JP2004002239A

JP2004002239A - Tnf-alpha production inhibitor

Info

Publication number: JP2004002239A
Application number: JP2002160833A
Authority: JP
Inventors: Jun Takeuchi; 竹内　潤
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2004-01-08

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an effective and highly safe TNF-α production inhibitor. <P>SOLUTION: The TNF-α production inhibitor contains an oligosaccharide with a sulfate group as its active ingredient, specifically represented by formula (1) [(Hex-HexN)n] or formula (2) [(HexN-Hex)n] [wherein Hex is a hexose residue; HexN is a hexosamine residue which may be N-acetylated or N-sulfated; at least one hydroxyl group or amino group of Hex and/or HexN is sulfated; n is an integer of 1 to 5; (-) is a glucosidic linkage; and a nonreducing end may be further bonded with sialic acid]. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＮＦ−α産生抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本明細書において用いる略号の意味を説明する。
【０００３】
「ＴＮＦ−α」は「腫瘍壊死因子α」を、「Ｈｅｘ」は「ヘキソース残基」を、「ＨｅｘＮ」は「Ｎ−アセチル化又はＮ−硫酸化されていてもよいヘキソサミン残基」を、「Ｇａｌ」は「ガラクトース残基」を、「ＧｌｃＮＡｃ」は「Ｎ−アセチルグルコサミン残基」を、「ＭａｎＮＡｃ」は「Ｎ−アセチルマンノサミン残基」を、「ＮｅｕＡｃ」は「Ｎ−アセチルノイラミン酸残基」を、「６Ｓ」は「６−Ｏ−硫酸エステル」を、「β１−４」は「β１，４グリコシド結合」をそれぞれ意味する。
ＴＮＦ−αは、マクロファージなどから生産されるサイトカインの一種である。ＴＮＦ−αはグラム陰性菌、ウイルス、マイトジェンなどの刺激によって、ｉｎ　ｖｉｖｏで誘導される。ＴＮＦ−αが受容体に結合すると、シグナルが細胞内に伝達され、タンパク質のチロシンホスファターゼ、ホスホリパーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ、スフィンゴミエリナーゼなどの活性化といったシグナル伝達機構が働く。その結果転写因子ＮＦκＢの活性化などが引き起こされることから、炎症に関与しているということができる。またＴＮＦ−αには、ＨＩＶウイルスの増殖を促進させる活性や、自己免疫疾患であるリウマチを悪化させる活性等があることが知られている。したがって、ＴＮＦ−αの産生を抑制する薬剤が提供されれば、実験試薬用途のみならず、炎症の抑制、ＨＩＶウイルスの増殖抑制及びリウマチ等の自己免疫疾患の改善等への応用も期待できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、炎症の抑制、ＨＩＶウイルスの増殖抑制及び自己免疫疾患等の改善等に応用しうる、有効かつ安全性の高いＴＮＦ−α産生抑制剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、硫酸基を有するオリゴ糖がＴＮＦ−αの産生を抑制する活性を有することを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、硫酸基を有するオリゴ糖を有効成分とするＴＮＦ−α産生抑制剤（以下、本発明抑制剤という）を提供する。
【０００７】
本発明抑制剤の有効成分である「硫酸基を有するオリゴ糖」は、下記一般式（１）又は（２）で示されるものが好ましい。
【０００８】
（Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ）ｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
（ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ）ｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（２）
（式中、ＨｅｘとＨｅｘＮの少なくとも１つのヒドロキシル基又はアミノ基は硫酸化されており、ｎは１〜５の整数を、−はグリコシド結合を示す。また非還元末端側にさらにシアル酸が結合していてもよい。）
【０００９】
この「ヘキソース残基」は、ガラクトース残基、グルコース残基、マンノース残基又はフコース残基であることが好ましい。また「ヘキソサミン残基」は、Ｎ−アセチル化又はＮ−硫酸化されていてもよいグルコサミン残基、ガラクトサミン残基又はマンノサミン残基であることが好ましい。
【００１０】
また「ヘキソサミン残基」はＮ−アセチル化されているものが好ましい。
【００１１】
また「ヘキソース残基」はガラクトース残基であることが好ましい。
【００１２】
また「ヘキソサミン残基」はＮ−アセチルグルコサミン残基であることが好ましい。
【００１３】
またヘキソース残基及びヘキソサミン残基の両方について、それぞれ１以上のヒドロキシル基が硫酸化されていることが好ましい。
【００１４】
また前記一般式（１）において−で示されるグリコシド結合がβ１，４グリコシド結合であり、一般式（２）において−で示されるグリコシド結合がβ１，３グリコシド結合であるものが好ましい。
【００１５】
また、ヘキソース残基のＣ６位及びＣ４位並びにヘキソサミン残基のＣ３位及びＣ６位から選ばれる炭素原子に結合したヒドロキシル基、またはアミノ基が硫酸化されているものが好ましい。
【００１６】
また本発明抑制剤の有効成分である「硫酸基を有するオリゴ糖」は、少なくとも下記式（３）で示される２糖を繰り返し構成単位として１単位以上含むものであることが好ましい。
【００１７】
Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（３）
（式中、−はグリコシド結合を表す）
そのなかでも、「硫酸基を有するオリゴ糖」は下記式（４）で示されるものが好ましい。
【００１８】
Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　・・・（４）
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本発明の抑制剤に用いられる硫酸基を有するオリゴ糖は、硫酸基を有しているオリゴ糖である限りにおいて特に限定されない。例えば、天然物、天然物を分解して得られた物、化学的にあるいは酵素的に合成した物等のいずれでもよい。なお、硫酸基を有するオリゴ糖の調製方法の一例を後述の実施例に示す。
【００２０】
硫酸基を有するオリゴ糖は、中でも下記一般式（１）又は（２）で示されるものであることが好ましい。
【００２１】
（Ｈｅｘ−ＨｅｘＮ）ｎ　　　・・・（１）
（ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ）ｎ　　　・・・（２）
（式中、ＨｅｘとＨｅｘＮの少なくとも１つのヒドロキシル基又はアミノ基は硫酸化されており、ｎは１〜５の整数を、−はグリコシド結合を表す。また非還元末端側にさらにシアル酸が結合していてもよい）
上記式（１）、（２）中のヘキソース残基は、ガラクトース残基、グルコース残基、マンノース残基又はフコース残基であることが好ましく、ガラクトース残基であることがより好ましい。
【００２２】
また、上記式（１）、（２）中のヘキソサミン残基は、Ｎ−アセチル化又はＮ−硫酸化されていてもよいグルコサミン残基、ガラクトサミン残基又はマンノサミン残基であることが好ましい。
【００２３】
上記ヘキソサミン残基はＮ−アセチル化されているものがより好ましい。最も好ましいヘキソサミン残基は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である。
【００２４】
また、上記ヘキソース残基及び上記ヘキソサミン残基の両方について、それぞれ１以上のヒドロキシル基が硫酸化されているものが好ましい。
【００２５】
また、上記一般式（１）において−で示されるグリコシド結合がβ１，４グリコシド結合であり、上記一般式（２）において−で示されるグリコシド結合がβ１，３グリコシド結合であるものが好ましい。
【００２６】
さらに、本発明における硫酸基を有するオリゴ糖は、上記一般式（１）または（２）において、ヘキソース残基のＣ６位及びＣ４位並びにヘキソサミン残基のＣ３位及びＣ６位から選ばれる炭素原子に結合したヒドロキシル基、またはアミノ基が硫酸化されたものであることが好ましい。
【００２７】
このような硫酸基を有するオリゴ糖としては、ケラタン硫酸の基本構造（ガラクトース残基またはガラクトース−６−Ｏ−硫酸残基と、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸残基とが交互にグリコシド結合した構造）を少なくとも含む２糖以上のオリゴ糖であることが特に好ましい。本発明に好ましく用いられるオリゴ糖は、通常には、硫酸化されたＮ−アセチルグルコサミン残基を還元末端に有する２〜１０糖のオリゴ糖であり、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されているものが好ましく、ガラクトース残基の６位のヒドロキシル基およびＮ−アセチルグルコサミン残基の６位の両方が硫酸化されているものがより好ましい。また、本発明で用いられる硫酸基を有するオリゴ糖は、２〜４糖のオリゴ糖であることが特に好ましい。
