JP2004000155A

JP2004000155A - Marker for predicting condition of cardiac failure and method for utilizing the same

Info

Publication number: JP2004000155A
Application number: JP2003050597A
Authority: JP
Inventors: Masafumi Kitakaze; 北風　政史; Seiji Takashima; 高島　成二; Masanori Asakura; 朝倉　正紀; Tadashi Isomura; 磯村　正; Hidehiko Furukawa; 古川　秀比古; Ryuta Koishi; 小石　龍太; Kenji Nakamaru; 中丸　健治
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-01-08

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new method for diagnosing, treating or preventing cardiac failure by discovering a new index for predicting condition or progress of the cardiac failure. <P>SOLUTION: A gene, the expression amount of which is extremely changed between the human myocardial tissue of a patient of the cardiac failure and the normal human myocardial tissue is specified. The condition of the cardiac failure is predicted by utilizing the gene or the protein encoded by the gene to improve the diagnosis or the treatment. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、心不全の病態予測方法に関する。より詳しくは、特定遺伝子またはその転写産物の発現プロファイルに基づき、心不全の病態を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心不全は心筋症（例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症等）、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等）、高血圧症（高血圧性心肥大等）等の様々な原因により心機能が低下した最終病態である。形態学的には、心室容積の拡張および心室壁厚の短縮といった心臓の器質的変化（リモデリング）が生じている。同時に、血液中および器質的変化を示した心筋組織において数種のマーカー蛋白質またはその遺伝子（心房性利尿ペプチド・ＡＮＰおよび脳性利尿ペプチド・ＢＮＰ等）の発現が亢進することが知られている。
【０００３】
これらのマーカー蛋白質やその遺伝子発現量は、患者が心不全であるか否か、またはその重症度を知る指標となりうる。しかしながら、従来のマーカー蛋白質やその遺伝子発現の亢進は、心不全の病態が進行した結果生じるものであり、様々な原因によって心機能が低下する過程を反映していない。つまり、心不全の個々の症例について、その病態を把握し、予後を予測するためには、様々な原因によって生じる変化を別個に検証する必要がある。
【０００４】
心不全の最近の治療法は、一次的にはアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿剤の使用を指向している。しかし、ＡＣＥ阻害剤は心不全における生存を延長するが、これは最終段階である心不全に向けた進行を遅らせるためであり、ＡＣＥ阻害剤を投与されている患者の多くは、機能的に第ＩＩＩ級心不全を持っている。さらに、ＡＣＥ阻害剤は心不全患者の６０％以上では症状緩和ができず、心不全による死亡を約１５〜２０％しか減少させることができない。一方、ジゴキシンを除く筋変力作用陽性剤の長期的投与は、不整脈惹起、突然死のような、生命に関わる重大な副作用を伴う。他方、心移植による治療は、ドナー心臓の入手可能性により限定される。こうした従来療法の欠陥は、別の有効な治療的手法の必要性を示唆する。
【０００５】
Ｇ−タンパク質共役受容体：ＧＰＣＲ（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７回膜貫通部位を持つレセプター蛋白質であり、様々な生理機能に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。ＧＰＣＲは数百ものファミリータンパク質が知られているが、種々の疾患の治療用薬剤がこのＧＰＣＲの活性に影響を与えることにより作用を発揮する。例えば、前立腺癌および乳癌、子宮平滑筋腫、子宮内膜症、性的早熟および非腫瘍性卵巣アンドロゲン過剰症候群を治療するために用いられてきたゴナドトロピン放出ホルモンのアゴニストアナログであるロイプロリド、ゴナドレリンおよびナファレリン（例えば、非特許文献２参照）、高血圧、狭心症および精神病を治療するために用いられてきた心臓のβ−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニストであるプロプラノロール（例えば、非特許文献３および４参照）、気管支拡張剤として用いられてきた肺のβ２−アドレナリン作動性レセプターアゴニストであるメタプロテレノール（例えば、非特許文献５参照）、ならびに、潰瘍および特発性蕁麻疹を治療するために用いられてきたヒスタミン２レセプターアンタゴニストであるシメチジン（例えば、非特許文献６および７参照）がＧＰＣＲに作用するという。したがって、ＧＰＣＲは創薬標的として重要と考えられるが、心不全におけるＧＰＣＲ遺伝子の発現プロファイルを網羅的に解析したという報告はない。
【０００６】
【非特許文献１】
「ザ　イーエムビーオー　ジャーナル（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ）」　１９９９　；１８（７）：ｐ１７２３−１７２９
【非特許文献２】
「アメリカン　ファミリー　フィジシャン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）」　１９９２；４４：ｐ１７７７−１７８２
【非特許文献３】
「クリニカル　ファーマコキネティックス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）」　１９８７；１３：ｐ５１−６４，
【非特許文献４】
「ニューロサイコ−バイオロジー（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ）」　１９８６；１５：ｐ２０−２７
【非特許文献５】
「アンルズ　オブ　アレルギー（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ）」　１９７３；３１：ｐ４６０−４６６
【非特許文献６】
「ニューイングランド　ジャーナル　オブ　メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」　１９８４；３１１：ｐ６８９−６９３
【非特許文献７】
「ディー　アイ　シー　ピー（ＤＩＣＰ）」　１９９１；２５：ｐ６０９−６１２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、心不全の病態や進行を予測するための新しい指標を提供し、これを利用することにより、心不全の診断、治療または予防の改善を図ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ヒト心不全患者心筋組織とヒト正常心筋組織との間で発現量が著しく変動している遺伝子は心不全の個々の病態を反映しうると考えた。そして、該遺伝子やその転写産物を利用することにより、心不全の病態を予測し、診断あるいは治療するための新たな方法を提供しうることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量により、該検体提供者の心不全の病態を予測する方法。
（２）　心不全の病態予測用キット。
（３）　配列番号５に示される塩基配列で特定される遺伝子、または配列番号２０に示されるアミノ酸配列で特定される蛋白質を含む、心不全の治療用組成物。（４）　配列番号１〜４および配列番号６〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子のアンチセンス核酸、または配列番号１７〜１９および配列番号２１〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質を特異的に認識、中和する抗体蛋白質を含む、心不全の治療用組成物。
（５）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現を亢進または抑制させたときに現れる表現型の変化を、被験物質の存在下および非存在下で比較することによって、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
（６）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子、または配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質の発現量を、被験物質の存在下および非存在下で比較することによって、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
（７）　配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される心不全の病態予測用マーカー遺伝子を含有する組成物。
（８）　配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される心不全の病態予測用マーカー蛋白質を含有する組成物。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．心不全の病態予測用マーカー遺伝子
本発明にかかる「心不全の病態予測用マーカー遺伝子」とは、ヒト心不全の病態を予測するための指標として用いられる遺伝子を意味する。該遺伝子は、具体的には、配列番号１〜１６の塩基配列から選ばれるいずれか１の塩基配列によって特定される遺伝子である。本発明は、この心不全の病態予測用マーカー遺伝子、および該マーカー遺伝子の心不全の病態予測、治療、または予防のための使用を提供する。なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子のみならずＥＳＴも含むものとする。
【００１１】
１．１　マーカー遺伝子の特定方法
本発明の心不全の病態予測用マーカー遺伝子は、以下の工程１）および２）：１）ヒト心不全患者心筋組織およびヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡを調製する工程；
２）上記各全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを利用してヒト心不全患者心筋組織とヒト正常心筋組織の間で発現量が著しく異なる遺伝子を特定する工程；
を順次行うことによって、特定することができる。
以下、各工程について詳細に説明する。
【００１２】
工程１：全ＲＮＡの調製
本工程で用いられる「ヒト心不全患者心筋組織」としては、例えば、心筋生検、バチスタ手術、ドール手術、もしくは左心補助装置挿入により左心室心筋組織の摘出を受けた心不全患者由来の摘出心筋組織を用いることができる。なお、該心筋組織は適切なインフォームドコンセントに基づく契約により、供与を受けるものとする。
【００１３】
前記摘出組織は、全ＲＮＡ抽出のために摘出後直ちにその組織片をＲＮＡ抽出用溶媒に直接溶解することが好ましい。該抽出溶媒としては、例えば、フェノール等のリボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むものが好ましい。心筋組織から全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　（１９８７）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６２，　１５６−１５９）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【００１４】
抽出された全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いることが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００１５】
対照として用いられるヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡは、上記と同様に抽出、精製して調製することも可能であるが、市販のヒト正常心筋組織由来全ＲＮＡを好適に利用することができる。該市販品は、例えば、バイオチェイン社、クロンテック社、インビトロジェン社およびアンビオン社等、複数のメーカーから購入可能である。
【００１６】
工程２：遺伝子の発現量の解析
遺伝子の発現量は、工程１で得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００１７】
以下に、遺伝子発現量の解析方法として、固相化試料を用いた解析方法と、その他のいくつかの解析方法について説明する。
【００１８】
（１）固相化試料を用いた解析方法
遺伝子発現量は、公知のヒト遺伝子が固定された固相化試料に上記標識プローブを、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせることにより測定できる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。前記標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては、精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用いることがより好ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の解析方法について説明する。
【００１９】
ａ）遺伝子チップ：
本発明で用いられる遺伝子チップは、データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）配列、または全ＲＮＡ配列を基に合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドを固相化したものが好ましい。該遺伝子チップは、市販のもの（例えば、アフィメトリクス社製等）を用いてもよいし、公知の方法（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，　Ｒ．　Ｊ．　ｅｔａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）に基づき作製してもよい。
【００２０】
遺伝子チップによる解析は、常法にしたがって実施することができる。例えば、アフィメトリクス社製チップを用いる場合であれば、製品に添付されたプロトコールに従い、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを調製する。次いで、該プロトコールに従いハイブリダイゼーションを行い、蛍光標識したアビジンをビオチンに結合させ、その発光を検出、解析を行えばよい。
【００２１】
ｂ）アレイまたはメンブレンフィルター：
本発明で用いられるアレイまたはメンブレンフィルターは、ヒトの臓器組織、もしくは該臓器組織から単離または株化された細胞から得られた全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物を固相化したものが好ましい。
【００２２】
固相化するｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、ヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものを用いる。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、予め、ヒト心不全患者心筋組織およびヒト正常心筋組織のそれぞれに由来する全ＲＮＡの間で発現量の異なる全ＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９３，　６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｋａｔｏ，　Ｋ．　（１９９５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２３，　３６８５−３６９０）等を利用して選択されたものであってもよい。また、市販のアレイやフィルター（例えば、インテリジーン：宝酒造（株）社製、アトラスシステム：クローンテック社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッター（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：宝酒造（株）社製等）を用いて固相化して作製してもよい。
【００２３】
アレイを用いた解析では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）で標識されたｄ−ＵＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製する。このとき、ヒト心不全患者心筋組織由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。蛍光シグナルは蛍光シグナル検出機を用いて検出、解析する。例えば、宝酒造（株）社の市販アレイであれば、同社のプロトコールに従い、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、蛍光シグナル検出機（例えば、ＧＭＳ４１８アレイスキャナー：宝酒造（株）社製等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。
【００２４】
メンブレンフィルターを用いた解析では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、^３２Ｐ、^３３Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。例えば、市販のフィルター製マイクロアレイである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
【００２５】
いずれの固相化試料を用いる場合も、同一ロットの固相化試料にヒト心不全患者心筋組織由来のプローブおよびヒト正常心筋組織由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション条件は同じとする。前述したように、蛍光標識プローブの場合は、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ，　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔ．　２１，　ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、３３−３７）。
【００２６】
（２）その他の解析方法
上記以外の解析方法としては、例えば、サブトラクション法（Ｓｉｖｅ，　Ｈ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｊｏｈｎ，　Ｔ．　Ｓｔ．　（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１６，　１０９３７、Ｗａｎｇ，　Ｚ．，　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ，　Ｄ．　Ｄ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　８８，　１１５０５−１１５０９）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ，　Ｐ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ，　Ａ．　Ｂ．　（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７，　９６７−９７１、Ｌｉａｎｇ，　Ｐ．，　Ａｖｅｒｂｏｕｋｈ，　Ｌ．，Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ，　Ｋ．，　Ｓａｇｅｒ，　Ｒ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ，　Ａ．　Ｂ．　（１９９２）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５２，　６９６６−６９６８）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（Ｊｏｈｎ，　Ｔ．　Ｓｔ．，　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ，　Ｒ．　Ｗ．　Ｃｅｌｌ　（１９７９）　１６，　４４３−４５２）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．，　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　（１９８２）　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ＲＴ−ＰＣＲ法、およびリアルタイムＰＣＲ法等を挙げることができる。以下、各解析方法について具体的に説明する。
【００２７】
ａ）サブトラクションクローニング法：
特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。サブトラクションの方法としては、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得られた全ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキシアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社　（１９９３）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラリーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られた全ＲＮＡにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｎｉｓｈｉｎａ，　Ｙ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（１９９４）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３５５，　４−１０）等が挙げられる。
【００２８】
具体的には、まずヒト心不全患者心筋組織およびヒト正常心筋組織のそれぞれについてｍＲＮＡ（または全ＲＮＡ）を精製し、ヒト正常心筋組織から精製した全ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−^３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することもできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一本鎖ｃＤＮＡと、ヒト心不全患者心筋組織から抽出したＲＮＡとを混合し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相補性より安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。すなわち、ヒト心不全患者心筋組織でも発現している全ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、ヒト正常心筋組織に特異的に発現しているＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。次いで、ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素等で標識されている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。なお、この操作は市販のキット（例えば、ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキット：クローンテック社製等）を利用して行うこともできる。
【００２９】
ｂ）ディファレンシャル・ディスプレイ法：
Ｌｉａｎｇらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９２）　２５７，　９６７−９７１）に準じ、例えば、以下のように実施できる。まずヒト正常心筋組織およびヒト心不全患者心筋組織各々からｍＲＮＡ（または全ＲＮＡ）を抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、ランダムプライマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプライマー）を用いることができる。あるいは、アンカードプライマー（ａｎｃｈｏｕｒｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）およびアービトラリープライマー（ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒ）各一種ずつを組み合わせて用いてもよい。アンカードプライマーとしては、オリゴｄ（Ｔ）_ｎＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを用いることができる。また、アービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いることができる。このようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行うことで、より広い範囲の遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。続いて、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析することにより、いずれかのヒト由来の心筋組織で特異的に発現している遺伝子を選択し、そのｃＤＮＡ断片を単離することができる。なお、この方法は、市販されているキット（例えば、ＲＮＡイメージ・キット：ジェンハンター社製等）を用いて行うこともできる。
【００３０】
ｃ）ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法：
目的の組織から精製した全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的組織および対照組織の全ＲＮＡから合成した^３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、目的組織のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。例えば、まずヒト正常心筋組織から精製した全ＲＮＡから常法に従いｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、ヒト正常心筋組織から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−^３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することにより全ＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様に、ヒト心不全患者心筋組織から精製した全ＲＮＡを鋳型に^３２Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして、ヒト正常心筋組織ライブラリーから作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、ヒト正常心筋組織または心不全心筋組織由来ｃＤＮＡプローブの一方にのみハイブリダイズするクローンを選ぶことにより、ヒト正常心筋組織に特異的に発現する遺伝子（すなわち、ヒト心不全患者心筋組織において発現がないかまたは低下している遺伝子）、またはヒト心不全心筋組織に特異的に発現する遺伝子（ヒト心不全患者心筋組織において発現が亢進している遺伝子）をクローニングすることができる。
【００３１】
ｄ）クロスハイブリダイゼーション法：
ヒト正常心筋組織またはヒト心不全患者心筋組織のいずれかに由来するｃＤＮＡライブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られた陽性クローンをプローブとして、ヒト正常心筋組織およびヒト心不全患者心筋組織のそれぞれに由来する全ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する。
【００３２】
こうして得られたｃＤＮＡをプローブとして、ヒト正常心筋組織またはヒト心不全患者心筋組織由来の全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行うことにより、選択した遺伝子の全ＲＮＡが、ヒト正常心筋組織で特異的に発現していることを確認できる。かくして、ヒト正常心筋組織全ＲＮＡにおいて高発現している遺伝子のｃＤＮＡを単離・取得することができる。
【００３３】
ｅ）ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法
予め心不全との関連が予測される遺伝子について、該遺伝子が心不全の病態予測用マーカーになりうるか否かを検討したい場合、ＲＴ−ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ）法は微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できる。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ）法では、５’端は蛍光色素（レポーター）で、３’端は蛍光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を定量する。
【００３５】
（３）評価・判定
上記解析の結果、ヒト心不全患者心筋組織由来の全ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡとの間で発現量が著しく異なる遺伝子をヒト心不全の病態予測用マーカー遺伝子として特定する。ここで、「著しく異なる」とは、両者の発現量が少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上異なることを意味する。
【００３６】
但し、遺伝子の特性によっては、上記とは異なった判定基準を適用する。例えば、Ｇ−タンパク質共役受容体：ＧＰＣＲ（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、７回膜貫通部位を持つレセプター蛋白質であり、種々の生理機能に関与していることが報告されている。そして、様々な疾患の治療用薬剤が、このＧＰＣＲの活性に影響を与えることにより作用する。したがって、ＧＰＣＲは創薬標的として重要と考えられ、ヒト心臓で発現、または心不全病態と関連して発現が変化するＧＰＣＲ遺伝子は心不全の治療に有用である可能性が高い。そこで、ＧＰＣＲについては、ヒト心不全患者心筋組織由来の全ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来の全ＲＮＡとの間で発現量が有意に変化する遺伝子（例えば、心不全群と正常群の発現量の平均値に有意差がある（ｐ＜０．０５）遺伝子）と、心不全、正常を問わず、解析した心臓ＲＮＡサンプルの全てに共通して発現している遺伝子（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　Ｇｅｎｅ　Ｃｈｉｐによって計測される遺伝子発現量の絶対値であるＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅが５０以上である遺伝子）をマーカー遺伝子として特定する。
【００３７】
こうして、特定されたマーカー遺伝子としては、例えば、配列番号１〜１６のいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を挙げることができる。該遺伝子に関する詳細な情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の遺伝子配列データベースから入手可能である。
【００３８】
なお、上記マーカー遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ登録情報は、本願の優先日である２００２年２月２８日および２００２年４月１５日の時点と、本願出願時の２００３年２月時点では若干の相違がある。そこで、それらの対応を図１にまとめた。
【００３９】
１．２　マーカー遺伝子の検定
上記のようにして特定されたマーカー遺伝子は、心筋由来の細胞で該遺伝子を高発現させ、ヒト心不全患者心筋組織と同様の表現型の変化が現れるか否か、あるいはヒト心不全患者心筋組織の表現型の変化が復帰するか否かを検定することができる。該検定は、例えば、以下のようにして実施できる。
【００４０】
まず、特定された遺伝子断片をプローブとして、ヒト心筋組織由来のｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡを、正常動物心筋組織に導入して高発現させ、その動物にヒト心不全患者心筋組織と同様の表現型が表れるか否かを検討する。
【００４１】
ｃＤＮＡを動物個体内で高発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。具体的には、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット：宝酒造（株）社製等）を利用する方法を例示することができる。
【００４２】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４３】
また、培養細胞レベルでは、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット心筋組織由来の株化された細胞、ラット新生児心筋組織由来初代培養細胞、心筋組織細胞に分化誘導したマウスＥＳ細胞等へ導入し高発現させて、ヒト心不全患者心筋組織と同様の表現型の変化が表れるか否かを検討することができる。逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡ配列に対するアンチセンス核酸を、ヒト心不全患者心筋組織の病態を反映する表現型の変化が検出可能な細胞へ導入し、該表現型が改善されるか否かを検討する（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，　Ｅ．　ｅｄ．　（１９９１）　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ．　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．　Ｆｉｅｌｄ，Ａ．　Ｋ．　ａｎｄ　Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，　Ｊ．　（１９９５）　Ｅｘｐ．　Ｏｐｉｎ．ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｒｕｇｓ．　４，　７９９−８２１）こともできる。
【００４４】
完全長ｃＤＮＡを動物または細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーターおよび形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）等により細胞に導入することができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００４５】
また、遺伝子操作により、正常心筋組織において対象とする遺伝子が高発現するように、トランスジェニック動物を作製し、病態が出現するか否かを検討することも可能である。逆に、心不全心筋組織において試験する遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し、その病態が改善されるか否かを検討することも可能である。前記トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生させることにより得ることができ、その手順は公知の方法［発生工学実験マニュアル（野村達次　監修、勝木元也　編、１９８７年刊）、マウス胚の操作マニュアル（”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”　Ｂ．　Ｈｏｇａｎ，　Ｆ．　Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅ．　Ｌａｃｙ著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎　訳、１９８９年刊）、特公平５−４８０９３号公報等参照］に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合であれば、まず雌マウスに排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。
【００４６】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば：前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等、を挙げることができる。
【００４７】
一方、上記工程の結果、ヒト心不全患者心筋組織においてヒト正常心筋組織より発現量が著しく少ない（発現していない場合も含む）と判定された遺伝子断片の場合も、同様に、まず該遺伝子断片をプローブとして、ヒト心筋組織由来のｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを取得する。
【００４８】
そして、この完全長ｃＤＮＡを心不全動物心筋組織に導入して高発現させ、その動物の表現型の変化が復帰するか否か（例えば、表現型の変化が疾患である場合は、症状が改善するか否か）を検討する。培養細胞レベルでは、完全長ｃＤＮＡをヒト正常心筋組織またはヒト心不全患者心筋組織から単離または株化された細胞へ導入し、高発現させることにより、表現型の変化を反映する現象が復帰するか否かを検討する。あるいは逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡ配列に対するアンチセンス配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ（Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ１８８−２００）を、正常心筋組織由来の細胞に導入し、心不全心筋組織と同様の表現型の変化が現れるか否かを検討する。なお、遺伝子導入は前述の方法に従って実施することができる。また、遺伝子操作により、ヒト心不全患者心筋組織で対象とする遺伝子が高発現するように、トランスジェニック動物を作製し、病態が改善されるか否かを検討することもできる。同様に、ヒト正常心筋組織において試験する遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し、その病態が出現するか否かを検討することもできる。
【００４９】
２．心不全の病態予測用マーカー蛋白質
本発明にかかる「心不全の病態予測用マーカー蛋白質」とは、ヒト心不全の病態を予測するための指標として用いられる蛋白質を意味し、本発明のマーカー遺伝子によってコードされる蛋白質である。該蛋白質は、具体的には、配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列によって特定されるポリペプチドからなる。本発明は、この心不全の病態予測用マーカー蛋白質、および該マーカー蛋白質の心不全の病態予測、治療または予防のための使用を提供する。なお、本明細書中において、「蛋白質」という言葉には、ポリペプチドのみならず、これに糖鎖等が付加されたものも含むものとする。
【００５０】
なお、上記マーカー蛋白質のＧｅｎＢａｎｋ登録情報は、本願の優先日である２００２年２月２８日および２００２年４月１５日の時点と、本願出願時の２００３年２月時点では若干の相違がある。そこで、それらの対応を図１にまとめた。
【００５１】
３．心不全の病態予測方法
本発明のマーカー遺伝子および本発明のマーカー蛋白質の発現量は、心不全の病態や予後を反映する。従って、検体中の該遺伝子または該蛋白質の発現量を定量することにより、心不全の病態を予測し、心不全の診断に利用することができる。なお、「検体」とは、被験者や臨床献体等から単離された、血液、体液、組織または排泄物等の試料を意味するが、本発明のマーカー遺伝子を利用した予測方法の場合は、心筋組織または心筋細胞が好ましい。また、本発明のマーカー蛋白質を利用した予測方法の場合は、血液または心筋組織が好ましく、血清または心筋組織細胞抽出液がより好ましい。
【００５２】
例えば、正常心筋組織に対する検体中のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白質の発現変動が、心不全患者由来心筋組織における発現変動と類似している場合、当該患者は心不全または心不全になる確率が高いと予測される。また、個々の患者について、該マーカー遺伝子やマーカー蛋白質の発現変動を経時的に観察すれば、該患者の予後を予測することができる。
【００５３】
３．１　マーカー遺伝子を利用した病態予測方法
本発明のマーカー遺伝子を利用した病態予測方法は、具体的には、以下の工程１）〜３）を含む：
１）単離された心筋組織または心筋細胞を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する；２）上記検体由来全ＲＮＡとヒト正常心筋組織由来全ＲＮＡの間における、本発明の各マーカー遺伝子の発現量の相違を検出する；
３）上記各マーカー遺伝子の発現量の相違を解析し、検体提供者の心不全の病態を予測する。
【００５４】
ここで、工程１における全ＲＮＡの抽出は、１．１に示した方法に従って実施することができ、抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが好ましい。また、工程２におけるマーカー遺伝子発現量の検出も、１．１に示した方法に従って実施することができるが、特に、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法を用いて実施することが簡便で好ましい。なお、「発現量の相違」は、検体とヒト正常心筋組織における遺伝子発現量を定量的に比較できる限り、発現量差であっても、発現量比であってもよい。
【００５５】
工程３における予測は、特定のマーカー遺伝子について個別に評価して行うことも可能であるが、複数のマーカー遺伝子について、その発現量の相違を総合的に評価して行うことが好ましい。
【００５６】
３．２　マーカー蛋白質を利用した病態予測方法
本発明のマーカー蛋白質を利用した病態予測方法は、具体的には、以下の工程１）〜３）を含む：
１）単離された血液または心筋細胞を含む検体中のポリペプチドを固相化する；２）上記固相化ポリペプチドにおける、本発明の各マーカー蛋白質の発現量を該マーカー蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）上記検体とヒト正常心筋組織の間における、各マーカー蛋白質の発現量の相違を解析し、心不全の病態を予測する。
【００５７】
前記予測方法の好適な態様として、抗体を利用した方法について説明する。まず、試料中のポリペプチドを９６穴プレートのウェル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、該マーカー蛋白質を特異的に認識する抗体を用いて検出する。９６穴プレートに固相化する方法としては、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）等が挙げられる。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【００５８】
ｉ）試料の調製
試料としては、心不全または正常のヒト全血または血清または心筋組織細胞抽出液が好ましく、血清または心筋組織細胞抽出液がより好ましい。該全血、血清または心筋組織細胞抽出液は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料は、例えば、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば、心筋組織細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、例えば、回収した心筋組織細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用する等して、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
【００６０】
ｉｉ）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するため、該ポリペプチドを固相化する。ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられる固相としては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００６１】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ　２　ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎ，　Ａ．　Ｍ．　Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，　Ｄ．　Ｈ．　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，　Ｅ．Ｍ．　Ｓｈｅｖａｃｈ，　Ｗ．　Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　ｖｏｌｕｍｅ　２　参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材は市販のもの（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド）等）を用いることができる。
【００６２】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば、０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置することにより、ウエル底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【００６３】
ｉｉｉ）抗体
用いられる抗体は、本発明のマーカー蛋白質またはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、前記ポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来の蛋白質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【００６４】
前記抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７、１９９２）、抗原となる蛋白質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，　Ｒ．　ｅｄ．，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐ．３６５−３６７，　１９８０，　Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．）に従って、本発明の蛋白質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００６５】
抗体作製用の抗原としては、本発明のマーカー蛋白質またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。なかでも、本発明のマーカー蛋白質のＮ末端に、キーホールリンペットヘモシアニンを担体として結合させたものが好ましい。
【００６６】
前記抗原ポリペプチドは、本発明のマーカー蛋白質を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、本発明のマーカー遺伝子の発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
【００６７】
前記宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
【００６８】
例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
【００６９】
また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５，　８７−９３）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００７０】
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｙ．　（１９８１）　Ｃｅｌｌ　２３，　１７５−１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，　Ｌ．　Ａ．　（１９８０）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ７７，　４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００７１】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８１）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１，　８５４−８６４）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００７３】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　：　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｐ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｐ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００７４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ，　Ｔ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ，　（１９９２）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．ｉ：　３９１−３９６）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ，ｉ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｖ．Ｃ．　Ｅｍｅｒｙ　（１９９３）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４２０３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ　Ｗａｎｇ，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３７９，　１６７−１７４）。
【００７５】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ，Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，　Ｂ．　Ｄ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５７，　３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１−５）等を好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ，　Ｌ．　Ｎｉｌｅｓ，ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２８，
１２５−１３１）。
【００７６】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
【００７７】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。目的とするポリペプチドは、以上記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
【００７８】
上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法等の各種免疫学的測定法や免疫組織染色等に用いることができる。
【００７９】
ｉｖ）検出
上記ｉｉｉ）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【００８０】
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【００８１】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【００８２】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上記３）において抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
【００８３】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【００８４】
ｖ）測定操作
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば、５％　スキムミルク、０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１〜１０％のウシ血清アルブミン、０．５〜３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６〜２４時間、または室温で１〜３時間である。
【００８５】
次に、メンブレンを０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分〜１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【００８６】
ｂ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【００８７】
次に、ウェル内を０．０５〜０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１〜３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【００８８】
例えば、本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明のマーカー蛋白質の各アミノ酸配列より、親水性に富む領域をそれぞれ２箇所選択する。次に、各領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【００８９】
ｖｉ）評価
以上に記載した方法で、心不全由来の試料と、正常心筋由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果上記ｉｉｉ）記載の方法で作製された抗体が特異的に結合するポリペプチドの量を各マーカー蛋白質の発現量として、心不全の病態を予測することができる。なお、該予測は、特定のマーカー蛋白質について個別に評価して行うことも可能であるが、複数のマーカー蛋白質について、その発現量を総合的に評価して行うことが好ましい。
【００９０】
４．心不全の病態予測用キット
本発明は、また、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白質の発現を指標とした、心不全の病態予測方法に用いられるキットを提供する。
【００９１】
前記キットは、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む。
ａ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【００９２】
前記ａ）記載のプライマーは、本発明のマーカー遺伝子の塩基配列（配列番号１〜１６）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、前記ｂ）記載のプローブは、本発明のマーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、２０〜１５００塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。一方、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐシステムは２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に本発明のマーカー遺伝子の３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【００９３】
前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に１．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００９４】
前記ｄ）およびｅ）記載の抗体は、３．２に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【００９５】
本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明にかかる心不全の病態予測方法に必要な試薬等を適宜含んでいてもよい。
【００９６】
５．心不全の治療用組成物
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が低下している本発明のマーカー遺伝子（例えば、配列番号５）は、該遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を、公知の方法に従い、心不全患者の心臓または他の組織に導入・発現させることにより、該遺伝子の発現不足による病態を治療することができる。同様の効果は、該遺伝子がコードする本発明のマーカー蛋白質を心不全患者に導入することによっても達成しうる。
【００９７】
また、心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が増加している本発明のマーカー遺伝子（配列番号１〜４および配列番号６〜１６）は、アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等の方法により該遺伝子の発現を抑制することにより、該遺伝子の発現過剰による病態を治療することができる。同様の効果は、該遺伝子がコードする本発明のマーカー蛋白質を特異的に認識・中和する抗体分子、該蛋白質のドミナントネガティブ体または該蛋白質の活性を特異的に阻害する物質等を、心不全患者に導入することによっても達成しうる。
【００９８】
５．１　遺伝子導入による心不全の治療
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が低下しているマーカー遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を組換えベクター（ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｖｅｃｔｏｒ）に挿入し、心筋細胞で発現させることにより、心不全患者における該遺伝子の発現低下を正常状態に回復させることができる。
【００９９】
ここで、使用されるベクター・プロモーター系は、ヒト心筋細胞に対する遺伝子導入が可能であるものが望ましい。例えば、ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクタ一等のウイルスベクターが挙げられる。ウイルス以外のベクターとしてはリン醸カルシウムと核酸の複合体、リボソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等も使用可能である。さらに、エレクトロポレーション、遺伝子銃等の方法も遺伝子導入に用いてもよい。
【０１００】
前記プロモーターは、心筋細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に限定されない。例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンドビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターが挙げられる。その他、シュードタイプのウィルスベクターを用いても良い。その一例としては、ＨＩＶの外皮蛋白質であるＥｎｖ蛋白質を、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質に置換したシュードタイプウイルスベクターがある（Ｎａｌｄｉｎｉ　Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２　２６３（１９９６））。
【０１０１】
５．２　蛋白質投与による心不全の治療
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が低下しているマーカー遺伝子がコードする蛋白質を患者に投与することにより、心不全の治療を行うことができる。
【０１０２】
まず、前記遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を適当なベクター・プロモーター系に連結し、宿主細胞系に遺伝子導入して目的とする蛋白質を産生させ、抽出・精製して該遺伝子がコードする蛋白質を入手する。
【０１０３】
前記ベクターとしては、前項のベクター・プロモーター系で列挙したもののうち哺乳類、特にヒト細胞に遺伝子導入可能なベクターが挙げられる。同様に、使用可能なプロモータとしては、前項のベクター・プロモーター系で列挙したもののうち哺乳類、特にヒト細胞で遺伝子発現が可能なプロモータが挙げられる。また、Ｌａｃプロモーター等大腸菌宿主内で発現可能なプロモーターも使用できる。
【０１０４】
前記宿主細胞系としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌、発育鶏卵等が挙げられる。さらに、遺伝子導入した宿主細胞系から産生された蛋白質を抽出する方法としては、例えば、細胞をホモジュナイズする方法、ＳＤＳ等の界面活性剤や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音波処理、凍結・融解を繰り返す方法等が挙げられる。いずれの方法で得られた蛋白質も、常法により精製できる。例えば、超遠心や密度勾配遠心を利用した遠心分離、イオン交換カラムやアフィニティーカラム（例えば、前述の特異的な抗体を用いる）、逆相カラム等を利用したカラム分離、ポリアクリルアミドゲル等を用いたゲル分離等、一般的な生化学的手法が精製に利用できる。
【０１０５】
上記のようにして製造、精製された蛋白質は、公知の方法に従って、薬学的に許容される担体或いは希釈剤と混合され、薬学的に有用な組成物に製剤化することができる。前記薬学的組成物は、一または複数の治療的に有効な量の前記ポリペプチドを含んでなる。適当な担体、および希釈剤については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されている。
【０１０６】
前記蛋白質に関して、投与に適した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用されている多くのヒト蛋白質を含む薬学的組成物と同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具体的に言えば、ポリペプチドを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して調製可能である。また，リボソーム等の封入体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能である。
【０１０７】
５．３　遺伝子の発現抑制による心不全の治療
心不全患者心筋組織において正常心筋組織よりも発現が増加しているマーカー遺伝子の翻訳を、アンチセンス核酸、リボザイムまたはｓｉＲＮＡを用いて阻止し、心不全患者における該遺伝子の発現上昇を正常状態に回復させることができる。
【０１０８】
前記アンチセンス核酸は、前記遺伝子（ｍＲＮＡ分子）の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子として設計される（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９９０；　Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８　参照）。アンチセンス核酸は細胞中でｍＲＮＡとハイブリッド形成し、２本鎖分子を生じ、該ｍＲＮＡの翻訳を阻止することにより、転写産物である蛋白質の発現を妨害する。こうしたアンチセンス法は、従来より多数実施されている（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８；　Ｈａｍｂｏｒら，１９８８）。
【０１０９】
前記リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに似た方法で、他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。ＲＮＡのヌクレオチド配列を適当に修飾すれば、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識しかつ切断するＲＮＡ分子をつくることもできる（Ｃｅｃｈ，１９８８）。リボザイムは配列特異的であるため、特定な配列を有するｍＲＮＡのみを失活させることができる。リボザイムは、テトラヒメナ型、およびハンマーヘッド型の２種類が同定されている（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ　＆　Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８）。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基配列を認識し、ハンマーヘッド型は１１〜１８塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、標的ｍＲＮＡ鎖に対する特異性は高いといわれている。従って、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のｍＲＮＡ鎖を失活するテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、特に１８塩基以上の認識配列を有するものがより好ましい。
【０１１０】
前記ＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、ｍＲＮＡと相補的な配列を有するｓｉＲＮＡがｍＲＮＡと結合することにより細胞内に二本鎖ＲＮＡが生じ、配列特異的にｍＲＮＡが切断、不活性化される現象である。二本鎖ＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩタイプのエンドヌクレアーゼ（Ｄｉｃｅｒ）によって細胞内で速やかに分断され、ｍＲＮＡの相補的配列部分に結合してＲＮＡプロセッシング複合体を形成する。該複合体はその塩基対の中央でＲＮＡを切断し、標的ｍＲＮＡを不活化する。
【０１１１】
６．心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法。
本発明はまた、本発明のマーカー遺伝子を利用することにより、多数の被検物質から、心不全の治療または予防剤としての可能性を有する物質を機能的に同定するための試験方法を提供する。該試験方法において、被験物質は　▲１▼本発明のマーカー遺伝子の発現を亢進または抑制させたときに現れる表現型の変化、あるいは、▲２▼ヒト心不全病態を反映した培養細胞またはモデル動物における該マーカー遺伝子やマーカー蛋白質の発現量、を指標として評価される。該マーカー遺伝子やマーカー蛋白質は、元々細胞中に存在する内在性のものを利用してもよいし、人為的に導入した外来性のものを利用してもよい。
以下、これらの試験方法について、具体的に説明する。
【０１１２】
６．１　レポーター遺伝子を指標とした方法
既知の心不全関連遺伝子（心不全の病態依存的に発現が促進される遺伝子）のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」という）を組み込んだ発現プラスミドを作製する。次いで、（ｉ）上記レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを同時トランスフェクションした群、
（ｉｉ）上記レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のマーカー遺伝子を含まない上記組換えベクターを同時トランスフェクションした群、
の２つの細胞群を作製する。心不全の治療または予防剤としての可能性は、各群の細胞培養時に被検試料を添加し、上記各群の該レポーター遺伝子の発現量に差異が現れるか否かによって評価することができる。例えば、本発明のマーカー遺伝子によってコードされるマーカー蛋白質の産生が促進されるような条件下で、該レポーター遺伝子の発現を強く抑制する被験試料は、心不全の治療または予防剤として有用な可能性が高い。
【０１１３】
前記試験方法で用いられる動物細胞は、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にする組換えベクターをトランスフェクションした場合に、該レポーター遺伝子の発現量が亢進するものでなければならない。また、（ｉ）群における該レポーター遺伝子の発現量と（ｉｉ）群における発現量の差が大きいものほど好ましい。そのような細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞を挙げることができるが、これに限定されない。
【０１１４】
前記試験方法で用いられる、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現させるためのベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、レポーター遺伝子の転写を開始させるためのプロモーターとしては、例えば、ヒト心不全において血中濃度の上昇する蛋白質（例えばＡＮＰ、ＢＮＰ）をコードする遺伝子のプロモーター領域等を挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
上記レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下のタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１１６】
ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【０１１７】
ｂ）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【０１１８】
ｃ）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
【０１１９】
ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
【０１２０】
ｅ）緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【０１２１】
本発明の試験方法において、培養細胞株に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，　Ｇ．　（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１１，　１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，　Ｆ．　Ｌ．　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ａ．　Ｊ．　（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，　４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７，　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８４）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
【０１２２】
かくして、本発明のマーカー遺伝子の発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、該マーカー遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、細胞が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
【０１２３】
以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、および本発明のマーカー遺伝子の発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、本発明のマーカー遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。かかる形質転換細胞の作出においては、導入される遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれるなどして、宿主細胞の継代を重ねても安定的に保持されることが望ましい。そのように形質転換された細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、もしくは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
【０１２４】
こうして得られた細胞株を、本発明のマーカー遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該マーカー遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、該被験物質の心不全の治療または予防剤としての効果が評価できる。すなわち、本発明のマーカー遺伝子の発現が促進されるような誘導条件下で、該レポーター遺伝子の発現を強く抑制する被験試料は、心不全の治療や予防剤として有用な物質であると考えられる。
【０１２５】
６．２　培養細胞における表現型の変化を指標とした方法
心筋組織由来の細胞、または他の筋肉由来細胞、心筋に分化誘導したＥＳ細胞・幹細胞等のこれに類する細胞に、本発明のマーカー遺伝子を強制発現させるか、本発明のマーカー蛋白質を外部から作用させる。こうして現れる、心不全につながると考えられる表現型の変化を確認し、その変化を指標として、心不全の治療または予防剤として有用な物質として評価することができる。なお、表現型の変化としては、例えば、ＡＮＰやＢＮＰをコードする遺伝子等の既知の心不全病態関連遺伝子の発現変動、細胞の形態変化、総蛋白質の変化等を挙げることができる。具体的には、本試験方法は、１．２のマーカー遺伝子の検定や３．の病態予測方法で説明した方法にしたがって実施することができる。
【０１２６】
６．３　トランスジェニック動物における表現型の変化を指標とした方法
本発明のマーカー遺伝子を導入したトランスジェニック動物（例えば、マウス等）を作製し、心筋特異的発現プロモーターを利用して心筋組織特異的に発現させることにより、ヒト心不全に類似した変化が現れれば、該動物を利用して心不全の治療や予防に有用な物質を探索することができる。あるいは、本発明のマーカー遺伝子に対するリボザイムやＲＮＡｉを動物に導入して、ヒト心不全に類似した変化が惹起できれば、該動物を利用して、心不全の治療や予防に有用な物質を探索することができる。なお、本発明のマーカー遺伝子はヒト由来の遺伝子であるため、前記トランスジェニック動物の作製にあたっては、例えばマウスであれば、該遺伝子のマウスオーソログを取得してこれを導入することになる。
【０１２７】
前記試験は、該遺伝子によってコードされるマーカー蛋白質やその抗体を直接動物に導入することによっても、行うことができる。具体的には、本試験方法は、１．２のマーカー遺伝子の検定や３．の病態予測方法で説明した方法にしたがって実施することができる。
【０１２８】
６．４　心不全病態モデル培養細胞におけるマーカー発現量を指標とした方法
心不全における心筋細胞の表現型の変化を、心筋由来細胞株（Ｈ９Ｃ２等、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４４６、骨格筋由来細胞（Ｌ６　ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４５８、Ｃ２Ｃ１２　　ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７７２）、心筋初代培養細胞等を用いて再現する。具体的には、１）アンジオテンシン、エンドセリン（ペプチド研究所製）等の神経液性因子の投与により、これらの因子の慢性的過剰によって生じる変化を再現、２）細胞を低酸素条件（１％以下）で培養することにより、虚血による心筋細胞の傷害を再現（アネロパックケンキｆｏｒ　Ｃｅｌｌ、三菱ガス化学株式会社製）、３）細胞をシリコン膜状で培養し、機械的に伸展させることにより、血圧負荷による細胞に対するストレスを再現する（培養細胞伸展システム　ストレッチＮ−３００、スカラッテック製）等の方法が挙げられる。このようにして得られた細胞を用い、１．１および３．２に記載した方法にしたがい、本発明のマーカー遺伝子、マーカー蛋白質の発現変動を確認し、この変動を指標として、心不全の治療または予防剤として有用な物質を評価することができる。
【０１２９】
６．５　心不全病態モデル動物におけるマーカー発現量を指標とした方法
各種の心不全モデル動物も利用可能である。該モデル動物としては、例えば、ダール食塩感受性ラット（日本ＳＬＣ、日本クレア）（Ｉｎｏｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．　１９９４；２６７：Ｈ２４７１−Ｈ２４８２，　Ｄｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．　２０００；１８：１１１−１２０）による高血圧負荷慢性心不全モデル、心筋症ハムスター（ＢＩＯ　ＢＲＥＥＤＥＲＳ、日本クレア）（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　１９９４Ｓｅｐ；９４（３）：１０５９−６８，　Ｂａｊｕｓｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．　Ｈｅａｒｔ．　Ｊ．１９６９；７７：　６８６−６９６）等の自然発症モデルや、イヌにおけるＰａｃｉｎｇ心不全モデル（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９８６；７４：　１０７５−１０８４）、冠動脈部分狭窄心不全モデル（Ｈａｒｒｉｓ，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９５０；１：　１３１８−１３２８）、マウスにおける大動脈部分狭窄による圧負荷心不全モデル（Ｈｏｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　１９９３；８７［ｓｕｐｐｌｅ　ＶＩＩ］：　ＶＩＩ−１４−ＶＩＩ−２１）等を用いることができる。これらのモデル動物の心筋組織を用い、１．１および３．２に記載した方法にしたがい、本発明のマーカー遺伝子、マーカー蛋白質の発現変動を確認し、この変動を指標として、心不全の治療または予防剤として有用な物質を評価することができる。
【０１３０】
なお、本発明のマーカー遺伝子およびマーカー蛋白質はヒト由来の配列であるため、前記細胞株、初代培養のうちヒト以外の動物に由来するもの、および各種心不全モデルの使用においては、例えば、マウスであれば、該遺伝子、蛋白質のマウスオーソログを取得し、これを用いることになる。
【０１３１】
７．心不全の治療または予防効果試験用キット
前記「心不全の治療または予防剤としての効果を試験する方法」のうち、６．４および６．５記載の方法は、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白質の発現量を指標として被験物質を評価する。したがって、該試験は、心不全の病態予測方法同様、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含むキットを用いて実施することができる。
【０１３２】
ａ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜１６から選ばれるいずれか１の塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号１７〜３１から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列で特定される蛋白質に特異的に結合し、該蛋白質を検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【０１３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【０１３４】
実施例１：ヒト心不全患者心筋組織からの全ＲＮＡの抽出
バチスタ手術により摘出されたヒト心不全患者左心室心筋組織片（６例、葉山ハートセンターより入手）は、摘出後ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ（アンビオン製）中に保存した。各組織片の重量を測定し、組織片０．３ｇに対し３ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン。キネマティカ社製）を用いて室温でホモジナイズを行った（目盛８で１分間）。これを室温で５分間静置した後、０．６ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。再び室温で３分間静置してから、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、２．４ｍｌのリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含７０％エタノールを加えた。これを１２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させたのちに、リボヌクレアーゼ・デオキシリボヌクレアーゼ不含蒸留水（インビトロジェン社製）に溶解することにより、全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡ試料は、使用時まで−８０℃に保存した。
【０１３５】
実施例２：チップによる解析
＜試験方法＞
チップ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｕ９５Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ：アフィメトリクス社製）による解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ）に従って、以下のように行った。
ａ）ｃＤＮＡの合成
上記実施例１記載の方法で得られた全ＲＮＡ、およびヒト正常心筋組織由来全ＲＮＡ（バイオチェイン社製）各５μｇを出発材料として、上記マニュアルの記載に従ってｃＤＮＡの合成および精製を行った。
ｂ）ｃＲＮＡの合成
上記ａ）で得られたｃＤＮＡ　１μｇを鋳型として、上記マニュアルの記載に従ってｃＲＮＡの作製を行った（反応条件は３７℃、４．５時間とした）。この操作で得られたｃＲＮＡ　１０μｇを断片化し、プローブ溶液に加えた。
ｃ）プローブ溶液の作製
上記マニュアルの記載に従い、プローブ溶液を調製した。
ｄ）ハイブリダイゼーションおよび染色、スキャニング
上記ｃ）で得られたプローブ溶液をチップにハイブリダイゼーションさせた後、洗浄、染色、スキャニング操作を上記マニュアルの記載に従って行った。
ｅ）解析
上記ｄ）のスキャニングで得られたデータを、アフィメトリクス社製解析ソフトウェア　マイクロアレイスイート　Ｖｅｒ．４により解析し、ヒト正常心筋組織のデータを基準にしてヒト心不全患者左心室心筋で得られたデータと比較検討した。そして、２例以上の心不全サンプルにおいて、Ｆｏｌｄ　Ｃｈａｇｅ値（遺伝子発現変動を示す値）が２以上（遺伝子発現が２倍以上上昇したことを示す）または−２以下（遺伝子発現量が１／２以下に低下したことを示す）である遺伝子を選択した。
【０１３６】
＜結果＞
心不全患者左心室心筋でヒト正常心筋組織よりも高発現している４種の遺伝子が見出され、そのＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒは表１のとおりであった。また、心不全患者左心室心筋でヒト正常心筋組織よりも発現が低下している遺伝子として１種の遺伝子が見出され、そのＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒは表２のとおりであった。
【０１３７】
【表１】

