JP2004008107A

JP2004008107A - Method for simultaneously extracting and purifying nucleic acid

Info

Publication number: JP2004008107A
Application number: JP2002166784A
Authority: JP
Inventors: Koichi Kojima; 児嶋　浩一
Original assignee: Japan Agriculture Forestry and Fisheries Ministry of; Shimadzu Corp
Current assignee: Japan Agriculture Forestry and Fisheries Ministry of; Shimadzu Corp
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2004-01-15
Anticipated expiration: 2022-06-07
Also published as: JP4092141B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for readily and efficiently extracting and purifying a nucleic acid from a biological material having a hard cell wall such as a bacterium of the genus Mycobacterium present in a biological sample such as excrement from which the purification is considered to be difficult. <P>SOLUTION: The method for simultaneously extracting and purifying the nucleic acid comprises stirring the sample such as the excrement containing the biological material such as the one belonging to the Mycobacterium, with an aqueous solution containing a chelating reagent and a quaternary ammonium salt, an organic solvent and fine particles. For example, the chelating agent is selected from EDTA or a reagent resembling the EDTA. Hexadecyltrimethylammonium bromide or the like is used as the quaternary ammonium salt. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を用いて各種の操作を行う場合の試料となる核酸を得るための核酸調製法に関し、より詳しくは、精製が困難とされる糞便などの生物試料中から、抽出が困難とされるマイコバクテリウム属の細菌などの核酸を得るための核酸調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、目的試料から核酸を調製する場合、試料の特性に応じて、以下に挙げる方法などから適切な抽出法と精製法を選択し、抽出、精製の２つの工程を順に行うことが一般的である。
【０００３】
（抽出法）
ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物、動物などの生物材料から核酸を抽出する一般的な方法として、リゾチームなどの酵素により細胞壁を分解し、溶液中に抽出する方法や、プロテネースなどの酵素によりタンパク質を分解し細胞を破壊し、溶液中に抽出する方法などが用いられている。
【０００４】
しかし、これら酵素処理による核酸抽出は、熟練した技術が要求されるものであり、また、時間もかかるため処理効率が悪いという問題がある。特に、この抽出方法を、マイコバクテリウム属の細菌や真菌類であるカビの胞子などの細胞壁が堅いものに適用した場合は、菌体が壊れないために、核酸の抽出効率が極端に悪い。たとえば、菌体の破壊が難しいマイコバクテリウム属の細菌から核酸を抽出するために、Ｖａｒｙらの論文（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８（５），９３３−９３７，（１９９０））に記載された方法では、３種類の酵素で計４８時間におよぶ処理を行っている。
【０００５】
そこで、細胞壁が堅く、菌体破壊が難しいという問題を克服するために、フェノールと微粒子を用いて激しく撹拌する方法が知られている。例えば、Ｇｉｅｓｓｅｎらの論文（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６（１９９２），２５５−２６３）では、マイコバクテリウム属の細菌を含む検体を、ＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）及びフェノール中で酸化ジルコニウムの微粒子と共に激しく攪拌することで菌体を破壊するという工夫をしている。また、アメリカ特許４，９１８，１７８号明細書にも同様の記載がある。
【０００６】
しかし、この抽出法では核酸抽出の効率は良くなる反面、フェノールという非常に有害性の高い試薬を用いることや、攪拌操作中にフェノールが実験室環境を汚染するという問題などがあり、実用性は低い。
【０００７】
（精製法）
核酸抽出液から核酸を精製するには、核酸抽出液中の蛋白質や脂溶性の夾雑物成分を取り除かなければならない。一般的には、フェノール・クロロホルムを用いて、蛋白質や脂溶性の夾雑物成分を取り除く方法が知られている。また、ガラスビーズ等に核酸を吸着させ、核酸以外の成分を取り除く方法や、フィルター等を用いて夾雑物を濾別する方法なども知られている。
【０００８】
しかし、生物試料が特に糞便などである場合には、上記の精製法では次のような問題が起こる。例えばフェノール・クロロホルムを用いる方法では、糞便中に存在する脂溶性以外の夾雑物成分を取り除くことができない。また、ガラスビーズを用いる方法では、糞便中の夾雑物が核酸のガラスビーズへの吸着を阻害する。フィルターを用いる方法では、糞便中の夾雑物によりフィルターの目詰まりが起こり濾過できない。従ってこれらの精製法では、糞便から純度の高い核酸を得ることはできない。
【０００９】
実際に糞便を試料としてプロテネースによる酵素処理とフェノール・クロロホルムにより核酸の精製操作を行った後、エタノール沈殿法により核酸の沈殿を得ると、その沈殿は黄色ないし褐色に着色したものであった。これは糞便中の夾雑物が除去されずに、高純度に核酸の精製が行われていないことを示している。
【００１０】
そこで本発明者は、特に精製が難しい糞便から純度の高い核酸を得るため、第四級アンモニウム塩を用いる核酸精製法を開発した（特開２００２−３７７９８Ａ号公報）。この方法では、糞便に由来する核酸以外の夾雑物を高効率で除去することができる。
【００１１】
しかし前述のように、簡単かつ効率の良い抽出法は未だ開発されておらず、また、本発明者による優れた核酸精製法は提案されていても、核酸調製のためには抽出及び精製の２つの工程を順次行わなければならない。そこで、多数検体の処理を迅速に行うために、容易にかつ効率の良い抽出ができると同時に精製もできる核酸調製法が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生物材料から核酸の抽出と精製とを同時に行う簡便な方法を提供することにある。特に本発明の目的は、細胞を破壊することが難しく、核酸を抽出するために特別の操作が必要であった生物材料、特にマイコバクテリウム属の細菌が、糞便等の精製が難しいとされていた生物試料中に存在する場合に、有害性の高い試薬を用いずに抽出と精製とを同時に行う簡便な方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討した結果、生物材料を、キレート試薬及び第四級アンモニウム塩を含む水溶液と、有機溶媒と、微粒子と共に攪拌することで、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、核酸を抽出及び精製すべき生物材料を、キレート試薬及び第四級アンモニウム塩を含む水溶液と、有機溶媒と、微粒子と共に攪拌し、核酸の抽出と精製を同時に行うことを特徴とする核酸抽出同時精製法である。
【００１５】
本発明は、前記キレート試薬は、ポリアミノカルボン酸及びその塩からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００１６】
本発明は、前記キレート試薬は、ＥＤＴＡ及びＥＤＴＡに類似の試薬からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００１７】
本発明は、前記キレート試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（ＴＰＥＮ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００１８】
本発明は、前記キレート試薬の濃度が、前記水溶液を基準として５ｍＭ〜５００ｍＭである、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００１９】
本発明は、前記第四級アンモニウム塩が、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、ヘキサジメチリンブロミド、ヘキサフルオレニウムブロミド及びメチルチアゾリウムブロミドからなる群から選ばれる、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記第四級アンモニウム塩の濃度が、前記水溶液を基準として０．００１〜２０重量％である、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２０】
本発明は、前記有機溶媒がクロロホルム、四塩化炭素、アルコール類、芳香族炭化水素、エーテル類及びケトン類からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記有機溶媒として、複数の有機溶媒を任意の割合で混合して用いる、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記有機溶媒として、クロロホルム及びアルコール類を任意の割合で混合して用いる、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記クロロホルム及びアルコール類は、容量比でクロロホルム：ブタノール＝７：３〜９：１の割合である、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２１】
本発明は、前記有機溶媒の量が、前記水溶液を基準として５〜９５容量％である、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２２】
本発明は、前記微粒子の直径が０．０５〜０．５ｍｍである、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記微粒子として、直径が０．０５〜０．５ｍｍの微粒子を用い、さらに直径が０．５ｍｍよりも大きい粒子を任意の割合で混合して用いる、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２３】
本発明は、フェノールを用いないことを特徴とする、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２４】
本発明は、前記生物材料が、ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物である、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記細菌がマイコバクテリウム属に属するものである、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記マイコバクテリウム属の細菌が、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ菌又はクローン病菌である、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２５】
