JP2004016144A

JP2004016144A - Transformed silkworm producing human collagen

Info

Publication number: JP2004016144A
Application number: JP2002177536A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Tomita; 冨田　正浩; Tsutomu Sato; 佐藤　勉; Takayasu Adachi; 安達　敬泰; Hiroto Munetsuna; 宗綱　洋人; Katsutoshi Yoshizato; 吉里　勝利; Toshiki Tamura; 田村　俊樹
Original assignee: Terumo Corp; Koken Co Ltd; National Institute of Agrobiological Sciences; Hiroshima Industrial Promotion Organization; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Terumo Corp; Koken Co Ltd; National Institute of Agrobiological Sciences; Japan Science and Technology Agency; Hiroshima Industrial Promotion Organization
Priority date: 2002-06-18
Filing date: 2002-06-18
Publication date: 2004-01-22

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a transformed silkworm producing a recombinant human collagen as a protein contained in a cocoon and to provide a method for producing the recombinant human collagen which the cocoon produces. <P>SOLUTION: The transformed silkworm producing the recombinant human collagen as a part of the protein in the cocoon or a silk gland has a polynucleotide encoding the human collagen in a genome DNA. The method for producing the human collagen comprises producing the human collagen from the transformed silkworm. A recombinant vector set is used for recombination and preparation of the transformed silkworm. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この出願の発明は、組換えヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、組換えヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコと、この形質転換カイコを作製するための組換えベクター、並びに組換えヒト・コラーゲンの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲンは細胞外基質を構成する代表的タンパク質であり、細胞の足場となって生体の構造を維持するといった機械的機能の他、細胞の増殖、分化、移動などを制御する様々な生理的機能を有している。そのためコラーゲンは生体の損傷を修復するためのバイオマテリアルとして（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．　１０，　４８５−４９１，　１９７０）、またある種の薬剤を徐放するためのキャリアーとして（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ３３，　３０７−３１５，　１９９５）、医療分野で広く利用されている。しかし、現在用いられているコラーゲンの大部分はウシやブタ等の動物組織由来のものであり、これらのコラーゲンをヒトに移植した場合、約３％の患者にアレルギー反応が生じることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６，　８７７−８８２，　１９８６；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１１，　１７６−１８０，　１９９０）。また、動物組織由来コラーゲンにおけるウイルスやプリオン等病原体混入の危険性は近年大きな問題となっている。そのため抗原性が無く、また病原体混入の危険性が無い組換え型ヒト・コラーゲンを産生するシステムが望まれている。そこで、この出願の発明者らの一部は、ヒト・コラーゲンをコードするｃＤＮＡを挿入した組換えウイルスを昆虫細胞に感染させることにより、ヒト生体内のものと同等な三重らせん構造を有する組換えヒト・コラーゲンを製造する方法を発明し、特許出願している（特開平８−２３９７９号公報）。また、哺乳動物細胞や酵母を用いてヒト・コラーゲンを製造する方法も考案されている（特表平７−５０１９３９公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、組換えヒト・コラーゲンを生産する方法として、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母を用いる方法等が考案されているが、昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いる方法では医療分野で用いることが可能なほどの高い生産量を上げることは難しい。また、酵母を用いる方法は、組換え産物が菌体内に産生されるため、組換えヒト・コラーゲンの精製は必ずしも容易ではない。
【０００４】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、高い生産性と精製の容易さを兼ね備えた組換えヒト・コラーゲン生産法と、そのための遺伝子工学材料を提供することを課題といている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する第１の発明として、ヒト・コラーゲンをコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡ内に有し、組換えヒト・コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコを提供する。
【０００６】
またこの出願は、第２の発明として、ヒト・コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡ内に有し、前記融合タンパク質を繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコを提供する。
【０００７】
なお、これら第１発明および第２発明の形質転換カイコには、カイコ成虫、幼虫、蛹および卵が含まれる。
【０００８】
これら第１発明および第２発明の形質転換カイコは、さらに、プロリン水酸化酵素αサブユニットおよびβサブユニットの少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡ内に有すること、そしてプロリン水酸化酵素αサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列を有することをそれぞれ好ましい態様としている。
【０００９】
この出願はさらに第３の発明として、前記第１発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒト・コラーゲンを単離、精製することを特徴とする組換えヒト・コラーゲンの製造方法を提供する。
【００１０】
また、第４の発明として、前記第２発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒト・コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離し、この融合タンパク質から組換えヒト・コラーゲンを分離、精製することを特徴とする組換えヒト・コラーゲンの製造方法を提供する。
【００１１】
また、第５の発明として、前記第２発明の形質転換カイコが産生する組換えヒト・コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を提供する。
【００１２】
この出願はさらにまた、第６の発明として、少なくとも以下の組換えベクター：
（１）　　昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれたヒト・コラーゲン発現カセットを有する組換えベクター；および
（２）　　トランスポゾンのトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクター
からなる組換えベクターセットを提供する。
【００１３】
この第６発明のベクターセットにおいては、さらに以下の組換えベクター：
（３）　　外来性のプロリン水酸化酵素αサブユニットおよびβサブユニットの少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクター
を含むこと、そしてプロリン水酸化酵素αサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列を有することをそれぞれ好ましい態様としている。
【００１４】
さらにこの第６発明のベクターセットにおいては、ヒト・コラーゲン発現カセットが、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒト・コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチド、またはカイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下に、カイコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒト・コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであることを具体的な態様としている。
【００１５】
この出願は、またさらに第７の発明として、配列番号２のアミノ酸配列を有する、カイコ由来のプロリン水酸化酵素αサブユニットを提供する。
【００１６】
またさらに、この出願は、第７発明のプロリン水酸化酵素αサブユニットをコードし、配列番号１の塩基配列を有するｃＤＮＡ断片を提供する。
【００１７】
以下、実施形態を示し、これらの発明についてさらに詳しく説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
コラーゲンには現在までにＩ型からＸＸＩ型までの２１種の異なった型のものが存在することが知られている。これらのコラーゲンはいずれも三つのサブユニット（α鎖）から形成される三量体分子で、その分子内に三重らせん構造をもつことが特徴である。コラーゲンの中には、先ず前駆体であるプロコラーゲンとして合成された後、成熟型のコラーゲン分子に変換されるものがある。例えばＩ、ＩＩ、ＩＩＩ型コラーゲン等の線維性コラーゲンは、その本体である三重らせん領域のアミノ末端側およびカルボキシル末端側に非三重らせん構造のアミノプロペプチドおよびカルボキシルプロペプチドを有したプロコラーゲンとして合成され、両方のプロペプチドが特異的なプロテアーゼにより切断された後、成熟したコラーゲンとなる。また、コラーゲンはその生合成過程で、プロリンの水酸化、リジンの水酸化、リジンおよび水酸化リジンの酸化（アルデヒド化）等を含む様々な翻訳後修飾を受ける。特にプロリン水酸化酵素によるプロリンの水酸化は、コラーゲンが生理的温度での安定性を獲得する上で非常に重要である。
【００１９】
この出願の発明が対象とするヒト・コラーゲンは、Ｉ型からＸＸＩ型コラーゲンを含むすべてのコラーゲンであり、これらコラーゲンの部分アミノ酸配列も含む。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改変したものや、コラーゲンに由来しないアミノ酸配列を付加したものも含む。また、成熟したコラーゲンに加え、前駆体であるプロコラーゲンやプロペプチドの一部が切断されたのもの含む。さらに、この出願の発明では、プロリンの水酸化を含む翻訳後修飾が不完全であったり、三重らせん構造が不完全である未成熟なコラーゲン分子も対象とする。
【００２０】
カイコは吐糸期にはいると、大量の絹糸を吐き出して繭を作る。この絹糸の主成分はフィブロイン、Ｐ２５およびセリシンを含む絹タンパク質であり、これら絹タンパク質の合成量は１頭のカイコあたり平均で約０．５ｇにも達するほど莫大である。絹タンパク質は絹糸腺と呼ばれる器官で合成される。絹糸腺は後部絹糸腺、中部絹糸腺および前部絹糸腺より構成され、後部絹糸腺ではフィブロインおよびＰ２５が、中部絹糸腺ではセリシンがそれぞれ特異的に合成・分泌される。フィブロインはＨ鎖およびＬ鎖から構成される複合体で、さらにこの複合体にＰ２５が会合している（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　４０５１７−４０５２８，　２０００）。後部絹糸腺から分泌されたフィブロインおよびＰ２５は、絹糸腺の蠕動運動によって徐々に中部絹糸腺へと送られ、そこで分泌されたセリシンによって周りを被覆され、さらに前部絹糸腺へと送られ絹糸として吐糸される。このように、カイコ絹糸腺は優れたタンパク質合成能力を有した器官であり、この器官で組換えヒト・コラーゲンを発現させた場合、非常に高い生産性が期待できる。さらに、絹糸は体外に排出されること、絹糸を構成する絹タンパク質の種類が少ないこと、および絹タンパク質の中で最も存在量の多いフィブロインは水溶液に不溶性であることから、合成された組換えヒト・コラーゲンをカイコが吐き出した繭から、または絹糸腺内のタンパク質から回収および精製することは著しく容易である。
【００２１】
カイコにおける一過性の外来遺伝子発現システムはカイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）をベクターとして利用する方法が確立されている（特公平７−９７９９５号公報）。しかし、この方法ではウイルスの感染によりカイコは致死するため、次世代以降に外来遺伝子を伝達することはできず、有用タンパク質の発現は一代限りである。そのため、外来遺伝子を発現させる度にウイルス接種を行う必要がある。一方、田村ら（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１８，　８１−８４，　２０００）は、鱗翅目昆虫Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉに由来するＤＮＡ型トランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃを組み込んだプラスミドベクターをカイコ卵に微量注射することにより、世代を通じて永続的に外来遺伝子が組み込まれた形質転換カイコを作製することに成功している。
【００２２】
この出願の発明では、ヒト・コラーゲン発現カセットをＤＮＡ型トランスポゾンをもとに作製したプラスミドベクターへ組み込み、このベクターをカイコ卵へ微量注入するとことによりカイコ染色体内にヒト・コラーゲン発現カセットを挿入し、世代を通じて永続的に組換えヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコを作製する。
【００２３】
ヒト・コラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、ヒト・コラーゲンのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ等を用いることができるが、好ましくはｃＤＮＡを使用する。
【００２４】
ヒト・コラーゲンｃＤＮＡはＩ型からＸＸＩ型コラーゲンのいずれのｃＤＮＡであってもよい。これらのｃＤＮＡの塩基配列は文献（例えば、Ｅｓｓａｙｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２７，　４９−６７，　１９９２；　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６４，　４０３−４３４，　１９９５）に記載された情報から入手可能であり、例えば、これらのｃＤＮＡ配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、あるいはｃＤＮＡ配列の両端に対応するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒトの遺伝子を鋳型とするＰＣＲ法、またはヒト細胞から抽出したＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によって、ヒトＩ型〜ＸＸＩ型コラーゲンの各ｃＤＮＡを得ることができる。
【００２５】
カイコ絹糸腺細胞にてヒト・コラーゲンｃＤＮＡを発現させるために、ヒト・コラーゲンｃＤＮＡの上流にフィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖、Ｐ２５およびセリシンを含む絹タンパク質遺伝子由来の発現制御配列（プロモーターおよびエンハンサー）を組み込む。これら絹タンパク質のプロモーターおよびエンハンサーを利用することにより、組換えヒト・コラーゲンを絹糸腺特異的に大量に発現させることができる。例えば、フィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖、Ｐ２５のプロモーターおよびエンハンサーを利用すれば、ヒト・コラーゲンを後部絹糸腺で発現させることができ、セリシンのプロモーターおよびエンハンサーを利用すれば、ヒト・コラーゲンを中部絹糸腺で発現させることができる。また、絹糸腺細胞からの分泌や吐糸を容易にするために、ヒト・コラーゲンｃＤＮＡとフィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖、Ｐ２５およびセリシンを含む絹タンパク質ｃＤＮＡとの融合ポリヌクレオチドを作製し、この融合ポリヌクレオチドをカイコ・ゲノム配列内に組み込むことにより、ヒト・コラーゲンとカイコ絹タンパク質の融合タンパク質を合成させても良い。この場合、融合させるタンパク質は絹タンパク質の部分アミノ酸配列であっても良いし、全長アミノ酸配列であっても良い。例えば、ヒト・コラーゲンのシグナルペプチドを絹タンパク質のシグナルペプチドと置換した融合タンパク質を合成させれば、ヒト・コラーゲンの絹糸腺細胞からの分泌を容易にすることができる。また、例えばフィブロインＬ鎖全長とヒト・コラーゲンの融合タンパク質を合成させれば、合成されたフィブロインＬ鎖とヒト・コラーゲンの融合タンパク質は、フィブロインＨ鎖とジスルフィド結合により複合体を形成し、より効率良く分泌させることができる。
【００２６】
形質転換カイコ作成のための組換えベクターには、ヒト・コラーゲン発現カセットを挟むようにして、昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンの一対の反復配列を組み込む。昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ（Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　９，　１４５−１５５，　２０００）、およびＭｉｎｏｓ（Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　９，　２７７−２８１，　２０００）等が知られている。これらのトランスポゾンは、カイコ細胞内で転移活性を示すことことから、これらのＤＮＡ型トランスポゾンをもとに作製したベクターによりカイコを形質転換させることが可能である。特にｐｉｇｇｙＢａｃをもとに作製したプラスミドベクターは、カイコ卵に微量注入することにより、実際にカイコを形質転換させることに成功している（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１８，　８１−８４　，　２０００）。以下にｐｉｇｇｙＢａｃを例に挙げて、その性質およびヒト・コラーゲン遺伝子を導入する方法を説明するが、この発明で使用する昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンはｐｉｇｇｙＢａｃに限定するものではなく、ｍａｒｉｎｅｒおよびＭｉｎｏｓを含む他のＤＮＡ型トランスポゾンであっても良い。これらｐｉｇｇｙＢａｃ以外のトランスポゾンを用いた場合のヒト・コラーゲン遺伝子を導入する方法は、以下に記したｐｉｇｇｙＢａｃを用いた方法と基本的に同様である。
