JP2003533680A

JP2003533680A - リバースアイソトープ希釈アッセイ及びラクトース不耐性アッセイ

Info

Publication number: JP2003533680A
Application number: JP2001583819A
Authority: JP
Inventors: エー．ワーグナー，デイビッド
Original assignee: メタボリックソリューションズ，インコーポレイティド
Priority date: 2000-05-18
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2003-11-11
Also published as: US20020159950A1; WO2001087352A1; AU2001261394A1; US6902719B2

Abstract

(57)【要約】本明細書でいう「リバースアイソトープ希釈アッセイ」では、一定の代謝物を産生する経路を第二構成経路により産生されるラベル化代謝物の希釈によりアッセイする。一の態様において、本発明はヒトのラクトース消化不良又はラクトース不耐をモニターするための方法に関連する。特に、この方法はラベル化グルコースのリバーストレーサー及び非ラベル化ラクトースを個体に投与し、そして呼息又は血液中のラベル化二酸化炭素を評価することを要する。ラクトースが消化されるなら、ラベル化グルコースにより産生されるラベル化ＣＯ₂ はラクトースの代謝により希釈される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は本明細書でいう「リバースアイソトープ希釈アッセイ」又は「ＲＩＤ
」と称する疾患又は代謝不全を追跡するための新規アッセイに関連する。このア
ッセイにおいては、一定の代謝物を第二の構成経路により産生される同一の代謝
物で希釈することによってアッセイする。より詳しくは、本発明は個体に「リバ
ーストレーサー」分子及び非ラベル化基質分子を同時投与することに関連する。
リバーストレーサー分子及び基質分子は共に当量終点、例えばＣＯ₂ へと代謝さ
れる。しかしながら、「リバーストレーサー」分子は、定義によると、アッセイ
する経路とは異なる速作用性構成経路を介して代謝される。従って、基質分子が
添加され、そして注目の経路が作動すると、このリバーストレーサー代謝物は注
目の経路の作動により希釈される。対照的に、この経路が活性でないと、ラベル
化代謝物は希釈されない。従って、注目の経路の活性はリバーストレーサー分子
の希釈率から決定されうる。

【０００２】一の観点において、本発明はヒトの「ラクトース消化不良」又は「ラクトース
不耐」を追跡するための方法に関する。詳しくは、この方法はトレーサー量のラ
ベル化グルコース及び生理学的又は薬理学的用量の非ラベル化ラクトースを個体
に投与し、そして呼息又は血液中のラベル化二酸化炭素を評価することを要する
。

【０００３】発明の背景二酸化炭素の細胞性代謝の最終産物である。それはヒトにおいて９mmol／kg／
時間の速度で排出される（１）。¹³Ｃラベル化基質からの¹³ＣＯ₂ 産生速度は１
９４０年代頃から細胞、組織、灌流処理した器官及び完全動物において示されて
いる（２）。更に、このアプローチは肝機能、吸収不良、細菌感染症、酵素欠乏
症、膵不全及びタンパク質代謝を測定するための生物医薬において利用されてい
る。

【０００４】 ¹³ＣＯ₂ 呼息検査の原理は、¹³Ｃでラベル化された基質を経口又は静脈内投与
することにある。この基質は活性を測定すべき特定の酵素により攻撃される標的
結合を保有しなくてはならない。¹³Ｃ結合の酵素的切断は律速段階である。最終
的に、¹³Ｃ成分は直接加水分解されるか、又は¹³ＣＯ₂ へと迅速に変換される。

【０００５】現況のＣＯ₂ 検査は一般に大量のラベル化基質を必要とする。放射能ラベルを
基礎とする試験には、患者が放射性物質を消費することを理由に問題がある。廃
棄及び取扱いのコストも放射能ラベルでは高い。非放射能ラベルを採用しても問
題は小さくならず、なぜならラベル化基質は非常に高価であり、従ってかかる試
験のコストを顕著に高めるからである。当業界において必要とされるのは、要求
される感度を損うことなく、代謝試験に必要なラベルの量及びコストを消滅する
方法である。本明細書に記載の発明はこのニーズに応え、またラクトース不耐ア
ッセイに関して例示してはいるが、ＣＯ₂ 呼息検査が利用されるいかなる場合に
も利用されうる。本発明は更にＣＯ₂ 以外の代謝物及び呼息サンプル以外のサン
プルにも利用できうる。