本発明は、前記生物材料は、生物の組織、体液、分泌物、排泄物などの生物試料又は土、水、空気などの環境試料に含まれる、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記生物試料が動物の糞便、痰又は血液である、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記糞便が人又は家畜に由来するものである、前記の核酸抽出同時精製法である。
本発明は、前記家畜が牛、ヤギ又は羊である、前記の核酸抽出同時精製法である。
【００２６】
本発明において核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方を意味する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、例えばチューブ内において、生物材料を、キレート試薬及び第四級アンモニウム塩を含む水溶液と、有機溶媒と、微粒子と共に攪拌する。
【００２８】
本発明において使用する生物材料は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物、動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、特に細胞の破壊が難しい真菌、マイコバクテリウム属の細菌などの生物材料に有用である。マイコバクテリウム属の細菌としては、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ菌（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クローン菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
これらの生物材料は、生物の組織、体液、分泌物、排泄物などの生物試料や、土、水、空気、などの環境試料に含まれるが、これらに限定されない。生物試料としては、動物の糞便、痰、血液などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、前記糞便として特に、家畜や人の糞便に有用であるが、これらに限定されない。さらに、前記家畜としては、牛、ヤギ、羊などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明で用いる水溶液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液などのｐＨ緩衝溶液を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明において用いるキレート試薬は、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似したポリアミノカルボン酸を用いると良い。具体的には、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｎｉｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｂｉｃｉｎｅ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ　ｓｃｉｄ），ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅ；ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）；ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（１，６−Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ；ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ），ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ；ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｋｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ；ＴＰＥＮ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＴＴＨＡ）などが挙げられる。これらのキレート試薬は、単独で用いても２種以上を併用しても良い。
【００３２】
細胞壁がその構造を維持する要因のひとつとして、カルシウムイオンの存在がある。これらキレート試薬はカルシウムイオンに配位しやすいものである。これらキレート試薬は、細胞壁のカルシウムイオンに配位し、細胞壁の構造を変成させることによりその構造を維持できない状態にし、細胞壁を破壊しやすくすると考えられる。
【００３３】
本発明においてキレート試薬は、前記水溶液を基準として例えば５ｍＭ〜２５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭの濃度で用いると良い。キレート試薬の濃度が５ｍＭ未満では細胞の破壊効率が低くなる傾向にあり、５００ｍＭより濃度が高いと、細胞破壊後の核酸精製も同時に行う本発明の方法において、付加的な処理が必要になる場合がある。
【００３４】
本発明は、キレート試薬を用いて、細胞を破壊するために従来のフェノールなどの他の変成剤を用いなくとも良いのが特徴であり、このことがより簡便で安全な核酸抽出を可能としている。
【００３５】
本発明で使用する第四級アンモニウム塩は、カチオン化された窒素原子Ｎ^＋を含むオニウム塩であり、好ましくは界面活性を有するものである。第四級アンモニウム塩としては、具体的に、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ）、ヘキサデシルピリジニウムクロリド（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ヘキサジメチリンブロミド（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ　Ｂｒｏｍｉｄｅ）、ヘキサフルオレニウムブロミド（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｅｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ）、メチルチアゾリウムブロミド（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、疎水基を適宜調整すると良い。これらの第四級アンモニウム塩は、単独で用いても２種以上を併用しても良い。
【００３６】
第四級アンモニウム塩は、前記水溶液を基準として０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％の濃度で用いると良い。０．００１重量％より少ないと精製効果が少なく、２０重量％を超えると第四級アンモニウム塩自身が析出しやすい。
【００３７】
本発明で用いる有機溶媒は、クロロホルム、四塩化炭素、アルコール類、ベンゼンなどの芳香族炭化水素、エーテル類、ケトン類などを挙げることができるがこれらに限定されない。芳香族炭化水素においては、有害性の高いフェノールを使用しないほうが好ましい。またこれら有機溶媒は、水と任意の割合で混ざり合わないものが好ましい。またこれら有機溶媒は、単独で用いても２種以上を併用しても良く、クロロホルムとアルコールとの組み合わせが好ましく、クロロホルムとブタノールとの組み合わせがより好ましい。クロロホルムとブタノールは、容量比で７：３〜９：１の割合で組み合わせることが好ましい。特に本発明においては、クロロホルム：ブタノール＝８：２（容量比）の混合液が有用である。
【００３８】
対象となる生物材料の種類にも依るが、有機溶媒の量は、前記水溶液を基準として５〜９５容量％で用いると良い。
【００３９】
このような有機溶媒を用いることにより、生物材料の夾雑物が有機溶媒中に取り込まれやすく、効率の良い精製ができる。
【００４０】
また本発明においては、生物材料を微粒子の存在下で、キレート試薬及び第四級アンモニウム塩を含む水溶液と、有機溶媒と共に激しく攪拌する。微粒子を加えることにより細胞が微粒子と衝突し、細胞の破壊がより効率的に行われる。この時に用いる微粒子は、通常、細胞懸濁液に対し生物学的に関与しないガラスビーズや酸化ジルコニウムの微粒子などが用いられる。通常、微粒子としては比重が２．０以上、例えば２．３〜６．３で、直径が０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍのものが用いられるが、これに限定されない。直径１ｍｍ以上だと、細胞の破壊効率が悪くなる傾向にある。
【００４１】
また、撹拌効率をより高め、細胞の破壊効率をより上げるために、上記範囲の直径を有する微粒子に加え、補助的に、０．５ｍｍよりも大きい直径を有する粒子、例えば直径が１．０ｍｍ〜２．０ｍｍのものを用いても良い。０．５ｍｍよりも大きい直径を有するこれら粒子は、前述の０．０５〜０．５ｍｍの直径を有する微粒子と任意の重量割合で混合して使用することができる。このように、異なった大きさの粒子を用いることにより、撹拌効率をより高め、細胞と粒子の衝突がより高い頻度で起こると考えられる。
【００４２】
本発明において、上記の生物材料、キレート試薬、第四級アンモニウム塩、有機溶媒及び微粒子を添加する手順は限定されず、撹拌時に全てのものがチューブ内に存在していれば良い。例えば、先ずｐＨ緩衝溶液にキレート試薬及び第４級アンモニウム塩を溶解させた水溶液を調製し、生物材料が入ったチューブに前記水溶液を加えて懸濁させ、次にこの懸濁液へ有機溶媒及び微粒子を加えて撹拌する。これら手順においては、当業者が添加時期を適宜調整することができる。
【００４３】
このようにして、目的とする核酸を高純度で得ることができる。本発明の方法では、キレート試薬と微粒子とにより細胞壁が破壊され核酸が周辺の水中に抽出され、さらに第四級アンモニウム塩と有機溶媒とにより、前記核酸が精製されると考えられる。
【００４４】
なお、本発明において、核酸とはＤＮＡ、ＲＮＡの両方を意味し、動物の糞便中に存在する細菌、ウィルス及び原虫の核酸、より詳しくは動物の糞便中に存在する感染症の原因となる細菌、ウィルス及び原虫の核酸や、動物の糞便中に存在する腫瘍細胞等の異形細胞の核酸を得る。
【００４５】
【実施例】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４６】
［実験例］
本実験例では、生物材料として、マイコバクテリア属の菌であり、ヨーネ病の原因菌であるＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（以下ヨーネ菌と略す）を含むヨーネ病に感染した牛に由来する糞便を用いた。
まず、ヨーネ菌感染牛に由来の糞便１ｇを蒸留水１０ｍＬに懸濁し、５分放置した後、上清５ｍＬを回収し遠心してヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。
【００４７】
次に、組成が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、１重量％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、７００ｍＭ　ＮａＣｌである水溶液を調製し、糞便ペレットが入ったチューブに、前記水溶液を１ｍｌ、クロロホルムとブタノールとの混合液［クロロホルム：ブタノール＝８：２（容量比）］を２ｍｌ加えた。さらに微粒子として直径０．１ｍｍ（比重２．５）、直径１．０ｍｍ及び直径２．０ｍｍのガラスビーズをそれぞれ３．０ｇずつ加え、ボルテックスミキサーで攪拌（２，５００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）した。攪拌した試料を遠心（遠心力；１０，０００Ｇ、５ｍｉｎ）し、その上清５００μＬを回収し、エタノール沈殿法により核酸ペレットを得た。
【００４８】
