【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコラーゲン産生促進剤、詳しくは表皮基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ 型コラーゲンの産生促進剤に関する。さらには、基底膜構造を良い状態に保つことによって、老化防止効果を奏する基底膜ケア用組成物を提供することに関する。皮膚基底膜ケア用組成物とは皮膚基底膜をケアすることによって皮膚のシワ形成を抑制し、皮膚のハリや弾力を維持し、若々しい肌の状態を維持する皮膚外用剤である。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚の構造は大きく分けて角層、表皮、基底膜、真皮、皮下組織からなる。基底膜は表皮と真皮の境界部に存在し、その機能は、多岐にわたり、表皮の真皮への接着、表皮の極性の決定、表皮の分化・増殖の制御、さらには真皮の細胞が産生する因子や血成分由来の栄養供給の制御に関与している。そのため、表皮基底膜は皮膚の構造、恒常性の維持にとってきわめて重要な役割を果たしている。この表皮基底膜は、皮膚老化に伴い多重化、断裂などの構造異常を示すことが報告されている（Ｌａｖｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９７９ ７３： ５９−６６）。したがって表皮基底膜の構造変化が、しわ、たるみなどの老徴の発現、老化に伴う皮膚機能低下の一因となっていると考えられている。実際、皮膚基底膜構造を詳細に観察すると、２０代後半から３０代前にかけて基底膜ダメージが高頻度に観察されるようになり、皮膚老化の誘導に重要な役割を示している （ＩＦＳＣＣ Ｍａｇａｚｉｎｅ， ２０００ ４（４）：１５−２３）。したがって、表皮基底膜の構造を良い状態に保つことが、皮膚の健康、将来の老化を防止するという点からも重要であることより、新たなスキンケアとして皮膚基底膜ケアの重要性が提唱されている。
【０００３】
基底膜の主要な構成成分にはラミニン５、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ 型コラーゲンなどがある。このうちラミニン５については、本発明者らが既に着目しており、ラミニン５の産生能を高める薬剤として、大豆由来の調製物やリゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジン酸等を見出した（特開平１１−３４３２２６号、特開２０００−２２６３０８号公報）。
【０００４】
本発明は、基底膜ケアをさらに進歩させるため、ラミニン５とともに、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ 型コラーゲンに着目したものである。
【０００５】
ＩＶ型コラーゲンは基底膜の骨格を形成し、ナイトジェンを介してラミニン複合体と相互作用している。ＶＩＩ 型コラーゲンは、基底膜を真皮につなぎとめる働きをし、皮膚構造を強固にしている。詳しくは、ＶＩＩ 型コラーゲンが形成するアンカリング線維が基底膜のラミナデンサから発し、真皮中のコラーゲン線維（Ｉ型、ＩＩＩ 型、Ｖ型コラーゲンからなる）と相互作用し、再度のラミナデンサに結合することによって、基底膜と真皮の結合を強固なものにしている。
【０００６】
ＩＶ型コラーゲンについては、加齢と共に基底膜中で低下することが観察されている（Ｖａｚｑｕｅｚ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｔｕｒｉｔａｓ １９９６， ２５： ２０９−２１５）。したがって、表皮基底膜中のＩＶ型コラーゲンの発現促進は皮膚老化の防止において重要な役割を担うと考えられる。
【０００７】
また、ＶＩＩ 型コラーゲンにおいても、高齢者由来の皮膚線維芽細胞が若い人由来の皮膚線維芽細胞に比べて、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで産生能が低下するとの報告 （Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， １０２：２０５−２０９， １９９４）がある。また、ＶＩＩ 型コラーゲンにより構成されるアンカリング線維は、正常皮膚において生理的老化および光老化に伴い減少するとの報告もある（辻卓夫、日皮会誌 １０５：９６３−９７５， １９９５， Ｔｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， ８３：４４８−４５３， １９８４）。しわ改善効果についてよく知られているレチノイン酸をＵＶ傷害皮膚に連続塗布すると、アンカリング線維の数が有意に増加すると報告されていることより （Ｗｏｏｄｌｅｙ， ＪＡＭＡ， ２６３：３０５７−３０５９， １９９０）、アンカリング線維の増加はしわ等の老化現象の改善に関与している可能性が示唆されている。
【０００８】
以上のことから、基底膜骨格を形成するＩＶ型コラーゲン、表皮と真皮を結合させているアンカリング線維の主構成成分であるＶＩＩ 型コラーゲンの産生を促進することは、若齢時のような健康で若々しい皮膚を維持するために重要な成分であると考えられる。
【０００９】
ＩＶ型およびＶＩＩ 型コラーゲン産生制御因子のスクリーニング方法については、本発明者らが、簡易スクリーニング法を開発している（特願２００１−６３７４９）。この方法では、ＩＶ型およびＶＩＩ 型コラーゲン産生を促進する薬剤をスクリーニングすることが可能となっている。
【００１０】