【０００６】ラクトース消化不良は乳の主要糖たるラクトースの有意な量を消化できないこ
とである。この能力の欠如は小腸を覆う細胞により通常産生される酵素ラクター
ゼの不足による。消費されたラクトースの量を消化するのに十分なラクターゼが
ないと、その結果は極めて難儀であり、そして子供の間では危険な脱水症をもた
らしうる。一般的な症状には吐き気、けいれん、鼓脹、放屁及び下痢が挙げられ
、それはラクトース含有食品を食して又は飲んでから約３０分〜２時間で開始す
る。この症状の症度は各個体が寛容しうるラクトース量に応じて変わる。

【０００７】腸内酵素ラクターゼ（β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）はラクトースの代謝を司る
。誕生時では、ヒトは小腸内に大量のラクターゼ活性を有するが、たいていの民
族ではこの活性は３〜５才の幼児期において著しく低下する。ラクターゼ欠乏症
の状態では、ラクトースは小腸を代謝されないまま通過し、浸透圧により大量の
水を引き込む。次にラクトースは大腸を通過し、そして結腸細菌により発酵する
。浸透圧及び発酵といったこの２つの過程を介し、ラクトース消化不良に伴う典
型的な症状、例えば鼓脹、けいれん、過剰な放屁及び重篤な下痢が誘導される。

【０００８】乳及びその他の乳製品は米国の食餌における栄養素の主要源である。このよう
な栄養素のうち最も重要なのはカルシウムである。カルシウムは成長及び生涯の
骨修復にとって必須であるが、発育齢の間特に関心がもたられる。中年及び高齢
期では、カルシウムの欠乏は骨粗しょう症として知られる細くて脆い骨をもたら
しうる。従って、ラクトース消化不良についての子供及び成人の双方の関心は、
乳をわずかに又は全く含まない食餌で十分なカルシウムを獲得することにある。

【０００９】乳不耐と自己報告する者のほぼ５０％は消化不良者ではないことが示されてい
る（１〜３）。その代わり、彼らは機能性腸疾患、例えば刺激性腸症候群（ＩＢ
Ｓ）、小児の再発性胃痛（ＲＡＰ）又はその他の胃腸合併症に苦しむ。このよう
な自己報告乳不耐においては、乳消費の顕著で不必要な低下及び不十分な食餌カ
ルシウム摂取があることが見い出されている（４）。

【００１０】ラクトース消化不良は比較的治療し易い。ラクターゼを産生する身体能力を高め
る治療の存在しないが、この症状は制御できる。低ラクトース又はラクトースフ
リーでさえもある多くの食品が現在入手できる。更に、ラクターゼのかむことの
できる錠剤であって、ラクトース含有食の直前に食すると多くの症状を軽減でき
るものが処方箋なしで入手できる。

【００１１】しかしながら、このような提唱されている治療法及び矯正法は全て真にラクト
ース消化不良の者（酵素ラクターゼの真に欠乏した者）に対してのみ有用である
。例えば刺激性腸症候群（ＩＢＳ）に苦しんでいるガラクターゼ欠乏症として誤
診された者の場合、錠剤の形態でのラクターゼの付与又はラクトースフリー乳製
品への変更はその症状を軽減しないであろう。更に、消化不良者であるとの誤ま
った印象のもとで乳製品を拒否している自己治療者は骨成長不良及び修復不良、
骨粗しょう症、及びその食餌からの乳製品の不必要な排除に由来するその他の症
状の危険に自ら陥っている。

【００１２】ラクトース消化不良の診断は食餌からの乳（及び乳製品）の排除に結びついた
インタビュー工程、臨床検査及び空腸生検採取を頼りとする。我々は各規準の様
子を簡単に説明する。

【００１３】インタビュー工程では患者にその胃腸症状の履歴及びその乳摂取との関係を尋
ね、それは簡単に実施でき、安価である。それはまた全体的に単純化されすぎて
おり、またかなり不正確である。まず、乳不耐と自己報告する者のほぼ５０％が
正常なラクトース消化者であり、そして第二に、ラクターゼ欠乏症の者の７０％
が（徴候的であるにもかかわらず）ラクトース又は「乳糖」の摂取に対するこの
疾患の広い胃腸徴候とは相関しなかった（７）。