【００２８】
本発明で用いられる硫酸基を有するオリゴ糖は、シアル酸残基及び／又はフコース残基を含んでいてもよい。通常には、シアル酸残基は、α２，３又はα２，６グリコシド結合で、非還元末端のガラクトース残基に結合し、フコース残基は、α１，３グリコシド結合でＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸残基に結合する。
【００２９】
また、本発明で用いられるオリゴ糖の糖鎖部分が保持されている限り、例えば、その還元末端に他の分子が結合していてもよい。他の分子としては、脂質分子、タンパク質分子等が挙げられる。
【００３０】
本発明で用いられる硫酸基を有するオリゴ糖は、さらに好ましくは、少なくとも、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）（式中、−はグリコシド結合を表す）で示される２糖を繰り返し構成単位として１単位以上含むケラタン硫酸オリゴ糖である。
【００３１】
さらに、上記硫酸基を有するオリゴ糖として、下記式（４）で示される二硫酸化Ｎ−アセチルラクトサミン２糖（以下、「Ｌ４」ともいう）が好適な例として挙げられる。
【００３２】
Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）　　　　　　・・・（３）
硫酸基を有するオリゴ糖としては、下記式（４）〜（９）で示されるものも挙げられる。以下、（４）で示されるオリゴ糖を「Ｌ４Ｌ４」、（５）で示されるオリゴ糖を「ＳＬ２Ｌ４」、（６）で示されるオリゴ糖を「Ｋ４」、（７）で示されるオリゴ糖を「Ｇ４Ｌ４」、（８）で示されるオリゴ糖を「Ｋ２」、（９）で示されるオリゴ糖を「Ｍ４」ともいう。
【００３３】
Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）β１−３Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）　　・・・（４）
ＮｅｕＡｃ〜Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）β１−３Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）　・・・（５）
ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）β１−３Ｇａｌ（６Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（６）
ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）β１−３Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（７）
ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）β１−３Ｇａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（８）
Ｇａｌ（６Ｓ）β１−４ＭａｎＮＡｃ（６Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（９）
（式中、〜はα２，３又はα２，６グリコシド結合を表す。）
【００３４】
また、本発明に用いられる硫酸基を有するオリゴ糖は、電離した状態のもの、プロトンが付加した構造のものをも包含する。また硫酸基を有するオリゴ糖の薬学的に許容される塩をも包含する。
【００３５】
薬学的に許容される塩とは、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム、リチウム）、アルカリ土類金属（カルシウム等）、アンモニウム等の無機塩基との間で形成された塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との間で形成された塩のうち、薬学的に許容されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
なお、本発明で用いられる硫酸基を有するオリゴ糖は、上記した各オリゴ糖のうちの単一の種からなっていても、複数種の混合物であってもよい。
【００３７】
本発明で用いられる硫酸基を有するオリゴ糖の由来や製造方法も特に限定されず、例えばケラタン硫酸を分解して得られる生成物であってもよく、また、例えばＮ−アセチルラクトサミンや、Ｎ−アセチルラクトサミンが２単位以上結合してなるオリゴ糖等を硫酸化して得られる生成物であってもよい。また、化学合成により得られる生成物であってもよい。
【００３８】
このような硫酸基を有するオリゴ糖の中でも、ケラタン硫酸、好ましくは後述する高硫酸化ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖（ケラタン硫酸由来のオリゴ糖）が好ましい。このようなケラタン硫酸オリゴ糖は、例えばケラタン硫酸（好ましくは高硫酸化ケラタン硫酸）の緩衝溶液にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ型ケラタン硫酸分解酵素、例えばバチルス属細菌由来のケラタナーゼＩＩ（特開平２−５７１８２号公報）、またはバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株由来のケラタン硫酸分解酵素（国際公開第ＷＯ９６／１６１６６号）を作用させて分解した後、得られた分解物を分画することにより得ることができる。得られたオリゴ糖は通常の分離精製方法、例えば、エタノール沈殿による分画、ゲル濾過および陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離精製法により、目的のオリゴ糖を分離精製することができる。このような製造方法の例は、国際公開第ＷＯ９６／１６９７３号に記載されている。
【００３９】
なお、原料となるケラタン硫酸は、主としてガラクトースまたはガラクトース−６−Ｏ−硫酸とＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸との２糖の繰り返し構造で構成され、動物種および器官などによって硫酸含量が異なっているが、通常はサメなどの軟骨魚類、クジラ、ウシなどの哺乳動物の軟骨、骨や角膜などの生原料から製造されるものを用いることができる。
【００４０】
原料として使用されるケラタン硫酸は、通常入手できるものであればよく、特に限定されないが、構成糖であるガラクトース残基が硫酸化された高硫酸化ケラタン硫酸（構成２糖あたり１．５〜２分子の硫酸基を含む高硫酸化ケラタン硫酸をケラタンポリ硫酸ということもある）を用いることが好ましい。また、ガラクトース残基の硫酸基の位置として、６位が好ましい。このような高硫酸化ケラタン硫酸は、たとえば、サメなどの軟骨魚類のプロテオグリカンから取得できる。また、市販されているものを使用することもできる。
【００４１】
例えば、Ｌ４、Ｌ４Ｌ４及びＳＬ２Ｌ４については国際公開第ＷＯ９６／１６９７３号に記載の方法で製造することができる。またＫ４、Ｇ４Ｌ４及びＫ２については特開２０００−２５６３８５号公報に記載の方法で製造することができる。またＭ４については特開２００２−２９９７４号公報に記載の方法で製造することができる。
【００４２】
本発明抑制剤の有効成分である「硫酸基を有するオリゴ糖」は、その使用の目的に応じて適宜精製されたものを用いることができる。例えば本発明抑制剤を実験等の試薬として用いる場合には、ＴＮＦ−α産生抑制作用の阻害物質を実質的に含有しない程度に精製されたものであることが好ましい。本発明抑制剤を医薬として用いる場合には、ＴＮＦ−α産生抑制作用の阻害物質を実質的に含有しないことはもとより、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を含まないものであることが好ましい。
【００４３】
本発明抑制剤を医薬として利用する場合について、以下に説明する。
本発明抑制剤は、ＴＮＦ−αの産生の抑制が求められる疾患に対して用いることができ、その限りにおいて、適用可能な具体的疾患は限定されない。
【００４４】
ＴＮＦ−αの産生の抑制が求められる疾患の一例としては、炎症、ＨＩＶウイルス感染（ＡＩＤＳ）、リウマチ等の自己免疫疾患等が挙げられる。これら疾患のいずれにも本発明抑制剤を適用することができる。
【００４５】
本発明抑制剤は、ＴＮＦ−αの産生の抑制が求められる疾患に対してあらゆる目的で適用することができる。例えば、純然とした治療目的のみならず、疾患の予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）等を目的として適用することができる。
【００４６】
本発明抑制剤は、対象となる疾患の性質や進行状況、投与方法などに応じて、任意の剤形を適宜選択することができる。
【００４７】
すなわち、本発明抑制剤は注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入などにより投与することができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
【００４８】
本発明抑制剤の有効成分である硫酸基を有するオリゴ糖の配合量ならびに本発明抑制剤の投与量は、この抑制剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重、年齢、性別等に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、硫酸基を有するオリゴ糖の臨床量としては成人１日１回あたり５０〜５０００ｍｇが例示される。
【００４９】
