JP2004024195A

JP2004024195A - Monoclonal antibody against human snk protein and method for determining cancer of thyroid gland

Info

Publication number: JP2004024195A
Application number: JP2002189518A
Authority: JP
Inventors: Shunichi Yamashita; 山下　俊一; Keiichi Sugiyama; 杉山　啓一; Yuki Yoshida; 吉田　由紀; Takeshi Urano; 浦野　健; Koichi Furukawa; 古川　鋼一
Original assignee: PharmaDesign Inc Japan
Current assignee: PharmaDesign Inc Japan
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-01-29

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a monoclonal antibody against a human SNK protein and to provide a method for determining a cancer of thyroid gland. <P>SOLUTION: The present invention provides a monoclonal antibody against the human SNK protein capable of being used for determination of malignancy/benignancy of a tumor generated in the thyroid gland, a method for determining malignancy/benignancy of the human thyroid gland tumor using the monoclonal antibody and a reagent kit for determining the malignancy/benignancy of the human thyroid gland tumor. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、甲状腺に生じた腫瘍の悪性／良性の判別に使用することができるヒトＳＮＫ蛋白質に対するモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を用いたヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別方法及びヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別用試薬キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
甲状腺腫瘍は、良性の甲状腺腫瘍と悪性の甲状腺腫瘍とに分類され、悪性の甲状腺腫瘍（いわゆる甲状腺癌）は、他臓器へ転移により全身衰弱を引き起こす。さらに、甲状腺癌は、乳頭腺癌、濾胞腺癌、髄様癌、悪性リンパ腫及び未分化癌に分類される。乳頭腺癌と濾胞腺癌とは両方合わせて「分化がん」と呼ばれ、乳頭腺癌は甲状腺癌全体の約９０〜９５％、濾胞腺癌は約５％とこの２つで甲状腺癌のほとんどを占めている。乳頭腺癌は、前記のように最も一般的な甲状腺癌で、男性よりも女性に圧倒的に多く、４０〜６０歳代でみつかることが大半であるが、若い年齢層で発見されるケースもある。頚部に結節状のしこりを触れる以外には特に症状はない。進行は他の臓器のがんに比べ非常に遅いが、リンパ節や肺などに転移がみられる場合もある。濾胞腺癌は、乳頭腺癌と同様に進行はゆっくりであるが、手術前に診断がつきにくく、骨（特に脊椎骨）に転移しやすいという特徴がある。髄様癌は、甲状腺癌全体の１〜２％を占める比較的珍しい癌で、甲状腺のＣ細胞と呼ばれる細胞から発生し、カルシトニンや　ＣＥＡ　という物質を分泌する。散発性のものと遺伝性のものがある。悪性リンパ腫は、リンパ組織を構成する細胞成分の腫瘍性増殖により起こる疾患で、甲状腺に原発することはまれで、甲状腺癌全体の２％程度を占めている。未分化癌は、髄様癌と同様に非常に稀な癌で、前記の分化癌が変化（転化ともいう）して発生するものと考えられる。分化癌と比較しやや高齢者（６０〜７０歳以上）に多く、発生に男女差はほとんどない。分化癌とは逆に進行がきわめて速く、全身的な症状を伴ってくるのが特徴である。
【０００３】
現在、甲状腺癌は、超音波検査（エコー）、頸部ＣＴスキャン、頸部軟線撮影、核医学検査、穿刺吸引細胞診等により行なわれている。超音波検査は、超音波を用いて、甲状腺腫瘍の有無やリンパ節への転移を観察する方法である。体に害のない検査であるため比較的頻繁に用られているが、体型などによっては、臓器の観察が容易でなかったり、検査を行う術者の技量によって、診断の信頼性に差が出るという欠点がある。頸部ＣＴスキャンは、レントゲンを用いて、人体の輪切り像を見る検査で、甲状腺の腫瘍の有無やリンパ節への転移を観察する方法である。頸部軟線撮影は、レントゲン写真の一種で、甲状腺の石灰化の検出に用いられる。核医学検査は、放射性元素をもちいて、甲状腺の形態、機能を検査する方法である。穿刺吸引細胞診は、甲状腺に細い針を刺し、腫瘍細胞を採取し、細胞を直接検査する方法である。この検査で癌細胞が検出されれば、１００％近く癌と診断できるが、癌細胞が存在するにも拘わらず採取されていなかったり、癌細胞の数が極端に少なかったりするために癌細胞が検出されない場合や、濾胞性腫瘍の場合は、良性と悪性の鑑別が臨床上、治療法の決定や予後を考える上で問題となる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、甲状腺に生じた腫瘍の悪性／良性の判別に使用することができるヒトＳＮＫ蛋白質に対するモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を含む生化学的研究用試薬、ヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別方法及びヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別用試薬キットを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ヒトＳＮＫ蛋白質を免疫原として作製したモノクローナル抗体を使用することによって、ヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性を判別することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）である。
（１）　ヒトＳＮＫ蛋白質に結合するモノクローナル抗体又はその断片。
（２）　配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質に結合するモノクローナル抗体又はその断片。
（３）　配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質とタグ蛋白質との融合蛋白質を免疫原として得られる請求項１記載の抗体又はその断片。
（４）　タグ蛋白質が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼであることを特徴とする上記（３）の抗体又はその断片。
（５）　独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８５５として寄託されているハイブリドーマより得られる上記（１）〜（４）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片。
【０００７】
（６）　ヒトＳＮＫ蛋白質で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、当該哺乳動物と同種又は異種の動物由来の自己増殖能を有する細胞とを融合し、当該融合細胞をクローン化することにより得られる、上記（１）〜（５）のいずれかのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（７）　ハイブリドーマが、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８５５として寄託されたものである、上記（６）のハイブリドーマ。
（８）　上記（６）又は（７）のハイブリドーマを培養し、培養上清から上記（１）〜（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
（９）　被検者から採取したヒト甲状腺腫瘍細胞中に存在するヒトＳＮＫ蛋白質の分布状態を指標として当該被検者の甲状腺腫瘍の悪性／良性を判別することを特徴とするヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別方法。
