JP2003532382A

JP2003532382A - ポリメラーゼ連鎖反応システム

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Publication number: JP2003532382A
Application number: JP2001549774A
Authority: JP
Inventors: ベネット，ウィリアム，ジェイ．; リチャーズ，ジェイムズ，ビー．; ストラットン，ポール，エル．; ハドリー，ディーン，アール．; ミラノヴィッチ，フレッド，ピー．; ベルグラダー，フィリップ; メイヤー，ピーター，エル．
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2000-01-04
Filing date: 2001-01-03
Publication date: 2003-11-05
Anticipated expiration: 2021-01-03
Also published as: US20020191826A1; EP1246700A1; EP1246700B1; WO2001049416A1; JP3911417B2; AU2927801A; JP4240332B2; US6699713B2; JP2007089591A; ATE365076T1; DE60128998D1

Abstract

(57)【要約】携帯型ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムは１または複数のチャンバモジュールを含む。各モジュールでは、生物学的試料の二重検定が実施可能である。各モジュールは、線形光学システムを備えた２つの平行に設けられた検査用ポートを有する。本システムは携帯可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】米国政府は、米国エネルギー省とカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間でローレンスリバモア国立研究所（Ｌａ
ｗｒｅｎｃｅＬｉｖｅｒｍｏｒｅＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
）の運営のために締結された契約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−４８に従って本発
明に権利を有する。

【０００２】（関連出願との相互参照）本願は２０００年１月４日に出願された“ＨａｎｄｈｅｌｄＰＣＲｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔ”と題する米国仮出願第６０／１７４，４１６号の特典を主張す
るものであり、これは参照により本願に組み入れられる。

【０００３】

【発明の属する技術分野】

本発明は化学反応、増幅および検出のための装置、特にポリメラーゼ連鎖反応
、増幅および検出を行なうためのシステムに関する。

【０００４】

【従来の技術】

Ｎｏｒｔｈｒｕｐ等に付与された化学反応用のシリコンベーススリーブ装置に
ついての米国特許第５，５８９，１３６号（１９９６年１２月３１日発行）には
、「ドープされた加熱用ポリシリコンのようなヒータと対流型冷却用のバルクシ
リコンを組み合わせたシリコンベースのスリーブ型化学反応チャンバ。この反応
チャンバは、均一加熱を行ないつつ消費電力が小さくなるように、臨界比のシリ
コンと窒化シリコンを加熱材料（例えば液体）のボリュームと組み合わせる。こ
の反応チャンバは、反応混合物を収容した反応スリーブに２次チューブ（例えば
プラスチック）を導入でき、これにより、材料不適合の問題の可能性も軽減する
。この反応チャンバは、有機、無機、または生化学的反応、例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または他のＤＮＡ反応（例えば、リガーゼチェー
ンリアクションなど）――これらは合成的、熱的サイクルを用いた反応の例であ
る――などの合成または処理のための任意の化学反応システムに利用することが
できる。この反応チャンバは、合成装置、特にＤＮＡ増幅およびＤＮＡ合成のた
めの合成装置において利用することができる。」なる記載がある。

【０００５】 “ＨａｎｄｈｅｌｄａｄｖａｎｃｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｎａ
ｌｙｚｅｒ”と題する論文が、Ｗ．Ｊ．Ｂｅｎｅｔｔ、Ｊ．Ｂ．Ｒｉｃｈａｒｄ
ｓ、Ｐ．Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．Ｈａｄｌｅｙ、Ｂ．Ｈ．Ｂｏｄｔｋｅｒ、
Ｓ．Ｌ．Ｎａｓａｒａｂａｄｉ、Ｆ．Ｐ．Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈ、Ｒ．Ｐ．Ｍａ
ｒｉｅｌｌａ、Ｒ．Ｐ．ＫｏｏｐｍａｎおよびＰ．Ｂｅｌｇｒａｄｅｒによって
、２０００年１１月５〜８日、マサチューセッツ州、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）
で開かれたＳｏｃｉｅｔｙｏｆＰｈｏｔｏ−ＯｐｔｉｃａｌＩｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＥｎｖ
ｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＳｅｎｓｉｎｇで提出
された。この論文は、参照として本願に組み入れられる。

【０００６】また、“Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆ
ｏｒｈａｎｄｈｅｌｄＰＣＲａｓｓａｙｓ”と題する論文が、Ｊ．Ｂ．Ｒ
ｉｃｈａｒｄｓ、Ｗ．Ｊ．Ｂｅｎｅｔｔ、Ｐ．Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．Ｈａ
ｄｌｅｙ、Ｓ．Ｌ．ＮａｓａｒａｂａｄｉおよびＦ．Ｐ．Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈ
によって、２０００年１１月５〜８日、マサチューセッツ州、ボストン（Ｂｏｓ
ｔｏｎ）で開かれたＳｏｃｉｅｔｙｏｆＰｈｏｔｏ−ＯｐｔｉｃａｌＩｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ
ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＳｅｎｓｉｎ
ｇで提出された。この論文は、参照として本願に組み入れられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生物学的有機体の同定のための最良の標
準手法（ｇｏｌｄｓｔａｎｄａｒｄ）として広く受け入れられている。ＰＣＲ
は、溶液中のＤＮＡセグメント濃度を経時的に指数関数的割合で増大させる生化
学的方法である。これは、同一種有機体の株間の識別が可能である。ＰＣＲでは
、典型的には、試料を９５℃近くの温度と６０℃以下の温度に繰り返し循環させ
る必要がある。理論的には、ＤＮＡセグメントの濃度は周期ごとに倍増する。本
発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および検出用システムの様々な実
施形態を提供する。本発明のシステムは、軽量でコンパクトであり、電力効率が
良い。