【００２７】
ｐｉｇｇｙＢａｃは、鱗翅目昆虫Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ由来の培養細胞であるＴＮ−３６８から単離されたＤＮＡ型トランスポゾンである。中央部にあるトランスポゼースＯＲＦと、その両端に存在する１３　ｂｐの逆向き反復配列から構成されており、長さは約２．５　ｋｂである。トランスポゼースＯＲＦからはトランスポゼースタンパク質が合成され、この酵素の作用により、逆向き反復配列にはさまれた領域（ｐｉｇｇｙＢａｃ自体）を標的配列であるＴＴＡＡに転移させる（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６１，　８−１７，　１９８９）。このようなｐｉｇｇｙＢａｃの性質を利用してカイコ・ゲノム配列内にヒト・コラーゲン発現カセットを挿入するには、例えば田村らの方法（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１８，　８１−８４，　２０００）と同様な方法によって行うことができる。即ち、ｐｉｇｇｙＢａｃの一対の逆向き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、ヒト・コラーゲン発現カセットを一対の逆向き反復配列で夾むように挿入する。そしてこのプラスミドベクターを、ｐｉｇｇＢａｃのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、ｐｉｇｇｙＢａｃの逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的にはｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。このヘルパープラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモーターは、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエＨＳＰ７０プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、コラーゲン発現カセットを組み込んだベクター内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。この場合、マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエＨＳＰ７０プロモーター等のプロモーター配列を組み込み、その作用によりマーカー遺伝子を発現させるようにする。
【００２８】
ベクターを微量注入したカイコ卵から孵化した幼虫（Ｆ０世代）を飼育する。このＦ０世代のカイコのうち一部カイコには、ヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれている。しかし、この世代のカイコでは、カイコ体内の全細胞のうちの一部分の細胞にのみにヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれており、全細胞にヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれたカイコを得るためには、Ｆ０カイコを交配し、生殖細胞を通じてヒト・コラーゲン発現カセットが伝達された形質転換カイコを得なければならない。即ち、得られた全Ｆ０世代のカイコを野生型カイコと、あるいはＦ０カイコ同士で交配し、次世代（Ｆ１世代）のカイコからヒト・コラーゲン発現カセットを有した形質転換カイコを選抜する必要がある。Ｆ１世代のカイコからの形質転換カイコの選抜は、例えばＰＣＲ法やサザンブロット法を用いて行う。また、マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺伝子としてＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、Ｆ１世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。このようにして選抜されたカイコは、その染色体内にヒト・コラーゲン発現カセットが組み込まれている形質転換カイコである。従って、これらのカイコを野生型カイコと、あるいは形質転換カイコどうしで交配させた子孫においてもヒト・コラーゲン発現カセットは消失することなく伝達され、世代を通じてヒト・コラーゲンまたはコラーゲンと絹タンパク質との融合タンパク質を産生させることができる。
【００２９】
上記のヒト・コラーゲン発現カセットを有する形質転換カイコに、さらにプロリン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを絹糸腺で発現しうる形態で導入すれば、生理的温度において完全に熱安定なヒト・コラーゲンを生産させることができる。導入するプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）は、ヒトや他の動物に由来するポリヌクレオチドであっても良いし、カイコ由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドでも良い。プロリン水酸化酵素はαサブユニットとβサブユニットの複合体であり、この複合体を形成しなければ酵素活性は生じない。αサブユニットは触媒活性を有するサブユニットであり、本来コラーゲンを産生する細胞に存在する。一方、βサブユニットはタンパク質のジスルフィド結合の構造変換を触媒する酵素であるプロテインジスルフィドイソメラーゼと同一のポリペプチドであり、全ての細胞に普遍的にかつ比較的多量に存在する。カイコ絹糸腺細胞は、コラーゲンを多量に産生する細胞ではないのでαサブユニットの存在量はわずかであるが、βサブユニットは比較的多量に存在する。カイコにプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入し、カイコ絹糸腺にてプロリン水酸化酵素を発現させるには、上記のようにヒト等の動物由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる方法と、カイコのプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる方法がある。ヒト等動物由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合、αサブユニットおよびβサブユニットのそれぞれをコードする２種類のポリヌクレオチドが必要である。昆虫のβサブユニットはヒト等動物由来のαサブユニットとほとんど活性型の複合体を形成しないため、ヒト等動物由来のαサブユニットの発現のみでは活性型の酵素を合成させることができない。一方、カイコのプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合は、αサブユニットのものだけでよい。絹糸腺にて発現するαサブユニットは、比較的多量に存在する内在性のβサブユニットと活性型の複合体を形成することができるからである。
【００３０】
この出願は、第７発明として、配列番号２のアミノ酸配列を有する新規なカイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットを提供する。また、第８発明として、このプロリン水酸化酵素αサブユニットをコードし、配列番号１の塩基配列を有するｃＤＮＡを提供する。このｃＤＮＡをカイコ染色体内に導入するには、カイコ絹糸腺でｃＤＮＡを発現させることができるプロモーターをｃＤＮＡの上流に連結して発現カセットを構築する。この条件を満たすプロモーターとしては、例えば絹糸腺だけで遺伝子を発現させることができるフィブロイン、Ｐ２５、およびセリシンを含む絹タンパク質のプロモーターや、どの組織でも発現可能なプロモーターであるカイコ・アクチン、ショウジョウバエＨＳＰ７０、ＡｃＮＰＶのＩＥ１等のプロモーターを挙げることができる。このようにして構築したプロリン水酸化酵素発現カセットをカイコ染色体に導入する方法は、前記のヒト・コラーゲンを導入する方法と同じ方法を用いればよい。即ち、プロリン水酸化酵素発現カセットをｐｉｇｇｙＢａｃ等のＤＮＡ型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列で夾むようにしてプラスミドベクターに挿入し、このプラスミドとヘルパープラスミドをカイコ卵に微量注入する。ヒト・コラーゲンとプロリン水酸化酵素の両方の発現カセットを有するカイコを作製するためには、ヒト・コラーゲン発現カセットを有する形質転換カイコにプロリン水酸化酵素発現カセットを導入しても良いし、逆にプロリン水酸化酵素発現カセットを有する形質転換カイコにヒト・コラーゲン発現カセットを導入しても良い。あるいは、ヒト・コラーゲン発現カセットのみを有する形質転換カイコと、プロリン水酸化酵素発現カセットを有する形質転換カイコを別々に作製し、これらを交配させることによって、両方の発現カセットを有する形質転換カイコを選抜しても良い。
【００３１】
ヒト・コラーゲン発現カセットを有する形質転換カイコは、５齢期に達すると、内在性の絹タンパク質と共にヒト・コラーゲンを合成し、絹糸の一部として繭中にヒト・コラーゲンを分泌する。繭中のヒト・コラーゲンは例えば６０％　ＬｉＳＣＮ等によって簡単に抽出することができる。また、例えばヒト・コラーゲンをカイコ・フィブロインＬ鎖との融合タンパク質として合成させた場合には、還元状態にすることにより融合タンパク質とフィブロインＨ鎖間のジスルフィド結合を切断し抽出することができる。また、繭中に含まれるヒト・コラーゲンが線維性コラーゲンであり、三重らせん領域部分（アテロコラーゲン）のみを精製する場合には、繭のタンパク質をペプシン等のタンパク質分解酵素で処理する。この操作によりタンパク質分解酵素で消化されることのないアテロコラーゲンが抽出でき、かつ他の多くのタンパク質はペプシンの消化を受けるため、その後の精製を容易に行うことができる。また、ヒト・コラーゲンを形質転換カイコの絹糸腺から繭の場合と同様の方法で抽出・精製することもきる。絹糸腺はカイコを解剖することにより簡単に分離することができ、含まれるタンパク質のほとんどが絹タンパク質であるため、繭の場合同様、容易にヒト・コラーゲンを抽出・精製することが可能である。
【００３２】
【実施例】
以下に、ヒトＩＩＩ型プロコラーゲンのアミノ酸配列のうち、三重らせん領域の一部を欠いたヒト・ミニＩＩＩ型コラーゲンの製造方法に関する実施例を挙げてこの出願の発明をより具体的に説明するが、この出願の発明はこの例に限定されるものではない。
１．ベクターの作製
カイコ・フィブロインＬ鎖全長ｃＤＮＡ（塩基番号２８−７６７　：　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１０，　１２７−１３９，　１９８９）を、プライマー（配列番号３）および５’末端にＢａｍＨＩ切断配列を組み込んだプライマー（配列番号４）を用いたカイコ絹糸腺由来ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって単離した。次に、ＥＧＦＰｃＤＮＡをｐＥＧＦＰベクター（クロンテック）から、ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで切り出し、これを、フィブロインＬ鎖ｃＤＮＡの５’末端のＢａｍＨＩ切断部位に連結した。この融合ｃＤＮＡ（ＬＥ）はフィブロインＬ鎖とＥＧＦＰの融合タンパク質をコードする。
【００３３】
ヒトＩＩＩ型プロコラーゲンｃＤＮＡ（塩基番号９２−４５５０　：　ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース登録番号Ｘ１４４２０）を含むプラスミド（ｐ３Ａ１：Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３１２，　８４７−８５３，　１９９５）をＸｈｏＩで消化して塩基番号１０７５−３５４５の領域を取り除いた後、切断末端をセルフライゲーションにより繋ぐことにより、ミニＩＩＩ型コラーゲンｃＤＮＡを作製した。このミニコラーゲンｃＤＮＡは、アミノプロペプチド、三重らせん領域の一部（全長コラーゲン三重らせん領域の１８．８％）、およびカルボキシルプロペプチドをコードする塩基配列から構成される。ミニコラーゲンｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、ミニコラーゲンの三重らせん領域（Ｎ−テロペプチドおよびＣ−テロペプチドを含む）をコードするｃＤＮＡ、およびＮ−プロペプチドと三重らせん領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。三重らせん領域のｃＤＮＡの増幅には、配列番号５および６のプライマーを、Ｎ−プロペプチドと三重らせん領域のｃＤＮＡの増幅には、配列番号７および６のプライマーを用いた。増幅した三重らせん領域のｃＤＮＡはＢａｍＨＩで、Ｎ−プロペプチドと三重らせん領域のｃＤＮＡはＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで消化し、それぞれ、ＬＥのＢａｍＨＩ切断部位（フィブロインＬ鎖ｃＤＮＡとＥＧＦＰｃＤＮＡの間）に挿入した。三重らせん領域のｃＤＮＡを組み込んだ融合ｃＤＮＡをｍｉｎｉ−ｈｅｌｉｘ、Ｎ−プロペプチドと三重らせん領域のｃＤＮＡを組み込んだ融合ｃＤＮＡをＮ−ｐｒｏ＋ｍｉｎｉ−ｈｅｌｉｘとした。
【００３４】
ｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＥＧＦＰａｆｍ］ベクター（Ｄｅｖ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｅｖｏｌ．　２１０，　６３０−６３７，　２０００）に含まれるＥＧＦＰｃＤＮＡをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化することにより取り除き、代わりにｐＤｓＲｅｄ２−１ベクター（クロンテック）からＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切り出したＤｓＲｅｄｃＤＮＡ　を組み込んだ（ｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ］）。次に、カイコゲノムＤＮＡから、プライマー（配列番号８および９）を用いて、フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片（塩基番号−６００〜３４：Ｇｅｎｅ　１１０，　１５１−１５８，　１９９２）、およびプライマー（配列番号１０および１１）を用いてフィブロインＬ鎖遺伝子のポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片（塩基番号１３１１４〜１３５９７：Ｇｅｎｅ　１１０，　１５１−１５８，　１９９２）を増幅し、これらのＤＮＡ断片をｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ］に組み込んだ。さらに、フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片とフィブロインＬ鎖遺伝子のポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片の間に、ＬＥ、ｍｉｎｉ−ｈｅｌｉｘおよびＮ−ｐｒｏ＋ｍｉｎｉ−ｈｅｌｉｘを挿入した。ＬＥ、ｍｉｎｉ−ｈｅｌｉｘおよびＮ−ｐｒｏ＋ｍｉｎｉ−ｈｅｌｉｘを含むベクターは、それぞれｐＬＥ、ｐＭＯＳＲＡ−７およびｐＭＯＳＲＡ−８とした。
２．プラスミドベクターのカイコ卵への微量注入
上記の３種類のベクター（ｐＬＥ，　ｐＭＯＳＲＡ−７，　ｐＭＯＳＲＡ−８）を塩化セシウム超遠心法で精製した後、それぞれのベクターをヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１８，　８１−８４，　２０００）と１：１の割合で混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ＤＮＡ濃度が４００μｇ／ｍｌなるようにインジェクションバッファー（５　ｍＭＫＣｌ，　０．５　ｍＭリン酸バッファー　ｐＨ　７．０）に溶解した。このＤＮＡ溶液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約１５〜２０　ｎｌの液量で微量注入した。ｐＬＥは１９００個、ｐＭＯＳＲＡ−７は２５９７個、ｐＭＯＳＲＡ−８は２７５７個の卵に注入した。
３．トランスジェニックカイコのスクリーニング
ベクターＤＮＡを微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ、ｐＬＥ注入卵からは５８９頭、ｐＭＯＳＲＡ−７注入卵からは８５５頭、ｐＭＯＳＲＡ−８注入卵からは５６２頭のカイコ幼虫が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け生殖可能な成虫が得られたためこれらを交配し、ｐＬＥについては１６３、ｐＭＯＳＲＡ−７については１３１、ｐＭＯＳＲＡ−８については１２７のＦ１卵塊（１頭の成虫が産んだ１００〜３００個の卵を１つの卵塊とする）を得ることができた。これらの卵塊を２５℃で５日間インキュベートした後、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、ｐＬＥについては４２、ｐＭＯＳＲＡ−７については２４、およびｐＭＯＳＲＡ−８については３５の卵塊（胚）に、単眼や神経系からＤｓＲｅｄタンパク質由来の赤色蛍光を発する胚が含まれていた。これら陽性卵（胚）を含む卵塊をさらに２５℃でインキュベートし孵化させ、単眼および神経系から赤色蛍光を発する陽性Ｆ１幼虫を分離した。これら陽性Ｆ１カイコを飼育し野生型カイコと交配させ、さらに次の世代（Ｆ２世代）のカイコを得た。Ｆ２カイコのうち約１／２のカイコは赤色蛍光を発しており、組み込まれた外来遺伝子は、脱落することなく、メンデルの法則に従って次世代へ伝達されることが確認された。交配・産卵後のＦ１カイコ成虫からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析を行ったところ、これら陽性カイコのゲノムＤＮＡ内に、外来遺伝子が組み込まれていることを確認した。さらに、サザンブロット解析の結果から、全ての陽性カイコを系統分けした。最終的に樹立できたトランスジェニックカイコの系統数は、ｐＬＥが組み込まれたカイコが４２系統、ｐＭＯＳＲＡ−７が組み込まれたカイコが２１系統、およびｐＭＯＳＲＡ−８が組み込まれたカイコが２８系統であった。
４．トランスジェニックカイコの繭からの組換えタンパク質の検出