（１０）　ヒト甲状腺腫瘍細胞中に存在するヒトＳＮＫ蛋白質の分布状態を、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を用いる免疫組織染色法により調べることを特徴とする上記（９）のヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別方法。
（１１）　上記（１）〜（５）のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片を含むことを特徴とするヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別用試薬キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、甲状腺に生じた腫瘍の悪性／良性の判別に使用することができるヒトＳＮＫ蛋白質（ｈＳＮＫ蛋白質ともいう）に対するモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を用いたヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別方法及びヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別用試薬キットである。以下に、本発明のハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製法について詳述する。
【０００９】
本発明で用いられるｈＳＮＫ蛋白質としては、天然由来のものでもよく、また、遺伝子工学的手法により製造されたものでもよい。また、ｈＳＮＫ蛋白質としては、その一部が変異されたムテインでもよい。本発明のモノクローナル抗体を製造するには、ｈＳＮＫ蛋白質（免疫原）で適当な哺乳動物を免疫し、当該免疫動物の脾臓細胞と、当該動物と同種又は異種の哺乳動物のリンパ球様細胞とを融合し、次いでこの融合細胞をクローン化することにより製造することができる。具体的製造方法は次の通りである。哺乳動物の免疫に際して免疫原として使用するｈＳＮＫ蛋白質としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるｈＳＮＫ蛋白質や配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるｈＳＮＫ蛋白質由来部分ペプチド（例えば、ｈＳＮＫ蛋白質の１番目アミノ酸から３９７番目アミノ酸までの配列からなるペプチド）を使用することができる。また、それらの免疫原である蛋白質のＣ末又はＮ末にタグ蛋白質を融合させた融合蛋白質を免疫原として用いることもできる。ここで、「タグ蛋白質」とは、目的蛋白質のアフィニティー精製により分離を容易に行うためやその他、目的蛋白質の挙動を追跡するため等の目的で、所望の蛋白質の末端に余分に付加する蛋白質をいう。タグ蛋白質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）などが挙げられる。
【００１０】
ｈＳＮＫ蛋白質で免疫するための哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられるがこれらに限定されない。免疫に際しての免疫原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等のいずれの経路でも投与することができる。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｈＳＮＫ蛋白質を数日〜数週間おきに数回接種する。接種量は一匹当たり、一回につき１〜１０００μｇのｈＳＮＫ蛋白質を使うのが好ましい。
【００１１】
上記ｈＳＮＫ蛋白質で免疫されたマウスより脾臓を摘出し、遠心分離により抗体産生細胞（脾臓細胞）を得る。この細胞は増殖能が無いので、自己増殖能を有する細胞と融合させる。自己増殖能を有する細胞としてはミエローマ細胞等のリンパ球様細胞が特に好ましい。ミエローマ細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を分泌しないものを選択するのが好ましい。かかるミエローマ細胞としては、例えばマウスミエローマ細胞Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−１８）［Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　６：５１１−５１９（１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１５８１）［Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３Ｘ　６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−９）［Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）］などが挙げられる。抗体産生細胞とミエローマ細胞等との融合は、常法に従い、例えばこれら細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）で処理することにより実施できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の使用割合は、細胞数比で約３：１〜１０：１とするのが好ましい。
【００１２】
得られた融合細胞を限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を増殖させ、各ウェルにおいて産生される抗体を、ｈＳＮＫ蛋白質固相化プレートを使用するＥＬＩＳＡ法において試験し、さらに必要に応じて、免疫組織染色法によって、甲状腺腫瘍組織との反応性を調べ、その結果から所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択する。すなわち、ｈＳＮＫ蛋白質をアルキレンジアルデヒドおよび塩基性ポリペプチド又は塩基性合成ポリマーの存在下に固相化させて、ｈＳＮＫ蛋白質特異抗体アッセイプレートを調製する。このアッセイプレートを用い、上記融合細胞の産生する抗体をＥＬＩＳＡ法で試験し、ｈＳＮＫ蛋白質に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。　なお、ｈＳＮＫ蛋白質に反応する抗体を産生するハイブリドーマ株（名称：αＳＮＫ２−７−４）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成１４年５月１５日付で受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８５５として寄託されている。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、上記において選択されたハイブリドーマを適当な培地を用いて培養して得られる培養上清から常法（例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、プロティンＡを用いるアフィニティークロマトグラフィー等）により容易に取得することができる。また、上記ハイブリドーマを適当な哺乳動物（例えば、マウス等）の腹腔内に接種し、ハイブリドーマ細胞を増殖させた後、当該哺乳動物の腹水、血清等から所望のモノクローナル抗体を採取することもできる。
【００１４】
得られたモノクローナル抗体は、そのまま使用することもできるが、活性フラグメントとして断片化して使用することもできる。活性フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等の各種フラグメントで、ｈＳＮＫ蛋白質への特異的結合活性が失われていないものであればよい。これら活性フラグメントの調製は、精製モノクローナル抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することで行うことができる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参照）。
【００１５】