【０１３８】
【表２】

【０１３９】
実施例３：ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ法）による発現量の解析
＜試験方法＞
実施例２で得られたヒト心不全患者左心室心筋でヒト正常心筋組織よりも高発現していた遺伝子、および発現が低下していた遺伝子の発現変動をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲで測定した。
【０１４０】
ａ）材料
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲで用いるプライマーは、アマシャム・ファルマシア社またはインビトロジェン社に発注して作製した。また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いるプローブとして、その５’末端にレポーター色素Ｆａｍ、３’末端にレポーター消光体のＴａｍｕｒａを結合したオリゴヌクレオチドを合成した（ＴａｑＭａｎ　フルオレセント・プローブ：アプライドバイオシステムズジャパン社製）。また各遺伝子の発現量の標準化をはかるために、ヒトＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎ　Ｈｕｍａｎ　ＧＡＰＤＨ：アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いた。
【０１４１】
ｂ）ＰＣＲ反応
これらの材料を用いて、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法による、上記ｅ）で得られた遺伝子の発現量の定量を行った。ＰＣＲ反応は９６穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）中で行った。反応溶液の組成は１ウェル中、実施例１の方法で得られた全ＲＮＡ　５０ｎｇ、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プライマー（１０μＭ）を正方向側、逆方向側ともに０．５μｌ（最終濃度１００ｎＭ）、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブを任意量（最終濃度１００ｎＭ）、ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎ　Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ・ＲＴ−ＰＣＲ・マスター・ミックス：アプライドバイオシステムズジャパン社製）２５μｌ、超純水任意量、全量で５０μｌとした。この際、検量線作成用ＲＮＡ溶液は原液濃度を便宜的に「５００」とし、以降２倍希釈を繰り返して濃度「２５０」、「１２５」、「６２．５」、「３１．３」、「１５．６」、「７．８」の溶液について同様に反応液を調製した。ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ＡＢＩ７７００：アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。反応は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０回繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。
【０１４２】
ｃ）発現量の算出
各サイクル毎のレポーター色素の発光量からＧＡＰＤＨ、実施例２で得られた遺伝子の増幅曲線を作成した。検量線作成用ＲＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。実施例２で得られた遺伝子の発現量は同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨの発現量の値で補正を行った。
【０１４３】
＜結果＞
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより検出されたヒト心不全患者左心室心筋、およびヒト正常心筋組織における発現量の変動は、実施例２で得られたチップ解析による該遺伝子の発現量の変動と一致した。
【０１４４】
実施例４：ＧＰＣＲ遺伝子発現量の解析
＜試験方法＞
実施例２において得られたヒト正常心筋組織および心不全患者左心室心筋の発現量解析データより、ＧＰＣＲ遺伝子のデータを抽出し、実施例２とは異なる基準で心不全の病態予測用マーカー遺伝子を選択した。すなわち、正常心筋組織と心不全患者左心室心筋で発現量に差があるもの、または全サンプルにおいてＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ　Ｇｅｎｅ　Ｃｈｉｐによって計測される遺伝子発現量の絶対値）が５０以上であるものを選択した。ＧＰＣＲ遺伝子データの抽出には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社Ｎｅｔ　Ａｆｆｙｘのプローブのアノテーション情報を利用した。
【０１４５】
＜結果＞
正常心筋組織と心不全患者左心室心筋組織で発現量に差がある、または全サンプルにおいてＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値が５０以上であるＧＰＣＲ遺伝子は１１種あり、そのＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒは表３のとおりであった。
【０１４６】
【表３】