樹立したトランスジェニックカイコは全て絹糸腺からＥＧＦＰタンパク質由来の緑色蛍光を発した。さらにこれらのカイコが吐き出した繭も非常に強い緑色蛍光を発し、繭中に組換えタンパク質が分泌されている可能性が強く示唆された。そこで、トランスジェニックカイコの繭からタンパク質を抽出し、電気泳動等によって組換えタンパク質の検出を試みた。トランスジェニックカイコの繭を、６０％　ＬｉＳＣＮ、５％　β−メルカプトエタノールで溶解し、５Ｍ尿素および１％　ＳＤＳを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５バッファーで透析した。この抽出液にＳＤＳ−サンプル緩衝液（０．１２５Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ　６．８／４％ＳＤＳ／１０％２−メルカプトエタノール／２０％グリセロール）を加えて混合し５分間１００℃で熱処理した。この試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｕｒｅ　２２７，　６８０−６８５，　１９７０）に供し、Ｍａｔｕｄａｉｒａらの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６１，　１００３５−１００３８，　１９８７）に準じて、泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜ＢＡ８５（Ｓ　＆　Ｓ社）に転写した。次に、タンパク質が転写されたニトロセルロース膜をブロッキング液（３％　ＢＳＡ／５０　ｍＭトリス塩酸緩衝液　ｐＨ　７．５／１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）で４℃において１６時間処理した後、抗ＧＦＰ抗体および抗フィブロインＬ鎖抗体と反応させた。これらの抗体が反応するタンパク質をＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク）で検出した。その結果、ｐＬＥが組み込まれたカイコの繭からは６３　ｋＤａのフィブロインＬ鎖／ＥＧＦＰ融合タンパク質が、ｐＭＯＳＲＡ−７およびｐＭＯＳＲＡ−８が組み込まれたカイコの繭からは、それぞれ７５　ｋＤａおよび８８　ｋＤａのミニコラーゲン融合タンパク質が、抗ＧＦＰおよび抗フィブロインＬ鎖抗体と反応するタンパク質として検出された。さらに、ｐＭＯＳＲＡ−７カイコの繭中に含まれるミニコラーゲン融合タンパク質のバンドをゲルから切り出し、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２１，　４３０−４３９，　２０００）の方法に準じて、Ｑ−ＴＯＦ質量分析機を用いて、融合タンパク質のアミノ酸配列を解析した。その結果、フィブロインＬ鎖のアミノ酸配列と一致する配列（ＶＴＩＮＱＹＳＤＮＥＩＰＲおよびＡＩＬＮＶＱ）、ミニコラーゲンのアミノ酸配列と一致する配列（ＡＡＧＡ）、ＥＧＦＰのアミノ酸配列と一致する配列（ＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴおよびＥＧＤＴ）が決定された。これらの結果より、トランスジェニックカイコの繭中には、確かに組換えミニコラーゲン融合タンパク質が含まれていることが明らかとなった。この組換えタンパク質の含有量を測定するため、ｐＭＯＳＲＡ−７カイコの繭中に含まれるタンパク質を、既知濃度のＥＧＦＰを標準タンパク質として共に電気泳動しＣＢＢ染色を行った。染色されたバンドをイメージアナライザーで定量し、組換えタンパク質の含有量を算出した。その結果、繭重量当たり約０．８％の含有量であった。
５．カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットｃＤＮＡのクローニング
先ず、混合プライマーを用いたｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ＰＣＲ法によって、カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットｃＤＮＡの部分配列をクローニングした。すでに報告されているヒト、ショウジョウバエ、および線虫のプロリン水酸化酵素αサブユニット遺伝子のアミノ酸配列を比較し、種間で保存されている領域をもとに、アミノ酸配列から推定される塩基配列をもつ混合プライマーＰ３（配列番号１２）、Ｐ５ＩＩ（配列番号１３）を設計した。なお、混合プライマー配列中、ｎはａ、ｃ、ｇまたはｔ、ｒはａまたはｇ、ｙはｃまたはｔ、ｓはｃまたはｇ、ｗはａまたはｔであることを示す。続いてＰＣＲの鋳型とするため、カイコ培養細胞であるＢｍＮ４細胞とカイコ２齢幼虫からそれぞれｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。そのうちの２００ｎｇ分のＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲを９４℃１分、５８℃１分、７２℃１分、の反応条件で４０サイクル行った。その結果、ＢｍＮ４細胞とカイコ２齢幼虫ともに電気泳動で約１５０ｂｐの増幅産物が確認でき、その増幅産物をインビトロジェン社ｐＣＲ２．１にサブクローニングし、ジデオキシ法によって塩基配列を決定したところ、このｃＤＮＡ断片は塩基配列レベル、そこから予想されるアミノ酸配列レベルともに他動物のプロリン水酸化酵素αサブユニットと高い相同性をもち、カイコ・プロリン水酸化酵素ｃＤＮＡの部分断片であることが明らかになった。
【００３５】
続いて、ｃＤＮＡ全長をクローニングするため、得られたカイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットｃＤＮＡ断片の上流、下流をＲＡＣＥ　（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）法によって単離した。ｃＤＮＡ断片の塩基配列から５’ＲＡＣＥ用プライマーＧＳＰ１（配列番号１４）、３’ＲＡＣＥ用プライマーＧＳＰ２（配列番号１５）を設計した。ＲＡＣＥはクロンテック社ＳＭＡＲＴＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用して行った。ＲＡＣＥの結果、電気泳動で、５’領域約１．７ｋｂ、３’領域約１．２ｋｂのｃＤＮＡ断片を確認することができた。これらのｃＤＮＡ断片を上記同様にサブクローニングし、その塩基配列を解析したところ、カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットをコードする配列を全て含んでいた。その塩基配列を配列番号１に示す。また、このｃＤＮＡにコードされるカイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットは配列番号２のアミノ酸配列を有していた。
６．組換えカイコ・プロリン水酸化酵素の発現とその酵素活性の測定
Ｓｆ９細胞で組換えカイコ・プロリン水酸化酵素を合成させ水酸化酵素活性を測定することを試みた。組換えバキュロウィルスの作製はＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。作製するウィルス（ＡｃＰ４Ｈα）は、ポリヘドリンプロモーター下にカイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニット
ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまでを挿入した。ＡｃＰ４Ｈαの作製は以下のようにして行った。カイコ・プロリン水酸化酵素αサブユニットｃＤＮＡの塩基配列からＰＣＲプライマー４ＨＡｓｍａ−Ｆ　（配列番号１６）および４ＨＡｈｉｎ−Ｒ（配列番号１７）を設計した。鋳型にはカイコ５齢幼虫の血球由来ｃＤＮＡを用い、ＰＣＲを９４℃２分、９４℃３０秒、５５℃３０秒、６８℃２分、の反応条件で２０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物はＳｍａＩで切断したｐＵＣ１８に挿入しＰＣＲエラーがないことをシークエンシングによって確認した。続いて、そのプラスミドをＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そのインサートをＳｔｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したトランスファーベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１に挿入した。完成したトランスファーベクターを用い、以降の操作はＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍのプロトコールに従って組換えバキュロウィルスＡｃＰ４Ｈαを作製した。また同様にしてカイコ・プロリン水酸化酵素βサブユニットを合成するための組換えバキュロウィルスＡｃＰ４Ｈβも作製した。
【００３６】
作製した組換えバキュロウィルスＡｃＰ４ＨαおよびＡｃＰ４Ｈβ（約１ｘ１０^７ｐｆｕ／ｍｌ）それぞれ１００μｌをＳｆ９細胞（１ｘ１０^６個）に共感染させ、７２時間後に細胞を回収し、抽出用バッファー　（０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．８，　０．１　Ｍ　ｇｌｙｃｉｎｅ，　０．１　Ｍ　ＮａＣｌ，　１０　ｍＭ　ＤＴＴ，　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ）でホモジナイズし、遠心して上清を回収した。このＡｃＰ４Ｈα　／ＡｃＰ４Ｈβ共感染Ｓｆ９細胞抽出液を水酸化酵素活性測定の際の酵素溶液として用いた。またラット線維芽細胞とウィルスを感染させていないＳｆ９細胞の抽出液を、ＡｃＰ４Ｈα　／ＡｃＰ４Ｈβ共感染Ｓｆ９細胞酵抽出液と比較するためのコントロールとして用いた。
【００３７】
Ｐｒｏｌｙｌ　４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　活性は^３Ｈ標識プロトコラーゲンから遊離する^３Ｈ_２Ｏのカウントを測定する方法を用いた。　基質として用いる^３Ｈ標識組換えプロトコラーゲンは定法に従い、鶏胚頭蓋骨の器官培養によって作製した。調製した基質と酵素溶液を５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．６，　０．５　ｍＭ　Ｆｅ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，　２．５　ｍＭ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ，　０．５　ｍＭ　２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ溶液１００μｌ中で３７　°Ｃ、３０　分反応させた後、定法により、トリチウム水のカウントを測定した。
【００３８】
測定の結果、ＡｃＰ４Ｈα　／ＡｃＰ４Ｈβ共感染Ｓｆ９細胞の酵素活性は、ウィルスを感染させていない　Ｓｆ９　細胞の酵素活性の２倍以上であり、ラット皮膚線維芽細胞の酵素活性とほぼ同程度であった。従って、ＡｃＰ４Ｈα　／ＡｃＰ４Ｈβ共感染Ｓｆ９細胞抽出液、すなわち組換えカイコプロリン水酸化酵素に確かにプロリン水酸化酵素活性があることが明らかになった。哺乳類やショウジョウバエのカイコプロリン水酸化酵素は四量体を形成することがわかっており、おそらくＳｆ９細胞で合成されたカイコカイコプロリン水酸化酵素も四量体を形成し、酵素活性を有していることが示唆された。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、組換えヒト・コラーゲンを繭または絹糸腺に含まれるタンパク質の一部として生産する形質転換カイコと、このカイコが生産する組換えヒト・コラーゲンが提供される。組換えヒト・コラーゲンは、形質転換カイコの吐き出す繭または絹糸腺から回収するため、抽出しやすく、純度の高いコラーゲンを容易に得ることができる。また、形質転換カイコの生産する組換えヒト・コラーゲンは、ウイルスやプリオン等の病原体混入の危険が無く、またヒトに対して抗原性の無い安全ヒト・コラーゲンであるため、医療、食品、化粧品等の様々な産業分野で利用することが可能である。
【００４０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは、ｐＬＥ、ｐＭＯＳＲＡ−７およびｐＭＯＳＲＡ−８ベクターの制限酵素地図である。Ｂは、ｐＬＥ、ｐＭＯＳＲＡ−７およびｐＭＯＳＲＡ−８ベクターに含まれる融合ｃＤＮＡの模式図である。
【図２】野生型カイコ（レーン１）、およびｐＬＥ（レーン２）、ｐＭＯＳＲＡ−７（レーン３）、ｐＭＯＳＲＡ−８（レーン４）が組み込まれたトランスジェニックカイコが作り出した繭からタンパク質を抽出した後ＳＤＳ電気泳動を行い、ＣＢＢでタンパク質染色を行った結果である（パネル左）。また、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体（パネル中央）、および抗フィブロインＬ鎖抗体（パネル右）を用いてウエスタンブロットを行った結果である。[0001]
[Industrial applications]
The invention of this application relates to a transgenic silkworm that produces recombinant human collagen. More specifically, the invention of this application relates to a transgenic silkworm producing recombinant human collagen, a recombinant vector for producing the transgenic silkworm, and a method for producing recombinant human collagen.
[0002]
[Prior art]
Collagen is a typical protein that constitutes the extracellular matrix, and has various physiological functions that control cell growth, differentiation, migration, etc., in addition to mechanical functions such as maintaining the structure of living organisms as a scaffold for cells. Have. Therefore, collagen is used as a biomaterial for repairing damage to living bodies (J. Surg. Res. 10, 485-491, 1970), and as a carrier for sustained release of certain drugs (J. Controlled Release 33, 307). −315, 1995), and are widely used in the medical field. However, most of the currently used collagen is derived from animal tissues such as cows and pigs, and it is known that when these collagens are transplanted into humans, allergic reactions occur in about 3% of patients. (J. Immunol. 136, 877-882, 1986; Biomaterials 11, 176-180, 1990). In addition, the danger of contamination with pathogens such as viruses and prions in animal tissue-derived collagen has become a serious problem in recent years. Therefore, a system for producing recombinant human collagen which has no antigenicity and has no risk of pathogen contamination is desired. Therefore, some of the inventors of the present application have developed a recombinant virus having a triple helix structure equivalent to that in a human body by infecting insect cells with a recombinant virus into which cDNA encoding human collagen has been inserted. A method for producing human collagen has been invented and a patent application has been filed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-23979). A method for producing human collagen using mammalian cells or yeast has also been devised (Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-501939).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, as a method for producing recombinant human collagen, methods using insect cells, mammalian cells, yeast, and the like have been devised, but methods using insect cells or mammalian cells may be used in the medical field. It is difficult to increase production as high as possible. In the method using yeast, purification of recombinant human collagen is not always easy because a recombinant product is produced in the cells.
[0004]
The invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and solves the problems of the prior art, and provides a recombinant human collagen production method having both high productivity and easy purification, and The challenge is to provide genetic engineering materials.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a first invention for solving the above-mentioned problems, the present application has a polynucleotide encoding human collagen in genomic DNA and produces recombinant human collagen as a part of a protein in a cocoon or silk gland. To provide a transformed silkworm.
[0006]
This application also provides, as a second invention, a polynucleotide encoding a fusion protein of human collagen and silkworm silk protein in genomic DNA, wherein the fusion protein is part of a protein in a cocoon or silk gland. The resulting transgenic silkworm is provided.
[0007]
The transformed silkworms of the first and second inventions include silkworm adults, larvae, pupae, and eggs.
[0008]
The transgenic silkworms of the first invention and the second invention further have a polynucleotide encoding at least one of proline hydroxylase α-subunit and β-subunit in genomic DNA; In a preferred embodiment, the polynucleotide encoding the unit has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0009]
This application further provides, as a third invention, a method for producing recombinant human collagen, comprising isolating and purifying recombinant human collagen from the cocoon or silk gland of the transformed silkworm of the first invention. I do.