【０００８】

【発明の実施形態】

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムを提供する。
このシステムの実施形態は、生物学的試料ボリュームを含むようにされた１また
は複数の試料チャンバモジュールを含む。各試料チャンバモジュールは、二重検
定を行なう機能を有し、試料チャンバモジュールに動作可能に結合した平行な検
査用ポートを有する。各ポートは、光学的蛍光検出システムを有する。本発明の
さらなる実施形態、利点および特徴は、そのすべてではないが、以下に記載する
とおりである。本発明の様々な実施形態、利点および特徴は、この記載を検討し
、本発明の実行により当業者には明確なものとなるであろう。

【０００９】添付図面は本願の開示に組み入れられ、その一部をなすが、これらは本発明の
実施形態を例示し、発明の説明とともに、本発明の原理を説明するためのもので
ある。

【００１０】本発明の１つの実施形態は、本体、および生物学的試料ボリュームを含み得る
ように形成された１または複数の試料チャンバモジュールを含むようになされた
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムを提供する。各試料チャン
バモジュールは二重検定をサポートする機能を有する。試料チャンバモジュール
には、平行に設けられた検査用ポートが動作可能に接続されている。ポリメラー
ゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出の別の実施形態は、各検査用ポートに動作可能
に接続された線形検出システムを含む。試料チャンバモジュールは、多重検査用
ポートを有し、これらは試料ボリューム中の異なる領域を検査する。平行に設け
られた検査用ポートは、それぞれ光学的蛍光検出システムを有する。本発明のシ
ステムの別の実施形態は、平行に設けられた検査用ポート内に直接に光エネルギ
ーを向けるＬＥＤを含む。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム
の別の実施形態はポジティブコーリングアルゴリズム（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃａ
ｌｌｉｎｇａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を含む。このシステムの様々な実施形態にお
いて、試料は複数の試料チャンバモジュールの少なくとも１つに装入される。試
料はシリコンベース内の加熱ユニットを用いることにより加熱され、また、試料
は冷却される。光エネルギーが平行検査用ポートを通して試料内に向けられ、試
料の特性が検出される。

【００１１】 −（携帯型高度核酸分析器（ＨＡＮＡＡ：ＨａｎｄｈｅｌｄＡｄｖａｎｃｅ
ｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｎａｌｙｚｅｒ））− 図面を参照すると、特に図１に、本発明の実施形態の一例が示されている。シ
ステム１０を「ＨＡＮＡＡ（ＨａｎｄｈｅｌｄＡｄｖａｎｃｅｄＮｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄＡｎａｌｙｚｅｒ）」と呼ぶ。システム１０は４つのチャンバ
を有する電池駆動の携帯型装置である。システム１０は２つの基本構成部分１１
と１２からなる。一方の構成部分は本体１１であり、電子回路（検出器を含む。
）、電池および操作用インタフェースを含む。第２の構成部分は試料モジュール
１２である。試料モジュール１２は、本体１１の端に設けられたドッキングシス
テムに滑入する。装置の大きさは、およそ長さ１０インチ（２５．４センチ）×
幅４インチ（１０センチ）×深さ２インチ（５．１センチ）である。ＨＡＮＡＡ
システム１０のさらなる特徴を次に述べる。

【００１２】ＨＡＮＡＡの実施形態は、任意の所望の場所において使用できるように設計さ
れており、軍や警察関係者などによる使用を含む。これはまた医療現場での医療
関係者による使用にも適している。ＨＡＮＡＡの応用は、ＤＮＡまたはＲＮＡを
ベースとする任意の有機体やこうした有機体から得られる試料の検出を含む。例
としては、病理学、法医学、生物化学兵器薬剤の検出、感染病の診断、遺伝子テ
スト、環境テストなどが含まれる。

【００１３】本発明によるＨＡＮＡＡの実施形態は、４つのチャンバモジュール１４ａ、１
４ｂ、１４ｃおよび１４ｄを含み、これらは同時にまたは独立に熱上下サイクル
を経る。このため、様々な試料濃度で陽性対照や陰性対照が可能になる。４つの
チャンバモジュールのそれぞれは、１つの試料に対して２つの独立の測定を行な
う二重検定を行なう機能を有する。熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅ
ｒ）の構造は、非常に小さな機械的外形を保持しつつ、２つの平行に設けられた
検査用ポートを受け入れる。各ポートは、チャンバモジュールのコンパクトな平
面形状を維持しつつユニークに特化された光学的検出システムを有する。検出シ
ステムの出力はアルゴリズムによって分析されるが、このアルゴリズムは、試料
が陽性である場合を自動的に判定し、検定結果情報をリアルタイムでユニークで
融通の利くフォーマットで提示する。