これまで、コラーゲン産生の促進剤に関して検討されてきているが、これらの検討は、すべて対象を真皮の主要構成成分であり、かつ、線維性のコラーゲンであるＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンであり、同じコラーゲンとして分類される本発明が対象とするＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンとは、その分子構造、遺伝子、その産生制御が全く異なっている。事実、Ｉ、ＩＩＩ型コラーゲンは表皮ケラチノサイトでは産生されないが、ＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンはケラチノサイトで産生されるコラーゲンである。すなわち、それぞれのコラーゲンの産生制御機構は異なっており、過去にコラーゲン産生促進作用を示すと報告されたものでも、ＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン産生効果について検討したが、ほとんどのものが無効であった。したがって、ここで述べるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進剤は、特異的なスクリーング法を用いてはじめて見出されたものである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、皮膚におけるＩＶ型およびＶＩＩ 型コラーゲンの産生を促進することで、皮膚基底膜構造の正常化または機能・構造の維持を図る基底膜ケア薬剤を提供することにある。さらに、ラミニン５産生促進剤単独での基底膜ケアに追加して、ＩＶ型、ＶＩＩ 型コラーゲン産生促進剤を付加することによって基底膜ケア効果を高めることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは多種多様の物質についてＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ 型コラーゲンの産生能の増強作用について検討してきた。その結果、ＩＶ型コラーゲンとＶＩＩ 型コラーゲンを同時に産生促進する薬剤、ＩＶ型コラーゲンの産生を促進する薬剤、ＶＩＩ 型コラーゲンの産生を促進する薬剤を見出した。
【００１３】
ＩＶ型コラーゲンとＶＩＩ 型コラーゲンを同時に産生促進する薬剤としては、加水分解カゼイン、ブナの芽、可溶性卵殻膜、カッコン、西洋キヅタよりなる群から選ばれる植物及び動物由来の抽出物の一種または二種以上を有効成分とする皮膚外用剤が提供される。
【００１４】
ＩＶ型コラーゲンの産生促進剤としては、加水分解カゼイン、｛プレ（一般名 Ｐｕｌｅ、学名 Ａｌｓｔｏｎｉａ ｓｃｈｏｌａｒｉｓ、キョウチクトウ科の生薬）、ブナの芽、エリスリナ（一般名 ａｍａｓｓｉｓａ、学名 ｅｒｙｔｒｉｎａ ｓｐ．、マメ科の生薬）、可溶性卵殻膜、カッコン、西洋キヅタよりなる群から選ばれる植物及び動物由来の抽出物の一種または二種以上を有効成分とする皮膚外用剤が提供される。
【００１５】
ＶＩＩ型コラーゲンの産生促進剤としては、ブナの芽、加水分解カゼイン、カッコン、可溶性卵殻膜、西洋キヅタよりなる群から選ばれる植物及び動物の抽出物の一種または二種以上を有効成分とする皮膚外用剤が提供される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の、ＩＶ型コラーゲンおよびＶＩＩ 型コラーゲンの産生促進効果がある基底膜ケア用組成物に用いる有効成分は具体的には以下のとおりである。
【００１７】
「加水分解カゼイン」とは、カゼインタンパクを加水分解して得れらる薬剤である。本発明で用いられる「加水分解カゼイン」は市販のものであってもよく、例えば牛乳カゼインタンパクを加水分解して製造されるプロモイスミルク（成和化成株式会社製商品名）が挙げられる。
【００１８】
「プレ（Ｐｕｌｅ）」とは、キョウチクトウ科 Ａｌｓｔｏｎｉａ ｓｃｈｏｌａｒｉｓ．であり、東南アジア原産の常緑樹である。本発明に用いられる「プレエキス」には、好ましくは樹皮から抽出したエキスを用いる。
【００１９】
「ブナの芽」とは、ブナ科ブナ属植物の木の芽である。別名シロブナ、ホンブナ、ソバグリ等の名称で呼ばれるブナ科ブナ属ブナ（Ｆａｇｕｓ ｃｒｅｎａｔａ Ｂｌｕｍｅ）、同科同属クロブナ（Ｆａｇｕｓ ｊａｐｏｎｉｋａ Ｍａｘｉｍ）、同科同属アメリカブナ（Ｆａｇｕｓ ｇｒａｎｄｉｆｏｌｉａ）、同科同属ヨーロッパブナ（Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ Ｌ．）、同科同属シダレブナ（Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ Ｌ．ｖａｒ． ｐｅｎｄｕｌａ）、同科同属ムラサキブナ（Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ Ｌ．ｖａｒ． ｐｕｒｐｕｒｅａ）、または同科同属オリエントブナ（Ｆａｇｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓＬｉｐｓｋｙ）等の芽を、１種または２種以上を混合したものから抽出して「ブナの芽エキス」が得られる。本発明に用いられるブナ属植物の木の芽は、芽の部分であればその有効性が認められるが、好ましくは幼芽を用いた方が有効性は高い。本発明で用いられる「ブナの芽エキス」は市販のものであってもよく、例えばＧＡＴＵＬＩＮＥ ＲＣ（池田物産株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２０】
「エリスリナ」とは、マメ科 ｅｒｙｔｒｉｎａ ｓｐ．であり、高原、湿地などに自生する植物である。本発明に用いられる「エリスリナエキス」には、好ましくは葉から抽出したエキスを用いる。
【００２１】
「可溶性卵殻膜」とは、鶏の卵の卵殻膜を加水分解抽出して得られる可溶性卵殻膜ケラチンを含む薬剤である。本発明で用いられる「可溶性卵殻膜」は市販のものであってもよく、例えば卵殻膜ケラチン加水分解物（キューピー株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２２】