後述する実施例に示したように、本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色法で、被検者の甲状腺腫瘍を染色すると、良性の甲状腺腫瘍と悪性の甲状腺腫瘍とでは、染色パターンが異なっていた。すなわち、良性の濾胞腺腫（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ａｄｅｎｏｍａ）では核が選択的に染色されるのに対し、悪性の濾胞腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び悪性の乳頭腺癌（Ｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）では、核の染色性は低下し、細胞質と同程度（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）もしくはほとんど染色されなかった（Ｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）。従って、本発明の抗体を用いることによって、甲状腺腫瘍が悪性腫瘍であるのか否かを判別することができる。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、従来、浸潤の有無をもって癌細胞であるのか否かを判定していた甲状腺腫瘍において、細胞浸潤前に、悪性であるか否か（すなわち、癌細胞であるか否か）を判別することができるため、臨床応用を考える場合、極めて有用な抗体であると言える。即ち、本発明の抗体は、免疫組織染色あるいは細胞質蛍光抗体法によって生検試料中の甲状腺癌細胞を検出するなど、診断の目的に用いることができる。このモノクローナル抗体を用いると、甲状腺腫瘍の悪性／良性の判別において非常に精度の高い診断結果を得ることができる。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体を用いる免疫組織染色法、細胞質蛍光抗体法による診断法の詳細は以下のとおりである。　免疫組織染色は、Ｖｅｃｔｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　ＣＡ、米国）を使用することができる。染色手順は、組織切片の載ったプレートを内因性ペルオキシダーゼをブロックするため、３０％Ｈ_２Ｏ_２とメチルアルコールを１：１００の割合で混合させたもので２０分間処理する。次いで、ＰＢＳにて３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍に希釈した正常馬血清を加え、非特異的反応をブロックする。２０分間室温でインキュベートした後、モノクローナル抗体を加える。モノクローナル抗体は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌに希釈したものを使用する。室温にて１時間あるいは、４℃で一晩放置した後、ＰＢＳにて３回洗浄する。ＰＢＳにて３回洗浄後、ビオチン化した馬抗マウス抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈して加える。３０分間室温で放置した後、ＰＢＳで３回洗浄する。次いで、ペルオキシダーゼが結合したアビジン−ビオチン結合物を加える。濃度はＰＢＳにて１０００倍に希釈したものを加える少なくとも３０分前に調製する。室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳで洗浄を３回行う。発色は、０．２Ｍトリスアミノメタン２５ｍｌ、０．２Ｎ塩酸１９．２ｍｌに蒸留水を加え１００ｍｌとしたものに、ジアミノベンチジン塩酸塩２０ｍｇを溶解させる。更にＨ_２Ｏ_２を０．０３ｍｌ程の割合で加える。以上の液にプレートを７分間反応させる。その後、発色を停止させる。核染色はヘマトキシリンで行う。
【００１８】
細胞質蛍光抗体法１〜５×１０^４の標的細胞を、スライドグラス上に９５％アセトンで１０分間固定し、−７０℃に保存しておいたものを標的細胞として用いる。　第一次抗体としてハイブリドーマ培養上清２５μｌを用いて４℃または２５℃にて３０分間反応させる。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体として２０〜４０倍希釈蛍光標識抗マウスウサギ抗体を２５℃にて３０分間反応させる。反応は蛍光顕微鏡下で蛍光の有無によって判定する。
【００１９】
本発明による悪性腫瘍の判別方法は、常法により作製した組織標品切片または細胞懸濁液を、本発明の抗体で処理し、鏡検により抗体結合の有無、その分布を観察することにより、悪性腫瘍であるか否かを判定する。この際、ローダミンやテキサスレッド等の色素やＦＩＴＣなどの蛍光色素で標識した抗体を用いれば、形態学的観察は容易となる。あるいはペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素やビオチンなど標識した抗体を用い、抗体処理後にその酵素反応を利用した特殊染色を行なってもよい。この際には観察を容易にするため核染色を行まってもよい。またこのような標識抗体を使わない場合には、抗体処理後に抗ＩｇＧ抗体で処理し、ペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーセ法などにより特殊染色する免疫組織化学的観察を行なってもよい。電子顕微鏡により抗体結合の有無を観察する場合には、フェリチン標識した抗体を用いるのが好ましい。この場合には通常の電子顕微鏡標品の作製手順に従って鏡検試料を作製する。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体又はその断片を主要構成要素とするヒト甲状腺腫瘍の悪性／良性判別用試薬キットを構築することも、本発明の好ましい態様の一つである。その場合には必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付すればよい。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕　本発明のモノクローナル抗体の作製
（１）　免疫原蛋白質の調製
ヒト甲状腺単層培養細胞から採取したＲＮＡより、プライマーペア〔５’−　ａｔｇｔｃｇａｃｃａｔｇｇａｇｃａｃｔｃｔｃａｃｔｃｇｃａｃａａｇ−３’（配列番号４）及び５’−　ｔｇｔｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｃａｔａｃｔｃｔａｃａｔ−３’（配列番号５）〕を用いたＲＴ−ＰＣＲでｈＳＮＫ蛋白質をコードする全長ｃＤＮＡ（配列番号３）をクローニングした。次いで、得られた全長ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーペア〔５’−　ｃｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｇｃｇｇａｃｔａｔｃ−３’（配列番号６）及び５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｔｔａｃａｔｃｔｔｔｇｔａａｇａｇ−３’（配列番号７）〕を用いたＰＣＲにより、ｈＳＮＫ蛋白質のＮ端側にＢａｍＨＩ部位、Ｃ端側にＸｈｏＩ部位を付加したｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡの３９７／３９８アミノ酸コード部分にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位を利用し、全長ｈＳＮＫからＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで１−３９７アミノ酸コード部分を切り出し、それをＧＳＴ／ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターに挿入した。このｃＤＮＡをＢＬ２１にトランスフォームし、大腸菌から得られたグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ（タグ蛋白質）とｈＳＮＫ蛋白質との融合蛋白質〔以下、ＧＳＴ？ＳＮＫ（ＢＨ）ともいう〕をグルタチオン−セファロースビーズで精製し、以下においてモノクローナル抗体作製用の免疫原として用いることにした。
【００２２】
（２）マウスの免疫
上記（１）で調製したＧＳＴ‐ＳＮＫ（ＢＨ）５０μｇに不完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ社）１５０μｌを加え、室温で５分間ｖｏｒｔｅｘし、エマルジョンを形成させた。これを８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス（♀）の皮下に注入し、初回免疫を行った。２週間後に今度はＧＳＴ？ＳＮＫ（ＢＨ）１００μｇに完全アジュバント（ＳＩＧＭＡ社）２００μｌを加え、同様にｖｏｒｔｅｘし、エマルジョン化したものを同マウスに皮下注した。翌週、この免疫マウスの尾から約５００μｌの血液を採取した。３７℃で４５分インキュベートし、補体を失活させた後、１２，０００ｒｐｍで５分間（４℃）で遠心し、上清の血清を分離した。この血清を５００倍に希釈し、ＣＯＳ−７細胞に強発現させたｍｙｃ−ＳＮＫを認識しうるかをポジティブコントロールに抗ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロットで確認したが、まだ有意なバンドは検出されず、抗体価が十分に上昇していないと考えられたので、引き続きに２週間に一度の免疫を行った。初回から合計して７回目の免疫を行い、翌週採血して同様にウエスタンブロットを行ったところ、有意なバンドが検出された。そこで、このマウスの脾臓から感作されたＢ細胞を採取し、ＮＳ−１細胞と融合させ、ハイブリドーマを作成することにした。
【００２３】
（３）　抗ｈＳＮＫ蛋白質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製
