can be detected by using a dye that develops a color by an enzyme reaction as a substrate. Such enzymes and substrates will be described later. The detection of biotin can be performed in the same manner as the detection of an enzyme by further binding an enzyme labeled with avidin or streptavidin to biotin, or by binding a biotinylated enzyme via avidin or streptavidin. it can.
[0078]
In a direct competition method in which a monoclonal antibody is immobilized and dioxins and a dioxin labeled with a labeling substance are competed in the reaction with the monoclonal antibody, a labeled dioxin bound to the immobilized monoclonal antibody is detected. And dioxins in a sample can be measured.
Examples of the solid phase on which the monoclonal antibody is immobilized include agarose beads, latex particles, and immunoplates such as polystyrene and nylon. The monoclonal antibody can be immobilized on the solid phase by adding a buffer containing a sample containing the monoclonal antibody to the solid phase, or by immersing the solid phase in a buffer in which the monoclonal antibody is dissolved. Alternatively, the monoclonal antibody can be immobilized on a nitrocellulose filter or a nylon membrane by dot blot or western blot.
Labeling substances for labeling dioxin include enzymes, biotin, fluorescent substances, luminescent substances, radioisotopes, and the like. The enzyme can be detected by using a dye that develops a color by an enzyme reaction as a substrate. Such enzymes and substrates will be described later. The detection of biotin can be performed in the same manner as the detection of an enzyme by further binding an enzyme labeled with avidin or streptavidin to biotin, or by binding a biotinylated enzyme via avidin or streptavidin. it can.
[0079]
Further, in the direct competition method in which the monoclonal antibody is immobilized and the hapten antigen and dioxins are competed in the reaction with the immobilized monoclonal antibody, the hapten antigen bound to the immobilized monoclonal antibody is detected, and the hapten antigen in the sample is detected. Dioxins can be measured. The detection of the hapten antigen bound to the immobilized monoclonal antibody can be performed by using a labeled hapten antigen labeled with a labeling substance as the hapten antigen and detecting the labeling substance.
[0080]
As the solid phase on which the monoclonal antibody is immobilized, the same solid phase as that used in the indirect competition method can be used.
For the detection of a labeling substance and an enzyme for labeling a hapten antigen, the same substances as those used in the indirect competition method can be used.
[0081]
A specific method for measuring dioxins by the indirect competition method, which is one mode of the method of the present invention, will be described.
A hapten antigen diluted with a buffer such as phosphate buffered saline (hereinafter, referred to as “PBS”) is placed in the wells of a 96-well immunoplate, allowed to adsorb at 4 ° C. overnight, and then the immunoplate is washed with PBS. Wash.
[0082]
Thereafter, in order to prevent nonspecific adsorption of the monoclonal antibody and the like, a blocking solution such as Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products) was added to each well, and blocking was performed at 37 ° C. for 1 hour or at 4 ° C. overnight.
[0083]
Next, after washing with 0.02% Tween 20 PBS (a solution obtained by mixing Tween 20 in PBS at a ratio of 0.02%; hereinafter, referred to as “TPBS”), a sample in which dioxins are measured in advance and at 37 ° C. The monoclonal antibody (primary antibody) of the present invention reacted for 2 hours was added, reacted at 37 ° C. for 45 minutes, the plate was washed with TPBS, and alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody or peroxidase-labeled anti-mouse antibody was used as a secondary antibody. A labeled anti-mouse IgG antibody such as a mouse immunoglobulin (IgG) antibody is added and reacted at 37 ° C. for 45 minutes. The plate is washed in the same manner as described above, a chromogenic substrate is added, and the mixture is reacted at room temperature for 15 minutes, and the enzyme activity is measured by the absorbance at a wavelength showing the maximum absorption of the chromogenic substrate.
[0084]
When alkaline phosphatase is used, paranitrophenyl phosphate or the like is used as a chromogenic substrate. When peroxidase is used, orthophenylenediamine or 2,2-azino-di-3-ethylbenzthiazoline-6 is used as a chromogenic substrate. -Sulfonic acid and the like.
[0085]
The titer and cross-reactivity of the monoclonal antibody of the present invention can be measured by an ELISA method or the like.
