JP2003532641A - 糖尿病を予防し又は治療する方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
患者の糖尿病を予防し、その発症を遅延させ又は治療する方法であって、糖尿病を患っていることが疑われるか、糖尿病になりつつあるか、又は糖尿病である患者を選択し、分泌型ルシフェラーゼ又はヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼの分泌型のような分泌型外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬剤の一回以上の患者への投薬をなす、ことを含む方法。
Description
【０００１】
（連邦支援研究又は開発に関する陳述）
この発明は合衆国陸軍省のナショナル・メディカル・テクノロジー・テストベ
ッド・インクとの協力協定番号ＤＡＭＤ１７-９７-２-７０１６で米国政府の支
援の下になされた。米国政府はこの発明に一定の権利を有する。 （関連出願とのクロスリファレンス） 本出願は２０００年４月１７日に出願された「糖尿病の防止方法」と題された
米国特許出願第６０／１９８１３７号の優先権を主張しており、その全体を出典
明示によりここに取り込むものである。
ッド・インクとの協力協定番号ＤＡＭＤ１７-９７-２-７０１６で米国政府の支
援の下になされた。米国政府はこの発明に一定の権利を有する。 （関連出願とのクロスリファレンス） 本出願は２０００年４月１７日に出願された「糖尿病の防止方法」と題された
米国特許出願第６０／１９８１３７号の優先権を主張しており、その全体を出典
明示によりここに取り込むものである。
【０００２】
（背景）
糖尿病は合衆国においてまた全世界において主要な罹患及び死亡原因である。
糖尿病は糖（グルコース）を代謝する能力の欠如を特徴とする代謝病であって、
一般に二つのタイプに分類される。二つのタイプのうち、１型糖尿病は青年期で
の膵臓β細胞の自己免疫破壊から通常生じ、インスリンの生成が不十分になる。
糖尿病は糖（グルコース）を代謝する能力の欠如を特徴とする代謝病であって、
一般に二つのタイプに分類される。二つのタイプのうち、１型糖尿病は青年期で
の膵臓β細胞の自己免疫破壊から通常生じ、インスリンの生成が不十分になる。
【０００３】
１型糖尿病の原因と治療の研究では非ヒト動物が使用されることがよくある。
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは１型糖尿病を研究するために一般に受け入れら
れている一つの動物モデル系であるが、これはＮＯＤマウスでは、主要組織適合
複合体分子のような一般的な感受性因子を共有することを含む、ヒトの１型糖尿
病に匹敵する糖尿病の形態が進行するからである。ＮＯＤマウスとヒトの研究に
より、膵臓β細胞によって合成される二つのタンパク質が糖尿病の発症の原因と
なる自己抗原として決定的な役割を担っていることが示された。その二つのタン
パク質とはインスリンホルモンという分泌型タンパク質と、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ（ＧＡＤ）酵素という、β細胞に可溶型ＧＡＤ６７か膜結合型ＧＡ
Ｄ６５として見出される細胞内タンパク質である。ＮＯＤマウスにおける糖尿病
の発症に対するこれら二つの自己抗原の重要性は、大体の病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞
が単一のインスリンエピトープを認識し、β細胞特異的に減少したｇａｄ６５／
６７遺伝子を持つマウスが糖尿病にならないという知見に示されている。ヒトで
は、抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の存在によって糖尿病の発症を予測してい
る。しかし、ヒトにおいて糖尿病を予防する方法がなお必要とされている。
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは１型糖尿病を研究するために一般に受け入れら
れている一つの動物モデル系であるが、これはＮＯＤマウスでは、主要組織適合
複合体分子のような一般的な感受性因子を共有することを含む、ヒトの１型糖尿
病に匹敵する糖尿病の形態が進行するからである。ＮＯＤマウスとヒトの研究に
より、膵臓β細胞によって合成される二つのタンパク質が糖尿病の発症の原因と
なる自己抗原として決定的な役割を担っていることが示された。その二つのタン
パク質とはインスリンホルモンという分泌型タンパク質と、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ（ＧＡＤ）酵素という、β細胞に可溶型ＧＡＤ６７か膜結合型ＧＡ
Ｄ６５として見出される細胞内タンパク質である。ＮＯＤマウスにおける糖尿病
の発症に対するこれら二つの自己抗原の重要性は、大体の病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞
が単一のインスリンエピトープを認識し、β細胞特異的に減少したｇａｄ６５／
６７遺伝子を持つマウスが糖尿病にならないという知見に示されている。ヒトで
は、抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の存在によって糖尿病の発症を予測してい
る。しかし、ヒトにおいて糖尿病を予防する方法がなお必要とされている。
【０００４】
（概要）
本発明においては、患者の糖尿病を予防し、その発症を遅延させ又は治療する
方法が提供される。該方法は、糖尿病を患っていることが疑われるか、糖尿病に
なりつつあるか、又は糖尿病である患者を選択することを先ず含む。次に、患者
に、分泌型外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬剤（医薬薬
剤）の一回以上の投薬がなされる。 好適な実施態様では、患者の選択は、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体ある
いは抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在を患者において同定すること
、又は増加する高血糖の存在を患者において同定すること、又は糖尿の存在を患
者において同定すること、又は糖尿病に対する遺伝的素因の存在を患者において
同定することを含む。特に好適な実施態様では、一回以上の投薬は複数回の投薬