【００１４】数多くの臨床検査がラクトース消化不良の評価のために有用である。最もよく
挙げられる検査は水素呼息検査、ラクトース寛容検査及び便酸性検査である。水
素呼息検査は呼息中の水素の量を測定する。通常、呼息には非常にわずかな水素
しか検出されない。しかしながら、ラクトース消化不良者の場合、ラクトースは
未代謝のまま結腸を通過し、そこで細菌はそれを発酵させ、そして水素を含む様
々な気体が生成される。水素は腸内から吸収され、血流を通って肺にまで運ばれ
、そして排出される。この検査では、患者はラクトース入り飲料を飲まされ、そ
して呼息が数時間かけて規則的な間隔で分析される。呼息内の水素のレベルの上
昇はラクトースが適正に消化されなかったことを示唆する。

【００１５】水素呼息検査の結果の解釈は様々な要因によって不明瞭となりうる。まず、消
化不良者の５〜２０％は水素を産生せず、検査の感度を下げてしまう（８）。非
産生者の相当なパーセンテージは小児において見い出せる（９）。これは水素を
産生できる微生物叢を有しないこと又はメタンを産生するための水素の利用のい
ずれかによる。第二に、信頼できる検査のためには、検査の朝に歯をみがいては
いけない、検査中に喫煙、睡眠又は興奮してはいけない等の慎重な患者の準備が
絶対的に必要である（１０）。また、検査前１ケ月、機械的腸洗浄又は抗生物質
の使用があってはならず、なぜなら両者は結腸細菌のタイプ及び量に影響を及ぼ
すからである（１０）。最後に、検査の前夜は低炭水化物、低ファイバー食品が
要求される。このような推奨からの任意の逸脱は検査を損ってしまう。

【００１６】ラクトース寛容検査においては、絶食させた個体（＞１０時間食事抜き）に大
量のラクトース負荷を含む液体（一般には１リットルのミルクのラクトース含量
に相当する２ｇ／kgから最大５０ｇ）を与える。血液サンプルを２時間の間に何
回か採取し、患者の血液グルコース値を測定する。この結果を患者がどの程度ラ
クトースを消化するかの指標として用いる。

【００１７】ここでも、この検査方法にはいくつかの欠点がある。この検査はラクトースの
超生理学的用量を利用し、このことは正常な乳又は乳製品の摂取への普遍化に疑
問を投げかける。それはグルコース濃度を測定するために２時間にわたる最低４
本の刺針を要し、また絶食状態に対する患者の合意を強制する。更に、それは低
い特異性に悩まされ（１３％の偽陽性が報告されている）、その理由は平坦化し
た応答が小腸疾患に由来する欠陥グルコース吸収からの微分を要求するからであ
る（１１）。医療文献では、偽陰性及び偽陽性結果に基づき、「ラクトース負荷
後の血液グルコースのルーチン評価は小児及び成人における有用な測定値ではな
く、従って廃棄すべきである」と提唱されている（１２）。

【００１８】最近の研究で、水素呼息検査及びラクトース寛容検査の双方を利用して検査し
た３００人の対象者のうちの４０％において、この二通りの検査が一致しなかっ
た（１３）。しかしながら、この研究は水素呼息検査がラクトース吸収不良を有
し、その徴候を有すると思われる個体を同定するのに良いことを示唆している。

【００１９】このような２通りの診断検査における必要とされるラクトース負荷及びラクト
ース誘導下痢による脱水に由来する付随の危険性に基づき、それらは幼児及び非
常に若い子供では一般に利用されない。幼児及び低齢児はその代わりに便酸性検
査を受けることがある。結腸内の細菌により発酵される未消化のラクトースは、
便サンプルの中で検出されうる乳酸及びその他の短鎖脂肪酸を生成する。この検
査は完全にラクトース支配されている食餌（例えば乳児食又は母乳）においての
み有効であり、そして幼児のラクトース消化不良の割合は極めて低いため、往々
にして利用されない。

【００２０】空腸生検採取は患者のラクターゼ活性のレベルを確立するための有効な方法で
ある。しかしながら、それは極めて侵襲性であり、またまれにしか利用されない
。ラクトース消化不良は危険な身体状態ではないと一般に考えられているため、
かかる高価で侵襲性で、また快くない手順は有用な選択肢ではない。