「カッコン」とは、マメ科 クズ「Ｐｕｅｒａｒｉａ ｈｉｒｓｕｔａ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ」（またはマメ科 Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ Ｏｈｗｉ、マメ科 Ｐｕｅｒａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａｎａ Ｂｅｎｔｈ．）である。この貯蔵根を細切断し乾燥した後、「カッコンエキス」を得る。漢方では下熱、鎮痙に効果があるとされている。また、ラミニン５の産生促進効果があることも確認されている（特願平２００１−２５０２９５）。本発明で用いられる「カッコンエキス」は市販のものであってもよく、例えばファルコレックス カッコン Ｂ（一丸ファルコス株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２３】
「西洋キヅタ」ウコギ科 Ｈｅｄｅｒａ ｈｅｌｉｘ （一般名 アイビー）であり、常緑つる性の低木である。本発明に用いられる「西洋キヅタエキス」には、好ましくは葉から抽出したエキスを用いる。また本発明で用いられる「西洋キヅタエキス」は市販のものであってもよく、例えばコスメレン・セイヨウキズタエキス（日光ケミカルズ株式会社製商品名）が挙げられる。
【００２４】
上記植物のエキスは、通常公知の方法により、それぞれの原料植物から、抽出することにより製造したものである。すなわち、原料植物を、生のまま、又は必要により乾燥した後、そのまま若しくは粉砕して、抽出溶媒と共に浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得られる。この際、用いられる抽出溶媒は、通常、植物抽出物の抽出用に用いられている溶媒であれば何でもよい。例えば、熱水、低級アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、これらのアルコール類の含水物、炭化水素系溶媒（ｎ−ヘキサン、トルエン等）、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、酢酸エチルエステル、エーテル等、あるいはこれらの混合物等の有機溶媒を挙げることができる。本発明における抽出物の配合量は、外用剤全量中、乾燥物として０．０００２〜２０．０重量％、好ましくは０．００１〜１．０重量％である。０．０００２重量％未満であると、本発明でいう効果が十分に発揮されず、２０．０重量％を超えると製剤化が難しいので好ましくない。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２６】
本発明皮膚外用剤が採り得る剤型や用途は、特に限定されるものではなく、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系等の剤型で用いることができる。また、本発明の皮膚外用剤の用途は、化粧水，乳液，クリーム，パック等の基礎化粧料、口紅，アイシャドー，ファンデーション等のメーキャップ化粧料、シャンプー，リンス，ヘアトニック等の頭髪化粧料、ボディー化粧料、芳香化粧料、洗浄料等の他、軟膏等の形態で用いる医薬品や医薬部外品等、多岐にわたり用いることが可能である。
【００２７】
【実施例】
以下、具体例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
ＩＶ型、ＶＩＩ 型コラーゲンの産生能の測定試験
（１） ヒト線維芽細胞の培養
ヒト線維芽細胞は新生児包皮より単離し、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）で培養した。トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理によって接着細胞を浮遊させ、ろ過して均一な細胞懸濁液を得た。遠心分離によって細胞を集め２５０μＭ （アスコルビン酸グルコシド）ＡＡ２Ｇ−０．２５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう懸濁した（ここでは、アスコルビン酸グルコシドを用いたが、アスコルビン酸に関しては、アスコルビン酸そのもの、アスコルビン酸リン酸エステルなどの誘導体も使用可能である）。細胞懸濁液０．５ｍＬずつ２４穴プレートに播種し、細胞が接着した後、植物、動物由来の抽出物を添加した。３７℃にて４８時間培養した後、培養上清を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに得た。−２０℃に保存し、後日コラーゲン濃度を測定した。細胞内および固相に残存したコラーゲンは、培養上清回収後のプレートに界面活性剤を含むトリス塩酸緩衝液を添加し、凍結後、再溶解して回収した。
【００２８】
（２） サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンの測定
培養上清、細胞層に存在するＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンは、本発明者らが開発したサンドイッチＥＬＩＳＡ法（特願２００１−６３７４９）によって測定した。ＶＩＩ 型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンに対する抗体は精製ＶＩＩ 型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンをそれぞれ抗原として、モノクローナル抗体の場合はマウス等を感作動物として用い、ポリクローナル抗体の場合はウサギ等を感作動物として用い、常法（Ｌｕｎｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８６， ２６１：９０４２−９０４８； Ｈｕｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， １０７： ２６２３−２６３４）に従って作製されたものである。