得られた核酸ペレットを蒸留水５０μＬに溶解し、更に蒸留水を用いてペレット溶解液の２倍段階稀釈系列を調製した。得られた核酸の稀釈系列にヨーネ菌に特異的な遺伝子であるＩＳ９００の一部の領域を増幅するためのプライマー［塩基配列がＧＡＴＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧのもの（配列番号１）及びＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴのもの（配列番号２）］、Ｔａｑポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ及び緩衝溶液を添加し、９７℃−３０秒、６５℃−３０秒、７２℃−３０秒、４０サイクルの温度条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で反応産物を検出した。
【００４９】
ボルテックスミキサーによる攪拌前におけるチューブ内の試料の写真を図１に、ボルテックスミキサーによる攪拌と遠心操作後におけるチューブ内の試料の写真を図２に示した。図１では水層（上層）が糞便成分により着色していた。図２では糞便の色素成分が有機層（下層）に移行しており、精製がなされていることが解った。
【００５０】
ＰＣＲ反応産物の検出結果を図３に示す。この実験で使用したＰＣＲプライマーでは、ＩＳ９００遺伝子が存在すれば３６２塩基対（ｂｐ）の反応産物が得られる。レーン１（左端）は核酸ペレット溶解液５０μＬの内の２５μＬを、レーン２は１２．５μＬ、レーン３は６．３μＬ、レーン４は３．１μＬ、レーン５は１．６μＬ、レーン６は０．８μＬ、レーン７は０．４μＬ、レーン８は０．２μＬ含んでいる。なお、レーンＭは分子量マーカでΦｘ１７４　ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて消化したものである。
【００５１】
レーン１からレーン５までとレーン８に、３６２ｂｐの産物が検出できた。これは糞便中のヨーネ菌から核酸抽出が行われ、かつ、ＰＣＲ反応が可能となる程度に精製も同時に行われたことを示すものである。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、生物材料から核酸の抽出と精製とを同時に行う簡便な方法を提供することができる。特に、細胞を破壊することが難しく、核酸を抽出するために特別の操作が必要であった生物材料、特にマイコバクテリウム属の細菌が、糞便等の精製が難しいとされていた生物試料中に存在する場合に、有害性の高い試薬を用いずに抽出と精製とを同時に行う簡便な方法を提供することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ボルテックスミキサーによる攪拌前におけるチューブ内の試料の写真である。
【図２】ボルテックスミキサーによる攪拌と遠心操作を行った後におけるチューブ内の試料の写真である。
【図３】ＰＣＲ反応産物のアガロースゲル電気泳動による検出結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid preparation method for obtaining a nucleic acid as a sample when performing various operations using the nucleic acid, and more specifically, it is difficult to extract from a biological sample such as stool which is difficult to purify. The present invention relates to a nucleic acid preparation method for obtaining a nucleic acid such as a bacterium belonging to the genus Mycobacterium.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, when preparing a nucleic acid from a target sample, it is common practice to select an appropriate extraction method and a purification method from the following methods, etc., according to the characteristics of the sample, and to sequentially perform two steps of extraction and purification. is there.
[0003]
(Extraction method)
As a general method of extracting nucleic acids from biological materials such as viruses, bacteria, fungi, protozoa, plants, and animals, there are methods of decomposing cell walls with enzymes such as lysozyme and extracting them into solution, and methods of extracting proteins with enzymes such as proteinases. A method of decomposing cells to destroy cells and extracting them into a solution is used.
[0004]
However, the nucleic acid extraction by these enzyme treatments requires a skilled technique, and has a problem that the treatment efficiency is poor because it takes a long time. In particular, when this extraction method is applied to cells having a rigid cell wall such as bacteria of the genus Mycobacterium or fungal fungi, the efficiency of nucleic acid extraction is extremely poor because the cells are not broken. For example, in order to extract nucleic acids from bacteria of the genus Mycobacterium, which is difficult to destroy, it is described in a paper by Vary et al. (J. Clin. Microbiol., 28 (5), 933-937, (1990)). In this method, a total of 48 hours of treatment is performed with three types of enzymes.
[0005]
Therefore, in order to overcome the problem that the cell walls are hard and it is difficult to destroy cells, there is known a method of vigorously stirring using phenol and fine particles. For example, in a paper by Giesssen et al. (J. Med. Microbiol., 36 (1992), 255-263), a sample containing a bacterium belonging to the genus Mycobacterium was analyzed using TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) and phenol. By vigorously stirring with zirconium oxide fine particles, the cells are destroyed. A similar description is given in U.S. Pat. No. 4,918,178.
[0006]
However, while this extraction method improves the efficiency of nucleic acid extraction, it has problems such as the use of a very toxic reagent called phenol and the problem that phenol contaminates the laboratory environment during the stirring operation. Low.
[0007]
(Purification method)
In order to purify a nucleic acid from a nucleic acid extract, it is necessary to remove proteins and fat-soluble contaminant components from the nucleic acid extract. Generally, a method of removing proteins and fat-soluble contaminant components using phenol / chloroform is known. There are also known a method of adsorbing nucleic acids to glass beads or the like to remove components other than nucleic acids, and a method of filtering out contaminants using a filter or the like.
[0008]
However, when the biological sample is particularly faeces, the following problems occur in the above-described purification method. For example, a method using phenol / chloroform cannot remove foreign components other than fat-soluble components present in feces. Further, in the method using glass beads, impurities in feces hinder the adsorption of nucleic acids to the glass beads. In the method using a filter, clogging of the filter is caused by impurities in feces and filtration is not possible. Therefore, these purification methods cannot obtain highly pure nucleic acids from feces.
[0009]
After actually performing an enzyme treatment with proteinase and purification of nucleic acid with phenol / chloroform using feces as a sample, a precipitate of nucleic acid was obtained by an ethanol precipitation method, and the precipitate was colored yellow or brown. This indicates that nucleic acids were not purified to high purity without removing contaminants in feces.
[0010]