【００２１】従って、当業界において必要とされるのは、非侵襲性で、安価で正確な、信頼
でき、高感度なラクトース不耐検査である。ラクトース不耐との関係で本明細書
において例示するリバースアイソトープ希釈検査はこのニーズに応える。

【００２２】発明の概要略語及び定義リバーストレーサー：第二構成経路のためのラベル化基質；本明細書では、ラ
クトース不耐ＲＩＤに用いたとき、¹³Ｃ−グルコースとして例示。

【００２３】リバーストレーサー代謝物：第二構成経路におけるリバーストレーサーの代謝
により産生されるラベル化代謝物。

【００２４】ＲＩＤ：リバースアイソトープ希釈。本明細書記載のアッセイであり、ここで
第一酵素が、この第一酵素及び第二構成酵素の双方により産生されるラベル化代
謝物の希釈によりアッセイされる。

【００２５】基質：注目の酵素により代謝され、リバーストレーサーの代謝により産生され
るものと同じ代謝物を産生するラベルされていない基質分子。本明細書ではラク
トース不耐ＲＩＤにおいてラクトースで例示。

【００２６】本発明は下記の通りに一般的に記載できるリバースアイソトープ希釈アッセイ
である：アッセイすべき第一酵素を、第一酵素（又はこの第一酵素の下流）によ
り産生される測定可能な代謝物の希釈効果によって定量する。その代謝物は第二
酵素（又は酵素経路）の作用により産生されるものと同一の代謝物である。リバ
ーストレーサーをこの第一酵素に特異的な基質と一緒に同時投与する。このリバ
ーストレーサー分子はこの第二経路に特異的なラベル化基質分子であり、そして
第二酵素及び／又は経路により迅速且つ構成的に代謝されてラベル化成分を産生
する。かくして、このラベル化分子が希釈されることは、第一経路が活性である
ことを意味する。希釈されないということは、第一酵素が活性でないことを意味
する。ラベル化代謝物の典型的な希釈曲線を図１に示す。

【００２７】本発明はラクトース不耐アッセイに関して例示するが、一般にはラベル化炭酸
水素塩の排出を追跡することによってその足跡を追跡できる任意の疾患に適用で
きうる。かかる検査には、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
ｐｙｌｏｒｉ）呼息検査（ラベル化尿素を基準）；ヒト肝グリコーゲン代謝物
呼息検査（天然¹³Ｃ濃厚炭水化物を使用）；胃空洞化検査（ラベル化オクタン酸
塩又は酢酸塩を基準）；化学療法呼息検査（ラベル化エリトロマイシンを基準）
；細菌過剰増殖検査（ラベル化キシロース又はソルビトールを基準）；肝機能呼
息検査（例えばラベル化アミノピリン、メチオニン又はフェニルアラニンを基準
）；並びに膵充足呼息検査（ラベル化された混合トリグリセリド又はコーンスタ
ーチを基準）。

【００２８】我々は、吸息中のＣＯ₂ の測定に基づくラクトース不耐アッセイＲＩＤにおい
て利用するための¹³Ｃ−グルコースリバーストレーサーとラクトースとの組合せ
を示した。例えば、¹³Ｃ−酢酸塩リバーストレーサー及びフルクトース基質をフ
ルクトース吸収不良ＲＩＤＣＯ₂ 呼息検査において組合せてよい。エリトロマ
イシン呼息検査は¹³Ｃ−酢酸塩及び非ラベル化エリトロマイシンの利用によりＲ
ＩＤへと変換できうる。ヘリコバクター・ピロリＣＯ₂ 呼息検査はラベル化¹³Ｃ
−グルコース及び非ラベル化尿素の利用によりＲＩＤに適用することもできる。
以下の表はＲＩＤ検査の追加の例を供する。

【００２９】

【表１】

【００３０】上記の表は¹³Ｃ−酢酸塩、¹³Ｃ−グルコース又は¹³Ｃ−炭酸水素塩がリバース
トレーサーとして働くであろうことを示す。いくつかの検査に関し、これらの基
質の一つは価格又は生化学的理由のために好適でありうる。その他の¹³Ｃリバー
ストレーサー、例えば¹³Ｃ−グリシン、¹³Ｃ−オクタン酸塩、¹³Ｃ−パルミチン
酸塩、¹³Ｃ−ギ酸塩、¹³Ｃ−プロピオン酸塩及び¹³Ｃ−尿素が本発明において有
効であろう。しかしながら、それらのコストははるかに高い。

