JP2003528567A - Human hydrolase protein - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、ヒトヒドロラーゼタンパク質(HYDRL)と、HYDRLを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、HYDRLの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。 (57) Abstract The present invention provides human hydrolase proteins (HYDRLs) and polynucleotides that identify and encode HYDRLs. The invention also provides expression vectors and host cells, antibodies, agonists, antagonists. Furthermore, the present invention provides a method for diagnosing, treating, or preventing a disease associated with the expression of HYDRL.
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、ヒドロラーゼタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列、並びにこ
れらの配列を用いた細胞増殖異常症、自己免疫異常症/炎症性疾患、神経障害、
腎障害、副腎機能不全症、及び遺伝障害の診断、治療並びに予防に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid sequence and an amino acid sequence of a hydrolase protein, and abnormal cell proliferation, autoimmune disorder / inflammatory disease, neuropathy, and the like using these sequences.
The present invention relates to diagnosis, treatment and prevention of renal disorders, adrenal insufficiency, and genetic disorders.
【0002】
(発明の背景)
加水分解とは、水の分子を導入することによって基質内の共有結合を破壊する
ことである。加水分解反応は、基質上の標的結合における水分子の酸素原子によ
る求核作用に関与している。水分子は、標的結合全域で分裂し、標的結合を破壊
し、2個の生成物分子を生成する。ヒドロラーゼは、細胞信号発信、細胞増殖、
炎症、アポトーシス、分化、排出等の機能に不可欠な反応に関係する。ヒドロラ
ーゼは、これらの機能に関与するような疾患プロセスにおいて鍵となる段階に関
与している。ヒドロラーゼは加水分解酵素であり、基質特性によって、アミノヒ
ドロラーゼ、ホスホリパーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ホスホジエストラー
ゼ、グリコシダーゼ、グリオキサラーゼ、スルファターゼ、ホスホヒドロラーゼ
、セリンヒドロラーゼ、リゾチームを含むクラスにグループ分けされるであろう
。BACKGROUND OF THE INVENTION Hydrolysis is the disruption of covalent bonds within a substrate by the introduction of water molecules. The hydrolysis reaction is involved in the nucleophilic action of the oxygen atom of the water molecule in the target binding on the substrate. Water molecules split across target binding, breaking target binding and producing two product molecules. Hydrolases are used for cell signaling, cell proliferation,
It is involved in reactions essential for functions such as inflammation, apoptosis, differentiation and excretion. Hydrolases are involved in key steps in disease processes such as those involved in these functions. Hydrolases are hydrolases and are grouped according to their substrate properties into classes including aminohydrolases, phospholipases, carboxylesterases, phosphodiesterases, glycosidases, glyoxalase, sulfatases, phosphohydrolases, serine hydrolases, lysozymes. Let's do it.
【0003】
NG,NG-ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ(DDAH)は、内因性酸
化窒素シンターゼ(NOS)阻害因子、NG-モノメチルアルギニン、及びNG,NG-ジメ
チル-L-アルギニンを、L-チトルリンに加水分解する酵素である。DDAHを阻害す
ることによって、NOS阻害因子の細胞内濃度はNOSを阻害するのに十分なレベルま
でを高められる。従って、DDAHを阻害することはNOSを阻害する手段となり、DDA
Hの活性における変化は、酸化窒素生成における異常生理学的変異において役割
を果たすことが可能である(MacAllister, R.J. ら (1996) Br. J. Pharmacol.
119:1533-1540)。DDAHは、アルツハイマー病において細胞骨格の異常及び酸化
ストレスを示すようなニューロンに見られる。年齢に適した管理をしている場合
には、ニューロンにDDAHは見られなかった。このことは、アルツハイマー病の病
原論において酸化ストレス及び酸化窒素が介在する事象が何らかの役割を演じて
いることを示唆している(Smith, M.A. ら (1998) Free Rad. Biol. Med. 25:89
8-902)。NG, NG-dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH) hydrolyzes the endogenous nitric oxide synthase (NOS) inhibitor, NG-monomethylarginine, and NG, NG-dimethyl-L-arginine into L-citrulline. It is an enzyme that decomposes. By inhibiting DDAH, intracellular concentrations of NOS inhibitors can be increased to levels sufficient to inhibit NOS. Therefore, inhibiting DDAH is a means of inhibiting NOS,
Changes in H activity can play a role in abnormal physiological mutations in nitric oxide production (MacAllister, RJ et al. (1996) Br. J. Pharmacol.
119: 1533-1540). DDAH is found in neurons that exhibit cytoskeletal abnormalities and oxidative stress in Alzheimer's disease. Neurons did not show DDAH in age-matched management. This suggests that oxidative stress and nitric oxide-mediated events play a role in the pathogenesis of Alzheimer's disease (Smith, MA et al. (1998) Free Rad. Biol. Med. 25:89.
8-902).
【0004】
ホスホジエストラーゼは、ホスホジエステルに2つあるエステル結合のうち1
つのエステル結合の加水分解に対して触媒作用を及ぼす。従って、ホスホジエス
トラーゼは、様々な細胞のプロセスに非常に重要である。ホスホジエストラーゼ
は、タンパク質合成のみならず細胞の成長及び複製に不可欠であるようなDNA及
びRNAのエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含む。Phosphodiesterase is one of two ester bonds in phosphodiester.
It catalyzes the hydrolysis of one ester bond. Therefore, phosphodiesterases are very important in various cellular processes. Phosphodiesterases include DNA and RNA endonucleases and exonucleases that are essential for cell growth and replication as well as protein synthesis.
【0005】
膵リパーゼ及び補リパーゼは、複合体を形成する。この複合体は、不溶性の長
鎖トリアシルグリセロールを腸管細胞の刷子縁を越えることができるような極性
分子へより多く転換することによって食事脂肪を消化させる際に、役割を演じる
ようなものである。補リパーゼは、リパーゼのC末端ドメインに結合する。この
相互作用は、溶解状態で、補リパーゼのグルタミン酸残基とリパーゼのリシン残
基との間に形成されるイオン対の形成に関与している。これらの残基は、種の間
で厳密に転換される(Ayvazian, L. ら (1998) .J. Biol. Chem. 273:33604-336
09)。補リパーゼは、膵臓リパーゼにおいて胆汁酸塩の阻害因子効果に打ち克つ
ものと思われる(1999年4月28日のOMIM 246600)。Pancreatic lipase and co-lipase form a complex. This complex is likely to play a role in digesting dietary fat by converting insoluble long-chain triacylglycerols into more polar molecules that can cross the brush border of intestinal cells. . Complement lipase binds to the C-terminal domain of lipase. This interaction is involved in the formation of the ion pair formed in solution between the glutamate residue of co-lipase and the lysine residue of lipase. These residues are strictly converted between species (Ayvazian, L. et al. (1998) .J. Biol. Chem. 273: 33604-336.
09). Complement lipase appears to overcome the inhibitory effect of bile salts on pancreatic lipase (OMIM 246600, April 28, 1999).
【0006】
カルボキシルエステラーゼは、カルボン酸エステルを加水分解するタンパク質
であり、A、B、Cの3つのカテゴリーに分けられる。殆どのB型カルボキシル
エステラーゼは、進化論的に関連し、タンパク質ファミリーを構成するものと考
えられる。タンパク質のB型カルボキシルエステラーゼファミリーには、脊椎動
物アセチルコリンエステラーゼ、哺乳類の肝臓ミクロソームのカルボキシルエス
テラーゼ、哺乳類の胆汁酸塩活性リパーゼ、アヒルの脂肪アシル-CoA ヒドロラ
ーゼ等が含まれる。このタンパク質ファミリーのメンバーには、サイログロブリ
ンやショウジョウバエのタンパク質神経アクチンのように、触媒的に活性でない
が進化論的に他のB型カルボキシルエステラーゼに関係するようなドメインを含
むものもある。カルボキシルエステラーゼの活性部位には、セリン、グルタミン
酸またはアスパラギン酸のエステル、ヒスチジンの3残基が含まれる。この触媒
部位を取り囲む配列は、よく保存されており、サインパターンとして用いること
ができる(www.expasy.ch/cgi-bin/get-prodoc-entry のPROSITEの1999年5月11
日時点でのドキュメンテーション入力PDOC00112)。[0006] Carboxylesterase is a protein that hydrolyzes carboxylic acid esters and is classified into three categories, A, B, and C. Most B-type carboxylesterases are evolutionarily related and are thought to constitute a protein family. The B-type carboxylesterase family of proteins includes vertebrate acetylcholinesterase, mammalian liver microsomal carboxylesterase, mammalian bile salt active lipase, duck fatty acyl-CoA hydrolase and the like. Some members of this protein family include domains that are not catalytically active but evolutionarily related to other B-type carboxylesterases, such as the thyroglobulin and Drosophila protein neuronal actin. The active site of carboxylesterase contains three residues of serine, an ester of glutamic acid or aspartic acid, and histidine. The sequence surrounding this catalytic site is well conserved and can be used as a signature pattern (see PROSITE, www.expasy.ch/cgi-bin/get-prodoc-entry, May 1999 11).
Documentation input as of day PDOC00112).
【0007】
アシル-CoA チオエステラーゼは、カルボキシルエステラーゼファミリーの別
のメンバーである(Alexson, S.E. ら (1993) Eur. J. Biochem. 214:719-727)
。アシル-CoA チオエステラーゼがステロイド合成組織において調節的役割を有
していることを示唆している証拠がある(Finkielstein, C. ら (1998) Eur. .J
. Biochem. 256:60-66)。Acyl-CoA thioesterase is another member of the carboxylesterase family (Alexson, SE et al. (1993) Eur. J. Biochem. 214: 719-727).
. There is evidence suggesting that acyl-CoA thioesterases have a regulatory role in steroidogenic tissues (Finkielstein, C. et al. (1998) Eur. .J
Biochem. 256: 60-66).
【0008】
ホスホリパーゼA2 阻害因子は、ヒトの多ロイシンα2 グリコプロテインと3
3%の配列相同性を有していると同定されている(Okumura, K. ら (1998) J. B
iol. Chem. 273:19469-19475)。多ロイシン反復(LRR)コンセンサス配列は、
ホルモンの受容体、酵素、酵素阻害因子、細胞癒着のためのタンパク質、リボソ
ーム結合タンパク質等、生物学的に重要なプロセスに関係するようなタンパク質
を含む多数のタンパク質の1次構造においても見られる。LRRを含有する全ての
タンパク質ドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用に関与していると考え
られる。Phospholipase A 2 inhibitors are associated with human multileucine α 2 glycoprotein and 3
It has been identified as having 3% sequence homology (Okumura, K. et al. (1998) J. B.
iol. Chem. 273: 19469-19475). The multileucine repeat (LRR) consensus sequence is
It is also found in the primary structure of many proteins, including proteins that are involved in biologically important processes such as hormone receptors, enzymes, enzyme inhibitors, proteins for cell adhesion, ribosome binding proteins and the like. All protein domains containing LRR are thought to be involved in protein-protein interactions.
【0009】
グリオキサラーゼシステムは、メチグリオキサールからS-D-ラクトイルグルタ
チオンを形成する際に触媒作用を及ぼすようなグリオキサラーゼIと、トリオー
スリン酸エネルギー代謝の副次生成物と、S-D-ラクトイルグルタチオンをD-乳酸
に加水分解し、グルタチオンを減少させるようなグリオキサラーゼIIとからなる
。メチグリオキサールのレベルは、過血糖症の間、おそらくトリオースリン酸エ
ネルギー代謝が増加することによって上昇する。レベルの上昇したグリオキサラ
ーゼII活性は、ヒトの非インスリン依存型糖尿病及び同病のラットモデルにおい
て見られる。グリオキサラーゼシステムは、細菌性毒の解毒と、細胞増殖及び微
小管アセンブリの制御に関与している。レベルの上昇したS-D-ラクトイルグルタ
チオンは、グリオキサラーゼIIの基質であり、HL60細胞の成長停止及び毒性を低
減させる。従って、グリオキサラーゼシステム及び特にグリオキサラーゼIIは、
細胞増殖及び糖尿病等の自己免疫疾患に関連するであろう。The glyoxalase system consists of glyoxalase I, which catalyzes the formation of SD-lactoylglutathione from methiglyoxal, a by-product of triosephosphate energy metabolism, and SD-lactoylglutathione. Is hydrolyzed to D-lactic acid to reduce glutathione, and consists of glyoxalase II. Metglioxal levels are elevated during hyperglycemia, presumably by increasing triose phosphate energy metabolism. Elevated levels of glyoxalase II activity are found in human non-insulin dependent diabetes and rat models of the same. The glyoxalase system is involved in the detoxification of bacterial toxins and the regulation of cell growth and microtubule assembly. Elevated levels of SD-lactoyl glutathione are substrates for glyoxalase II and reduce growth arrest and toxicity in HL60 cells. Thus, the glyoxalase system and especially glyoxalase II
It may be associated with cell proliferation and autoimmune diseases such as diabetes.
【0010】
α/βヒドロラーゼタンパク質のフォールドは、系統発生的起源及び触媒機能
が異なる幾つかのヒドロラーゼに共通している。α/βヒドロラーゼのフォール
ドを伴なう酵素は、αヘリックスで連結された8枚のβシートからなる共通の核
構造を有する。このフォールドの最も保存された構造機能は、求核性ヒスチジン
酸の触媒三つ組のループである。求核性ループ及び酸ループは1つ以上の型のア
ミノ酸を収容するが、触媒三つ組におけるヒスチジンは完全に保存される(Olli
s, D.L. ら (1992) Protein Eng. 5:197-211)。[0010] The α / β hydrolase protein fold is common to several hydrolases of differing phylogenetic origin and catalytic function. Enzymes associated with the α / β hydrolase fold have a common nuclear structure consisting of eight β-sheets linked by α-helices. The most conserved structural function of this fold is the loop of the catalytic triad of nucleophilic histidine acids. The nucleophilic and acid loops accommodate more than one type of amino acid, but histidine in the catalytic triad is completely conserved (Olli
s, DL et al. (1992) Protein Eng. 5: 197-211).
【0011】
スルファターゼは、広範囲にわたる配列相同性及び高度の構造的類似性を共有
するような高度に保存された遺伝子ファミリーのメンバーである。スルファター
ゼは、硫酸エステルの分割に対して触媒作用を及ぼす。この機能を発揮するため
、保存されたシステイン残基の酸化に関与するような小胞体において、スルファ
ターゼは独自の後翻訳変異を受ける。ヒトの疾患で多発性スルファターゼ欠損と
称されるものは、不活性スルファターゼに至らしめるようなこの後翻訳変異段階
における欠陥に起因するものである(Recksiek, M. ら (1998) J. Biol. Chem.
273:6096-6103)。Sulfatase is a member of a highly conserved gene family that shares extensive sequence homology and a high degree of structural similarity. Sulfatase catalyzes the cleavage of sulfates. To exert this function, sulfatase undergoes a unique post-translational mutation in the endoplasmic reticulum, which is involved in the oxidation of conserved cysteine residues. What is referred to as multiple sulfatase deficiency in human disease is due to a defect in this posttranslational mutational stage leading to inactive sulfatase (Recksiek, M. et al. (1998) J. Biol. Chem. .
273: 6096-6103).
【0012】
ホスホヒドロラーゼは、リン酸エステルを加水分解する酵素である。ホスホヒ
ドロラーゼの中には、mutT ドメインサイン配列を含むものもある。mutTは、DNA
から酸化的にダメージを受けた形状のグアニンを取り除く責任を有するようなGO
システムに関与するタンパク質である。mutTのN末端に見られる約40アミノ酸
残基の領域は、ホスホヒドロラーゼを含む他のタンパク質においても見られる(
www.expasy.ch/cgi-bin/get-prodoc-entry のPROSITEの1999年4月27日時点での
ドキュメンテーション入力PDOC00695)。Phosphohydrolase is an enzyme that hydrolyzes phosphate esters. Some phosphohydrolases contain a mutT domain signature sequence. mutT is DNA
GO responsible for removing oxidatively damaged forms of guanine from
It is a protein involved in the system. The region of about 40 amino acid residues found at the N-terminal of mutT is also found in other proteins including phosphohydrolase (
Documentation input for PROSITE at www.expasy.ch/cgi-bin/get-prodoc-entry as of April 27, 1999 PDOC00695).
【0013】
グリコシダーゼは、1個以上の糖を含む化合物であるようなグリコシドのヘミ
アセチル結合の分割に対して触媒作用を及ぼす。哺乳類のβガラクトシダーゼは
、ガングリオシド、グリコプロテイン、及びグリコサミノグリカンから末端ガラ
クトースを取り除く。βガラクトシダーゼは、グリコシルヒドロラーゼに分類さ
れるファミリー35に属する。この酵素の欠損と、B型モルキオ病として知られ
る遺伝病であるGM1-ガングリオシドーシスとは関連がある(www.expasy.ch/cgi-
bin/get-prodoc-entry のPROSITEの1999年5月12日時点でのドキュメンテーショ
ン入力PDOC00910)。Glycosidases catalyze the cleavage of hemiacetyl bonds of glycosides, such as compounds containing one or more sugars. Mammalian β-galactosidase removes terminal galactose from gangliosides, glycoproteins, and glycosaminoglycans. β-galactosidase belongs to family 35, which is classified as a glycosyl hydrolase. Deficiency of this enzyme is associated with GM1-gangliosidosis, a genetic disease known as type B Morquio disease (www.expasy.ch/cgi-
Documentation input PDOC00910 of PROSITE in bin / get-prodoc-entry as of May 12, 1999).