である。他の特に好適な実施態様では、一回以上の投薬を患者になすことは、一
回以上の投薬を患者に筋肉注射することを含む。他の好適な実施態様では、本方
法は、投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすることを含む。 特に好適な実施態様では、外因性タンパク質は配列番号：１又は配列番号：３
の配列を有する分泌型レニラルシフェラーゼである。
方法が提供される。該方法は、糖尿病を患っていることが疑われるか、糖尿病に
なりつつあるか、又は糖尿病である患者を選択することを先ず含む。次に、患者
に、分泌型外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬剤（医薬薬
剤）の一回以上の投薬がなされる。 好適な実施態様では、患者の選択は、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体ある
いは抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在を患者において同定すること
、又は増加する高血糖の存在を患者において同定すること、又は糖尿の存在を患
者において同定すること、又は糖尿病に対する遺伝的素因の存在を患者において
同定することを含む。特に好適な実施態様では、一回以上の投薬は複数回の投薬
である。他の特に好適な実施態様では、一回以上の投薬を患者になすことは、一
回以上の投薬を患者に筋肉注射することを含む。他の好適な実施態様では、本方
法は、投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすることを含む。 特に好適な実施態様では、外因性タンパク質は配列番号：１又は配列番号：３
の配列を有する分泌型レニラルシフェラーゼである。
【０００５】
本発明の上記の特徴及びその他の特徴、側面及び効果は次の説明、特許請求の
範囲及び添付図面を参照すると一層理解される。
範囲及び添付図面を参照すると一層理解される。
【０００６】
（説明）
本発明の一実施態様では、ヒト又は動物において１型糖尿病の発症を遅延させ
又は１型糖尿病を防止する方法が提供される。該方法は、糖尿病を患っているこ
とが疑われるか、糖尿病になりつつある患者を選択し、その患者に、薬剤の一回
以上の投薬をなすことを含む。薬剤は、分泌型レニラルシフェラーゼをコードし
ているポリヌクレオチドを含み得るか、グルタミン酸デカルボキシラーゼの分泌
型をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
又は１型糖尿病を防止する方法が提供される。該方法は、糖尿病を患っているこ
とが疑われるか、糖尿病になりつつある患者を選択し、その患者に、薬剤の一回
以上の投薬をなすことを含む。薬剤は、分泌型レニラルシフェラーゼをコードし
ているポリヌクレオチドを含み得るか、グルタミン酸デカルボキシラーゼの分泌
型をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【０００７】
本発明は、細胞内ヒトＧＡＤ、ヒトＧＡＤの分泌型又はウミシイタケ(レニラ
・レニフォルミス)ルシフェラーゼの分泌型の何れかをコードしているプラスミ
ドＤＮＡを投与した非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいてシクロホスファミド
で促進された糖尿病を研究した結果として得られた。要約すると、４週齢の動物
に細胞内ヒトＧＡＤ、ヒトＧＡＤの分泌型又はウミシイタケ(レニラ・レニフォ
ルミス)ルシフェラーゼの分泌型の何れかをコードしているプラスミドＤＮＡを
注射した。分泌型ＧＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡを注射した動物では
糖尿病の発生が有意に低減されることが証明された。ウミシイタケ(レニラ・レ
ニフォルミス)ルシフェラーゼをコードしているプラスミドＤＮＡを注射した動
物では糖尿病の発症に有意な遅延が生じることが実証された。しかし、細胞内Ｇ
ＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡを注射した動物では、過去の研究では、
ヒトＧＡＤ６５又は分泌型ＧＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡの注射によ
りＮＯＤマウスの膵臓の小島炎症（膵島炎）を予防したことを示しているが、糖
尿病の発生を有意に低減することも糖尿病の発症を有意に遅延させることもなか
った。本発明を以下に詳細に開示する。
・レニフォルミス)ルシフェラーゼの分泌型の何れかをコードしているプラスミ
ドＤＮＡを投与した非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいてシクロホスファミド
で促進された糖尿病を研究した結果として得られた。要約すると、４週齢の動物
に細胞内ヒトＧＡＤ、ヒトＧＡＤの分泌型又はウミシイタケ(レニラ・レニフォ
ルミス)ルシフェラーゼの分泌型の何れかをコードしているプラスミドＤＮＡを
注射した。分泌型ＧＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡを注射した動物では
糖尿病の発生が有意に低減されることが証明された。ウミシイタケ(レニラ・レ
ニフォルミス)ルシフェラーゼをコードしているプラスミドＤＮＡを注射した動
物では糖尿病の発症に有意な遅延が生じることが実証された。しかし、細胞内Ｇ
ＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡを注射した動物では、過去の研究では、
ヒトＧＡＤ６５又は分泌型ＧＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡの注射によ
りＮＯＤマウスの膵臓の小島炎症（膵島炎）を予防したことを示しているが、糖
尿病の発生を有意に低減することも糖尿病の発症を有意に遅延させることもなか
った。本発明を以下に詳細に開示する。
【０００８】
先ず、ｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５及びｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５
５と命名されたプラスミドをLiu, J等（１９９９）に開示されたようにして作製