本実施例において使用した抗体は以下の通りである：
ＶＩＩ 型コラーゲン特異的抗体
モノクローナル抗体ＮＰ−１８５；
モノクローナル抗体ＮＰ−３２；
ＩＶ型コラーゲン特異的抗体
モノクローナル抗体ＪＫ−１９９ ；
ポリクローナル抗体ａｎｔｉ ｔｙｐｅＩＶ−Ｃ
【００２９】
詳しくは、固層抗体にモノクローナル抗体 （ＪＫ１９９， ＮＰ１８５）、ニ次抗体にビオチン化した抗体（ｂ−ａｎｔｉ ｔｙｐｅＩＶ−Ｃ、ｂ−ＮＰ３２）を用いた。抗体でコーティーングした９６穴プレートにサンプルを入れて３７℃で２時間結合反応させたのちに洗浄した。その後あらかじめアビジン−パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させたビオチン化抗体を３７℃１時間反応させた。洗浄後、ＰＯＤの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を加え約３０分間反応させた。１Ｍ 硫酸溶液で反応を止めた後ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３０】
ＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲンの産生量は、培地中に遊離された量と細胞層に残った量との総和をもって示した。
【００３１】
（３） 結果
動物・植物由来の抽出物の添加によるＩＶ型コラーゲン産生促進効果を下記表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
ＩＶ型コラーゲン産生においては「加水分解カゼイン」、「プレエキス」、「ブナの芽エキス」「エリスリナエキス」を加えて培養することによって、明らかにＩＶ型コラーゲン産生が促進された。また、「可溶性卵殻膜」、「カッコンエキス」、「西洋キヅタエキス」を加えた場合もＩＶ型コラーゲン産生が促進された。
【００３５】
ＶＩＩ 型コラーゲンの産生においては「ブナの芽エキス」、「加水分解カゼイン」を加えて培養することによって、明らかにＶＩＩ 型コラーゲン産生が促進された。「カッコンエキス」、「可溶性卵殻膜」、「西洋キヅタエキス」を加えた場合も、ＶＩＩ 型コラーゲン産生が促進された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の基底膜ケア用組成物は、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品、化粧品を含む）等に配合することにより、表皮基底膜の主要構成成分であるＶＩＩ 型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンの産生を促進する。ＶＩＩ 型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンの産生を促進にすることによって基底膜をケアし、優れた老化防止効果を奏するものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a collagen production promoter, and more particularly to a production promoter for type IV collagen and type VII collagen, which are main components of the epidermal basement membrane. Furthermore, it is related with providing the composition for basement membrane care which shows an anti-aging effect by keeping a basement membrane structure in a favorable state. The skin basement membrane care composition is an external preparation for skin that suppresses wrinkle formation of the skin by caring for the skin basement membrane, maintains the firmness and elasticity of the skin, and maintains a youthful skin condition.
[0002]
[Prior art]
Skin structure is roughly divided into stratum corneum, epidermis, basement membrane, dermis, and subcutaneous tissue. The basement membrane exists at the boundary between the epidermis and the dermis, and its functions are diverse, factors such as adhesion of the epidermis to the dermis, determination of the polarity of the epidermis, control of epidermal differentiation and proliferation, and factors produced by dermal cells It is involved in the control of nutrient supply derived from blood and blood components. Therefore, the epidermal basement membrane plays an extremely important role in maintaining the structure and homeostasis of the skin. It has been reported that this epidermal basement membrane shows structural abnormalities such as multiplexing and tearing with skin aging (Lavker et al., J. Invest. Dermatol. 