なお、本発明抑制剤の有効成分である硫酸基を有するこれらのオリゴ糖の安全性については、国際公開第ＷＯ９６／１６９７３号、特開２０００−２５６３８５号公報、特開２００２−２９９７４号公報等に示されている。
【００５０】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】
ラットの腹腔内から採取したマクロファージを用いて、硫酸基を有するオリゴ糖（Ｌ４）によるＴＮＦ−α産生に対する効果を試験した。
【００５２】
マクロファージを採取する５日前に、４％のチオグリコレート・ブロス（ＴｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅＢｒｏｔｈ；ＤＩＦＣＯ社製）を６週齢のルイス系ラット（雌）の腹腔に１０ｍｌ投与した。
【００５３】
ＲＰＭＩ１６４０液体培地を麻酔したラットの腹腔に２５ｍｌ注入し、しばらく放置した後培地を回収した。この操作を３回繰り返して腹腔内のマクロファージを採取した。
【００５４】
検鏡したマクロファージの細胞数を計測し、１０％仔ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ１６４０液体培地を用いて細胞を洗浄し、同液体培地に細胞を懸濁して、２ｘ１０^５個／ウエルとなるように９６穴の平底プレートにまいた。
【００５５】
３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３時間培養し、同液体培地で洗浄して浮遊細胞を除き、プレートに付着した細胞を腹腔内マクロファージとして試験に用いた。
【００５６】
同液体培地を洗浄後のプレートに２００μｌ／ウエル入れ、リポ多糖（ＬＰＳ）（シグマ社製）を終濃度０．１ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。
【００５７】
ＬＰＳの添加と同時に、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌとなるようにＬ４を添加した。各濃度ともｎ＝６とした。
【００５８】
また、ＴＮＦ−αの産生抑制作用が知られているプレドニゾロン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ；塩野義製薬株式会社製）についてもＬ４と同様に試験した。添加濃度は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌとし、各濃度ともｎ＝４とした。
【００５９】
３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０時間培養し、培養上清を回収して、培養上清中のＴＮＦα濃度をラット−ＴＮＦαＥＬＩＳＡキット（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）を用いてを測定した。平均値および標準誤差を算出し、パラメトリックなＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて統計学的有意性の検討を行った。結果を図１に示す。なお、図中の＊＊はｐ＜０．０１で有意な差があることを、＊はｐ＜０．０５で有意な差があることをそれぞれ示す。また図中の「無添加」は、ＬＰＳを添加しなかったものを示す。
【００６０】
図１から、硫酸基を有するオリゴ糖（Ｌ４）によって、マクロファージによるＴＮＦαの産生が抑制されることが示された。特に、Ｌ４を１０ｎｇ／ｍｌ添加した場合及び１００ｎｇ／ｍｌ添加した場合において、有意な産生抑制効果が見られた。
【００６１】
また図１から、Ｌ４はプレドニゾロンの１／１００〜１／１０００量で同等のＴＮＦα産生抑制能を発揮することが示された。すなわち、Ｌ４のＴＮＦα産生抑制能は、プレドニゾロンに比して顕著に高い（約１００〜１０００倍）ことが示された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明抑制剤は、ＴＮＦαの産生を顕著に抑制できることから極めて有用である。また本発明抑制剤は、実験用試薬のみならず医薬として利用することもでき、しかもその安全性も高いことから極めて有用である。
【００６３】
【図面の簡単な説明】
【図１】硫酸基を有するオリゴ糖（Ｌ４）による、ＴＮＦαの産生抑制作用を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a TNF-α production inhibitor.
[0002]
[Prior art]
First, the meanings of the abbreviations used in this specification will be described.
[0003]
“TNF-α” refers to “tumor necrosis factor α”, “Hex” refers to a “hexose residue”, and “HexN” refers to a “hexosamine residue that may be N-acetylated or N-sulfated”. “Gal” represents “galactose residue”, “GlcNAc” represents “N-acetylglucosamine residue”, “ManNAc” represents “N-acetylmannosamine residue”, and “NeuAc” represents “N-acetylneuron residue”. “Laminic acid residue”, “6S” means “6-O-sulfate”, and “β1-4” means “β1,4 glycosidic bond”.
TNF-α is a type of cytokine produced from macrophages and the like. TNF-α is induced in vivo by stimulation with Gram-negative bacteria, viruses, mitogens and the like. When TNF-α binds to the receptor, a signal is transmitted into the cell, and a signal transmission mechanism such as activation of protein tyrosine phosphatase, phospholipase A, protein kinase C, phosphatidylcholine-specific phospholipase C, sphingomyelinase and the like works. As a result, activation of the transcription factor NFκB and the like are caused, and it can be said that the protein is involved in inflammation. It is known that TNF-α has an activity of promoting the growth of HIV virus, an activity of exacerbating rheumatism which is an autoimmune disease, and the like. Therefore, if a drug that suppresses the production of TNF-α is provided, it can be expected to be applied not only to experimental reagents, but also to suppression of inflammation, suppression of HIV virus growth, and improvement of autoimmune diseases such as rheumatism.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above problems, and provides an effective and highly safe TNF-α production inhibitor which can be applied to suppression of inflammation, suppression of HIV virus growth, improvement of autoimmune diseases and the like. The task is to provide.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that an oligosaccharide having a sulfate group has an activity of suppressing the production of TNF-α, thereby completing the present invention.
[0006]
That is, the present invention provides a TNF-α production inhibitor (hereinafter, referred to as the inhibitor of the present invention) containing an oligosaccharide having a sulfate group as an active ingredient.
[0007]
The “oligosaccharide having a sulfate group” which is an active ingredient of the inhibitor of the present invention is preferably represented by the following general formula (1) or (2).