した。細胞内又は分泌型グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードしているプラ
スミドＤＮＡを筋肉内注射すると、非肥満糖尿病マウスの膵島炎を低減する。Ge
ne Ther. Mol. Biol. 3, 197-206。プラスミドが有するｃＤＮＡｓは、それぞれ
、ソフトコーラルのウミシイタケ(レニラ・レニフォルミス）ルシフェラーゼの
分泌型をコードしている配列番号：１のＳＲＵＣ３；全長ヒトＧＡＤ６５タンパ
ク質をコードしている配列番号：２のｇａｄ６５；パルミトイル化配列と全長Ｇ
ＡＤ６５タンパク質の分泌を防止するゴルジ標的シグナルを除去する８８のアミ
ノ酸のアミノ末端領域の欠失を有し、配列番号：２の残基２６５−１７５８を残
す、配列番号：２のヒトＧＡＤ６５の分泌型の切断形態をコードしている修飾ｇ
ａｄ６５ｃＤＮＡである。欠失配列は、分泌前に細胞内で切断されたシグナルペ
プチドをコードしているヒトＩＬ-２配列で置換された。この切断型ＧＡＤ６５
タンパク質（ＧＡＤ５５）は１型糖尿病に罹っている患者の抗体によって認識さ
れる全ての既知のエピトープを含んでいた。各ｃＤＮＡはプラスミドｐＮＤ２の
サイトメガロウイルスプロモーターの転写調節下に配された。加えて、各プラス
ミドはＣｏＬ-Ｅ１複製起点とバクテリア大腸菌エシェリキア中でのプラスミド
ＤＮＡの増幅のためのアンピシリン耐性をコードする遺伝子を有していた。
５と命名されたプラスミドをLiu, J等（１９９９）に開示されたようにして作製
した。細胞内又は分泌型グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードしているプラ
スミドＤＮＡを筋肉内注射すると、非肥満糖尿病マウスの膵島炎を低減する。Ge
ne Ther. Mol. Biol. 3, 197-206。プラスミドが有するｃＤＮＡｓは、それぞれ
、ソフトコーラルのウミシイタケ(レニラ・レニフォルミス）ルシフェラーゼの
分泌型をコードしている配列番号：１のＳＲＵＣ３；全長ヒトＧＡＤ６５タンパ
ク質をコードしている配列番号：２のｇａｄ６５；パルミトイル化配列と全長Ｇ
ＡＤ６５タンパク質の分泌を防止するゴルジ標的シグナルを除去する８８のアミ
ノ酸のアミノ末端領域の欠失を有し、配列番号：２の残基２６５−１７５８を残
す、配列番号：２のヒトＧＡＤ６５の分泌型の切断形態をコードしている修飾ｇ
ａｄ６５ｃＤＮＡである。欠失配列は、分泌前に細胞内で切断されたシグナルペ
プチドをコードしているヒトＩＬ-２配列で置換された。この切断型ＧＡＤ６５
タンパク質（ＧＡＤ５５）は１型糖尿病に罹っている患者の抗体によって認識さ
れる全ての既知のエピトープを含んでいた。各ｃＤＮＡはプラスミドｐＮＤ２の
サイトメガロウイルスプロモーターの転写調節下に配された。加えて、各プラス
ミドはＣｏＬ-Ｅ１複製起点とバクテリア大腸菌エシェリキア中でのプラスミド
ＤＮＡの増幅のためのアンピシリン耐性をコードする遺伝子を有していた。
【０００９】
プラスミドＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５-ａ中で増幅し、アルカリ溶解法に標準的
な２回の塩化セシウム精製を続けて単離した。ＤＮＡの定性及び定量をＵＶ分光
光度計（１．８を超えるＡ２６０／Ａ２８０比）とアガロースゲル電気泳動法で
測定した。ついで、プラスミドＤＮＡを最終濃度２μｇ／μｌのリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）中、滅菌条件下で溶解させ、−２０℃で保存した。
な２回の塩化セシウム精製を続けて単離した。ＤＮＡの定性及び定量をＵＶ分光
光度計（１．８を超えるＡ２６０／Ａ２８０比）とアガロースゲル電気泳動法で
測定した。ついで、プラスミドＤＮＡを最終濃度２μｇ／μｌのリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）中、滅菌条件下で溶解させ、−２０℃で保存した。
【００１０】
プラスミドＤＮＡを雌のＮＯＤ／ＭｒｋＴａｃマウス（Taconic Laboratories
, Germantown, NY US）に筋肉内投与した。各動物には、２７Ｇの針を備えた使
い捨てのツベルクリン注射器を使用して４週齢にて２００マイクログラム／脚を
それぞれの大腿四頭筋に注射し、２日後に同一量の注射をし、全体で８００マイ
クログラムのプラスミドＤＮＡ／マウスとした。３つのグループのマウスは配列
番号：１のｓｒｕｃ３；配列番号：２のｇａｄ６５、又は配列番号：３のｓｇａ
ｄ５５の何れかのｃＤＮＡを有するｐＮＤ-２プラスミドの注射を受けた。更な
るグループのマウスをコントロールとして未処理のまま残した。全てのマウスは
糖尿病の発症を促進するために、１０及び１２週齢にてシクロホスファミド（２
００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受けた。マウスは、非病原性フリー条件下の動
物用設備中に維持され、６６ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン（Phoenix Scientific,
St Joseph, MO US）、７．５ｍｇ／ｋｇ体重のオキシラジン(oxylazine)（Lloyd
Laboratories, Shenandoa, IO US）、及び１．５ｍｇ／ｋｇ体重のアセプロマ
ジンマレアート（Fermenta Animal Health Co., MO US）を使用して全身麻酔下
でＤＮＡの注射を受けた。
, Germantown, NY US）に筋肉内投与した。各動物には、２７Ｇの針を備えた使
い捨てのツベルクリン注射器を使用して４週齢にて２００マイクログラム／脚を
それぞれの大腿四頭筋に注射し、２日後に同一量の注射をし、全体で８００マイ
クログラムのプラスミドＤＮＡ／マウスとした。３つのグループのマウスは配列
番号：１のｓｒｕｃ３；配列番号：２のｇａｄ６５、又は配列番号：３のｓｇａ
ｄ５５の何れかのｃＤＮＡを有するｐＮＤ-２プラスミドの注射を受けた。更な
るグループのマウスをコントロールとして未処理のまま残した。全てのマウスは
糖尿病の発症を促進するために、１０及び１２週齢にてシクロホスファミド（２
００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受けた。マウスは、非病原性フリー条件下の動