1979 73: 59-66). Therefore, it is considered that the structural change of the epidermal basement membrane contributes to the appearance of sensations such as wrinkles and sagging, and to the decrease in skin function accompanying aging. In fact, when the skin basement membrane structure is observed in detail, basement membrane damage is frequently observed from the late 20s to the 30s, indicating an important role in the induction of skin aging (IFSCC Magazine, 2000 4 (4): 15-23). Therefore, it is important to keep the structure of the epidermal basement membrane in a good state from the viewpoint of preventing skin health and future aging. Therefore, the importance of skin basement membrane care has been proposed as a new skin care. Yes.
[0003]
Major components of the basement membrane include laminin 5, type IV collagen, type VII collagen and the like. Among these, about the laminin 5, the present inventors have already paid attention, and discovered the preparation derived from a soybean, a lysophosphatidylcholine, a lysophosphatidic acid, etc. as a chemical | medical agent which raises the productivity of a laminin 5 ( JP-A-11-343226, JP-A-2000-226308).
[0004]
In order to further advance the basement membrane care, the present invention focuses on type IV collagen and type VII collagen, which are main components of the basement membrane, together with laminin 5.
[0005]
Type IV collagen forms the basement membrane skeleton and interacts with the laminin complex via nitrogen. Type VII collagen functions to connect the basement membrane to the dermis and strengthens the skin structure. Specifically, anchoring fibers formed by type VII collagen originate from the lamina densa of the basement membrane, interact with collagen fibers in the dermis (consisting of type I, type III, type V collagen), and bind to the lamina densa again. This strengthens the bond between the basement membrane and the dermis.
[0006]
It has been observed that type IV collagen decreases in the basement membrane with aging (Vazquez F et al., Maturatas 1996, 25: 209-215). Therefore, the promotion of type IV collagen expression in the epidermis basement membrane is considered to play an important role in preventing skin aging.