【００３１】リバーストレーサーは一般に非放射能安定アイソトープでラベルされて放射能
廃棄有害物質及び患者の曝露を最少限となるようにされているが、その他のアイ
ソトープを使用してもよい。一般に、¹³Ｃアイソトープが好ましいが、 ²Ｄ，¹⁵ Ｎ，³⁴Ｓ等も測定すべき代謝物のために適宜利用されうる。酸素ラベル化基質が
別の可能性であるが、¹⁸Ｏ基質の使用は非現実的といえるほどに高いことがある
。

【００３２】本発明は炭酸水素塩以外の代謝物のリバースアイソトープ検出を含むように広
げることもできる。例えば、それは呼息の中のＮ₂ 気体、又は血液もしくは尿中
のＮＨ₃ もしくは尿素の検出と結合させて¹⁵Ｎ−ラベル化基質のために採用する
ことができる。例えば、ヘリコバクター・ピロリ呼息検査は、尿中のラベル化Ｎ
Ｈ₃ の検出に結びつけて、ラベル化¹⁵Ｎ−アンモニア又は¹⁵Ｎ−アンモニウム塩
及び非ラベル化尿素の利用により、ＲＩＤに適用させることもできる。同様に、
この方法は呼息の中の ²Ｈの検出に結びつけて、重水素化基質を伴って採用する
ことができる。ラクトース不耐、細菌過剰増殖及び小腸での食品の急速通過は全
て水素呼息検査によりアッセイできる。

【００３３】呼息又は血液中のラベル化代謝物、例えばＣＯ₂ の測定はアイソトープを検出
できる装置、例えばマススペクトル、レーザー支援スペクトル、赤外線スペクト
ル又はその他のスペクトル測定装置によって行うことができうる。更に、この方
法は連続モニターによるＣＯ₂ のアイソトープ測定を含む（Katzman ら、ＵＳ６
１８６９５８）。

【００３４】本明細書においてはアッセイを呼息検査として例示するが、血液、糞、唾液、
尿又はその他の体液検体検査も、適正なリバーストレーサーと基質との組合せを
選定することを条件に、実施できる。

【００３５】本発明は更にヒトのラクトース消化不良又はラクトース不耐の評価のための方
法及びキットも提供する。この方法は上述の通りであり、そしてこのキットは少
なくともラベル化トレーサー及び非ラベル化基質を含む。このキットは更にサン
プル集収具、例えば呼息集収具、及び使用説明書を含んでもよい。集収具、例え
ば呼息、血液及び尿集収具は当業界において周知であり、そして本明細書ではあ
えて説明しない。

【００３６】ＲＩＤ技術の主たる利点の一つは医療診断検査のコストの低下にある。例えば
、ラクトース消化不良の診断において、¹³Ｃ−ラクトースをラクターゼ酵素活性
の直接的な測定のために投与してよい。しかしながら、¹³Ｃ−ラクトースは二糖
であるが故に合成するのが非常に高価なトレーサーである。ＲＩＤ系検査におい
て¹³Ｃ−グルコース及び非ラベル化ラクトースを使用すると、検査当りのコスト
は数ドルだけとなり、それに比べ通常の¹³Ｃ−ラクトース系検査では１００ドル
超である。

【００３７】本発明の一の態様は対象者の酵素活性をアッセイする方法である。この方法は
対象者に有効量のリバーストレーサーを投与することを含んで成り、ここで当該
リバーストレーサーは対象者により構成的に代謝されてラベル化代謝物を生み出
すラベル化分子である。対象者には有効な量の非ラベル化基質が同時投与され、
ここで当該基質はアッセイすべき酵素により特異的に代謝され、そしてこの基質
はこの酵素により代謝され、先の段階に由来する代謝物と同一の非ラベル化代謝
物を生み出す。検体を対象者から集め、そして検体中のラベル化代謝物の量を測
定して、当該対象者の当該酵素の活性を決定する。この方法は更にラベル化代謝
物の量を標準と比較し、この比較は酵素活性の規準を供し、そしてこの標準は健
康な対象者のコントロール集団により産生されるラベル化代謝物の平均量となる
。