Therefore, the present inventor has developed a nucleic acid purification method using a quaternary ammonium salt in order to obtain high-purity nucleic acid from stool that is particularly difficult to purify (JP-A-2002-37798A). In this method, impurities other than nucleic acids derived from feces can be removed with high efficiency.
[0011]
However, as described above, a simple and efficient extraction method has not yet been developed, and even though an excellent nucleic acid purification method proposed by the present inventors has been proposed, two methods of extraction and purification are required for nucleic acid preparation. Two steps must be performed sequentially. Therefore, in order to rapidly process a large number of samples, there has been a demand for a nucleic acid preparation method capable of easily and efficiently extracting and simultaneously purifying the nucleic acid.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a simple method for simultaneously extracting and purifying a nucleic acid from a biological material. In particular, the object of the present invention is that it is difficult to destroy cells, and it is difficult to purify stool and the like of biological materials, particularly bacteria of the genus Mycobacterium, which required a special operation for extracting nucleic acids. It is an object of the present invention to provide a simple method for simultaneously performing extraction and purification without using a highly harmful reagent when present in a biological sample.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above object can be achieved by stirring a biological material together with an aqueous solution containing a chelating reagent and a quaternary ammonium salt, an organic solvent, and fine particles. Was completed.
[0014]
That is, the present invention is characterized in that a biological material from which a nucleic acid is to be extracted and purified is stirred with an aqueous solution containing a chelating reagent and a quaternary ammonium salt, an organic solvent, and fine particles to simultaneously perform nucleic acid extraction and purification. This is a simultaneous nucleic acid extraction and purification method.
[0015]
The present invention is the above-described simultaneous nucleic acid extraction and purification method, wherein the chelating reagent is selected from the group consisting of polyaminocarboxylic acids and salts thereof.
[0016]
The present invention is the above-described simultaneous nucleic acid extraction and purification method, wherein the chelating reagent is selected from the group consisting of EDTA and a reagent similar to EDTA.
[0017]
In the present invention, the chelating reagent may be ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), O, O′-bis (2-aminophenylethylene glycol) ethylenediaminetetraacetic acid (BAPTA), N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine ( Bicine), trans-1,2-diaminocyclohexane-ethylenediaminetetraacetic acid (CyDTA), 1,3-diamino-2-hydroxypropane-ethylenediaminetetraacetic acid (DPTA-OH), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminedipropanoic acid Hydrochloride (EDDP), ethylenediamine dimethylenephosphonic acid monohydrate (EDDPO), N- (2-hydroxyethyl) ethylenediaminetriacetic acid (EDTA-OH), ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid (EDTPO), O, O'- Screw 2-aminoethyl) ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediaminediacetic acid (HBED), 1,6-hexamethylenediaminetetraacetic acid (HDTA), N- (2- (Hydroxyethyl) iminodiacetic acid (HIDA), iminodiacetic acid (IDA), 1,2-diaminopropanetetraacetic acid (methyl-EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), nitrilotripropanoic acid (NTP), nitrilotrimethylenephosphone The method for simultaneous nucleic acid extraction and purification described above, wherein the method is selected from the group consisting of trisodium acid trisodium salt (NTPO), ethylenediaminetetra (2-pyridylmethyl) (TPEN) and triethylenetetraaminehexaacetic acid (TTHA).
[0018]
The present invention is the method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein the concentration of the chelating reagent is 5 mM to 500 mM based on the aqueous solution.
[0019]
The present invention provides the nucleic acid extraction method, wherein the quaternary ammonium salt is selected from the group consisting of hexadecyltrimethylammonium bromide, hexadecylpyridinium chloride, hexadimethylene bromide, hexafluorenium bromide and methylthiazolium bromide. It is a purification method.
The present invention is the method for simultaneously purifying and extracting nucleic acids, wherein the concentration of the quaternary ammonium salt is 0.001 to 20% by weight based on the aqueous solution.
[0020]
The present invention is the above-described method for simultaneously purifying and extracting nucleic acid, wherein the organic solvent is selected from the group consisting of chloroform, carbon tetrachloride, alcohols, aromatic hydrocarbons, ethers and ketones.
The present invention is the above-described method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein a plurality of organic solvents are mixed and used at an arbitrary ratio as the organic solvent.
The present invention is the above-described method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein chloroform and alcohol are mixed and used at an arbitrary ratio as the organic solvent.
The present invention is the above-described simultaneous nucleic acid extraction and purification method, wherein the chloroform and the alcohol are in a volume ratio of chloroform: butanol = 7: 3 to 9: 1.