まず、以下のようにしてハイブリドーマの生存・増殖を助けるためのフィーダー細胞を調製した（細胞融合処理の１〜２日前に準備）。すなわち、まず９６ウエル平底プレートには一枚あたり７ｍｌ弱（１ウエル当たり一滴）入るので、７×１２ｍｌの１×ＨＡＴ・２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地を準備した。一方、４〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（♀）を６〜８匹用意した。ＰＢＳをシリンジに取り、腹腔内に６ｍｌ注入した。針を刺したまま丹念に腹部をｔａｐｐｉｎｇし、腹腔中のリンパ球を十分にＰＢＳ中に浸出させた。次いで、脂肪を吸ったり、腸管を傷つけたりしないように注意してＰＢＳを回収した。回収したＰＢＳを５０ｍｌ遠心チューブに集め、１，５００ｒｐｍで５分遠心し、上清を吸引した後、ペレットをｔａｐｐｉｎｇした。３０ｍｌのＰＢＳで一度、細胞を洗浄した。洗浄後、残ったペレットをｔａｐｐｉｎｇした後、１×ＨＡＴ・２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地に懸濁した。得られた懸濁液を９６穴プレートのウエルに一滴ずつ分注することによりフィーダー細胞調製プレートを得た。
【００２４】
一方、ミエローマ細胞ＮＳ−１を以下のようにして調製した。ＮＳ−１細胞は、予め１０〜２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン存在下の１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で培養することにより、復帰変異によるＨＧＰＲＴ活性の獲得を防いだ。融合処理当日に対数増殖期になるように、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地中で培養した。培養器中の細胞をはがし、５０ｍｌ遠心チューブに集めた。１，５００ｒｐｍで５分遠心し、上清を吸引した後、ペレットをｔａｐｐｉｎｇした。細胞を、一度ｗａｓｈｉｎｇした後、５ｍｌのＲＰＭＩに懸濁し、０．１〜１×１０^８個／ｍｌの細胞数であることを確認し、このようにして得たミエローマ細胞ＮＳ−１を細胞融合に使用した。
【００２５】
また、Ｂ細胞を以下のようにして調製した。抗体産生能を高めるために融合処理の３〜４日前に、上記（２）において得られた感作マウスの静脈洞もしくは腹腔に可溶性免疫原蛋白質を１５０μｇ注射した。免疫したマウスより脾臓を取り出し、ＲＰＭＩを５ｍｌ入れた６ｃｍ　ｄｉｓｈに移した。ｄｉｓｈ内で脾臓を２本の注射針でできるだけ細かくほぐした。上清だけを１５ｍｌ遠心チューブに回収した。ＲＰＭＩ（ｐｌａｉｎ）を５ｍｌ加えて、残りの細胞を同様に回収した。１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を吸引した後、ペレットをｔａｐｐｉｎｇした。ＲＰＭＩで１回洗浄後、ＲＰＭＩ５ｍｌに懸濁した。得られた懸濁液１０μｌに対し、４０μｌのＲＰＭＩを加え（５倍希釈）、細胞数が１×１０^８個／ｍｌ以上存在することを確認した。
【００２６】
次いで、以下のようにして細胞融合処理を行った。予め０．５ｍｌの５０％ＰＥＧ／ＰＢＳ、１　ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ、９ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩをそれぞれ１５ｍｌ容チューブに取り３７℃で温めておいた。ＮＳ−１細胞：Ｂ細胞＝１：１０になるようにＮＳ−１細胞を取り、Ｂ細胞の入っているチューブに入れた。ｕｐ／ｄｏｗｎしてよく混ぜた後、チューブ一杯までＲＰＭＩを加え洗浄した。０．５ｍｌの５０％ＰＥＧ／ＰＢＳを先の長いパスチュアパイペットに取り、９０秒掛けてゆっくり添加した。このとき、ペレットが十分ほぐれるように混ぜ合わせた。１ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを６０秒掛けて同様に添加した。９ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを４分掛けてゆっくり加えた。洗浄後、２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩに懸濁した。得られた懸濁液を、フィーダー細胞を撒いたプレートに一滴ずつたらした。３〜４日後に２×ＨＡＴ・２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを一滴ずつ添加した。融合処理１〜２週後にコロニーを形成しているウエルの細胞上清を採取し、数回にわたりＥＬＩＳＡを試行した。その結果、ここできわめて強い陽性の結果が得られたＮｏ．２−７−４（αＳＮＫ２−７−４と命名）を選択した。
【００２７】
〔実施例２〕　本発明のモノクローナル抗体による甲状腺腫瘍の良性／悪性の判別
血清（ポリクローナル抗体）の抗体価をチェックしたときと同じように、ＣＯＳ−７に発現させたｍｙｃ−ＳＮＫを認識できるかどうかをウエスタンブロット法で確認した。この際、このクローンＮｏ．２−７−４はｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ＳＮＫも認識しうることが確認された。そこで、このクローンを培養し、他の用途についても可能かどうかの検討を行った。
【００２８】
培養した細胞の培養液を回収し、５０ｍｌに達したので、この中に抗マウスＩｇＧ　ｂｅａｄｓ（１：１）を２００μｌ加え、４℃で一晩ｉｎｃｕｂａｔｅし、抗ｈＳＮＫ抗体ｂｅａｄｓを作成した。これをｍｙｃ？ＳＮＫを強発現させたＣＯＳ−７の細胞溶解液と混合し、４℃で９０分ｉｎｃｕｂａｔｅした。Ｂｅａｄｓを十分にｗａｓｈｉｎｇした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白を分離し、抗ｍｙｃ抗体でｄｅｔｅｃｔｉｏｎしたところ、ｍｙｃ？ＳＮＫを認識したことから、この抗体は免疫沈降にも用いることが可能であると判断した。そこでより高濃度の抗体を得るために、マウスの腹腔内にハイブリドーマを注入し、腹水として採取することにした。１０ｃｍｄｉｓｈ　４枚分（１×１０^５個）のハイブリドーマを集め、３，０００ｒｐｍで１０分遠心し、ペレットを５００μｌのＰＢＳに懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入した。数週後にハイブリドーマが生着し、腹水が十分たまったところでマウスを屠殺し、その腹水を採取した。この腹水を１０００倍に希釈してウエスタンブロットを行ったところ、培養細胞の上清と同じ結果が得られたので、腹水中にも抗ｈＳＮＫ抗体は存在し、ウエスタンブロット及び免疫沈降反応（ＩＰ：Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）に使用可能であると判断した。
【００２９】
ところで、このｈＳＮＫは細胞内ではきわめて不安定な存在であり、通常はウエスタンブロットでもほとんど確認できない。Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるＬＬｎＬを加えることにより、初めてｄｅｔｅｃｔすることが可能となる。得られた腹水を１００倍に希釈し、蛍光免疫染色を行ったところ、ＬＬｎＬで処理したＣＯＳ−７およびＮＰＡ（甲状腺癌細胞株）で細胞質が染色されたが、未処理の細胞は染色されなかった。この結果はウエスタンブロットの結果と合致した。腹水を２００倍希釈し、これを一次抗体としてＡＢＣ法で甲状腺癌各種を組織染色したところ、以下の所見が得られた。
【００３０】
正常の甲状腺濾胞細胞は一般にｈＳＮＫの発現は認めないが、ごく一部の細胞のみ核が染色されていた（図１）。バセドウ病や腺腫様過形成組織では、全体に発現の上昇がみられ、その発現は特に核に局在していた（図２及び図３）。良性の腺腫（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ａｄｅｎｏｍａ）でも、バセドウ病と同様に核に局在が認められ、細胞質の発現は低く、全体的な発現量はバセドウ病に比べて、さらに上昇していた（図４）。一方、濾胞腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）では、細胞質にｈＳＮＫの発現を認めるようになり、逆に核の染色は低下し、多くの癌細胞で核と細胞質が共に染色された（図５）。乳頭腺癌（Ｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）ではさらに核が染色されず、細胞質のみが染色される細胞の割合が増加していた（図６及び図７）。未分化癌（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）も同様に核の染色性が低下し、核、細胞質全体が染色されていたが、一部に分裂期と思われる染色体が染色されており、このＳＮＫの発現が細胞周期と何らかの関係がある可能性が示唆された（図８）。また、上記の結果より、本発明のヒトＳＮＫ蛋白質に対するモノクローナル抗体は甲状腺癌の判別に応用できることが判明した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、腫瘍組織標品をヒトＳＮＫ蛋白質に対する抗体で処理し、抗体の結合状態を形態学的に観察するものであり、甲状腺に生じた腫瘍の悪性／良性の判別に有用である。本発明により、甲状腺腫瘍の悪性／良性判別キットが提供される。
【００３２】
【配列表】