【０１４７】
【発明の効果】
本発明のマーカー遺伝子や該遺伝子がコードしている蛋白質は、心不全の病態や進行を予測するための新しい指標となりうる。従って、該遺伝子や蛋白質を利用することにより、心不全の診断、治療または予防の改善が可能となる。
【０１４８】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞　ＳＡＮＫＹＯ　ＣＯＭＰＡＮＹ，　ＬＩＭＩＴＥＤ
＜１２０＞　Ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｆａｉｌｕｒｅ　ａｎｄ
ｕｓｅｓ　ｔｈｅｒｅｏｆ
＜１３０＞　２００２１９３ＳＵ
＜１４０＞
＜１４１＞
＜１５０＞　ＪＰ　２００２−０５４３８８
＜１５１＞　２００２−０２−２８
＜１５０＞　ＪＰ　２００２−１１２２２８
＜１５１＞　２００２−０４−１５
＜１６０＞　３１
＜１７０＞　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｖｅｒ．　２．１
＜２１０＞　１
＜２１１＞　１４７８
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜２２０＞
＜２２３＞　Ｉｎｖｅｎｔｏｒ：　Ｋｉｔａｋａｚｅ，　Ｍａｓａｆｕｍｉ；　Ｔａｋａｓｈｉｍａ，　Ｓｅｉｊｉ；　Ａｓａｋｕｒａ，　Ｍａｓａｎｏｒｉ；Ｉｓｏｍｕｒａ，　Ｔａｄａｓｈｉ；　Ｆｕｒｕｋａｗａ，　Ｈｉｄｅｈｉｋｏ；　Ｋｏｉｓｈｉ，　Ｒｙｕｔａ；　Ｎａｋａｍａｒｕ，　Ｋｅｎｊｉ＜４００＞　１
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　２
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＜２１１＞　２９４７
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　５
ｇｇｃｃｔｔａｔｃｔ　ｔｔｃｃａｇｔｃｇｔ　ｃｃａｇｃａｔｇｃｔ　ｃｔｇｃｃｃａｃｃｃ　ｃａｃｇｃｃｇａｇｇ　ｔｇｃａｃｔｇａｃｃ　６０　　　　ａｔｇａｇｃｃｔｃａ　ａｃｔｃｃｔｃｃｃｔ　ｃａｇｃｔｇｃａｇｇ　ａａｇｇａｇｃｔｇａ　ｇｔａａｔｃｔｃａｃ　ｔｇａｇｇａｇｇａｇ　１２０　　　ｇｇｔｇｇｃｇａａｇ　ｇｇｇｇｃｇｔｃａｔ　ｃａｔｃａｃｃｃａｇ　ｔｔｃａｔｃｇｃｃａ　ｔｃａｔｔｇｔｃａｔ　ｃａｃｃａｔｔｔｔｔ　１８０　　　ｇｔｃｔｇｃｃｔｇｇ　ｇａａａｃｃｔｇｇｔ　ｃａｔｃｇｔｇｇｔｃ　ａｃｃｔｔｇｔａｃａ　ａｇａａｇｔｃｃｔａ　ｃｃｔｃｃｔｃａｃｃ　２４０　　　ｃｔｃａｇｃａａｃａ　ａｇｔｔｃｇｔｃｔｔ　ｃａｇｃｃｔｇａｃｔ　ｃｔｇｔｃｃａａｃｔ　ｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃ　ｃｇｔｇｔｔｇｇｔｇ　３００　　　ｃｔｇｃｃｔｔｔｔｇ　ｔｇｇｔｇａｃｇａｇ　ｃｔｃｃａｔｃｃｇｃ　ａｇｇｇａａｔｇｇａ　ｔｃｔｔｔｇｇｔｇｔ　ａｇｔｇｔｇｇｔｇｃ　３６０　　　ａａｃｔｔｃｔｃｔｇ　ｃｃｃｔｃｃｔｃｔａ　ｃｃｔｇｃｔｇａｔｃ　ａｇｃｔｃｔｇｃｃａ　ｇｃａｔｇｃｔａａｃ　ｃｃｔｃｇｇｇｇｔｃ　４２０　　　ａｔｔｇｃｃａｔｃｇ　ａｃｃｇｃｔａｃｔａ　ｔｇｃｔｇｔｃｃｔｇ　ｔａｃｃｃｃａｔｇｇ　ｔｇｔａｃｃｃｃａｔ　ｇａａｇａｔｃａｃａ　４８０　　　ｇｇｇａａｃｃｇｇｇ　ｃｔｇｔｇａｔｇｇｃ　ａｃｔｔｇｔｃｔａｃ　ａｔｃｔｇｇｃｔｔｃ　ａｃｔｃｇｃｔｃａｔ　ｃｇｇｃｔｇｃｃｔｇ　５４０　　　ｃｃａｃｃｃｃｔｇｔ　ｔｔｇｇｔｔｇｇｔｃ　ａｔｃｃｇｔｇｇａｇ　ｔｔｔｇａｃｇａｇｔ　ｔｃａａａｔｇｇａｔ　ｇｔｇｔｇｔｇｇｃｔ　６００　　　ｇｃｔｔｇｇｃａｃｃ　ｇｇｇａｇｃｃｔｇｇ　ｃｔａｃａｃｇｇｃｃ　ｔｔｃｔｇｇｃａｇａ　ｔｃｔｇｇｔｇｔｇｃ　ｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃ　６６０　　　ｔｔｔｃｔｇｇｔｃａ　ｔｇｃｔｇｇｔｇｔｇ　ｃｔａｔｇｇｃｔｔｃ　ａｔｃｔｔｃｃｇｃｇ　ｔｇｇｃｃａｇｇｇｔ　ｃａａｇｇｃａｃｇｃ　７２０　　　ａａｇｇｔｇｃａｃｔ　ｇｔｇｇｃａｃａｇｔ　ｃｇｔｃａｔｃｇｔｇ　ｇａｇｇａｇｇａｔｇ　ｃｔｃａｇａｇｇａｃ　ｃｇｇｇａｇｇａａｇ　７８０　　　ａａｃｔｃｃａｇｃａ　ｃｃｔｃｃａｃｃｔｃ　ｃｔｃｔｔｃａｇｇｃ　ａｇｃａｇｇａｇｇａ　ａｔｇｃｃｔｔｔｃａ　ｇｇｇｔｇｔｇｇｔｃ　８４０　　　ｔａｃｔｃｇｇｃｃａ　ａｃｃａｇｔｇｃａａ　ａｇｃｃｃｔｃａｔｃ　ａｃｃａｔｃｃｔｇｇ　ｔｇｇｔｃｃｔｃｇｇ　ｔｇｃｃｔｔｃａｔｇ　９００　　　ｇｔｃａｃｃｔｇｇｇ　ｇｃｃｃｃｔａｃａｔ　ｇｇｔｔｇｔｃａｔｃ　ｇｃｃｔｃｔｇａｇｇ　ｃｃｃｔｃｔｇｇｇｇ　ｇａａａａｇｃｔｃｃ　９６０　　　ｇｔｃｔｃｃｃｃｇａ　ｇｃｃｔｇｇａｇａｃ　ｔｔｇｇｇｃｃａｃａ　ｔｇｇｃｔｇｔｃｃｔ　ｔｔｇｃｃａｇｃｇｃ　ｔｇｔｃｔｇｃｃａｃ　１０２０　　ｃｃｃｃｔｇａｔｃｔ　ａｔｇｇａｃｔｃｔｇ　ｇａａｃａａｇａｃａ　ｇｔｔｃｇｃａａａｇ　ａａｃｔａｃｔｇｇｇ　ｃａｔｇｔｇｃｔｔｔ　１０８０　　ｇｇｇｇａｃｃｇｇｔ　ａｔｔａｔｃｇｇｇａ　ａｃｃａｔｔｔｇｔｇ　ｃａａｃｇａｃａｇａ　ｇｇａｃｔｔｃｃａｇ　ｇｃｔｃｔｔｃａｇｃ　１１４０　　ａｔｔｔｃｃａａｃａ　ｇｇａｔｃａｃａｇａ　ｃｃｔｇｇｇｃｃｔｇ　ｔｃｃｃｃａｃａｃｃ　ｔｃａｃｔｇｃｇｃｔ　ｃａｔｇｇｃａｇｇｔ　１２００　　ｇｇａｃａｇｃｃｃｃ　ｔｇｇｇｇｃａｃａｇ　ｃａｇｃａｇｃａｃｇ　ｇｇｇｇａｃａｃｔｇ　ｇｃｔｔｃａｇｃｔｇ　ｃｔｃｃｃａｇｇａｃ　１２６０　　ｔｃａｇｇｔａａｃｃ　ｔｇｃｇｔｇｃｔｔｔ　ａｔａａｇｃｃｔｃｔ　ｃａｃｃｔｇｔｃｇｃ　ｇｔｔｔｔｃｃｃｔｇ　ｔｇｔｔｇｃｇｔｔｔ　１３２０　　ｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃ　ｇｃｇｔｔｔｃｃｃｃ　ｔｇｔｇｃａｇｇｃｔ　ｃａａｇａｇｃｔｇｇ　ｃｇｇａｇｇｇｇｃａ　ｔｔｔｃｃｃａｃｇｇ　１３８０　　ｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３８２　　＜２１０＞　６
＜２１１＞　４５４６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　６
ａａｇａｔｇｇｃｇｇ　ｇｃｇｇｇｃｔｇｃｔ　ｃｔｇａａｇａｇａｃ　ｃｃｃｇｇｃｇｇｃｇ　ｇｃｇｇａｇｇａｇｇ　ａｇａｇａａｇｃｇｃ　６０　　　　ａｇｃｇｃｃｇｃｇｃ　ｃｇｃｇｃｃｇｇｇｇ　ｃｃｃａｔｇｔｇｇｇ　ｇａｇｇａｇｔｃｇｇ　ａｇｔｃｇｃｔｇｔｔ　ｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇ　１２０　　　ｃｃｔｇｔａｇｃｔｇ　ｃｔｇｇａｃｃｃｇａ　ｇｔｇｇｇａｇｔｇａ　ｇｇｇｇｇａａａｃｇ　ｇｃａｇｇａｔｇａａ　ｇｔｔｃｇｃｃｇａｇ　１８０　　　ｃａｃｃｔｃｔｃｃｇ　ｃｇｃａｃａｔｃａｃ　ｔｃｃｃｇａｇｔｇｇ　ａｇｇａａｇｃａａｔ　ａｃａｔｃｃａｇｔａ　ｔｇａｇｇｃｔｔｔｃ　２４０　　　ａａｇｇａｔａｔｇｃ　ｔｇｔａｔｔｃａｇｃ　ｔｃａｇｇａｃｃａｇ　ｇｃａｃｃｔｔｃｔｇ　ｔｇｇａａｇｔｔａｃ　ａｇａｔｇａｇｇａｃ　３００　　　ａｃａｇｔａａａｇａ　ｇｇｔａｔｔｔｔｇｃ　ｃａａｇｔｔｔｇａａ　ｇａｇａａｇｔｔｔｔ　ｔｃｃａａａｃｃｔｇ　ｔｇａａａａａｇａａ　３６０　　　ｃｔｔｇｃｃａａａａ　ｔｃａａｃａｃａｔｔ　ｔｔａｔｔｃａｇａｇ　ａａｇｃｔｃｇｃａｇ　ａｇｇｃｔｃａｇｃｇ　ｃａｇｇｔｔｔｇｃｔ　４２０　　　ａｃａｃｔｔｃａｇａ　ａｔｇａｇｃｔｔｃａ　ｇｔｃａｔｃａｃｔｇ　ｇａｔｇｃａｃａｇａ　ａａｇａａａｇｃａｃ　ｔｇｇｔｇｔｔａｃｔ　４８０　　　ａｃｇｃｔｇｃｇａｃ　ａａｃｇｃａｇａａａ　ｇｃｃａｇｔｃｔｔｃ　ｃａｃｔｔｇｔｃｃｃ　ａｔｇａｇｇａａｃｇ　ｔｇｔｃｃａａｃａｔ　５４０　　　ａｇａａａｔａｔｔａ　ａａｇａｃｃｔｔａａ　ａｃｔｇｇｃｃｔｔｃ　ａｇｔｇａｇｔｔｃｔ　ａｃｃｔｃａｇｔｃｔ　ａａｔｃｃｔｇｃｔｇ　６００　　　ｃａｇａａｃｔａｔｃ　ａｇａａｔｃｔｇａａ　ｔｔｔｔａｃａｇｇｇ　ｔｔｔｃｇａａａａａ　ｔｃｃｔｇａａａａａ　ｇｃａｔｇａｃａａｇ　６６０　　　ａｔｃｃｔｇｇａａａ　ｃａｔｃｔｃｇｔｇｇ　ａｇｃａｇａｔｔｇｇ　ｃｇａｇｔｇｇｃｔｃ　ａｃｇｔａｇａｇｇｔ　ｇｇｃｃｃｃａｔｔｔ　７２０　　　ｔａｔａｃａｔｇｃａ　ａｇａａａａｔｃａａ　ｃｃａｇｃｔｔａｔｃ　ｔｃｔｇａａａｃｔｇ　ａｇｇｃｔｇｔａｇｔ　ｇａｃｃａａｔｇａａ　７８０　　　ｃｔｔｇａａｇａｔｇ　ｇｔｇａｃａｇａｃａ　ａａａｇｇｃｔａｔｇ　ａａｇｃｇｔｔｔａｃ　ｇｔｇｔｃｃｃｃｃｃ　ｔｔｔｇｇｇａｇｃｔ　８４０　　　ｇｃｔｃａｇｃｃｔｇ　ｃａｃｃａｇｃａｔｇ　ｇａｃｔａｃｔｔｔｔ　ａｇａｇｔｔｇｇｃｃ　ｔａｔｔｔｔｇｔｇｇ　ａａｔａｔｔｃａｔｔ　９００　　　ｇｔａｃｔｇａａｔａ　ｔｔａｃｃｃｔｔｇｔ　ｇｃｔｔｇｃｃｇｃｔ　ｇｔａｔｔｔａａａｃ　ｔｔｇａａａｃａｇａ　ｔａｇａａｇｔａｔａ　９６０　　　ｔｇｇｃｃｃｔｔｇａ　ｔａａｇａａｔｃｔａ　ｔｃｇｇｇｇｔｇｇｃ　ｔｔｔｃｔｔｃｔｇａ　ｔｔｇａａｔｔｃｃｔ　ｔｔｔｔｃｔａｃｔｇ　１０２０　　ｇｇｃａｔｃａａｃａ　ｃｇｔａｔｇｇｔｔｇ　ｇａｇａｃａｇｇｃｔ　ｇｇａｇｔａａａｃｃ　ａｔｇｔａｃｔｃａｔ　ｃｔｔｔｇａａｃｔｔ　１０８０　　ａａｔｃｃｇａｇａａ　ｇｃａａｔｔｔｇｔｃ　ｔｃａｔｃａａｃａｔ　ｃｔｃｔｔｔｇａｇａ　ｔｔｇｃｔｇｇａｔｔ　ｃｃｔｃｇｇｇａｔａ　１１４０　　ｔｔｇｔｇｇｔｇｃｃ　ｔｇａｇｃｃｔｔｃｔ　ｇｇｃａｔｇｃｔｔｃ　ｔｔｔｇｃｔｃｃａａ　ｔｔａｇｔｇｔｃａｔ　ｃｃｃｃａｃａｔａｔ　１２００　　ｇｔｇｔａｔｃｃａｃ　ｔｔｇｃｃｃｔｔｔａ　ｔｇｇａｔｔｔａｔｇ　ｇｔｔｔｔｃｔｔｃｃ　ｔｔａｔｃａａｃｃｃ　ｃａｃｃａａａａｃｔ　１２６０　　ｔｔｃｔａｃｔａｔａ　ａａｔｃｃｃｇｇｔｔ　ｔｔｇｇｃｔｇｃｔｔ　ａａａｃｔｇｃｔｇｔ　ｔｔｃｇａｇｔａｔｔ　ｔａｃａｇｃｃｃｃｃ　１３２０　　ｔｔｃｃａｔａａｇｇ　ｔａｇｇｃｔｔｔｇｃ　ｔｇａｔｔｔｃｔｇｇ　ｃｔｇｇｃｇｇａｔｃ　ａｇｃｔｇａａｃａｇ　ｃｃｔｇｔｃａｇｔｇ　１３８０　　ａｔａｃｔｇａｔｇｇ　ａｃｃｔｇｇａａｔａ　ｔａｔｇａｔｃｔｇｃ　ｔｔｃｔａｃａｇｔｔ　ｔｇｇａｇｃｔｃａａ　ａｔｇｇｇａｔｇａａ　１４４０　　ａｇｔａａｇｇｇｃｃ　ｔｇｔｔｇｃｃａａａ　ｔａａｔｔｃａｇａａ　ｇａａｔｃａｇｇａａ　ｔｔｔｇｃｃａｃａａ　ａｔａｔａｃａｔａｔ　１５００　　ｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇ　ｃｃａｔｔｇｔｔｃａ　ｇｔｇｃａｔｔｃｃｔ　ｇｃｔｔｇｇｃｔｔｃ　ｇｃｔｔｃａｔｃｃａ　ｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃ　１５６０　　ｃｇａｔａｔｃｇａｇ　ａｃａｃａａａａａｇ　ｇｇｃｃｔｔｔｃｃｔ　ｃａｔｔｔａｇｔｔａ　ａｔｇｃｔｇｇｃａａ　ａｔａｃｔｃｃａｃａ　１６２０　　ａｃｔｔｔｃｔｔｃａ　ｔｇｇｔｇａｃｇｔｔ　ｔｇｃａｇｃｃｃｔｔ　ｔａｃａｇｃａｃｔｃ　ａｃａａａｇａａｃｇ　ａｇｇｔｃａｃｔｃｇ　１６８０　　ｇａｃａｃｔａｔｇｇ　ｔｇｔｔｃｔｔｔｔａ　ｃｃｔｇｔｇｇａｔｔ　ｇｔｃｔｔｔｔａｔａ　ｔｃａｔｃａｇｔｔｃ　ｃｔｇｃｔａｔａｃｃ　１７４０　　ｃｔｃａｔｃｔｇｇｇ　ａｔｃｔｃａａｇａｔ　ｇｇａｃｔｇｇｇｇｔ　ｃｔｃｔｔｃｇａｔａ　ａｇａａｔｇｃａｇｇ　ａｇａｇａａｃａｃｔ　１８００　　ｔｔｃｃｔｃｃｇｇｇ　ａａｇａｇａｔｔｇｔ　ａｔａｃｃｃｃｃａａ　ａａａｇｃｃｔａｃｔ　ａｃｔａｃｔｇｔｇｃ　ｃａｔａａｔａｇａｇ　１８６０　　ｇａｔｇｔｇａｔｔｃ　ｔｇｃｇｃｔｔｔｇｃ　ｔｔｇｇａｃｔａｔｃ　ｃａａａｔｃｔｃｇａ　ｔｔａｃｃｔｃｔａｃ　ａａｃｔｔｔｇｔｔｇ　１９２０　　ｃｃｔｃａｔｔｃｔｇ　ｇｇｇａｃａｔｃａｔ　ｔｇｃｔａｃｔｇｔｃ　ｔｔｔｇｃｃｃｃａｃ　ｔｔｇａｇｇｔｔｔｔ　ｃｃｇｇｃｇａｔｔｔ　１９８０　　ｇｔｇｔｇｇａａｃｔ　ｔｃｔｔｃｃｇｃｃｔ　ｇｇａｇａａｔｇａａ　ｃａｔｃｔｇａａｔａ　ａｃｔｇｔｇｇｔｇａ　ａｔｔｃｃｇｔｇｃｔ　２０４０　　ｇｔｇｃｇｇｇａｃａ　ｔｃｔｃｔｇｔｇｇｃ　ｃｃｃｃｃｔｇａａｃ　ｇｃａｇａｔｇａｔｃ　ａｇａｃｔｃｔｃｃｔ　ａｇａａｃａｇａｔｇ　２１００　　ａｔｇｇａｃｃａｇｇ　ａｔｇａｔｇｇｇｇｔ　ａｃｇａａａｃｃｇｃ　ｃａｇａａｇａａｔｃ　ｇｇｔｃａｔｇｇａａ　ｇｔａｃａａｃｃａｇ　２１６０　　ａｇｃａｔａｔｃｃｃ　ｔｇｃｇｃｃｇｇｃｃ　ｔｃｇｃｃｔｃｇｃｔ　ｔｃｔｃａａｔｃｃａ　ａｇｇｃｔｃｇｔｇａ　ｃａｃｔａａｇｇｔａ　２２２０　　ｔｔｇａｔａｇａａｇ　ａｃａｃａｇａｔｇａ　ｔｇａａｇｃｔａａｃ　ａｃｔｔｇａａｔｔｔ　ｔｃｔｇａａｇｔｃｔ　ａｇｃｔｔａａｃａｔ　２２８０　　ｃｔｔｔｇｇｔｔｔｔ　ｃｃｔａｃｔｃｔａｃ　ａａｔｃｃｔｔｔｃｃ　ｔｃｇａｃｃａａｃｇ　ｃａａｃｃｔｃｔａｇ　ｔａｃｃｔｔｔｃｃａ　２３４０　　ｇｃｃｇａａａａｃａ　ｇｇａｇａａａａｃａ　ｃａｔａａｃａｃａｔ　ｔｔｔｃｃｇａｇｃｔ　ｃｔｔｃｃｇｇａｔｃ　ｇｇａｔｃｃｔａｔｇ　２４００　　ｇａｃｔｃｃａａａｃ　ａａｇｃｔｃａｃｔｇ　ｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔ　ｃｔｔｔｔｃｔｔｃｔ　ｇｇｔｔｔａａｔｔｔ　ｔａａｔｔｔｔｃｔａ　２４６０　　ｔｔｔｔｃａａａａｃ　ａａａｔａｔｔｔａｃ　ｔｔｃａｔｔｔｇｃｃ　ａａｔｃａｇａｇｇａ　ｔｇｔｔｔｔａａｇａ　ａａｃａａａａｃａｔ　２５２０　　ａｇｔａｔｃｔｔａｔ　ｇｇａｔｔｇｔｔｔａ　ｃａａｔｃａｃａａｇ　ｇａｃａｔａｇａｔａ　ｃｃｔａｔｃａｇｇａ　ｔｇａａｇａａｃａｇ　２５８０　　ｇｃａｔｔｇｃａａｇ　ｇａｃｃｃｔｃｔｇａ　ｔｇｇｇａｃｇｇｔａ　ｃｔｇａｇａｔａｔｃ　ｔｃｇｇｃｔｔｃｃｇ　ｃｔｃａｇｃｃｃｇｇ　２６４０　　ｔｔｔｔｇａｃｔｇｇ　ｔｔｇａａａｃｃｇｇ　ａｃａｔｔｇｇｔｔｔ　ｔｔａａａｔｔｔｔｔ　ｔｇｔｃａｇｔｔｔａ　ｔｇｔｇｇａｇａａｔ　２７００　　ｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔ　ｃｃｔｔｃａｔａｃｃ　ｃａｇｃｇｃａａａｇ　ｇｃａｃｔｇｇｃｃｇ　ｃａｃｔｔｇｃａｇｇ　ａａａａｇｔｇｃａａ　２７６０　　ｃｔｔａａａｇｃａｇ　ｔａｔｃｔｔｃａｔｔ　ｃａｔｇａａｇｃｔａ　ｃｔｔｔｔｔａａｔｔ　ｔｇａｔｇｔａａｃｔ　ｔｔｔｃｔｔａｔｔｔ　２８２０　　ｔｇｇｇａａｇｇｇｔ　ｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇ　ｇｔｇｇｇａａａｔａ　ｔｇａｔｇｔａｔｔｔ　ｇｔｔａｃａｃａｃａ　ｇｔｔｔｔｃｔｃａｔ　２８８０　　ｔａｔｔｔａｔｇａａ　ａｃｔｔａａｃｃａｔ　ａｃａｇａａｔｇａｔ　ａｔａａｃｔｃｃｔｇ　ｔｇｃａａｔｇａａｇ　ｇｔｇａｔａａｃａｇ　２９４０　　ｔａａａａｇａａｇｇ　ｃａｇｇｇｇａａａｃ　ｔｔａｃｇｔｔｇｇａ　ｔｇａｃａｔｔｔａｔ　ｇａｇｇｇｔｃａｇｔ　ｃｃｃａｃａｔａｃｃ　３０００　　ｔｃｔｔｔｃａｇｇａ　ｇａｃａａｃｔｔｇｃ　ａｃｃａｇｔｔｔｇａ　ｃｃｔｔｔｔｃｔｔｔ　ｔｃｔｔｔｇｔｔｔｔ　ｔａｔｔｔｔａａｇｃ　３０６０　　ｃａａａｇｔｔｔｃａ　ｔｔｇｃｔａａｃｔｔ　ｃｔｔａａｇｔｔｇｃ　ｔｇｃｔｇｃｔｔｔａ　ｇａｇｔｃｃｔｇａｇ　ｃａｔａｔｃｔｃｔｃ　３１２０　　ｇｔａａｃａａｇｇａ　ａｔｃｃｃａｃａｃｔ　ｔｃａｃａｃｃａｃｃ　ｇｇｃｔｇａａｔｔｔ　ｃａｔｇｇａａｇａｇ　ｇｔｔｃｔｇａｔａａ　３１８０　　ｔｔｔｔｔｔｔａａｃ　ｔｔｔｔｔａａｇｇａ　ａｃａｇａｔｇｔｇｇ　ａａｔａｃａｃｔｇｇ　ｃｃｃａｔａｔｔｔｃ　ａａｃｃｔｔａａｃａ　３２４０　　ｇｃｔｇａａｇｃｔａ　ｔｇｃｃｔｔａｔｔａ　ｔｇｃａｔｃｃａｃａ　ｔｇｔａｔｇｇｔｃｃ　ｃｔｇｔａｇｃｇｔｇ　ａｃｃｔｔｔａｃｔａ　３３００　　ｇｃｔｃｔｇａａｔｃ　ａｇａａｇａｃａｇａ　ｇｃｔａｔｔｔｃａｇ　ａｇｇｃｔｃｔｇｔｇ　ｔｇｃｃｃｔｃａｃｔ　ａｇａｔａｇｔｔｔｔ　３３６０　　ｔｃｔｔｃｔｇｇｇｔ　ｔｃａａｃｃａｃｔｔ　ｔａｇｃｃａｇａａｔ　ｔｔｇａｔｃａａａｔ　ｔａａａａｇｔｃｔｇ　ｔｃａｔｇｇｇｇａａ　３４２０　　ｇｃｔａｔａｔｔｔｔ　ｔｇａｇｃａｃａｔｇ　ｇａａｃａａａｔｔａ　ｔａｃｔｔｃｃｔｃａ　ｔｔｃａｔａｔｔａｔ　ｇｔｔｇａｔａｃａａ　３４８０　　ａａｇａｃｃｔｔｇｇ　ｃａｇｃｃａｔｔｔｃ　ｔｃｃｃａｇｃａｇｔ　ｔｔｔａａａｇｇａｔ　ｇａａｃａｔｔｇｇａ　ｔｔｔｃａｔｇｃｃａ　３５４０　　ｔｃｃｃａｔａｇａａ　ａａｃｃｔｇｔｔｔｔ　ａａａａｔｔｔｔａｇ　ｇｇａｔｃｔｔｔａｃ　ｔｔｇｇｔｃａｔａｃ　ａｔｇａａａａｇｔａ　３６００　　ｃａｃｔｇｃｔｔａｇ　ａａａｔｔａｔａｇａ　ｃｔａｔｔａｔｇａｔ　ｃｔｇｔｃｃａｃａｇ　ｔｇｃｃｃａｔｔｇｔ　ｃａｃｔｔｃｔｔｔｇ　３６６０　　ｔｃｔｃａｔｔｔｃｔ　ｔｃｃｃｔｔｔｇｔｔ　ｃｃｔｔａｇｔｃａｔ　ｃｃａａａｔａａｇｃ　ｃｔｇａａａａｃｃａ　ｔａａｇａｇａｔａｔ　３７２０　　ｔａｃｔｔｔａｔｔｇ　ａａｔａｔｇｇｔｔｇ　ｇｃａｔｔａａａｔｔ　ｔａｇｃａｔｔｔｃａ　ｔｔａｔｃｔａａｃａ　ａａａｔｔａａｔａｔ　３７８０　　ａａａｔｔｃｃａｇｇ　ａｃａｔｇｇｔａａａ　ａｔｇｔｇｔｔｔｔａ　ａｔａａｃｃｃｃｃａ　ｇａｃｃｃａａａｔｇ　ａａａａｔｔｔｃａａ　３８４０　　ａｇｔｃａａｔａｃｃ　ａｇｃａｇａｔｔｃａ　ｔｇａａａｇｔａａａ　ｔｔｔａｇｔｃｃｔａ　ｔａａｔｔｔｔｃａｇ　ｃｔｔａａｔｔａｔａ　３９００　　ａａｃａａａｇｇａａ　ｃａａａｔａａｇｔｇ　ｇａａｇｇｇｃａｇｃ　ｔａｔｔａｃｃａｔｔ　ｃｇｃｔｔａｇｔｃａ　ａａａｃａｔｔｃｇｇ　３９６０　　ｔｔａｃｔｇｃｃｃｔ　ｔｔａａｔａｃａｃｔ　ｃｃｔａｔｃａｔｃａ　ｇｃａｃｔｔｃｃａｃ　ｃａｔｇｔａｔｔａｃ　ａａｇｔｃｔｔｇａｃ　４０２０　　ｃｃａｔｃｃｃｔｇｔ　ｃｇｔａａｃｔｃｃａ　ｇｔａａａａｇｔｔａ　ｃｔｇｔｔａｃｔａｇ　ａａａａｔｔｔｔｔａ　ｔｃａａｔｔａａｃｔ　４０８０　　ｇａｃａａａｔａｇｔ　ｔｔｃｔｔｔｔｔａａ　ａｇｔａｇｔｔｔｃｔ　ｔｃｃａｔｃｔｔｔａ　ｔｔｃｔｇａｃｔａｇ　ｃｔｔｃｃａａａａｔ　４１４０　　ｇｔｇｔｔｃｃｃｔｔ　ｔｔｔｇａａｔｃｇａ　ｇｇｔｔｔｔｔｔｔｇ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＜２１１＞　１２４５
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　７
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＜２１１＞　３５４２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　８
ｇａａｔｔｃｔｇｇｇ　ｎｔｔａｇｇｃｇａｔ　ｔｃｔｇｇｇｔｔａｇ　ｃａｇｇｃｔｔｇｇｇ　ｃｃｃａａｇｔｇｃｔ　ｃｇａｇｔｇｃｔｇｇ　６０　　　　ｇｇｔｔｇａｇｔｔｇ　ｇａｔｇａｃｃｃｇｇ　ｃｇａａｇｇｇｔａａ　ｇｃａｔｔｃｃｔｇｃ　ａｇｇｇａｃｃｃｇａ　ｇｇｃｃｃｔｇｇｗｇ　１２０　　　ｇｇａｃｔｇａｔｇｇ　ｔｃａｔｃｔｇｃｇｇ　ｔｔａａｇｃｃｇｇｃ　ａｇｇａｇｇｃｇｔｃ　ｔｇｇｇｇｃａｇｇｇ　ａｃｃｃａｇｇｇｇｔ　１８０　　　ｃｃｇａａｃａｇｃａ　ｇｇａｇｇｔｇｔｃｃ　ａａｔｔｔａｇｇａａ　ｔｃｃａｇｇｔａｔｃ　ｃａｇｇｃａｇｇａｇ　ｇｃａｇａｇｔｃａｇ　２４０　　　ｇｃｃｃａａａａｔｃ　ｃａｇｇｔｇｔｃｃｇ　ｇｇｃａｇａａｇｇａ　ｇｇｃａｔｃｔｇａｃ　ｔｃａｇｇｇａｔｃｃ　ａｇｔｃｔｔｃｃａｇ　３００　　　ｃａｇｇｇｇｇｇｔｃ　ｔｇｃｃｃａｇａｇａ　ｃｃｔａｇａｇａｔｔ　ｃａｇｇｃｇｇａａａ　ｇａａｇｇｇｔｃｃａ　ｇｃｃａｇｇａａｃａ　３６０　　　ｇａａｇｔｃｔｇｇｇ　ａｇｇｇｔｇｇｇｇｇ　ｇｔｇｇｇｇｇｇｃｔ　ｇａｇｔｔｃｃｃａｇ　ｇｔｇｔｔａｃｃｇｃ　ｇｇｇａｇｔｇｃｇｇ　４２０　　　ｇｇｔｇａｔｇｇｃｔ　ｇｇｃｇｇｇａｇｃｔ　ｔｃａｃｇｃｇｃａｔ　ｔｃｃｃｔｇｇｇｇｇ　ｃｇｇａｇｔｃｔａａ　ｇｇｃｔｇｇｃａｇｔ　４８０　　　ａｃｔｇａａａａｔｃ　ｇｔｇａｇｇｇｇｔｃ　ｔｇｇｇａｇｃｃｔｃ　ａｇｇｃａｃｇａｇｃ　ｔａｇｃａｔｃａｔｃ　ａｔｃｔｃｔｇａｔｇ　５４０　　　ｇｇａｇｇｇａｇｃｇ　ｇａｇｃｔｇｃｔｃａ　ｇｔｃｔｃｃｃｔｇａ　ｔｇｇｇｇｔａｇａｔ　ｇｔｔｔｃｃｃｔａｃ　ｃｃｃａａｔｃｔｔｇ　６００　　　ａｇｃｃｔｔｃｇｇｇ　ｇｇｃａｔｃｃｃｃｔ　ｇｇａｔｃｃｔａｔｇ　ｇｃｃｃｔｃｔｔｃｃ　ａｃｔｔａｔａｇｔａ　ｃｃｃｃｔｔｃｔｔｃ　６６０　　　ｔｇｔｃｔｃｔｃｃｔ　ｃｔｇｇｔｃａｃａｃ　ａｃｇｔｇｇｇａａａ　ａａｇａｇａｃｃｔｇ　ｃａｇｇａｃｃｔａｇ　ｇａｃａｇｇｇａｔｃ　７２０　　　ｃｃｃａｇｇａａｇａ　ｇａｃｃｃｃｔｇｔｔ　ｔａｇａｇｇｃｃｔｇ　ｇｇｇｇｃａｔｔｇｇ　ａｇｇｇｇａｃａｇｃ　ｇｇｔａｔｃｃｔｇｇ　７８０　　　ｇａａｇａｇｃｃｃｃ　ａｇｇｇｃａｔｇａａ　ｔｇｔｇｇｇｇａｔａ　ａｇｇｃａｔｔｇｇｇ　ａｃｔｃｔａｔｃａｇ　ｇｔａｔｃｃｔｇａｇ　８４０　　　ｇａｇａｇａｃｔｃｃ　ｃａｃｃａｃｇｔａｔ　ｃｃｔｇａｇａａｇｃ　ａｃｃｔｃａｃｃｃｃ　ｃｔｃｃａｇａｃｃｃ　ｃａａｃｔｃｃｃａｔ　９００　　　ｃａｃｃｃａｇｃｔｔ　ｇｇｔｃａｇｃｔｔｃ　ｔｃａｃａａｇｇｃｃ　ｔｔｔｃｔｃｃｔｇｃ　ａｇｇｔａｃｃａｔｇ　ａｔｇｔｇｇｇｇｔｇ　９６０　　　ｃａｇｇｃａｇｃｃｃ　ｔｃｔｇｇｃｃｔｇｇ　ｃｔｃｔｃａｇｃｔｇ　ｇｃｔｃａｇｇｃａａ　ｃｇｔｇａａｔｇｔａ　ａｇｃａｇｃｇｔｇｇ　１０２０　　ｇｃｃｃａｇｃａｇａ　ｇｇｇｇｃｃｃａｃａ　ｇｇｔｃｃａｇｃｃｇ　ｃａｃｃａｃｔｇｃｃ　ｃｔｃｇｃｃｔａａｇ　ｇｃｃｔｇｇｇａｔｇ　１０８０　　ｔｇｇｔｇｃｔｃｔｇ　ｃａｔｃｔｃａｇｇｃ　ａｃｃｃｔｇｇｔｇｔ　ｃｃｔｇｃｇａｇａａ　ｔｇｃｇｃｔａｇｔｇ　ｇｔｇｇｃｃａｔｃａ　１１４０　　ｔｃｇｔｇｇｇｃａｃ　ｔｃｃｔｇｃｃｔｔｃ　ｃｇｔｇｃｃｃｃｃａ　ｔｇｔｔｃｃｔｇｃｔ　ｇｇｔｇｇｇｃａｇｃ　ｃｔｇｇｃｃｇｔｇｇ　１２００　　ｃａｇａｃｃｔｇｃｔ　ｇｇｃａｇｇｃｃｔｇ　ｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃ　ｔｇｃａｃｔｔｔｇｃ　ｔｇｃｔｇｔｃｔｔｃ　ｔｇｃａｔｃｇｇｃｔ　１２６０　　ｃａｇｃｇｇａｇａｔ　ｇａｇｃｃｔｇｇｔｇ　ｃｔｇｇｔｔｇｇｃｇ　ｔｇｃｔｇｇｃａａｔ　ｇｇｃｃｔｔｔａｃｃ　ｇｃｃａｇｃａｔｃｇ　１３２０　　ｇｃａｇｔｃｔａｃｔ　ｇｇｃｃａｔｃａｃｔ　ｇｔｃｇａｃｃｇｃｔ　ａｃｃｔｔｔｃｔｃｔ　ｇｔａｃａａｔｇｃｃ　ｃｔｃａｃｃｔａｃｔ　１３８０　　ａｔｔｃａｇａｇａｃ　ａａｃａｇｔｇａｃａ　ｃｇｇａｃｃｔａｔｇ　ｔｇａｔｇｃｔｇｇｃ　ｃｔｔａｇｔｇｔｇｇ　ｇｇａｇｇｔｇｃｃｃ　１４４０　　ｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇ　ｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔ　ｇｔｇｃｔｇｇｃｃｔ　ｇｇａａｃｔｇｃｃｔ　ｇｇａｔｇｇｃｃｔｇ　ａｃｃａｃａｔｇｔｇ　１５００　　ｇｃｇｔｇｇｔｔｔａ　ｔｃｃａｃｔｃｔｃｃ　ａａｇａａｃｃａｔｃ　ｔｇｇｔａｇｔｔｃｔ　ｇｇｃｃａｔｔｇｃｃ　ｔｔｃｔｔｃａｔｇｇ　１５６０　　ｔｇｔｔｔｇｇｃａｔ　ｃａｔｇｃｔｇｃａｇ　ｃｔｃｔａｃｇｃｃｃ　ａａａｔｃｔｇｃｃｇ　ｃａｔｃｇｔｃｔｇｃ　ｃｇｃｃａｔｇｃｃｃ　１６２０　　ａｇｃａｇａｔｔｇｃ　ｃｃｔｔｃａｇｃｇｇ　ｃａｃｃｔｇｃｔｇｃ　ｃｔｇｃｃｔｃｃｃａ　ｃｔａｔｇｔｇｇｃｃ　ａｃｃｃｇｃａａｇｇ　１６８０　　ｇｃａｔｔｇｃｃａｃ　ａｃｔｇｇｃｃｇｔｇ　ｇｔｇｃｔｔｇｇａｇ　ｃｃｔｔｔｇｃｃｇｃ　ｃｔｇｃｔｇｇｔｔｇ　ｃｃｃｔｔｃａｃｔｇ　１７４０　　ｔｃｔａｃｔｇｃｃｔ　ｇｃｔｇｇｇｔｇａｔ　ｇｃｃｃａｃｔｃｔｃ　ｃａｃｃｔｃｔｃｔａ　ｃａｃｃｔａｔｃｔｔ　ａｃｃｔｔｇｃｔｃｃ　１８００　　ｃｔｇｃｃａｃｃｔａ　ｃａａｃｔｃｃａｔｇ　ａｔｃａａｃｃｃｔａ　ｔｃａｔｃｔａｃｇｃ　ｃｔｔｃｃｇｃａａｃ　ｃａｇｇａｔｇｔｇｃ　１８６０　　ａｇａａａｇｔｇｃｔ　ｇｔｇｇｇｃｔｇｔｃ　ｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔ　ｇｔｔｃｃｔｃｔｔｃ　ｃａａｇａｔｃｃｃｃ　ｔｔｃｃｇａｔｃｃｃ　１９２０　　ｇｃｔｃｃｃｃｃａｇ　ｔｇａｔｇｔｃｔａｇ　ｃｔｇａｇｔｃｔｔｃ　ａｔｇａｃｃｃｔｔｃ　ａａｃｃｃｔｇａｔｔ　ａｃｔａｃａｇａａｔ　１９８０　　ｔｃｃａｇａａｔｇｔ　ｔａｇｇｃｔｃｔｃｃ　ａｇｇｇｃｔｔｃｔｔ　ｔｃｃａａａｃｃｃｃ　ｃａｇｃｔｃｃａｃａ　ｃｃｃｃｃｃａｇａｃ　２０４０　　ｃｃａｇｃｔｇｇｔｔ　ｃｔｇｇａｇｔｔｃｔ　ａｇｇａｃａｔｔｇｇ　ｇｔｇｔｔｔｃａａｇ　ｇｔｔｃｔｇｔｔｃａ　ｇａｔｃｃｃｔａｔｇ　２１００　　ｇｇｇｇｃｃｃａｇｃ　ｔｇｇｃｔｃｃａｃｇ　ｇｔｔｃｃａｇａａｔ　ｇｔｔｃａｇｇｔｇｇ　ｔｃａｇｔｇｔｔｃｔ　ａｃｔｃａｇａａａｔ　２１６０　　ｇｔｃｔｃａｃａｇｃ　ｃｃａｇｃｔｇｇｇｔ　ｔｇｃａａｔｔｃｃａ　ｇａａｔｇｃｔｇｇｇ　ａｇｔｔｔｔａｃａｇ　ｔｇｃｃａｔｔｃｃａ　２２２０　　ａｇｔｃｃｃａｇａｔ　ｇｔｃｃｃｔｃｔｔｃ　ｃｃｃｃａａａｃｔｔ　ｇａｃｃｔｔｇａｃｃ　ａｔｇｔｃａｃｔｔｔ　ａｃｇｔｔｔｇａａｔ　２２８０　　ｔｔｃｔｇａｇｃｔａ　ａａｇａｇｔｃａｇａ　ｇａｇａｔｔａｇｔｃ　ａｃａｔａｇｔｔｇｃ　ｃｔａａａｔａｇｇａ　ｇａｇａｇａａａｇａ　２３４０　　ｔｔａｔａｔａｔｇｃ　ａｃａｔａｔａｃａａ　ａｇａｃａｇｔｇｔｃ　ｔａｔｔｔａｔｇａｔ　ｔｇａｔｔｔａｔｔｔ　ａｔｔｔａｔａａａｔ　２４００　　ｔｔａｃｔｔａｔｇｇ　ｇｔｇｇｔａａｇｇｇ　ｇｃａａａａａａｇａ　ｇｇｃｃｃａｃａｃｃ　ｔｔｇａｔａｔｃｃａ　ｇｇｃｃａｔａｃｃａ　２４６０　　ｇｇｇｔａｔｃｃｃｔ　ｔｇｔｃｃｃｔｔｃａ　ｃｃｃｃｃａｔｔｔｃ　ｔｒａｃｃｔｃａｇｔ　ｔｃｃｔｇｇａｇｇｇ　ｇｇｇａａａｇｇｇｔ　２５２０　　ｇａａａｇａｇａａａ　ｃｃａｃｇｔａｔｔｔ　ｔｇｔｔａｔｔａｔｔ　ｔｔｇｇａｔｔａｔｔ　ｔｔｔｔａｔｃｇａａ　ｇａｇａｔｃａｔａｇ　２５８０　　ａａａｃｃａｇａｇｃ　ｃｔｔｃｔｃｃｃｃａ　ｇｇｃｃｔｇｃｃｃｔ　ｃｃｔｃｇｇｇｔｔｔ　ｇｇａａｇｇｇｇａａ　ｃａｃａｃｃａｇｃｃ　２６４０　　ｔｃｔｇｇｔｔｔｔｔ　ｔａｔｔｔｔｔｔｔａ　ａｇａａｇｃｃａｔｃ　ａｃｃｔｇａｇｃａａ　ｃｃａａａａａｔｔｃ　ｃｔｃｔｇｃｇｃｔｇ　２７００　　ｇｇｇｔｃｃｇａｃｔ　ｇｃｃｃｔｃｔｇｇｔ　ｇｇｃｃａｔｔｔｇｇ　ｇｇａａａａｃｔｇｃ　ａｇｃｃｃｇｇｃｃａ　ｇｇｃａｇｃｔｇｇｇ　２７６０　　ａｃｃａｇａａｔｇｃ　ａａｃｃｃｃａｇｃｔ　ｃｃａｃｔｃｃａｇｃ　ｃｔｇｇｃｇｔｃｃａ　ｇｇｇｃｃａｃａｇｃ　ｃａｔｇｇｃｃｔｇｇ　２８２０　　ｇｇｇｃｃａａｇｃｃ　ｔｃａｃｃｃｔｇｃｇ　ｇｔｇｃｃｃｔａａａ　ｇｇａｇｇｇｇｇｇｇ　ｃａｃｇａｇｃｃａａ　ｃａｃｃｃｃａｃｃｃ　２８８０　　ｃｔｃｔｇｃｃａａｃ　ｃｇｇｇｇｔａｔｇｇ　ｃｃｃｃｃａｇｔｇｃ　ａｔｔｃｃｃｔｇｔｔ　ｃｃｃｇｔｃｔｃｃａ　ａｃｃｃａａｃｔｃａ　２９４０　　ａｔａａａａａａｔｇ　ａｔｔｔｔｇｔｃａｔ　ａａａｔａｔｇｔｔｔ　ｃｃｃｔａｔｇｔｇｔ　ｇｔｇｔｇｇａｇｇｇ　ｔａｔｇｇａｇｔｇｇ　３０００　　ｇｇｃｃｔｇａｔｇｇ　ｇｇｇａｔｇｇｃｃｔ　ｇｇａａｔｇａｇａｇ　ｇｇｔｃａａｇｃｃａ　ｇｇｃｃｔｇｇｒｇｇ　ｇｃｃｔｇｔｔｇｇｇ　３０６０　　ｇｇａｔｃｔｇｇｇｇ　ａｇｃｔｇｇａｃａｇ　ａｇｇｇｔｇｇａｇｇ　ｇｔｇｇｃｔｇｇｃａ　ｇｇｔｇａｃｔｃｃｔ　ｔｃｔｃａｇａｔｇｔ　３１２０　　ｃａｇｔｇｃｃｃｃｔ　ｃｔｇｃｔｃａｇａｃ　ｃｔｇｇｇｃａｃｔｇ　ａｃｔｇｇｃａａｇｇ　ａｃｃｔｔａｃｃｔｃ　ｃｔｃｃｔｇｇｔｇａ　３１８０　　ｃａｇｇａａｃｃｔｇ　ｇｇｔｇｃｔｔｇｇｃ　ｔｃｔｔｃｃｔｇｇｇ　ｔｃａａｇｇａｔｇｃ　ｔｃａｃａｔｃｃｔｇ　ｃｃｃａｃａｃｃｇｇ　３２４０　　ｃｃａｃｔｇｔｇｇｇ　ｇｃｔｔａｇａｃａｔ　ｇａｔｇａａｔａｔｇ　ｃｔｃａａａｇｃａｔ　ｇｔｃａｇｔｔｔｃｃ　ｔｔａａｔａａｔａａ　３３００　　ｔａｇｇｔｃｃｔａｃ　ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｔｔｔｇａｇａｃａｇ　ａｇｔｃｔｃｇｃｔｃ　ｔｇｔｃｃｃｃｃａｇ　３３６０　　ｇｃｔｇｇａｇｔｇｃ　ａｇｔｇｇｃｇｔｇａ　ｔｃｔｃｇｇｃｔｃａ　ｃｔｇｃａａｇｃｔｃ　ｃａｃｃｔｃｃｃｇｇ　ｇｔｔｃａｃｇｃｃａ　３４２０　　ｔｔｃｔｃｃｔｇｃｃ　ｔｃａｇｃｃｔｃｃｃ　ｇａｇｔａｇｃｔｇｇ　ｇａｃｙａｃａｇｇｃ　ｇｃｃｃａｃｃａｔｃ　ａｃｇｃｃｃｇｇｃｔ　３４８０　　ａａｔｔｔｔｔｔｔｔ　ｇｔａｙｔｔｔｔａｇ　ｔａｇａｇａｃｇｇｇ　ｇｔｔｔｃａｃｔｇｔ　ｇｔａａｇｃｃａｇｇ　ａｔｇｇｔｃｔｃｇａ　３５４０　　ｔｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５４２　　＜２１０＞　９
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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ａｔｇｇａｃｃｃａｇ　ａａｇａａａｃｔｔｃ　ａｇｔｔｔａｔｔｔｇ　ｇａｔｔａｔｔａｃｔ　ａｔｇｃｔａｃｇａｇ　ｃｃｃａａａｃｔｃｔ　６０　　　　ｇａｃａｔｃａｇｇｇ　ａｇａｃｃｃａｃｔｃ　ｃｃａｔｇｔｔｃｃｔ　ｔａｃａｃｃｔｃｔｇ　ｔｃｔｔｃｃｔｔｃｃ　ａｇｔｃｔｔｔｔａｃ　１２０　　　ａｃａｇｃｔｇｔｇｔ　ｔｃｃｔｇａｃｔｇｇ　ａｇｔｇｃｔｇｇｇｇ　ａａｃｃｔｔｇｔｔｃ　ｔｃａｔｇｇｇａｇｃ　ｇｔｔｇｃａｔｔｔｃ　１８０　　　ａａａｃｃｃｇｇｃａ　ｇｃｃｇａａｇａｃｔ　ｇａｔｃｇａｃａｔｃ　ｔｔｔａｔｃａｔｃａ　ａｔｃｔｇｇｃｔｇｃ　ｃｔｃｔｇａｃｔｔｃ　２４０　　　ａｔｔｔｔｔｃｔｔｇ　ｔｃａｃａｔｔｇｃｃ　ｔｃｔｃｔｇｇｇｔｇ　ｇａｔａａａｇａａｇ　ｃａｔｃｔｃｔａｇｇ　ａｃｔｇｔｇｇａｇｇ　３００　　　ａｃｇｇｇｃｔｃｃｔ　ｔｃｃｔｇｔｇｃａａ　ａｇｇｇａｇｃｔｃｃ　ｔａｃａｔｇａｔｃｔ　ｃｃｇｔｃａａｔａｔ　ｇｃａｃｔｇｃａｇｔ　３６０　　　ｇｔｃｃｔｃｃｔｇｃ　ｔｃａｃｔｔｇｃａｔ　ｇａｇｔｇｔｔｇａｃ　ｃｇｃｔａｃｃｔｇｇ　ｃｃａｔｔｇｔｇｔｇ　ｇｃｃａｇｔｃｇｔａ　４２０　　　ｔｃｃａｇｇａａａｔ　ｔｃａｇａａｇｇａｃ　ａｇａｃｔｇｔｇｃａ　ｔａｔｇｔａｇｔｃｔ　ｇｔｇｃｃａｇｃａｔ　ｃｔｇｇｔｔｔａｔｃ　４８０　　　ｔｃｃｔｇｃｃｔｇｃ　ｔｇｇｇｇｔｔｇｃｃ　ｔａｃｔｃｔｔｃｔｇ　ｔｃｃａｇｇｇａｇｃ　ｔｃａｃｇｃｔｇａｔ　ｔｇａｔｇａｔａａｇ　５４０　　　ｃｃａｔａｃｔｇｔｇ　ｃａｇａｇａａａａａ　ｇｇｃａａｃｔｃｃａ　ａｔｔａａａｃｔｃａ　ｔａｔｇｇｔｃｃｃｔ　ｇｇｔｇｇｃｃｔｔａ　６００　　　ａｔｔｔｔｃａｃｃｔ　ｔｔｔｔｔｇｔｃｃｃ　ｔｔｔｇｔｔｇａｇｃ　ａｔｔｇｔｇａｃｃｔ　ｇｃｔａｃｔｇｔｔｇ　ｃａｔｔｇｃａａｇｇ　６６０　　　ａａｇｃｔｇｔｇｔｇ　ｃｃｃａｔｔａｃｃａ　ｇｃａａｔｃａｇｇａ　ａａｇｃａｃａａｃａ　ａａａａｇｃｔｇａａ　ｇａａａｔｃｔａｔａ　７２０　　　ａａｇａｔｃａｔｃｔ　ｔｔａｔｔｇｔｃｇｔ　ｇｇｃａｇｃｃｔｔｔ　ｃｔｔｇｔｃｔｃｃｔ　ｇｇｃｔｇｃｃｃｔｔ　ｃａａｔａｃｔｔｔｃ　７８０　　　ａａｇｔｔｃｃｔｇｇ　ｃｃａｔｔｇｔｃｔｃ　ｔｇｇｇｔｔｇｃｇｇ　ｃａａｇａａｃａｃｔ　ａｔｔｔａｃｃｃｔｃ　ａｇｃｔａｔｔｃｔｔ　８４０　　　ｃａｇｃｔｔｇｇｔａ　ｔｇｇａｇｇｔｇａｇ　ｔｇｇａｃｃｃｔｔｇ　ｇｃａｔｔｔｇｃｃａ　ａｃａｇｃｔｇｔｇｔ　ｃａａｃｃｃｔｔｔｃ　９００　　　ａｔｔｔａｃｔａｔａ　ｔｃｔｔｃｇａｃａｇ　ｃｔａｃａｔｃｃｇｃ　ｃｇｇｇｃｃａｔｔｇ　ｔｃｃａｃｔｇｃｔｔ　ｇｔｇｃｃｃｔｔｇｃ　９６０　　　ｃｔｇａａａａａｃｔ　ａｔｇａｃｔｔｔｇｇ　ｇａｇｔａｇｃａｃｔ　ｇａｇａｃａｔｃａｇ　ａｔａｇｔｃａｃｃｔ　ｃａｃｔａａｇｇｃｔ　１０２０　　ｃｔｃｔｃｃａｃｃｔ　ｔｃａｔｔｃａｔｇｃ　ａｇａａｇａｔｔｔｔ　ｇｃｃａｇｇａｇｇａ　ｇｇａａｇａｇｇｔｃ　ｔｇｔｇｔｃａｃｔｃ　１０８０　　ｔａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０８３　　＜２１０＞　１０
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１２＞　ＤＮＡ
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＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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＜２１１＞　２７５３
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１６
ｇｔｃｇｇｇｇｇｃａ　ｇｃａｇｃａａｇａｔ　ｇｃｇａａｇｃｇａｇ　ｃｃｇｔａｃａｇａｔ　ｃｃｃｇｇｇｃｔｃｔ　ｃｃｇａａｃｇｃａａ　６０　　　　ｃｔｔｃｇｃｃｃｔｇ　ｃｔｔｇａｇｃｇａｇ　ｇｃｔｇｃｇｇｔｔｔ　ｃｃｇａｇｇｃｃｃｔ　ｃｔｃｃａｇｃｃａａ　ｇｇａａａａｇｃｔａ　１２０　　　ｃａｃａａａａａｇｃ　ｃｔｇｇａｔｃａｃｔ　ｃａｔｃｇａａｃｃａ　ｃｃｃｃｔｇａａｇｃ　ｃａｇｔｇａａｇｇｃ　ｔｃｔｃｔｃｇｃｃｔ　１８０　　　ｃｇｃｃｃｔｃｔａｇ　ｃｇｔｔｃｇｔｃｔｇ　ｇａｇｔａｇｃｇｃｃ　ａｃｃｃｃｇｇｃｔｔ　ｃｃｔｇｇｇｇａｃａ　ｃａｇｇｇｔｔｇｇｃ　２４０　　　ａｃｃａｔｇｇｇｇｃ　ｃｃａｃｃａｇｃｇｔ　ｃｃｃｇｃｔｇｇｔｃ　ａａｇｇｃｃｃａｃｃ　ｇｃａｇｃｔｃｇｇｔ　ｃｔｃｔｇａｃｔａｃ　３００　　　ｇｔｃａａｃｔａｔｇ　ａｔａｔｃａｔｃｇｔ　ｃｃｇｇｃａｔｔａｃ　ａａｃｔａｃａｃｇｇ　ｇａａａｇｃｔｇａａ　ｔａｔｃａｇｃｇｃｇ　３６０　　　ｇａｃａａｇｇａｇａ　ａｃａｇｃａｔｔａａ　ａｃｔｇａｃｃｔｃｇ　ｇｔｇｇｔｇｔｔｃａ　ｔｔｃｔｃａｔｃｔｇ　ｃｔｇｃｔｔｔａｔｃ　４２０　　　ａｔｃｃｔｇｇａｇａ　ａｃａｔｃｔｔｔｇｔ　ｃｔｔｇｃｔｇａｃｃ　ａｔｔｔｇｇａａａａ　ｃｃａａｇａａａｔｔ　ｃｃａｃｃｇａｃｃｃ　４８０　　　ａｔｇｔａｃｔａｔｔ　ｔｔａｔｔｇｇｃａａ　ｔｃｔｇｇｃｃｃｔｃ　ｔｃａｇａｃｃｔｇｔ　ｔｇｇｃａｇｇａｇｔ　ａｇｃｃｔａｃａｃａ　５４０　　　ｇｃｔａａｃｃｔｇｃ　ｔｃｔｔｇｔｃｔｇｇ　ｇｇｃｃａｃｃａｃｃ　ｔａｃａａｇｃｔｃａ　ｃｔｃｃｃｇｃｃｃａ　ｇｔｇｇｔｔｔｃｔｇ　６００　　　ｃｇｇｇａａｇｇｇａ　ｇｔａｔｇｔｔｔｇｔ　ｇｇｃｃｃｔｇｔｃａ　ｇｃｃｔｃｃｇｔｇｔ　ｔｃａｇｔｃｔｃｃｔ　ｃｇｃｃａｔｃｇｃｃ　６６０　　　ａｔｔｇａｇｃｇｃｔ　ａｔａｔｃａｃａａｔ　ｇｃｔｇａａａａｔｇ　ａａａｃｔｃｃａｃａ　ａｃｇｇｇａｇｃａａ　ｔａａｃｔｔｃｃｇｃ　７２０　　　ｃｔｃｔｔｃｃｔｇｃ　ｔａａｔｃａｇｃｇｃ　ｃｔｇｃｔｇｇｇｔｃ　ａｔｃｔｃｃｃｔｃａ　ｔｃｃｔｇｇｇｔｇｇ　ｃｃｔｇｃｃｔａｔｃ　７８０　　　ａｔｇｇｇｃｔｇｇａ　ａｃｔｇｃａｔｃａｇ　ｔｇｃｇｃｔｇｔｃｃ　ａｇｃｔｇｃｔｃｃａ　ｃｃｇｔｇｃｔｇｃｃ　ｇｃｔｃｔａｃｃａｃ　８４０　　　ａａｇｃａｃｔａｔａ　ｔｃｃｔｃｔｔｃｔｇ　ｃａｃｃａｃｇｇｔｃ　ｔｔｃａｃｔｃｔｇｃ　ｔｔｃｔｇｃｔｃｔｃ　ｃａｔｃｇｔｃａｔｔ　９００　　　ｃｔｇｔａｃｔｇｃａ　ｇａａｔｃｔａｃｔｃ　ｃｔｔｇｇｔｃａｇｇ　ａｃｔｃｇｇａｇｃｃ　ｇｃｃｇｃｃｔｇａｃ　ｇｔｔｃｃｇｃａａｇ　９６０　　　ａａｃａｔｔｔｃｃａ　ａｇｇｃｃａｇｃｃｇ　ｃａｇｃｔｃｔｇａｇ　ａａｇｔｃｇｃｔｇｇ　ｃｇｃｔｇｃｔｃａａ　ｇａｃｃｇｔａａｔｔ　１０２０　　ａｔｃｇｔｃｃｔｇａ　ｇｃｇｔｃｔｔｃａｔ　ｃｇｃｃｔｇｃｔｇｇ　ｇｃａｃｃｇｃｔｃｔ　ｔｃａｔｃｃｔｇｃｔ　ｃｃｔｇｃｔｇｇａｔ　１０８０　　ｇｔｇｇｇｃｔｇｃａ　ａｇｇｔｇａａｇａｃ　ｃｔｇｔｇａｃａｔｃ　ｃｔｃｔｔｃａｇａｇ　ｃｇｇａｇｔａｃｔｔ　ｃｃｔｇｇｔｇｔｔａ　１１４０　　ｇｃｔｇｔｇｃｔｃａ　ａｃｔｃｃｇｇｃａｃ　ｃａａｃｃｃｃａｔｃ　ａｔｔｔａｃａｃｔｃ　ｔｇａｃｃａａｃａａ　ｇｇａｇａｔｇｃｇｔ　１２００　　ｃｇｇｇｃｃｔｔｃａ　ｔｃｃｇｇａｔｃａｔ　ｇｔｃｃｔｇｃｔｇｃ　ａａｇｔｇｃｃｃｇａ　ｇｃｇｇａｇａｃｔｃ　ｔｇｃｔｇｇｃａａａ　１２６０　　ｔｔｃａａｇｃｇａｃ　ｃｃａｔｃａｔｃｇｃ　ｃｇｇｃａｔｇｇａａ　ｔｔｃａｇｃｃｇｃａ　ｇｃａａａｔｃｇｇａ　ｃａａｔｔｃｃｔｃｃ　１３２０　　ｃａｃｃｃｃｃａｇａ　ａａｇａｃｇａａｇｇ　ｇｇａｃａａｃｃｃａ　ｇａｇａｃｃａｔｔａ　ｔｇｔｃｔｔｃｔｇｇ　ａａａｃｇｔｃａａｃ　１３８０　　ｔｃｔｔｃｔｔｃｃｔ　ａｇａａｃｔｇｇａａ　ｇｃｔｇｔｃｃａｃｃ　ｃａｃｃｇｇａａｇｃ　ｇｃｔｃｔｔｔａｃｔ　ｔｇｇｔｃｇｃｔｇｇ　１４４０　　ｃｃａｃｃｃｃａｇｔ　ｇｔｔｔｇｇａａａａ　ａａａｔｃｔｃｔｇｇ　ｇｃｔｔｃｇａｃｔｇ　ｃｔｇｃｃａｇｇｇａ　ｇｇａｇｃｔｇｃｔｇ　１５００　　ｃａａｇｃｃａｇａｇ　ｇｇａｇｇａａｇｇｇ　ｇｇａｇａａｔａｃｇ　ａａｃａｇｃｃｔｇｇ　ｔｇｇｔｇｔｃｇｇｇ　ｔｇｔｔｇｇｔｇｇｇ　１５６０　　ｔａｇａｇｔｔａｇｔ　ｔｃｃｔｇｔｇａａｃ　ａａｔｇｃａｃｔｇｇ　ｇａａｇｇｇｔｇｇａ　ｇａｔｃａｇｇｔｃｃ　ｃｇｇｃｃｔｇｇａａ　１６２０　　ｔａｔａｔａｔｔｃｔ　ａｃｃｃｃｃｃｔｇｇ　ａｇｃｔｔｔｇａｔｔ　ｔｔｇｃａｃｔｇａｇ　ｃｃａａａｇｇｔｃｔ　ａｇｃａｔｔｇｔｃａ　１６８０　　ａｇｃｔｃｃｔａａａ　ｇｇｇｔｔｃａｔｔｔ　ｇｇｃｃｃｃｔｃｃｔ　ｃａａａｇａｃｔａａ　ｔｇｔｃｃｃｃａｔｇ　ｔｇａａａｇｃｇｔｃ　１７４０　　ｔｃｔｔｔｇｔｃｔｇ　ｇａｇｃｔｔｔｇａｇ　ｇａｇａｔｇｔｔｔｔ　ｃｃｔｔｃａｃｔｔｔ　ａｇｔｔｔｃａａａｃ　ｃｃａａｇｔｇａｇｔ　１８００　　ｇｔｇｔｇｃａｃｔｔ　ｃｔｇｃｔｔｃｔｔｔ　ａｇｇｇａｔｇｃｃｃ　ｔｇｔａｃａｔｃｃｃ　ａｃａｃｃｃｃａｃｃ　ｃｔｃｃｃｔｔｃｃｃ　１８６０　　ｔｔｃａｔａｃｃｃｃ　ｔｃｃｔｃａａｃｇｔ　ｔｃｔｔｔｔａｃｔｔ　ｔａｔａｃｔｔｔａａ　ｃｔａｃｃｔｇａｇａ　ｇｔｔａｔｃａｇａｇ　１９２０　　ｃｔｇｇｇｇｔｔｇｔ　ｇｇａａｔｇａｔｃｇ　ａｔｃａｔｃｔａｔａ　ｇｃａａａｔａｇｇｃ　ｔａｔｇｔｔｇａｇｔ　ａｃｇｔａｇｇｃｔｇ　１９８０　　ｔｇｇｇａａｇａｔｇ　ａａｇａｔｇｇｔｔｔ　ｇｇａｇｇｔｇｔａａ　ａａｃａａｔｇｔｃｃ　ｔｔｃｇｃｔｇａｇｇ　ｃｃａａａｇｔｔｔｃ　２０４０　　ｃａｔｇｔａａｇｃｇ　ｇｇａｔｃｃｇｔｔｔ　ｔｔｔｇｇａａｔｔｔ　ｇｇｔｔｇａａｇｔｃ　ａｃｔｔｔｇａｔｔｔ　ｃｔｔｔａａａａａａ　２１００　　ｃａｔｃｔｔｔｔｃａ　ａｔｇａａａｔｇｔｇ　ｔｔａｃｃａｔｔｔｃ　ａｔａｔｃｃａｔｔｇ　ａａｇｃｃｇａａａｔ　ｃｔｇｃａｔａａｇｇ　２１６０　　ａａｇｃｃｃａｃｔｔ　ｔａｔｃｔａａａｔｇ　ａｔａｔｔａｇｃｃａ　ｇｇａｔｃｃｔｔｇｇ　ｔｇｔｃｃｔａｇｇａ　ｇａａａｃａｇａｃａ　２２２０　　ａｇｃａａａａｃａａ　ａｇｔｇａａａａｃｃ　ｇａａｔｇｇａｔｔａ　ａｃｔｔｔｔｇｃａａ　ａｃｃａａｇｇｇａｇ　ａｔｔｔｃｔｔａｇｃ　２２８０　　ａａａｔｇａｇｔｃｔ　ａａｃａａａｔａｔｇ　ａｃａｔｃｃｇｔｃｔ　ｔｔｃｃｃａｃｔｔｔ　ｔｇｔｔｇａｔｇｔｔ　ｔａｔｔｔｃａｇａａ　２３４０　　ｔｃｔｔｇｔｇｔｇａ　ｔｔｃａｔｔｔｃａａ　ｇｃａａｃａａｃａｔ　ｇｔｔｇｔａｔｔｔｔ　ｇｔｔｇｔｇｔｔａａ　ａａｇｔａｃｔｔｔｔ　２４００　　ｃｔｔｇａｔｔｔｔｔ　ｇａａｔｇｔａｔｔｔ　ｇｔｔｔｃａｇｇａａ　ｇａａｇｔｃａｔｔｔ　ｔａｔｇｇａｔｔｔｔ　ｔｃｔａａｃｃｃｇｔ　２４６０　　ｇｔｔａａｃｔｔｔｔ　ｃｔａｇａａｔｃｃａ　ｃｃｃｔｃｔｔｇｔｇ　ｃｃｃｔｔａａｇｃａ　ｔｔａｃｔｔｔａａｃ　ｔｇｇｔａｇｇｇａａ　２５２０　　ｃｇｃｃａｇａａｃｔ　ｔｔｔａａｇｔｃｃａ　ｇｃｔａｔｔｃａｔｔ　ａｇａｔａｇｔａａｔ　ｔｇａａｇａｔａｔｇ　ｔａｔａａａｔａｔｔ　２５８０　　ａｃａａａｇａａｔａ　ａａａａｔａｔａｔｔ　ａｃｔｇｔｃｔｃｔｔ　ｔａｇｔａｔｇｇｔｔ　ｔｔｃａｇｔｇｃａａ　ｔｔａａａｃｃｇａｇ　２６４０　　ａｇａｔｇｔｃｔｔｇ　ｔｔｔｔｔｔｔａａａ　ａａｇａａｔａｇｔａ　ｔｔｔａａｔａｇｇｔ　ｔｔｃｔｇａｃｔｔｔ　ｔｇｔｇｇａｔｃａｔ　２７００　　ｔｔｔｇｃａｃａｔａ　ｇｃｔｔｔａｔｃａａ　ｃｔｔｔｔａａａｃａ　ｔｔａａｔａａａｃｔ　ｇａｔｔｔｔｔｔｔａ　ａａｇ　　　　　　　　２７５３　　＜２１０＞　１７
＜２１１＞　２６８
＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞　１７
Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ
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＜２１２＞　ＰＲＴ
＜２１３＞　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ
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Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｒｐ
３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ
１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　３２５　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０
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Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ
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Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ
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Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　３２５　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
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＜４００＞　２８
Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０
Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　　２４０Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　３２５　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３３５　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ
３４０　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　３５５　　　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５　＜２１０＞　２９
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Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０
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Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ
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３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　１４５　　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ
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Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　３５５　　　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　３７０　　　　　　　　　　　　　　　　　３７５　　　　　　　　　　　　　　　　　３８０
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、各マーカー遺伝子およびマーカー蛋白質のＧｅｎＢａｎｋ　登録情報の新旧対応を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for predicting the condition of heart failure. More specifically, the present invention relates to a method for predicting the pathology of heart failure based on the expression profile of a specific gene or a transcription product thereof.
[0002]
[Prior art]
Heart failure is caused by various causes such as cardiomyopathy (eg, dilated cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, etc.), ischemic heart disease (eg, myocardial infarction, angina pectoris, etc.), hypertension (hypertensive cardiac hypertrophy, etc.). This is the final condition in which cardiac function has declined. Morphologically, remodeling of the heart occurs such as expansion of ventricular volume and reduction of ventricular wall thickness. At the same time, it is known that the expression of several marker proteins or their genes (such as atrial diuretic peptide / ANP and cerebral diuretic peptide / BNP) is enhanced in the blood and in myocardial tissues showing organic changes.
[0003]
These marker proteins and their gene expression levels can be indicators of whether or not the patient has heart failure or its severity. However, the conventional enhancement of the expression of marker proteins and their genes is a result of progression of the pathology of heart failure, and does not reflect the process by which cardiac function declines due to various causes. In other words, in order to understand the condition of each case of heart failure and predict the prognosis, it is necessary to separately examine changes caused by various causes.
[0004]
Recent therapies for heart failure primarily target the use of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors and diuretics. However, ACE inhibitors prolong survival in heart failure, which delays progress toward the final stage, heart failure, and many patients receiving ACE inhibitors are functionally grade III Have heart failure. Moreover, ACE inhibitors fail to relieve symptoms in more than 60% of heart failure patients and can only reduce heart failure deaths by about 15-20%. On the other hand, long-term administration of a positive inotropic agent other than digoxin is accompanied by serious life-threatening side effects such as arrhythmia and sudden death. On the other hand, treatment with heart transplants is limited by the availability of donor hearts. These deficiencies in conventional therapies suggest the need for alternative effective therapeutic approaches.
[0005]
G-protein coupled receptor: GPCR (G protein coupled receptor) is a receptor protein having seven transmembrane sites and has been reported to be involved in various physiological functions (for example, Non-Patent Document 1). reference). Although GPCRs are known for hundreds of family proteins, drugs for treating various diseases exert their effects by affecting the activity of the GPCR. For example, leuprolide, gonadrelin and nafarelin, agonist agonists of gonadotropin-releasing hormone that have been used to treat prostate and breast cancer, uterine leiomyoma, endometriosis, sexually precocious and non-neoplastic ovarian androgen excess syndrome See, for example, Non-Patent Document 2), propranolol, a cardiac β-adrenergic receptor antagonist that has been used to treat hypertension, angina and psychosis (see, for example, Non-Patent Documents 3 and 4), bronchi Metaproterenol, a pulmonary β2-adrenergic receptor agonist that has been used as a dilator, see, for example, Non-Patent Document 5, and histamine 2 that has been used to treat ulcers and idiopathic urticaria Shime is a receptor antagonist It is said that thidine (see, for example, Non-Patent Documents 6 and 7) acts on a GPCR. Therefore, although GPCRs are considered important as drug discovery targets, there is no report that the expression profile of GPCR genes in heart failure was exhaustively analyzed.
[0006]
[Non-patent document 1]
"The EMBO Journal"1999; 18 (7): p1723-1729
[Non-patent document 2]
"American Family Physician"1992; 44: p1777-1782.
[Non-Patent Document 3]
"Clinical Pharmacokinetics"1987; 13: p51-64,
[Non-patent document 4]
"Neuropsycho-biology"1986; 15: p20-27.
[Non-Patent Document 5]
"Annals of Allergy"1973; 31: p460-466.
[Non-Patent Document 6]
"New England Journal of Medicine", 1984; 311: p689-693.
[Non-Patent Document 7]
"DICP"(1991); 25: p609-612.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a new index for predicting the pathology and progression of heart failure, and to utilize the index to improve the diagnosis, treatment or prevention of heart failure.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, genes whose expression levels are significantly fluctuated between human heart failure patient's myocardial tissue and human normal myocardial tissue reflect individual pathologies of heart failure. I thought I could. Then, they have found that a new method for predicting the pathological condition of heart failure, and diagnosing or treating the disease can be provided by using the gene and its transcript, and completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention provides the following (1) to (8).
(1) a marker gene for predicting the condition of heart failure specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOS: 1 to 16, or a heart failure identified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 17 to 31 A method for predicting the pathology of heart failure of the sample provider based on the expression level of the pathological prediction marker protein.
(2) A kit for predicting the condition of heart failure.
(3) A composition for treating heart failure, comprising the gene specified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the protein identified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. (4) an antisense nucleic acid of a gene specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 and SEQ ID NOs: 6 to 16, or any one selected from SEQ ID NOs: 17 to 19 and SEQ ID NOs: 21 to 31 A composition for treating heart failure, comprising an antibody protein that specifically recognizes and neutralizes a protein specified by the amino acid sequence of (1).
(5) A marker gene for predicting the condition of heart failure specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOS: 1 to 16, or a heart failure identified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 17 to 31 The effect of the test substance as a therapeutic or prophylactic agent for heart failure is compared by comparing the phenotypic changes that appear when the expression of the disease state predicting marker protein is enhanced or suppressed with and without the test substance. How to test.
(6) a heart failure disease state predictive marker gene specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 16, or a heart failure specificity identified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 17 to 31 A method for testing the effect of a test substance as a therapeutic or preventive agent for heart failure by comparing the expression level of a disease state predictive marker protein in the presence and absence of the test substance.
(7) A composition comprising a marker gene for predicting a disease state of heart failure specified by any one base sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 16.
(8) A composition comprising a marker protein for predicting a disease state of heart failure specified by any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 17 to 31.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Marker genes for predicting the pathology of heart failure
The “marker gene for predicting the condition of heart failure” according to the present invention means a gene used as an index for predicting the condition of human heart failure. The gene is specifically a gene specified by any one base sequence selected from the base sequences of SEQ ID NOS: 1 to 16. The present invention provides a marker gene for predicting the condition of heart failure, and use of the marker gene for predicting, treating, or preventing the condition of heart failure. In this specification, the term "gene" includes not only DNA but also its mRNA and cDNA. In addition, it includes ESTs as well as full-length genes.
[0011]
1.1 Method for specifying marker gene
The marker gene for predicting the pathology of heart failure of the present invention comprises the following steps 1) and 2): 1) a step of preparing total RNA derived from a human heart failure patient's myocardial tissue and a normal human myocardial tissue;
2) a step of preparing cRNA or cDNA from each of the above-mentioned total RNAs, and using this to identify genes whose expression levels are significantly different between human heart failure patient's myocardial tissue and normal human myocardial tissue;
Can be specified by performing the following operations sequentially.
Hereinafter, each step will be described in detail.
[0012]
Step 1: Preparation of total RNA
The “heart muscle tissue of a human heart failure patient” used in this step includes, for example, a myocardial tissue from a heart failure patient who has had a left ventricular myocardial tissue removed by a myocardial biopsy, a batista operation, a Dole operation, or insertion of a left ventricular assist device. Can be used. The myocardial tissue shall be provided under a contract based on appropriate informed consent.
[0013]
It is preferable that the extirpated tissue be directly dissolved in a solvent for RNA extraction immediately after the extirpation for the extraction of total RNA. As the extraction solvent, for example, a solvent containing a component having an action of inactivating ribonuclease such as phenol is preferable. The method for extracting total RNA from myocardial tissue is not particularly limited. For example, guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloric acid method, guanidine acid thiocyanate / phenol / chloroform method ( Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159) and the like. Among them, the guanidine acid thiocyanate-phenol-chloroform method is preferred.
[0014]
It is preferable that the extracted total RNA is further purified and used only for mRNA if necessary. Although the purification method is not particularly limited, most of mRNAs present in the cytoplasm of eukaryotic cells have a poly (A) sequence at the 3 ′ end, and thus, using this feature, for example, the following is carried out. be able to. First, a biotinylated oligo (dT) probe is added to the extracted total RNA to prepare poly (A) ⁺ Adsorb RNA. Next, a paramagnetic particle carrier on which streptavidin is immobilized is added, and the poly (A) is bound using biotin / streptavidin binding. ⁺ Allow RNA to be captured. After the washing operation, finally, the oligo (dT) probe is ⁺ Elute the RNA. In addition, using an oligo (dT) cellulose column, poly (A) ⁺ A method in which RNA is adsorbed and eluted and purified may be employed. Eluted poly (A) ⁺ RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
[0015]
Total RNA derived from human normal myocardial tissue used as a control can be extracted and purified in the same manner as described above, and commercially available total RNA derived from human normal myocardial tissue can be suitably used. The commercial product can be purchased from a plurality of manufacturers such as Biochain, Clontech, Invitrogen and Ambion.
[0016]
Step 2: Analysis of gene expression level
The expression level of the gene can be detected as its signal intensity by preparing cRNA or cDNA from the total RNA obtained in step 1 and labeling it with an appropriate label.
[0017]
Hereinafter, as a method for analyzing the gene expression amount, an analysis method using a solid-phased sample and some other analysis methods will be described.
[0018]
(1) Analysis method using immobilized sample
The gene expression level can be measured by hybridizing the above-mentioned labeled probes separately or under the same conditions and simultaneously hybridizing them to a solid-phased sample on which a known human gene is immobilized (Brown, PO et al.). (1999) Nature genet. 21, supplement, 33-37). As the labeled probe, not a specific mRNA clone but a label obtained by labeling all expressed mRNAs is used. As a starting material for preparing a probe, unpurified mRNA may be used, but poly (A) purified by the above-described method may be used. ⁺ More preferably, RNA is used. Hereinafter, an analysis method using various types of immobilized samples will be described.
[0019]
a) Gene chip:
The gene chip used in the present invention is preferably a solid-phased antisense oligonucleotide synthesized based on an EST (expressed sequence tag) sequence on a database or a total RNA sequence. As the gene chip, a commercially available gene chip (for example, manufactured by Affymetrix) may be used, or a known method (Lipshutz, RJ et al. (1999) Nature genet. 21, supplement, 20-24). It may be manufactured based on the above.
[0020]
Analysis using a gene chip can be performed according to a conventional method. For example, when a chip manufactured by Affymetrix is used, a biotin-labeled cRNA probe is prepared according to the protocol attached to the product. Next, hybridization may be performed according to the protocol, avidin labeled with fluorescence may be bound to biotin, and the luminescence may be detected and analyzed.
[0021]
b) Array or membrane filter:
The array or the membrane filter used in the present invention has immobilized cDNA or RT-PCR product prepared from total RNA obtained from human organ tissue or cells isolated or established from the organ tissue. Are preferred.
[0022]
As the cDNA or RT-PCR product to be immobilized, one cloned by performing a reverse transcriptase reaction or PCR with primers prepared based on sequence information of a human EST database or the like is used. This cDNA or RT-PCR product can be obtained by a subtraction method (Diatchenko, L. et al., Supra) in advance using total RNAs having different expression levels between total RNAs derived from human heart failure cardiac muscle tissue and human normal cardiac muscle tissue. 1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6025-6030), Differential Display Method (Kato, K. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3885-3690) and the like. May be done. Alternatively, a commercially available array or filter (for example, InteliGene: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., Atlas System: manufactured by Clontech, etc.) may be used, or the above cDNA or RT-PCR product may be obtained from a commercially available spotter ( For example, a solid phase may be prepared using GMS417 Arrayer (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
[0023]
In the analysis using an array, poly (A) ⁺ When preparing cDNA from RNA, a labeled probe is prepared by adding d-UTP or the like labeled with a fluorescent dye (eg, Cy3, Cy5, etc.). At this time, poly (A) derived from human heart failure patient myocardial tissue ⁺ RNA and poly (A) derived from human normal myocardial tissue ⁺ If the RNAs are labeled with different dyes, both can be mixed and used in the subsequent hybridization. The fluorescent signal is detected and analyzed using a fluorescent signal detector. For example, in the case of Takara Shuzo Co., Ltd.'s commercial array, hybridization and washing are performed according to the company's protocol, and a fluorescent signal is detected by a fluorescent signal detector (eg, GMS418 array scanner: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Later, analysis is performed.
[0024]
Analysis using a membrane filter revealed that poly (A) ⁺ When producing cDNA from RNA, radioisotopes (eg, ³² P, ³³ A labeled probe is prepared by adding d-CTP or the like labeled with P), and hybridization is performed by a conventional method. For example, after performing hybridization and washing using a commercially available filter microarray, Atlas System (Clontech), detection and analysis are performed using an analyzer (eg, Atlas Image: Clontech, etc.). I do.
[0025]
When using any of the immobilized samples, a probe derived from a human heart failure patient's myocardial tissue and a probe derived from a human normal myocardial tissue are hybridized to the same lot of immobilized samples. At this time, the hybridization conditions are the same except for the probe used. As described above, in the case of a fluorescently labeled probe, if each probe is labeled with a different fluorescent dye, a mixture of both probes can be hybridized to one solid-phased sample at a time and the fluorescence intensity can be read. (Brown, PO et al. (1999) Nature genet. 21, supplement, 33-37).
[0026]
(2) Other analysis methods
As an analysis method other than the above, for example, a subtraction method (Sive, HL and John, T. St. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10937, Wang, Z., and Brown, D.D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 11505-11509), Differential Display Method (Liang, P., and Pardee, AB (1992) Science 257, 967-971, Liang). , P., Averbuch, L., Keyomarsi, K., Sager, R., and Pardee, AB (1992) Cancer Research 52, 6966-6968, Differe. Char hybridization method (John, T. St., and Davis, RW Cell (1979) 16, 443-452), and cross hybridization method using an appropriate probe ("Molecular Cloning, A Laboratory"). Manual "Maniatis, T., Fritsch, EF, Sambrook, J. (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press), RT-PCR, and real-time PCR. Hereinafter, each analysis method will be specifically described.
[0027]
a) Subtraction cloning method:
In this method, a cDNA of a gene specifically expressed in a specific cell is obtained, and the gene is cloned by screening a cDNA library using the cDNA as a probe. As a subtraction method, a single-stranded cDNA is prepared from the total RNA, and this is hybridized with the total RNA obtained from another cell, and then the single-stranded DNA not hybridized with the hydroxyapatite column is used. First, a method for preparing a cDNA library from the cDNA (Bio Manual Series 3, Gene Cloning Experiment Method, Yodosha (1993), Current Protocols in Molecular Biology), or a cDNA library first Then, a single-stranded DNA was prepared from this library using a helper phage or the like, and the single-stranded DNA was hybridized with biotin-labeled total RNA obtained from another cell. The single-stranded DNA that did not hybridize was isolated using A method of preparing a cDNA library by returning to a double-stranded form with a merase (Tanaka, H., Yoshimura, Y., Nishina, Y., Nozaki, M., Nojima, H., and Nishimune, Y. (1994) FEBS) Lett., 355, 4-10).
[0028]
Specifically, first, mRNA (or total RNA) is purified from each of a myocardial tissue of a human heart failure patient and a normal human myocardial tissue, and cDNA is synthesized with a reverse transcriptase using the total RNA purified from the normal human myocardial tissue as a template. . [Α- ³² The cDNA can also be labeled by adding [P] dNTP. Although the labeled cDNA and the total RNA serving as a template form a stable double-stranded DNA-RNA hybrid, only high-temperature treatment in the presence of an alkali degrades only the RNA to purify the single-stranded cDNA. When this single-stranded cDNA and RNA extracted from the myocardial tissue of a human heart failure patient are mixed and allowed to stand under appropriate conditions, a double-stranded DNA-RNA hybrid is formed that is more stable than the nucleotide sequence complementarity. That is, cDNA using total RNA expressed as a template in a human heart failure patient's myocardial tissue forms a hybrid, whereas cDNA using an RNA specifically expressed in a normal human myocardial tissue as a template remains single-stranded. It is. Next, the double-stranded DNA-RNA hybrid and the single-stranded cDNA are separated by a hydroxyapatite column, and only the single-stranded cDNA is purified. By repeating this step, cDNA specific to the target tissue can be concentrated. When the concentrated specific cDNA is labeled with a radioisotope or the like, it can be used as a probe for screening a cDNA library. This operation can also be performed using a commercially available kit (for example, PCR Select cDNA Subtraction Kit: manufactured by Clontech, etc.).
[0029]
b) Differential display method:
According to the method of Liang et al. (Science (1992) 257, 967-971), for example, it can be carried out as follows. First, mRNA (or total RNA) is extracted from each of human normal myocardial tissue and human heart failure patient's myocardial tissue, and is converted into single-stranded cDNA using reverse transcriptase. Next, PCR is performed using the obtained single-stranded cDNA as a template and appropriate primers. As the primer, for example, a random primer (about 10 to 12 mer primer having an arbitrary sequence) can be used. Alternatively, an anchored primer and an arbitrary primer may be used in combination. Oligo d (T) as uncard primer _n A primer consisting of VX [n = 11 to 12; V = guanine, adenine or cytosine; X = guanine, adenine, thymine or cytosine] can be used. As the arbitrary primer, a random primer of about 10 mer having an arbitrary sequence can be used. By performing such PCR by combining various primers, it becomes possible to screen a wider group of genes. Subsequently, the obtained PCR product is subjected to gel electrophoresis, and the expression pattern (fingerprint) of the total RNA developed (displayed) on the gel is comparatively analyzed. And a cDNA fragment thereof can be isolated. In addition, this method can also be performed using a commercially available kit (for example, RNA image kit: manufactured by Jenhunter).
[0030]
c) Differential hybridization method:
A cDNA library prepared from total RNA purified from the target tissue was synthesized from total RNA of the target tissue and control tissue. ³² This is a method of screening with a P-labeled cDNA probe and selecting a clone that hybridizes only with the probe of the target tissue. For example, first, a cDNA library is prepared from total RNA purified from human normal myocardial tissue according to a conventional method, and two sets of replica filters are prepared from the library. Next, cDNA is synthesized with reverse transcriptase using total RNA purified from human normal myocardial tissue as a template. [Α- ³² Label the cDNA by adding [P] dNTP. Although the labeled cDNA and the template total RNA form a stable double-stranded DNA-RNA hybrid, only high-temperature treatment in the presence of alkali degrades only the total RNA to purify the single-stranded cDNA. I do. Similarly, using total RNA purified from human heart failure patient myocardial tissue as a template ³² A single-stranded cDNA labeled with P is prepared. Hybridization is performed with a filter prepared from a human normal myocardial tissue library using both labeled cDNAs as probes. By comparing the autoradiographic images of the X-ray film and selecting a clone that hybridizes only to one of the cDNA probes derived from human normal myocardial tissue or heart failure myocardial tissue, a gene specifically expressed in human normal myocardial tissue (ie, It is possible to clone a gene that is not expressed or reduced in the myocardial tissue of a human heart failure patient or a gene that is specifically expressed in a myocardial tissue of a human heart failure (a gene whose expression is upregulated in the myocardial tissue of a human heart failure patient). it can.
[0031]
d) Cross hybridization method:
A cDNA library derived from either a human normal myocardial tissue or a human heart failure patient's myocardial tissue is hybridized with an appropriate DNA as a probe under conditions of low stringency to obtain a positive clone. Using the obtained positive clone as a probe, Northern hybridization is performed on total RNA derived from each of a human normal myocardial tissue and a human heart failure patient's myocardial tissue, and a clone expressing only one of them is selected.
[0032]
By performing Northern blotting on total RNA derived from human normal myocardial tissue or human heart failure patient's myocardial tissue using the thus obtained cDNA as a probe, total RNA of the selected gene is specifically expressed in human normal myocardial tissue. You can confirm that you are doing. Thus, the cDNA of a gene highly expressed in human normal myocardial tissue total RNA can be isolated and obtained.
[0033]
e) RT-PCR method, real-time PCR method
When it is desired to examine in advance whether a gene predicted to be associated with heart failure can be a marker for predicting the condition of heart failure, the RT-PCR method or the real-time PCR (TaqMan PCR) method can be used to detect a small amount of DNA with high sensitivity. And it can be quantitatively detected.
[0034]
In the real-time PCR (TaqMan PCR) method, an oligonucleotide probe that hybridizes to a specific region of a target gene and is labeled at the 5 ′ end with a fluorescent dye (reporter) and at the 3 ′ end with a fluorescent dye (quencher) is used. . In a normal state, the fluorescence of the reporter is suppressed by the quencher in the probe. In a state where the fluorescent probe is completely hybridized to the target gene, PCR is performed from outside using Taq DNA polymerase. As the elongation reaction by Taq DNA polymerase proceeds, the fluorescent probe is hydrolyzed from the 5 'end by its exonuclease activity, releasing the reporter dye and emitting fluorescence. In the real-time PCR method, the initial amount of the template DNA is quantified by monitoring the fluorescence intensity in real time.
[0035]
(3) Evaluation and judgment
As a result of the above analysis, a gene whose expression level is significantly different between total RNA derived from human heart failure patient's myocardial tissue and total RNA derived from human normal myocardial tissue is specified as a marker gene for predicting the pathology of human heart failure. Here, "significantly different" means that the expression levels of both differ by at least 2 times or more, preferably 5 times or more.
[0036]
However, a different criterion is applied depending on the characteristics of the gene. For example, G-protein coupled receptor: GPCR (G protein coupled receptor) is a receptor protein having seven transmembrane sites and has been reported to be involved in various physiological functions. Then, therapeutic agents for various diseases act by affecting the activity of this GPCR. Therefore, GPCRs are considered important as drug targets, and GPCR genes whose expression is altered in the human heart or associated with heart failure conditions are likely to be useful in the treatment of heart failure. Therefore, for GPCRs, genes whose expression levels change significantly between total RNA derived from human heart failure patient's myocardial tissue and total RNA derived from human normal myocardial tissue (for example, the average value of the expression levels of the heart failure group and the normal group) (P <0.05), a gene commonly expressed in all of the analyzed cardiac RNA samples irrespective of heart failure or normal (eg, a gene measured by Affymetrix Gene Chip) A gene whose average difference, which is the absolute value of the expression level, is 50 or more) is specified as a marker gene.
[0037]
As the marker gene specified in this way, for example, a gene specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 16 can be mentioned. Detailed information on the gene is available, for example, from gene sequence databases such as GenBank.
[0038]
Note that the GenBank registration information of the marker gene is slightly different between February 28, 2002 and April 15, 2002, which are the priority dates of the present application, and February 2003, the time of filing the present application. Therefore, those correspondences are summarized in FIG.
[0039]
1.2 Marker gene test
The marker gene identified as described above is expressed at a high level in myocardium-derived cells, and whether the same phenotypic change as human heart failure patient myocardial tissue appears, or expression of human heart failure patient myocardial tissue It can be tested whether or not the type change returns. The test can be performed, for example, as follows.
[0040]
First, using the specified gene fragment as a probe, a full-length cDNA is obtained from a human myocardial tissue-derived cDNA library according to a known method such as a colony hybridization method. The full-length cDNA is introduced into a normal animal cardiac muscle tissue and highly expressed, and it is examined whether or not the animal has the same phenotype as that of a human heart failure patient cardiac muscle tissue.
[0041]
In order to highly express cDNA in an animal individual, a method of incorporating the obtained full-length cDNA into a viral vector and administering to a animal can be mentioned. As a method for gene transfer using a viral vector, for example, cDNA is introduced into a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a pox virus, a polio virus, a simbis virus, etc. Method. Among them, a method using a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, and a vaccinia virus is particularly preferable. Specifically, a method using a commercially available kit (adenovirus expression vector kit: manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can be exemplified.
[0042]
Examples of non-viral gene transfer methods include a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofection method, a microinjection method, a calcium phosphate method, and an electroporation method. Among them, the DNA vaccine method and the liposome method are preferred.
[0043]
At the level of cultured cells, full-length cDNA is introduced into established cells derived from human, mouse, and rat myocardial tissues, primary cultured cells derived from rat neonatal myocardial tissues, and mouse ES cells induced to differentiate into myocardial tissue cells. Expression can be examined to determine whether the same phenotypic change as in human heart failure patient myocardial tissue appears. Conversely, an antisense nucleic acid against the total RNA sequence of the gene to be tested is introduced into a cell in which a phenotypic change that reflects the pathology of a human heart failure patient's myocardial tissue is detectable, and whether the phenotype is improved is determined. (Wickstrom, E. ed. (1991) Prospects for antisense nucleic acid therapy of cancer and AIDS. Wiley-Liss, Inc., New York, Fed., USA). Drugs.4, 799-821).
[0044]
When introducing the full-length cDNA into an animal or a cell, the cDNA is incorporated into a vector containing an appropriate promoter and a sequence involved in expression of the gene, and a host cell is transformed with the vector. As a vertebrate cell expression vector, a vector having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like located upstream of the gene to be expressed can be used. May be provided. Examples of the expression vector include pSV2dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864). The expression vector is prepared by the diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), and calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL. and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457) and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) and the like. Thus, a desired transformed cell can be obtained.
[0045]
In addition, it is also possible to prepare a transgenic animal so that the target gene is highly expressed in normal myocardial tissue by genetic manipulation, and to examine whether or not a pathological condition appears. Conversely, it is also possible to prepare a knockout animal in which the gene to be tested is disrupted in heart failure myocardial tissue, and to examine whether the condition is improved. The transgenic animal can be obtained by obtaining a fertilized egg from the animal, transferring the gene, transplanting the animal into a pseudopregnant animal, and generating the transgenic animal, using a known method [Developmental Engineering Experiment Manual (supervised by Tatsuji Nomura) , Edited by Motoya Katsuki, 1987), Operation Manual for Mouse Embryos (“Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual”), written by B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy, Kazuya Yamauchi, Atsushi Iwata, Yutaka Akira Yoichiro, 1989), Japanese Patent Publication No. 5-48093, etc.]. Specifically, for example, in the case of a mouse, first, an ovulation-inducing agent is administered to a female mouse, then mated with a male of the same strain, and the pronuclear fertilized egg is collected from the oviduct of the female mouse the next day. Next, the DNA fragment solution to be introduced is injected into the pronucleus of a fertilized egg using a micro glass tube. Regulatory genes such as promoters and enhancers for expressing the introduced gene in animal cells are not particularly limited as long as they function in the introduced animal cells. The fertilized egg into which the DNA has been injected is transplanted into the oviduct of a pseudopregnant foster female mouse (Slc: ICR, etc.), and is born about 20 days later by spontaneous delivery or cesarean section.
[0046]
The method for confirming that the thus obtained animal carries the transgene includes, for example: extracting DNA from the animal's tail or the like and using the DNA with specific sense and antisense primers. PCR, PCR, digestion of the DNA with several types of restriction enzymes, gel electrophoresis, blotting the DNA in the gel onto a nitrocellulose membrane or nylon membrane, and then probe all or a part of the labeled transgene. And a method of performing Southern blot analysis.
[0047]
On the other hand, in the case of a gene fragment determined to have a significantly lower expression level (including the case where it is not expressed) in human heart failure patient myocardial tissue than human normal myocardial tissue as a result of the above step, similarly, As a probe, a full-length cDNA is obtained from a cDNA library derived from human myocardial tissue.
[0048]
Then, this full-length cDNA is introduced into the cardiac muscle tissue of a heart failure animal to be highly expressed, and whether the phenotypic change of the animal is restored or not (for example, if the phenotypic change is a disease, the symptoms are improved) Or not). At the cultured cell level, is it possible to reverse phenotypic changes by introducing full-length cDNA into cells isolated or established from human normal myocardial tissue or human heart failure patient myocardial tissue and expressing it in high levels? Consider whether or not. Alternatively, conversely, single-stranded DNA, RNA or siRNA having an antisense sequence to the total RNA sequence of the gene to be tested (Genes and Developments, January 15, 2001, Vol. 15, No. 2, p188-200) Then, it is introduced into cells derived from normal myocardial tissue, and it is examined whether or not the same phenotypic change as in heart failure myocardial tissue appears. The gene transfer can be performed according to the method described above. In addition, transgenic animals can be prepared by genetic manipulation so that the target gene is highly expressed in the myocardial tissue of a patient with human heart failure, and it can be examined whether or not the disease state is improved. Similarly, a knockout animal in which the gene to be tested has been disrupted in human normal myocardial tissue can be prepared to examine whether or not the disease state appears.
[0049]
2. Marker protein for predicting the pathology of heart failure
The “marker protein for predicting the pathology of heart failure” according to the present invention refers to a protein used as an index for predicting the pathology of human heart failure, and is a protein encoded by the marker gene of the present invention. The protein specifically comprises a polypeptide specified by any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 17 to 31. The present invention provides a marker protein for predicting the condition of heart failure, and use of the marker protein for predicting, treating or preventing the condition of heart failure. In the present specification, the term “protein” includes not only polypeptides but also those to which sugar chains and the like are added.
[0050]
Note that the GenBank registration information of the marker protein is slightly different between February 28, 2002 and April 15, 2002, which are priority dates of the present application, and February 2003, the time of filing of the present application. Therefore, those correspondences are summarized in FIG.
[0051]
3. How to predict the pathology of heart failure
The expression levels of the marker gene of the present invention and the marker protein of the present invention reflect the pathology and prognosis of heart failure. Therefore, by quantifying the expression level of the gene or the protein in the sample, the pathology of heart failure can be predicted and used for diagnosis of heart failure. The “specimen” refers to a sample such as blood, body fluid, tissue, or excrement isolated from a subject or a clinical donation. In the case of the prediction method using the marker gene of the present invention, Tissue or cardiomyocytes are preferred. In the case of the prediction method using the marker protein of the present invention, blood or myocardial tissue is preferable, and serum or myocardial tissue cell extract is more preferable.
[0052]
For example, when the expression fluctuation of a marker gene or a marker protein in a sample with respect to normal myocardial tissue is similar to the fluctuation in expression in myocardial tissue derived from a heart failure patient, the patient is predicted to have a high probability of having heart failure or heart failure. Further, the prognosis of each patient can be predicted by observing the variation in the expression of the marker gene or marker protein over time with respect to each patient.
[0053]
3.1 Method for predicting pathological condition using marker gene
The method for predicting a disease state using the marker gene of the present invention specifically includes the following steps 1) to 3):
1) Extracting total RNA from a sample containing isolated myocardial tissue or myocardial cells; 2) Expression amount of each marker gene of the present invention between total RNA derived from the sample and total RNA derived from human normal myocardial tissue Detecting differences in
3) Analyze the difference in the expression level of each of the above marker genes, and predict the pathology of heart failure of the sample provider.
[0054]
Here, the extraction of total RNA in step 1 can be performed according to the method described in 1.1, and it is preferable that the extracted total RNA be further purified and used as mRNA. The detection of the expression level of the marker gene in step 2 can also be performed according to the method described in 1.1. In particular, nucleic acid hybridization using a solid-phased sample such as a gene chip or a cDNA array, RT- It is convenient and preferable to carry out using a PCR method or a real time PCR method. The “difference in expression level” may be an expression level difference or an expression level ratio as long as the gene expression level in a sample and human normal myocardial tissue can be quantitatively compared.
[0055]
The prediction in step 3 can be performed by individually evaluating specific marker genes, but it is preferable to comprehensively evaluate the differences in expression levels of a plurality of marker genes.
[0056]
3.2 Method for predicting pathological condition using marker protein
The method for predicting a disease state using the marker protein of the present invention specifically includes the following steps 1) to 3):
1) immobilizing a polypeptide in a sample containing isolated blood or cardiomyocytes; 2) determining the expression level of each marker protein of the present invention in the immobilized polypeptide specifically for the marker protein; Detection using a binding antibody;
3) Analyze the difference in the expression level of each marker protein between the sample and human normal myocardial tissue, and predict the pathology of heart failure.
[0057]
As a preferred embodiment of the prediction method, a method using an antibody will be described. First, a polypeptide in a sample is immobilized on the bottom surface of a well of a 96-well plate, a membrane, or the like, and then detected using an antibody that specifically recognizes the marker protein. Examples of the method for immobilization on a 96-well plate include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioisotope immunoassay (RIA). On the other hand, as a method for immobilizing a sample on a membrane, a method of transferring a polypeptide to a membrane via polyacrylamide electrophoresis of a sample (Western blotting) or a dot blotting method of directly impregnating a sample or a dilution thereof into the membrane is used. And a slot blot method.
[0058]
i) Sample preparation
The sample is preferably heart failure or normal human whole blood or serum or myocardial tissue cell extract, and more preferably serum or myocardial tissue cell extract. The whole blood, serum or myocardial tissue cell extract is subjected to high-speed centrifugation as necessary to remove insoluble substances, and then prepared as a sample for ELISA / RIA or a sample for western blot as follows.
[0059]
As the sample for ELISA / RIA, for example, the collected serum may be used as it is, or may be appropriately diluted with a buffer. The sample for Western blot (for electrophoresis) is, for example, a sample buffer solution containing 2-mercatorethanol for SDS-polyacrylamide electrophoresis (e.g., using a myocardial tissue cell extract as it is, or appropriately diluting it with a buffer solution). Sigma). As the sample for dot / slot blot, for example, a collected myocardial tissue cell extract itself or a sample appropriately diluted with a buffer is directly adsorbed to a membrane using a blotting apparatus or the like.
[0060]
ii) Immobilization of sample
In order to specifically detect the polypeptide in the sample obtained as described above, the polypeptide is immobilized. Examples of the solid phase used for the Western blotting, dot blotting or slot blotting include nitrocellulose membrane (for example, manufactured by Bio-Rad), nylon membrane (for example, Hybond-ECL (Amersham-Pharmacia)), and the like. Examples thereof include a cotton membrane (for example, a blot absorbent filter (manufactured by Bio-Rad) and the like) and a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (for example, manufactured by Bio-Rad) and the like.
[0061]
As a so-called blotting method for transferring a polypeptide from a gel after electrophoresis to a membrane, a wet blotting method (CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 ed by JE Corigan, A. M. Kruisbek, D.M. EM Shevach, W. Strober), a semi-dry blotting method (see CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2), and the like. Commercially available equipment (for example, Bio Dot (Bio-Rad), etc.) can be used for the dot blot method and the slot blot method.
[0062]
On the other hand, in order to perform detection and quantification by the ELISA method / RIA method, a sample or a dilution thereof (for example, 0.05%) is placed in a dedicated 96-well plate (for example, Immunoplate Maxisorp (manufactured by Nunc Corporation) or the like). A phosphate-buffered saline solution containing sodium azide (diluted with PBS) is added and left at 4 ° C. to room temperature overnight or at 37 ° C. for 1 to 3 hours to form a well bottom. Is immobilized by adsorbing the polypeptide.
[0063]
iii) Antibody
The antibody used specifically recognizes the marker protein of the present invention or a part thereof. Such antibodies include, for example, antibodies that bind to any of the above polypeptides but do not bind to any other mouse or human protein.
[0064]
The antibody can be prepared by an ordinary method (for example, Shinsei Kagaku Jikken Kozai 1, Protein 1, p. 389-397, 1992) by using an antigen protein or an arbitrary polypeptide selected from its amino acid sequence. It can be obtained by immunizing and collecting and purifying an antibody produced in the animal body. Also, the present invention is in accordance with a known method (for example, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p. 365-367, 1980, Prenum Press, NY). A hybridoma can be established by fusing an antibody-producing cell producing an antibody against the above-mentioned protein with a myeloma cell, and a monoclonal antibody can be obtained therefrom.
[0065]
Examples of the antigen for producing an antibody include the marker protein of the present invention or a polypeptide comprising at least six consecutive partial amino acid sequences thereof, or a derivative obtained by adding an arbitrary amino acid sequence or carrier thereto. In particular, the marker protein of the present invention is preferably bound to the N-terminal of the marker protein using keyhole limpet hemocyanin as a carrier.
[0066]
The antigen polypeptide can be obtained by producing a marker protein of the present invention in a host cell by genetic manipulation. Specifically, a vector capable of expressing the marker gene of the present invention may be prepared and introduced into a host cell to express the gene.
[0067]
Examples of the host cell include prokaryotic cells, such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. To transform a gene of interest into these host cells, the host cells are transformed with a plasmid vector that contains replicons or origins of replication from species compatible with the host and regulatory sequences. The vector is preferably a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
[0068]
For example, in the case of Escherichia coli, the K12 strain or the like is often used, and the vector is generally a pBR322 or pUC-based plasmid, but is not limited thereto, and various known strains and vectors can be used. Examples of the promoter used in E. coli include a tryptophan (trp) promoter, a lactose (lac) promoter, a tryptophan lactose (tac) promoter, a lipoprotein (lpp) promoter, a polypeptide chain elongation factor Tu (tufB) promoter, and the like. And any of them can be suitably used.
[0069]
In the case of Bacillus subtilis, strain 207-25 is preferable, and pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) or the like is used as a vector, but is not limited thereto. Not something. In addition, secretion and expression outside the cells can be achieved by ligating the DNA sequence encoding the signal peptide sequence of α-amylase of Bacillus subtilis to the vector.
[0070]
Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast. As vertebrate cells, for example, monkey COS cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL-1650) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) Strains deficient in dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) and the like are often used, but are not limited thereto.
[0071]
As a vertebrate cell expression vector, a vector having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like located upstream of a gene to be normally expressed can be used. In addition, it may have a replication origin if desired. Examples of the expression vector include pCR3.1 (Invitrogen) having an early promoter of cytomegalovirus and pSV2dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) and the like, but are not limited thereto.
[0072]
As an example, when a COS cell is used as a host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, is capable of autonomous growth in COS cells, and further has a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site. The one provided with is preferably used. The expression vector is prepared by the diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), and calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL. and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457) and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) and the like. Thus, the desired transformed cells can be obtained.
[0073]
When a CHO cell is used as a host cell, a vector capable of expressing a neo gene functioning as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, for example, pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular" Cloning A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Trans. By selecting a G418-resistant colony, a transformed cell stably producing the desired polypeptide can be obtained.
[0074]
When insect cells are used as host cells, ovarian cell-derived cell lines (Sf-9 or Sf-21) of Spodoptera frugiperda of Lepidoptera and Noctuidae, and High Five cells (Wickham, T. J. et al.) Derived from egg cells of Trichoplusia ni. al, (1992) Biotechnol. Prog. i: 391-396) and the like, and as a baculovirus transfer vector, pVL1392 / 1393 using a polyhedrin protein promoter of autographer nucleopolyhedrovirus (AcNPV). (Kidd, IM and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. pplied Biochemistry and Biotechnology 42037-159). In addition, vectors using baculovirus P10 or a promoter of the same basic protein can also be used. Furthermore, the recombinant protein can be expressed as a secreted protein by linking the secretory signal sequence of the AcNPV envelope surface protein GP67 to the N-terminal side of the target protein (Zhe-mei Wang, et al. (1998)). Biol. Chem., 379, 167-174).
[0075]
As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known, and among them, Saccharomyces yeast, for example, baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable. Examples of expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include, for example, an alcohol dehydrogenase gene promoter (Bennetzen, JL and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025). ) Or the promoter of the acid phosphatase gene (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5). When expressed as a secretory protein, it can be expressed as a recombinant having a secretory signal sequence and a cleavage site of an endogenous protease or a known protease possessed by the host cell at the N-terminal side. For example, in a system in which human mast cell tryptase of a trypsin-type serine protease is expressed in petroleum yeast, the activity is achieved by connecting the secretory signal sequence of α-factor of yeast and the cleavage site of KEX2 protease possessed by petroleum yeast to the N-terminal side and expressing it. It is known that type tryptase is secreted into the medium (Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28,
125-131).
[0076]
The transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the target polypeptide inside or outside the cell. As the medium used for the culturing, various kinds of commonly used media can be appropriately selected depending on the host cell used. For example, as the COS cells, those obtained by adding serum components such as fetal calf serum to a medium such as RPMI1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”) as necessary can be used.
[0077]
The recombinant protein produced by the above culture inside or outside the cells of the transformant can be separated and purified by a known separation operation method utilizing the physical properties and chemical properties of the protein. . Examples of the method include various liquids such as treatment with a protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC). Chromatography and dialysis can be used alone or in combination. Further, if histidine consisting of 6 residues is linked to the recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified by a nickel affinity column. The desired polypeptide can be easily produced in high yield and high purity by appropriately combining the above-described methods.
[0078]
The antibody obtained as described above can be used for various immunological measurement methods such as RIA, ELISA, fluorescent antibody method, passive hemagglutination, immunohistological staining, and the like.
[0079]
iv) detection
The antibody obtained by the method described in iii) above may be directly labeled, or may be used as a primary antibody to specifically recognize the primary antibody (recognize an antibody derived from the animal in which the antibody was produced). Used for detection in cooperation with secondary antibodies.
[0080]
Preferred examples of the type of the label include, but are not limited to, an enzyme (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase) or biotin (however, an operation of further binding an enzyme-labeled streptavidin to biotin of the secondary antibody is added). As the labeled secondary antibody (or labeled streptavidin), various types of previously labeled antibodies (or streptavidin) are commercially available. In the case of RIA, an antibody labeled with a radioisotope such as I125 is used, and the measurement is performed using a liquid scintillation counter or the like.
[0081]
By detecting the activity of these labeled enzymes, the amount of the polypeptide that is the antigen is measured. When labeling with alkaline phosphatase or horseradish peroxidase, substrates that emit color or emit light by the catalyst of these enzymes are commercially available.
[0082]
When a substrate that develops color is used, it can be visually detected using Western blotting or dot / slot blotting. In the ELISA method, it is preferable to measure and quantify the absorbance (measurement wavelength varies depending on the substrate) of each well using a commercially available microplate reader. Further, by preparing a dilution series of the antigen used in the preparation of the antibody in the above 3), performing a detection operation simultaneously with other samples as a standard antigen sample, and preparing a standard curve in which the standard antigen concentration and the measured value are plotted. It is also possible to quantify the antigen concentration in other samples.
[0083]
On the other hand, when a substrate that emits light is used, in Western blotting or dot / slot blotting, it can be detected by autoradiography using an X-ray film or an imaging plate or photographing using an instant camera. . Further, quantification using densitometry, a molecular imager Fx system (manufactured by Bio-Rad), or the like is also possible. When a luminescent substrate is used in the ELISA method, the enzyme activity is measured using a luminescent microplate reader (for example, manufactured by Bio-Rad).
[0084]
v) Measurement operation
a) Western blot, dot blot or slot blot
First, in order to prevent non-specific adsorption of antibodies, the membrane is previously placed in a buffer containing a substance that inhibits such non-specific adsorption (skim milk, casein, bovine serum albumin, gelatin, polyvinylpyrrolidone, etc.) for a certain period of time. Perform the soaking operation (blocking). As the composition of the blocking solution, for example, phosphate buffered saline (PBS) or Tris buffered saline (TBS) containing 5% skim milk, 0.05 to 0.1% Tween 20 is used. Instead of skim milk, Block Ace (Dainippon Pharmaceutical), 1 to 10% bovine serum albumin, 0.5 to 3% gelatin, 1% polyvinylpyrrolidone, or the like may be used. The blocking time is 16-24 hours at 4 ° C. or 1-3 hours at room temperature.