[0021]
The present invention is the method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein the amount of the organic solvent is 5 to 95% by volume based on the aqueous solution.
[0022]
The present invention is the above-described method for simultaneous nucleic acid extraction and purification, wherein the diameter of the fine particles is 0.05 to 0.5 mm.
The present invention relates to the method for simultaneous nucleic acid extraction and purification described above, wherein fine particles having a diameter of 0.05 to 0.5 mm are used as the fine particles, and particles having a diameter larger than 0.5 mm are mixed at an arbitrary ratio. is there.
[0023]
The present invention is the above-described simultaneous nucleic acid extraction and purification method, wherein phenol is not used.
[0024]
The present invention is the above-described method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein the biological material is a virus, a bacterium, a fungus, a protozoan, a plant or an animal.
The present invention is the method for simultaneous nucleic acid extraction and purification, wherein the bacterium belongs to the genus Mycobacterium.
The present invention is the method for simultaneous nucleic acid extraction and purification, wherein the bacterium of the genus Mycobacterium is Mycobacterium tuberculosis, an atypical acid-fast bacterium, a mycobacterium leprae, a Mycobacterium tuberculosis, or a Crohn's disease bacterium.
[0025]
The present invention is the above-described method for simultaneous purification and extraction of nucleic acids, wherein the biological material is contained in a biological sample such as tissue, body fluids, secretions, and excrement of an organism, or an environmental sample such as soil, water, and air.
The present invention is the method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein the biological sample is animal feces, sputum or blood.
The present invention is the above-described method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein the feces are derived from humans or domestic animals.
The present invention is the above-described method for simultaneous purification of nucleic acid extraction, wherein the livestock is a cow, a goat or a sheep.
[0026]
In the present invention, nucleic acid means both DNA and RNA.
[0027]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the method of the present invention, for example, in a tube, a biological material is stirred with an aqueous solution containing a chelating reagent and a quaternary ammonium salt, an organic solvent, and fine particles.
[0028]
Biological materials used in the present invention include, but are not limited to, viruses, bacteria, fungi, protozoa, plants, animals, and the like. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is particularly useful for biological materials such as fungi and Mycobacterium that are difficult to destroy cells. Bacteria of the genus Mycobacterium include, but are not limited to, Mycobacterium tuberculosis, atypical mycobacteria, Leprosy, Mycobacterium paratuberculosis, and clonal bacteria.
[0029]
These biological materials include, but are not limited to, biological samples such as biological tissues, body fluids, secretions, and excrement, and environmental samples such as soil, water, and air. Biological samples include, but are not limited to, animal feces, sputum, blood, and the like. The present invention is particularly useful for the livestock and human feces as the feces, but is not limited thereto. Further, the livestock includes, but is not limited to, cows, goats, sheep, and the like.
[0030]
Examples of the aqueous solution used in the present invention include, but are not limited to, pH buffer solutions such as a phosphate buffer, a Tris buffer, and an acetate buffer.
[0031]
As the chelating agent used in the present invention, EDTA or a polyaminocarboxylic acid similar to EDTA is preferably used. Specifically, ethylenediaminetetraacetic acid (ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid; EDTA), O, O'-bis (2-aminophenylethylene glycol) ethylenediaminetetraacetic acid (O, O'-) Bis (2-aminophenyl) ethyleneglycol-N, N, N ', N'-tetraacetic acid; BAPTA), N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (N, N-Bis (2-hydroxyethyl) glycine; Bicine) ), Trans-1,2-diaminocyclohexane-ethylenediaminetetraacetic acid (trans-1,2-diaminocyclohexane-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid; CyDTA), 1,3- Amino-2-hydroxypropane-ethylenediaminetetraacetic acid (1,3-diamino-2-hydroxypropane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid; DPTA-OH), diethylenetriaminepentaacetic acid (Diethylenetriamine-N, N, N ', N ", N" -pentaacetic acid; DTPA), ethylenediamine-N, N'-dipropionic acid, dihydrochloride; EDDP, ethylenediamine dimethylenephosphonic acid monohydrate (Ethylenediamine-N) N'-bis (methylenephosphonic scid), hemihydrate; EDDPO), N- (2-h (Droxyethyl) ethylenediaminetriacetic acid (N- (2-hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N ′, N ″ -triacetic acid; EDTA-OH), ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid (Ethylenediamine-N, N, N ′, N′-) tetrakis (methylenephosphonic acid); EDTPO), O, O'-bis (2-aminoethyl) ethylene glycol tetraacetic acid (O, O'-Bis (2-aminoethyl) ethyleneglycol-N, N, N ', N'-tetraacetic) acid; EGTA), N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine diacetate (N, N'-Bis (2-hydroxybenzyl) ethylenedia) ine-N, N'-diacetic acid; HBED), 1,6-hexamethylenediaminetetraacetic acid (1,6-hexamethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid; HDTA), N- (2- (Hydroxyethyl) iminodiacetic acid (N- (2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid; HIDA), iminodiacetic acid (IDA), 1,2-diaminopropanetetraacetic acid (1,2-diaminpropane-N, N, N) ', N'-tetraacetic acid; methyl-EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), nitrilotripropionic acid acid; NTP), nitrilotrimethylene phosphonic acid trisodium salt (Nitrilotris (methylenephosphonic acid), trisodium salt; NTPO), ethylenediamine tetra (2-pyridylmethyl) (N, N, N ', N'-Tetrakis (2-pyridylmethyl) ) Ethylenediamine; TPEN), and triethylenetetraamine hexaacetic acid (Triethylenetetramine-N, N, N ′, N ″, N ′ ″, N ′ ″-hexaacetic acid; TTHA). These chelating reagents may be used alone or in combination of two or more.