【００１４】ＨＡＮＡＡは、試料モジュールを含み、これは高度なシリコン熱サイクラーを
一体として含む。高度なシリコン熱サイクラーはＮｏｒｔｈｒｕｐ等に付与され
た “Ｓｉｌｉｃｏｎ−ＢａｓｅｄＳｌｅｅｖｅＤｅｖｉｃｅｓｆｏｒ
ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅａｃｔｉｏｎｓ”と題する米国特許第５，５８９，１３
６号（１９９６年１２月３１日発行）に示されており、これは本願出願人に譲渡
されている。米国特許第５，５８９，１３６号の図面および明細書は、本願に参
照によって組み込まれる。ＨＡＮＡＡの熱サイクラーは、非等方的なエッチング
構造を取っており、これによりヒートマスを減少させるとともに冷却効率を増す
。これは薄膜ヒーター／温度センサと組み合わされ、非常に迅速で効率的な熱サ
イクルを可能にする。ＨＡＮＡＡ熱サイクラーは２つの窓を有しており、これに
よって、非常に小さな機械的外形を維持しつつ励起と検出を行なう２つの独立な
光学路を実現している。各ポートは、それぞれ発光ダイオード（ＬＥＤ）を有し
ており、非常に単純で直接的な光学システムを有し、これにより、信頼性と性能
を高めつつ、複雑さ、大きさやコストを低減している。

【００１５】ＨＡＮＡＡでは、試料溶液中に光学プローブを含有させて、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）プロセスをＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースの蛍光検定によって
監視している。ＰＣＲ操作手順は１）試料を処理してターゲットとなるＤＮＡ分
子を粗抽出物中に放出させること、２）酵素、バッファ、デオキシヌクレオチド
三リン酸（ｄＮＴＰＳ）およびオリゴヌクレオチドプライマーを含む水溶液を添
加すること、３）反応混合物を２または３つの温度（例えば、９０〜９６℃、７
２℃、および３７〜５５℃）の間で熱循環させること、および４）増幅されたＤ
ＮＡを検出することを含む。中間的なステップ、例えば、反応生成物を精製した
り、表面屈折プライマーを組み込むことなどを、ＰＣＲ操作手順に組み込んでも
良い。

【００１６】光学プローブを試料溶液中に含有させれば、ＰＣＲ濃度のリアルタイム光学検
出が可能となる。プローブは、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブでも
よい。これは、コネチカット州（Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ）０６８５９−０００１
、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、メインアベニュー（ＭａｉｎＡｖｅｎｕ
ｅ）７６１所在の、ＰＥ社（ＰＥＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の事業単位である
アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入
手可能である。こうしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、フォースター（
Ｆｏｒｓｔｅｒ）エネルギー転移によって当初は消光されている染料分子を含む
。増幅プロセスにおいて、酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）がプローブ複合体を切り
取る。この結果、染料が消光剤から分離して、その場所でレポータ染料はそれに
特有な発光ができるようになる。リアルタイム検出では、試料は、陽性を検出す
るためにサイクルの完了を必要としないため、検定時間が減少する。また、ゲル
電気泳動のようなフォローオン処理ステップを必要としない。リアルタイム検出
は、サイクル速度を犠牲とすることなく、また、大きさや電力消費を著しく増大
させることなく提供される。本発明のこの実施形態は、リアルタイム検出機能を
備えた汎用携帯型ＰＣＲ熱サイクラーを提供する。

【００１７】 −ＨＡＮＡＡヒーターの制御− 図２および３に示すように、ＨＡＮＡＡヒーターおよびスリーブ型反応チャン
バは、概ね２０で示される。スリーブ型反応チャンバは、米国特許第５，５８９
，１３６号（１９９６年１２月３１日発行）およびこれと同時係属の “Ａｎ
ＩｍｐｒｏｖｅｄＰＣＲＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ”と題する米国特許出願
第０９／２００３０９（９８年１１月２５日出願）に示されており、これらはい
ずれも本願出願人に譲渡されている。米国特許第５，５８９，１３６号およびこ
れと同時係属の米国特許出願第０９／２００３０９（９８年１１月２５日出願）
の開示は本願に参照により組み込まれる。

【００１８】ＨＡＮＡＡヒーターおよびスリーブ型反応チャンバ２０は、２つのシリコンボ
ディ部材または部分２１と２２からなっている。各ボディ部材２１と２２は、全
長に沿って縦長に延びたカッタウェイ２３と２４を有し、これらはボディ部分２
１と２２が結合されているときは、挿入物のための開口部２５（反応チャンバ２
５ともいう）を形成する。ボディ部分２１と２２それぞれの外面および側面には
、間を隔てて縦長に延びたＶ字型溝２６と２７が形成される。Ｖ字型溝２６と２
７は、ボディ部分２１と２２の外側面の内面上に形成されている。縦長に延びた
Ｖ字型溝２６と２７は、矢印３０で示すように、空気の流通路２８と２９を形成
する。