[0085]
Next, the membrane was washed with PBS or TBS containing 0.05 to 0.1% Tween 20 (hereinafter referred to as "washing solution") to remove an excess blocking solution, and then prepared by the method described in 3) above. The antibody is immersed in a solution appropriately diluted with a blocking solution for a certain period of time to bind the antibody to the antigen on the membrane. The dilution ratio of the antibody at this time can be determined, for example, by conducting a preliminary Western blotting experiment using a serially diluted recombinant antigen described in 3) above as a sample. This antibody reaction operation is preferably performed at room temperature for 2 hours. After completion of the antibody reaction operation, the membrane is washed with a washing solution. Here, when the used antibody is labeled, the detection operation can be performed immediately. When an unlabeled antibody is used, a secondary antibody reaction is subsequently performed. For example, when a commercially available product is used, the labeled secondary antibody is diluted 2000 to 20000-fold with a blocking solution and used (if a suitable dilution ratio is described in the attached instruction, follow the description). . After washing and removing the primary antibody, the membrane is immersed in a secondary antibody solution at room temperature for 45 minutes to 1 hour, washed with a washing solution, and then subjected to a detection operation according to the labeling method. The washing operation is performed, for example, by first shaking the membrane in the washing solution for 15 minutes, exchanging the washing solution for a new one, shaking for 5 minutes, exchanging the washing solution again, and shaking for 5 minutes. If necessary, the washing solution may be further exchanged for washing.
[0086]
b) ELISA / RIA
First, as in the case of Western blotting, blocking is performed in advance to prevent nonspecific adsorption of the antibody to the bottom surface in the well of the plate on which the sample is immobilized by the method 2). The blocking conditions are as described in the section of Western blot.
[0087]
Next, the wells are washed with PBS or TBS containing 0.05 to 0.1% Tween 20 (hereinafter, referred to as “washing solution”) to remove an excess blocking solution, and then manufactured by the method described in 3) above. A solution obtained by appropriately diluting the antibody with a washing solution is dispensed and incubated for a certain period of time to bind the antibody to the antigen. The dilution ratio of the antibody at this time can be determined, for example, by performing a preliminary ELISA experiment using a sample obtained by serially diluting the recombinant antigen described in 3) above. This antibody reaction operation is preferably performed at room temperature for about 1 hour. After completion of the antibody reaction operation, the inside of the well is washed with a washing solution. Here, when the used antibody is labeled, the detection operation can be performed immediately. When an unlabeled antibody is used, a secondary antibody reaction is subsequently performed. For example, when a commercially available product is used, the labeled secondary antibody is diluted 2000 to 20000 times with a washing solution and used (if a suitable dilution ratio is described in the attached instruction, follow the description). After washing and removing the primary antibody, the secondary antibody solution is dispensed into the wells, incubated at room temperature for 1 to 3 hours, washed with a washing solution, and then subjected to a detection operation according to the labeling method. The washing operation is performed, for example, by first dispensing a washing solution into a well and shaking for 5 minutes, exchanging the washing solution for a new one, shaking for 5 minutes, exchanging the washing solution again and shaking for 5 minutes. . If necessary, the washing solution may be further exchanged for washing.
[0088]
For example, in the present invention, the so-called sandwich ELISA can be performed by the method described below. First, two highly hydrophilic regions are selected from each amino acid sequence of the marker protein of the present invention. Next, a partial peptide consisting of 6 or more amino acids in each region is synthesized, and two types of antibodies using the partial peptide as an antigen are obtained. One of the antibodies is labeled as described in 4) above. The unlabeled antibody is immobilized on the bottom surface in the well of a 96-well ELISA plate according to the method described in 2) above. After blocking, the sample solution is placed in a well and incubated at room temperature for 1 hour. After washing the wells, the labeled antibody diluent is dispensed into each well and incubated. After washing the inside of the well again, a detection operation according to the labeling method is performed.
[0089]
vi) Evaluation
In the method described above, the detection results are compared between a sample derived from heart failure and a sample derived from normal myocardium, and as a result, a polypeptide to which the antibody specifically bound by the method described in iii) above binds is detected. Using the amount as the expression amount of each marker protein, the pathology of heart failure can be predicted. The prediction can be performed by individually evaluating a specific marker protein, but it is preferable to comprehensively evaluate the expression levels of a plurality of marker proteins.
[0090]
4. Kit for predicting the condition of heart failure
The present invention also provides a kit for use in a method for predicting the pathology of heart failure, using the expression of the marker gene or marker protein of the present invention as an index.
[0091]
The kit includes at least one selected from the group consisting of the following a) to e).
a) A continuous oligonucleotide primer having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying a gene specified by any one base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 16
b) A continuous polynucleotide probe having a length of 20 to 1500 bases for specifically hybridizing to a gene specified by any one base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 16 and detecting the gene
c) Immobilized sample on which the polynucleotide probe according to b) is immobilized
d) an antibody that specifically binds to a protein specified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 17 to 31, and detects the protein
e) a secondary antibody capable of specifically binding to the antibody according to d) above
[0092]
The primer described in a) above can be easily designed and amplified by a conventional method based on the base sequence (SEQ ID NOS: 1 to 16) of the marker gene of the present invention, for example, using commercially available primer design software. The probe described in b) is a polynucleotide that specifically hybridizes to the marker gene of the present invention, and preferably has a length of about 20 to 1500 bases. Specifically, in the case of Northern hybridization, a single-stranded oligonucleotide or double-stranded DNA having a length of about 20 bases is preferably used. In the case of a microarray, a double-stranded DNA having a length of about 100 to 1500 bases or a single-stranded oligonucleotide having a length of about 20 to 100 bases is suitably used. On the other hand, the Affimetrix Gene Chip system is preferably a single-stranded oligo having a length of about 25 bases. These are particularly preferably designed as probes that specifically hybridize to a portion having high sequence specificity existing in the 3 ′ untranslated region of the marker gene of the present invention. These primers and probes may be labeled with an appropriate label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, or the like), or may be modified with biotin, phosphoric acid, an amine, or the like.
[0093]
The solid-phased sample described in c) is produced by fixing the probe described in b) to a solid phase such as a glass plate, a nylon membrane, microbeads, or a silicon chip. The immobilized sample and the method for preparing the same have already been described in 1.1, but examples thereof include a gene chip, a cDNA array, an oligo array, and a membrane filter.
[0094]
The antibodies described in d) and e) can be prepared by the method described in 3.2. The antibody may be labeled with an appropriate label (for example, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, or the like), or may be appropriately modified with biotin or the like.
[0095]
In addition to the components described above, the kit of the present invention may contain, as necessary, reagents and the like necessary for the method for predicting the state of heart failure according to the present invention, such as hybridization, labeling of a probe, and detection of a label. Good.
[0096]
5. Composition for the treatment of heart failure
The marker gene of the present invention (for example, SEQ ID NO: 5) whose expression is lower in the heart failure patient's myocardial tissue than in the normal myocardial tissue can be obtained by converting the entire open reading frame sequence of the gene into a heart failure patient's heart or By introducing and expressing the gene in another tissue, a pathological condition due to insufficient expression of the gene can be treated. A similar effect can be achieved by introducing the marker protein of the present invention encoded by the gene into a patient with heart failure.
[0097]
In addition, the marker gene of the present invention (SEQ ID NOS: 1 to 4 and SEQ ID NOs: 6 to 16) whose expression is increased in myocardial tissue of a heart failure patient as compared to normal myocardial tissue is obtained by a method such as antisense, ribozyme, or RNAi. By suppressing the expression of, a pathological condition caused by overexpression of the gene can be treated. A similar effect is obtained by using an antibody molecule that specifically recognizes and neutralizes the marker protein of the present invention encoded by the gene, a dominant negative body of the protein or a substance that specifically inhibits the activity of the protein, etc. Can also be achieved.
[0098]
5.1 Treatment of heart failure by gene transfer
By inserting the entire open reading frame sequence of a marker gene whose expression in cardiac muscle tissue of a heart failure patient is lower than that of a normal heart muscle tissue into a recombinant vector (gene transfer vector) and expressing it in cardiomyocytes, the gene is expressed in the heart muscle patient. Can be restored to a normal state.
[0099]
Here, the vector / promoter system to be used is preferably one capable of gene transfer into human cardiomyocytes. For example, viral vectors such as MoMLV vector, herpes virus vector, adenovirus vector, AAV vector, HIV vector, SIV vector, Sendai virus vector and the like can be mentioned. As a vector other than a virus, a complex of phosphorus-containing calcium and a nucleic acid, a ribosome, a cationic lipid complex, a Sendai virus liposome, a polymer carrier having a polycation as a main chain, and the like can also be used. Further, methods such as electroporation and gene gun may be used for gene transfer.
[0100]
The promoter is not particularly limited as long as it can express a gene in cardiomyocytes. For example, adenovirus, cytomegalovirus, human immunodeficiency virus, simian virus 40, Rous sarcoma virus, herpes simplex virus, mouse leukemia virus, Sindbis virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, papilloma Viruses, human T-cell leukemia virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, JC virus, parvovirus B19, poliovirus and other virus-derived promoters, albumin, SRα, heat-shock protein, elongation factor and other mammalian-derived promoters, CAG Examples include a chimeric promoter such as a promoter, and a promoter whose expression is induced by tetracycline, steroid, or the like. In addition, a pseudo-type virus vector may be used. One example is a pseudotyped virus vector in which the Env protein, an HIV coat protein, is replaced with a VSV-G protein, a coat protein of vesicular stomatitis virus (VSV) (Naldini L et al .: Science). 272 263 (1996)).
[0101]
5.2 Treatment of heart failure with protein administration
Heart failure can be treated by administering to the patient a protein encoded by a marker gene whose expression is lower in normal heart muscle tissue than in normal heart muscle tissue.
[0102]
First, the entire open reading frame sequence of the gene is ligated to an appropriate vector / promoter system, the gene is introduced into a host cell system to produce the desired protein, and the protein encoded by the gene is obtained by extraction and purification. I do.
[0103]
Examples of the vector include vectors that can be introduced into mammals, particularly human cells, among those listed in the vector promoter system in the preceding section. Similarly, usable promoters include those promoters capable of expressing genes in mammals, particularly human cells, among those listed in the above-mentioned vector / promoter system. Further, a promoter that can be expressed in an E. coli host such as the Lac promoter can also be used.
[0104]
Examples of the host cell system include animal cells, insect cells, plant cells, Escherichia coli, embryonated chicken eggs and the like. Further, as a method for extracting a protein produced from a host cell system into which a gene has been introduced, for example, a method of homemodifying a cell, a method of dissolving a cell membrane using a surfactant or an enzyme such as SDS, an ultrasonic treatment, a freezing method -A method of repeating melting and the like can be mentioned. The protein obtained by any of the methods can be purified by a conventional method. For example, centrifugation using ultracentrifugation or density gradient centrifugation, ion exchange column or affinity column (for example, using the specific antibody described above), column separation using reverse phase column, or the like, polyacrylamide gel or the like is used. General biochemical techniques such as gel separation can be used for purification.
[0105]
The protein produced and purified as described above can be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and formulated into a pharmaceutically useful composition according to a known method. The pharmaceutical composition comprises one or more therapeutically effective amounts of the polypeptide. Suitable carriers and diluents are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences.
[0106]
With respect to the protein, a dosage form suitable for administration is not particularly limited, but is preferably prepared as an injection, as in the case of a pharmaceutical composition containing many human proteins already used as a medicine. More specifically, an injection is prepared by dissolving the polypeptide in a suitable solvent such as water, physiological saline, or an isotonic buffer. At that time, it can be prepared by adding polyethylene glycol, glucose, various amino acids, collagen, albumin and the like as a protective material. It is also possible to administer the polypeptide by embedding the polypeptide in an inclusion body such as ribosome.
[0107]
5.3 Treatment of heart failure by suppressing gene expression
Preventing the translation of a marker gene whose expression is increased in myocardial tissue of a heart failure patient from that of a normal myocardial tissue using an antisense nucleic acid, ribozyme or siRNA, and restoring the increased expression of the gene in a heart failure patient to a normal state. Can be.
[0108]
The antisense nucleic acid is designed as a DNA or RNA molecule complementary to at least a part of the gene (mRNA molecule) (see Weintraub, 1990; Marcus-Sekura, 1988). Antisense nucleic acids hybridize to mRNA in cells, produce double-stranded molecules, and block the translation of the mRNA, thereby preventing the expression of a transcript of the protein. Many such antisense methods have been practiced (Marcus-Sekura, 1988; Hambor et al., 1988).
[0109]
The ribozyme is an RNA molecule that has the ability to specifically cleave other single-stranded RNA molecules in a manner similar to DNA restriction endonucleases. By appropriately modifying the nucleotide sequence of the RNA, RNA molecules can be created that recognize and cleave specific nucleotide sequences within the RNA molecule (Cech, 1988). Since ribozymes are sequence-specific, only mRNA having a specific sequence can be inactivated. Two types of ribozymes, a tetrahymena type and a hammerhead type, have been identified (Hasselhoff & Gerlach, 1988). The Tetrahymena type ribozyme recognizes a 4-base sequence, and the hammerhead type recognizes a 11-18 base sequence. It is said that the longer the recognition sequence, the higher the specificity for the target mRNA chain. Therefore, hammerhead ribozymes are more preferable than tetrahymena ribozymes that inactivate a specific mRNA chain, and those having a recognition sequence of 18 bases or more are more preferable.
[0110]
The RNAi (RNA interference) is a phenomenon in which an siRNA having a sequence complementary to an mRNA binds to the mRNA to generate a double-stranded RNA in a cell, and the mRNA is sequence-specifically cleaved and inactivated. . The double-stranded RNA is rapidly cleaved in the cell by an RNase III type endonuclease (Dicer), and binds to a complementary sequence portion of the mRNA to form an RNA processing complex. The complex cleaves the RNA at the center of its base pair and inactivates the target mRNA.
[0111]
6. A method for testing the effect as a therapeutic or prophylactic agent for heart failure.
The present invention also provides a test method for functionally identifying a substance having a potential as an agent for treating or preventing heart failure from a large number of test substances by utilizing the marker gene of the present invention. In the test method, the test substance may be: (1) a phenotypic change that appears when the expression of the marker gene of the present invention is enhanced or suppressed, or (2) a phenotypic change in a cultured cell or a model animal reflecting a human heart failure pathology. Evaluation is performed using the expression level of a marker gene or marker protein as an index. As the marker gene or marker protein, an endogenous one originally present in a cell or an exogenous one introduced artificially may be used.
Hereinafter, these test methods will be specifically described.
[0112]
6.1 Method using reporter gene as index
Preparation of an expression plasmid incorporating a gene capable of detecting the activity of a known heart failure-related gene (a gene whose expression is promoted depending on the condition of heart failure) under the control of the promoter (hereinafter referred to as “reporter gene”) I do. Next, (i) a group co-transfected with the reporter gene expression plasmid and a recombinant vector capable of expressing the marker gene of the present invention in mammalian cells,
(Ii) a group co-transfected with the reporter gene expression plasmid and the recombinant vector not containing the marker gene of the present invention,
Are prepared. Possibility as a therapeutic or preventive agent for heart failure can be evaluated by adding a test sample during cell culture of each group and determining whether there is a difference in the expression level of the reporter gene in each group. For example, a test sample that strongly suppresses the expression of the reporter gene under conditions that promote the production of the marker protein encoded by the marker gene of the present invention may be useful as a therapeutic or preventive agent for heart failure. high.
[0113]
The animal cells used in the above-mentioned test method must have an increased expression level of the reporter gene when transfected with a recombinant vector capable of expressing the marker gene of the present invention in mammalian cells. Further, it is preferable that the difference between the expression level of the reporter gene in the group (i) and the expression level in the group (ii) is large. Such cells include, but are not limited to, HEK293 cells.
[0114]
Examples of a vector used in the test method for expressing the marker gene of the present invention in mammalian cells include pCR3.1 (manufactured by Invitrogen), pCMV-Script (manufactured by Stratagene), and the like. Not limited. Examples of a promoter for initiating transcription of a reporter gene include, but are not limited to, a promoter region of a gene encoding a protein (eg, ANP, BNP) whose blood concentration increases in human heart failure. .
[0115]
The reporter gene may be any as long as it encodes a reporter protein that can be specifically distinguished from any other protein that the host cell can produce in a series of steps of the test method. Preferably, the cell before transformation does not have a gene encoding the same or similar protein as the reporter protein. For example, even if the reporter protein is toxic to the cell or if the cell confers resistance to sensitive antibiotics, the presence or absence of reporter gene expression will determine the viability of the cell. Can be determined. However, a more preferable reporter gene used in the present invention can specifically and quantitatively detect the expression level (for example, a specific antibody against a protein encoded by the reporter gene has been obtained). Na) structural gene. More preferably, it is a gene encoding an enzyme or the like which specifically reacts with a foreign substrate to generate a metabolite which can be easily measured quantitatively. Examples of such reporter genes include, for example, genes encoding the following proteins, but the present invention is not limited thereto.
[0116]
a) Chloramphenicol acetyltransferase:
An enzyme that adds an acetyl group to chloramphenicol, and can be detected by a so-called CAT assay or the like. As a vector for preparing a reporter assay vector simply by incorporating a promoter, a pCAT3-Basic vector (promega) is commercially available.
[0117]
b) Firefly luciferase:
It can be quantified by measuring bioluminescence generated when luciferin is metabolized. As a vector for the reporter assay, a pGL3-Basic vector (promega) is commercially available.
[0118]
c) β-galactosidase:
There are substrates that can be measured by color reaction, fluorescence or chemiluminescence, respectively. As a vector for a reporter assay, pβgal-Basic (promega) is commercially available.
[0119]
d) Secreted alkaline phosphatase:
There are substrates that can be measured by color reaction, bioluminescence or chemiluminescence, respectively. As a vector for a reporter assay, pSEAP2-Basic (manufactured by Clontech) is commercially available.
[0120]
e) green-fluorescent protein:
Although it is not an enzyme, it can quantify directly because it emits fluorescence. Similarly, pEGFP-1 (manufactured by Clontech) is commercially available as a vector for a reporter assay.
[0121]
In the test method of the present invention, as a method for introducing an expression plasmid into a cultured cell line, the DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308), calcium phosphate- DNA co-precipitation method (Graham, FL and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), electric pulse perforation method (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1) , 841-845), lipofection method (Lopata et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol. 4, can be exemplified 1641-1643) or the like, not limited to these, it is possible to employ any of the methods commonly used in the art to which this invention belongs. However, when the cultured cell line is a so-called floating cell, it is preferable to use a method other than the calcium phosphate-DNA coprecipitation method. In any method, it is necessary to use optimized transfection conditions according to the cells used.
[0122]
Thus, when cells co-transfected with the marker gene expression vector of the present invention and a reporter expression vector are cultured, transcription of the reporter gene is promoted in a manner dependent on the expression of the marker gene. Therefore, under the conditions where the reporter gene can be expressed, the change in the expression level of the reporter gene between the case where an arbitrary test substance is added to the medium and the case where the test substance is not added is shown. The effect as an agent can be evaluated. Here, the “conditions under which the reporter gene can be expressed” may be any conditions under which the cells can survive and produce proteins. Preferably, in a medium suitable for the cell line to be used (a serum component such as fetal bovine serum may be added) in the presence of air containing 4 to 6% (most preferably 5%) carbon dioxide, Incubate at 36-38 ° C (most preferably 37 ° C) for 2-3 days (most preferably 2 days).
[0123]
As described above, apart from the test method using the transient gene transfer method, a test method using cells obtained by double transforming host cells with a reporter gene and an expression vector for the marker gene of the present invention. Can also be adopted. In this case, the expression of the reporter gene is promoted under conditions that induce the expression of the marker gene of the present invention using an expression vector such as pIND (manufactured by Invitrogen) or pTet-On (manufactured by Clontech). It is necessary to establish such a cell line. In producing such a transformed cell, it is desirable that the introduced gene be stably retained even after repeated passages of the host cell, for example, by integration into the chromosome of the host cell. In order to select cells so transformed, the transgene is ligated with a selectable marker such as an antibiotic resistance (eg, neomycin (or G418) resistance gene neo, etc.) and transfected, or prepared separately. Preferably, the selected marker and the transgene are co-transfected. Thereafter, by utilizing the characteristics of the selectable marker, stably transformed cells can be selected.
[0124]
When the cell line thus obtained is placed under conditions that induce the expression of the marker gene of the present invention, the transcription of the reporter gene is promoted in a manner dependent on the expression of the marker gene. Therefore, under the conditions where the reporter gene can be expressed, the change in the expression level of the reporter gene between the case where an arbitrary test substance is added to the medium and the case where the test substance is not added is shown. The effect as an agent can be evaluated. That is, a test sample that strongly suppresses the expression of the reporter gene under an inducing condition that promotes the expression of the marker gene of the present invention is considered to be a useful substance as a therapeutic or preventive agent for heart failure.
[0125]
6.2 Method using phenotypic change in cultured cells as an index
The marker gene of the present invention is forcibly expressed in cells derived from myocardial tissue or other muscle-derived cells, or similar cells such as ES cells or stem cells differentiated into myocardium, or the marker protein of the present invention acts externally. Let it. A change in the phenotype that appears to lead to heart failure, which appears in this way, can be confirmed, and the change can be used as an index to evaluate as a substance useful as a therapeutic or preventive agent for heart failure. Examples of the change in phenotype include a change in expression of a known gene associated with a heart failure condition such as a gene encoding ANP or BNP, a change in cell morphology, a change in total protein, and the like. Specifically, this test method can be used for 1.2 marker gene tests and The method can be performed according to the method described in the method for predicting a disease state.
[0126]
6.3 Method based on phenotypic changes in transgenic animals
If a transgenic animal (for example, a mouse or the like) into which the marker gene of the present invention is introduced is prepared and expressed in a myocardial tissue-specific manner using a myocardial-specific expression promoter, if a change similar to human heart failure appears, Using the animal, a substance useful for treating or preventing heart failure can be searched. Alternatively, if a change similar to human heart failure can be induced by introducing a ribozyme or RNAi against the marker gene of the present invention into an animal, a substance useful for treating or preventing heart failure can be searched using the animal. . In addition, since the marker gene of the present invention is a human-derived gene, when producing the transgenic animal, for example, in the case of a mouse, a mouse ortholog of the gene is obtained and introduced.
[0127]
The test can also be performed by directly introducing a marker protein encoded by the gene or an antibody thereof to an animal. Specifically, this test method can be used for 1.2 marker gene tests and The method can be performed according to the method described in the method for predicting a disease state.
[0128]
6.4 Method using marker expression level in cultured cells of heart failure disease state model as index
Changes in the phenotype of cardiomyocytes in heart failure can be determined by using cardiomyocyte-derived cell lines (H9C2, etc., ATCC: CRL-1446, skeletal muscle-derived cells (L6 ATCC: CRL-1458, C2C12 ATCC: CRL-1772), primary cultured myocardial cells, etc. Specifically, 1) administration of neurohumoral factors such as angiotensin and endothelin (manufactured by Peptide Research Laboratories) reproduces the changes caused by chronic excess of these factors. By culturing under oxygen conditions (1% or less), the damage of cardiomyocytes due to ischemia is reproduced (Aneropak Kenki for Cell, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.). To reproduce the stress on the cells due to the blood pressure load (cultured cell stretching system Stretch N-300, Crisp made Tech) The method and the like. Using the cells obtained in this way, according to the methods described in 1.1 and 3.2, a change in the expression of the marker gene or marker protein of the present invention was confirmed, and the change was used as an index to treat or treat heart failure. Substances useful as prophylactic agents can be evaluated.
[0129]
6.5 Method using marker expression level as an index in heart failure disease model animals
Various animal models of heart failure are also available. Examples of the model animal include a Dahl salt-sensitive rat (Japan SLC, Japan Claire) (Inoko et al., American Journal of Physiology. 1994; 267: H2471-H2482, Doi et al., Journal of Hyperion; : 111-120), a model of hypertension-induced chronic heart failure, cardiomyopathy hamster (BIO BREEDERS, CLEA Japan) (Journal of Clinical Investigation 1994 Sep; 94 (3): 1059-68, Bajusz et al., Am. Heart. ; 77: 686-696), and a Pacing heart failure model in dogs (Armstrong et al.). al., Circulation 1986; 74: 1075-1084), a partial coronary artery stenosis heart failure model (Harris, Circulation 1950; 1: 1318-1328), a pressure overload heart failure model due to aortic partial stenosis in mice (Howard et al., Circulation 1993; 87 [supple VII]: VII-14-VII-21) or the like can be used. Using the myocardial tissues of these model animals, the expression variation of the marker gene and marker protein of the present invention was confirmed according to the methods described in 1.1 and 3.2, and the variation was used as an index to treat or prevent heart failure. Substances useful as agents can be evaluated.
[0130]
Since the marker gene and marker protein of the present invention are sequences derived from humans, the cell lines, primary cultures derived from non-human animals, and various heart failure models, for example, mice, For example, a mouse ortholog of the gene or protein is obtained and used.
[0131]
7. Kit for testing the effect of treating or preventing heart failure
Among the above “methods for testing effects as therapeutic or prophylactic agents for heart failure”, the methods described in 6.4 and 6.5 evaluate a test substance using the expression level of the marker gene or marker protein of the present invention as an index. . Therefore, this test can be carried out using a kit containing at least one or more selected from the group consisting of the following a) to e), similarly to the method for predicting the pathology of heart failure.
[0132]
a) A continuous oligonucleotide primer having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying a gene specified by any one base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 16
b) A continuous polynucleotide probe having a length of 20 to 1500 bases for specifically hybridizing to a gene specified by any one base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 16 and detecting the gene
c) Immobilized sample on which the polynucleotide probe according to b) is immobilized
d) an antibody that specifically binds to a protein specified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 17 to 31, and detects the protein
e) a secondary antibody capable of specifically binding to the antibody according to d) above
[0133]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to such Examples.
[0134]
Example 1 Extraction of Total RNA from Human Heart Failure Patient Myocardial Tissue
Left ventricular myocardial tissue pieces (6 cases, obtained from Hayama Heart Center) of human heart failure patients removed by batista surgery were stored in RNA later Reagent (Ambion) after the removal. The weight of each tissue piece was measured, 0.3 ml of the tissue piece was added with 3 ml of TRIzol reagent (manufactured by Invitrogen), and homogenized at room temperature using an ultra-high-speed homogenizer (Polytron, manufactured by Kinematica) (scale 8). For 1 minute). After the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, 0.6 ml of chloroform was added, and the mixture was mixed by inverting vigorously for 15 seconds. After leaving still at room temperature for 3 minutes, the mixture was centrifuged at 12000 × g and 4 ° C. for 15 minutes. After centrifugation, the upper layer was recovered, and 2.4 ml of ribonuclease-free isopropyl alcohol was added and mixed. This was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 12,000 × g at 4 ° C. for 10 minutes. Then, the supernatant was removed, and ribonuclease-free 70% ethanol was added. This was centrifuged at 12000 × g at 4 ° C. for 10 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was dried. The whole was dissolved in ribonuclease / deoxyribonuclease-free distilled water (Invitrogen) to give a total. RNA was obtained. This total RNA sample was stored at -80 ° C until use.
[0135]
Example 2: Analysis by chip
<Test method>
The analysis using a chip (Human Genome U95A2, B, C, D, E: manufactured by Affymetrix) was performed as follows in accordance with the expression analysis technical manual (Expression Analysis Technical Manual) of Affymetrix.
a) cDNA synthesis
Using 5 μg each of total RNA obtained by the method described in Example 1 and total RNA derived from human normal myocardial tissue (manufactured by Biochain) as starting materials, cDNA was synthesized and purified as described in the manual.
b) cRNA synthesis
Using 1 μg of the cDNA obtained in the above a) as a template, cRNA was prepared as described in the above manual (reaction conditions were 37 ° C., 4.5 hours). 10 μg of the cRNA obtained by this operation was fragmented and added to the probe solution.
c) Preparation of probe solution
A probe solution was prepared according to the description in the above manual.
d) Hybridization and staining, scanning
After the probe solution obtained in the above c) was hybridized to the chip, washing, staining, and scanning operations were performed as described in the manual.
e) Analysis
The data obtained by the scanning in the above d) is analyzed by Affymetrix's analysis software Microarray Suite Ver. 4, and compared with data obtained from the left ventricular myocardium of a human heart failure patient based on the data of human normal myocardial tissue. In two or more heart failure samples, the Fold Change value (a value indicating a change in gene expression) is 2 or more (indicating that gene expression has increased by a factor of 2 or more) or -2 or less (the gene expression level is 1/2 or less). , Which indicates that the gene has been reduced).
[0136]
<Result>
In the left ventricular myocardium of a heart failure patient, four types of genes that were more highly expressed than human normal myocardial tissue were found, and their GenBank Accession Numbers are as shown in Table 1. In addition, one gene was found as a gene whose expression in the left ventricular myocardium of a heart failure patient was lower than that in a normal human myocardial tissue, and the GenBank Accession Number is as shown in Table 2.
[0137]
[Table 1]