【0014】
セリンヒドロラーゼは、その活性部位にセリン残基を含むような機能的クラス
の加水分解酵素である。この酵素クラスには、多様な基質を加水分解するプロテ
イナーゼ、エステラーゼ、及びリパーゼが含まれるので、このクラスの生物学的
役割は異なる。このスーパーファミリーにあるタンパク質は、基質特性またはア
ミノ酸相似性に基づいて更にサブファミリーにグループ分けすることができる(
Puente, X.S. 及び C. Lopez-Ont (1995) J. Biol. Chem. 270:12926-12932)。
セリンヒドロラーゼスーパーファミリーの1つのメンバーに、ショウジョウバエ
胎芽のcDNAライブラリから単離したショウジョウバエ遺伝子であるクラーケンが
ある。クラーケンは、カルボニル基を含むグループを有する基質の分割に対して
触媒作用を及ぼすようなメンバーを有するサブファミリーに属する(Chan, E.
ら (1998) Gene 222:195-201)。Serine hydrolases are a functional class of hydrolases that contain a serine residue in their active site. The biological role of this class is different because it includes proteinases, esterases, and lipases that hydrolyze various substrates. Proteins in this superfamily can be further grouped into subfamilies based on substrate properties or amino acid similarities (
Puente, XS and C. Lopez-Ont (1995) J. Biol. Chem. 270: 12926-12932).
One member of the serine hydrolase superfamily is Kraken, a Drosophila gene isolated from a Drosophila embryo cDNA library. Krakens belong to a subfamily with members that catalyze the resolution of substrates with groups containing carbonyl groups (Chan, E.
(1998) Gene 222: 195-201).
【0015】
リゾチームcスーパーファミリーは、通常のリゾチームc、カルシウム結合リ
ゾチームc、及びαラクトアルブミンからなる(Prager, E.M. 及び P. Jolles
(1996) EXS 75:9-31)。リゾチームcスーパーファミリーのタンパク質は、35
〜40%の配列相同性及び共通の3次元フォールドを有するが、異なる機能を有
することがある。リゾチームcは、様々な組織及び分泌物に遍在し、或る種の細
菌の細胞壁を溶解させることができる(McKenzie, H.A. (1996) EXS 75:365-409
)。αラクトアルブミンは、カルシウムを結合し、ラクトースの合成に関係する
ようなメタロプロテインである(Iyer, L.K. 及び P.K. Qasba (1999) Protein
Eng. 12: 129-139)。αラクトアルブミンは、哺乳類の乳汁及び初乳に存在する
(McKenzie、前出)。The lysozyme c superfamily consists of normal lysozyme c, calcium-binding lysozyme c, and alpha lactalbumin (Prager, EM and P. Jolles.
(1996) EXS 75: 9-31). 35 proteins of the lysozyme c superfamily
It has ~ 40% sequence homology and a common three-dimensional fold, but may have different functions. Lysozyme c is ubiquitous in various tissues and secretions and can lyse the cell wall of certain bacteria (McKenzie, HA (1996) EXS 75: 365-409.
). Alpha-lactalbumin is a metalloprotein that binds calcium and is involved in lactose synthesis (Iyer, LK and PK Qasba (1999) Protein).
Eng. 12: 129-139). Alpha-lactalbumin is present in mammalian milk and colostrum (McKenzie, supra).
【0016】
リゾチームは、細菌の細胞壁の或る種のムコ多糖、特にN-アセチルムラミン酸
とN-アセチルグルコサミンとのβ(1-4)グリコシド結合の加水分解に対して触
媒作用を及ぼし、細菌性溶解を引き起こす。リゾチームは、ウイルス、鳥類、哺
乳動物を含む種々の生体に発生する。ヒトにおいては、脾臓、肝臓、腎臓、白血
球、血漿、唾液、乳汁、涙、及び軟骨にリゾチームが見られる(Online Mendeli
an Inheritance in Man (OMIM) #153450 Lysozyme、Weaver, L.H. ら (1985) J.
Mol. Blot. 184:739-741)。リゾチームcは、反芻動物内において摂取した細
菌細胞からタンパク質を解放する消化酵素として機能し、ヒトの新生児内でも同
様の機能を発揮するであろう(Braun, O.H. ら (1995) Klin. Pediatr. 207:4-7
)。Lysozyme catalyzes the hydrolysis of β (1-4) glycosidic bonds between certain mucopolysaccharides of the bacterial cell wall, especially N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine, Causes bacterial lysis. Lysozyme occurs in a variety of organisms including viruses, birds and mammals. In humans, lysozyme is found in the spleen, liver, kidneys, white blood cells, plasma, saliva, milk, tears, and cartilage (Online Mendeli
an Inheritance in Man (OMIM) # 153450 Lysozyme, Weaver, LH et al. (1985) J.
Mol. Blot. 184: 739-741). Lysozyme c functions as a digestive enzyme that releases proteins from ingested bacterial cells in ruminants and may exert similar functions in human neonates (Braun, OH et al. (1995) Klin. Pediatr. 207). : 4-7
).
【0017】
リゾチームの型はニワトリ型及びグース型の2つがよく知られており、もとは
それぞれニワトリの卵白及びガチョウの卵白から単離されたものである。ニワト
リ型リゾチームとグース型リゾチームは、3次元構造が類似であるがアミノ酸配
列が異なる(Nakano, T. 及び T. Graf (1991) Biochim. Biophys. Acta 1090:2
73-276)。ニワトリの中性親和性顆粒球(異染)にはニワトリ型、グース型のリ
ゾチームが共に見られるが、ニワトリの卵白にはニワトリ型リゾチームのみが見
られる。通常ニワトリ型リゾチームのmRNAは、骨髄、脾臓、嚢、卵管の細胞のみ
ならず、癒着性の単球及びマクロファージにも、非着性の前骨髄球及び顆粒球に
も見られる。グース型リゾチームのmRNAは、骨髄及び肺の非着性細胞に見られる
。幾つかのイソチームは、白血球形、胃腸形と、おそらくはリンパ球形を含めて
、ウサギにおいて見られる(前出のOMIM #153450、前出のNakano 及び Graf、及
びGenBank GI 1310929)。ニワトリ型リゾチームに類似のタンパク質をコードす
るようなヒトのリゾチーム遺伝子は、クローン複製されている(Yoshimura, K.
ら (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:794-801)。規則的に離隔した
システイン残基の特色をなすようなコンセンサスモチーフは、多様な種のリゾチ
ームC酵素に由来している(Swiss Institute of Bloinformatics がhttp://exp
asy.hcuge.chで提供するProsite のドキュメンテーション入力P500128)。リゾ
チームCは、アミノ酸配列の40%がαラクトアルブミンと同一である。Two types of lysozyme are well known, a chicken type and a goose type, and they are originally isolated from chicken egg white and goose egg white, respectively. Chicken lysozyme and goose lysozyme have similar three-dimensional structures but different amino acid sequences (Nakano, T. and T. Graf (1991) Biochim. Biophys. Acta 1090: 2).
73-276). Both chicken-type and goose-type lysozymes are found in the neutral-affinity granulocytes of chickens (metachromatic), but only chicken-type lysozyme is found in the egg white of chickens. Usually, chicken lysozyme mRNA is found not only in cells of bone marrow, spleen, sac, and oviduct, but also in adherent monocytes and macrophages, and in nonadherent promyelocytes and granulocytes. Goose-type lysozyme mRNA is found in non-adherent cells of bone marrow and lung. Some isozymes are found in rabbits, including leukocyte, gastrointestinal, and possibly lymphoid (OMIM # 153450, supra, Nakano & Graf, supra, and GenBank GI 1310929). The human lysozyme gene, which encodes a protein similar to chicken lysozyme, has been cloned and replicated (Yoshimura, K.
(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 150: 794-801). A consensus motif that features regularly spaced cysteine residues is derived from lysozyme C enzymes of diverse species (Swiss Institute of Bloinformatics http: // exp.
Prosite documentation input provided by asy.hcuge.ch P500128). Lysozyme C is 40% identical in amino acid sequence to α-lactalbumin.
【0018】
リゾチームは、幾つかの病気と関連がある。リゾチーム尿は、糖尿病性ニュー
ロパシー(Shima, M. ら (1986) Clin. Chem. 32:1818-1822)、地方流行性ニュ
ーロパシー(Bruckner, I ら (1978) Med. Interne. 16:117-125)、尿路機能不
全(Heidegger, H. (1990) Minerva Ginecol. 42:243-250)、及び急性単球性白
血病(Shaw, M.T. (1978) Am. J. Hematol. 4:97-103)に観察される。Nakano(
前出)は、宿主防衛システムにおいてリゾチームが果たす役割を示唆している。
遺伝性リゾチームを欠いている老ウサギは、皮下膿瘍等の感染に対して感受性が
増している(OMIM #153450、前出)。ヒトのリゾチーム遺伝子の突然変異は、遺
伝系統的アミロイドーシスの原因となる。遺伝系統的アミロイドーシスは、腎臓
、副腎腺、脾臓、及び肝臓を含む内臓にアミロイドが沈着するような稀な常染色
体性優性遺伝病であり、通常50才までに致命的な症状を現す。アミロイド沈着
物には、様々な形状のリゾチームが含まれる。腎アミロイドーシスは、最も一般
的で、潜在的に最も深刻な器官形状に関係する(Pepys, M.B. ら (1993) Nature
362:553-557、OMIM #105200 Familial Visceral Amyloidosis、Cotran, R.S.
ら (1994) Robbins Pathologic Basis of Disease, W.B. Saunders Company, Ph
iladelphia PA, pp. 231-238)。細菌性髄膜炎を患う患者の髄液において、リゾ
チーム及びラクタートのレベルの増加が観察される。(Ponka, A. ら (1983) In
fection 11:129-131)。急性単球性白血病は、塊状リゾチーム尿によって特徴付
けられる(Den Tandt, W.R. (1988) Int. J. Biochem. 20:713-719)。Lysozyme is associated with several diseases. Lysozyme urine includes diabetic neuropathy (Shima, M. et al. (1986) Clin. Chem. 32: 1818-1822), epidemic neuropathy (Bruckner, I et al. (1978) Med. Interne. 16: 117-125), Observed in urinary tract dysfunction (Heidegger, H. (1990) Minerva Ginecol. 42: 243-250) and acute monocytic leukemia (Shaw, MT (1978) Am. J. Hematol. 4: 97-103). It Nakano (
The above) suggests the role of lysozyme in the host defense system.
Older rabbits lacking hereditary lysozyme are more susceptible to infections such as subcutaneous abscesses (OMIM # 153450, supra). Mutations in the human lysozyme gene cause genetic phylogenetic amyloidosis. Genetic systematic amyloidosis is a rare autosomal dominant genetic disease in which amyloid deposits in internal organs including kidney, adrenal gland, spleen, and liver, and usually causes fatal symptoms by the age of 50 years. Amyloid deposits include various forms of lysozyme. Renal amyloidosis is associated with the most common and potentially the most severe organ morphology (Pepys, MB et al. (1993) Nature
362: 553-557, OMIM # 105200 Familial Visceral Amyloidosis, Cotran, RS
Et al (1994) Robbins Pathologic Basis of Disease , WB Saunders Company, Ph
iladelphia PA, pp. 231-238). Increased levels of lysozyme and lactate are observed in the cerebrospinal fluid of patients with bacterial meningitis. (Ponka, A. et al. (1983) In
infection 11: 129-131). Acute monocytic leukemia is characterized by massive lysozyme urine (Den Tandt, WR (1988) Int. J. Biochem. 20: 713-719).
【0019】
新たなヒドロラーゼタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見
は、細胞増殖性疾患、自己免疫/炎症性疾患、神経疾患、腎臟病、副腎疾患、及
び遺伝性疾患の診断、予防、及び治療に利用されるような新たな化合物を与える
ことによって、当業者の需要を満足させる。The discovery of new hydrolase proteins and polynucleotides encoding them has led to the diagnosis, prevention and treatment of cell proliferative disorders, autoimmune / inflammatory disorders, neurological disorders, renal illness, adrenal disorders, and hereditary disorders. To meet the demands of those skilled in the art by providing new compounds such as
【0020】
新規のヒドロラーゼタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見
により、細胞増殖異常症、自己免疫異常症/炎症性疾患、神経障害、腎障害、副
腎機能不全症、及び遺伝障害の診断及び治療、予防に有用な新規の組成物を提供
して当分野のニーズを満たすことができる。With the discovery of novel hydrolase proteins and polynucleotides encoding them, diagnosis and treatment of cell proliferative disorders, autoimmune disorders / inflammatory diseases, neuropathy, renal disorders, adrenal insufficiency, and genetic disorders , Can provide novel compositions useful in prevention to meet the needs of the art.
【0021】
(発明の要約)
本発明は、総称して「HYDRL」、個別には「HYDRL-1」、「HYDRL-2」、「HYDRL
-3」、「HYDRL-4」、「HYDRL-5」、「HYDRL-6」、「HYDRL-7」、「HYDRL-8」、
「HYDRL-9」、「HYDRL-10」、「HYDRL-11」、「HYDRL-12」、「HYDRL-13」、「H
YDRL-14」、「HYDRL-15」、及び「HYDRL-16」と呼ばれる実質的に精製されたポ
リペプチドであるヒドロラーゼタンパク質を提供する。本発明の一実施態様では
、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列
を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:
1−16からなる一群から選択されたアミノ酸配列の保存されたアミノ酸が1つ以
上置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。(Summary of the Invention) [0021] The present invention refers to "HYDRL" as a general term, and individually "HYDRL-1", "HYDRL-2", and "HYDRL".
-3 "," HYDRL-4 "," HYDRL-5 "," HYDRL-6 "," HYDRL-7 "," HYDRL-8 ",
"HYDRL-9", "HYDRL-10", "HYDRL-11", "HYDRL-12", "HYDRL-13", "H
Provided are hydrolase proteins that are substantially purified polypeptides designated YDRL-14 "," HYDRL-15 ", and" HYDRL-16 ". In one embodiment of the invention there is provided a substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. The present invention also provides SEQ ID NO:
There is provided a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more conserved amino acids of an amino acid sequence selected from the group consisting of 1-16 are substituted.
【0022】
更に本発明は、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列の少なくとも1つと90%以上のアミノ酸同一性を有する実質的
に精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−16及びそれらの
断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単
離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID
NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと90%以上のポリヌクレオチド配列
同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。The present invention further provides a substantially purified variant having 90% or more amino acid identity with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. provide. The invention also provides an isolated and substantially purified polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. The present invention also provides SEQ ID
An isolated and purified polynucleotide variant sequence having 90% or more polynucleotide sequence identity with a polynucleotide encoding a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 1-16 and fragments thereof. provide.
【0023】
更に、本発明は、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条
件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。Furthermore, the present invention provides an isolated hybridisation under stringent conditions to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. To provide a purified polynucleotide.
The present invention also provides an isolated and purified polynucleotide containing a sequence complementary to a polynucleotide encoding a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. provide.
【0024】
本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、(a)ポリヌクレオチド配列の相補体を、少なくとも1つのサンプ
ルのポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を
形成する過程と、(b)そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを
含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレ
オチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様で
は、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。The present invention is also a method of detecting a polynucleotide in a sample containing nucleic acids, the method comprising: (a) hybridizing a complement of a polynucleotide sequence with a polynucleotide of at least one sample, and performing hybridization. A detection method comprising the step of forming a complex and (b) the step of detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex and the presence of the polynucleotide in the sample are correlated. . In one embodiment of the invention, the step of amplifying the polynucleotide prior to hybridization is included.
【0025】
本発明はまた、SEQ ID NO:17−32及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。また、本発明は、SEQ ID NO:17−32及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列と90%以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する
単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、SEQ
ID NO:17−32及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌク
レオチドを提供する。The present invention also provides an isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-32 and fragments thereof. The present invention also provides an isolated and purified polynucleotide variant sequence having 90% or more polynucleotide sequence identity with a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-32 and fragments thereof. provide. Further, the present invention provides SEQ
There is provided an isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of ID NO: 17-32 and fragments thereof.
【0026】
本発明は更に、SEQ ID NO:1−16からなる一群から選択されたアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも1つの断片を含む
発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に
含まれる。The invention further provides an expression vector comprising at least one fragment of a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16. In another embodiment, the expression vector is contained within a host cell.