[0008]
(Hex-HexN) n (1)
(HexN-Hex) n (2)
(In the formula, at least one hydroxyl group or amino group of Hex and HexN is sulfated, n is an integer of 1 to 5,-represents a glycosidic bond, and sialic acid is further bonded to the non-reducing terminal side. May be done.)
[0009]
This “hexose residue” is preferably a galactose residue, a glucose residue, a mannose residue or a fucose residue. The “hexosamine residue” is preferably a glucosamine residue, a galactosamine residue or a mannosamine residue which may be N-acetylated or N-sulfated.
[0010]
The “hexosamine residue” is preferably N-acetylated.
[0011]
The “hexose residue” is preferably a galactose residue.
[0012]
Further, the “hexosamine residue” is preferably an N-acetylglucosamine residue.
[0013]
In addition, it is preferable that at least one hydroxyl group of each of the hexose residue and the hexosamine residue is sulfated.
[0014]
Further, it is preferable that the glycoside bond represented by-in the general formula (1) is a β1,4 glycoside bond, and the glycoside bond represented by-in the general formula (2) is a β1,3 glycoside bond.
[0015]
Further, it is preferable that the hydroxyl group or the amino group bonded to the carbon atom selected from the C6 and C4 positions of the hexose residue and the C3 and C6 positions of the hexosamine residue is sulfated.
[0016]
The “oligosaccharide having a sulfate group” as an active ingredient of the inhibitor of the present invention preferably contains at least one disaccharide represented by the following formula (3) as a repeating structural unit.
[0017]
Gal (6S) -GlcNAc (6S) (3)
(Wherein,-represents a glycosidic bond)
Among them, the “oligosaccharide having a sulfate group” is preferably represented by the following formula (4).
[0018]
Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (4)
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
The oligosaccharide having a sulfate group used in the inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is an oligosaccharide having a sulfate group. For example, it may be a natural product, a product obtained by decomposing a natural product, or a product chemically or enzymatically synthesized. An example of a method for preparing an oligosaccharide having a sulfate group is described in Examples below.
[0020]
The oligosaccharide having a sulfate group is particularly preferably one represented by the following general formula (1) or (2).
[0021]
(Hex-HexN) n (1)
(HexN-Hex) n (2)
(In the formula, at least one hydroxyl group or amino group of Hex and HexN is sulfated, n is an integer of 1 to 5,-represents a glycosidic bond, and sialic acid is further bonded to the non-reducing terminal side. (May be)
The hexose residue in the above formulas (1) and (2) is preferably a galactose residue, a glucose residue, a mannose residue or a fucose residue, and more preferably a galactose residue.
[0022]
The hexosamine residue in the above formulas (1) and (2) is preferably a glucosamine residue, a galactosamine residue or a mannosamine residue which may be N-acetylated or N-sulfated.
[0023]
The hexosamine residue is more preferably N-acetylated. The most preferred hexosamine residue is an N-acetylglucosamine residue.
[0024]
In addition, it is preferable that at least one hydroxyl group of each of the hexose residue and the hexosamine residue is sulfated.
[0025]
Further, it is preferable that the glycoside bond represented by-in the general formula (1) is a β1,4 glycoside bond, and the glycoside bond represented by-in the general formula (2) is a β1,3 glycoside bond.
[0026]
Furthermore, the oligosaccharide having a sulfate group according to the present invention may have a structure in which carbon atoms selected from the C6 and C4 positions of a hexose residue and the C3 and C6 positions of a hexosamine residue in the general formula (1) or (2). Preferably, the bound hydroxyl or amino group is sulfated.
[0027]