【００１９】流通路２８と２９を形成する互いに結合した溝２６と２７によって形成された
空気の流通路を通って空気が流れると、チャンバ２５の表面から熱が取り除かれ
、これにより、スリーブ型反応チャンバすなわちＰＣＲ熱サイクラー２０の速度
と効率が増す。ボディ部分２１と２２のヒートマスの減少およびこれらの表面積
の増大により、熱効率が改善される。

【００２０】溝２６と２７および流通路２８と２９は、ボディ部分すなわち部材２１と２２
を形成する際、シリコンウエーハ内に非等方的にエッチングされる。ボディ部材
２１と２２をエッチングしてカッタウェイ２３と２４（これは反応チャンバ２５
を画定する）を形成し、ボディ部材をエッチングして縦方向に延びる溝２６と２
７（これらは空気の流通路２８および２９を形成する）を形成した後、ボディ部
材２１と２２を、接着剤や糊やバネ荷重などにより互いに結合する。

【００２１】ヒーターストリップ３１は中央の加熱素子となる。ヒーターストリップ３１は
プラチナ製で抵抗型ヒーターとしても使用される。プラチナは比較的高い抵抗温
度係数を有するため、ヒーター３１は温度センサーとしても機能する。このため
、温度の制御がより正確となり全体の設計が大幅に簡略化される。

【００２２】熱的プロファイル（温度対時間）は、高温と低温との間の遷移時間が最小にな
ったときに最も効率的である。これは加熱および冷却速度を迅速にすることによ
り実現できる。さらに、プロファイルの「角」（短い時間で温度変化が終わり、
ヒーターは所定の設定温度、（保存温度）を維持することになる）は、なるべく
鋭いことが必要である。ＨＡＮＡＡではこれを、加熱サイクルにおいてチャンバ
を過加熱する（また、冷却サイクルにおいては過冷却する）ことにより実現する
。液体が所望のホールド温度に極めて近くなると、ヒーター電流は瞬間的に低下
して徐熱のレベル（ｓｉｍｍｅｒｌｅｖｅｌ）に達する。チャンバのヒートマ
スが低いので、電流低下時を越えて実質的に温度がオーバーシュートすることは
ない。これにより、従来の方法と比べ鋭い角がもたらされる。従来の方法では、
温度が設定ポイントに近づいたときに、加熱速度が低下して、温度振動により設
定温度をオーバーシュートし、または反応が非常に遅れるため、そもそも適用で
きない方法である。

【００２３】チャンバを冷却するにはブロアーと通気システム（これは、装置外から空気を
引き込み加熱した表面のなるべく近くに循環させチャンバからそれを外に戻すも
のである）が必要である。空気は、両側のモジュール分割壁の上部に設けられた
２つのプレナム（ｐｌｅｎｕｍ）を通して入ってくる。空気は、チャンバ上の冷
却ポートに沿って一列に設けられた壁面の開口部を通して導入され、導入用開口
部の中間にある壁面開口部を通ってチャンバ外に出て行く。この点から、空気は
モジュール下のプレナム内に引き込まれ、さらにブロア内、本体内に引き込まれ
、その後、本体ハウジング側面の吐出口から出て行く。

【００２４】 −ＨＡＮＡＡ検定の構成− 各チャンバでは、２つの測定波長を用いる。試料容器は細長く、シリコンが融
通性のあるものとして、ＨＡＮＡＡは物理的に分離された２つの窓３２と３３（
図４によって最もよく示されている）を任意に備えており、これを通して試料の
プローブが行われる。これにより、システムは２つの平行かつ直線状の光学路に
還元されるため、システムが簡単になるという大きな利点が得られる。すなわち
、これによりビームスプリッタやダイクロイックフィルタが不要になり、パッケ
ージサイズが劇的に小さくなる。図５には、フィルタホルダー３４と３５を除い
た状態で、試料モジュールの一方１４ａを示す。

【００２５】 −ＨＡＮＡＡ光学システム− 図６に光学システムを示す。この図では、光は右から左に２つの平行行路を進
む。ＬＥＤ３６と３７は、大きさ、電力消費およびコストの点でＨＡＮＡＡに適
合する基準を満たす。入手の容易さと比較的低い分散角のために標準的な５ｍｍ
ＬＥＤパッケージが使用される。青色ＬＥＤ３７は非常に低い分散半角（１０°
）を有する。光学路が非常に短く、集束要件を大目に見、モジュールを通る開口
径が大きいとすると、この分散特性は好都合である。緑色ＬＥＤ３６は１５°の
分散角を有するものであって、この値はかなり大きいが、ＨＡＮＡＡシステムで
は十分に狭いので、帯域クリーンアップフィルタの前にコリメートレンズが必要
になることはない。