【0027】
本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、(a)ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む
宿主細胞を培養する過程と、(b)その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを
回収する過程とを含む製造方法を提供する。The present invention also provides a method for producing a polypeptide, which comprises (a) culturing a host cell containing an expression vector having the polynucleotide of the present invention under conditions suitable for expression of the polypeptide. , (B) recovering the polypeptide from the medium of the host cell.
【0028】
本発明はまた、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に提供する。The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof, together with a suitable pharmaceutical carrier. provide.
【0029】
更に本発明は、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポ
リペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。The present invention further provides a purified antibody that binds to a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. The invention also provides purified agonists and antagonists of the polypeptide.
【0030】
本発明はまた、HYDRLの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予
防方法であって、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に患者に効果的な量投与することを含む、治療または予防
方法を提供する。The present invention also provides a method of treating or preventing a disease associated with decreased expression or activity of HYDRL, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. There is provided a method of treatment or prophylaxis comprising administering to a patient an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide together with a suitable pharmaceutical carrier.
【0031】
本発明はまた、HYDRLの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予
防方法であって、SEQ ID NO:1−16及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを患者に効果的な量投与
することを含む、治療または予防方法を提供する。The present invention also provides a method of treating or preventing a disease associated with increased HYDRL expression or activity, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-16 and fragments thereof. Methods of treatment or prophylaxis are provided that include administering to the patient an effective amount of a polypeptide antagonist.
【0032】
(本発明の記載について)
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。Regarding the Description of the Present Invention Before explaining the protein and nucleic acid sequences and methods of the present invention, the present invention is not limited to the specific devices and materials and methods disclosed herein, and its embodiments are modified. Please understand what you can do. Also, the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is limited only by the scope of the following claims,
It should also be understood that it is not intended to limit the scope of the invention.
【0033】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。In the present specification and claims, “a”, “the (the same),” etc. represent the singular.
Note that includes plural forms unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, “a host cell” includes a plurality of host cells, “antibody” includes a plurality of antibodies, and equivalents well known to those skilled in the art.
【0034】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。All technical and scientific terms used herein, unless defined otherwise,
It has the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
Although any apparatus and materials and methods similar or equivalent to those described herein can be used in the practice and testing of the present invention, suitable apparatus and materials and methods are described herein.
All references mentioned herein are cited to describe and disclose the cell lines, protocols, reagents, vectors described in the references that may be used in connection with the present invention. The mere fact that the conventional invention is cited does not mean that the novelty of the present invention is impaired.
【0035】
定義
用語「HYDRL」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種(特にウ
シ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物)から得られる実質的
に精製されたHYDRLのアミノ酸配列を指す。 Definitions The term "HYDRL" is substantially purified obtained from all species including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant (especially mammals including bovine, ovine, porcine, murine, equine and human). HYDRL amino acid sequence.
【0036】
用語「アゴニスト」は、HYDRLの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を
指す。このアゴニストは、HYDRLに直接相互作用するか、或いはHYDRLが関与する
生物学的経路の成分と作用して、HYDRLの活性を調節するタンパク質、核酸、糖
質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of HYDRL. This agonist either interacts directly with HYDRL or acts with components of the biological pathway in which HYDRL is involved to regulate the activity of HYDRL such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compound or The composition may be included.
【0037】
用語「アレル変異配列」は、HYDRLをコードする遺伝子の別の形を指す。アレ
ル変異配列は、核酸配列における少なくとも1つの変異によって生じ、変異mR
NA若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれ
ば変わらない場合もある。ある遺伝子は、自然発生型のアレル変異配列が存在し
ないもの、1つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる
変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異
は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生
じる。The term “allelic variant sequence” refers to another form of the gene that encodes HYDRL. The allelic variant sequence results from at least one mutation in the nucleic acid sequence,
It may be NA or a mutated polypeptide, and its structure and function may or may not change. Some genes include those in which no naturally-occurring allelic variant is present, or one gene or many genes are present. Generally, mutations that give rise to allelic variant sequences are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these mutations, either alone or concurrently with other mutations, occurs one or more times within a given sequence.
【0038】
HYDRLをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、
或いは置換が起こっても、HYDRLと同じポリペプチド或いはHYDRLの機能特性の少
なくとも1つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、HYDRLをコードする
ポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配
列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにHYDRLをコード
するポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出
可能な或いは検出困難な多型を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、
サイレント変化を生じHYDRLと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、
或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にHY
DRLの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、
及び/または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷
電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したア
ミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非
荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニ
ンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロ
イシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチ
ロシンが含まれ得る。“Mutant” nucleic acid sequences encoding HYDRL include various nucleotide deletions, insertions,
Alternatively, it refers to a polypeptide which, even if substitutions occur, has the same polypeptide as HYDRL or which has at least one functional property of HYDRL. This definition includes improper or unexpected hybridization of a HYDRL-encoding polynucleotide sequence with an allelic variant at a position other than the normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotide probes of the HYDRL-encoding polynucleotide. Includes polymorphisms that are easily or difficult to detect using. The encoded protein can also be mutated,
Deletion, insertion of amino acid residues that cause silent changes and are functionally equivalent to HYDRL,
Alternatively, it may include substitution. Intentional amino acid substitution is a biological or immunological HY
To the extent that the activity of DRL is retained, the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity of the residue,
And / or based on similarities for amphipathicity. For example, negatively charged amino acids can include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids can include lysine and arginine. Amino acids with similar hydrophilicity values and having polar uncharged side chains can include asparagine, glutamine, serine, threonine. Amino acids with similar hydrophilicity values and having uncharged side chains can include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, phenylalanine and tyrosine.
【0039】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び
合成分子を含む。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子である場合、「
アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。The terms “amino acid” and “amino acid sequence” refer to oligopeptide, peptide, polypeptide, protein sequences, or any fragment thereof, including naturally occurring and synthetic molecules. When the "amino acid sequence" is a naturally occurring protein molecule, "
Amino acid sequence "and like terms are not intended to limit the amino acid sequence to the complete, unaltered amino acid sequence associated with the protein molecules described.
【0040】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は
、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術によって行われる。The term “amplification” refers to making copies of nucleic acid sequences. Amplification is generally performed by the polymerase chain reaction (PCR) technique well known in the art.
【0041】
用語「アンタゴニスト」は、HYDRLの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子
である。アンタゴニストは、HYDRLに直接相互作用するか、或いはHYDRLが関与す
る生物学的経路の成分と作用して、HYDRLの活性を調節する抗体、核酸、糖質、
小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。The term “antagonist” is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of HYDRL. Antagonists are antibodies, nucleic acids, carbohydrates, that interact directly with HYDRL or act with components of the biological pathways in which HYDRL is involved to regulate HYDRL activity.
It may include proteins such as small molecules, any other compound or composition.
【0042】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab')2、及びそれらの断片
、Fv断片などの無傷の分子を指す。HYDRLポリペプチドと結合する抗体は、抗体
を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である
。動物(例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ)を免疫化するのに使用され
るポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成
可能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプ
チドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログ
ロブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン(KLH)を含む。次ぎに、この
結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。The term “antibody” refers to intact molecules such as Fab and F (ab ′) 2 and fragments thereof, Fv fragments, which are capable of binding antigenic determinants. Antibodies that bind HYDRL polypeptides can be produced using intact molecules, or fragments thereof, containing small peptides that immunize the antibody. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, mouse, rat, or rabbit) can be synthesized from the translation of RNA or chemically and is optionally conjugated with a carrier protein. It is also possible. Commonly used carriers that are chemically linked to peptides include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemonean (KLH). The conjugated peptide is then used to immunize the animal.
【0043】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域(即ちエピトープ)
を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用い
られるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基(タンパク質上の特定
の領域或いは三次元構造体)に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原
決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原(即ち、免疫応答を引き出すために
用いられる免疫原)と競合し得る。The term “antigenic determinant” refers to the region (ie, epitope) of a molecule that makes contact with a particular antibody.
Refers to. When a protein or a fragment of a protein is used to immunize a host animal, various regions of this protein are antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a specific region on the protein or a three-dimensional structure). Can induce the production of The antigenic determinant may compete with the intact antigen (ie, the immunogen used to elicit an immune response) to bind the antibody.
【0044】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖に相補的な核酸配列を含
む任意の組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞に
よって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。
「マイナス(−)」という表現はアンチセンス鎖、「プラス(+)」という表現
はセンス鎖を指す。The term “antisense” refers to any composition containing a nucleic acid sequence complementary to the sense strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense molecules can be produced by any method including synthesis or transcription. Once introduced into a cell, complementary nucleotides combine with the natural sequences made by the cell to form a duplex, which inhibits transcription or translation.
The expression "minus (-)" refers to the antisense strand, and the expression "plus (+)" refers to the sense strand.
【0045】
用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的な
機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」は、天然或い
は組換え体のHYDRL、合成のHYDRLまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当
な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す
。The term “biological activity” refers to a protein having the structural, regulatory, or biochemical function of a naturally occurring molecule. Similarly, the term "immunologically active" means that a natural or recombinant HYDRL, synthetic HYDRL or any oligopeptide thereof induces a specific immune response in a suitable animal or cell to induce a specific antibody. Refers to the ability to combine with.
【0046】
用語「相補的」及び「相補性」は、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成して
自然に結合することを指す。例えば、配列「5'A−G−T3'」が相補的な配列
「3'T−C−A5'」と結合する。2つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核
酸のみが結合する部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全
な相補性となる場合もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブ
リダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間
の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸(PNA)分子の設計若しくは
使用において特に重要である。The terms “complementary” and “complementarity” refer to the natural binding of polynucleotides to form base pairs. For example, the sequence "5'AG-T3 '" binds to the complementary sequence "3'TC-A5'". The complementarity between two single-stranded molecules may be partial, where only some of the nucleic acids bind, or there may be complete complementarity between the single strands resulting in perfect complementarity. The degree of complementarity between nucleic acid strands greatly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands. This is particularly important in amplification reactions that depend on binding between nucleic acid strands, as well as in the design or use of peptide nucleic acid (PNA) molecules.
【0047】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含
む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。
HYDRL若しくはHYDRLの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、
ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾
燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。
ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩(例えば、NaCl)及び界面活
性剤(例えば、SDS:ドデシル硫酸ナトリウム)、その他の物質(例えば、デン
ハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど)を含む水溶液に展開され得る。“Composition comprising a given polynucleotide sequence” or “composition comprising a given amino acid sequence” refers broadly to any composition that comprises a given nucleotide or amino acid sequence. The composition may include a dry formulation or an aqueous solution.
A composition comprising a polynucleotide sequence encoding HYDRL or a fragment of HYDRL,
It can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a freeze-dried state and can be bound to a stabilizer such as sugar.
In hybridization, the probe is developed in an aqueous solution containing salts (eg, NaCl) and detergents (eg, SDS: sodium dodecyl sulfate) and other substances (eg, Denhardt's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.). obtain.
【0048】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにシークエンシングされ
た核酸配列であって、XL-PCRTM(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて5'及び
/または3'の方向に延長されてシークエンシングされた核酸配列、或いはGELVI
EW 断片構築システム(GCG, Madison, WI)などのフラグメントの構築のための
コンピュータプログラムを用いて1つ或いはそれ以上のインサイト社クローン、
及び場合によっては、1つ以上のパブリックのドメインESTの重複によって構築
された核酸配列を指す。延長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配
列もある。A “consensus sequence” is a nucleic acid sequence that has been sequenced to separate unwanted bases and is 5'and / or 3'using XL-PCR ™ (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Sequenced nucleic acid sequence or GELVI
EW fragment construction system (GCG, Madison, WI), etc. One or more Insight clones using computer programs for fragment construction,
And, in some cases, refers to nucleic acid sequences constructed by duplication of one or more public domain ESTs. Some consensus sequences are constructed by both extension and overlap.
【0049】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。
元の残基 保存的な置換
Ala Gly, Set
Arg His, Lys
Asn Asp, Gln, His
Asp Asn, Glu
Cys Ala, Ser
Gln Asn, Glu, His
Glu Asp, Gln, His
Gly Ala
His Asn, Arg, Gln, Glu
Ile Leu, Val
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile
Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr
Ser Cys, Thr
Thr Ser, Val
Trp Phe, Tyr
Tyr His, Phe, Trp
Val Ile. Leu, Thr
一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a)置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b)置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び/または、c)側鎖の大半が維持される。The term “conservative amino acid substitution” refers to a substitution that does not significantly alter the properties of the original protein. That is, the substitution does not significantly change the structure or function of the protein,
The structure of the protein, in particular its function, is preserved. The following shows conservative amino acid substitutions in which the original amino acid of one protein is replaced with another amino acid. Original residue Conservative substitution Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln , Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile . Leu, Thr In general, in the case of conservative amino acid substitutions, a) the backbone structure of the polypeptide in the substituted region, eg β sheet or α helix conformation, b) the charge of the molecule at the substituted site or Hydrophobic and / or c) most of the side chains are retained.
【0050】
用語「欠失」は、1個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或
いは1個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。The term “deletion” refers to an amino acid sequence change that lacks one or more amino acid residues, or a nucleic acid sequence change that lacks one or more nucleotides.
【0051】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指
す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒ
ドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチ
ドは、自然分子(未修飾の分子)の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも1
つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも1つを維持する、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって
修飾されたポリペプチドのことである。The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. Chemical modifications of polynucleotide sequences include, for example, replacement of hydrogen with an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group. A derivative polynucleotide has at least one biological or immunological function of a natural molecule (unmodified molecule).
Encodes a polypeptide that maintains one. A derivative polypeptide is a polypeptide modified by glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that maintains at least one of the biological or immunological functions of the original polypeptide. That is.
【0052】
用語「断片」は、HYDRLまたはHYDRLをコードするポリヌクレオチドの固有の部
分であって、その親配列(parent sequence)と同一であるがその配列より長さ
が短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から1つのヌクレオチド/
アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、5〜1000個の
連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原
、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも5、10、15
、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250
若しくは500個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断
片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプ
チド断片は、所定の配列に示された最初の250若しくは500のアミノ酸(或
いは、ポリペプチドの最初の25%または50%)から選択された連続するアミ
ノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面
を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。The term “fragment” refers to a unique portion of HYDRL or a polynucleotide encoding HYDRL that is identical to its parent sequence but shorter than that sequence. The maximum length of a "fragment" is 1 nucleotide / from the parent sequence.
It is the length less amino acid residues. For example, a fragment contains 5 to 1000 consecutive nucleotides or amino acid residues. Probes, primers, antigens, therapeutic molecules, or fragments used for other purposes should be at least 5, 10, 15
, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250
Alternatively, the length is 500 consecutive nucleotides or amino acid residues. Fragments may also be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment may comprise a predetermined length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids shown in the given sequence (or the first 25% or 50% of the polypeptide). . These lengths are examples, and any length described in the specification including the sequence listing and the tables and drawings can be included in the embodiments of the present invention.
【0053】
SEQ ID NO:17−32のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる
、SEQ ID NO:17−32を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含
む。SEQ ID NO:17−32のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技
術、またはSEQ ID NO:17−32を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方
法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:17−32の正確な断片の長さや領
域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定で
きる。Certain fragments of SEQ ID NO: 17-32 include, for example, a region of unique polynucleotide sequence that uniquely identifies SEQ ID NO: 17-32 that differs from other sequences in the same genome. . Certain fragments of SEQ ID NO: 17-32 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods of distinguishing SEQ ID NO: 17-32 from related polynucleotide sequences. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 17-32 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
【0054】
SEQ ID NO:1−16のある断片は、SEQ ID NO:17−32のある断片によってコード
される。SEQ ID NO:1−16のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−16を同定する固
有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−16のある断片は、特異
的にSEQ ID NO:1−16を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用で
ある。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−16の正確な断片の長さや領域は、その
断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。Certain fragments of SEQ ID NO: 1-16 are encoded by certain fragments of SEQ ID NO: 17-32. Certain fragments of SEQ ID NO: 1-16 contain regions of unique amino acid sequence that uniquely identify SEQ ID NO: 1-16. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1-16 are useful as immunogenic peptides for the production of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1-16. The exact fragment length and region of SEQ ID NO: 1-16 that matches a given fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
【0055】
用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似
性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸
とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な
配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハ
イブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダ
イゼーションアッセイ(サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法
、溶液ハイブリダイゼーション等)を用いて検査される。実質的に類似の配列或
いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完
全に類似(同一)の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、緩いストリンジェントな条件の下では非特異的な結合が許容されるというこ
とではなく、緩いストリンジェントな条件では、2つの配列の互いへの結合が特
異的(即ち、選択的)に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえな
い(例えば、30%未満の類似性或いは同一性)第2の標的配列を用いて、非特
異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合
は、実質的に類似配列或いはプローブが第2の非相補的標的配列とハイブリダイ
ズしない。The term “similarity” refers to a degree of complementarity. This includes partial similarity and complete similarity. The term “identity” can also be called “similarity”. Partially complementary sequences in which hybridization of the same sequence to the target nucleic acid is at least partially blocked are said to be "substantially similar." Inhibition of hybridization between the perfectly complementary sequence and the target sequence is tested using a hybridization assay (Southern or Northern blotting, solution hybridization, etc.) under mildly stringent conditions. Substantially similar sequences or hybridization probes competitively suppress binding of the perfectly similar (identical) sequence to the target sequence under mildly stringent conditions. This does not mean that non-specific binding is allowed under mildly stringent conditions, but under mildly stringent conditions, the binding of two sequences to each other is specific (ie, selective). You have to interact. A second target sequence, which may not be said to be partially complementary (eg, less than 30% similarity or identity), can be used to test for the absence of non-specific binding. In the absence of non-specific binding, the substantially similar sequence or probe will not hybridize to the second non-complementary target sequence.