[0007]
Also, in the case of type VII collagen, it has been reported that the ability of dermal fibroblasts derived from elderly people to be reduced at the protein level and mRNA level compared to dermal fibroblasts derived from young people (Chen et al., J. Biol. Invest. Dermatol., 102: 205-209, 1994). There is also a report that anchoring fibers composed of type VII collagen decrease with physiological aging and photoaging in normal skin (Takuo Tsuji, Nisshinkai 105: 963-975, 1995, Tidman et al. J. Invest Dermatol., 83: 448-453, 1984). It has been reported that the number of anchoring fibers is significantly increased when retinoic acid, which is well known for its wrinkle-improving effect, is continuously applied to UV-injured skin (Woodley, JAMA, 263: 3057-3059, 1990), It is suggested that the increase in anchoring fibers may be involved in the improvement of aging phenomena such as wrinkles.
[0008]
From the above, promoting the production of type IV collagen, which forms the basement membrane skeleton, and type VII collagen, which is the main component of anchoring fibers that bind the epidermis and dermis, It is considered to be an important ingredient for maintaining a youthful skin.
[0009]
Regarding screening methods for type IV and type VII collagen production control factors, the present inventors have developed a simple screening method (Japanese Patent Application No. 2001-63749). This method makes it possible to screen for agents that promote type IV and type VII collagen production.
[0010]
So far, collagen production promoters have been studied, but these studies are all the main components of the dermis and type I or III collagen, which is a fibrous collagen, and the same. The type IV and type VII collagens targeted by the present invention classified as collagen are completely different in their molecular structure, gene, and production control. In fact, type I and type III collagens are not produced by epidermal keratinocytes, whereas type IV and type VII collagens are collagens produced by keratinocytes. That is, the production control mechanism of each collagen is different, and even though it has been reported to show collagen production promoting action in the past, the type IV and type VII collagen production effects were examined, but most of them were ineffective. . Therefore, the type IV and type VII collagen production promoters described here are first discovered using a specific screening method.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a basement membrane care drug that promotes the production of type IV and type VII collagen in the skin to normalize the skin basement membrane structure or maintain the function / structure. Furthermore, in addition to the basement membrane care with the laminin 5 production promoter alone, the basement membrane care effect is enhanced by adding type IV and type VII collagen production promoters.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have examined the enhancing action on the production ability of type IV collagen and type VII collagen for various substances. As a result, the present inventors have found an agent that promotes production of type IV collagen and type VII collagen simultaneously, an agent that promotes production of type IV collagen, and an agent that promotes production of type VII collagen.
[0013]
One or two kinds of plant- and animal-derived extracts selected from the group consisting of hydrolyzed casein, beech buds, soluble eggshell membranes, cascon, and western ivy are used as the agents that simultaneously promote the production of type IV collagen and type VII collagen. An external preparation for skin containing the above as an active ingredient is provided.
[0014]
Examples of the type IV collagen production promoter include hydrolyzed casein, {pre (generic name Pule, scientific name Alstonia scholaris), beech sprout, erythrina (generic name amasissa, scientific name erytrina sp., Legumes) ), An external preparation for skin containing, as an active ingredient, one or more of plant- and animal-derived extracts selected from the group consisting of soluble eggshell membranes, shellfish and western ivy.
[0015]
Skin that contains one or more plant and animal extracts selected from the group consisting of beech buds, hydrolyzed casein, cuckoo, soluble eggshell membranes and western ivy as active ingredients as type VII collagen production promoter An external preparation is provided.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The active ingredients used in the basement membrane care composition having the effect of promoting the production of type IV collagen and type VII collagen of the present invention are specifically as follows.
[0017]
“Hydrolyzed casein” is a drug obtained by hydrolyzing casein protein. “Hydrolyzed casein” used in the present invention may be a commercially available product, for example, promoted milk (trade name, manufactured by Seiwa Kasei Co., Ltd.) produced by hydrolyzing milk casein protein.