Oligosaccharides having a sulfate group include the basic structure of keratan sulfate (a galactose residue or a galactose-6-O-sulfate residue and an N-acetylglucosamine-6-O-sulfate residue are alternately glycosides). Particularly preferred are oligosaccharides of at least two sugars containing at least a (bonded structure). The oligosaccharide preferably used in the present invention is usually an oligosaccharide having 2 to 10 saccharides having a sulfated N-acetylglucosamine residue at the reducing end, and a hydroxyl at the 6-position of the N-acetylglucosamine residue. Those in which the group is sulfated are preferred, and those in which both the hydroxyl group at the 6-position of the galactose residue and the 6-position of the N-acetylglucosamine residue are sulfated are more preferred. The oligosaccharide having a sulfate group used in the present invention is particularly preferably an oligosaccharide having 2 to 4 sugars.
[0028]
The oligosaccharide having a sulfate group used in the present invention may contain a sialic acid residue and / or a fucose residue. Usually, the sialic acid residue is linked to the non-reducing terminal galactose residue at an α2,3 or α2,6 glycosidic bond, and the fucose residue is linked to N-acetylglucosamine-6- at the α1,3 glycosidic bond. Binds to O-sulfate residues.
[0029]
Further, as long as the sugar chain portion of the oligosaccharide used in the present invention is retained, for example, another molecule may be bonded to the reducing end. Other molecules include lipid molecules, protein molecules, and the like.
[0030]
The oligosaccharide having a sulfate group used in the present invention is more preferably at least one disaccharide represented by Gal (6S) -GlcNAc (6S) (wherein,-represents a glycosidic bond) as a repeating structural unit. Keratan sulfate oligosaccharide containing at least one unit.
[0031]
Further, as a preferred example of the oligosaccharide having a sulfate group, disulfated N-acetyllactosamine disaccharide (hereinafter, also referred to as “L4”) represented by the following formula (4) is mentioned.
[0032]
Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (3)
Oligosaccharides having a sulfate group include those represented by the following formulas (4) to (9). Hereinafter, the oligosaccharide represented by (4) is represented by “L4L4”, the oligosaccharide represented by (5) is represented by “SL2L4”, the oligosaccharide represented by (6) is represented by “K4”, and the oligosaccharide represented by (7) is represented by “G4L4”, the oligosaccharide represented by (8) is also referred to as “K2”, and the oligosaccharide represented by (9) is also referred to as “M4”.
[0033]
Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) β1-3Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (4)
NeuAc to Galβ1-4GlcNAc (6S) β1-3Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (5)
GlcNAc (6S) β1-3Gal (6S) (6)
GlcNAc (6S) β1-3Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (7)
GlcNAc (6S) β1-3Gal (8)
Gal (6S) β1-4ManNAc (6S) (9)
(In the formula, represents a α2,3 or α2,6 glycosidic bond.)
[0034]
Further, the oligosaccharide having a sulfate group used in the present invention includes those having an ionized state and those having a proton-added structure. It also includes pharmaceutically acceptable salts of oligosaccharides having a sulfate group.
[0035]
Pharmaceutically acceptable salts include, for example, salts formed with inorganic bases such as alkali metals (sodium, potassium, lithium), alkaline earth metals (such as calcium) and ammonium, or diethanolamine salts, cyclohexyl Among the salts formed with organic bases such as amine salts and amino acid salts, the salts are pharmaceutically acceptable, but are not limited thereto.
[0036]
The oligosaccharide having a sulfate group used in the present invention may be composed of a single species among the above-mentioned oligosaccharides, or may be a mixture of plural species.
[0037]
The origin and production method of the oligosaccharide having a sulfate group used in the present invention are not particularly limited, and may be, for example, a product obtained by decomposing keratan sulfate, or may be, for example, N-acetyllactosamine or N-acetyllactosamine. A product obtained by sulfating an oligosaccharide or the like formed by binding two or more units of acetyllactosamine may be used. Further, it may be a product obtained by chemical synthesis.
[0038]