【0056】
ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「%の同一
性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、2つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、2つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ2つの配列間の比
較を行うことができる。The term “percent identity” or “% identity” with respect to polynucleotide sequences refers to matching residues between two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. It is a percentage. Such algorithms can insert gaps in the sequences to make a more meaningful comparison between the two sequences in a standardized and reproducible manner to optimize the alignment between the two sequences.
【0057】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式(DNASTAR, Madison W
I)である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセン
ト」としてCLUSTAL Vによって報告される。The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package and includes a suite of molecular biology analysis programs (DNASTAR, Madison W
I). This CLUSTAL V is for Higgins, DG and PM Sharp (1989) CABIOS
5: 151-153, Higgins, DG et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For pairwise alignments of polynucleotide sequences, the default parameter is Kt.
Set uple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. A "weighted" residue weight table was selected as the default. Percentage identity is reported by CLUSTAL V as the "percentage similarity" of aligned polynucleotide sequence pairs.
【0058】
別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/)などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCB
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J
. Mol. Biol. 215:403-410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には
、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配
列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラ
ムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、2
つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequen
ces」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形
式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp(以
下に記載)の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デ
フォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、
2つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設
定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblast
nを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のよ
うにする。
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、20または30
、40、50、70、100、200のヌクレオチドの断片の長さに対して測定
してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細
書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される
長さを示すことができる。Alternatively, a set of commonly used and freely available sequence comparison algorithms is
NCBI, Bethesda, MD, and Internet (http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
National Center for Biotechnology Information (NCB)
I) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, SF et al. (1990) J
Mol. Biol. 215: 403-410). The suite of BLAST software includes various sequence analysis programs, including "blastn" used to align known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is available,
Used to directly compare pairs of two nucleotide sequences. "BLAST 2 Sequen
"ces" can be used interactively by accessing http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). The BLAST program is commonly used with gaps and other parameters that set defaults. For example,
When comparing two nucleotide sequences, one may blast with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set to default parameters.
will use n. Such default parameters are, for example: Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: -2 Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on May be measured for the entire length of a given sequence, as determined by the sequence number of, or for shorter lengths, for example, fragments obtained from a given given sequence, for example at least contiguous , 20 or 30
, 40, 50, 70, 100, 200 nucleotide fragments. Such lengths are merely exemplary, and fragments of any length of the sequences set forth in the specification including sequence listing and tables and figures may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.
【0059】
高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードが縮重するため、類似のア
ミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的
に同じタンパク質をコードする多数の核酸配列を作ることができる。Nucleic acid sequences that do not show high identity can encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. Degeneracy can be used to alter nucleic acid sequences to create multiple nucleic acid sequences each encoding substantially the same protein.
【0060】
ポリペプチド配列に用いられる用語「同一性のパーセント」又は「同一性の%
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる2つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造(従って機能も)
が保存される。The term “percentage of identity” or “% of identity” as used for polypeptide sequences
"Is the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm." Methods of polypeptide sequence alignment are well known. Some alignment methods consider conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, described in detail above, generally conserve charge and hydrophobicity at the site of substitution, and result in polypeptide structure (and thus function) as well.
Is saved.
【0061】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム(上記)に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (supra). For pairwise alignments of polypeptide sequences using CLUSTAL V, the default parameters are Ktuple = 1, gap
Set penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. The PAM250 matrix is selected as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignments, the percent identity of paired aligned polypeptide sequences is reported by CLUSTAL V as the "percentage of similarity."
【0062】
別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、2つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblastpを使
用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにす
る。
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも15、20または30、40、50、70、150の残基の断片の長さ
に対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図
面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセント
が測定される長さを示すことができる。Alternatively, the NCBI BLAST software suite is used. For example, when making a pairwise comparison of two polypeptide sequences, one would use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set with default parameters. . Such default parameters are, for example: Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on It may be measured over the entire length of the peptide sequence, or for shorter lengths, eg fragments derived from one large given polypeptide sequence, eg at least 15, 20, or 30, 40 contiguous. , 50, 70, 150 residues may be measured against the length of the fragment. Such lengths are merely exemplary, and fragments of any length of the sequences set forth in the specification including sequence listing and tables and figures may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.
【0063】
「ヒト人工染色体(HAC)」は、約6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含み得り
、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小
染色体である。A “human artificial chromosome (HAC)” can contain a DNA sequence of about 6 kb to 10 Mb in size and is a linear, small, linear unit containing all the elements necessary for stable segregation and maintenance of mitotic chromosomes. It is a chromosome.
【0064】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せる
ために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。The term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been altered in order to resemble a more human antibody while retaining its original binding ability.
【0065】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で
、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニー
リングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、2つの核酸配
列が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で
、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリ
ダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性
即ちストリンジェント(stringency)の決定において特に重要であり、よりスト
リンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の
対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者に
よって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過
程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり
、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は
、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1%(w/v)のSDS、並びに約100
μg/mlのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms a base pair with a complementary single strand under defined hybridization conditions. Specific hybridization means that two nucleic acid sequences have high identity. Under conditions that allow annealing, specific hybridization complexes are formed and remain hybridized after the washing process. The washing process is particularly important in determining the stringency or stringency of the hybridization process, and under more stringent conditions, non-specific binding, ie binding of pairs of nucleic acid strands that are not perfectly matched. Is reduced. The conditions under which annealing between nucleic acid sequences is permissible are routinely determined by those of skill in the art and are constant during hybridization, but the washing process involves changing the conditions during which to achieve the desired stringency. Is possible and hybridization specificity is obtained. Annealing conditions are, for example, at a temperature of 68 ° C., about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS, and about 100.
Includes μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.
【0066】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う温度
で部分的に表すことができる。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とpHに
おける特定の配列の熱融点(Tm)より約5〜20℃低く選択される。このTmは、
(所定のイオン強度とpHの下)標的の配列の50%が完全に一致するプローブ
とハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼー
ションの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual
, 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainvi
ew NY; 特に2巻の9章に記載されている。In general, hybridization stringency can be expressed in part by the temperature at which the wash process occurs. The wash temperature is usually selected to be about 5-20 ° C below the thermal melting point (Tm) of the particular sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is
It is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. The formula for calculating the Tm and the conditions for nucleic acid hybridization are well known, Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Volume 2 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainvi.
ew NY; Especially described in Chapter 2 of Volume 2.
【0067】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンでは、約0.2×SSC及び約1%のSDSの存在の下、約68℃で1時間の洗浄過
程を含む。別法では、65℃、60℃、55℃、42℃の温度で行う。SSCの濃
度は、約0.1%のSDSが存在の下、約0.1〜2×SSCの範囲である。通常は、
遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断
剤には、例えば、約100〜200μg/mlの変性したサケ精子DNAが含まれ
る。約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAと
DNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これら
の洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェント
な条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を
示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリ
ペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。High stringency hybridization between the polynucleotides of the present invention involves a wash step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS. Alternatively, it is carried out at temperatures of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. The concentration of SSC is in the range of about 0.1-2xSSC in the presence of about 0.1% SDS. Normally,
Blocking agents are used to prevent non-specific hybridization. Such blocking agents include, for example, about 100-200 μg / ml denatured salmon sperm DNA. Organic solvents such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v, for example RNA and
It can be used in specific cases such as hybridization of DNA. Useful modifications of these wash conditions are well known to those of skill in the art. Hybridization, particularly under highly stringent conditions, may suggest evolutionary similarities between the nucleotides. Such similarities strongly suggest that the nucleotides and encoded polypeptides play a similar role.
【0068】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によっ
て、形成された2つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体
は溶液中(例えば、C0tまたはR0t分析)で形成されるか、或いは溶液中の
1つの核酸配列と固体の支持物(例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、
或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板)
に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。The term “hybridization complex” refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonding between complementary bases. Hybridization complexes may be formed in solution (eg, C 0 t or R 0 t analysis), or one nucleic acid sequence in solution and a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin). ,
Or a slide glass, or any suitable substrate for immobilizing cells and their nucleic acids)
Can be formed with another nucleic acid sequence fixed to.
【0069】
用語「挿入」或いは「付加」は、1個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチド
がそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。The term “insertion” or “addition” refers to a change in an amino acid sequence or nucleic acid sequence in which one or more amino acid residues or nucleotides have been added, respectively.
【0070】
「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連
する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイト
カイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴を
もつ。“Immune response” refers to conditions associated with inflammatory diseases and trauma, immune disorders, infectious diseases, genetic diseases and the like. These conditions are characterized by the expression of various factors such as cytokines and chemokines, other signaling molecules that affect the cell and systemic defense systems.
【0071】
用語「マイクロアレイ」は、基板上に配列されたそれぞれ異なったポリヌクレ
オチドの配列を指す。The term “microarray” refers to an array of different polynucleotides arranged on a substrate.
【0072】
マイクロアレイの文脈に用いられる用語「要素」或いは「アレイ要素」は、基
板の表面に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。The term “element” or “array element” as used in the context of microarray refers to hybridizable polynucleotides arranged on the surface of a substrate.
【0073】
用語「変調」は、HYDRLの活性の変化を指す。例えば、変調によって、HYDRLの
タンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或
いは免疫学的特性の変化が起こる。The term “modulation” refers to a change in the activity of HYDRL. For example, modulation results in a change in protein activity or binding properties of HYDRL, or other biological, functional or immunological properties.
【0074】
用語「核酸」或いは「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖であ
って、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のDN
A或いはRNA、ペプチド核酸(PNA)、任意のDNA様物質、及びRNA様物
質を指す。The term “nucleic acid” or “nucleic acid sequence” refers to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, or fragments thereof. In addition, DN of genomic or synthetic origin, which is a single-strand or double-strand and is a sense or antisense strand
A or RNA, peptide nucleic acid (PNA), any DNA-like substance, and RNA-like substance.
【0075】
「機能的に結合した」は、第1の核酸配列と第2の核酸配列が機能的な関係に
ある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を
与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般
に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で2つのタンパク質をコードす
る領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。“Operably linked” refers to the condition in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription or expression of the coding sequence. Generally, operably linked DNA sequences are very contiguous or contiguous if the regions encoding the two proteins must be joined in the same reading frame.
【0076】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド
骨格に結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含
む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組
成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写
物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る
。“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or anti-gene agent that comprises an oligonucleotide of at least about 5 nucleotides in length linked to a peptide backbone of amino acid residues ending in lysine. This terminal lysine renders the composition soluble. PNAs can bind preferentially to complementary single-stranded DNA or RNA to stop elongation of transcripts and polyethylene glycol to prolong life in cells.
【0077】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、HYDRLやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配
列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され
単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、
放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」
とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な
、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌク
レオチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA
一本鎖に沿って延長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配
列の増幅(及び同定)に用いることができる。The “probe” is a nucleic acid sequence encoding the same sequence or allele nucleic acid sequence, HYDRL, a complementary sequence thereof, or a fragment thereof used for detecting a related nucleic acid sequence. A probe is an oligonucleotide or polynucleotide that has been isolated with a detectable label or reporter molecule attached. Typical signs include
There are radioactive isotopes and ligands, chemiluminescent reagents, enzymes. "Primer"
Is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide. After the primer anneals to the polynucleotide, the target DNA is
It is extended along a single chain. The primer set can be used, for example, for amplification (and identification) of a nucleic acid sequence in a PCR method.
【0078】
本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも15
の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及び
プライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少
なくとも20または25、30、40、50、60、70、80、90、100
、150のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相
当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意
の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。The probes and primers used in the present invention include at least 15 of known sequences.
Of contiguous nucleotides. Longer probes and primers can be used to increase specificity. For example, at least 20 or 25, 30, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 contiguous of the disclosed nucleic acid sequences.
, 150 nucleotides. It should be understood that probes and primers that are considerably longer than the above examples can be used, and nucleotides of any length shown in the tables and drawings of the present specification and the sequence listing can also be used.
【0079】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。For the preparation and use of the probe and the primer, see, for example, Sambrook,
J. et al., 1989, Name "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd
Editions 1-3 (Cold Spring Harbor Press, Plainview NY), or Ausubel, FM
In 1987, the name "Current Protocols in Molecular Biology" (Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY), and Innis et al.,
In 1990, the name `` PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications '' (Acade
mic Press, San Diego CA.). The set of primers for PCR is, for example, Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA), and the like, and can be derived from one known sequence using a computer program for such purpose.
【0080】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大100ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、
及び32,000塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大5,000ヌク
レオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用で
ある。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含
まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能)は、
メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ
(genome-wide scope)におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライ
マー選択プログラム(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,
Cambridge MA1より入手可能)によって、ユーザーは、プライマー結合部位とし
て避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ(mispriming libaray
)」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチ
ドの選択に有用である(後の方の2つのプライマー選択プログラムのソースコー
ドは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように
変更することもできる)。PrimerGenプログラム(UK Human Genome Mapping Pro
ject Resource Centre, Cambridge UK より入手可能)は、多数の配列アライン
メントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の
最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイ
ズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及
び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である
。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド
の断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素
、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定
する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴ
ヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。Oligonucleotides used as primers are selected by computer programs well known in the art for primer selection. For example, OLIGO 4.06 software selects primer pairs for PCR, each up to 100 nucleotides,
And is useful for the analysis of large polynucleotides and oligonucleotides of up to 5,000 nucleotides from an input polynucleotide sequence of up to 32,000 bases. Similar primer selection programs include additional features that expand capacity. For example, the PrimOU primer selection program (Genome Center at Uni
versity of Texas South West Medical Center, available from Dallas TX)
Since a specific primer can be selected from the megabase sequence, it is useful for designing a primer in a genome-wide scope. Primer3 primer selection program (Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research,
(Available from Cambridge MA1) allows users to specify sequences that they want to avoid as primer binding sites.
) ”Can be entered. In addition, Primer3 is especially useful for the selection of oligonucleotides for microarrays (the source code of the latter two primer selection programs can be obtained from each source and modified to meet the needs of users). Can also). PrimerGen Program (UK Human Genome Mapping Pro
(available from the ject Resource Center, Cambridge UK), which designs primers based on multiple sequence alignments, so that they will hybridize to either the most conserved or the least conserved regions of the aligned nucleic acid sequences. Can be selected. Therefore, this program is useful for identifying unique and conserved oligonucleotide or polynucleotide fragments. The oligonucleotide or polynucleotide fragment identified by any of the selection methods described above is, for example, a PCR method or a sequencing primer, a microarray element, or a specific polynucleotide that identifies a polynucleotide that is completely or partially complementary to a sample nucleic acid. It is useful for the hybridization technique such as the probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
【0081】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。As used herein, “recombinant nucleic acid” is a sequence that is not a naturally occurring sequence, but is an artificial combination of two or more distant segments of a sequence. Often, this artificial combination is made by chemical synthesis, but it is more common to artificially manipulate distant segments of nucleic acid using genetic engineering techniques such as those described in Sambrook, supra. is there. The "recombinant nucleic acid" also includes a nucleic acid modified by simply adding or substituting a part of the nucleic acid. The recombinant nucleic acid may also include a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such recombinant nucleic acid can be, for example, part of a vector used to transform a cell.
【0082】
別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。Alternatively, such a recombinant nucleic acid is a vaccinia virus-based virus that, when used to vaccinate a mammal expressing the recombinant nucleic acid, elicits a defensive immune response in the mammal. It can be part of the vector.
【0083】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。HYDRLをコードす
る核酸若しくはその断片、HYDRL自体を含むと推定されるサンプルには、体液と
、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と
、溶液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又は組
織プリント等も含まれ得る。The term “sample” is used in its broadest sense. Samples suspected of containing HYDRL-encoding nucleic acid or a fragment thereof, and HYDRL itself include body fluids, extracts from cells, chromosomes or intracellular organelles isolated from cells, membranes, cells, and solutions. Genomic DNA, RNA, cDNA present in or immobilized on a substrate, tissues or tissue prints and the like may also be included.
【0084】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチ
ドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しく
は合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子に
よって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特
定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して
特異的である場合、結合していない標識した「A」及び抗体を含む反応液に、エ
ピトープAを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「A」が存在する
と、抗体と結合する標識Aの量が減少する。The terms “specific binding” and “specifically bind” refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. Point to. This interaction depends on the presence of a particular structure of the protein recognized by the binding molecule, eg, an antigenic determinant or epitope. For example, when the antibody is specific to the epitope "A", the reaction solution containing the unbound labeled "A" and the antibody is bound to the polypeptide containing the epitope A or the unbound unlabeled "A". Is present, the amount of labeled A bound to the antibody is reduced.