[0086]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. However, the present invention is not limited to these Examples unless it exceeds the gist.
[0087]
Example 1 Synthesis of New Hapten and Binding to Carrier Protein
A mono-6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl protein succinate protein complex was synthesized as follows.
[0088]
Embedded image
[0089]
(I) Synthesis of 4,5-dichloro-2- (3,4-dichlorophenoxy) benzoic acid (I)
2,4,5-trichlorobenzoic acid (1.48 g 6.56 mmol), 3,4-dichlorophenol (1.07 g 6.56 mmol), potassium carbonate (20 g), copper powder (0.4 g) and copper iodide (0.4 g) was suspended in 100 ml of nitrobenzene and heated at 175 ° C. for 2.5 hours under an argon atmosphere. After most of the nitrobenzene was distilled off under reduced pressure, water was added, and the mixture was completely distilled off azeotropically. After the remaining aqueous solution was acidified with hydrochloric acid, the precipitated crystals were collected by filtration, washed with water and dried. This was recrystallized from ethyl acetate-hexane to give the title compound as white crystals (yield: 0.85 g).
1 H NMR (CDCl 3 ) 6.87 ppm (dd 1H) 7.08 ppm (s 1H) 7.11 ppm (d 1H) 7.44 ppm (d 1H) 8.17 ppm (s 1H)
[0090]
(Ii) Synthesis of 2,3,6,7-tetrachloro-9-oxoxanthene (II)
4,5-Dichloro-2- (3,4-dichlorophenoxy) benzoic acid (800 mg 2.27 mmol) was dissolved in 20 ml of thionyl chloride and refluxed for 30 minutes. After the thionyl chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in methylene chloride, and aluminum chloride (500 mg 3.75 mmol) was gradually added with stirring on an ice water bath. After the addition of aluminum chloride, the mixture was further stirred for 1 hour. The reaction solution was poured into a hydrochloric acid solution and extracted with chloroform. The chloroform layer was washed with a hydrochloric acid solution and a sodium hydrogen carbonate solution and then concentrated to dryness to obtain a light brown solid (about 500 mg). After dissolving this in chloroform, hexane was gradually added to crystallize 2,3,7,8-tetrachloro-9-oxoxanthene as a by-product, and the crystal was removed by filtration. After the filtrate was concentrated to dryness, the residue was recrystallized from chloroform-methanol to obtain the title compound (yield: 200 mg).
1 H NMR (CDCl 3 ) 7.66 ppm (s 2H), 8.38 ppm (s 2H)
[0091]
(Iii) Synthesis of 6-tetrahydropyranyloxyhexyllithium (III)
6-Bromohexanol (4 ml) and 2,3-dihydropyran (4 ml) were mixed and stirred at room temperature for 30 minutes. The mixture was concentrated by an evaporator to obtain an oil. The oil (2 g, 8 mmol) was dissolved in diethyl ether and slowly added to lithium metal (112 mg, 16 mmol) with stirring on an ice-water bath under an argon atmosphere. After stirring for 2 hours on an ice water bath, a part of the reaction solution was taken, and titrated with a 2-propanol xylene solution using quinoline as an indicator to calculate the 6-tetrahydropyranyl oxyhexyl lithium concentration.
[0092]
(Iv) Synthesis of 9-hydroxy-9- (6-hydroxyhexyl) -2,3,6,7-tetrachloroxanthene (IV)
2,3,6,7-Tetrachloro-9-oxoxanthene (200 mg, 0.6 mmol) was dissolved in tetrahydrofuran, and 6-tetrahydropyranyloxyhexyllithium diethyldiethyl was stirred on an ice-methanol bath under an argon atmosphere. 1.4 equivalents of an ether solution were added. After stirring on an ice-methanol bath for 30 minutes, diluted hydrochloric acid was added, extracted with ethyl acetate, washed and concentrated, and purified by silica gel column chromatography to obtain 9-hydroxy-9- (6-tetrahydropyranoxyhexyl) -2. , 3,6,7-Tetrachloroxanthene was obtained (150 mg). 9-Hydroxy-9- (6-tetrahydropyranoxyhexyl) -2,3,6,7-tetrachloroxanthene is dissolved in methanol, one cup of paratoluenesulfonic acid monohydrate is added by earpick, and the mixture is added at room temperature. Stirred for .5 hours. Dilute hydrochloric acid was added and the mixture was extracted with ethyl acetate. The extract was washed and concentrated, and then purified by silica gel column chromatography to obtain 9-hydroxy-9- (6-hydroxyhexyl) -2,3,6,7-tetrachloroxanthene. (Yield: 70 mg).