[0010]
Further, as a fourth invention, a fusion protein of recombinant human collagen and silkworm silk protein is isolated from the cocoon or silk gland of the transformed silkworm of the second invention, and the recombinant human collagen is separated from the fusion protein. And a method for producing recombinant human collagen, which is characterized by purification.
[0011]
According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a fusion protein of the recombinant human collagen and the silkworm silk protein produced by the transformed silkworm of the second aspect.
[0012]
This application further provides, as a sixth invention, at least the following recombinant vector:
(1) a recombinant vector having a human collagen expression cassette flanked by a pair of inverted repeats of an insect DNA-type transposon; and
(2) a recombinant vector having a polynucleotide encoding a transposase of a transposon
And a recombinant vector set comprising:
[0013]
In the vector set of the sixth invention, the following recombinant vector is further provided:
(3) Recombinant vector having a polynucleotide encoding at least one of exogenous proline hydroxylase α subunit and β subunit
And that the polynucleotide encoding the proline hydroxylase α-subunit has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0014]
Further, in the vector set of the sixth invention, the human collagen expression cassette is a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding human collagen is linked under the control of an expression control sequence of a silkworm silk protein gene, or a silkworm silk protein gene. A specific embodiment is a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding a silkworm silk protein and a polynucleotide encoding human collagen are linked under the control of the expression control sequence described above.
[0015]
This application further provides, as a seventh invention, a silkworm-derived proline hydroxylase α-subunit having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0016]
Furthermore, this application provides a cDNA fragment encoding the proline hydroxylase α-subunit of the seventh invention and having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0017]
Hereinafter, embodiments will be described, and these inventions will be described in more detail.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
It is known to date that there are 21 different types of collagen from type I to type XXI. Each of these collagens is a trimer molecule formed from three subunits (α chains), and is characterized by having a triple helical structure in the molecule. Some collagen is first synthesized as a precursor, procollagen, and then converted into a mature collagen molecule. For example, fibrous collagen such as type I, II, and III collagen is synthesized as procollagen having a non-triple helix aminopropeptide and a carboxyl propeptide at the amino terminal side and the carboxyl terminal side of the triple helix region which is the main body thereof. This results in mature collagen after both propeptides have been cleaved by specific proteases. Collagen undergoes various post-translational modifications during its biosynthesis, including proline hydroxylation, lysine hydroxylation, and oxidation of lysine and lysine hydroxide (aldehyde conversion). In particular, hydroxylation of proline by proline hydroxylase is very important for collagen to acquire stability at physiological temperature.
[0019]
The human collagen targeted by the invention of this application is all collagens including type I to type XXI collagen, and also includes partial amino acid sequences of these collagens. Also included are those in which a part of the amino acid sequence of these collagens is modified, and those in which an amino acid sequence not derived from collagen is added. Further, in addition to mature collagen, it includes procollagen or propeptide which is a precursor in which a part of the propeptide is cleaved. Furthermore, the invention of this application is also directed to immature collagen molecules with incomplete post-translational modifications, including hydroxylation of proline, or incomplete triple helical structures.
[0020]
When the silkworm enters the spinning period, it emits a large amount of silk thread to make a cocoon. The main component of this silk thread is a silk protein containing fibroin, P25 and sericin, and the synthesis amount of these silk proteins is enormous, averaging about 0.5 g per silkworm. Silk proteins are synthesized in an organ called the silk gland. The silk gland is composed of a posterior silk gland, a central silk gland, and an anterior silk gland. Fibroin and P25 are specifically synthesized and secreted from the posterior silk gland, and sericin is specifically synthesized and secreted from the middle silk gland. Fibroin is a complex composed of an H chain and an L chain, and P25 is associated with this complex (J. Biol. Chem. 275, 40517-40528, 2000). Fibroin and P25 secreted from the posterior silk gland are gradually sent to the middle silk gland by the peristalsis of the silk gland, where they are coated around by the secreted sericin, and further sent to the anterior silk gland as silk. It is spun. Thus, the silkworm silk gland is an organ having excellent protein synthesis ability, and when recombinant human collagen is expressed in this organ, very high productivity can be expected. Furthermore, since silk is excreted from the body, the types of silk proteins that make up the silk are small, and fibroin, which is the most abundant of silk proteins, is insoluble in aqueous solutions, synthetic recombinant human -It is extremely easy to recover and purify collagen from the cocoons that the silkworms have exhaled or from proteins in the silk glands.
[0021]
As a transient foreign gene expression system in silkworm, a method using silkworm nucleopolyhedrovirus (BmNPV) as a vector has been established (Japanese Patent Publication No. 7-79995). However, in this method, since silkworms are killed by virus infection, foreign genes cannot be transmitted from the next generation onward, and the expression of useful proteins is limited to one generation. Therefore, it is necessary to inoculate the virus every time a foreign gene is expressed. On the other hand, Tamura et al. (Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000) reported that micro-injection of a plasmid vector incorporating piggyBac, a DNA-type transposon derived from the lepidopteran insect Trichoplusia ni, into silkworm eggs throughout the generation. We have succeeded in producing transgenic silkworms in which a foreign gene has been permanently integrated.
[0022]
In the invention of this application, a human collagen expression cassette is inserted into a silkworm chromosome by incorporating a human collagen expression cassette into a plasmid vector prepared based on a DNA-type transposon and injecting this vector into a silkworm egg in a small amount, Generate transgenic silkworms that produce recombinant human collagen permanently throughout the generation.
[0023]
As the polynucleotide encoding human collagen, genomic DNA, mRNA or cDNA synthesized from mRNA of human collagen can be used, but cDNA is preferably used.
[0024]
The human collagen cDNA may be any type I to type XXI collagen cDNA. The nucleotide sequences of these cDNAs can be obtained from information described in literatures (for example, Essays Biochem. 27, 49-67, 1992; Annu. Rev. Biochem. 64, 403-434, 1995). A method of screening a human cDNA library using oligonucleotides prepared based on the cDNA sequence of the above as a probe, or a PCR method using oligonucleotides corresponding to both ends of the cDNA sequence as primers and a human gene as a template, or human cells. CDNAs of human type I to type XXI collagen can be obtained by RT-PCR using RNA extracted from E. coli as a template.
[0025]
In order to express human collagen cDNA in silkworm silk gland cells, expression control sequences (promoter and enhancer) derived from silk protein gene including fibroin H chain, fibroin L chain, P25 and sericin are incorporated upstream of human collagen cDNA. . By using these silk protein promoters and enhancers, recombinant human collagen can be expressed in a large amount in a silk gland-specific manner. For example, human collagen can be expressed in the posterior silk gland using the promoter and enhancer of fibroin H chain, fibroin L chain, and P25, and human collagen can be expressed in the central silk using the sericin promoter and enhancer. It can be expressed in glands. In addition, in order to facilitate secretion and spinning from silk gland cells, a fusion polynucleotide of human collagen cDNA and a silk protein cDNA containing fibroin H chain, fibroin L chain, P25 and sericin was prepared, and the fusion polynucleotide was prepared. By incorporating nucleotides into the silkworm genome sequence, a fusion protein of human collagen and silkworm silk protein may be synthesized. In this case, the protein to be fused may be a partial amino acid sequence of the silk protein or a full-length amino acid sequence. For example, by synthesizing a fusion protein in which the signal peptide of human collagen is replaced with the signal peptide of silk protein, secretion of human collagen from silk gland cells can be facilitated. Further, for example, if a fusion protein of the full-length fibroin L chain and human collagen is synthesized, the synthesized fusion protein of the fibroin L chain and human collagen forms a complex with the fibroin H chain by disulfide bonds, and the efficiency is improved. It can be secreted well.