Among such oligosaccharides having a sulfate group, keratan sulfate, preferably an oligosaccharide obtained by decomposing highly sulfated keratan sulfate described later (oligosaccharide derived from keratan sulfate) is preferable. Such a keratan sulfate oligosaccharide is prepared by, for example, adding a keratan sulfate (preferably highly sulfated keratan sulfate) buffer solution to an endo-β-N-acetylglucosaminidase-type keratan sulfate degrading enzyme, such as keratanase II derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus. JP-A-2-57182), or after decomposing by the action of a keratan sulfate degrading enzyme derived from Bacillus circulans KsT202 strain (WO 96/16166), and fractionating the obtained degraded product. Can be. The oligosaccharide obtained can be separated and purified by a conventional separation and purification method, for example, fractionation by ethanol precipitation, separation and purification by gel filtration and anion exchange chromatography. An example of such a production method is described in WO 96/16973.
[0039]
In addition, keratan sulfate as a raw material is mainly composed of a repeating structure of disaccharide of galactose or galactose-6-O-sulfate and N-acetylglucosamine-6-O-sulfate, and the sulfuric acid content varies depending on animal species and organs. Although different, those usually produced from raw materials such as cartilage fish such as sharks, cartilage of mammals such as whales and cattle, bones and cornea can be used.
[0040]
Keratan sulfate used as a raw material is not particularly limited as long as it is generally available, and is highly sulfated keratan sulfate in which a galactose residue as a constituent sugar is sulfated (1.5 to 2 per constituent sugar). It is preferable to use keratan polysulfate (a highly sulfated keratan sulfate containing a sulfate group of a molecule is sometimes referred to as keratan polysulfate). The position of the sulfate group of the galactose residue is preferably at position 6. Such highly sulfated keratan sulfate can be obtained, for example, from proteoglycans of cartilaginous fish such as sharks. Also, commercially available ones can be used.
[0041]
For example, L4, L4L4 and SL2L4 can be produced by the method described in WO 96/16973. K4, G4L4 and K2 can be produced by the method described in JP-A-2000-256385. M4 can be produced by the method described in JP-A-2002-29974.
[0042]
As the “oligosaccharide having a sulfate group”, which is an active ingredient of the inhibitor of the present invention, those appropriately purified according to the purpose of use can be used. For example, when the inhibitor of the present invention is used as a reagent for experiments or the like, it is preferable that the inhibitor be purified to such a degree that it does not substantially contain an inhibitor of the TNF-α production inhibitory action. When the inhibitor of the present invention is used as a medicament, it is substantially free of an inhibitor of the inhibitory action on TNF-α production, and is purified to such an extent that it can be used as a medicament, and does not contain a substance that is not allowed to be mixed as a medicament Preferably, it is
[0043]
The case where the inhibitor of the present invention is used as a medicine will be described below.
The inhibitor of the present invention can be used for diseases in which suppression of TNF-α production is required, and as long as it is not limited, applicable specific diseases are not limited.
[0044]
Examples of diseases in which suppression of TNF-α production is required include inflammation, HIV virus infection (AIDS), and autoimmune diseases such as rheumatism. The inhibitor of the present invention can be applied to any of these diseases.
[0045]
The inhibitor of the present invention can be applied to any disease for which suppression of TNF-α production is required. For example, the present invention can be applied not only for pure treatment purposes but also for prevention, maintenance (prevention of deterioration), reduction (improvement of symptoms), and the like.
[0046]
An arbitrary dosage form of the inhibitor of the present invention can be appropriately selected depending on the nature, progress, administration method, and the like of a target disease.
[0047]
That is, the inhibitor of the present invention can be administered by injection (intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc.), nasal, oral, transdermal, inhalation, etc. It can be formulated. The dosage form that can be selected is not particularly limited. For example, injections (solutions, suspensions, emulsions, solids for dissolving before use), tablets, capsules, granules, powders, liquids, lipoizing agents, It can be widely selected from ointments, plasters, lotions, pastas, patches, gels, suppositories, external powders, sprays, inhalation powders and the like. In addition, in the preparation of these preparations, conventional excipients, stabilizers, binders, lubricants, emulsifiers, osmotic pressure regulators, pH regulators, other colorants, disintegrants, and other ingredients normally used in pharmaceuticals Can be used.