1 H NMR (CDCl 3 ) 0.74 ppm (m2H) 1.15 ppm (m4H), 1.26 ppm (t2H), 1.39 ppm (m2H), 3.54 ppm (t2H), 7.25 ppm (s2H), 7. 56 ppm (s2H)
[0093]
(V) Synthesis of mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl (V) succinate
Potassium carbonate (200 mg) and succinyl dichloride (1 ml) were added to methylene chloride, and 9-hydroxy-9- (6-hydroxyhexyl) -2,3,6,7-tetrachloroxanthene was added with stirring on an ice-water bath. 70 mg) A methylene chloride solution was gradually added dropwise. The mixture was stirred for 15 minutes on an ice water bath, and subsequently for 30 minutes at room temperature. Water and tetrahydrofuran were added, and a sodium hydroxide solution was further added, followed by stirring at room temperature for 15 minutes. The mixture was acidified with hydrochloric acid, extracted with ethyl acetate, dried and concentrated to dryness. The residue was purified by thin-layer chromatography (hexane-ethyl acetate) to give the title compound as white crystals (yield: 30 mg).
1 H NMR (CDCl 3 ) 1-2 ppm (m6H), 2.49 ppm (q2H), 4.01 ppm (m4H), 4.12 ppm (t2H), 5.92 ppm (t1H), 7.20 ppm (s1H), 7 .25 ppm (s 1H), 7.55 ppm (s 1H), 7.56 ppm (s 1H)
[0094]
(Vi) Synthesis of mono-6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl protein succinate complex (VI)
Mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl succinate (10 mg 0.02 mmol) was dissolved in dimethylformamide (5 ml) under an argon atmosphere, and tributylamine (10 μl) and chloroform were dissolved. Solution A was prepared by adding isobutyl formate (4 μl) and stirring at room temperature for 20 minutes.
Bovine serum albumin (70 mg) was dissolved in 3 ml of water, the pH was adjusted to 9.0 with a 0.1 N sodium hydroxide solution, water was added to make 6 ml, and 6 ml of dimethylformamide was further added to prepare solution B.
The solution B was stirred on an ice-water bath, and the solution A was gradually added dropwise while adjusting with a 0.1 N sodium hydroxide solution so that the pH became 8.0 to 9.0. After the addition, the mixture was further stirred on an ice water bath for 3 hours. The A + B mixture was dialyzed against water overnight, and then freeze-dried to obtain a white powder (70 mg). When the amino group of bovine serum albumin was quantified according to a conventional method, 25.3 molecules of mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl succinate per molecule of bovine serum albumin were determined. Had joined.
The same procedure was performed for bovine gamma globulin. 5.4 molecules of mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthen-9-ylidene) hexyl succinate were bound per molecule of bovine gamma globulin.
[0095]
Example 2 Preparation of Monoclonal Antibody Using Novel Hapten-Carrier Protein Complex as Antigen
Using the novel hapten-bovine serum albumin complex as an immunizing antigen, hybridoma cells were prepared according to a conventional method to obtain a monoclonal antibody.
Specifically, 100 μg of mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl-bovine serum albumin complex antigen succinate was mixed with an equal amount of Freund's complete adjuvant for 6 weeks. It was intraperitoneally administered to five aged female BALB / c mice. Three weeks later, the same amount of antigen was mixed with an equal amount of incomplete Freund's adjuvant and similarly administered intraperitoneally. One week later, blood was collected from the retro-orbital vein and serum was separated. It was confirmed by ELISA using 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl-bovine gamma globulin complex antigen. To the mouse with an increased antibody titer, 100 μg of the antigen was administered into the tail vein, and three days later, the spleen was removed. The isolated spleen cells and PAI myeloma cells were fused at a ratio of 5: 1 by the PEG method, and hybridoma cells were obtained by HAT selection. Furthermore, antibody production positive cells were selected by ELISA. After growth, subcloning was performed and intraperitoneal administration was performed to collect ascites. Ammonium sulfate salting out from the ascites fluid and purification of the antibody using a protein G affinity column were performed. The purity was confirmed by SDS-PAGE, and the antibody isotype was determined by immunochromatography.