[0032]
One of the factors that maintain the structure of the cell wall is the presence of calcium ions. These chelating reagents are easily coordinated with calcium ions. It is considered that these chelating reagents coordinate with calcium ions in the cell wall, alter the structure of the cell wall, thereby making it impossible to maintain the structure and easily destroy the cell wall.
[0033]
In the present invention, the chelating reagent may be used at a concentration of, for example, 5 mM to 250 mM, preferably 10 mM to 250 mM, based on the aqueous solution. If the concentration of the chelating reagent is less than 5 mM, the cell destruction efficiency tends to be low. If the concentration is higher than 500 mM, additional treatment is required in the method of the present invention in which nucleic acid purification after cell destruction is performed simultaneously. There is.
[0034]
The present invention is characterized in that it is not necessary to use another denaturing agent such as a conventional phenol in order to destroy cells using a chelating reagent, which enables simpler and safer nucleic acid extraction. .
[0035]
The quaternary ammonium salt used in the present invention is an onium salt containing a cationized nitrogen atom N ⁺ , and preferably has surface activity. Specific examples of the quaternary ammonium salts include hexadecyltrimethylammonium bromide, hexadecylpyridinium chloride, hexadimethylline bromide, and hexadimethylline bromide. Examples include, but are not limited to, thiazolium bromide. For example, the hydrophobic group may be appropriately adjusted. These quaternary ammonium salts may be used alone or in combination of two or more.
[0036]
The quaternary ammonium salt may be used at a concentration of 0.001 to 20% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight, based on the aqueous solution. If the amount is less than 0.001% by weight, the purification effect is small, and if it exceeds 20% by weight, the quaternary ammonium salt itself is likely to precipitate.
[0037]
Examples of the organic solvent used in the present invention include, but are not limited to, chloroform, carbon tetrachloride, alcohols, aromatic hydrocarbons such as benzene, ethers, and ketones. In aromatic hydrocarbons, it is preferable not to use highly toxic phenol. Further, it is preferable that these organic solvents do not mix with water at an arbitrary ratio. These organic solvents may be used alone or in combination of two or more. A combination of chloroform and alcohol is preferable, and a combination of chloroform and butanol is more preferable. Chloroform and butanol are preferably combined in a volume ratio of 7: 3 to 9: 1. Particularly, in the present invention, a mixed solution of chloroform: butanol = 8: 2 (volume ratio) is useful.
[0038]
The amount of the organic solvent is preferably 5 to 95% by volume based on the aqueous solution, although it depends on the type of the biological material to be treated.
[0039]
By using such an organic solvent, impurities of the biological material are easily taken into the organic solvent, and efficient purification can be performed.
[0040]
In the present invention, the biological material is vigorously stirred with an aqueous solution containing a chelating reagent and a quaternary ammonium salt and an organic solvent in the presence of fine particles. By adding the fine particles, the cells collide with the fine particles, and the cells are more efficiently destroyed. As the fine particles used at this time, glass beads or zirconium oxide fine particles which are not biologically involved in the cell suspension are usually used. Usually, fine particles having a specific gravity of 2.0 or more, for example, 2.3 to 6.3, and a diameter of 0.05 mm to 0.5 mm are used, but are not limited thereto. If the diameter is 1 mm or more, the cell breaking efficiency tends to be poor.
[0041]
In addition, in order to further increase the stirring efficiency and further increase the cell destruction efficiency, in addition to the fine particles having a diameter in the above range, particles having a diameter larger than 0.5 mm, for example, 1.0 mm to 2.0 mm may be used. These particles having a diameter larger than 0.5 mm can be used by mixing with the above-mentioned fine particles having a diameter of 0.05 to 0.5 mm at an arbitrary weight ratio. Thus, it is considered that by using particles of different sizes, the stirring efficiency is further increased and the collision between the cells and the particles occurs more frequently.
[0042]