[0018]
“Pule” refers to the oleander family Alstonia scholaris. It is an evergreen tree native to Southeast Asia. As the “pre-extract” used in the present invention, an extract extracted from bark is preferably used.
[0019]
“Beech buds” are tree buds of the beech family. Also known as names such as Shirobuna, Honbuna, Sobaguri, etc. L.), Fagus sylvatica L. var. Pendula, Fagus sylvatica L. var. Purpura, 1 Or it extracts from what mixed 2 or more types, and a "beech bud extract" is obtained. The effectiveness of the buds of the beech genus plant used in the present invention is recognized as long as it is a bud part, but the use of young shoots is preferably more effective. The “beech bud extract” used in the present invention may be commercially available, and examples thereof include GATULINE RC (trade name, manufactured by Ikeda Bussan Co., Ltd.).
[0020]
“Erythrina” means leguminous erytrina sp. It is a plant that grows naturally on plateaus and wetlands. As the “erythrina extract” used in the present invention, an extract extracted from leaves is preferably used.
[0021]
“Soluble eggshell membrane” is a drug containing soluble eggshell membrane keratin obtained by hydrolytic extraction of eggshell membranes of chicken eggs. The “soluble eggshell membrane” used in the present invention may be commercially available, and examples thereof include eggshell membrane keratin hydrolyzate (trade name, manufactured by Kewpie Co., Ltd.).
[0022]
“Cakkon” is a leguminous sardine “Pueraria hirsuta Matsuura” (or Legaria lobata lobata Ohwi, Leguminosae Pueraria thumbergiana Benth.). After the storage root is cut into small pieces and dried, “Casscon extract” is obtained. Kampo is said to be effective for lower fever and spasm. It has also been confirmed that there is an effect of promoting production of laminin 5 (Japanese Patent Application No. 2001-250295). “Cakkon extract” used in the present invention may be a commercially available product, and examples thereof include Falco Rex Cakcon B (trade name, manufactured by Ichimaru Falcos Co., Ltd.).
[0023]
"Western ivy" Araceae Hedera helix (generic name: Ivy), an evergreen climbing shrub. The “Western Ivy extract” used in the present invention is preferably an extract extracted from leaves. The “Western Ivy Extract” used in the present invention may be a commercially available product, for example, Cosmelen / Kizo Kizuta Extract (trade name, manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.).
[0024]
The plant extract is produced by extraction from each raw plant by a generally known method. That is, the raw material plant is obtained as it is, or after drying if necessary, as it is or after being pulverized, immersed in an extraction solvent or heated to reflux, filtered and concentrated. In this case, the extraction solvent to be used may be any solvent as long as it is usually used for extraction of plant extracts. For example, hot water, lower alcohols (methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol, etc.), polyhydric alcohols (propylene glycol, 1,3-butylene glycol, etc.), hydrates of these alcohols, hydrocarbon solvents ( n-hexane, toluene, etc.), chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, acetic acid ethyl ester, ether, or a mixture thereof. The compounding amount of the extract in the present invention is 0.0002 to 20.0% by weight, preferably 0.001 to 1.0% by weight as a dry product in the total amount of the external preparation. If it is less than 0.0002% by weight, the effect referred to in the present invention is not sufficiently exhibited, and if it exceeds 20.0% by weight, it is difficult to make a preparation, which is not preferable.
[0025]
In addition to the above essential components, the external preparation for skin of the present invention is usually used for external preparations for skin such as cosmetics and pharmaceuticals, for example, whitening agents, moisturizers, antioxidants, oily components, ultraviolet absorbers, surfactants. Agents, thickeners, alcohols, powder components, colorants, aqueous components, water, various skin nutrients, and the like can be appropriately blended as necessary.
[0026]
The dosage form and application that the external preparation for skin of the present invention can take are not particularly limited, and for example, it can be used in dosage forms such as an aqueous solution system, a solubilization system, an emulsification system, and a powder dispersion system. In addition, the use of the external preparation for skin of the present invention includes basic cosmetics such as lotion, emulsion, cream and pack, makeup cosmetics such as lipstick, eye shadow and foundation, hair cosmetics such as shampoo, rinse and hair tonic, In addition to body cosmetics, aromatic cosmetics, cleaning agents, etc., they can be used in a wide variety of applications, such as pharmaceuticals and quasi drugs used in the form of ointments and the like.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to specific examples.