As a result, IgG1 class antibodies Dx-α and 5B-1 were obtained.
[0096]
Example 3 Antibody Titer and Reactivity with Known Dioxin Hapten Antigen 1) Titer
Determination of monoclonal antibody titer
A solution prepared by dissolving mono-succinate mono 6- (2,3,6,7-tetrachloroxanthene-9-ylidene) hexyl-bovine gamma globulin complex in PBS to a concentration of 10 μg / ml was placed in a 96-well immunoplate in one well. Each 100 μl was dispensed and incubated overnight in a refrigerator. After washing three times with about 300 μl of PBS per well three times, 250 μl of 25% Block Ace was dispensed per well and incubated at 37 ° C. for 1 hour or in a refrigerator overnight (antigen-fixed plate). Stored in refrigerator if not used immediately.
After washing the antigen-immobilized plate three times with 0.02% Tween 20 PBS (TPBS), 50 μl of each monoclonal antibody diluted to various concentrations with TPBS was dispensed and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. After washing three times with TPBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG antibody was dispensed at 37 ° C. for 45 minutes. After washing three times with TPBS, 100 μl of a paranitrophenyl phosphate solution, which is a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, was dispensed at room temperature and reacted at room temperature for 15 minutes, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured with a plate reader.
The results are shown in FIG. The two types of monoclonal antibodies (Dx-α, 5B-1) both had a color development lower limit concentration of about 15 ng / ml and a 50% color development concentration of about 120 ng / ml.
[0097]
2) Reactivity with known dioxin hapten antigen
Method for measuring monoclonal antibody titer using 2-adipamide-3,7,8-trichlorodibenzoparadioxin-bovine gamma globulin complex as a detection antigen, prepared according to Toxicology and Applied Pharmacology 82: 256-263 (1986). Performed in a similar manner.
FIG. 2 shows the results. The Dx-a monoclonal antibody cross-reacted with a known dioxin hapten. The lower color density was about 0.5 μg / ml, and the 50% color density was about 60 μg / ml.
[0098]
Example 4 Confirmation of crossing property with dioxins by indirect competition method
2-Amino-3,7,8-trichlorodibenzoparadioxin (Dx-NH) synthesized according to Toxicology and Applied Pharmacology 82, 256-263 (1986). 2 ) And 2-nitro-3,7,8-trichlorodibenzoparadioxin (Dx-NO 2 ) Was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), and a solution diluted 200-fold with PBS was used as a stock solution, and diluted to various concentrations with 0.5% DMSO PBS. An equal amount of a dioxin diluent and a 0.25 μg / ml solution of a monoclonal antibody (Dx-α) were mixed, and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
[0099]
After washing the antigen-immobilized plate prepared in the section of the measurement of the monoclonal antibody titer three times with TPBS, 100 μl of a dioxin-monoclonal antibody mixture was dispensed and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. After washing three times with TPBS, 100 μl of an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG antibody was dispensed at 37 ° C. for 45 minutes. After washing three times with TPBS, 100 μl of a paranitrophenyl phosphate solution, which is a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, was dispensed at room temperature and reacted at room temperature for 15 minutes, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured with a plate reader.
The results are shown in FIG. Monoclonal antibody Dx-α is Dx-NH 2 And Dx-NO 2 And showed cross-reactivity. The 50% competitive concentration is Dx-NH 2 About 4 μg / ml, Dx-NO 2 Was about 12 μg / ml.
[0100]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a hapten antigen of a dioxin for obtaining an antibody which is excellent in safety and distinguishes various chlorinated dioxins.
[0101]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing titers of monoclonal antibodies.
FIG. 2 shows the cross-reactivity of monoclonal antibodies with known dioxin haptens.
FIG. 3 is a diagram showing the competitive reactivity of a monoclonal antibody with a dioxin derivative.