[0048]
The compounding amount of the oligosaccharide having a sulfate group, which is an active ingredient of the inhibitor of the present invention, and the dose of the inhibitor of the present invention are determined by the method of administration, the dosage form, the purpose of use, the specific symptoms of the patient, and the weight of the patient. The clinical amount of the oligosaccharide having a sulfate group is, for example, 50 to 5000 mg per day for an adult.
[0049]
The safety of these oligosaccharides having a sulfate group, which is an active ingredient of the inhibitor of the present invention, is described in WO96 / 16973, JP-A-2000-256385, JP-A-2002-29974 and the like. It is shown.
[0050]
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[0051]
【Example】
Using macrophages collected from the intraperitoneal cavity of rats, the effect of sulfated oligosaccharides (L4) on TNF-α production was tested.
[0052]
Five days before collecting macrophages, 10 ml of 4% thioglycolate broth (manufactured by DIFCO) was intraperitoneally administered to 6-week-old Lewis rats (females).
[0053]
25 ml of RPMI1640 liquid medium was injected into the peritoneal cavity of anesthetized rats, and after allowing to stand for a while, the medium was collected. This operation was repeated three times to collect macrophages in the peritoneal cavity.
[0054]
The number of cells of the macrophages examined was counted, and the cells were washed with an RPMI 1640 liquid medium containing 10% fetal calf serum, and the cells were suspended in the liquid medium so that the cell density was 2 × 10 ⁵ cells / well. Plated in 96-well flat bottom plate.
[0055]
The cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 3 hours, washed with the same liquid medium to remove floating cells, and the cells attached to the plate were used as intraperitoneal macrophages in the test.
[0056]
The liquid medium was added to the washed plate at 200 μl / well, and lipopolysaccharide (LPS) (manufactured by Sigma) was added to a final concentration of 0.1 ng / ml.
[0057]
Simultaneously with the addition of LPS, L4 was added at 1 pg / ml, 10 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml or 100 ng / ml. N = 6 for each concentration.
[0058]
Prednisolone (Prednisolone; manufactured by Shionogi & Co., Ltd.), which is known to have a TNF-α production inhibitory effect, was also tested in the same manner as L4. The addition concentration was 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml or 1 μg / ml, and each concentration was n = 4.
[0059]
The cells were cultured for 20 hours at 37 ° C. and 5% CO ₂ , the culture supernatant was collected, and the TNFα concentration in the culture supernatant was measured using a rat-TNFα ELISA kit (manufactured by BIOSOURCE). The average value and standard error were calculated, and the statistical significance was examined using a parametric Dunnett's multiple comparison test. The results are shown in FIG. In addition, ** in the figure indicates that there is a significant difference at p <0.01, and * indicates that there is a significant difference at p <0.05. "No addition" in the figure indicates that no LPS was added.
[0060]
FIG. 1 shows that the oligosaccharide (L4) having a sulfate group suppresses the production of TNFα by macrophages. In particular, when L4 was added at 10 ng / ml and at 100 ng / ml, a significant production inhibitory effect was observed.
[0061]
FIG. 1 also shows that L4 exerts the same TNFα production inhibitory ability at 1/100 to 1/1000 of prednisolone. That is, the ability of L4 to suppress TNFα production was significantly higher than that of prednisolone (about 100 to 1000 times).
[0062]
【The invention's effect】
The inhibitor of the present invention is extremely useful because it can remarkably suppress the production of TNFα. The inhibitor of the present invention can be used not only as a reagent for experiments but also as a medicine, and is extremely useful because of its high safety.
[0063]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the effect of oligosaccharide (L4) having a sulfate group on the production of TNFα.