物用設備中に維持され、６６ｍｇ／ｋｇ体重のケタミン（Phoenix Scientific,
St Joseph, MO US）、７．５ｍｇ／ｋｇ体重のオキシラジン(oxylazine)（Lloyd
Laboratories, Shenandoa, IO US）、及び１．５ｍｇ／ｋｇ体重のアセプロマ
ジンマレアート（Fermenta Animal Health Co., MO US）を使用して全身麻酔下
でＤＮＡの注射を受けた。
【００１１】
動物における糖尿病の発症を、尿検査用のクリニスティックス・リージェント
・ストリップ（Clinistix Reagent Strips）（Bayer Corporation, Elkhart, IN
US）を用いて一週間に２回、糖尿をモニターすることによって、決定した。ひ
とたび糖尿が出てくると、（Accu-ChekTM Advantage(Roche Diagnostics Corpor
ation, Indianapolis, IN US)を使用して）二日連続して血糖値が３００ｍｇ／
デシリットルを超えた場合に糖尿病の診断を確認した。糖尿病と診断されたとき
、又は動物が１８週齢になった観察期間の終わりに、動物を屠殺した。結果の統
計的分析を、ログランクでのカプラン・マイヤー法とマンホイットニー検定を用
いて実施して糖尿病の発症の防止と遅延における差異を検出した。
・ストリップ（Clinistix Reagent Strips）（Bayer Corporation, Elkhart, IN
US）を用いて一週間に２回、糖尿をモニターすることによって、決定した。ひ
とたび糖尿が出てくると、（Accu-ChekTM Advantage(Roche Diagnostics Corpor
ation, Indianapolis, IN US)を使用して）二日連続して血糖値が３００ｍｇ／
デシリットルを超えた場合に糖尿病の診断を確認した。糖尿病と診断されたとき
、又は動物が１８週齢になった観察期間の終わりに、動物を屠殺した。結果の統
計的分析を、ログランクでのカプラン・マイヤー法とマンホイットニー検定を用
いて実施して糖尿病の発症の防止と遅延における差異を検出した。
【００１２】
しかして、図１に、ＮＯＤマウスに、全長ヒトＧＡＤ６５（塗りつぶしたボッ
クス）；ヒトＧＡＤ６５の分泌型であるＳＧＡＤ５５（白抜きボックス）；ウミ
シイタケ(レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼの分泌型であるＳＲＵＣ３（
白抜きの円）をコードするプラスミドＤＮＡが注射された；又はプラスミドＤＮ
Ａが注射されていない（塗りつぶした円）非糖尿病のシクロホスファミド処置Ｎ
ＯＤマウスのパーセント対時間として、ＤＮＡ投与の結果を示すグラフを示す。
分かるように、プラスミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５又はｐＮ
Ｄ２-ＳＧＡＤ５５の注射を受けた後に非糖尿病性のままであった１８週齢の動
物のパーセントはそれぞれ１８、３０及び６３で、未処置の動物の２３パーセン
トが観察期間の終了時点で糖尿病ではなかった。糖尿病の発症のカプラン・マイ
ヤープロットを、統計的分析と併せて見れば、ｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５の注射を
受けたマウスは、未処置のコントロールと比較した場合に統計的に有意な糖尿病
の低減を示したことが示されている（Ｐ＝０．０５、ログランク検定）。これに
対して、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５の注射を受けたマウスは同じコントロールと比較
して統計的に有意な糖尿病の低減を示さなかった（Ｐ＝０．３７、ログランク検
定）。未処置のマウスとｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたマウスのグループ
は観察期間の終了時点では同様な非糖尿病性動物パーセントであったが、マンホ
イットニー検定（Ｐ＝０．０１）を使用して未処置のコントロールと比較したと
き、ｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射によって、糖尿病の発症に有意な遅延が生じた
。発症に関して３種の処置マウスグループ間の差異は統計的に有意であるもので
はなかった（Ｐ＞０．１３、ログランク検定）。
クス）；ヒトＧＡＤ６５の分泌型であるＳＧＡＤ５５（白抜きボックス）；ウミ
シイタケ(レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼの分泌型であるＳＲＵＣ３（
白抜きの円）をコードするプラスミドＤＮＡが注射された；又はプラスミドＤＮ
Ａが注射されていない（塗りつぶした円）非糖尿病のシクロホスファミド処置Ｎ
ＯＤマウスのパーセント対時間として、ＤＮＡ投与の結果を示すグラフを示す。
分かるように、プラスミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５又はｐＮ
Ｄ２-ＳＧＡＤ５５の注射を受けた後に非糖尿病性のままであった１８週齢の動
物のパーセントはそれぞれ１８、３０及び６３で、未処置の動物の２３パーセン
トが観察期間の終了時点で糖尿病ではなかった。糖尿病の発症のカプラン・マイ
ヤープロットを、統計的分析と併せて見れば、ｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５の注射を
受けたマウスは、未処置のコントロールと比較した場合に統計的に有意な糖尿病
の低減を示したことが示されている（Ｐ＝０．０５、ログランク検定）。これに
対して、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５の注射を受けたマウスは同じコントロールと比較
して統計的に有意な糖尿病の低減を示さなかった（Ｐ＝０．３７、ログランク検
定）。未処置のマウスとｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたマウスのグループ
は観察期間の終了時点では同様な非糖尿病性動物パーセントであったが、マンホ
イットニー検定（Ｐ＝０．０１）を使用して未処置のコントロールと比較したと
き、ｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射によって、糖尿病の発症に有意な遅延が生じた