[0026]
A pair of repetitive sequences of an insect DNA-type transposon are inserted into a recombinant vector for preparing a transgenic silkworm with a human collagen expression cassette in between. PiggyBac, mariner (Insect Mol. Biol. 9, 145-155, 2000), Minos (Insect Mol. Biol. 9, 277-281, 2000), and the like are known as insect-derived DNA-type transposons. Since these transposons show translocation activity in silkworm cells, it is possible to transform silkworms with vectors prepared based on these DNA-type transposons. In particular, a plasmid vector prepared based on piggyBac has succeeded in actually transforming a silkworm by injecting a small amount into a silkworm egg (Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000). Hereinafter, the nature of piggyBac and the method of introducing a human collagen gene will be described by taking piggyBac as an example. However, the insect-derived DNA-type transposon used in the present invention is not limited to piggyBac, and may include mariner and Minos. May be used. The method of introducing a human collagen gene using a transposon other than piggyBac is basically the same as the method using piggyBac described below.
[0027]
piggyBac is a DNA-type transposon isolated from TN-368, a cultured cell derived from the lepidopteran insect Trichoplusia ni. It is composed of a transposase ORF in the center and 13 bp inverted repeats at both ends, and is about 2.5 kb in length. A transposase protein is synthesized from the transposase ORF, and by the action of this enzyme, a region (piggyBac itself) sandwiched between inverted repeats is transferred to TTAA, a target sequence (Virology 161, 8-17, 1989). In order to insert a human collagen expression cassette into a silkworm genome sequence using such properties of piggyBac, for example, a method similar to the method of Tamura et al. (Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000) is used. It can be carried out. That is, a pair of inverted repeat sequences of piggyBac are inserted into an appropriate plasmid vector, and a human collagen expression cassette is inserted so as to be surrounded by the pair of inverted repeat sequences. Then, this plasmid vector is microinjected into a silkworm egg together with a pigBac transposase expression vector (helper plasmid). This helper plasmid is a recombinant plasmid vector lacking one or both of the inverted repeat sequences of piggyBac and substantially incorporating only the transposase gene region of piggyBac. In this helper plasmid, an endogenous transposase promoter may be used as it is, or a silkworm actin promoter or a Drosophila HSP70 promoter may be used as a promoter for expressing transposase. In order to facilitate screening of the next-generation silkworm, a marker gene can be simultaneously incorporated into a vector into which a collagen expression cassette has been incorporated. In this case, a promoter sequence such as the silkworm actin promoter or the Drosophila HSP70 promoter is incorporated upstream of the marker gene, and the marker gene is expressed by its action.
[0028]
A larva (F0 generation) hatched from a silkworm egg into which the vector has been microinjected is bred. Some of the silkworms of the F0 generation incorporate a human collagen expression cassette. However, in the silkworm of this generation, the human collagen expression cassette is incorporated only in a part of all the cells in the silkworm body, and it is necessary to obtain a silkworm in which the human collagen expression cassette is incorporated in all cells. Must cross the F0 silkworm and obtain a transgenic silkworm in which the human collagen expression cassette has been transmitted through the germ cells. That is, it is necessary to breed the obtained all-F0 silkworms with wild-type silkworms or between F0 silkworms, and to select transformed silkworms having a human collagen expression cassette from the next-generation (F1 generation) silkworms. . Selection of the transformed silkworm from the silkworm of the F1 generation is performed using, for example, a PCR method or a Southern blot method. When a marker gene has been incorporated, selection can be made using the phenotypic trait. For example, when a fluorescent protein gene such as GFP is used as a marker gene, it can be carried out by irradiating the silkworm eggs and larvae of the F1 generation with excitation light and detecting the fluorescence emitted by the fluorescent protein. The silkworm thus selected is a transgenic silkworm in which a human collagen expression cassette is integrated in its chromosome. Therefore, even in the offspring obtained by crossing these silkworms with wild-type silkworms or transgenic silkworms, the human collagen expression cassette is transmitted without loss, and the fusion protein of human collagen or collagen and silk protein is transmitted throughout the generation. Can be produced.
[0029]
If a polynucleotide encoding proline hydroxylase is further introduced into the transgenic silkworm having the above human collagen expression cassette in a form that can be expressed in the silk gland, human collagen that is completely thermostable at physiological temperatures can be obtained. Can be produced. The proline hydroxylase polynucleotide (for example, cDNA) to be introduced may be a polynucleotide derived from humans or other animals, or a proline hydroxylase polynucleotide derived from silkworm. Proline hydroxylase is a complex of α-subunit and β-subunit, and the enzyme activity does not occur unless this complex is formed. The α subunit is a subunit having catalytic activity and is originally present in cells that produce collagen. On the other hand, the β subunit is the same polypeptide as protein disulfide isomerase, which is an enzyme that catalyzes the structural conversion of disulfide bonds in proteins, and is present universally and in relatively large amounts in all cells. Bombyx mori silk gland cells are not cells that produce large amounts of collagen, and thus have a small amount of α subunit, but relatively large amounts of β subunit. In order to introduce a proline hydroxylase polynucleotide into a silkworm and express proline hydroxylase in a silk gland of a silkworm, a method using a proline hydroxylase polynucleotide derived from an animal such as a human as described above, There is a method using a proline hydroxylase polynucleotide. When using a proline hydroxylase polynucleotide derived from an animal such as a human, two types of polynucleotides encoding each of the α subunit and the β subunit are required. Since the β subunit of an insect hardly forms a complex with an α subunit derived from an animal such as a human, an active enzyme cannot be synthesized only by expression of an α subunit derived from an animal such as a human. On the other hand, when a silkworm proline hydroxylase polynucleotide is used, only the α subunit is required. This is because the α subunit expressed in the silk gland can form an active complex with the endogenous β subunit present in a relatively large amount.
[0030]
This application provides, as a seventh invention, a novel silkworm proline hydroxylase α subunit having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. According to an eighth aspect of the present invention, there is provided a cDNA encoding the proline hydroxylase α-subunit and having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. In order to introduce this cDNA into the silkworm chromosome, an expression cassette is constructed by ligating a promoter capable of expressing the cDNA in the silkworm silk gland upstream of the cDNA. Examples of a promoter satisfying this condition include a promoter of a silk protein containing fibroin, P25 and sericin capable of expressing a gene only in a silk gland, a silkworm actin which can be expressed in any tissue, silkworm actin, Drosophila HSP70, A promoter such as AcNPV IE1 can be mentioned. The method for introducing the thus-constructed proline hydroxylase expression cassette into the silkworm chromosome may be the same as the above-described method for introducing human collagen. That is, a proline hydroxylase expression cassette is inserted into a plasmid vector so as to be surrounded by a pair of inverted repeat sequences of a DNA-type transposon such as piggyBac, and a small amount of this plasmid and a helper plasmid are injected into a silkworm egg. In order to produce a silkworm having both human collagen and proline hydroxylase expression cassettes, a proline hydroxylase expression cassette may be introduced into a transformed silkworm having a human collagen expression cassette, or conversely. A human collagen expression cassette may be introduced into a transgenic silkworm having a proline hydroxylase expression cassette. Alternatively, a transgenic silkworm having only the human collagen expression cassette and a transgenic silkworm having the proline hydroxylase expression cassette are separately prepared and crossed to select a transgenic silkworm having both expression cassettes. You may.