【0085】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或い
は分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物
が少なくとも約60%以上除去されたものであり、好ましくは約75%以上の除
去、最も好ましいのは約90%以上除去されたものを指す。The term “substantially purified” refers to a nucleic acid sequence or amino acid sequence that has been isolated or separated after being removed from its natural environment, such that the composition to which it is naturally associated has at least about 60 amino acids. % Or more, preferably about 75% or more, and most preferably about 90% or more.
【0086】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。“Substitution” is the replacement of one or more amino acids or nucleotides by different amino acids or nucleotides.
【0087】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィ
ルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲ
ル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板に
は、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこ
にポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。The term “substrate” refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microspheres. Includes particles and capillaries. The substrate has various surface morphologies such as walls or trenches, pins, channels, pores, to which polynucleotides and polypeptides bind.
【0088】
「形質転換」とは、外来DNAが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのこ
とである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条
件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を
挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス
感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、リポフェクション、及び微粒子
照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞
には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の
一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限
られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。“Transformation” is the process by which exogenous DNA enters and changes the recipient cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions by a variety of methods well known in the art and can be performed by any well known method of inserting an exogenous nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. be able to. This transformation method is
The choice depends on the type of host cell to be transformed. This method includes, but is not limited to, viral infection, electroporation, lipofection, and particulate irradiation. "Transformed" cells include stably transformed cells in which the introduced DNA is capable of replicating autonomously, either as a plasmid or as part of a host chromosome. Further, a cell that transiently expresses the introduced DNA or the introduced RNA within a limited time is also included.
【0089】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも40%
と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて
、例えば、少なくとも50%または60%、70%、80%、85%、90%、
95%、98%、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば
、「アレル」変異配列(上述)または「スプライス」変異配列、「種」変異配列
、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一
性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプ
ライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする
。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり
、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって
異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミ
ノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の1
つのヌクレオチドが異なる「1ヌクレオチド多型」(SNP)も含み得る。SNPの存
在は、例えば、或る集団(population)、病態、病態の特徴を表し得る。A “variant sequence” of a particular nucleic acid sequence refers to the default parameter setting “BLAST
2 Sequences "tool Version 2.0.9 (May-07-1999) shows that the specific nucleic acid sequence identity for a given length of a given nucleic acid sequence is at least 40%.
The nucleic acid sequence determined to be. Such nucleic acid pairs may, for example, be at least 50% or 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, over a length.
It may exhibit 95%, 98%, or more identity. A variant sequence can be represented, for example, as an "allelic" variant sequence (described above) or a "splice" variant sequence, a "species" variant sequence, a "polymorphism" variant sequence. Splice variant sequences may have very high identities to the reference molecule, but alternative splicing of exons during mRNA processing may result in more or less polynucleotides. The corresponding polypeptide may have additional functional domains present in the reference molecule or may lack domains present in the reference molecule. Species variant sequences are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides have a high degree of amino acid identity with each other. Polymorphic variant sequences differ in the polynucleotide sequence of a given gene from a given species and the species. The polymorphic variant sequence also includes one of the polynucleotide sequences
A "single nucleotide polymorphism" (SNP) that differs by two nucleotides may also be included. The presence of SNPs may be indicative of, for example, a population, a pathological condition, a characteristic of the pathological condition.
【0090】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも40%と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの
対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも50%または60%、70%、8
0%、85%、90%、95%、98%、或いはそれ以上の同一性を示し得る。A “variant” of a particular polypeptide sequence refers to the default parameter setting “
Blast 2 Sequences "Tool Version 2.0.9 (May-07-1999) by blastp, the identity of the particular polypeptide sequence to a certain length of a certain nucleic acid sequence is determined to be at least 40% of the nucleic acid sequence That is. Such polypeptide pairs may, for example, be at least 50% or 60%, 70%, 8 in a length.
It may exhibit 0%, 85%, 90%, 95%, 98%, or more identity.
【0091】
(発明)
本発明は、新規のヒトヒドロラーゼタンパク質(HYDRL)及びHYDRLをコードす
るポリヌクレオチドの発見に基づき、細胞増殖異常症、自己免疫異常症/炎症性
疾患、神経障害、腎障害、副腎機能不全症、及び遺伝障害の診断、治療、及び予
防におけるそれらの組成物の使用に関する。(Invention) The present invention is based on the discovery of a novel human hydrolase protein (HYDRL) and a polynucleotide encoding HYDRL. It relates to the use of these compositions in the diagnosis, treatment and prevention of adrenal insufficiency and genetic disorders.
【0092】
表1は、HYDRLをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたインサ
イト社クローンを示す。列1及び列2はそれぞれ、ポリペプチド及びポリヌクレ
オチドのSEQ ID NOを示す。列3は、各HYDRLをコードする核酸が同定されたIncy
teクローンのクローンIDを示し、列4は、それらのクローンが単離されたcDNAラ
イブラリを示す。列5は、Incyteクローン及びそれらに対応するcDNAライブラリ
を示す。cDNAライブラリが示されていないインサイト社クローンは、プールされ
たcDNAライブラリに由来する。列5のクローンは、各HYDRLのコンセンサスヌク
レオチド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼーション技術における断片とし
て有用である。Table 1 shows the Incyte clones used to construct the full length nucleotide sequence encoding HYDRL. Columns 1 and 2 show the SEQ ID NOs for the polypeptide and polynucleotide, respectively. Column 3 shows Incy in which the nucleic acid encoding each HYDRL was identified.
The clone IDs of the te clones are shown and column 4 shows the cDNA library from which those clones were isolated. Column 5 shows Incyte clones and their corresponding cDNA libraries. The Incyte clones for which the cDNA library is not shown are derived from the pooled cDNA library. The clone in row 5 was used to construct the consensus nucleotide sequence for each HYDRL and is useful as a fragment in hybridization techniques.
【0093】
表2の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示し、列1は配列番号
(SEQ ID NO)、列2は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列3は潜在
的なリン酸化部位、列4は潜在的なグリコシル化部位、列5はシグネチャ(sign
ature)配列及びモチーフを有するアミノ酸残基、列6はBLAST解析によって同定
された相同配列、列7は分析方法、及び場合によってはその分析方法が利用でき
る検索可能なデータベースを示す。列7の分析方法は、配列相同性及びタンパク
質モチーフから各ポリペプチドを特徴付けるために用いることが可能である。Each column of Table 2 shows various properties of each polypeptide of the invention, column 1 is the SEQ ID NO (SEQ ID NO), column 2 is the number of amino acid residues in each polypeptide, column 3 is Potential phosphorylation site, row 4 potential glycosylation site, row 5 signature
ature) amino acid residues having a sequence and a motif, column 6 shows a homologous sequence identified by BLAST analysis, column 7 shows an analytical method, and in some cases, a searchable database in which the analytical method can be used. The analysis method in column 7 can be used to characterize each polypeptide from sequence homology and protein motifs.
【0094】
図1に示されているように、HYDRL-1は、Colobus guerezaリゾチームc 前駆体
(GI 1790927; SEQ ID NO:33)、Colobus angolensisリゾチームc 前駆体 (GI 17
90967; SEQ ID NO:34)、及びNasalis larvatisリゾチームc 前駆体(GI 1790984;
SEQ IDNO:35)と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、HYDRL-1は、Colo bus guereza
リゾチームc 前駆体とは40%の同一性、Colobus angolensisリゾ
チームc 前駆体とは40%の同一性、Nasalis larvatisリゾチームc 前駆体とは
41%の同一性を有する。As shown in FIG. 1, HYDRL-1 is a Colobus guereza lysozyme c precursor
(GI 1790927; SEQ ID NO: 33), Colobus angolensis lysozyme c precursor (GI 17
90967; SEQ ID NO: 34), and Nasalis larvatis lysozyme c precursor (GI 1790984;
It has chemical and structural similarities to SEQ ID NO: 35). Specifically, HYDRL-1 is, Colo bus guereza lysozyme c 40% identity with the precursor, 40% identity to the Colobus Angolensis lysozyme c precursor, the same 41% and Nasalis Larvatis lysozyme c precursor Have sex.
【0095】
表3の列は、組織特異性と、HYDRLをコードするヌクレオチド配列に関連した
疾患または異常症、症状とを示している。表3の列1は、ヌクレオチドの配列番
号(SEQ ID NO)を示している。列2は、列1のヌクレオチド配列の断片を示し
ている。例えば、SEQ ID NO:17−32を同定し、SEQ ID NO:17−32と関連するポリ
ヌクレオチド配列とを区別する、ハイブリダイゼーション若しくは増幅の技術に
おいて、これらの断片は有用である。これら断片によりコードされるポリヌクレ
オチドは、例えば、免疫原性ペプチドとして有用である。列3は、HYDRLを発現
する組織カテゴリー、及びHYDRLを発現する全組織におけるその割合を示す。列
4は、HYDRLを発現する組織に関連する、疾患若しくは異常症、症状、並びにHYD
RLを発現する全組織におけるそれらの割合を示す。列5は、各cDNAライブラリを
サブクローニングするために用いたベクターを示す。The columns of Table 3 show the tissue specificity and diseases or disorders associated with the nucleotide sequence encoding HYDRL. Column 1 of Table 3 shows the nucleotide sequence number (SEQ ID NO). Column 2 shows a fragment of the nucleotide sequence of column 1. For example, these fragments are useful in hybridization or amplification techniques that identify SEQ ID NO: 17-32 and distinguish SEQ ID NO: 17-32 from related polynucleotide sequences. Polynucleotides encoded by these fragments are useful, for example, as immunogenic peptides. Column 3 shows the tissue category expressing HYDRL and its proportion in total tissues expressing HYDRL. Column 4 is a disease or disorder associated with tissues expressing HYDRL, symptoms, and HYD
Their proportions in the total tissues expressing RL are shown. Column 5 shows the vector used to subclon each cDNA library.
【0096】
SEQ ID NO:17のノーザン分析によって、癌に関連する組織におけるこの配列の
発現が示された。Northern analysis of SEQ ID NO: 17 showed expression of this sequence in tissues associated with cancer.
【0097】
SEQ ID NO:18は、染色体6の42.30センチモルガンから45.40センチモルガンま
での範囲と、染色体9の130.40センチモルガンから166.50センチモルガンまでの
範囲と、染色体16の88.10センチモルガンから92.60センチモルガンまでの範囲
とにマッピングされた。SEQ ID NO: 18 represents the range of chromosome 6 from 42.30 cmorgan to 45.40 cmorgan, the range of chromosome 9 from 130.40 cmorgan to 166.50 cmorgan, and the chromosome 16 of 88.10 cmorgan to 92.60 cmorgan. Mapped to a range up to.
【0098】
SEQ ID NO:25は、染色体1の22.90センチモルガンから39.90センチモルガンま
での範囲と、染色体3の30.90センチモルガンから43.00センチモルガンまでの範
囲とにマッピングされた。また、染色体3の30.90センチモルガンから43.00セン
チモルガンまでの範囲には、フォンヒッペル‐リンダウ症候群に関連する発現遺
伝子配列断片も含まれる。SEQ ID NO: 25 has been mapped to the range from 22.90 cmorgan to 39.90 cmorgan on chromosome 1 and the range from 30.90 cmorgan to 43.00 cmorgan on chromosome 3. In addition, the range from 30.90 centimorgans to 43.00 centimorgans on chromosome 3 also includes expressed gene sequence fragments associated with von Hippel-Lindau syndrome.
【0099】
SEQ ID NO:28は、染色体10の137.60センチモルガンから139.20センチモルガ
ンまでの範囲にマッピングされた。SEQ ID NO: 28 has been mapped to chromosome 10 in the range from 137.60 centimorgans to 139.20 centimorgans.
【0100】
表4の列は、HYDRLをコードするcDNAのクローンが単離されたcDNAライブラリ
の作製に用いられた組織の説明を示す。列1は、ヌクレオチドのSEQ ID NOを示
し、列2はそれらのクローンが単離されたcDNAライブラリを示し、列3は列2の
cDNAライブラリに対応する組織の由来及び詳細を示す。The columns of Table 4 provide a description of the tissues used to generate the cDNA library in which clones of cDNA encoding HYDRL were isolated. Row 1 shows the SEQ ID NO of the nucleotides, row 2 shows the cDNA library from which those clones were isolated, row 3 shows the cDNA library of row 2.
The origin and details of the tissue corresponding to the cDNA library are shown.
【0101】
本発明はまた、HYDRLの変異体を含む。好適なHYDRLの変異体は、HYDRLアミノ
酸配列と少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約
95%ものアミノ酸配列同一性を有し、HYDRLの機能的若しくは構造的特徴の少
なくとも1つを有する。The present invention also includes variants of HYDRL. Preferred variants of HYDRL have at least about 80%, or at least about 90%, or at least about 95% amino acid sequence identity with the HYDRL amino acid sequence and possess at least one of the functional or structural characteristics of HYDRL. Have.
【0102】
本発明はまた、HYDRLをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例で
は、本発明は、HYDRLをコードするSEQ ID NO:17−32からなる一群から選択され
た配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。The present invention also includes polynucleotides that encode HYDRL. In a particular embodiment, the invention comprises a polynucleotide sequence having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-32 encoding HYDRL.
【0103】
本発明はまた、HYDRLをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。
詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、HYDRLをコードするポリヌ
クレオチド配列と少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少な
くとも約95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施
態様は、SEQ ID NO:17−32からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約
80%、より好適には少なくとも約90%、最も好適には少なくとも約95%の
ポリヌクレオチド配列同一性を有する、SEQ ID NO:17−32からなる一群から選択
された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌ
クレオチドの変異配列は、HYDRLの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも一つ
を有するアミノ酸配列をコードし得る。The invention also includes variant sequences of the polynucleotide sequence encoding HYDRL.
In particular, such polynucleotide variants have at least about 80%, or at least about 90%, or even at least about 95% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide sequence encoding HYDRL. A particular embodiment of this invention is a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17-32 and having at least about 80%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% poly nucleotide sequence. A variant sequence of a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-32, having nucleotide sequence identity, is included. Variant sequences of any of the above polynucleotides may encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of HYDRL.
【0104】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るHYDRLをコードする種々のポリヌクレオ
チド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小
の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。した
がって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り
出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組
み合わせは、自然発生のHYDRLのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なト
リプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮す
る。Various polynucleotide sequences encoding HYDRL that may be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known naturally occurring gene. Those of ordinary skill in the art will understand. Thus, the present invention may include all of the possible polynucleotide sequence variations that may be created by the selection of combinations based on possible codon choices. These combinations are made on the basis of the standard triplet genetic code applied to the naturally occurring HYDRL polynucleotide sequences, and are considered to be the clear disclosure of all mutations.
【0105】
HYDRLをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された
ストリンジェントな条件の下で、自然発生のHYDRLのヌクレオチドとハイブリダ
イズ可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異な
ったコドンの使用を有するHYDRL或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配
列を作り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻
度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主
に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えな
いで、HYDRL及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する
別の理由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ま
しい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。It is desirable that the nucleotide sequence encoding HYDRL and its mutated sequences be capable of hybridizing to naturally occurring HYDRL nucleotides under appropriately selected stringent conditions, but with non-naturally occurring codons. It may be beneficial to create a nucleotide sequence that encodes HYDRL or a derivative thereof with substantially different codon usage, such as inclusion. Codons can be selected based on the frequency with which a particular codon is utilized by the host to increase the rate at which peptide expression occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason for substantially altering the nucleotide sequence encoding HYDRL and its derivatives without changing the encoded amino acid sequence is that RNA with favorable properties, such as a longer half-life, than transcripts made from naturally occurring sequences. To make a transcript.
【0106】
本発明はまた、HYDRL及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を
完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野
で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れ
の中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、HYDRLまたはその任意の断
片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。The present invention also includes the production of DNA sequences encoding HYDRL and its derivatives or fragments thereof, entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence can be inserted into any of the various available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry may be used to introduce mutations into the sequence encoding HYDRL or any fragment thereof.
【0107】
更に本発明には、種々のストリンジェント条件の下で、請求項に記載されたポ
リヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:17−32及びそれらの断片とハイブリダイ
ズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger
(1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods En
zymol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼ
ーションの条件は、「定義」に記載されている。The present invention further provides a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the claimed polynucleotide sequences, in particular SEQ ID NO: 17-32 and fragments thereof, under various stringent conditions. Included (eg Wahl, GM and SL Berger
(1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; and Kimmel. AR (1987) Methods En
zymol. 152: 507-511.). Hybridization conditions, including annealing and wash conditions, are described in the "Definitions".