。発症に関して３種の処置マウスグループ間の差異は統計的に有意であるもので
はなかった（Ｐ＞０．１３、ログランク検定）。
【００１３】
マウスの血清中の抗ルシフェラーゼ及び抗ＧＡＤ ＩｇＧ及びＩｇＧ１抗体の
量をエライザを使用して測定し、次のようにしてｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３、ｐＮＤ
２-ＧＡＤ６５、及びｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５プラスミドの注射後のルシフェラー
ゼ及びＧＡＤポリペプチドに対する免疫反応を検出した。心臓に穿刺して血液を
採取し（０．５−１．５ｍｌ）、４℃にて１０分間３０００ｘｇで２回遠心分離
を行って試料から血清を取得し、１０ｍｌの１％アジ化ナトリウムを各試料に加
えた。９６ウェルのマイクロタイータープレート（Dynex Technologies Inc., C
hantilly, VA US）に、５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのβ-メルカプトエタノール及
び大腸菌から単離した１０ｍｇ／ｍｌの組換えヒトＧＡＤ５５タンパク質、又は
ＢＳＡを含む１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、４℃にて一晩被
覆した。３７℃で２時間ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキング後、連続希釈
した血清をウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。未結合のタン
パク質と抗体を各反応後に室温で５分間、ＰＢＳ＋０．１％トリトンｘ１００の
４回の洗浄で除去した。アルカリホスファターゼ結合Ｆａｂ特異的抗マウスＩｇ
Ｇモノクローナル抗体（Sigma, St Louis, MO US）をブロックバッファーで１：
４００００に希釈し、ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。結
合抗体の相対量を、１００ｍｌのアルカリホスファターゼ基質Ｌｕｍｉ-Ｐｈｏ
ｓ Ｐｌｕｓ（Lumigen Inc., Southfield, MI US）を各ウェルに添加後に決定し
た。アルカリホスファターゼにより触媒された光の放射を、３７℃で３０分間反
応を継続させた後にＭＬ３０００照度計（Dynex Technologies Inc., Chantilly
, VA US）で測定した。
量をエライザを使用して測定し、次のようにしてｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３、ｐＮＤ
２-ＧＡＤ６５、及びｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５プラスミドの注射後のルシフェラー
ゼ及びＧＡＤポリペプチドに対する免疫反応を検出した。心臓に穿刺して血液を
採取し（０．５−１．５ｍｌ）、４℃にて１０分間３０００ｘｇで２回遠心分離
を行って試料から血清を取得し、１０ｍｌの１％アジ化ナトリウムを各試料に加
えた。９６ウェルのマイクロタイータープレート（Dynex Technologies Inc., C
hantilly, VA US）に、５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのβ-メルカプトエタノール及
び大腸菌から単離した１０ｍｇ／ｍｌの組換えヒトＧＡＤ５５タンパク質、又は
ＢＳＡを含む１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、４℃にて一晩被
覆した。３７℃で２時間ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡでブロッキング後、連続希釈
した血清をウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。未結合のタン
パク質と抗体を各反応後に室温で５分間、ＰＢＳ＋０．１％トリトンｘ１００の
４回の洗浄で除去した。アルカリホスファターゼ結合Ｆａｂ特異的抗マウスＩｇ
Ｇモノクローナル抗体（Sigma, St Louis, MO US）をブロックバッファーで１：
４００００に希釈し、ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。結
合抗体の相対量を、１００ｍｌのアルカリホスファターゼ基質Ｌｕｍｉ-Ｐｈｏ
ｓ Ｐｌｕｓ（Lumigen Inc., Southfield, MI US）を各ウェルに添加後に決定し
た。アルカリホスファターゼにより触媒された光の放射を、３７℃で３０分間反
応を継続させた後にＭＬ３０００照度計（Dynex Technologies Inc., Chantilly
, VA US）で測定した。
【００１４】
ＮＯＤマウスの他の３グループ及び未処置のＣＤ１マウスのコントロールグル
ープと比較した場合、抗ルシフェラーゼＩｇＧの増加はｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３プ
ラスミドＤＮＡの注射を受けたマウスの血清には見出されなかった。更に、未処
置のコントロール及びプラスミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたマウスと
比較した場合、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５及びｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５プラスミドの注
射を受けたマウスの血清中の抗ＧＡＤ ＩｇＧ抗体の力価の範囲には明らかな差
異はなかった。しかし、抗ＧＡＤ ＩｇＧの力価は、抗ルシフェラーゼＩｇＧの
力価とは対照的に、ＣＤ１コントロールにおけるよりもＮＯＤマウス中で一般に
高かった。
ープと比較した場合、抗ルシフェラーゼＩｇＧの増加はｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３プ
ラスミドＤＮＡの注射を受けたマウスの血清には見出されなかった。更に、未処
置のコントロール及びプラスミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたマウスと
比較した場合、ｐＮＤ２-ＧＡＤ６５及びｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５プラスミドの注
射を受けたマウスの血清中の抗ＧＡＤ ＩｇＧ抗体の力価の範囲には明らかな差
異はなかった。しかし、抗ＧＡＤ ＩｇＧの力価は、抗ルシフェラーゼＩｇＧの
力価とは対照的に、ＣＤ１コントロールにおけるよりもＮＯＤマウス中で一般に
高かった。
【００１５】
Ｔｈ２細胞は、ＩｇＧ１抗体の産生に至るプロセスを媒介するので、ＩｇＧ１
量を決定し、Ｔｈ２タイプの反応が誘発されるかどうかのマーカーとして使用し
た。ＩｇＧ１抗体は、アルカリホスファターゼ結合ＩｇＧ１特異的抗マウスＩｇ
Ｇモノクローナル抗体（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA U
S）を１：２０００の希釈で検出に使用したことを除いて、上述のものに対応す
るプロトコールを使用して決定した。
量を決定し、Ｔｈ２タイプの反応が誘発されるかどうかのマーカーとして使用し
た。ＩｇＧ１抗体は、アルカリホスファターゼ結合ＩｇＧ１特異的抗マウスＩｇ
Ｇモノクローナル抗体（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA U
S）を１：２０００の希釈で検出に使用したことを除いて、上述のものに対応す
るプロトコールを使用して決定した。
【００１６】
ＮＯＤマウスの他のグループ及びＣＤ１コントロールと比較した場合、プラス
ミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたマウスの血清には抗ルシフェラーゼＩ
ｇＧ１力価の増加は検出されなかった。同様に、ＣＤ１マウスと比較した場合、
プラスミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたグループ及び未処置のグループ
からのＮＯＤマウスの血清には抗ＧＡＤ ＩｇＧ１力価の増加は検出されなかっ
た。しかし、これに対して、プラスミドｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５の注射を受けた
幾つかの非糖尿病性マウスには抗ＧＡＤ ＩｇＧ１力価の増加が検出された。ま
た、プラスミドｐＮＤ２-ＧＡＤ６５の注射を受けたマウスの幾らかがまた抗Ｇ
ＡＤ ＩｇＧ１力価の増加を示したが、増加は糖尿病ではないことと必ずしも相
関しなかった。バックグラウンドを超える抗ルシフェラーゼ及び抗ＧＡＤ Ｉｇ
Ｇ２ａ抗体の力価を示した動物は皆無であった。
ミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたマウスの血清には抗ルシフェラーゼＩ
ｇＧ１力価の増加は検出されなかった。同様に、ＣＤ１マウスと比較した場合、
プラスミドｐＮＤ２-ＳＲＵＣ３の注射を受けたグループ及び未処置のグループ
からのＮＯＤマウスの血清には抗ＧＡＤ ＩｇＧ１力価の増加は検出されなかっ
た。しかし、これに対して、プラスミドｐＮＤ２-ＳＧＡＤ５５の注射を受けた
幾つかの非糖尿病性マウスには抗ＧＡＤ ＩｇＧ１力価の増加が検出された。ま
た、プラスミドｐＮＤ２-ＧＡＤ６５の注射を受けたマウスの幾らかがまた抗Ｇ
ＡＤ ＩｇＧ１力価の増加を示したが、増加は糖尿病ではないことと必ずしも相
関しなかった。バックグラウンドを超える抗ルシフェラーゼ及び抗ＧＡＤ Ｉｇ
Ｇ２ａ抗体の力価を示した動物は皆無であった。
【００１７】
これらの結果は、膵島炎を減少させなかったＳＲＵＣ３と、膵島炎を減少させ
たＧＡＤ６５をコードしているプラスミドＤＮＡの注射後にLiu, J等によって過
去に得られた膵島炎スコアが糖尿病の防止を予測するものではなかったことを示
している。更に、遺伝子ワクチンによってコードされるヒトＧＡＤポリペプチド
の細胞位置がＮＯＤマウスのＣＹＰ促進糖尿病の予防に影響を及ぼす。これは、
全長細胞内ＧＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡの注射では糖尿病を有意に
は防止できないが、分泌型ＧＡＤをコードしているプラスミドの注射では糖尿病
の頻度を減少させたからである。その減少には抗ＧＡＤ ＩｇＧ１力価の増加が
伴っており、これはＴｈ２リンパ球の関与を意味している。また、分泌型外来性
タンパク質と分泌型自己抗原をコードするＤＮＡの注射が共に糖尿病の発症を遅
延させるという点は、外因性タンパク質の分泌だけが疾患の発症に影響している
ことを意味している。
たＧＡＤ６５をコードしているプラスミドＤＮＡの注射後にLiu, J等によって過
去に得られた膵島炎スコアが糖尿病の防止を予測するものではなかったことを示
している。更に、遺伝子ワクチンによってコードされるヒトＧＡＤポリペプチド
の細胞位置がＮＯＤマウスのＣＹＰ促進糖尿病の予防に影響を及ぼす。これは、
全長細胞内ＧＡＤをコードしているプラスミドＤＮＡの注射では糖尿病を有意に
は防止できないが、分泌型ＧＡＤをコードしているプラスミドの注射では糖尿病
の頻度を減少させたからである。その減少には抗ＧＡＤ ＩｇＧ１力価の増加が
伴っており、これはＴｈ２リンパ球の関与を意味している。また、分泌型外来性
タンパク質と分泌型自己抗原をコードするＤＮＡの注射が共に糖尿病の発症を遅
延させるという点は、外因性タンパク質の分泌だけが疾患の発症に影響している
ことを意味している。
【００１８】
一実施態様では、本発明は患者における糖尿病を予防し、その発症を遅延させ
又は治療する方法である。該方法は、先ず、糖尿病を患っていることが疑われる
か、糖尿病になりつつあるか、又は糖尿病である患者を選択することを含む。選
択は、この明細書を参照して当業者が理解するであろう標準的な方法を使用して
なすことができる。例えば、選択は、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体あるい
は抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在、増加する高血糖の存在、糖尿
の存在、糖尿病に対する遺伝的素因の存在又はこれらの一以上を患者において同
定することによってなすことができる。
又は治療する方法である。該方法は、先ず、糖尿病を患っていることが疑われる
か、糖尿病になりつつあるか、又は糖尿病である患者を選択することを含む。選
択は、この明細書を参照して当業者が理解するであろう標準的な方法を使用して