[0031]
When the transgenic silkworm having the human collagen expression cassette reaches the age of five, it synthesizes human collagen together with endogenous silk proteins and secretes human collagen into the cocoon as part of the silk thread. Human collagen in the cocoon can be easily extracted with, for example, 60% LiSCN. Further, for example, when human collagen is synthesized as a fusion protein with the silkworm fibroin L chain, a disulfide bond between the fusion protein and the fibroin H chain can be cleaved and extracted by reducing the state. When human collagen contained in the cocoon is fibrous collagen and only the triple helix region (atelocollagen) is purified, the cocoon protein is treated with a protease such as pepsin. By this operation, atelocollagen that is not digested by proteolytic enzymes can be extracted, and many other proteins are digested with pepsin, so that subsequent purification can be performed easily. Further, human collagen can be extracted and purified from the silk gland of the transformed silkworm in the same manner as in the case of the cocoon. The silk gland can be easily separated by dissecting the silkworm, and since most of the contained proteins are silk proteins, it is possible to easily extract and purify human collagen as in the case of a cocoon.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the invention of this application will be described more specifically with reference to Examples relating to a method for producing human mini-type III collagen lacking a part of the triple helix region in the amino acid sequence of human type III procollagen. However, the invention of this application is not limited to this example.
1. Vector construction
Silkworm fibroin L chain full-length cDNA (base Nos. 28-767: J. Mol. Biol. 210, 127-139, 1989) was used as a primer (SEQ ID NO: 3) and a primer (SEQ ID NO: 3) incorporating a BamHI cleavage sequence at the 5 'end No. 4) and isolated from the silkworm gland cDNA by PCR using the cDNA as a template. Next, the EGFP cDNA was excised from the pEGFP vector (Clontech) with ApaI and BamHI, and ligated to the BamHI cleavage site at the 5 ′ end of the fibroin L chain cDNA. This fusion cDNA (LE) encodes a fusion protein of fibroin L chain and EGFP.
[0033]
Plasmid (p3A1: Biochem. J. 312, 847-853, 1995) containing human type III procollagen cDNA (base number 92-4550: GeneBank database registration number X14420) was digested with XhoI and the region of base number 1075-3545 After removing, the cut ends were connected by self-ligation to prepare a mini type III collagen cDNA. This minicollagen cDNA is composed of an aminopropeptide, a part of the triple helix region (18.8% of the full length collagen triple helix region), and a base sequence encoding a carboxyl propeptide. By PCR using minicollagen cDNA as a template, cDNA encoding the triple helix region (including N-telopeptide and C-telopeptide) of the minicollagen and cDNA encoding the N-propeptide and the triple helix region were amplified. . The primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 were used for amplification of the cDNA of the triple helix region, and the primers of SEQ ID NOs: 7 and 6 were used for amplification of the N-propeptide and the cDNA of the triple helix region. The amplified triple helix region cDNA was digested with BamHI, and the N-propeptide and triple helix region cDNA were digested with BamHI and BglII, and inserted into the BamHI cleavage site of LE (between the fibroin L chain cDNA and EGFP cDNA). The fusion cDNA incorporating the triple helix region cDNA was designated mini-helix, and the fusion cDNA incorporating the N-propeptide and triple helix region cDNA was designated N-pro + mini-helix.
[0034]
The EGFP cDNA contained in the pBac [3xP3-EGFPafm] vector (Dev. Genes Evol. 210, 630-637, 2000) was removed by digestion with BamHI and NotI, and instead replaced with BamHI and NotI from the pDsRed2-1 vector (Clontech). The excised DsRed cDNA was incorporated (pBac [3 × P3-DsRed]). Next, a DNA fragment (base numbers -600 to 34: Gene 110, 151-158, 1992) containing the promoter region of the fibroin L chain gene was obtained from the silkworm genomic DNA using the primers (SEQ ID NOS: 8 and 9) and the primers. (SEQ ID NOS: 10 and 11) were used to amplify a DNA fragment (base numbers 13114 to 13597: Gene 110, 151-158, 1992) containing the polyA addition signal of the fibroin L chain gene, and these DNA fragments were pBac [ 3xP3-DsRed]. Further, LE, mini-helix and N-pro + mini-helix were inserted between the DNA fragment containing the promoter region of the fibroin L chain gene and the DNA fragment containing the polyA addition signal of the fibroin L chain gene. Vectors containing LE, mini-helix and N-pro + mini-helix were pLE, pMOSRA-7 and pMOSRA-8, respectively.
2. Micro injection of plasmid vector into silkworm eggs
After purifying the above three types of vectors (pLE, pMOSRA-7, pMOSRA-8) by cesium chloride ultracentrifugation, each vector was converted to a helper plasmid, pHA3PIG (Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000). After mixing with ethanol at a ratio of 1: 1 and further performing ethanol precipitation, the resultant was dissolved in an injection buffer (5 mM KCl, 0.5 mM phosphate buffer, pH 7.0) so that the DNA concentration was 400 μg / ml. This DNA solution was microinjected into silkworm eggs (silkworm embryos) at the preblastoderm stage 2 to 8 hours after oviposition at a liquid volume of about 15 to 20 nl per egg. pLE was injected into 1900 eggs, pMOSRA-7 was injected into 2597 eggs, and pMOSRA-8 was injected into 2557 eggs.
3. Screening of transgenic silkworms
When the eggs into which the vector DNA was microinjected were incubated at 25 ° C, 589 silkworm larva hatched from the pLE injected egg, 855 from the pMOSRA-7 injected egg, and 562 from the pMOSRA-8 injected egg. Since hatched silkworms were kept bred and reproductive adults were obtained, they were crossed, and 163 for pLE, 131 for pMOSRA-7, and 127 for pMOSRA-8 were 127 F1 egg masses (100 adults produced by one adult). ~ 300 eggs as one egg mass). After incubating these egg masses at 25 ° C for 5 days, they were observed with a fluorescence microscope. As a result, the egg mass (embryo) of 42 for pLE, 24 for pMOSRA-7, and 35 for pMOSRA-8 contained an embryo that emits red fluorescence derived from DsRed protein from the monocular or nervous system. The egg mass containing these positive eggs (embryos) was further incubated at 25 ° C. and hatched, and positive F1 larvae emitting red fluorescence were separated from the monocular and nervous systems. These positive F1 silkworms were bred and crossed with wild-type silkworms to obtain the next generation (F2 generation) silkworms. About 1/2 of the F2 silkworms emitted red fluorescence, confirming that the integrated foreign gene was transmitted to the next generation according to Mendel's law without dropping out. DNA was extracted from the adult F1 silkworm after mating and spawning, and Southern blot analysis was performed. As a result, it was confirmed that the foreign gene was incorporated into the genomic DNA of these positive silkworms. Furthermore, from the results of Southern blot analysis, all positive silkworms were classified. The number of transgenic silkworms finally established was 42 for silkworms incorporating pLE, 21 for silkworms incorporating pMOSRA-7, and 28 for silkworms incorporating pMOSRA-8. Was.
4. Detection of recombinant protein from transgenic silkworm cocoons
All of the established transgenic silkworms emitted green fluorescence derived from the EGFP protein from the silk gland. Furthermore, the cocoons emitted by these silkworms also emitted very strong green fluorescence, strongly suggesting that the recombinant proteins could be secreted into the cocoons. Therefore, the protein was extracted from the cocoon of the transgenic silkworm, and the detection of the recombinant protein was attempted by electrophoresis or the like. Transgenic silkworm cocoons were dissolved in 60% LiSCN, 5% β-mercaptoethanol and dialyzed against 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 buffer containing 5 M urea and 1% SDS. SDS-sample buffer (0.125 M Tris-HCl buffer, pH 6.8 / 4% SDS / 10% 2-mercaptoethanol / 20% glycerol) was added to this extract, mixed and heat-treated at 100 ° C. for 5 minutes. . This sample was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis (Nature 227, 680-685, 1970), and the migrated protein was analyzed according to the method of Matutaira et al. (J. Biol. Chem. 261, 10035-10038, 1987). Transferred to a nitrocellulose membrane BA85 (S & S). Next, the nitrocellulose membrane onto which the protein has been transferred is treated with a blocking solution (3% BSA / 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 / 150 mM NaCl) at 4 ° C. for 16 hours, and then the anti-GFP antibody and anti-fibroin It was reacted with an L chain antibody. Proteins