【００３８】別の態様において、この方法は上記と似かよった工程を利用して対象者の代謝
不全を評価する方法である。リバーストレーサー、基質及び代謝不全は明細書を
通じて説明した通りであり、そして表１に列挙する。一の特定の態様において、
リバーストレーサーはラベル化グルコースであり、基質はラクトースであり、そ
してこのＲＩＤはラクトース不耐のためである。別の態様において、リバースト
レーサーはラベル化グルコースであり、基質はフルクトースであり、そしてＲＩ
Ｄはフルクトース吸収不良のためである。

【００３９】発明の詳細な説明

【００４０】ここでは、ラベル化トレーサーと非ラベル化プローブとを組合せることにより
酵素速度を直接測定するリバースアイソトープ希釈（ＲＩＤ）を利用するラクト
ース消化不良評価方法を提供する。この方法はリバーストレーサーとしての１−¹³ Ｃ−グルコース（２５〜１０００mg）及び検査基質としての非ラベル化ラクト
ース（５００mg〜１００ｇ）の同時投与を利用する。非ラベル化ラクトースは、
後に二酸化炭素へと直ちに変換されるグルコース及びガラクトースへと代謝され
る。投与されたＩ−¹³Ｃ−グルコースも¹³ＣＯ₂ へと直ちに代謝される。

【００４１】呼息又は血液中の¹³ＣＯ₂ の希釈値はラクターゼ酵素活性の指標となる。ラク
トース消化不良者の場合、１−¹³Ｃ−グルコーストレーサーは呼息の中で¹³ＣＯ₂ として希釈されないままのようであろう。即ち、呼息検査の結果は、消化不良
者の場合、ラクトースを投与したときとしないときとで同じであろう。これは消
化不良者の場合、グルコース及びガラクトースへと変換されるラクトースはほと
んどないからである。他方、正常な消化者は検査で与えられたラクトース負荷か
ら非ラベル化ＣＯ₂ を生成するであろう（グルコース及びガラクトースを介する
プロセシングを経て）。この検査は、呼息中の１−¹³Ｃ−グルコースリバースト
レーサーから生じる¹³ＣＯ₂ 増幅を介して消化されたラクトースの量を測定する
ことによりラクトース消化不良の度合いを示す。

【００４２】この方法は更に、前記ラベル化された二酸化炭素の量と標準との対比を含んで
成り、かかる対比はラクトース消化不良の規準を供する。この標準はラクトース
消化不良又はラクトース不耐のないコントロール集団におけるＣＯ₂ の平均アイ
ソトープ値を含んで成る。

【００４３】以下の実施例は本発明の特定の態様を例示するが、本発明の範囲を限定するも
のではない。

【００４４】実施例１．検査における投与呼息検査は全て最短で８時間の絶食の後に実施する。検査基質の投与の前に、
基底呼息サンプルを気胞気体集収システム（ＱＵＩＮＴＲＯＮＧＡＳＡＭＰＬ
ＥＲＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮＢＡＧ^TM，ＱＵＩＮＴＲＯＮＩＮＳＴＲＵＭＥ
ＮＴＣＯＭＰＡＮＹ^TM，Milwaukee, Wisconsin）を用いて集める。対象者に２
５０mlの水道水中の２５ｇのオレンジ風味ラクトースを含む１０％水性ラクトー
ス溶液（ＱＵＩＮＴＲＯＮＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＣＯＭＰＡＮＹ^TM）を投与
する。ラクトースに加えて、対象者にこの水性ラクトース溶液に添加された１０
０mgの１−¹³Ｃ−グルコース（ＣＡＭＢＲＩＤＧＥＩＳＯＴＯＰＥＬＡＢＯ
ＲＡＴＯＲＩＥＳ^TM，Andover, Massachusetts）を消費させる。最終気胞呼息サ
ンプルを０，６０及び９０分目での二酸化炭素中の¹³Ｃの富化について評価する
。

【００４５】実施例２．炭酸水素塩測定呼息貯蔵チューブ内の¹³ＣＯ₂ の量をＥＵＲＯＰＡＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ^TM ２０／２０ガスアイソトープ比質量スペクトルメーター（ＥＵＲＯＰＡＳＣ
ＩＥＮＴＩＦＩＣ^TM，Cincinnati, OH）により測定する。サンプル中の¹³ＣＯ₂
、対、¹²ＣＯ₂ （質量４５、対、４４）の比を測定し、そして対照気体（５％の
ＣＯ₂ 、残り７５％のＮ₂ 、２０％のＯ₂ ）と対比させる。対照気体は国際標準
で較正する。測定単位は原子％¹³Ｃとし、そして以下の通りに規定される：