[0138]
[Table 2]

[0139]
Example 3: Analysis of expression level by TaqMan PCR (real-time PCR method)
<Test method>
TaqMan PCR was used to measure the expression fluctuations of genes that were expressed in the left ventricular myocardium of a human heart failure patient obtained in Example 2 and that had higher expression than normal human myocardial tissue and genes whose expression had decreased.
[0140]
a) Materials
Primers used in TaqMan PCR were prepared by ordering from Amersham Pharmacia or Invitrogen. In addition, as a probe used in TaqMan PCR, an oligonucleotide having a reporter dye Fam attached to its 5 'end and a reporter quencher Tamura attached to its 3' end was synthesized (TaqMan Fluorescent Probe: manufactured by Applied Biosystems Japan). . In order to standardize the expression level of each gene, human GAPDH (TaqMan Human GAPDH: manufactured by Applied Biosystems Japan) was used.
[0141]
b) PCR reaction
Using these materials, the expression level of the gene obtained in the above e) was quantified by TaqMan PCR. The PCR reaction was performed in a 96-well reaction plate (MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate, manufactured by Applied Biosystems Japan). The reaction solution was composed of 50 ng of total RNA obtained by the method of Example 1, 0.5 μl of a primer for TaqMan PCR (10 μM) in both the forward direction and the reverse direction in one well (final concentration: 100 nM), and a solution for TaqMan PCR. An arbitrary amount of the probe (final concentration: 100 nM), a mixed solution for PCR amplification (TaqMan One-Step RT-PCR master mix: manufactured by Applied Biosystems Japan), 25 μl, an arbitrary amount of ultrapure water, and a total volume of 50 μl. At this time, the concentration of the stock solution in the RNA solution for preparing the calibration curve was set to “500” for convenience, and thereafter, the dilution was repeated two-fold, and the concentrations were set to “250”, “125”, “62.5”, “31.3”, “31.3”. Reaction solutions were similarly prepared for the solutions of "15.6" and "7.8". The PCR reaction was performed using a TaqMan PCR-dedicated thermal cycler / detector (ABI7700: manufactured by Applied Biosystems Japan). The reaction was carried out at a temperature of 48 ° C. for 30 minutes and at a temperature of 95 ° C. for 10 minutes, followed by repeating the reaction at a temperature of 95 ° C. for 15 seconds and a temperature of 60 ° C. for 1 minute 40 times, and the luminescence of the reporter dye was measured every cycle.
[0142]
c) Calculation of expression level
GAPDH, an amplification curve of the gene obtained in Example 2 was prepared from the luminescence of the reporter dye in each cycle. From the amplification curve of the dilution series of the RNA solution for preparing the calibration curve, a calibration curve was prepared with the concentration on the horizontal axis and the number of cycles on the vertical axis, and for each expression quantification sample, a constant value arbitrarily set in the logarithmic amplification phase The number of cycles exceeding the amount of luminescence was plotted on a calibration curve to calculate the relative expression level. The expression level of the gene obtained in Example 2 was corrected with the value of the expression level of GAPDH in the same sample.
[0143]
<Result>
The change in the expression level in the left ventricular myocardium of a human heart failure patient and the normal human myocardial tissue detected by TaqMan PCR was consistent with the change in the expression level of the gene by the chip analysis obtained in Example 2.
[0144]
Example 4: Analysis of GPCR gene expression level
<Test method>
GPCR gene data was extracted from the expression level analysis data of the human normal myocardial tissue and the left ventricular myocardium of the heart failure patient obtained in Example 2, and a marker gene for predicting the pathology of heart failure was selected based on criteria different from those in Example 2. . That is, those having a difference in the expression level between the normal myocardial tissue and the left ventricular myocardium of the heart failure patient, or those having an average difference value (absolute value of the gene expression level measured by the Affymetrix Gene Chip) of 50 or more in all the samples are selected. did. GPCR gene data was extracted by using annotation information of a probe of Affymetrix Net Affyx.
[0145]
<Result>
There are 11 GPCR genes having a difference in expression level between normal myocardial tissue and left ventricular myocardial tissue of a patient with heart failure, or an average difference value of 50 or more in all samples. GenBank Accession Number is as shown in Table 3.
[0146]
[Table 3]