【００２６】ＬＥＤスペクトラムの長波長ショルダを除くために、ＬＥＤの前には帯域フィ
ルタ３８と３９が必要である。これらの波長は発光波長と直接に重なるため、強
く減衰しておかなければならない。ＬＥＤからの光学ビームは分散性であるとす
ると、光はフィルタにある角度範囲で当たり、このため、低波長側に透過シフト
する。ＨＡＮＡＡチャンバモジュール内のすべてのフィルタはこの傾斜角の効果
を許容し得るように、概ね、用心深く決められた。特に発光フィルタは、通常よ
りも少しだけ長波長の帯域エッジを有するようにして、浅い角円錐に対するより
短波長の入射波長分を透過させるようにした。干渉励起フィルタは、吸収ガラス
によってバックアップされており、これにより発光帯域を超える長波長の放射を
取り除く。

【００２７】シリコンチャンバ内の窓側開口部３２、３３は比較的大きい（１．４×１．４
ｍｍ）。こうすることで、ＬＥＤレンズの焦点に必要な条件は最小限となり、標
準的な平凸レンズが使用できる。各ウィンドウ内での試料の励起ボリュームは約
１ｍｍ³である。

【００２８】加熱チャンバを出た光は、励起光も発光光も、別の平凸レンズによって集光さ
れ、再度平行な光になる。すべての発光光は、レンズの焦点約０．５ｍｍ内に入
るため、回収効率は非常に効率的である。集光部の立体角は実質的に励起された
ボリューム全体について等しく、全試料ボリュームが均一に励起される。試料モ
ジュールの大きさをかなり大きくすることなく励起光を検出パスから分離する方
法がないため、信頼性の置ける測定を行なうためには、発光フィルタで励起光を
効率的に排除する必要がある。実際的にはフィルタは非常によく機能する。励起
源からの検出器への漏洩光は一定の信号とみなされる。ＰＣＲ生成物の増加によ
り増大した信号は、漏洩光に加えて現れる。この結果、漏洩光により信号対雑音
比の減少はない。

【００２９】発光フィルタ上への入射角を制限するためには機械的手段も用いられる。コリ
メートレンズとフィルタ間の領域には、内部バッフルを備えた４ｍｍの光学路が
存在する。熱溶解積層法（ｆｕｓｅｄｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｍｏｄｅｌｉｎ
ｇ）マシンを用いて黒色ＡＢＳプラスチックでバッフル構造を形成する。光学チ
ャンネルは実質的に直径４ｍｍで、その側方には一連の４個の環状で鋸歯状の溝
を設け、これらは分散光をトラップしてそれらが壁面で偏向してフィルタに戻る
のを防ぐ。

【００３０】標準的なシリコンホトダイオードを検出に用い、その後に電荷積分回路を設け
る。積分時間は検定に応じて変えることができる。ＨＡＮＡＡの場合、試料内の
異なる２つのボリュームをわずかに異なる時間において検査する２つの分離され
た励起源が存在する。ＨＡＮＡＡのＬＥＤ源は波長において分離されているため
、単一光源装置と比べて、発光帯域は波長においても分離することができ、これ
により、隣接する検出器によって集光される発光光は少なくなる。

【００３１】最終的には、ＨＡＮＡＡにおいて信号を分離する鍵となるのは、発光源間の波
長の分離だけではなく、時間的な分離である。陽性検定ＬＥＤが照射される際に
は、陰性検定用の検出回路はオフにされる。このように、陰性検定を行なう際に
は、そのＬＥＤは、陽性検定用蛍光の励起ではるかに効率が小さくなる。励起の
効率を小さくしかつ集光の効率を小さくすることにより、ＨＡＮＡＡでは、補償
アルゴリズムなしで検定間の識別をすることができる。

【００３２】 −ポジティブコーリングアルゴリズム− 検定の識別は、実際には、光学検出システムで得られた生データの処理を行な
うポジティブコーリングアルゴリズムの一部として行われる。このアルゴリズム
は、高い信頼性で真の陽性を見極めつつ、偽陽性を排除するように設計される。
単一検定による偽陽性は、信号雑音や線形的に増大する信号によりもたらされる
可能性がある。二重検定を用いた場合、上述のように隣接する検定間のクロスト
ークの結果として偽陽性が生じる可能性もある。ＨＡＮＡＡで用いるアルゴリズ
ムは、改変型傾斜検出プロセッサである。これは絶対レベルではなく、信号レベ
ルの増加率に依拠している。絶対レベルは、当初の化学的状態や、システム雑音
および指数的な増大に対する線形的な信号のドリフトに関係する。

【００３３】すべての生信号は、実質的には第１０サイクル後の信号に対して正規化される
。すなわち、処理後の信号データは、常に第１０サイクルにおいて１．０の値を
有する。第１０サイクルは、試料溶液の混合が不十分であるなどの効果による何
らかの初期の信号変化を回避するために用いられる。また、これは十分である程
度に早期に行って真の陽性との干渉を避けるものとする。正規化前にはすべての
生信号は、２００カウントと第１０サイクルで記録されたカウント数との差に等
しくなる値からオフセットされる。これは、検定ごとまたはチャンバごとのバッ
クグラウンド信号の差を補償するために行われる。これはまた非常に微弱な信号
を希釈化する効果もある。