なすことができる。例えば、選択は、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体あるい
は抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在、増加する高血糖の存在、糖尿
の存在、糖尿病に対する遺伝的素因の存在又はこれらの一以上を患者において同
定することによってなすことができる。
【００１９】
次に、患者には分泌型外因性タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを
含む薬剤の一回以上の投薬をなす。好適な実施態様では、薬剤は、複数回の投薬
でなされる。他の好適な実施態様では、投薬量は約０．００１ｍｇ／Ｋｇと約１
０ｍｇ／Ｋｇの間である。別の好適な実施態様では、投薬量は約０．０１ｍｇ／
Ｋｇと約１ｍｇ／Ｋｇの間である。他の好適な実施態様では、投薬量は約０．１
ｍｇ／Ｋｇである。他の好適な実施態様では、投薬は週約２回から約１０回なさ
れる。特に好適な実施態様では、投薬は週４回なされる。
含む薬剤の一回以上の投薬をなす。好適な実施態様では、薬剤は、複数回の投薬
でなされる。他の好適な実施態様では、投薬量は約０．００１ｍｇ／Ｋｇと約１
０ｍｇ／Ｋｇの間である。別の好適な実施態様では、投薬量は約０．０１ｍｇ／
Ｋｇと約１ｍｇ／Ｋｇの間である。他の好適な実施態様では、投薬量は約０．１
ｍｇ／Ｋｇである。他の好適な実施態様では、投薬は週約２回から約１０回なさ
れる。特に好適な実施態様では、投薬は週４回なされる。
【００２０】
特に好適な実施態様では、分泌型外因性タンパク質は配列番号：１の配列を有
する分泌レニラルシフェラーゼである。他の特に好適な実施態様では、配列番号
：３の配列を有するヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼの分泌型である。加
えて、本方法は、投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすることを含
みうる。
する分泌レニラルシフェラーゼである。他の特に好適な実施態様では、配列番号
：３の配列を有するヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼの分泌型である。加
えて、本方法は、投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすることを含
みうる。
【００２１】
（実施例１）
本発明においては、患者の糖尿病の発症が例えば次のようにして遅延させられ
るか防止される。先ず、循環している抗インスリン及び抗ＧＡＤ自己抗体の有無
によって患者が選択される。ついで、ヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼの
分泌型をコードしているプラスミドを含む薬剤を０．１ｍｇ／Ｋｇ、患者に筋肉
内注射する。注射は３週間の間毎週繰り返し、循環する抗インスリン及び抗ＧＡ
Ｄ自己抗体の量をモニターする。循環する抗インスリン及び抗ＧＡＤ自己抗体の
量が正常値に戻ったときに治療を終了する。
るか防止される。先ず、循環している抗インスリン及び抗ＧＡＤ自己抗体の有無
によって患者が選択される。ついで、ヒトのグルタミン酸デカルボキシラーゼの
分泌型をコードしているプラスミドを含む薬剤を０．１ｍｇ／Ｋｇ、患者に筋肉
内注射する。注射は３週間の間毎週繰り返し、循環する抗インスリン及び抗ＧＡ
Ｄ自己抗体の量をモニターする。循環する抗インスリン及び抗ＧＡＤ自己抗体の
量が正常値に戻ったときに治療を終了する。
【００２２】
この明細書に引用した全ての文献につきその全体を出典明示によりここに取り
込む。本発明を所定の好適な実施態様を参照して詳細に検討したが、その他の実
施態様も可能である。従って、特許請求の範囲はこの明細書に記載の好適な実施
態様の説明に限定してはならない。
込む。本発明を所定の好適な実施態様を参照して詳細に検討したが、その他の実
施態様も可能である。従って、特許請求の範囲はこの明細書に記載の好適な実施
態様の説明に限定してはならない。
【図１】 ＮＯＤマウスに、全長ヒトＧＡＤ６５（塗りつぶしたボックス）
；ヒトＧＡＤ６５の分泌型であるＳＧＡＤ５５（白抜きボックス）；ウミシイタ
ケ(レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼの分泌型であるＳＲＵＣ３（白抜き
の円）をコードするプラスミドＤＮＡが注射された；又はプラスミドＤＮＡが注
射されていない（塗りつぶした円）非糖尿病のシクロホスファミド処置ＮＯＤマ
ウスのパーセント対時間を示すグラフである。
；ヒトＧＡＤ６５の分泌型であるＳＧＡＤ５５（白抜きボックス）；ウミシイタ
ケ(レニラ・レニフォルミス)ルシフェラーゼの分泌型であるＳＲＵＣ３（白抜き
の円）をコードするプラスミドＤＮＡが注射された；又はプラスミドＤＮＡが注
射されていない（塗りつぶした円）非糖尿病のシクロホスファミド処置ＮＯＤマ
ウスのパーセント対時間を示すグラフである。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Claims (28)
- 【請求項１】 患者の糖尿病を予防し、その発症を遅延させ又は治療する方
法において、 ａ）糖尿病を患っていることが疑われるか、糖尿病になりつつあるか、又は糖
尿病である患者を選択し； ｂ）分泌型外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬剤の一回
以上の患者への投薬をなす、ことを含む方法。 - 【請求項２】 患者の選択が、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体あるいは
抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在を患者において同定することを含
む請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 患者の選択が、増加する高血糖の存在を患者において同定す
ることを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 患者の選択が、糖尿の存在を患者において同定することを含
む請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 患者の選択が、糖尿病に対する遺伝的素因の存在を患者にお