【0108】
当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例
も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SE
QUENASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)
、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ)、
或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみられる
ような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用い
られる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム(Hamilton, Reno, NV)、
PTC200 Thermal Cycler200(MJ Research, Watertown MA)及びABI CATALYST 80
0 (Perkin-Elmer) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373
或いは377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシ
ークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当分野で周
知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の
様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Pr otocols in Molecular Biology
, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.を参照)。Any of the embodiments of the present invention can be carried out using DNA sequencing methods well known in the art. This method includes, for example, the Klenow fragment of DNA polymerase I, SE
QUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq Polymerase (Perkin Elmer)
, Thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ),
Alternatively, enzymes such as a combination of proofreading exonuclease and polymerase as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD) are used. Preferably, MICROLAB 2200 Liquid Transfer System (Hamilton, Reno, NV),
PTC200 Thermal Cycler200 (MJ Research, Watertown MA) and ABI CATALYST 80
Automate sequence preparation using a device such as 0 (Perkin-Elmer). Then ABI 373
Alternatively, sequencing is performed using the 377 DNA Sequencing System (Perkin-Elmer), MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamics. Sunnyvale CA) or other methods known in the art. The resulting sequences are analyzed using various algorithms well known in the art (e.g., Ausubel, FM (1997) Short Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, RA (1995) Molecular Biology and Biotechnology , Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.).
【0109】
当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配
列を利用して、HYDRLをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素
などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する1つの方法
では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクタ
ー内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する(例えば、Sarkar, G. (1993) PCR M
ethods Applic 2:318-322を参照)。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に伸
長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型
は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する(例え
ば、Triglia, T.等(1988)Nucleic Acids Res 16:8186を参照)。キャプチャPC
R法を用いる第3の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接す
るDNA断片のPCR増幅を含む(例えば、Lagerstrom, M.他(1991)PCR Methods Ap
plic 1:111-119を参照)。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ
−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を
挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列
を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res
. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMOTERFINDERライ
ブラリ(Clontech, Palo Alto CA)を用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能であ
る。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エ
キソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法では、プ
ライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software(National Bioscien
ces, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが22〜3
0ヌクレオチド、GC含有率が50%以上、約68℃〜72℃の温度で鋳型に対
してアニーリングするよう設計される。A variety of PCR-based methods well known in the art can be used to extend the nucleic acid sequence encoding HYDRL using partial nucleotide sequences to extract upstream sequences such as promoters and regulatory elements. To detect. For example, one method utilizing restriction site PCR is to amplify an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using common and nested primers (eg, Sarkar, G. (1993) PCR M).
See ethods Applic 2: 318-322). An alternative method using the inverse PCR method uses primers that extend in a wide range of directions and amplify unknown sequences from a circularized template. This template is derived from a restriction fragment containing known genomic loci and sequences surrounding it (see, eg, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). Capture pc
A third method using the R method involves PCR amplification of DNA fragments flanking known sequences of human and yeast artificial chromosome DNA (eg, Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Ap.
See plic 1: 111-119). This method allows digestion and ligation with multiple restriction enzymes to insert the recombinant double-stranded sequence into a region of unknown sequence prior to PCR. It is also possible to obtain the unknown sequence using other methods well known in the art. (For example, Parker, JD et al. (1991) Nucleic Acids Res
. 19: 3055-3060). Furthermore, by using PCR, nested primers, and PROMOTER FINDER library (Clontech, Palo Alto CA), walking within genomic DNA is possible. This method does not require screening the library and is useful for looking for intron / exon junctions. In all PCR-based methods, the primers are commercially available OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Bioscien
ces, Plymouth MN) or another suitable program etc.
It is designed to anneal to the template at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C with 0 nucleotides, a GC content of 50% or more.
【0110】
完全な長さのcDNAのスクリーニングの際は、大きなcDNAを含むようにサイズが
選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完
全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の5'領域を有する配列を含むも
のが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライ
ブラリは、5'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that are size-selected to contain large cDNAs. Furthermore, if the oligo d (T) library cannot produce a full-length cDNA, a randomly primed library, which often contains a sequence having the 5'region of the gene, is useful. Genomic libraries will be useful for extension of sequences into the 5'non-transcribed regulatory regions.
【0111】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び4つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力/光強度は、適切なソフトウエア(例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGA
TOR、Perkin-Elmer)を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングか
らコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能
である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合
もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。Sequencing or PCR using a commercially available capillary electrophoresis system
It is possible to analyze or confirm the size of the nucleotide sequence of the product. For more information,
Capillary sequencing uses a flowable polymer for electrophoretic separation, and a laser-activated fluorochrome specific for four different nucleotides and a CCD camera used to detect emitted wavelengths. It is possible.
The output / light intensity is determined by the appropriate software (eg GENOTYPER and SEQUENCE NAVIGA
TOR, Perkin-Elmer) is used to convert to an electric signal, and the process from sample loading to computer analysis and electronic data display can be controlled by computer. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA, which may be present in small amounts in a particular sample.
【0112】
本発明の別の実施例では、HYDRLをコードするポリヌクレオチド配列またはそ
の断片を組換えDNA分子に用いて、適切な宿主細胞内にHYDRL、その断片または機
能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的
に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得
り、これらの配列をHYDRLのクローン化及び発現に利用可能である。In another embodiment of the invention, the polynucleotide sequence encoding HYDRL or a fragment thereof is used in a recombinant DNA molecule to express HYDRL, a fragment or functional equivalent thereof in a suitable host cell. Is possible. Due to the unique duplication of the genetic code, alternative DNA sequences may be produced which encode substantially the same or functionally equivalent amino acid sequences, which sequences are available for cloning and expression of HYDRL.
【0113】
種々の目的でHYDRLをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知ら
れている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。こ
の目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び/または発現の調節
が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの
混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレ
オチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定
方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリ
コシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が
可能である。The nucleotide sequences of the present invention can be recombined using methods generally known in the art to alter the HYDRL coding sequence for a variety of purposes. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using DNA mixing with random fragments or PCR reassembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, oligonucleotide-mediated directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variants, and the like.
【0114】
別の実施例によれば、HYDRLをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法
を用いて、全体或いは一部が合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.等(198
0)Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他(1980)Nucl. Aci
ds Res. Symp. Ser.225-232を参照)。別法として、化学的方法を用いてHYDRL自
体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の
固相技術を用いて実行可能である(例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 26
9:202-204を参照)。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイ
ザ(Perkin Elmer)を用いて達成し得る。更にHYDRLのアミノ酸配列または任意
のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び/または化学的方法を用いた他の
タンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリ
ペプチドを作ることが可能である。According to another embodiment, the sequences encoding HYDRL can be wholly or partially synthesized using chemical methods well known in the art (eg, Carthers. MH et al. (198).
0) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Aci.
See ds Res. Symp. Ser. 225-232). Alternatively, chemical methods can be used to synthesize HYDRL itself or fragments thereof. For example, peptide synthesis can be performed using a variety of solid phase techniques (eg, Roberge, JY et al. (1995) Science 26.
9: 202-204). Alternatively, automation of synthesis may be achieved using, for example, the ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Furthermore, the amino acid sequence of HYDRL, or any part thereof, may be altered by direct synthetic alterations and / or combinations with sequences from other proteins or any part thereof using chemical methods. It is possible to make a polypeptide.
【0115】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei ns, Structures and Molecular Properties
, WH Freeman, New York, NYを参照)
。This peptide is used for preparative high performance liquid chromatography (eg, Chiez, RM).
And FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421)). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see, for example, Creighton. T. (1983) Proteins , Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York, NY).
.
【0116】
生物学的に活性なHYDRLを発現させるために、HYDRLをコードするヌクレオチド
配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、
好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を
含む。これらの要素には、ベクター及びHYDRLをコードするポリヌクレオチド配
列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、5'及び3'の
非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性
が様々である。特定の開始シグナルによって、HYDRLをコードする配列のより効
果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ATG開始
コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。HYDRLをコードする配列
及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は
、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかし
ながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレー
ムのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれ
なければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々な
ものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハン
サーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D
. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。For expression of biologically active HYDRL, the nucleotide sequence encoding HYDRL or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector
It contains the elements necessary to regulate the transcription and translation of the coding sequences inserted into a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and expression-inducible promoters, 5'and 3'untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding HYDRL. Such elements vary in length and specificity. With particular initiation signals, it is possible to achieve more efficient translation of the HYDRL coding sequence. Such signals include the ATG initiation codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the HYDRL coding sequence and its initiation codon, upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be required. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal containing an in-frame ATG initiation codon must be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be obtained from a variety of natural and synthetic sources. The efficiency of expression can be increased by the inclusion of enhancers suitable for the particular host cell system used. (For example, Scharf, D
Et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 201-18-162.).
【0117】
当業者に周知の方法を用いて、HYDRLをコードする配列、好適な転写及び翻訳
調節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、 in vitro
組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる。
(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び16-17章; 及び
Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John W
iley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。[0117]
Sequences encoding HYDRL, suitable transcription and translation, using methods well known to those of skill in the art.
It is possible to make expression vectors that include regulatory elements. These methods include in vitro
Recombinant DNA technology, synthetic technology, andin vivoIncludes gene recombination technology.
(For example, Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning. A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 & 8, and 16-17; and
Ausubel, F.M. et al. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John W
iley & Sons, New York NY, ch. 9 and 13-1-4).
【0118】
種々の発現ベクター/宿主系を利用して、HYDRLをコードする配列の保持及び
発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオフ
ァージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌な
どの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベ
クター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベ
クター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイル
ス、TMV)または細菌発現ベクター(例えば、TiまたはpBR322プラスミド
)で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用さ
れる宿主細胞によって限定されるものではない。A variety of expression vector / host systems may be utilized to retain and express sequences encoding HYDRL. These include, but are not limited to, microorganisms such as recombinant bacteriophage, plasmids, or bacteria transformed with cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viral expression vectors. Insect cell lines infected with (eg, baculovirus) or plants transformed with viral expression vectors (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or bacterial expression vectors (eg, Ti or pBR322 plasmids) Cell lines and animal cell lines are included. The present invention is not limited by the host cell used.
【0119】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、HYDRLをコー
ドするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、HYDR
Lをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニン
グ、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT1プラスミ
ド(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクター
の多数のクローニング部位にHYDRLをコードする配列をライゲーションするとlac
Z遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色
スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニン
グされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファ
ージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例
えば、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509
.を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のHYDRLが必要な場合は、HYDRL
の発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘
発するT5またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる
。In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use intended for the polynucleotide sequence encoding HYDRL. For example, HYDR
For routine cloning, subcloning, and propagation of L-encoding polynucleotide sequences, multifunctional E. coli vectors such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1 plasmid (GIBCO BRL) can be used. Ligation of the HYDRL coding sequence into multiple cloning sites of the vector resulted in lac.
The Z gene is disrupted, allowing a colorimetric screening method for identification of transformed bacteria containing recombinant molecules. In addition, these vectors can be used to generate in vitro transcription of cloned sequences, dideoxin screening, single chain rescue by helper phage, and nested deletions. (For example, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.
.). For example, if a large amount of HYDRL is needed for antibody production,
Vectors that induce high levels of expression can be used. For example, a vector containing a strongly inducible T5 or T7 bacteriophage promoter can be used.
【0120】
HYDRLの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシ
ダーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種
のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使
用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞
内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配
列を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Method
s Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-18
4.を参照)
植物系もHYDRLの発現に使用可能である。HYDRLをコードする配列の転写は、例
えば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で
、或いはTMV(Takamatsu, N.等(1987)EMBO J 6:307-311)由来のオメガリーダ
ー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或い
は病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能であ
る。(例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)
McGraw Hill NY, pp.191-196を参照)。It is possible to use yeast expression systems for the expression of HYDRL. Various vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase and PGH promoter can be used for yeast Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris . Furthermore, such vectors induce either the secretion of the expressed protein or its retention within the cell, integrating foreign sequences into the host genome for stable growth. (For example, Ausubel .; and Bitter, GA et al. (1987) Method above.
s Enzymol. 153: 51-794: Scorer. CA et al. (1994) Bio / Technology 121-181-18
Plant lines can also be used to express HYDRL. Transcription of the sequence encoding HYDRL is, for example, a viral promoter such as the 35S and 19S promoters derived from CaMV alone or an omega leader sequence derived from TMV (Takamatsu, N. et al. (1987) EMBO J 6: 307-311). Is promoted in combination with. These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. (For example, The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992)
See McGraw Hill NY, pp.191-196).
【0121】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び3連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物/翻訳複合体にHYDRLをコードする配列を
結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のE1またはE3領域への挿入により、
感染した宿主細胞にHYDRLを発現する生ウイルスを得ることが可能である(Logan
, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照)。さ
らに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用い
て、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質
を高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いるこ
とが可能である。In mammalian cells, a variety of virus-based expression systems may be utilized. When adenovirus is used as an expression vector, the HYDRL coding sequence may be linked to an adenovirus transcript / translation complex consisting of a late promoter and a triple leader sequence. By insertion into the nonessential E1 or E3 region of the viral genome,
It is possible to obtain live virus expressing HYDRL in infected host cells (Logan
, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers, such as the Rous Sarcoma Virus (RSV) enhancer, can be used to increase expression in mammalian host cells. For high level expression of proteins, SV40 or EBV based vectors can be used.
【0122】
ヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約6kb〜10MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル)で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。Human artificial chromosomes (HACs) can be used to supply fragments of DNA that are larger than those expressed in the plasmid and contained therein. HACs of about 6kb-10Mb for treatment
Are prepared and delivered by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles). (For example, Harrington.JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 3.
45-355.).
【0123】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるHYDRLの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、HYDRLを
コードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベ
クターは、ウイルス起源の複製及び/または内在性の発現要素や、同じ或いは別
のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択
培地に移す前に、強化培地で約1〜2日の間増殖させる。選択マーカーの目的は
選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配
列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された
細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能であ
る。For long-term production of recombinant proteins in mammalian systems, stable expression of HYDRL in cell lines is desirable. For example, the expression vector can be used to transform a cell line with a sequence encoding HYDRL. Such expression vectors contain replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells are grown in enriched medium for about 1-2 days before being transferred to selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to selective mediators, and its presence allows growth and recovery of cells which successfully express the introduced sequences. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques suitable for that cell type.
【0124】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン(cHYDRLsulfuron)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ(phosphinotricin acetyltransferase)に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子
、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載さ
れている(例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad
. Sci. 85:8047-51を参照)。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP;Clon
tech)、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS,ルシフェラーゼ及びその基質ル
シフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clon
tech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォ
ーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定
したタンパク質発現を定量することが可能である(例えば、Rhodes, C.A.他(19
95)Methods Mol. Biol. 55:121−791を参照)。[0124] Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. The selection systems include, but are not limited to, include herpes simplex virus thymidine kinase gene and adenine phosphoribosyltransferase genes, respectively tk - or apr - used in the cell. (For example, Wigler, M. et al. (1
977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycoside neomycin and G-418, and als or pat confers resistance to chlorsulfuron (cHYDRLsulfuron) and phosphinotricin acetyltransferase (eg, phosphinotricin acetyltransferase). , Wigl
er, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-3570; Colbere-Garapin,
F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Further genes available for selection have been described in the literature, eg trpB and hisD which alter what the cell needs for metabolism (eg Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad.
. Sci. 85: 8047-51). Anitocyanin, green fluorescent protein (GFP; Clon
tech), β-glucuronidase and its substrate GUS, luciferase and its substrate luciferin and other visible markers are used. Green fluorescent protein (GFP) (Clon
tech, Palo Alto, CA) can also be used. These markers can be used not only to identify transformants, but also to quantify transient or stable protein expression due to a particular vector system (eg, Rhodes, CA et al. (19
95) Methods Mol. Biol. 55: 121-791).
【0125】
マーカー遺伝子の発現の存在/不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、HYDRLをコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、HYDRLをコードする配
列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能であ
る。または、1つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がHYDRLをコードす
る配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー
遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。Even if the presence / absence of the expression of the marker gene indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of the gene. For example, if the sequence encoding HYDRL is inserted within a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding HYDRL can be identified by the lack of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be placed in tandem with the sequence encoding HYDRL under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
【0126】
一般に、HYDRLをコードする核酸配列を含み、HYDRLを発現する宿主細胞は、当
業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には
、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタン
パク質の検出及び/または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベー
スの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが
、これらに限定されるものではない。In general, a host cell containing a nucleic acid sequence encoding HYDRL and expressing HYDRL can be identified using a variety of methods well known to those of skill in the art. These methods include DNA-DNA or DNA-RNA hybridizations, PCR methods, protein biological methods including membrane-based, solution-based, or chip-based techniques for the detection and / or quantification of nucleic acids or proteins. Includes, but is not limited to, test methods or immunological assays.
【0127】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるHY
DRLの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。こ
のような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジ
オイムノアッセイ(RIA)、蛍光標示式細胞分取器(FACS)などがある。HYDRL上
の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2部位のモ
ノクローナルベースイムノアッセイ(two-site, monoclonal-based immunoassay
)が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ
及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton.
R. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Pa
ul. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Gree
ne Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D.