Measurement test of type IV and type VII collagen production ability (1) Culture of human fibroblasts Human fibroblasts were isolated from neonatal foreskin and Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS)) ). Adherent cells were suspended by trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) treatment and filtered to obtain a uniform cell suspension. Cells were collected by centrifugation and suspended in 250 μM (ascorbic acid glucoside) AA2G-0.25% FBS-DMEM to 2 × 10 5 cells / mL (in this case, ascorbic acid glucoside was used. Can also be used derivatives such as ascorbic acid itself and ascorbic acid phosphate ester). 0.5 mL of the cell suspension was seeded in a 24-well plate, and after the cells adhered, extracts derived from plants and animals were added. After culturing at 37 ° C. for 48 hours, the culture supernatant was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was obtained in a new tube. It preserve | saved at -20 degreeC and measured the collagen density | concentration at a later date. Collagen remaining in the cells and in the solid phase was collected by adding a Tris-HCl buffer containing a surfactant to the plate after collecting the culture supernatant, freezing, and re-dissolving.
[0028]
(2) Measurement of type IV and type VII collagen by sandwich ELISA method Culture supernatant, type IV and type VII collagen present in the cell layer are obtained by sandwich ELISA method developed by the present inventors (Japanese Patent Application No. 2001-63749). It was measured. For antibodies against type VII collagen and type IV collagen, purified VII collagen and type IV collagen are used as antigens, respectively, in the case of monoclonal antibodies, mice are used as sensitized animals, and in the case of polyclonal antibodies, rabbits are used as sensitized animals. , J. Biol. Chem. 1986, 261: 9042-9048; Hurle et al., J Cell Science 1994, 107: 2623-2634).
The antibodies used in this example are as follows:
Type VII collagen-specific antibody monoclonal antibody NP-185;
Monoclonal antibody NP-32;
Type IV collagen specific antibody monoclonal antibody JK-199;
Polyclonal antibody anti type IV-C
[0029]
Specifically, a monoclonal antibody (JK199, NP185) was used as the solid layer antibody, and a biotinylated antibody (b-antitype IV-C, b-NP32) was used as the secondary antibody. The sample was placed in a 96-well plate coated with an antibody, and the binding reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours, followed by washing. Thereafter, a biotinylated antibody to which avidin-peroxidase (POD) was bound in advance was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing, a tetramethylbenzidine (TMB) solution, which is a POD substrate, was added and allowed to react for about 30 minutes. After stopping the reaction with 1M sulfuric acid solution, the absorbance at 450 nm was measured using an ELISA plate reader.
[0030]
The production amounts of type IV and type VII collagen are shown as the sum of the amount released in the medium and the amount remaining in the cell layer.
[0031]
(3) Results Table 1 shows the effect of promoting the production of collagen type IV by the addition of extracts derived from animals and plants.
[0032]
[Table 1]
[0033]
[Table 2]
[0034]
In the production of type IV collagen, the production of type IV collagen was clearly promoted by adding “hydrolyzed casein”, “pre-extract”, “beech bud extract” and “erythrina extract”. In addition, the production of type IV collagen was also promoted when "soluble eggshell membranes", "caskong extract", and "western ivy extract" were added.
[0035]
In the production of type VII collagen, the production of type VII collagen was clearly promoted by adding “beech bud extract” and “hydrolyzed casein” and culturing. Addition of “Cakkon extract”, “soluble eggshell membrane”, and “Western ivy extract” also promoted type VII collagen production.
[0036]
【The invention's effect】
The composition for basement membrane care of the present invention is formulated into a skin external preparation (including pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics) and the like, thereby allowing the VII-type collagen and type-IV collagen, which are the main constituents of the epidermal basement membrane, to be incorporated. Promote production. By promoting production of type VII collagen and type IV collagen, the basement membrane is cared for and an excellent antiaging effect is exhibited.