いて同定することを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 一回以上の投薬が複数回の投薬である請求項１に記載の方法
。 - 【請求項７】 一回以上の患者への投薬をなすことが、一回以上の投薬を患
者に筋肉注射することを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 外因性タンパク質が配列番号：１の配列を有する分泌型レニ
ラルシフェラーゼである請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 外因性タンパク質が配列番号：３の配列を有するヒトのグル
タミン酸デカルボキシラーゼの分泌型である請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすること
を更に含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 患者の糖尿病を予防し、その発症を遅延させ又は治療する
方法において、 ａ）糖尿病を患っていることが疑われるか、糖尿病になりつつあるか、又は糖
尿病である患者を選択し； ｂ）分泌型レニラルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤の
一回以上の患者への投薬をなす、ことを含む方法。 - 【請求項１２】 患者の選択が、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体あるい
は抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在を患者において同定することを
含む請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 患者の選択が、増加する高血糖の存在を患者において同定
することを含む請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 患者の選択が、糖尿の存在を患者において同定することを
含む請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 患者の選択が、糖尿病に対する遺伝的素因の存在を患者に
おいて同定することを含む請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１６】 一回以上の投薬が複数回の投薬である請求項１１に記載の
方法。 - 【請求項１７】 一回以上の患者への投薬をなすことが、一回以上の投薬を
患者に筋肉注射することを含む請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１８】 分泌型レニラルシフェラーゼが配列番号：１の配列を含む
請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１９】 投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすること
を更に含む請求項１１に記載の方法。 - 【請求項２０】 患者の糖尿病を予防し、その発症を遅延させ又は治療する
方法において、 ａ）糖尿病を患っていることが疑われるか、糖尿病になりつつあるか、又は糖
尿病である患者を選択し； ｂ）分泌型グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを
含む薬剤の一回以上の患者への投薬をなす、ことを含む方法。 - 【請求項２１】 患者の選択が、抗インスリン又は抗ＧＡＤ自己抗体あるい
は抗インスリンと抗ＧＡＤ自己抗体の両方の存在を患者において同定することを
含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 患者の選択が、増加する高血糖の存在を患者において同定
することを含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２３】 患者の選択が、糖尿の存在を患者において同定することを
含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２４】 患者の選択が、糖尿病に対する遺伝的素因の存在を患者に
おいて同定することを含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２５】 一回以上の投薬が複数回の投薬である請求項２０に記載の
方法。 - 【請求項２６】 一回以上の患者への投薬をなすことが、一回以上の投薬を
患者に筋肉注射することを含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２７】 グルタミン酸デカルボキシラーゼが配列番号：３の配列を
含む請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２８】 投与後に、糖尿病の進行について患者をモニターすること
を更に含む請求項２０に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| PCT/US2001/012392 WO2001078771A1 (en) | 2000-04-17 | 2001-04-17 | Method of preventing or treating diabetes |
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|---|---|
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ID=22732129
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US6022697A (en) * | 1996-11-29 | 2000-02-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis and treatment of insulin-dependent diabetes mellitus |
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2001
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