to which these antibodies react were detected by ECL Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech). As a result, a 63 kDa fibroin L chain / EGFP fusion protein was obtained from the silkworm cocoon into which pLE was incorporated, and a 75 kDa and 88 kDa miniature from the silkworm cocoon into which pMOSRA-7 and pMOSRA-8 were incorporated, respectively. Collagen fusion protein was detected as a protein that reacts with anti-GFP and anti-fibroin light chain antibodies. Further, the band of the mini-collagen fusion protein contained in the cocoon of the pMOSRA-7 silkworm was cut out from the gel, and was subjected to Q-TOF mass spectrometry according to the method of Kristensen et al. (Electrophoresis 21, 430-439, 2000). The amino acid sequence of the fusion protein was analyzed. As a result, sequences matching the amino acid sequence of the fibroin L chain (VTINQYSDNEIPR and AILNVQ), sequences matching the amino acid sequence of minicollagen (AAGA), and sequences matching the amino acid sequence of EGFP (VSGEGEGDAT and EGDT) were determined. These results revealed that the transgenic silkworm cocoons certainly contained the recombinant minicollagen fusion protein. In order to measure the content of the recombinant protein, the protein contained in the cocoon of the pMOSRA-7 silkworm was electrophoresed together with a known concentration of EGFP as a standard protein, and subjected to CBB staining. The stained band was quantified with an image analyzer, and the content of the recombinant protein was calculated. As a result, the content was about 0.8% per cocoon weight.
5. Cloning of silkworm proline hydroxylase α subunit cDNA
First, the partial sequence of the silkworm proline hydroxylase α subunit cDNA was cloned by the degenerate PCR method using the mixed primers. Compare the previously reported amino acid sequences of the human, Drosophila, and nematode proline hydroxylase α subunit genes, and calculate the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence based on the conserved regions between species. Mixed primers P3 (SEQ ID NO: 12) and P5II (SEQ ID NO: 13) were designed. In the mixed primer sequence, n indicates a, c, g or t, r indicates a or g, y indicates c or t, s indicates c or g, and w indicates a or t. Subsequently, total RNA was extracted from BmN4 cells, a silkworm culture cell, and the second instar larvae of the silkworm, respectively, to use as PCR templates. PCR was performed for 40 cycles under the reaction conditions of 94 ° C. for 1 minute, 58 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute using cDNA obtained by reverse transcription of 200 ng of the RNA as a template. As a result, an amplification product of about 150 bp was confirmed by electrophoresis in both the BmN4 cell and the second instar larva of the silkworm, and the amplified product was subcloned into pCR2.1 of Invitrogen and the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method. Both the nucleotide sequence level and the amino acid sequence level predicted therefrom have high homology with the proline hydroxylase α subunit of other animals, and it has been revealed that the fragment is a partial fragment of the silkworm proline hydroxylase cDNA.
[0035]
Subsequently, in order to clone the full-length cDNA, the upstream and downstream of the obtained silkworm proline hydroxylase α subunit cDNA fragment were isolated by the RACE (Rapid Amplification cDNA Ends) method. Based on the nucleotide sequence of the cDNA fragment, a 5 ′ RACE primer GSP1 (SEQ ID NO: 14) and a 3 ′ RACE primer GSP2 (SEQ ID NO: 15) were designed. RACE was performed using Clontech SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit. As a result of RACE, a cDNA fragment having a 5 'region of about 1.7 kb and a 3' region of about 1.2 kb could be confirmed by electrophoresis. These cDNA fragments were subcloned in the same manner as described above, and their nucleotide sequences were analyzed. As a result, they contained all the sequences encoding the silkworm proline hydroxylase α subunit. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1. The silkworm proline hydroxylase α subunit encoded by this cDNA had the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
6. Expression of recombinant silkworm proline hydroxylase and measurement of its enzyme activity
An attempt was made to synthesize recombinant silkworm proline hydroxylase in Sf9 cells and measure the hydroxylase activity. Preparation of the recombinant baculovirus was performed using GIBCO BRL BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System. The virus (AcP4Hα) to be prepared is a silkworm proline hydroxylase α subunit under the polyhedrin promoter.
The cDNA was inserted from the start codon to the stop codon. The production of AcP4Hα was performed as follows. PCR primers 4HAsma-F (SEQ ID NO: 16) and 4HAhin-R (SEQ ID NO: 17) were designed from the base sequence of the silkworm proline hydroxylase α subunit cDNA. Using a cDNA derived from the blood cell of the 5th instar larva of silkworm as a template, PCR was performed for 20 cycles under the reaction conditions of 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 2 minutes. The obtained PCR product was inserted into pUC18 cut with SmaI, and the absence of PCR error was confirmed by sequencing. Subsequently, the plasmid was digested with SmaI and HindIII and the insert was inserted into the transfer vector pFASTBAC1 cut with StuI and HindIII. Using the completed transfer vector, a recombinant baculovirus AcP4Hα was prepared in accordance with the protocol of GACCO BRL BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System. Similarly, a recombinant baculovirus AcP4Hβ for synthesizing the silkworm proline hydroxylase β subunit was also prepared.
[0036]
The prepared recombinant baculoviruses AcP4Hα and AcP4Hβ (about 1 × 10 ⁷ pfu / ml) in 100 μl each of Sf9 cells (1 × 10 ⁶ ), The cells were collected 72 hours later, and the cells were collected and extracted with an extraction buffer (0.01 M Tris-HCl, pH 7.8, 0.1 M glycine, 0.1 M NaCl, 10 mM DTT, 0.1 mM DTT). The mixture was homogenized with 1% Triton X-100 (1 mM PMSF), centrifuged, and the supernatant was collected. This AcP4Hα / AcP4Hβ co-infected Sf9 cell extract was used as an enzyme solution for the measurement of hydroxylase activity. An extract of rat fibroblasts and Sf9 cells not infected with virus was used as a control for comparison with an Sf9 cell enzyme extract co-infected with AcP4Hα / AcP4Hβ.
[0037]
Prolyl 4-hydroxylase activity ³ Released from H-labeled protocollagen ³ H ₂ A method of measuring O count was used. Use as substrate ³ H-labeled recombinant protocollagen was prepared by organ culture of chicken embryo skull according to a standard method. The prepared substrate and enzyme solution were mixed with 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.5 mM Fe (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2.5 mM ascorbic acid, 0.5 mM 2-oxoglutarate solution was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and the tritium water count was measured by a standard method.
[0038]
As a result of the measurement, the enzyme activity of the Sf9 cells co-infected with AcP4Hα / AcP4Hβ was twice or more the enzyme activity of the Sf9 cells not infected with the virus, and was almost the same as the enzyme activity of rat skin fibroblasts. Therefore, it was revealed that the AcP4Hα / AcP4Hβ co-infected Sf9 cell extract, that is, the recombinant silkworm proline hydroxylase had certainly proline hydroxylase activity. It is known that mammalian and Drosophila silkworm proline hydroxylases form tetramers, and probably silkworm silkworm proline hydroxylase synthesized in Sf9 cells also forms tetramers and has enzymatic activity. It has been suggested.
[0039]
【The invention's effect】
As described in detail above, the invention of this application provides a transformed silkworm that produces recombinant human collagen as a part of a protein contained in a cocoon or a silk gland, and a recombinant human collagen produced by the silkworm. You. Recombinant human collagen is recovered from the cocoon or silk gland exhaled from the transgenic silkworm, so that it is easy to extract and easily obtain high-purity collagen. In addition, the recombinant human collagen produced by the transgenic silkworm has no danger of contamination with pathogens such as viruses and prions, and is safe human collagen without antigenicity to humans. Can be used in various industrial fields.
[0040]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is a restriction map of pLE, pMOSRA-7 and pMOSRA-8 vectors. B is a schematic diagram of the fusion cDNA contained in pLE, pMOSRA-7 and pMOSRA-8 vectors.
FIG. 2: Proteins were extracted from cocoons produced by transgenic silkworms incorporating wild-type silkworm (lane 1) and pLE (lane 2), pMOSRA-7 (lane 3), and pMOSRA-8 (lane 4). Thereafter, SDS electrophoresis was performed, and protein staining was performed with CBB (left panel). In addition, the results are shown in which the proteins in the gel were transferred to a nitrocellulose membrane and subjected to Western blotting using an anti-GFP antibody (center of the panel) and an anti-fibroin L chain antibody (right of the panel).