(1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。HY with either specific polyclonal or monoclonal antibodies
Immunological methods for detecting and measuring the expression of DRL are well known in the art. Such techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence activated cell sorter (FACS), and the like. A two-site, monoclonal-based immunoassay using a monoclonal antibody that reacts with two non-interfering epitopes on HYDRL.
) Is preferred, but competitive binding assays can also be used. These and other assays are well known in the art. (For example, Hampton.
R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Pa
ul. MN, Sect. IV; Coligan, JE et al Current Protocols in Immunology , Gree
ne Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; and Pound, JD
(1990) Immunochemical Protocols , Humans Press, Totowa NJ).
【0128】
種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。HYDRLをコードするポリヌクレオチドに
関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或
いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーショ
ン、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。
別法として、HYDRLをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを
生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知
であり市販されているこのようなベクターを、T7,T3,またはSP6などの好適なR
NAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNA
プローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pha
rmacia Biotech及びPromega(Madison WI)、U.S. Biochemical Corp(Clevelan
d OH)が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために
用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビ
ター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤など
が含まれる。Various labeling and conjugation methods are well known to those of skill in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for producing labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to HYDRL-encoding polynucleotides include oligo-labeling, nick-translation, end-labeling, or labeled nucleotides. Includes the PCR amplification used.
Alternatively, the HYDRL coding sequence, or any fragment thereof, can be cloned into a vector to generate an mRNA probe. Such vectors, which are well known in the art and are commercially available, can be prepared using suitable R7 such as T7, T3, or SP6.
RNA in vitro by the addition of NA polymerase and labeled nucleotides
It can be used for probe synthesis. These methods are described, for example, in Amersham Pha.
rmacia Biotech and Promega (Madison WI), US Biochemical Corp (Clevelan
d OH) can be carried out using various commercially available kits. Suitable reporter molecules or labels that can be used for easy detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents and the like.
【0129】
HYDRLをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地
でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換さ
れた細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用さ
れるその配列及び/またはそのベクターによる。HYDRLをコードするポリヌクレ
オチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するHYDRLの分
泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解され
よう。Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding HYDRL are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of this protein in cell culture. Whether the protein produced by a transformed cell is secreted or remains intracellular depends on the sequence and / or the vector used. It will be appreciated by those of skill in the art that expression vectors containing a polynucleotide encoding HYDRL can be designed to include a signal sequence that directs secretion of HYDRL across prokaryotic and eukaryotic cell membranes.
【0130】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化(
lipidation)、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」または「pro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利
用して、標的タンパク質、折りたたみ及び/または活性を特定することが可能で
ある。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿
主細胞(例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38)がAmerican Type Culture C
ollection(ATCC; Bethesda, MD)より入手可能であり、外来のタンパク質の正
しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。In addition, a host cell strain may be chosen for its ability to regulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Modifications of such polypeptides include acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation (
lipidation), and acylation, but is not limited thereto.
Post-translational processing which cleaves a "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify target proteins, folds and / or activities. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38) with specific cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational activity are available in the American Type Culture C
Ollection (ATCC; Bethesda, MD) and is selected to ensure correct modification and processing of foreign proteins.
【0131】
本発明の別の実施例では、HYDRLをコードする自然或いは変更された、または
組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配
列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラ
HYDRLタンパク質が、HYDRLの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリの
スクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分
が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような
部分には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパ
ク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6
−His、FLAG、c−mc、赤血球凝集素(HA)が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン
、マルトース、フェニルアルシン酸化物(phenylarsine oxide)、カルモジュリ
ン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。
FLAG、c−mc、及び赤血球凝集素(HA)によって、これらのエピトープ標識を特
異的に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合
タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、HYDRLをコードする配列と異種
タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むよ
うに遺伝子操作すると、HYDRLが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タ
ンパク質の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されてい
る。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促
進できる。In another embodiment of the invention, the natural or altered or recombinant nucleic acid sequence encoding HYDRL is linked to a heterologous sequence which results in the translation of the fusion protein of any of the host systems described above. For example, a chimera containing a heterologous moiety that can be recognized by a commercially available antibody
HYDRL proteins may facilitate the screening of peptide libraries for inhibitors of HYDRL activity. Also, the heterologous protein portion and the heterologous peptide portion can facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity substrates. Such moieties include glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6
-His, FLAG, c-mc, hemagglutinin (HA), but are not limited to these. GST and MBP, Trx, CBP, 6-His allow purification of cognate fusion proteins with immobilized glutathione, maltose, phenylarsine oxide, calmodulin, and metal chelate resins, respectively.
FLAG, c-mc, and hemagglutinin (HA) allow purification of immunoaffinity of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, HYDRL can be cleaved from the heterologous moiety after purification by genetically engineering the fusion protein to include a proteolytic cleavage site between the HYDRL coding sequence and the heterologous protein sequence. Methods for expressing and purifying fusion proteins are described in Ausubel. (1995, supra ch 10). A variety of commercially available kits can be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
【0132】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したHYDRLの合成が可能である。こ
れらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコ
ードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、35Sメチオニンであ
る放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。In another embodiment of the invention, it is possible to synthesize radiolabeled HYDRL in vitro using the TNT rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extraction system (Promega). These systems connect transcription and translation of sequences encoding proteins that are operably linked to the T7 or T3, SP6 promoters. Translation occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor, which is, for example, 35 S methionine.
【0133】
HYDRLの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド
合成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タ
ンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば431Aペプ
チドシンセサイザ(Perkin Elmer)を用いて行うことが可能である。HYDRLの種
々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。Fragments of HYDRL can be produced by direct peptide synthesis using solid phase techniques as well as recombinant products (see, eg, Creighton, pp. 55-60. Supra). Protein synthesis can be performed manually or automatically. Automated synthesis can be performed using, for example, a 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Various fragments of HYDRL are separately synthesized and then ligated to produce the full length molecule.
【0134】
(治療)
HYDRLのある領域とヒドロラーゼタンパク質のある領域との間に、例えば配列
及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、HYDRL
の発現は、増殖組織、炎症組織、及び癌と密接な関係がある。場合によっては、
HYDRLをコードする配列が、遺伝性の疾患に関連する染色体の領域に位置する。
従って、HYDRLは、細胞増殖異常症、自己免疫異常症/炎症性疾患、神経障害、
腎障害、副腎機能不全症、及び遺伝障害においてある役割を果たすと考えられる
。HYDRLの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、HYDRLの発現
または活性を低下させることが望ましい。また、HYDRLの発現または活性の低下
に関連する疾患の治療においては、HYDRLの発現または活性を増大させることが
望ましい。Treatment There are chemical and structural similarities between certain regions of HYDRL and certain hydrolase proteins, for example in the context of sequences and motifs. Furthermore, HYDRL
Is closely associated with proliferative tissue, inflamed tissue, and cancer. In some cases,
The sequence encoding HYDRL is located in a region of the chromosome associated with inherited disease.
Therefore, HYDRL is associated with cell proliferative disorders, autoimmune disorders / inflammatory diseases, neuropathy,
It is thought to play a role in renal disorders, adrenal insufficiency, and genetic disorders. In the treatment of diseases associated with increased HYDRL expression or activity, it is desirable to reduce HYDRL expression or activity. In addition, in the treatment of diseases associated with decreased HYDRL expression or activity, it is desirable to increase HYDRL expression or activity.
【0135】
従って、一実施例において、HYDRLの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にHYDRLまたはその断片や誘導体を投与すること
が可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、細胞増殖異
常症が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、
硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン
尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫
、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳
、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵
臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌など
が含まれ、また、自己免疫異常症/炎症性疾患も含まれ、その中には炎症、日光
性角化症、後天性免疫不全症候群(AIDS)及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候
群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテロ
ーム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多
腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、滑液包炎、胆
嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、
肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性
胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺
炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ
球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病(MCTD)、多発性硬化症、重症
筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真
性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シ
ェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性
硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、
癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症
、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷と、リンパ腫、白血病、及び
骨髄腫を含む造血系の癌が含まれ、また、神経障害も含まれ、その中には、癲癇
、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハン
チントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化
及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝
性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳
膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経
根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病
、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン
病(prion disease)と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神
経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫(cerebelloretinal hemangioblast
omatosis)、脳3叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、
脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロ
フィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性
、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺
と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、季節性の感情の障害(SA
D)、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠
陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレッ
ト病が含まれ、また、腎障害が含まれ、その中にはアミロイド腎症、高血圧症、
原発性アルドステロン症、副腎機能不全、腎不全、腎炎、慢性腎炎、細管介在性
腎炎(tubuloinserstitial nephritis)、多発生嚢胞性疾患などの腎臓の嚢胞性
疾患、腎異形成などの形成異常性奇形、皮質性または髄質性嚢胞症、常染色体優
性及び劣性の先天性多嚢胞性腎異形成(PRD)などの先天性多嚢胞性腎異形成(P
RD)、髄質性嚢胞症、海綿腎及び管状の異形成、アルポート症候群、肺の腫瘍や
脳底部の腫瘍などの腎臓に生理学的な影響を及ぼす非腎癌、多発性骨髄腫、腎臓
の腺癌、転移性の腎癌が含まれ、また、副腎機能不全症も含まれ、その中には、
口峡炎、アナフィラキシー、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング症候群
、高血圧症、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、褐色細胞腫が含まれ、また、遺伝障
害も含まれ、その中には、GM1ガングリオシドーシス、ニーマン‐ピック病、副
腎白質ジストロトフィ、アルポート症候群、コロイデレミア、デュシェンヌ−ベ
ッカー型筋ジストロフィ、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシ
ェ病、ハンチントン病、マルファン症候群、筋ジストロフィ、筋緊張性異栄養、
頻繁骨形成不全(pycnodysostosis)、レフサム症候群、網膜芽腫、鎌状赤血球
貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、フォン‐ウィルブランド病、フォンヒッ
ペル‐リンダウ症候群、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシ
ソームアシル-CoA酸化酵素欠損症(peroxisomal acyl-CoA oxidase deficiency
)、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム2官能タンパク質欠
損症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ及びカルニチ
ン欠損症、ミトコンドリ超長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンド
リ短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリ電子伝達フラボタンパ
ク質及び電子伝達フラボタンパク質:ユビキノンオキシドレダクターゼ欠損症、
ミトコンドリ3官能タンパク質欠損症、ミトコンドリ短鎖3-ヒドロキシアシル-C
oAデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれる。Accordingly, in one embodiment, HYDRL or a fragment or derivative thereof can be administered to a patient for the treatment or prevention of disorders associated with decreased HYDRL expression or activity. Examples of such disorders include, but are not limited to, cell proliferative disorders, including actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis,
Cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, bone marrow Tumor, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, accessory Includes thyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterine cancer, and also autoimmune disorders / inflammatory diseases, including inflammation, actinic keratosis, Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, arteriosclerosis, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmunity Thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidiasis Mesodermal dystrophy (APECED), bronchitis, bursitis, cholecystitis, cirrhosis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes mellitus,
Emphysema, lymphotoxin-induced transient lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Hepatitis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, lymphotoxin-induced temporary lymphopenia, mixed connective tissue disease (MCTD), multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, Myelofibrosis, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polycythemia vera, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Schögren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic Sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome,
Cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation and hematopoiesis, including viral and bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminth infections, trauma, and lymphomas, leukemias, and myeloma Cancers of the system are also included, including neuropathy, including epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, cerebral neoplasms, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and others. Extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, inherited ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and Viral meningitis, cerebral abscess, subdural empyema, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral central nervous system disease, and Kuru and Creutzfeldt-Jakob disease , Gerstmann's syndrome , Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome prion containing mellitus (prion disease), fatal familial insomnia, nervous system trophic diseases and metabolic diseases, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastoma (cerebelloretinal hemangioblast
cerebral trigeminal vascular syndrome, central nervous system mental retardation and other developmental disorders,
Cerebral palsy, neuroskeletal disorders, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord diseases, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, peripheral nerve diseases, dermatomyositis and polymyositis, and hereditary, metabolic, endocrine, and moderate Toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic quadriplegia, mood and anxiety psychiatric disorders, and delusional psychosis, and seasonal affective disorders (SA
D), akathisia, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, schizophrenia, postherpetic neuralgia, and Tourette's disease; Including amyloid nephropathy, hypertension,
Primary aldosteronism, adrenal insufficiency, renal failure, nephritis, chronic nephritis, tubuloinserstitial nephritis, cystic disease of the kidney such as polycystic disease, dysplastic malformation such as renal dysplasia, cortex Congenital polycystic renal dysplasia (PD), including congenital or medullocystic disease, autosomal dominant and recessive congenital polycystic renal dysplasia (PRD)
RD), medullary cysts, cavernous and tubular dysplasia, Alport syndrome, non-renal cancers that have a physiological effect on the kidneys, such as lung and basilar tumors, multiple myeloma, renal adenocarcinoma , Metastatic renal cancer, and also adrenal insufficiency, including:
Orbital gland inflammation, anaphylaxis, arrhythmias, asthma, cardiovascular shock, Cushing's syndrome, hypertension, hypoglycemia, myocardial infarction, migraine, pheochromocytoma, and also genetic disorders, including: GM1 gangliosidosis, Niemann-Pick disease, adrenoleukodystrophy, Alport syndrome, colloideremia, Duchenne-Becker muscular dystrophy, Down syndrome, cystic fibrosis, chronic granulomatosis, Gaucher disease, Huntington disease, Marfan syndrome, muscle Dystrophy, myotonic dystrophy,
Frequent pycnodysostosis, Lefsum syndrome, retinoblastoma, sickle cell anemia, thalassemia, Werner syndrome, von Willebrand disease, von Hippel-Lindau syndrome, Wilms tumor, Zellweger syndrome, peroxisome acyl-CoA oxidation Enzyme deficiency (peroxisomal acyl-CoA oxidase deficiency
), Peroxisome thiolase deficiency, peroxisome bifunctional protein deficiency, mitochondrial carnitine palmitoyl transferase and carnitine deficiency, mitochondrial ultralong chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, mitochondrial short chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, mitochondrial electron transfer flavoprotein And electron transfer flavoprotein: ubiquinone oxidoreductase deficiency,
Mitochondrial trifunctional protein deficiency, Mitochondrial short-chain 3-hydroxyacyl-C
Includes oA dehydrogenase deficiency.
【0136】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHYDRLの発
現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HYDRLまたはそ
の断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。In another embodiment, HYDRL or a fragment or derivative thereof is expressed for the treatment or prevention of diseases associated with decreased expression or activity of HYDRL, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer the resulting vector to a patient.
【0137】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHYDRL
の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精
製されたHYDRLを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与するこ
とも可能である。In yet another embodiment, HYDRL, including but not limited to the diseases listed above.
For the treatment or prevention of diseases associated with decreased expression or activity of A., it is possible to administer a pharmaceutical composition comprising substantially purified HYDRL to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
【0138】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHYDRL
の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HYDRLの活
性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。In yet another embodiment, HYDRL, including but not limited to the diseases listed above.
It is also possible to administer to the patient an agonist that regulates the activity of HYDRL for the treatment or prevention of diseases associated with decreased expression or activity of HYDRL.
【0139】
更なる実施例では、HYDRLの発現または活性の増大に関連した疾患の治療また
は予防のために、患者にHYDRLのアンタゴニストを投与することが可能である。
このような疾患の例には、限定するものではないが、上記した細胞増殖異常症、
自己免疫異常症/炎症性疾患、神経障害、腎障害、副腎機能不全症、及び遺伝障
害が含まれる。一実施態様では、HYDRLと特異的に結合する抗体が直接アンタゴ
ニストとして、或いはHYDRLを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッテ
ィング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。In a further embodiment, a patient may be administered an antagonist of HYDRL for the treatment or prevention of disorders associated with increased HYDRL expression or activity.
Examples of such diseases include, but are not limited to, the above described cell proliferative disorders,
Includes autoimmune disorders / inflammatory disorders, neuropathy, renal disorders, adrenal insufficiency, and genetic disorders. In one embodiment, an antibody that specifically binds to HYDRL can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver the drug to cells or tissues that express HYDRL.
【0140】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHYDRLの発
現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、HYDRLをコード
するポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与することも可能
である。In another embodiment, the complement of a polynucleotide encoding HYDRL for the treatment or prevention of diseases associated with increased expression or activity of HYDRL, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer a vector that expresses
【0141】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。In another example, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. One of ordinary skill in the art can select suitable therapeutic agents for use in the combination therapy according to conventional pharmaceutical principles. The combination with therapeutic agents may bring about a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases listed above. Using this method, it is possible to achieve a medicinal effect with a small amount of each drug, and it is possible to reduce the possibility of a wide range of side effects.