【００３３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常の甲状腺濾胞細胞を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図２】図２は、バゼドウ病の甲状腺腫を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図３】図３は、甲状腺腫様過形成組織を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図４】図４は、良性の腺腫（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ａｄｅｎｏｍａ）を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図５】図５は、濾胞腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図６】図６は、乳頭癌（Ｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図７】図７は、乳頭癌（Ｐａｐｉｌｌａｒｙ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。
【図８】図８は、未分化癌（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を本発明の抗体で免疫組織染色した結果を示した写真である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody against human SNK protein which can be used for discriminating malignant / benign tumors in the thyroid gland, a method for discriminating malignant / benign human thyroid tumors using this monoclonal antibody, and a method for discriminating malignant / benign from human thyroid tumors. The present invention relates to a reagent kit for determining benignity.
[0002]
[Prior art]
Thyroid tumors are classified into benign thyroid tumors and malignant thyroid tumors, and malignant thyroid tumors (so-called thyroid cancers) cause general weakness by metastasis to other organs. Furthermore, thyroid cancer is classified into papillary adenocarcinoma, follicular adenocarcinoma, medullary carcinoma, malignant lymphoma and anaplastic carcinoma. Both papillary adenocarcinoma and follicular adenocarcinoma are called "differentiated cancers". Papillary adenocarcinoma is about 90-95% of the total thyroid cancer, follicular adenocarcinoma is about 5%, and these two Most accounted for. Papillary adenocarcinoma is the most common thyroid carcinoma, as described above, and is predominantly more common in women than in men, most often found in the 40s and 60s, but also found in younger age groups. is there. No symptoms other than touching a nodular lump on the neck. It progresses much more slowly than cancer in other organs, but it may have spread to lymph nodes and lungs. Follicular adenocarcinoma progresses slowly like papillary adenocarcinoma, but is difficult to diagnose before surgery, and is characterized by metastasis to bones (especially vertebrae). Medullary carcinoma is a relatively rare cancer that accounts for 1-2% of all thyroid carcinomas, originates from cells called thyroid C cells, and secretes substances called calcitonin and CEA. There are sporadic ones and hereditary ones. Malignant lymphoma is a disease caused by the neoplastic growth of cell components constituting lymphoid tissue, rarely occurs in the thyroid gland, and accounts for about 2% of all thyroid cancers. An undifferentiated cancer is a very rare cancer like medullary cancer, and it is considered that the above-mentioned differentiated cancer is caused by a change (also called conversion). Compared to differentiated carcinoma, it is more common in the elderly (60-70 years old), and there is almost no difference in gender in occurrence. Contrary to differentiated carcinoma, it progresses extremely rapidly and is characterized by systemic symptoms.
[0003]
At present, thyroid cancer is performed by ultrasonic examination (echo), cervical CT scan, cervical soft radiography, nuclear medicine examination, fine needle aspiration cytology, and the like. Ultrasonography is a method for observing the presence or absence of thyroid tumor and metastasis to lymph nodes using ultrasound. Because it is a test that does not harm the body, it is used relatively frequently, but depending on the body type, it is not easy to observe the organ, and the reliability of diagnosis varies depending on the skill of the operator performing the test There is a disadvantage that. Cervical CT scan is a method of examining a sliced image of a human body using an X-ray and observing the presence or absence of a tumor in the thyroid gland and metastasis to lymph nodes. Cervical soft radiography is a type of radiograph and is used to detect thyroid calcification. Nuclear medicine examination is a method for examining the morphology and function of the thyroid gland using radioactive elements. Fine needle aspiration cytology is a method in which a thyroid gland is punctured with a fine needle, tumor cells are collected, and the cells are directly examined. If cancer cells are detected by this test, it can be diagnosed that the cancer is almost 100%. However, cancer cells are not collected despite the existence of cancer cells, or the number of cancer cells is extremely small. When not detected or in the case of follicular tumor, the distinction between benign and malignant is clinically problematic in deciding the treatment method and considering the prognosis.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to a monoclonal antibody against human SNK protein which can be used for discriminating malignant / benign from a tumor generated in the thyroid, a reagent for biochemical research containing this monoclonal antibody, a method for discriminating malignant / benign from human thyroid tumor, and An object of the present invention is to provide a reagent kit for discriminating malignant / benign from human thyroid tumor.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have succeeded in discriminating between malignant / benign human thyroid tumors by using a monoclonal antibody prepared using human SNK protein as an immunogen. Thus, the present invention has been completed.
[0006]
That is, the present invention includes the following (1) to (11).
(1) A monoclonal antibody or a fragment thereof that binds to human SNK protein.
(2) A monoclonal antibody or a fragment thereof that binds to a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
(3) The antibody or fragment thereof according to claim 1, wherein a fusion protein of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a tag protein is obtained as an immunogen.
(4) The antibody or fragment thereof according to (3) above, wherein the tag protein is glutathione S-transferase.
(5) The monoclonal antibody or fragment thereof according to any one of (1) to (4), obtained from a hybridoma deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Patent Organism Depositary under the Accession No. FERM P-18855.
[0007]
(6) obtained by fusing spleen cells of a mammal immunized with a human SNK protein with cells capable of self-proliferation derived from an animal of the same or different species as the mammal, and cloning the fused cells; A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to any one of the above (1) to (5).
(7) The hybridoma according to (6) above, wherein the hybridoma has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the accession number FERM P-18855.
(8) A method for producing a monoclonal antibody, comprising culturing the hybridoma according to (6) or (7) and collecting the monoclonal antibody according to any one of (1) to (5) from the culture supernatant. .
(9) Malignancy of a human thyroid tumor characterized in that the malignancy / benignity of a thyroid tumor of the subject is determined using the distribution state of human SNK protein present in human thyroid tumor cells collected from the subject as an index. / Benign discrimination method.
(10) The distribution state of human SNK protein present in human thyroid tumor cells is examined by an immunohistological staining method using the monoclonal antibody or a fragment thereof according to any of (1) to (5). (9) The method for discriminating malignant / benign from human thyroid tumor according to (9) above.
(11) A reagent kit for discriminating malignant / benign from human thyroid tumor, comprising the monoclonal antibody or a fragment thereof according to any one of (1) to (5).
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody against human SNK protein (also referred to as hSNK protein) that can be used for discriminating malignant / benign tumors generated in the thyroid, a method for discriminating malignant / benign human thyroid tumors using this monoclonal antibody, and This is a reagent kit for discriminating malignant / benign from human thyroid tumor. Hereinafter, the method for preparing the hybridoma and the monoclonal antibody of the present invention will be described in detail.
[0009]
The hSNK protein used in the present invention may be of natural origin or may be produced by genetic engineering techniques. The hSNK protein may be a mutein in which a part thereof is mutated. To produce the monoclonal antibody of the present invention, a suitable mammal is immunized with the hSNK protein (immunogen), and spleen cells of the immunized animal and lymphoid cells of a mammal homologous or heterologous to the animal are immunized. It can be produced by fusing and then cloning the fused cells. The specific manufacturing method is as follows. Examples of the hSNK protein used as an immunogen upon immunization of a mammal include, for example, a hSNK protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a partial peptide derived from the hSNK protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example, A peptide having a sequence from the first amino acid to the 397th amino acid of the hSNK protein can be used. Further, a fusion protein obtained by fusing a tag protein to the C-terminal or N-terminal of those immunogen proteins can also be used as the immunogen. Here, the term "tag protein" refers to a protein that is added to the end of a desired protein in order to facilitate separation by affinity purification of the target protein or to track the behavior of the target protein. Say. Examples of tag proteins include glutathione-S-transferase (GST), protein A, β-galactosidase, and maltose-binding protein (MBP).
[0010]
Examples of mammals to be immunized with the hSNK protein include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, rabbits, sheep, goats, and the like. The route of administration of the immunogen upon immunization is not particularly limited, and it can be administered by any route, for example, subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, and the like. Specifically, for example, a BALB / c mouse is inoculated several times with hSNK protein every several days to several weeks. It is preferable to use 1 to 1000 μg of hSNK protein per animal per inoculation.