In the present invention, the procedure for adding the above-mentioned biological material, chelating reagent, quaternary ammonium salt, organic solvent, and fine particles is not limited, and it is sufficient that all of the substances are present in the tube during stirring. For example, first, an aqueous solution in which a chelating reagent and a quaternary ammonium salt are dissolved in a pH buffer solution is prepared, and the aqueous solution is added to and suspended in a tube containing a biological material. Add the fine particles and stir. In these procedures, those skilled in the art can appropriately adjust the timing of addition.
[0043]
Thus, the target nucleic acid can be obtained with high purity. In the method of the present invention, it is considered that the cell wall is broken by the chelating reagent and the fine particles, the nucleic acid is extracted into the surrounding water, and the nucleic acid is further purified by the quaternary ammonium salt and the organic solvent.
[0044]
In the present invention, the term “nucleic acid” means both DNA and RNA, and includes bacteria present in animal feces, nucleic acids of viruses and protozoa, and more specifically, bacteria present in animal feces that cause infectious diseases. And nucleic acids of viruses and protozoa, and nucleic acids of atypical cells such as tumor cells present in animal feces.
[0045]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
[0046]
[Example of experiment]
In the present experimental example, fecal matter derived from cattle infected with Johne's disease, which contains Mycobacterium paratuberculosis (hereinafter abbreviated as Yeast's bacterium), which is a bacterium belonging to the genus Mycobacterium and is a causative bacterium of Johne's disease, was used as a biological material.
First, 1 g of stool derived from a Y. fungus infected cow was suspended in 10 mL of distilled water, left for 5 minutes, and then 5 mL of the supernatant was collected and centrifuged to obtain a stool pellet containing Y. fungi.
[0047]
Next, an aqueous solution having a composition of 10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 1% by weight hexadecyltrimethylammonium bromide and 700 mM NaCl was prepared, and 1 ml of the aqueous solution was mixed in a tube containing stool pellets, and chloroform and butanol were mixed. 2 ml of the liquid [chloroform: butanol = 8: 2 (volume ratio)] was added. Further, 3.0 g of glass beads each having a diameter of 0.1 mm (specific gravity 2.5), a diameter of 1.0 mm and a diameter of 2.0 mm were added, and the mixture was stirred with a vortex mixer (2,500 rpm, 60 min). The stirred sample was centrifuged (centrifugal force; 10,000 G, 5 min), and 500 μL of the supernatant was recovered, and a nucleic acid pellet was obtained by an ethanol precipitation method.
[0048]
The obtained nucleic acid pellet was dissolved in 50 μL of distilled water, and a two-fold dilution series of the pellet solution was prepared using distilled water. Primers for amplifying a partial region of IS900, which is a gene specific for Mycobacterium tuberculosis, in a dilution series of the obtained nucleic acid [base sequence is GATCGGAACGTCGGCTGGTCAGG (SEQ ID NO: 1) and ACGACGACCGGCAGCGGATGTCCT (SEQ ID NO: 2) ], A Taq polymerase enzyme, dNTPs, and a buffer solution were added, and a PCR reaction was performed under the temperature conditions of 97 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds, and 40 cycles. After the PCR reaction, the reaction products were detected by the procedure of agarose gel electrophoresis, ethidium staining, and photography using a transilluminator.
[0049]
FIG. 1 shows a photograph of the sample in the tube before stirring by the vortex mixer, and FIG. 2 shows a photograph of the sample in the tube after the stirring and centrifugation operation by the vortex mixer. In FIG. 1, the aqueous layer (upper layer) was colored by fecal components. In FIG. 2, the fecal pigment component migrated to the organic layer (lower layer), indicating that purification was performed.
[0050]
FIG. 3 shows the detection results of the PCR reaction products. With the PCR primers used in this experiment, a reaction product of 362 base pairs (bp) is obtained if the IS900 gene is present. Lane 1 (left end) contains 25 μL of 50 μL of the nucleic acid pellet lysate, Lane 2 has 12.5 μL, Lane 3 has 6.3 μL, Lane 4 has 3.1 μL, Lane 5 has 1.6 μL, and Lane 6 has 0.1 μL. 8 μL, lane 7 contains 0.4 μL and lane 8 contains 0.2 μL. Lane M is a molecular weight marker obtained by digesting Φx174 DNA with the restriction enzyme HincII.
[0051]
A 362 bp product was detected in lane 1 to lane 5 and lane 8. This indicates that nucleic acid extraction was performed from S. cerevisiae stool and that purification was also performed simultaneously to such an extent that a PCR reaction was possible.
[0052]
【The invention's effect】
According to the present invention, a simple method for simultaneously extracting and purifying a nucleic acid from a biological material can be provided. In particular, biological materials that were difficult to destroy cells and required special operations to extract nucleic acids, especially bacteria of the genus Mycobacterium, were used in biological samples that were considered difficult to purify such as feces. When present, it is possible to provide a simple method for simultaneously performing extraction and purification without using a highly harmful reagent.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph of a sample in a tube before stirring by a vortex mixer.
FIG. 2 is a photograph of a sample in a tube after performing stirring and centrifugation by a vortex mixer.
FIG. 3 shows the results of detection of PCR reaction products by agarose gel electrophoresis.