Claims

A transgenic silkworm having a polynucleotide encoding human collagen in genomic DNA and producing recombinant human collagen as part of a protein in a cocoon or silk gland.

The transformed silkworm of claim 1, further comprising a polynucleotide encoding at least one of proline hydroxylase α subunit and β subunit in genomic DNA.

The transformed silkworm of claim 2, wherein the polynucleotide encoding the proline hydroxylase α subunit has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

A transformed silkworm having a polynucleotide encoding a fusion protein of human collagen and silkworm silk protein in genomic DNA, and producing the fusion protein as a part of a protein in a cocoon or silk gland.

6. The transgenic silkworm of claim 5, wherein the polynucleotide encoding the proline hydroxylase α subunit has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

A method for producing recombinant human collagen, comprising isolating and purifying recombinant human collagen from the cocoon or silk gland of the transformed silkworm of claim 1, 2 or 3.

Isolating a fusion protein of recombinant human collagen and silkworm silk protein from the cocoon or silk gland of the transformed silkworm of claim 4, 5 or 6, and separating and purifying the recombinant human collagen from the fusion protein. A method for producing recombinant human collagen.

A fusion protein of the recombinant human collagen and silkworm silk protein produced by the transformed silkworm of claim 4, 5 or 6.

At least the following recombinant vectors:
(1) a recombinant vector having a human collagen expression cassette flanked by a pair of inverted repeat sequences of an insect DNA-type transposon; and (2) a recombinant vector having a polynucleotide encoding a transposase of a transposon. Replacement vector set.

In addition, the following recombinant vectors:
(3) The recombinant vector set according to claim 10, which comprises a recombinant vector having a polynucleotide encoding at least one of proline hydroxylase α subunit and β subunit.

The recombinant vector set according to claim 11, wherein the polynucleotide encoding the proline hydroxylase α subunit has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

13. The recombinant vector set according to claim 10, 11 or 12, wherein the human collagen expression cassette is a fusion polynucleotide obtained by linking a polynucleotide encoding human collagen under the control of an expression control sequence of a silkworm silk protein gene.

The human collagen expression cassette is a fusion polynucleotide in which a polynucleotide encoding a silkworm silk protein and a polynucleotide encoding human collagen are linked under the control of an expression control sequence of a silkworm silk protein gene. Or 12 recombinant vector sets.

A proline hydroxylase α subunit derived from silkworm having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

A cDNA fragment encoding the proline hydroxylase α subunit of claim 15 and having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.