【００３４】正規化により、典型的なＰＣＲでは、処理された信号は１．０程度を前後し、
（濃度に応じて、通常は２０サイクル前後で）指数関数的増加が観察される。擬
陽性を招く危険を最小限にするため、ポジティブコーリングアルゴリズムでは、
１２サイクルに至るまでデータの分析は開始しない。この１２サイクルの時点で
、アルゴリズムは、正規化された信号における以前のサイクルから現サイクルま
での増加分を比較する。もし、増加分が予め設定された閾値（典型的には０．０
２）を超えたとき、そのサイクルに対してヒットが記録される。もし、４つの連
続サイクル中、３つのサイクルヒットが記録されればその検定は陽性と宣言され
、ユーザは警報を受ける。アルゴリズムは図７に模式的に描かれており、これは
以下の表１に示す分析データに対応するものである。

【００３５】

【表１】

【００３６】上述のように、ＨＡＮＡＡは一つのランでは信号対サイクル結果を表示しない
（部分的には、これは、モノクロディスプレイの解像度が６４×１２８しかなく
、８個までの個別検定を同時に行なうという事実によるものである。）。むしろ
、表示は検定の堅牢さに関する情報、およびそれがポジティブであるか否かの情
報を提示するために用いる。このようにすることにより、表示は、８つの検定の
それぞれについての単純な棒グラフを示すことになり、棒グラフのレベルが最新
の４サイクルにおけるヒット数に対応して０から最大４までの値を示す。レベル
が整数値をわずかに下回ることによりミスが表示される。不十分な検定では、グ
ラフは実行中に１〜１弱から０との間で、上下し、ときたまレベル２直下まで上
がるかもしれない。レベル２には、２回の連続ヒットがあったときにのみ到達す
ることになる。４サイクルのうち３回ヒットしたときには、グラフは影付けされ
、（オプションではあるが、）ビープ音を鳴らして装置は陽性を知らせる。当該
ランの間、影付きの最大レベルはラッチされる。標準的なポジティグ検定では、
１から２、３（影付）、４（影付）と棒グラフが徐々に上昇する。４レベルは良
好な検定であることをさらに示す。もし、棒グラフレベル４に達しない場合は、
検定は弱く、ほとんど陽性とは呼べない。もし、検定が弱いと見られた場合は、
ユーザは傾斜閾値を減らすことを考慮するべきである。

【００３７】 −ＨＡＮＡＡ電子回路／コントロールシステム− コントロールシステムは、１または２以上のマスターマイクロプロセッサおよ
び１または２以上のスレーブマイクロコントローラからなる。どちらのプロセッ
サもプログラム可能なタイプであり、このため、システムケースを開けることな
く、回路中のコードの変更／修正を行なうことができる。マスタープロセッサは
ＤＯＳを実行インテル（Ｉｎｔｅｌ）の８０３８６ＥＸである。これは５００ｋ
ＲＡＭ、クロック／カレンダー、６個のシリアルポートおよび２Ｍｂフラッシュ
ディスクを有する。このプロセッサは、ユーザインターフェースを有し、ログデ
ータのディスク記録、熱プロファイルの編集、チャンバごとの校正ルーチンの実
行、およびデータ分析（有機体のリアルタイム検出）を行なう。

【００３８】スレーブマイクロコントローラは、インテル（Ｉｎｔｅｌ）８０５１シリーズ
とコンパチブルな８ビットデバイスである。各コントローラは、３２ｋＲＡＭ、
および３２ｋＥＥＰＲＯＭを有し、また、反応チャンバヒーターを駆動する２個
のパルス幅変調出力、冷却ファン、ＬＥＤ、およびコントロール信号用のバイナ
リＩ／Ｏ、並びにチャンバ温度、電池電圧および電流を測定し、ＰＣＲプロセス
で得られたＤＮＡ信号を記録するためのアナログ入力を有する。

【００３９】以上述べてきたように、本発明の様々な実施形態を記載し、構造的詳細を図に
示した。様々な実施形態の詳細な説明は、本発明の一般的説明とともに、本発明
の原理を説明するためのものである。１つの実施形態は、本体、ならびに、生物
学的試料ボリュームを含むようにされた１または複数の試料チャンバモジュール
を含むポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムを提供する。各試料
チャンバモジュールは二重検定を実施する機能を有する。並行になった検査用ポ
ートが試料チャンバモジュールに動作可能に接続されている。