Claims

A TNF-α production inhibitor comprising an oligosaccharide having a sulfate group as an active ingredient.

The TNF-α production inhibitor according to claim 1, wherein the oligosaccharide having a sulfate group is represented by the following general formula (1) or (2).
(Hex-HexN) n (1)
(HexN-Hex) n (2)
Wherein Hex represents a hexose residue and HexN represents a hexosamine residue which may be N-acetylated or N-sulfated. At least one hydroxyl or amino group of Hex and HexN is sulfated. And n represents an integer of 1 to 5, and-represents a glycosidic bond. Further, sialic acid may be further bound to the non-reducing terminal side.)

The TNF-α production inhibitor according to claim 2, wherein the hexose residue is a galactose residue, a glucose residue, a mannose residue, or a fucose residue.

The TNF-α production inhibitor according to claim 2 or 3, wherein the hexosamine residue is a glucosamine residue, a galactosamine residue, or a mannosamine residue which may be N-acetylated or N-sulfated.

The TNF-α production inhibitor according to any one of claims 2 to 4, wherein the hexosamine residue is N-acetylated.

The TNF-α production inhibitor according to any one of claims 2 to 5, wherein the hexose residue is a galactose residue.

The TNF-α production inhibitor according to any one of claims 2 to 6, wherein the hexosamine residue is an N-acetylglucosamine residue.

The TNF-α production inhibitor according to any one of claims 2 to 7, wherein at least one hydroxyl group of each of the hexose residue and the hexosamine residue is sulfated.

The glycoside bond represented by-in the general formula (1) is a β1,4 glycoside bond, and the glycoside bond represented by-in the general formula (2) is a β1,3 glycoside bond. The TNF-α production inhibitor according to claim 1.

The hydroxyl group or the amino group bonded to a carbon atom selected from the C6 and C4 positions of the hexose residue and the C3 and C6 positions of the hexosamine residue is sulfated. 3. The TNF-α production inhibitor according to item 1.

The TNF-α production inhibitor according to claim 10, wherein the oligosaccharide having a sulfate group contains at least one unit of a disaccharide represented by the following formula (3) as a repeating structural unit.
Gal (6S) -GlcNAc (6S) (3)
(In the formula, Gal represents a galactose residue, GlcNAc represents an N-acetylglucosamine residue, 6S represents 6-O-sulfate, and-represents a glycoside bond.)

The TNF-α production inhibitor according to claim 11, wherein the oligosaccharide having a sulfate group is represented by the following formula (4).
Gal (6S) β1-4GlcNAc (6S) (4)
(In the formula, Gal represents a galactose residue, GlcNAc represents an N-acetylglucosamine residue, 6S represents a 6-O-sulfate, and β1-4 represents a β1,4 glycoside bond.)