[0147]
【The invention's effect】
The marker gene of the present invention and the protein encoded by the gene can serve as new indices for predicting the pathology and progression of heart failure. Therefore, the diagnosis, treatment or prevention of heart failure can be improved by using the gene or protein.
[0148]
[Sequence list]
SEQUENCE LISTING
<110> SANKYO COMPANY, LIMITED
<120> Marker for predicting state of heart failure and
uses thereof
<130> 200293SU
<140>
<141>
<150> JP 2002-054388
<151> 2002-02-28
<150> JP 2002-112228
<151> 2002-04-15
<160> 31
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1478
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Inventor: Kitakaze, Masafumi; Takashima, Seiji; Asakura, Masanori; Isomura, Tadashi; Furukawa, Hidehiko, Koisha, Ritsui;
gcgggcgaca cgagggccgc ggtgcagtgt ccgacccgag agttgcggcc tgagtcaccg 60 gccccgccct ccggagccgg acgctccggg aggcccggga gcggcagtgg aaccgactcc 120 cagaactccg gacgtgtgcg gcgcagtgag tcgcagccat gttcctggtt aactcgttct 180 tgaagggcgg cggcggcggc ggcgggggag gcgggggcct gggtgggggc ctgggaaatg 240 tgcttggagg cctgatcagc ggggccgggg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg 300 gtgg tggagg cggcggtggc ggtggaacgg ccatgcgcat cctaggcgga gtcatcagcg 360 ccatcagcga ggcggctgcg cagtacaacc cggagccccc gcccccacgc acacattact 420 ccaacattga ggccaacgag agtgaggagg tccggcagtt ccggagactc tttgcccagc 480 tggctggaga tgacatggag gtcagcgcca cagaactcat gaacattctc aataaggttg 540 tgacacgaca ccctgatctg aagactgatg gttttggcat tgacacatgt cgcagcatgg 600 tggccgt at ggatagcgac accacaggca agctgggctt tgaggaattc aagtacttgt 660 ggaacaacat caaaaggtgg caggccatat acaaacagtt cgacactgac cgatcaggga 720 ccatttgcag tagtgaactc ccaggtgcct ttgaggcagc agggttccac ctgaatgagc 780 atctctataa catgatcatc cgacgctact cagatgaaag tgggaacatg gattttgaca 840 acttcatcag ctgcttggtc aggctggacg ccatgttccg tgccttcaaa tctcttgaca 900 aagatggcac ggacaaatc caggtgaaca tccaggagtg gctgcagctg actatgtatt 960 cctgaactgg agccccagac ccgccccctc accgccttgc tataggagtc acctggagcc 1020 tcggtctctc ccagggccga tcctgtctgc agtcacatct ttgtggggcc tgctgaccca 1080 caagcttttg ttctctcagt acttgttacc cagcttctca acatccaggg cccaatttgc 1140 cctgcctgga gttccccctg gctctaggac actctaacaa gctctgtcca cgggtctccc 1200 cattcccacc a ggccctgca cacacccact ccgtaacctc tcccctgtac ctgtgccaag 1260 cctagcactt gtgatgcctc catgccccga gggcctctct cagttctggg aggatgactc 1320 cagtccctgc acgccctggc acacccttca cggttgctac ccaggcggcc aagctccaga 1380 ccgtgccaga cccaggtgcc ccagtgcctt tgtctatatt ctgctcccag cctgccaggc 1440 caggaggaaa taaacatgcc ccagttgctg atctctaa 1478 <210> 2
<211> 1246
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ctgccccatg cagccctgag ccccacagca agtctgccat gggccgcggg gcccgtgtcc 60 cctcggaggc cccgggggca ggcgtcgagc gccgctggct tggagccgcg ctggtcgccc 120 tgtgcctcct ccccgcgctg gtgctgctgg cccggctggg ggccccggcg gtgccggcct 180 ggagcgcagc gcagggagac gtcgctgcgc tgggcctctc ggcggtcccc cccacccggg 240 tcccgggccc actggccccc cgcagacgcc gctacacgct gactccagcc aggctgcgct 300 ggga ccactt caacctcacc tacaggatcc tctccttccc gcggaacctg ctgagcccgc 360 gggagacgcg gcgggcccta gctgccgcct tccgcatgtg gagcgacgtg tcccccttca 420 gcttccgcga ggtggccccc gagcagccca gcgacctccg gataggcttc tacccgatca 480 accacacgga ctgcctggtc tccgcgctgc accactgctt cgacggcccc acgggggagc 540 tggcccacgc cttcttcccc ccgcacggcg gcatccactt cgacgacagc gagtactggg 600 tcctggg cc cacgcgctac agctggaaga aaggcgtgtg gctcacggac ctggtgcacg 660 tggcggccca cgagatcggc cacgcgctgg gcctgatgca ctcacaacac ggccgggcgc 720 tcatgcacct gaacgccacg ctgcgcggct ggaaggcgtt gtcccaggac gagctgtggg 780 ggctgcaccg gctctacgga tgcctcgaca ggctgttcgt gtgcgcgtcc tgggcgcgga 840 ggggcttctg cgacgctcgc cggcggctca tgaagaggct ctgccccagc agctgcgact 900 tctgctacga ttccccttc cccacggtgg ccaccacccc accgcccccc aggaccaaaa 960 ccaggctggt gcccgagggc aggaacgtga ccttccgctg cggccagaag atcctccaca 1020 agaaagggaa agtgtactgg tacaaggacc aggagcccct ggagttctcc taccccggct 1080 acctggccct gggcgaggcg cacctgagca tcatcgccaa cgccgtcaat gagggcacct 1140 acacctgcgt ggtgcgccgc cagcagcgcg tgctgaccac ctactcctgg cgagtccgtg 1200 tgcggggctg a gcccgggctg ataaaagtact ttctctctga aaaaaa 1246 <210> 3
<211> 2947
<212> DNA
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gtcgggggca gcagcaagat gcgaagcgag ccgtacagat cccgggctct ccgaacgcaa 60 cttcgccctg cttgagcgag gctgcggttt ccgaggccct ctccagccaa ggaaaagcta 120 cacaaaaagc ctggatcact catcgaacca cccctgaagc cagtgaaggc tctctcgcct 180 cgccctctag cgttcgtctg gagtagcgcc accccggctt cctggggaca cagggttggc 240 accatggggc ccaccagcgt cccgctggtc aaggcccacc gcagctcggt ctctgactac 300 gtca actatg atatcatcgt ccggcattac aactacacgg gaaagctgaa tatcagcgcg 360 gacaaggaga acagcattaa actgacctcg gtggtgttca ttctcatctg ctgctttatc 420 atcctggaga acatctttgt cttgctgacc atttggaaaa ccaagaaatt ccaccgaccc 480 atgtactatt ttattggcaa tctggccctc tcagacctgt tggcaggagt agcctacaca 540 gctaacctgc tcttgtctgg ggccaccacc tacaagctca ctcccgccca gtggtttctg 600 cgggaag ga gtatgtttgt ggccctgtca gcctccgtgt tcagtctcct cgccatcgcc 660 attgagcgct atatcacaat gctgaaaatg aaactccaca acgggagcaa taacttccgc 720 ctcttcctgc taatcagcgc ctgctgggtc atctccctca tcctgggtgg cctgcctatc 780 atgggctgga actgcatcag tgcgctgtcc agctgctcca ccgtgctgcc gctctaccac 840 aagcactata tcctcttctg caccacggtc ttcactctgc ttctgctctc catcgtcatt 900 ctgtactgca aatctactc cttggtcagg actcggagcc gccgcctgac gttccgcaag 960 aacatttcca aggccagccg cagctctgag aagtcgctgg cgctgctcaa gaccgtaatt 1020 atcgtcctga gcgtcttcat cgcctgctgg gcaccgctct tcatcctgct cctgctggat 1080 gtgggctgca aggtgaagac ctgtgacatc ctcttcagag cggagtactt cctggtgtta 1140 gctgtgctca actccggcac caaccccatc atttacactc tgaccaacaa ggagatgcgt 1200 cgggccttca t ccggatcat gtcctgctgc aagtgcccga gcggagactc tgctggcaaa 1260 ttcaagcgac ccatcatcgc cggcatggaa ttcagccgca gcaaatcgga caattcctcc 1320 cacccccaga aagacgaagg ggacaaccca gagaccatta tgtcttctgg aaacgtcaac 1380 tcttcttcct agaactggaa gctgtccacc caccggaagc gctctttact tggtcgctgg 1440 ccaccccagt gtttggaaaa aaatctctgg gcttcgactg ctgccaggga ggagctgctg 1500 caagccagag g gaggaaggg ggagaatacg aacagcctgg tggtgtcggg tgttggtggg 1560 tagagttagt tcctgtgaac aatgcactgg gaagggtgga gatcaggtcc cggcctggaa 1620 tatatattct acccccctgg agctttgatt ttgcactgag ccaaaggtct agcattgtca 1680 agctcctaaa gggttcattt ggcccctcct caaagactaa tgtccccatg tgaaagcgtc 1740 tctttgtctg gagctttgag gagatgtttt ccttcacttt agtttcaaac ccaagtgagt 1800 gtgtgcactt c tgcttcttt agggatgccc tgtacatccc acaccccacc ctcccttccc 1860 ttcatacccc tcctcaacgt tcttttactt tatactttaa ctacctgaga gttatcagag 1920 ctggggttgt ggaatgatcg atcatctata gcaaataggc tatgttgagt acgtaggctg 1980 tgggaagatg aagatggttt ggaggtgtaa aacaatgtcc ttcgctgagg ccaaagtttc 2040 catgtaagcg ggatccgttt tttggaattt ggttgaagtc actttgattt ctttaaaaaa 2100 catcttttca a tgaaatgtg ttaccatttc atatccattg aagccgaaat ctgcataagg 2160 aagcccactt tatctaaatg atattagcca ggatccttgg tgtcctagga gaaacagaca 2220 agcaaaacaa agtgaaaacc gaatggatta acttttgcaa accaagggag atttcttagc 2280 aaatgagtct aacaaatatg acatccgtct ttcccacttt tgttgatgtt tatttcagaa 2340 tcttgtgtga ttcatttcaa gcaacaacat gttgtatttt gttgtgttaa aagtactttt 2400 cttgattttt g aatgtattt gtttcaggaa gaagtcattt tatggatttt tctaacccgt 2460 gttaactttt ctagaatcca ccctcttgtg cccttaagca ttactttaac tggtagggaa 2520 cgccagaact tttaagtcca gctattcatt agatagtaat tgaagatatg tataaatatt 2580 acaaagaata aaaatatatt actgtctctt tagtatggtt ttcagtgcaa ttaaaccgag 2640 agatgtcttg tttttttaaa aagaatagta tttaataggt ttctgacttt tgtggatcat 2700 tttgcacata g cttttcaa cttttaaaaca ttaataaact gatttttttta aag 2753 <210> 17
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Phe Leu Val Asn Ser Phe Leu Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Asn Val Leu Gly Gly Leu 20 25 30 Ile Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala Met Arg Ile Leu Gly Gly 50 55 60 Val Ile Ser Ala Ile Ser Glu Ala Ala Ala Gln Tyr Asn Pro Glu Pro 65 70 75 80Pro Pro Pro Arg Thr His Tyr Ser Asn Ile Glu Ala Asn Glu Ser Glu 85 90 95 Glu Val Arg Gln Phe Arg Arg Leu Phe Ala Gln Leu Ala Gly Asp Asp 100 105 110 MetGal r Glu Leu Met Asn Ile Leu Asn Lys Val Val 115 120 125 Thr Arg His Pro Asp Leu Lys Thr Asp Gly Phe Gly Ile Asp Thr Cys 130 135 140 Arg Ser Met Val Ala Val Met Asp Ser Asp Thr Thr Gly Lys Leu Gly 145 150 155 160 Phe Glu Glu Phe Lys Tyr Leu Trp Asn Asn Ile Lys Arg Trp Gln Ala 165 170 175 Ile Tyr Lys Gry Phar AsP er Ser 180 185 190 Glu Leu Pro Gly Ala Phe Glu Ala Ala Gly Phe His Leu Asn Glu His
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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405
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
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<213> Homo sapiens
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305
<210> 26
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Arg Trp Leu Trp Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Val Ile Leu Ala 1 5 10 15 Val Gly Leu Ser Arg Val Ser Gly Gly Ala Pro Leu His Leu Gly Arg 20 25 30 His Arg Ala Glu Thr Gln Glu Gln Gln Ser Arg Ser Lys Arg Gly Thr 354045 Glu Asp Glu Glu Ala Lys Gly Val Gln Gln Tyr Val Pro Glu Glu Trap 50 55 60 Ala G n Pro Thr Lys 65 70 75 80
Pro Leu Val Ala Thr Ser Pro Asn Pro Asp Lys Asp Gly Gly Thr Pro 85 90 95 Asp Ser Gly Gln Glu Leu Arg Gly Asn Leu Thr Gly Ala Pro Gly Gln 100 105 110 Arg Leu Gln Ile Gln Asn Pro Leu Tyr Pro Val Thr Glu Ser Ser Tyr 115 120 125 Ser Ala Tyr Ala Ile Met Leu Leu Ala Leu Val Val Phe Ala Val Gly 130 135 140 Ile Val GlyVal Gly AsnLL His Ser Tyr Tyr 145 150 155 160Leu Lys Ser Ala Trp Asn Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ala Leu Trp Asp 165 170 175 Phe Leu Val Leu Phe Phe Cys Leu Pro Ile Val Ile Phe Asn Glu Ile 180 185 190 Thr Lys Gln Arg Leu Leu Gly Asp Val Ser Cys Arg Ala Val Pro Pro He 195 200 205 Met Glu Val Ser Ser Leu Gly Val Thr Thr The Ser Leu Cys Ala Leu 220 Gly Ile Asp Arg Phe His Val Ala Thr Ser Thr Leu Pro Lys Val Arg
225 230 235 240Pro Ile Glu Arg Cys Gln Ser Ile Leu Ala Lys Leu Ala Val Ile Trp 245 250 255 Val Gly Ser Met Thr Leu Ala Val Pro Glu Leu Leu Leu Trp Gln Leu 260 265 270 Ala Gln Glu Pro Ala Pro Thr Met Gly Thr Leu Asp Ser Cys Ile Met 275 280 285 Lys Pro Ser Ala Ser Leu Pro Glu Ser Leu Tyr Ser Leu Val Met Thr 290 295 300 Tyr Gl n Ala Arg Met Trp Trp Tyr Phe Gly Cys Tyr Phe Cys Leu 305 310 315 320Pro Ile Leu Phe Thr Val Thr Cys Gln Leu Val Thr Trp Arg Val Arg 325 330 335 Gly Pro Pro Gly Arg Lys Ser Glu Cys Arg Ala Ser Lys His Glu Gln 340 345 350 Cys Glu Ser Gln Leu Asn Ser Thr Val Val Gly Leu Thr Val Val Tyr 355 360 365 Ala Phe Cys Thr Leu Pro Glu Asn Val Cys Asn le Val Val Ala Tyr 370 375 380 Leu Ser Thr Glu Leu Thr Arg Gln Thr Leu Asp Leu Leu Gly Leu Ile
385 390 395 400Asn Gln Phe Ser Thr Phe Phe Lys Gly Ala Ile Thr Pro Val Leu Leu 405 410 415 Leu Cys Ile Cys Arg Pro Leu Gly Gln Ala Phe Leu Asp Cys Cys Cys 420 425 430 Cys Cys Cys Cys Glu Glu Cys Gly Gly Ala Ser Glu Ala Ser Ala Ala 435 440 445 Asn Gly Ser Asp Asn Lys Leu Lys Thr Glu Val Ser Ser Ser Ile Tyr 450 455 H460 L s Pro Arg Glu Ser Pro Pro Leu Leu Pro Leu Gly Thr Pro 465 470 475 480Cys
<210> 27
<211> 391
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Phe Pro Asn Gly Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro
1 5 10 15 Ser Pro Gly Ser Cys Gly Glu Gly Gly Gly Ser Arg Gly Pro Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Asp Gly Met Glu Glu Pro Gly Arg Asn Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Ser Glu Gly Gln Gly Ser Ala Ile Leu Ile Ser Phe Ile 505560 Tyr Ser Val Val Cys Leu Val Gly Leu Cys Gly Asn Ser Met Val Ile 6570 7580TyrVal Tyr Ala Lys Met Lys Thr Ala Thr Asn Ile Tyr 85 90 95 Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Leu Met Leu Ser Val Pro 100 105 110 Phe Leu Val Thr Ser Thr Leu Leu Arg His Trp Pro Phe Gly Ala Leu 115 120 125 Leu Cys Arg Leu Val Leu Ser Val Asp Ala Val Asn Met Phe Thr Ser 130 135 140 Ile Tyr Cys Leu Val Val LeuValValValValValVale 5 150 155 160 His Pro Ile Lys Ala Ala Arg Tyr Arg Arg Pro Thr Val Ala Lys Val
165 170 175 Val Asn Leu Gly Val Trp Val Leu Ser Leu Leu Val Ile Leu Pro Ile 180 185 190 Val Val Phe Ser Arg Thr Ala Ala Asn Ser Asp Gly Thr Val Ala Cys 195 200 205 Asn Met Leu Met Pro Glu Pro Ala Gln Arg Trp Leu Val Gly Phe Val 210 215 220 Leu Tyr Thr Phe Leu Met Gly Phe Leu Leu Pro Val Gly Ala Ile Cys 225 230 235 240 Leu CyC r Val Leu Ile Ile Ala Lys Met Arg Met Val Ala Leu Lys 245 250 255 Ala Gly Trp Gln Gln Arg Lys Arg Ser Glu Arg Lys Ile Thr Leu Met 260 265 270 Val Met Met Val Val Met Val Phe Val Ile Cys Trp Met Pro Phe Tyr 275 280 285 Val Val Gln Leu Val Asn Val Phe Ala Glu Gln Asp Asp Ala Thr Val 290 All 300 Gall Ley Sale Gallery Asn Pro 305 310 315 320
Ile Leu Tyr Gly Phe Leu Ser Asp Asn Phe Lys Arg Ser Phe Gln Arg 325 330 335 Ile Leu Cys Leu Ser Trp Met Asp Asn Ala Ala Glu Glu Pro Val Asp 340 345 350 Tyr Tyr Ala Thr Ala Leu Lys Ser Arg Ala Tyr Ser Val Glu Asp Phe 355 360 365 Gln Pro Glu Asn Leu Glu Ser Gly Gly Val Phe Aarg Asn Gly Thr CyThrThrThrThrThrThrThrThrThrThrThrThrThrThrThr
385 390
<210> 28
<211> 368
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Ala Asp Ala Gln Asn Ile Ser Leu Asp Ser Pro Gly Ser Val Gly 1 5 10 15 Ala Val Ala Val Pro Val Val Phe Ala Leu Ile Phe Leu Leu Gly Thr 20 25 30 Val Gly Asn Gly Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Gln Pro Gly Pro Ser
35 40 45 Ala Trp Gln Glu Pro Gly Ser Thr Thr Asp Leu Phe Ile Leu Asn Leu 50 55 60 Ala Val Ala Asp Leu Cys Phe Ile Leu Cys Cys Val Pro Phe Gln Ala 65 70 75 80Thr Ile Tyr Thr Leu Asp Ala Trp Leu Phe Gly Ala Leu Val Cys Lys 85 90 95 Ala Val His His Leu Leu Ile Tyr Leu Thr Met Tyr Ala Ser Ser Phe Thr Al Ala Val Ala l Asp Arg Tyr Leu Ala Val Arg His Pro Leu 115 120 125 Arg Ser Arg Ala Leu Arg Thr Pro Arg Asn Ala Arg Ala Ala Val Gly 130 135 140 Leu Val Trp Leu Leu Ala Ala Leu Phe Ser Ala Pro Tyr Leu Ser Tyr 145 150 155 160 Tyr Gly Thr Val Arg Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Cys Val Pro Ala Trp 165 170 175 Glu Asp Ala Arg Arg AlAhAlA AlA LaAlA AlA LaAlA la Gly 180 185 190
Tyr Leu Leu Pro Val Ala Val Val Ser Leu Ala Tyr Gly Arg Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Leu Trp Ala Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Ala Glu 210 215 220 Ala Arg Arg Arg Ala Thr Gly Arg Ala Gly Arg Ala Met Leu Ala Val 225 230 235 240 Ala Ala Leu Tyr Ala Leu Cys Trp Gly Pro His His Ala Leu Ile Leu 245 250 255 Cys Phe Trp PyrAgy Ser Pro Ala Thr Tyr Ala Cys 260 265 270 Arg Leu Ala Ser His Cys Leu Ala Tyr Ala Asn Ser Cys Leu Asn Pro 275 280 285 Leu Val Tyr Ala Leu Ala Ser Arg His Phe Arg Ala Arg Phe Arg Arg 290 295 300 Leu Trp Pro Cys Gly Arg Arg Arg Arg His Arg Ala Arg Arg Ala Leu 305 310 315 320 Arg Arg Val Arg Pro Ala Ser Ser Gly Pro Pro Gly Cys Pro Gly25 330 335 Ala Arg Pro Ser Gly Arg Leu Leu Ala Gly Gly Gly Gln Gly Gly Pro Glu
340 345 350 Pro Arg Glu Gly Pro Val His Gly Gly Gly Glu Ala Ala Arg Gly Pro Glu 355 360 365 <210> 29
<211> 350
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Glu Thr Asn Ser Ser Leu Pro Thr Asn Ile Ser Gly Gly Thr Pro 1 5 10 15 Ala Val Ser Ala Gly Tyr Leu Phe Leu Asp Ile Ile Thr Tyr Leu Val 20 25 30 Phe Ala Val Thr Phe Val Leu Gly Val Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile 354045 Trp Val Ala Gly Phe Arg Met Thr His Thr Thr Thr Thr Ile Ser Tyr 5055 60 LeuPearsAlPeuAlAu r Leu Pro Phe 65 70 75 80
Phe Met Val Arg Lys Ala Met Gly Gly His Trp Pro Phe Gly Trp Phe 85 90 95 Leu Cys Lys Phe Val Phe Thr Ile Val Asp Ile Asn Leu Phe Gly Ser 100 105 110 Val Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ala Leu Asp Arg Cys Val Cys Val Leu 115 120 125 His Pro Val Val Trp Thr Gln Asn His Arg Thr Thr Val Ser Leu Ala Lys Lys 130 135 140 Val Ile Ile Gly ProTrip Thr Leu Pro Val 145 150 155 160Ile Ile Arg Val Thr Thr Val Pro Gly Lys Thr Gly Thr Val Ala Cys 165 170 175 Thr Phe Asn Phe Ser Pro Trp Thr Asn Asp Pro Lys Glu Arg Ile Asn 180 185 190 Val Ala Val Ala Met Leu Thr Val Arg Gly Ile Ile Arg Phe Ile Ile 195 200 205 Gly Phe Ser Ala Pro Met Ser Ile Val Ala Val Ser Tyr Gly Leu 210 2 220 Ala Thr Lys Ile His Lys Gln Gly Leu Ile Lys Ser Ser Arg Pro Leu
225 230 235 240Arg Val Leu Ser Phe Val Ala Ala Ala Phe Phe Leu Cys Trp Ser Pro 245 250 255 Tyr Gln Val Val Ala Leu Ile Ala Thr Val Arg Ile Arg Glu Leu Leu 260 265 270 Gln Gly Met Tyr Lys Glu Ile Gly Ile Ala Val Asp Val Thr Ser Ala 275 280 285 Leu Ala Phe Phe Asn Ser Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Val Phe Met 290 295 300 Gly Gln p Phe Arg Glu Arg Leu Ile His Ala Leu Pro Ala Ser Leu 305 310 315 320Glu Arg Ala Leu Thr Glu Asp Ser Thr Gln Thr Ser Asp Thr Ala Thr 325 330 335 Asn Ser Thr Leu Pro Ser Ala Glu Val Glu Leu Gln Ala Lys 340 345 350 <210> 30
<211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Lys Ala Leu Ile Phe Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Thr Phe Cys Gln Ser Gly Met Glu Asn Asp Thr Asn Asn Leu Ala Lys 20 25 30 Pro Thr Leu Pro Ile Lys Thr Phe Arg Gly Ala Pro Pro Asn Ser Phe 354045 Glu Glu Phe Pro Phe Ser Ala Leu Glu Gly Trp Thr Gly Ala Thr Ile 505560 Thr Girls Lys LyLyles s Leu His Val 65 70 75 80Lys Asn Ala Thr Met Gly Tyr Leu Thr Ser Ser Leu Ser Thr Lys Leu 85 90 95 Ile Pro Ala Ile Tyr Leu Leu Val Phe Val Val Gly Val Pro Ala Asn 100 105 110 Ala Val Thr Leu Trp Met Leu Phe Phe Arg Thr Arg Ser Ile Cys Thr 115 120 125 Thr Val Phe Tyr Thr Asn Leu Ala Ile Ala Asp Phe Leu Phe 130 Vs 130 Vs r Leu Pro Phe Lys Ile Ala Tyr His Leu Asn Gly Asn Asn Trp Val
145 150 155 160Phe Gly Glu Val Leu Cys Arg Ala Thr Thr Val Ile Phe Tyr Gly Asn 165 170 175 Met Tyr Cys Ser Ile Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Ile Asn Arg Tyr 180 185 190 Leu Ala Ile Val His Pro Phe Thr Tyr Arg Gly Leu Pro Lys His Thr 195 200 205 Tyr Ala Leu Val Thr Thr Cys Gly Leu Val Trp Ala Thr Val Val Phe Leu Tyr 210 215 220 MetaL o Phe Phe Ile Leu Lys Gln Glu Tyr Tyr Leu Val Gln Pro 225 230 235 240Asp Ile Thr Thr Cys His Asp Val His Asn Thr Cys Glu Ser Ser Ser 245 250 255 Pro Phe Gln Leu Tyr Tyr Phe Ile Ser Leu Ala Phe Phe Gly Phe Leu 260 265 270 Ile Pro Pro Val Leu Ile Ile Tyr Cys Tyr Ala Ala Ile Ile Arg Thr 275 280 285 Leu Asn Ala Tyr Asp Rip Trap al Lys Ala Ser Leu 290 295 300 Leu Ile Leu Val Ile Phe Thr Ile Cys Phe Ala Pro Ser Asn Ile Ile
305 310 315 320Leu Ile Ile His His Ala Asn Tyr Tyr Tyr Asn Asn Thr Asp Gly Leu 325 330 335 Tyr Phe Ile Tyr Leu Ile Ala Leu Cys Leu Gly Ser Leu Asn Ser Cys 340 345 350 Leu Asp Pro Phe Leu Tyr Phe Leu Met Ser Lys Thr Arg Asn His Ser Ser 355 360 365 Thr Ala Tyr Leu Thr Lys
370
<210> 31
<211> 382
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Gly Pro Thr Ser Val Pro Leu Val Lys Ala His Arg Ser Ser Val 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Val Asn Tyr Asp Ile Ile Val Arg His Tyr Asn Tyr Thr 20 25 30 Gly Lys Leu Asn Ile Ser Ala Asp Lys Glu Asn Ser Ile Lys Leu Thr
35 40 45 Ser Val Val Phe Ile Leu Ile Cys Cys Phe Ile Ile Leu Glu Asn Ile 50 55 60 Phe Val Leu Leu Thr Ile Trp Lys Thr Lys Lys Phe His Arg Pro Met 65 70 75 80Tyr Tyr Phe Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ala Gly Val 85 90 95 Ala Tyr Thr Ala Asn Leu Leu Leu Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Lyng Leu 100 Thr e Leu Arg Glu Gly Ser Met Phe Val Ala Leu 115 120 125 Ser Ala Ser Val Phe Ser Leu Leu Ala Ile Ala Ile Glu Arg Tyr Ile 130 135 140 Thr Met Leu Lys Met Lys Leu His Asn Gly Ser Asn Asn Phe Arg Leu 145 150 155 160 Phe Leu Leu Ile Ser Ala Cys Trp Val Ile Ser Leu Ile Leu Gly Gly 165 170 175 Leu Pro Ile Met Gly Trap Asn CysIl Asy ys Ser 180 185 190 Thr Val Leu Pro Leu Tyr His Lys His Tyr Ile Leu Phe Cys Thr Thr
195 200 205 Val Phe Thr Leu Leu Leu Leu Ser Ile Val Ile Leu Tyr Cys Arg Ile 210 215 220 Tyr Ser Leu Val Arg Thr Arg Ser Arg Arg Leu Thr Phe Arg Lys Asn 225 230 235 240Ile Ser Lys Ala Ser Arg Ser Ser Glu Lys Ser Leu Ala Leu Leu Lys 245 250 255 Thr Val Ile Ile Val Leu Ser Val Phe Ile Ala Cys Trp Ala Pro Leu 260 265 270 Phe Ile u Leu Leu Leu Asp Val Gly Cys Lys Val Lys Thr Cys Asp 275 280 285 Ile Leu Phe Arg Ala Glu Tyr Phe Leu Val Leu Ala Val Leu Asn Ser 290 295 300 Gly Thr Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Leu Thr Asn Lys Glu Met Arg Arg 305 310 315 320 Ala Phe Ile Arg Ile Met Ser Cys Cys Lys Cys Pro Ser Gly Asp Ser 325 330 335 Ala Gly Lys Phe Lys Argy ProIa et Glu Phe Ser Arg 340 345 350
Ser Lys Ser Asp Sern Ser Ser His Pro Gln Lys Asp Glu Gly Asp Asn 355 360 365 365 Pro Glu Thr Thr Me Ser Ser 3 Gy AsnVal
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows new and old correspondences of GenBank registration information of each marker gene and marker protein.