[0011]
The spleen is removed from the mouse immunized with the hSNK protein and centrifuged to obtain antibody-producing cells (spleen cells). Since these cells do not have the ability to proliferate, they are fused with cells capable of self-proliferation. Lymphoid cells such as myeloma cells are particularly preferred as cells having the ability to self-proliferate. As the myeloma cells, it is preferable to use those of the same animal type as the animal from which the antibody-producing cells were obtained, and it is also preferable to select cells that do not secrete antibodies. Such myeloma cells include, for example, mouse myeloma cells P3 / NS1 / 1-Ag4-1 (ATCC TIB-18) [Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)], Sp2 / 0-Ag14 (ATCC CRL-1581) [Nature 276: 269-270 (1978)], P3X 63Ag8 (ATCC TIB-9) [Nature 256: 495-497 (1975)] )]. Fusion between the antibody-producing cells and myeloma cells or the like can be carried out according to a conventional method, for example, by treating these cells with a solution (or suspension) containing a cell fusion agent such as polyethylene glycol. The ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably about 3: 1 to 10: 1 in cell number ratio.
[0012]
The obtained fused cells were separated by limiting dilution, the separated fused cells were grown, and the antibody produced in each well was tested in an ELISA method using a hSNK protein-immobilized plate, and if necessary, further. The reactivity with the thyroid tumor tissue is examined by immunohistochemical staining, and the hybridoma producing the desired antibody is selected from the results. That is, the hSNK protein is immobilized in the presence of an alkylenedialdehyde and a basic polypeptide or a basic synthetic polymer to prepare an hSNK protein-specific antibody assay plate. Using this assay plate, antibodies produced by the above fused cells are tested by ELISA, and hybridomas producing antibodies that react with the hSNK protein are selected. A hybridoma strain producing an antibody that reacts with the hSNK protein (name: αSNK2-7-4) was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (1-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). Deposited on May 15, 2002 under the accession number FERM P-18855.
[0013]
The monoclonal antibody of the present invention can be prepared by a conventional method (for example, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A) from a culture supernatant obtained by culturing the hybridoma selected above in an appropriate medium. Etc.) can be easily obtained. In addition, after inoculating the hybridoma into the peritoneal cavity of a suitable mammal (eg, a mouse) and growing the hybridoma cells, a desired monoclonal antibody can be collected from ascites, serum, or the like of the mammal.
[0014]
The obtained monoclonal antibody can be used as it is, or can be used after being fragmented as an active fragment. As an active fragment, F (ab ') ₂ , Fab ', Fab, etc., as long as the specific binding activity to the hSNK protein is not lost. The preparation of these active fragments can be performed by applying a known method such as papain, pepsin, or trypsin treatment to the purified monoclonal antibody (for example, “Immunobiochemical Research Method (Seizoku Chemistry Experimental Course 5)”). , Edited by The Biochemical Society of Japan, p. 89 (1986)).
[0015]
As shown in the Examples below, when a thyroid tumor of a subject is stained by an immunohistological staining method using the monoclonal antibody of the present invention, the staining pattern differs between a benign thyroid tumor and a malignant thyroid tumor. I was That is, the nucleus is selectively stained in a benign follicular adenoma, whereas in a malignant follicular adenocarcinoma and a malignant papillary adenocarcinoma, the nuclear staining is reduced. However, no staining was observed (Follicular carcinoma) or almost no staining (Papillary carcinoma). Therefore, it is possible to determine whether the thyroid tumor is a malignant tumor by using the antibody of the present invention.
[0016]
Prior to cell invasion, the monoclonal antibody of the present invention was used to determine whether or not it was a cancer cell in a thyroid tumor, which was previously determined based on the presence or absence of invasion. ) Can be discriminated, and it can be said that this antibody is extremely useful when considering clinical applications. That is, the antibody of the present invention can be used for diagnostic purposes, such as detecting thyroid cancer cells in a biopsy sample by immunohistochemical staining or cytoplasmic fluorescent antibody method. When this monoclonal antibody is used, extremely high-precision diagnostic results can be obtained in discriminating between malignant and benign thyroid tumors.
[0017]
The details of the immunohistochemical staining method using the monoclonal antibody of the present invention and the diagnostic method using the cytoplasmic fluorescent antibody method are as follows. For immunohistochemistry, a Vectstain ABC kit (Vector, Burlingame CA, USA) can be used. The staining procedure involved 30% H in order to block endogenous peroxidase on the plate with tissue sections. ₂ O ₂ And methyl alcohol mixed at a ratio of 1: 100 for 20 minutes. Next, the cells are washed three times with PBS, and normal horse serum diluted 10-fold with PBS containing 1% BSA is added to block nonspecific reactions. After incubation for 20 minutes at room temperature, the monoclonal antibody is added. As the monoclonal antibody, one diluted from 2 μg / ml to 10 μg / ml with PBS containing 1% BSA is used. After leaving it at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. overnight, it is washed three times with PBS. After washing three times with PBS, a biotinylated equine anti-mouse antibody is diluted 1000-fold with PBS containing 1% BSA and added. After leaving at room temperature for 30 minutes, it is washed three times with PBS. Next, the avidin-biotin conjugate to which peroxidase is bound is added. The concentration is adjusted at least 30 minutes before adding a 1000-fold dilution in PBS. After reacting at room temperature for 30 minutes, washing is performed three times with PBS. For the color development, 20 mg of diaminobenzidine hydrochloride is dissolved in 25 ml of 0.2 M trisaminomethane and 19.2 ml of 0.2 N hydrochloric acid to make 100 ml by adding distilled water. Further H ₂ O ₂ At a rate of about 0.03 ml. The plate is reacted with the above solution for 7 minutes. Thereafter, the coloring is stopped. Nuclear staining is performed with hematoxylin.
[0018]
Cytoplasmic fluorescent antibody method 1-5 × 10 ⁴ Are fixed on a slide glass with 95% acetone for 10 minutes, and those stored at −70 ° C. are used as target cells. The reaction is performed at 4 ° C. or 25 ° C. for 30 minutes using 25 μl of the hybridoma culture supernatant as the primary antibody. After washing with PBS, a 20- to 40-fold diluted fluorescent-labeled anti-mouse rabbit antibody is reacted at 25 ° C. for 30 minutes as a secondary antibody. The reaction is determined by the presence or absence of fluorescence under a fluorescence microscope.
[0019]
The method for discriminating a malignant tumor according to the present invention comprises treating a tissue sample section or a cell suspension prepared by an ordinary method with the antibody of the present invention, and observing the presence or absence of antibody binding by microscopy, and the distribution thereof. It is determined whether the tumor is a malignant tumor. At this time, morphological observation is facilitated by using an antibody labeled with a dye such as rhodamine or Texas Red or a fluorescent dye such as FITC. Alternatively, an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase or a labeled antibody such as biotin may be used, and after the antibody treatment, special staining using the enzyme reaction may be performed. At this time, nuclear staining may be performed to facilitate observation. When such a labeled antibody is not used, immunohistochemical observation may be performed in which the antibody is treated with an anti-IgG antibody and then subjected to special staining by a peroxidase / anti-peroxidase method or the like. When observing the presence or absence of antibody binding by an electron microscope, it is preferable to use a ferritin-labeled antibody. In this case, a microscopic sample is prepared according to a normal preparation procedure for an electron microscope sample.
[0020]
Construction of a reagent kit for discriminating malignant / benign from human thyroid tumor, which comprises the monoclonal antibody of the present invention or a fragment thereof as a main component, is also a preferred embodiment of the present invention. In that case, if necessary, select appropriate reagents according to the measurement method from each reagent such as a coloring reagent, a reaction stopping reagent, a standard antigen reagent, and a sample pretreatment reagent, and attach them to the kit of the present invention. do it.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[Example 1] Preparation of monoclonal antibody of the present invention
(1) Preparation of immunogenic protein
SN-PCR protein using primer pairs [5′-atgtcgaccatggagcactctcactcgccaagag-3 ′ (SEQ ID NO: 4) and 5′-tgtccatctttcttcaacacatactctactat-3 ′ (SEQ ID NO: 5)] from RNA collected from human thyroid monolayer cultured cells. Was cloned (SEQ ID NO: 3). Then, using the obtained full-length cDNA as a template, NSN of KSN by PCR using a primer pair [5′-cgcggatccatggagctttttgcggactatc-3 ′ (SEQ ID NO: 6) and 5′-ccgctcgagtcgttactcatttttagtagagt-3tag (SEQ ID NO: 7)], NSN of the protein by KPCR A cDNA having a BamHI site at the end and an XhoI site at the C end was prepared. Using the HindIII site in the 397/398 amino acid coding portion of this cDNA, the 1-397 amino acid coding portion was excised from full length hSNK with BamHI-HindIII and inserted into the GST / pGEX4T-1 vector. This cDNA was transformed into BL21, and a fusion protein of glutathione S-transferase (tag protein) obtained from E. coli and hSNK protein [hereinafter, GST? SNK (BH)] was purified with glutathione-Sepharose beads and used as an immunogen for preparing monoclonal antibodies in the following.