【００４６】原子％¹³Ｃ＝¹³ＣＯ₂ ／（¹³ＣＯ₂ ＋¹²ＣＯ₂ ）★１００％

【００４７】前後に３通りのレベルの％¹³Ｃでの二酸化炭素気体の標準を毎日流しておき、
装置の性能を検査しておく。装置の分析精度は０．０００１原子％¹³Ｃである。

【００４８】各呼息サンプルの原子％¹³Ｃ値を、各期間内での呼息中に回収された用量のパ
ーセントを計算するために用いる。各期間についての曲線下面積（ＡＵＣ）は線
形台形法（ｌｉｎｅａｒｔｒａｐｅｚｏｉｄｍｅｔｈｏｄ）により、期間中
の２つの時点の原子％¹³Ｃを利用して計算する。各期間内で代謝される用量のパ
ーセントを以下の通りに計算される：

【００４９】総¹³Ｃ排出（mmol）＝％¹³Ｃ（ＡＵＣ）×ＣＯ₂ 産生mmol／min ×時間ここでＣＯ₂ は５mmol／min ／ｍ² ×体表面積（ｍ² ）により見積られ、％用量代謝＝総¹³Ｃ排出（mmol）／用量（mmol）×１００％である。

【００５０】実施例３．検査の確認一次調査は検査の有効性を確立した。１８才超の１２０人の対象者（男性５１
人、女性６９人）をラクトース消化不良について評価した。各対象者を一夜の絶
食を経て二通りの状況で検査した。対象者に身体検査を受けさせ、そして乳製品
の消費についての彼らの経験に関するインタビューを受けさせた。１日目に、１
００mgの用量のＤ−グルコース（Ｉ−¹³Ｃ、９９％）（ＣＡＭＢＲＩＤＧＥＩ
ＳＯＴＯＰＥＬＡＢＯＲＡＯＴＲＩＥＳ^TM，Andover, MA ）を水道水で２５ml
に希釈した。５０ｇの用量のラクトース（ＱＵＩＮＴＲＯＮ，ＩＮＣ^TM，Milwau
kee WI）と同時に投与した。¹³ＣＯ₂ ／¹²ＣＯ₂ 比の測定のために呼息サンプル
を投与から５，１５，３０，４５，６０，７５，９０，１０５及び１２０分目に
て集めた。サンプルをＦＩＮＮＩＧＡＮＢＲＥＡＴＨＭＡＴＰＬＵＳ^TMガス
アイソトープ比分析器で排出されたＣＯ₂ の¹³Ｃ／¹²Ｃ比について分析した。呼
息検査結果は全て時間当りに代謝された％用量へと換算した。

【００５１】同時に、水素呼息検査（ＱＵＩＮＴＲＯＮ，ＩＮＣ．^TM，Milwaukee WI）及び
ラクトース寛容検査（血液グルコース値）を標準プロトコールに従って行った。
更に、ラクトース消化の別の規準として尿内のガラクトースレベルの測定のため
に尿を集めた。翌日（２日目）、実験を繰り返したが、ラクトース負荷を５０ｇ
から２５ｇに変えた。

【００５２】次のデーターの分析に対する主たる制限はラクトース吸収不良の診断のための
「黄金の標準」の不在である。最も信頼できる検査でさえも、水素呼息検査は８
５％に未たない精度を報告する。従って、新しい検査は、たとえ完全に正確であ
ったとしても、黄金の標準（８５％）を超える精度評点を有すことができない。
我々の研究の場合、この制約を解決する試みにおいて、ラクターゼ状態の診断を
、対照の方法を全て組合せ、そして主要診断見解に基づく結果のコレクションか
ら統一診断を得ることにより（３通りの検査のうち２つ）、決定した。ラクトー
ス消化不良呼息検査（ＬＭＢＴ）及び各対照方法（水素呼息検査、血液グルコー
ス検査及び尿性ガラクトース）を個別にこの統一診断に対して評価した。性能特
徴を以下の表２に示す。注意すべきことに、２５ｇの水素呼息検査は５９人の対
象者に対してだけ行い、他の検査は１２０人の対象者に対して実施した。