【００４０】ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出の別の実施形態は、各検査用ポー
トに動作可能に接続された線形検出システムを含む。線形検出システムは、実質
的に互いに平行に配置されている。試料チャンバモジュールは、本体に分離可能
に接続される。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施
形態は携帯可能である。本体は、長さが約１０インチ（２５．４センチ）以下、
幅が約４インチ（１０センチ）以下、奥行が約２インチ（５．１センチ）以下で
あり、重さが約２ポンド（０．９ｋｇ）以下である。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮ
Ａ増幅および検出システムの別の実施形態は電池駆動である。各試料チャンバモ
ジュールは、複数のポートを有し、これらは試料ボリューム中の異なる領域を検
査する。平行に設けられた各検査用ポートは、それぞれ光学的蛍光検出システム
を有する。

【００４１】ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施形態は、スリ
ーブ内に複数の溝を有し、これによってスリーブのヒートマスを減少させ表面積
を増大させたスリーブ型反応チャンバを含む。複数の溝は、少なくとも１本の縦
方向に延びる溝、少なくとも１本の半径方向に延びる溝、および縦方向に延びる
溝と接続する少なくとも１本の半径方向に延びる溝を有し、これらはこれらを通
る流通路を形成する。

【００４２】システムの別の実施形態は、平行に設けられた各検査用ポート内に光エネルギ
ーを導入するＬＥＤを有し、平行に設けられた各検査用ポートには帯域フィルタ
が設けられている。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の
実施形態は、ポジティブコーリングアルゴリズム、検定状態を示すユーザインタ
フェース、１または複数のマスターマイクロプロセッサ、および１または複数の
スレーブマイクロコントローラを含む。

【００４３】このシステムの様々な実施形態において、試料は少なくとも１つの多重的試料
チャンバモジュールに装入される。試料はシリコンベース内の加熱ユニットを用
いることにより加熱され、また、試料は冷却される。光エネルギーが平行検査用
ポートを通して試料内に導入され、試料の特性が検出される。

【００４４】本発明は様々な修正や異なる形とすることが可能であり、具体的な実施形態を
図面に例として挙げここで記載した。しかし、本発明は、具体的に開示したかた
ちに限定されるものと理解してはならない。そうではなくて、本発明は、請求の
範囲に規定するように、本発明の思想および範囲内に含まれるすべての修正、等
価な構成および変形を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態を説明する図である。