Claims

Heart failure pathogenic marker gene specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOS: 1 to 16, or heart failure specified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 17 to 31, in the sample A method for predicting the disease state of heart failure of the sample provider based on the expression level of the disease state predicting marker protein.

A method for predicting the pathology of heart failure, comprising the following steps 1) to 3):
1) extracting total RNA from each sample containing blood or cardiomyocytes isolated from a subject and a normal person;
2) Prediction of the pathology of heart failure specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 16, between the total RNA extracted from the subject-derived sample and the total RNA extracted from the normal-derived sample Detecting differences in the expression levels of marker genes for use;
3) Analyze the difference in the expression level of each of the above marker genes, and predict the pathology of heart failure in the subject.

A method for predicting the pathology of heart failure, comprising the following steps 1) to 3):
1) extracting total RNA from a sample containing isolated blood or cardiomyocytes;
2) detecting a difference in the expression level of a marker gene for predicting the condition of heart failure between the total RNA derived from the specimen and the total RNA derived from normal myocardial tissue, which is specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 16; Do;
3) Analyze the difference in the expression level of each of the above marker genes, and predict the pathology of heart failure of the sample provider.

The expression level of the marker gene for predicting the condition of heart failure is determined by a nucleic acid hybridization method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, a subtraction method, a differential method using a solid-phased sample selected from a gene chip, a cDNA array, and a membrane filter. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the detection is performed by any one method selected from a display method, a differential hybridization method, and a cross hybridization method.

A method for predicting the pathology of heart failure, comprising the following steps 1) to 3):
1) Immobilize the polypeptide in each sample containing blood or cardiomyocytes isolated from a subject and a normal person, respectively;
2) a marker protein for predicting a disease state of heart failure, which is specified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 17 to 31 in the immobilized polypeptide derived from the subject and the immobilized polypeptide derived from the normal human; Detecting the expression level using an antibody that specifically binds to the marker protein;
3) Analyze the difference in the expression level of each marker protein between the sample derived from the subject and the sample derived from the normal person, and predict the pathology of heart failure in the subject.

A method for predicting the pathology of heart failure, comprising the following steps 1) to 3):
1) immobilizing a polypeptide in a sample containing isolated blood or cardiomyocytes; 2) specifying the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 17 to 31 in the immobilized polypeptide; Detecting the expression level of a marker protein for predicting the pathology of heart failure using an antibody that specifically binds to the marker protein;
3) Analyze the difference in the expression level of each marker protein between the above sample and normal human cardiac muscle tissue, and predict the pathology of heart failure of the sample provider.

The amount of expression of the marker protein for predicting a disease state of heart failure is detected by any one method selected from Western blotting, dot blotting, slot blotting, ELISA, and RIA. The method according to any one of 1, 5, and 6.

A kit for predicting the pathology of heart failure, comprising at least one or more selected from the group consisting of:
a) a continuous oligonucleotide primer having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying a gene specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to b) selected from SEQ ID NOs: 1 to 16 C) a polynucleotide probe having a length of 20 to 1500 bases, which specifically hybridizes to a gene specified by any one of the base sequences to be detected, and the polynucleotide probe described in b) above is immobilized. D) an antibody for specifically binding to a protein specified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 17 to 31, and detecting the protein e) an antibody according to d) above Antibodies that can specifically bind to

A composition for treating heart failure, comprising the gene specified by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the protein identified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20.

Antisense nucleic acid of a gene specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 and SEQ ID NOs: 6 to 16, or any one amino acid selected from SEQ ID NOs: 17 to 19 and SEQ ID NOs: 21 to 31 A composition for treating heart failure, comprising an antibody protein that specifically recognizes and neutralizes a protein specified by a sequence.

A marker gene for predicting a heart failure condition specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 16, or a heart failure predicting condition specified by any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 17 to 31 Testing the effect of the test substance as a therapeutic or prophylactic agent for heart failure by comparing the phenotypic changes that appear when the expression of the marker protein is increased or suppressed with and without the test substance Method.

The method according to claim 11, wherein the phenotypic change is detected as a change in the expression of a reporter gene transcribed in a manner dependent on the expression of a marker gene for predicting a disease state of heart failure.

In a cultured cell or a model animal reflecting a human heart failure condition, a marker gene for predicting the condition of heart failure specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 16, or any one selected from SEQ ID NOs: 17 to 31 Testing the effect of the test substance as a therapeutic or prophylactic agent for heart failure by comparing the expression level of a marker protein for predicting the condition of heart failure identified by the amino acid sequence of Example 1 in the presence and absence of the test substance how to.

14. The method according to any one of claims 11 to 13, wherein the marker gene for predicting the condition of heart failure or the marker protein for predicting the condition of heart failure is an endogenous gene or protein.

14. The method according to any one of claims 11 to 13, wherein the marker gene for predicting the condition of heart failure or the marker protein for predicting the condition of heart failure is an exogenous gene or protein.

A composition comprising a marker gene for predicting a disease state of heart failure specified by any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOS: 1 to 16.

A composition comprising a marker protein for predicting a disease state of heart failure specified by any one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 17 to 31.