【００５３】

【表２】

【００５４】サンプルは１５分毎に集めたが、我々は精度を失うことなく基底値、６０分及
び９０分のサンプルだけを用いてラクトース消化者を消化不良者から区別できた
。検査が６０分目にて陽性なら、理論的に検査は止めてよい。検査が９０分以内
で完了できるという事実は、結腸微生物叢により代謝されるグルコースに関わる
潜在的な問題を阻止する。一般に腸通過又は口〜旨端時間は通常７５分以上であ
る。

【００５５】成人でのこれらの研究に基づき、以下のカットオフ値をラクトース吸収不良の
規定に用いることができる：６０分目にて、１．５０％超の¹³Ｃグルコース代謝９０分目にて、４．５０％超の¹³Ｃグルコース代謝１２０分目にて、７．５０％超の¹³Ｃグルコース代謝

【００５６】実施例４．フルクトース吸収不良ＲＩＤ完全に確認はできていないが、ＲＩＤはフルクトース吸収不良呼息検査につい
て例示した。この検査においては、患者にラベル化酢酸塩及び非ラベル化フルク
トースを同時投与した。患者がフルクトースを吸収及び利用できないなら、¹³Ｃ
Ｏ₂ レベルは高いままであり、正常患者では¹³ＣＯ₂ レベルは非ラベル化フルク
トースの同時吸収及び代謝により希釈される。

【００５７】図３は２５のフルクトースを伴って及び伴わないで１００mgのナトリウム１−¹³ Ｃ−酢酸塩の投与された１人の対象者の結果を示す。このグラフは単位時間当
りの二酸化炭素に対する代謝された酢酸塩のパーセントのプロットを示す。この
対象者では、フルクトースを吸収され、そしてそれ自体二酸化炭素へと変換され
るので、それは呼息二酸化炭素内で出現する¹³Ｃの量を希釈する。フルクトース
を吸収しない対象者の場合、２本の呼息¹³Ｃ排出曲線は同じであろう。

【００５８】各文献を便宜上ここに挙げ、それらは引用することで本明細書に組入れる。

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＯ₂ 希釈曲線（ラクトース不耐）。

【図２】ＲＩＤ概念の模式図。

【図３】ＣＯ₂ 希釈曲線（フルクトース消化不良）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】対象者の酵素活性をアッセイする方法であって：ａ）対象者に有効量のリバーストレーサーを投与し、ここで当該リバーストレ
ーサーは対象者により構成的に代謝されてラベル化代謝物を産生するラベル化分
子であり；ｂ）前記対象者に有効量の非ラベル化基質を投与し、ここで当該基質はアッセ
イする酵素により特異的に代謝され、そして当該基質は当該酵素により代謝され
て工程ａ）由来の代謝物と同一の非ラベル化代謝物を産生し；ｃ）前記対象者から検体を集め；そしてｄ）前記検体中の前記ラベル化分子の量を測定し、前記対象者の前記酵素の活
性を決定する、ことを含んで成る方法。
【請求項２】対象者の代謝不全を評価する方法であって：ａ）対象者に有効量のリバーストレーサーを投与し、ここで当該リバーストレ
ーサーは対象者により構成的に代謝されてラベル化代謝物を産生するラベル化分
子であり；ｂ）前記対象者に有効量の非ラベル化基質を投与し、ここで当該基質はアッセ
イする酵素により特異的に代謝され、そして当該基質は当該酵素により代謝され
て工程ａ）由来の代謝物と同一の非ラベル化代謝物を産生し；ｃ）前記対象者から検体を集め；そしてｄ）前記検体中の前記ラベル化分子の量を測定し；そしてｅ）前記検体中のラベル化代謝物の量を標準と対比させ、ここで当該標準から
の偏差は当該対象者の代謝不全を示唆し、そして当該標準は健康な対象者のコン
トロール集団により産生されるラベル化代謝物の平均量である、工程を含んで成る方法。
【請求項３】ラクトース不耐の検査のためのキットであって、ラベル化リ
バーストレーサー分子のサンプル、ラクトースのサンプル、及び任意的に呼息集
収具を含んで成るキット。
【請求項４】前記ラベル化リバーストレーサーが１−¹³Ｃ−グルコースで
ある、請求項３記載のキット。
【請求項５】前記ラベル化リバーストレーサーが均一にラベル化された¹³ Ｃ₆ −グルコースである、請求項３記載のキット。