Claims

Simultaneous nucleic acid extraction and purification characterized by stirring a biological material from which nucleic acid is to be extracted and purified, together with an aqueous solution containing a chelating reagent and a quaternary ammonium salt, an organic solvent, and fine particles, and simultaneously extracting and purifying the nucleic acid. Law.

The method according to claim 1, wherein the chelating reagent is selected from the group consisting of polyaminocarboxylic acids and salts thereof.

The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to claim 1, wherein the chelating reagent is selected from the group consisting of EDTA and a reagent similar to EDTA.

The chelating reagent includes ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), O, O'-bis (2-aminophenylethylene glycol) ethylenediaminetetraacetic acid (BAPTA), N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), trans -1,2-diaminocyclohexane-ethylenediaminetetraacetic acid (CyDTA), 1,3-diamino-2-hydroxypropane-ethylenediaminetetraacetic acid (DPTA-OH), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminedipropanoic acid hydrochloride (EDDP) ), Ethylenediamine dimethylenephosphonic acid monohydrate (EDDPO), N- (2-hydroxyethyl) ethylenediaminetriacetic acid (EDTA-OH), ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid (EDTPO), O, O'-bis (2- A Noethyl) ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), N, N'-bis (2-hydroxybenzyl) ethylenediamine diacetate (HBED), 1,6-hexamethylenediaminetetraacetic acid (HDTA), N- (2-hydroxyethyl) Iminodiacetic acid (HIDA), iminodiacetic acid (IDA), 1,2-diaminopropanetetraacetic acid (methyl-EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), nitrilotripropanoic acid (NTP), trisodium nitrilotrimethylenephosphonate The nucleic acid extraction simultaneous purification according to any one of claims 1 to 3, which is selected from the group consisting of a salt (NTPO), ethylenediaminetetra (2-pyridylmethyl) (TPEN) and triethylenetetraaminehexaacetic acid (TTHA). Law.

The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to any one of claims 1 to 4, wherein the concentration of the chelating reagent is 5 mM to 500 mM based on the aqueous solution.

The quaternary ammonium salt is selected from the group consisting of hexadecyltrimethylammonium bromide, hexadecylpyridinium chloride, hexadimethylene bromide, hexafluorenium bromide and methylthiazolium bromide. 6. The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to item 4.

The simultaneous nucleic acid extraction and purification method according to any one of claims 1 to 6, wherein the concentration of the quaternary ammonium salt is 0.001 to 20% by weight based on the aqueous solution.

The method for simultaneous nucleic acid extraction and purification according to any one of claims 1 to 7, wherein the organic solvent is selected from the group consisting of chloroform, carbon tetrachloride, alcohols, aromatic hydrocarbons, ethers and ketones.

The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to any one of claims 1 to 8, wherein a plurality of organic solvents are mixed and used at an arbitrary ratio as the organic solvent.

The method for simultaneous purification and extraction of nucleic acids according to any one of claims 1 to 9, wherein chloroform and alcohols are mixed and used at an arbitrary ratio as the organic solvent.

The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to any one of claims 1 to 10, wherein the organic solvent is a mixed solution having a volume ratio of chloroform: butanol = 7: 3 to 9: 1.

The simultaneous nucleic acid extraction and purification method according to any one of claims 1 to 11, wherein the amount of the organic solvent is 5 to 95% by volume based on the aqueous solution.

The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to any one of claims 1 to 12, wherein the diameter of the fine particles is 0.05 to 0.5 mm.

The fine particles having a diameter of 0.05 to 0.5 mm are used as the fine particles, and particles having a diameter larger than 0.5 mm are mixed at an arbitrary ratio and used. For simultaneous purification of nucleic acid extraction.

The method for simultaneously purifying and extracting nucleic acids according to any one of claims 1 to 14, wherein phenol is not used.

The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to any one of claims 1 to 15, wherein the biological material is a virus, a bacterium, a fungus, a protozoan, a plant or an animal.

17. The method for simultaneous nucleic acid extraction and purification according to claim 16, wherein the bacterium belongs to the genus Mycobacterium.

18. The method for simultaneous purification and extraction of nucleic acid according to claim 17, wherein the bacterium belonging to the genus Mycobacterium is Mycobacterium tuberculosis, an atypical acid-fast bacterium, a leprosy, a Mycobacterium tuberculosis or a Crohn's disease bacterium.

The nucleic acid extraction method according to any one of claims 1 to 18, wherein the biological material is contained in a biological sample such as a tissue, a body fluid, a secretion, or an excrement of an organism or an environmental sample such as soil, water, or air. Purification method.

20. The method according to claim 19, wherein the biological sample is animal feces, sputum or blood.

21. The method for simultaneous purification of nucleic acid extraction according to claim 20, wherein the feces are derived from humans or domestic animals.

22. The method for simultaneous nucleic acid extraction and purification according to claim 21, wherein the livestock is a cow, goat or sheep.