[0022]
(2) Immunization of mice
150 μl of incomplete adjuvant (SIGMA) was added to 50 μg of GST-SNK (BH) prepared in the above (1), and the mixture was vortexed at room temperature for 5 minutes to form an emulsion. This was injected subcutaneously into an 8-week-old BALB / C mouse (♀) to perform a first immunization. Two weeks later this time GST? 200 μl of complete adjuvant (SIGMA) was added to 100 μg of SNK (BH), and the mixture was vortexed and emulsified in the same manner and injected subcutaneously into the same mouse. The following week, approximately 500 μl of blood was collected from the tail of this immunized mouse. After incubating at 37 ° C. for 45 minutes to inactivate the complement, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes (4 ° C.), and the serum of the supernatant was separated. This serum was diluted 500-fold, and it was confirmed by western blotting using an anti-myc antibody as a positive control whether or not myc-SNK strongly expressed in COS-7 cells could be recognized, but no significant band was detected yet. Since it was considered that the antibody titer was not sufficiently increased, immunization was performed once every two weeks. A total of seven immunizations were performed from the first time, blood was collected the following week, and Western blotting was performed in the same manner. As a result, a significant band was detected. Therefore, the sensitized B cells were collected from the spleen of this mouse and fused with NS-1 cells to prepare a hybridoma.
[0023]
(3) Preparation of hybridoma producing anti-hSNK protein monoclonal antibody
First, feeder cells for assisting hybridoma survival and proliferation were prepared as follows (prepared one to two days before cell fusion treatment). That is, first, 7 ml (1 drop per well) is put into a 96-well flat bottom plate, so that 7 × 12 ml of 1 × HAT / 20% FCS-RPMI medium was prepared. On the other hand, 6 to 8 BALB / c mice (♀), 4 to 8 weeks old, were prepared. PBS was taken in a syringe and 6 ml was intraperitoneally injected. The abdomen was carefully tapped with the needle inserted, and lymphocytes in the abdominal cavity were sufficiently leached into PBS. Next, the PBS was collected with care not to inhale fat or damage the intestinal tract. The collected PBS was collected in a 50 ml centrifuge tube, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, the supernatant was aspirated, and the pellet was tapped. The cells were washed once with 30 ml of PBS. After washing, the remaining pellet was tapped, and then suspended in 1 × HAT / 20% FCS-RPMI medium. The obtained suspension was dispensed drop by drop into a well of a 96-well plate to obtain a feeder cell preparation plate.
[0024]
On the other hand, myeloma cell NS-1 was prepared as follows. NS-1 cells were previously cultured in a 10% FCS-RPMI medium in the presence of 10 to 20 μg / ml of 8-azaguanine to prevent the acquisition of HGPRT activity due to reversion. The cells were cultured in a 10% FCS-RPMI medium so that the logarithmic growth phase was reached on the day of the fusion treatment. The cells in the incubator were detached and collected in a 50 ml centrifuge tube. After centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was aspirated, the pellet was tapped. After washing the cells once, they were suspended in 5 ml of RPMI, and 0.1 to 1 × 10 ⁸ The cell number was confirmed to be cells / ml, and the myeloma cells NS-1 thus obtained were used for cell fusion.
[0025]
In addition, B cells were prepared as follows. Three to four days before the fusion treatment, 150 μg of the soluble immunogenic protein was injected into the venous sinus or peritoneal cavity of the sensitized mouse obtained in the above (2) in order to enhance the antibody production ability. The spleen was removed from the immunized mouse and transferred to a 6 cm dish containing 5 ml of RPMI. In the dish, the spleen was loosened as finely as possible with two needles. Only the supernatant was collected in a 15 ml centrifuge tube. 5 ml of RPMI (plain) was added, and the remaining cells were similarly collected. After centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was aspirated, the pellet was tapped. After washing once with RPMI, it was suspended in 5 ml of RPMI. To 10 μl of the obtained suspension, 40 μl of RPMI was added (5-fold dilution), and the cell number was 1 × 10 6 ⁸ It was confirmed that the number of cells / ml or more was present.
[0026]
Next, cell fusion treatment was performed as follows. 0.5 ml of 50% PEG / PBS, 1 ml of 20% FCS-RPMI, and 9 ml of 20% FCS-RPMI were each placed in a 15 ml tube and warmed at 37 ° C. in advance. NS-1 cells were taken out such that NS-1 cells: B cells = 1: 10 and placed in a tube containing B cells. After up / down and mixing well, RPMI was added to the entire tube and washed. 0.5 ml of 50% PEG / PBS was taken into the long pasture pipette and slowly added over 90 seconds. At this time, they were mixed so that the pellets were sufficiently loosened. 1 ml of 20% FCS-RPMI was similarly added over 60 seconds. 9 ml of 20% FCS-RPMI was added slowly over 4 minutes. After washing, the cells were suspended in 20% FCS-RPMI. The obtained suspension was dropped on a plate on which the feeder cells had been spread. Three to four days later, 2 × HAT 20% FCS-RPMI was added dropwise. One to two weeks after the fusion treatment, cell supernatants of the wells forming colonies were collected, and ELISA was repeated several times. As a result, a very strong positive result was obtained here. 2-7-4 (named αSNK2-7-4) was selected.
[0027]
[Example 2] Discrimination between benign / malignant thyroid tumors using the monoclonal antibody of the present invention
As in the case of checking the antibody titer of the serum (polyclonal antibody), it was confirmed by western blotting whether myc-SNK expressed in COS-7 could be recognized. At this time, this clone No. It was confirmed that 2-7-4 can also recognize endogenous SNK. Therefore, this clone was cultured, and it was examined whether it could be used for other purposes.
[0028]
The culture solution of the cultured cells was collected and reached 50 ml, and 200 μl of anti-mouse IgG beads (1: 1) was added thereto, followed by incubating overnight at 4 ° C. to prepare anti-hSNK antibody beads. Is this myc? It was mixed with a cell lysate of COS-7 in which SNK was strongly expressed, and incubated at 4 ° C. for 90 minutes. After washing the Beads sufficiently, the proteins were separated by SDS-PAGE and detected with an anti-myc antibody. Based on the recognition of SNK, it was concluded that this antibody could be used for immunoprecipitation. Therefore, in order to obtain a higher concentration of the antibody, the hybridoma was injected into the abdominal cavity of the mouse and collected as ascites. Four 10 cm dishes (1 × 10 ⁵ ) Were collected, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, and the pellet was suspended in 500 μl of PBS and injected intraperitoneally into BALB / c mice. A few weeks later, the hybridomas survived, and when the ascites became sufficient, the mice were sacrificed and the ascites was collected. When the ascites was diluted 1000 times and subjected to Western blot, the same result as that of the supernatant of the cultured cells was obtained. Therefore, the anti-hSNK antibody was also present in the ascites, and the Western blot and immunoprecipitation (IP: It was determined that it could be used for Immuno-preciitation.
[0029]
By the way, hSNK is extremely unstable in the cells, and can hardly be confirmed by Western blotting. By adding LLnL, which is a Protesome inhibitor, it is possible to detect for the first time. The obtained ascites was diluted 100-fold and subjected to fluorescent immunostaining. The cytoplasm was stained with LLnL-treated COS-7 and NPA (thyroid cancer cell line), but untreated cells were not stained. Was. This result was consistent with the result of Western blot. The ascites was diluted 200-fold, and this was used as a primary antibody. Tissue staining of various thyroid cancers was performed by the ABC method. The following findings were obtained.
[0030]
Normal thyroid follicle cells generally do not show hSNK expression, but only a small portion of the cells stain the nucleus (FIG. 1). In Graves' disease and adenomatous hyperplastic tissue, the expression was increased throughout, and the expression was particularly localized in the nucleus (FIGS. 2 and 3). In benign adenomas (Follicular adenomas), as in Graves 'disease, localization was observed in the nucleus, cytoplasmic expression was low, and the overall expression level was further increased as compared to Graves' disease (FIG. 4). On the other hand, in follicular adenocarcinoma (Follicular carcinoma), hSNK expression came to be observed in the cytoplasm, and conversely, the staining of the nucleus was reduced, and the nucleus and cytoplasm were stained in many cancer cells (FIG. 5). In papillary carcinoma, papillary carcinoma did not further stain the nucleus, and the proportion of cells stained only in the cytoplasm increased (FIGS. 6 and 7). In anaplastic carcinoma (anaplastic carcinoma), the staining of the nucleus similarly deteriorated, and the nucleus and the entire cytoplasm were stained. However, chromosomes presumed to be in the mitotic phase were partially stained, and the expression of this SNK was It was suggested that there might be some relationship with the period (FIG. 8). From the above results, it was found that the monoclonal antibody against the human SNK protein of the present invention can be applied to discrimination of thyroid cancer.
[0031]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention treats a tumor tissue sample with an antibody against human SNK protein and morphologically observes the binding state of the antibody, and is useful for discriminating malignant / benign tumors in the thyroid gland. According to the present invention, a malignant / benign discrimination kit for thyroid tumor is provided.
[0032]
[Sequence list]