【図２】マイクロ加工された、シリコンＰＣＲヒーターチャンバの等角投影図である。

【図３】ＰＣＲヒーターチャンバの空冷法を示す断面図である。

【図４】上部チャンネルが内部的なポジティブコントロール用に使用されるＨＡＮＡＡ
の標準的な検定の構成を示す図である。

【図５】フィルタホルダーを除いたＨＡＮＡＡチャンバモジュールを示す図である。

【図６】ＨＡＮＡＡの光学路を示す概略図である。

【図７】ＨＡＮＡＡで用いるポジティブコーリングアルゴリズムを図解したグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リチャーズ，ジェイムズ，ビー．アメリカ合衆国，94506 カリフォルニア州，ダンヴィル，ローレンスロード 1463 (72)発明者ストラットン，ポール，エル．アメリカ合衆国，94513 カリフォルニア州，ブレントウッド，ウィンザーウェイ 1369 (72)発明者ハドリー，ディーン，アール．アメリカ合衆国，95337 カリフォルニア州，マンテカ，チャブリスウェイ 449 (72)発明者ミラノヴィッチ，フレッド，ピー．アメリカ合衆国，94549 カリフォルニア州，ラファイエット，ウッドヴュードライヴ 3383 (72)発明者ベルグラダー，フィリップアメリカ合衆国，95336 カリフォルニア州，マンテカ，ペブルウェイ 719 (72)発明者メイヤー，ピーター，エル．アメリカ合衆国，95684 カリフォルニア州，サマセット，ヴァンプーカコート 7570 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 HA14 HA19 4B029 AA07 AA23 BB20 FA15 4B063 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR56 QR62 QS11 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的試料ボリュームを含み得るようなされた１つまたは
複数の試料チャンバモジュールであって、前記各試料チャンバモジュールが、二
重検定を行ない得るものである試料チャンバモジュールと、試料チャンバモジュールに動作可能に接続した平行な検査用ポートを有するポ
リメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２】前記各検査用ポートに線形検出システムが動作可能に接続さ
れている請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム
。
【請求項３】前記各検査用ポートに動作可能に接続された線形検出システ
ムを含み、前記線形検出システムが実質的に互いに平行に配置されている請求項
１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項４】本体に対し取り外し可能に接続された１または複数のチャン
バモジュールを備えた本体を含む請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ
増幅および検出システム。
【請求項５】前記本体および１または複数のチャンバモジュールが携帯可
能である請求項４に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム
。
【請求項６】前記本体の長さが約１２インチ以下である請求項４に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項７】前記本体の長さが約１０インチ以下である請求項４に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項８】前記本体の幅が約６インチ以下である請求項４に記載のポリ
メラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項９】前記本体の幅が約４インチ以下である請求項４に記載のポリ
メラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項１０】前記本体の深さが約４インチ以下である請求項４に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項１１】前記本体の深さが約２インチ以下である請求項４に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項１２】前記本体と１または複数の前記チャンバモジュールの重さ
が約５ポンド未満である請求項４に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅およ
び検出システム。
【請求項１３】前記本体と１または複数の前記チャンバモジュールの重さ
が約２ポンド以下である請求項４に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅およ
び検出システム。
【請求項１４】前記本体と１または複数の前記チャンバモジュールが電池
駆動である請求項４に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システ
ム。
【請求項１５】前記検査用ポートのそれぞれが固有の光学的蛍光検出シス
テムを有する請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出シス
テム。
【請求項１６】前記平行に設けられた検査用ポートのそれぞれが固有の光
学的蛍光検出システムを有する請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増
幅および検出システム。
【請求項１７】前記試料チャンバモジュールのそれぞれが、前記試料ボリ
ューム内の個別の検査領域をそれぞれの光学的蛍光検出システムを用いて検査す
る多重ポートを有する請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および
検出システム。
【請求項１８】スリーブ型反応チャンバを含み、これはスリーブ内に複数
の溝を有し、これによってスリーブのヒートマスを減少させ表面積を増大させる
請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項１９】前記複数の溝は、少なくとも１本の縦方向に延びる溝、少
なくとも１本の半径方向に延びる溝、および前記縦方向に延びる溝と接続する少
なくとも１本の半径方向に延びる溝を有し、これらはこれらを通る流通路を形成
する請求項１８に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２０】前記複数の溝は、前記スリーブの反対側面上に延びる少な
くとも１本の縦方向の溝、および前記縦方向に延びる溝と接続する少なくとも１
本の半径方向に延びる溝を有し、これらはこれらを通る流通路を形成する請求項
１９に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２１】前記スリーブの反対側面上に２本の縦方向に延びる溝が配
置され、前記の半径方向に延びる接続溝の複数が前記スリーブの反対の端部分に
沿って位置する請求項２０に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出
システム。
【請求項２２】前記各溝がＶ字型の形状を有する請求項２１に記載のポリ
メラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２３】前記スリーブがシリコン製である請求項２２に記載のポリ
メラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２４】前記スリーブ型反応チャンバが２つの部分からなり、前記
部分は接着またはクランプ止めされている請求項２３に記載のポリメラーゼ連鎖
反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２５】前記２つの部分がチャンバを規定し、その間に挿入物を包
み込み、前記挿入物は前記チャンバを定める２つの部分の壁面の少なくとも一部
と直接接触するよう構成されている請求項２４に記載のポリメラーゼ連鎖反応Ｄ
ＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２６】ＬＥＤが前記平行に設けられた検査用ポートのそれぞれに
光エネルギーを向ける請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および
検出システム。
【請求項２７】前記平行に設けられた検査用ポート内に帯域フィルタを有
する請求項２６に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項２８】非直交的な、蛍光による、高度にコンパクトな光学検出シ
ステムを含む請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出シス
テム。
【請求項２９】検定状態を示すユーザインターフェースを含む請求項１に
記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項３０】１または複数のマスターマイクロプロセッサおよび１また
は複数のスレーブマイクロコントローラを含む請求項１に記載のポリメラーゼ連
鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項３１】前記試料ボリューム内に生物学的作用物質が存在したとき
に判定を行なうポジティブコーリングアルゴリズムを含む請求項１に記載のポリ
メラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項３２】特定の検定の有効性を表示する状態表示ディスプレイを含
む請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。
【請求項３３】前記本体内に電子回路を含み、前記スリーブ型反応チャン
バを介して前記本体を出て外気を効率的に結合し前記試料と前記電子回路を同時
に冷却する強制冷却通気管を含む請求項２５に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮ
Ａ増幅および検出システム。
【請求項３４】二重検定を行ない得る試料チャンバモジュール内に生物学
的試料を挿入するステップ、および前記試料チャンバモジュールに動作可能に結
合した平行に設けられた検査用ポートを通して前記生物学的試料に光エネルギー
を向けるステップを含むポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項３５】前記光エネルギーが前記生物学的試料に線形検出システム
を通して向けられる請求項３４に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および
検出方法。
【請求項３６】前記試料をシリコンベース内の加熱ユニットを用いて加熱
するステップ、および前記試料を冷却するステップを含む請求項３４に記載のポ
リメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項３７】スリーブ型反応チャンバを通して冷却用空気を強制的に通
気させ前記生物学的試料を冷却することを含む請求項３６に記載のポリメラーゼ
連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項３８】前記試料チャンバモジュールが個別の試料チャンバを含み
、さらに試料チャンバを前記生物学的試料が可及的速やかに所望の温度に達して
それを維持するように一時的に過熱するステップを含む請求項３４に記載のポリ
メラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項３９】多数の信号増加と前記増加についてのサイクルごとの閾値
との関係に基づいて前記試料の検定が陽性であるかを判定するステップを含む請
求項３４に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項４０】前記検定のそれぞれについて確実度または信頼度をリアル
タイムで表示するステップを含む請求項３９に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮ
Ａ増幅および検出方法。