[0033]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 4: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 5: synthetic DNA
SEQ ID NO: 6: synthetic DNA
SEQ ID NO: 7: synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing the results of immunohistochemical staining of normal thyroid follicle cells with the antibody of the present invention.
FIG. 2 is a photograph showing the results of immunohistochemical staining of Gob's goiter of Graves' disease with the antibody of the present invention.
FIG. 3 is a photograph showing the results of immunohistological staining of goiter-like hyperplastic tissue with the antibody of the present invention.
FIG. 4 is a photograph showing the results of immunohistological staining of a benign adenoma (Follicular adenoma) with the antibody of the present invention.
FIG. 5 is a photograph showing the result of immunohistochemical staining of follicular carcinoma with the antibody of the present invention.
FIG. 6 is a photograph showing the results of immunohistological staining of papillary carcinoma with the antibody of the present invention.
FIG. 7 is a photograph showing the results of immunohistological staining of papillary carcinoma with the antibody of the present invention.
FIG. 8 is a photograph showing the results of immunohistological staining of undifferentiated cancer (Anaplastic carcinoma) with the antibody of the present invention.

Claims

A monoclonal antibody or a fragment thereof that binds to human SNK protein.

A monoclonal antibody or a fragment thereof that binds to a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.

The antibody or fragment thereof according to claim 1, wherein a fusion protein of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and a tag protein is obtained as an immunogen.

The antibody or fragment thereof according to claim 3, wherein the tag protein is glutathione S-transferase.

The monoclonal antibody or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 4, which is obtained from a hybridoma deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the Accession No. FERM @ P-18855.

2. A spleen cell of a mammal immunized with a human SNK protein and a cell capable of self-proliferation derived from an animal of the same or different species as the mammal, and obtained by cloning the fused cell. A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5.

The hybridoma according to claim 6, wherein the hybridoma has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the accession number FERM @ P-18855.

A method for producing a monoclonal antibody, comprising culturing the hybridoma according to claim 6 or 7, and collecting the monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5 from a culture supernatant.

Malignant / benign discrimination of a human thyroid tumor characterized by discriminating malignant / benign of the subject's thyroid tumor using the distribution state of human SNK protein present in human thyroid tumor cells collected from the subject as an index Method.

The method according to claim 9, wherein the distribution state of the human SNK protein present in the human thyroid tumor cells is examined by an immunohistological staining method using the monoclonal antibody or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 5. A method for distinguishing between malignant and benign human thyroid tumors.

A reagent kit for discriminating malignant / benign human thyroid tumors, comprising the monoclonal antibody or a fragment thereof according to any one of claims 1 to 5.