【0142】
HYDRLのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可
能である。詳しくは、精製されたHYDRLを用いて抗体を作ったり、治療薬のライ
ブラリをスクリーニングしてHYDRLと特異的に結合するものを同定が可能である
。HYDRLの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。
このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、
一本鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメン
トが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体
(即ち、二量体の形成を阻害するもの)が特に好ましい。HYDRL antagonists can be prepared using methods conventional in the art. Specifically, purified HYDRL can be used to produce antibodies, and therapeutic drug libraries can be screened to identify those that specifically bind to HYDRL. The antibody of HYDRL can also be produced using a method generally used in this field.
Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies,
Included are single chains, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. However, it is not limited to these. For therapeutic purposes, neutralizing antibodies (ie, those that inhibit dimer formation) are particularly preferred.
【0143】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、HYDRLまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備え
るそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々
のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバン
トにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュ
バント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性
乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面
活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジ
ュバントの中では、BCG(bacilli Calmette-Guerin)及びCorynebacterium parv um
が特に好ましい。For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, can be injected with HYDRL or any fragment or oligopeptide thereof with immunogenic properties. Can be immunized with. Depending on the host species, various adjuvants may be used to enhance the immune response. Such adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, and surfactants such as dinitrophenol. However, it is not limited thereto. Among adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parv um it is particularly preferred.
【0144】
HYDRLに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、
または断片は、少なくとも約5のアミノ酸からなり、一般的には約10以上のア
ミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、また
はそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが
望ましく、小さな自然発生の分子の全アミノ酸配列も含む。HYDRLアミノ酸の短
い伸展部は、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗
体が産生され得る。Oligopeptides, peptides used to induce antibodies to HYDRL,
Alternatively, fragments preferably consist of at least about 5 amino acids, generally about 10 or more amino acids. These oligopeptides or peptides, or fragments thereof, are preferably identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and also include the entire amino acid sequence of small naturally occurring molecules. Short stretches of HYDRL amino acids can be fused with sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies to the chimeric molecule.
【0145】
HYDRLに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗
体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術
には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブ
リドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない(例えば、Kohler
, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. M
ethods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-20
30; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照)。Monoclonal antibodies against HYDRL can be produced by successive cell lines in culture, using any technique that produces antibody molecules. These techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler.
, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al. (1985) .J. Immunol. M.
ethods 81-8-42; Cote, RJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-20.
30; Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).
【0146】
更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる(例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:6
04-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照)。別法では、当分
野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して
、HYDRL特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオ
タイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから
鎖混合によって生成することもできる(例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Nat
l. Acad. Sci. 88:11120-3を参照)。In addition, techniques such as splicing the mouse antibody gene onto the human antibody gene developed for the production of “chimeric antibodies” can be used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity. (For example, Morrison, SL et al. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81-4851-4855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 6.
04-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452,454). Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies are applied using methods well known in the art to produce HYDRL specific single chain antibodies. Antibodies with related specificities but of different idiotype composition can also be generated by chain mixing from random combinatorial immunoglobulin libraries (eg, Burton DR (1991) Proc. Nat).
l. Acad. Sci. 88: 11120-3).
【0147】
抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる(例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照)。Antibodies can be induced by in vivo production in a population of lymphocytes, or by screening immunoglobulin libraries or a panel of highly specific binding reagents, as shown in the literature. (See, for example, Orlando, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833.
-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
【0148】
HYDRLに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば
、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF(ab')に
断片と、F(ab')に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFa
b断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライ
ブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速
且つ容易な同定が可能となる(例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:12
75-1281を参照)。Antibodies containing specific binding sites for HYDRL can also be produced. For example, such fragments include F (ab ') fragments produced by pepsin digestion of antibody molecules and Fa (ab') fragments produced by reducing the disulfide bridges of the fragments.
b fragments are included, but are not limited to. Alternatively, generating a Fab expression library allows for rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity (eg, Huse, WD et al. (1989) Science 254: 12.
See 75-1281).
【0149】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、HYDR
Lとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性HYDRL
エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、2部位モノクローナ
ルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用す
ることができる(Pound、前出)。Various immunoassays are used to screen to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding, or immunoradioactivity, using either polyclonal or monoclonal antibodies with isolated specificity are well known in the art. Usually for such immunoassays, HYDR
Included is the measurement of complex regulation between L and its specific antibody. Two incoherent HYDRL
Two-site monoclonal-based immunoassays are generally used with monoclonal antibodies reactive to the epitope, but competitive binding assays can also be used (Pound, supra).
【0150】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、H
YDRL抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状
態の下でHYDRL抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割った
ものである。多数のHYDRLエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール
抗体試薬の測定値Kaは、HYDRL抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定
のHYDRLエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のKaは、親和性の
真の測定値を表す。Ka値が109〜1012L/molの高親和性抗体試薬は、
HYDRL抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いる
のが好ましい。Ka値が106〜107L/molの低親和性抗体試薬は、HYDRL
が抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製(immunopurifica
tion)及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach
. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E
. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John
Wiley & Sons, New York NY)。Using various methods such as Scatchard analysis in conjunction with radioimmunoassay techniques, H 2
Assess the affinity of the YDRL antibody. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is the molar concentration of HYDRL antibody complex divided by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The measured value Ka of the polyclonal antibody reagent having a heterogeneous affinity for many HYDRL epitopes represents the average affinity or binding activity of the HYDRL antibody. The Ka of a monoclonal antibody reagent monospecific for a particular HYDRL epitope represents a true measure of affinity. The high affinity antibody reagent having a Ka value of 10 9 to 10 12 L / mol is
It is preferably used in immunoassays in which the HYDRL antibody complex must withstand vigorous manipulation. Low affinity antibody reagents with Ka values of 10 6 to 10 7 L / mol are HYDRL
Is required to dissociate from the antibody in the final activated state (immunopurifica
tion) and similar treatments. (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach .IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E
. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies , John
Wiley & Sons, New York NY).
【0151】
ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、ある下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なくとも1〜
2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な抗体を
含むポリクロナール抗体試薬は一般に、HYDRL抗体複合体を沈殿させなければな
らない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合
活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Catty, 前
出, 及びColigan 他、前出を参照)。The antibody titer and avidity of the polyclonal antibody reagents are further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain downstream applications. For example, at least 1
Polyclonal antibody reagents containing 2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, are generally used in processes in which the HYDRL antibody complex must be precipitated. Specificity of antibodies and antibody titer, binding activity, quality of antibodies and guidelines for usage in various applications are publicly available. (See, eg, Catty, supra, and Coligan et al., Supra).
【0152】
本発明の別の実施例では、HYDRLをコードするポリヌクレオチド、またはその
任意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態
では、HYDRLをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止する
のに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、HYDRLをコー
ドするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがっ
て、相補的分子または断片は、HYDRLの活性の調節、または遺伝子機能の調節の
ために使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センス
またはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、HYDRLをコードす
る配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能
である。In another embodiment of the invention, the polynucleotide encoding HYDRL, or any fragment or complementary sequence thereof, can be used for therapeutic purposes. In certain embodiments, if the complementary sequence of a polynucleotide encoding HYDRL is suitable for blocking the transcription of mRNA, it can be used. In particular, cells can also be transformed with sequences complementary to the polynucleotide encoding HYDRL. Thus, the complementary molecule or fragment can be used to regulate the activity of HYDRL or the regulation of gene function. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the HYDRL coding sequence or at various positions along the coding region.
【0153】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてHYDRLをコー
ドポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することがで
きる(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpes or vaccinia, or various bacterial plasmids can also be used to deliver the nucleotide sequence to the target organ, tissue or cell population. Methods which are well known to those skilled in the art can be used to generate vectors expressing nucleic acid sequences complementary to HYDRL-encoding polynucleotides (see, eg, Sambrook et al., Supra, and Ausubel et al., Supra). .
【0154】
HYDRLをコードする遺伝子は、HYDRLをコードするポリヌクレオチド又はその断
片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することに
よって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又は
アンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。DNAの中に組み入れられ
ない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損な
われるまでmRNA分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月
以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く
持続し得る。The gene encoding HYDRL can be stopped by transforming cells or tissues with an expression vector that expresses high levels of a polynucleotide encoding HYDRL or a fragment thereof. Such constructs can be used to introduce non-translatable sense or antisense sequences into cells. Even when not integrated into DNA, such vectors continue to transcribe mRNA molecules until impaired by endogenous nucleases. Non-replicating vectors also have transient expression that lasts for a month or more, and may last even longer if suitable replication elements are part of the vector system.
【0155】
上記した通り、遺伝子の発現は、HYDRLをコードする遺伝子の制御5’または
調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子(DNA或いはRNA、PNA)
を設計することによって調節することができる。例えば開始部位から約−10か
ら約+10までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いることが可
能である。同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる
。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の
結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる最
近の治療の進歩は文献に記載されている(例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: H
uber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照)。相補的な配列またはアンチセンス分
子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳
を阻止するように設計できる。[0155] As described above, the expression of a gene is the sequence complementary to the regulatory 5'or regulatory region of the gene encoding HYDRL or an antisense molecule (DNA or RNA, PNA).
Can be adjusted by designing. For example, it is possible to use an oligonucleotide derived from the transcription start site from about -10 to about +10 from the start site. Similarly, it can be blocked using "triple helix" and base pairing methods. The triple helix structure is useful because it prevents the double helix from expanding sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules. Recent therapeutic advances with triplex DNA have been described in the literature (eg Gee, JE et al. (1994) In: H
uber, BE and BI Carr, Molecular and Immunologic Approaches , Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to block translation of mRNA by blocking the binding of transcripts to ribosomes.
【0156】
酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、HYDRLをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に
触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。Ribozymes, enzymatic RNA molecules, can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by nucleotide strand scission.
For example, recombinant hammerhead ribozyme molecules that specifically and effectively catalyze nucleotide scission of sequences encoding HYDRL are included.
【0157】
任意の潜在的RNA標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列GU
A、GUU、及びGUCを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャ
ニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む
標的遺伝子の領域に対応する15個から20個のリボヌクレオチドの短いRNA配
列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価
することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを
用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテ
ストすることによって評価することが可能である。A specific ribozyme cleavage site in any potential RNA target is identified by the subsequent sequence GU.
Initially identified by scanning the target molecule against ribozyme cleavage sites including A, GUU, and GUC. Once identified, a short RNA sequence of 15 to 20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site is evaluated for secondary structural features that impair the function of the oligonucleotide. Is possible. The suitability of candidate targets can also be assessed by testing their ease of hybridization with complementary oligonucleotides using a ribonuclease protection assay.
【0158】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでHYDRLをコードするDNA配列の
転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポ
リメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能で
ある。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作
製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。Complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made for the synthesis of nucleic acid molecules using methods well known in the art. These methods include methods of chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, RNA molecules can be generated in vitro and in vivo by transcription of the DNA sequence encoding HYDRL, such DNA sequences being produced using various RNA vector promoters such as T7 or SP6. Can be incorporated into. Alternatively, these cDNA constructs that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells, or tissues.
【0159】
RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の5’及び/または3’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は2’Oメチルの使用が含まれる、がこれらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。Modification of RNA molecules can increase intracellular stability and prolong half-life. Possible modifications include the addition of flanking sequences at the 5'and / or 3'ends of the molecule, or the use of phosphorothionate or 2'O methyl rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. , Are not limited to these. Unique to PNA production, this concept is that adenine, cytidine, guanine, thymine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases,
And the acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of uridine, as well as the inclusion of non-conventional bases such as inosine, queosine, and wybutosine, in whole of these molecules. Can be expanded to.
【0160】
ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o
、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる(例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照)。[0160] vectors available are a number of ways of introducing into a cell or tissue, in vivo, are equally suitable for use in in vitr o, and ex vivo. For ex vivo treatment, the vector is introduced into hepatocytes taken from a patient and cloned and propagated for autologous transplant back into the same patient. Transfection, ribosome injection or delivery by polycationic aminopolymers can be performed using methods well known in the art (eg Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462.
-66 :).
【0161】
上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサ
ギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。Any of the above methods of treatment can be applied to any subject in need of treatment including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits and monkeys.
【0162】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、HYDRL、HYDRLに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はHYDR
Lのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの1
種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができ
る。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水な
どが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬
物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。Another embodiment of the present invention relates to the administration of a pharmaceutical or sterile composition in association with a pharmaceutically acceptable carrier for all of the above mentioned therapeutic effects. Such a pharmaceutical composition comprises HYDRL, an antibody against HYDRL, a mimetic, an agonist, an antagonist, or HYDR.
It consists of L inhibitors and so on. This composition can be used alone or as a stabilizer.
It may be administered in sterile biocompatible pharmaceutical carriers with more than one additional agent. Such pharmaceutical carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, glucose, water and the like. This composition can be administered alone or with another agent such as a drug or hormone.
【0163】
本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。The pharmaceutical composition used in the present invention can also be administered using any number of routes. This route includes oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, percutaneous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, ectopic, sublingual, It also includes, but is not limited to, the rectum.
【0164】
活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。In addition to the active ingredients, these pharmaceutical compositions contain suitable pharmaceutically acceptable excipients and auxiliaries, which facilitate the formulation of the active compounds into pharmaceutically usable agents. The carrier may be included. Detailed techniques for formulation and administration are described in the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA).
【0165】
経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。Pharmaceutical compositions for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in dosages suitable for oral administration. Such carriers allow tablets, pills, dragees, capsules, and pharmaceutical compositions to be ingested by patients.
It is formulated as a liquid, gel, syrup, mud, or suspension.
【0166】
経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、(所望に応じてすりつぶした後)タブレット或
いは糖衣錠コア(dragee cores)にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。Medicaments for oral use include tablets or dragee cores (after grinding if desired) by mixing the active compound with solid drug additives and treating the resulting granule mixture. cores). Suitable excipients include lactose, sucrose, mannitol, or sugars including sorbitol, starch from corn, wheat, rice, potato, or other plants, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, or cellulose such as sodium carboxymethylcellulose, Gum, including gum arabic and gum tragacanth, carbohydrates or protein excipients such as proteins such as gelatin and collagen.
If desired, a disintegrant or solubilizer such as cross-linked polyvinylpyrrolidone, kanten, alginic acid, or its salt sodium alginate is added.
【0167】
糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル(carbopol gel)、ポリエチレングリコール、及び/または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。Dragee cores are used with a suitable coating such as a concentrated sugar solvent. Such concentrated sugar solvents may include gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel, polyethylene glycol, and / or titanium dioxide, lacquer solvents, and suitable organic or mixed solvents. Dyestuffs or pigments are added to the tablets or dragee coatings for identification of the product or to indicate the quantity of active compound, ie the dose.
【0168】
経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。Pharmaceutical formulations for oral use include push-fit capsules made of gelatin, encapsulated capsules made of gelatin and a coating such as glycerol or sorbitol. Push-fit capsules contain the active ingredient in admixture with excipients or binders such as lactose or starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, and, if desired, stabilizers. In soft capsules, the active compound, with or without stabilizer,
It may be dissolved or suspended in a suitable solution such as a fatty oil, solution, or polyethylene glycol solution.
【0169】
非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。Pharmaceutical agents suitable for parenteral administration are formulated in aqueous solutions, but physiologically compatible buffers such as Hank's solution, Ringer's solution, physiological buffered saline are preferred. Aqueous suspension injections may contain substances which increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. Additionally, suspensions of the active compounds may be formulated as suitable oily injection suspensions. Suitable hydrophilic solutions or vehicles include fatty oils such as sesame oil, ethyl oleate, triglycerides or synthetic fatty acids such as ribosomes. Non-lipid polycationic amino polymers are used for delivery purposes. Optionally, the suspension may also contain suitable stabilizers or agents which increase the solubility of the compounds to allow for concentrated solutions.
【0170】
局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。For local or nasal administration, suitable penetrants that penetrate certain barriers are used in the formulation. Such penetrants are well known to those of ordinary skill in the art.
【0171】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離(levigating)、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared using methods well known in the art, such as conventional mixing, dissolving, granulating, sugar coating, elevating, emulsifying, encapsulating, encapsulating, or lyophilizing processes. Can be manufactured.
【0172】
医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の薬
剤の形態には、1mM〜50mMヒスチジン、0.1%〜2%スクロース、及び
2%〜7%マンニトールの幾つか或いは全てを含み、pHの範囲が4.5〜5.
5であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。Pharmaceutical compositions are formulated as salts and can be formed with many acids including, but not limited to, hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid. Salts are more soluble in water or other protic solvents than are the corresponding free base systems. Another drug form comprises some or all of 1 mM to 50 mM histidine, 0.1% to 2% sucrose, and 2% to 7% mannitol, with a pH range of 4.5-5.
5, a lyophilized powder that is buffered prior to use can be used.
【0173】
医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。HYDRLの投与のため、このようなラベルには、量、
頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。After the pharmaceutical compositions have been prepared, they are packaged in suitable boxes and labeled as medication for the indicated symptoms. For the administration of HYDRL, such a label would include the amount,
Frequency and method of administration will be included.
【0174】
本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。Suitable pharmaceutical compositions for use in the present invention include compositions wherein the active ingredients in effective amounts to achieve the objectives are included. Those of ordinary skill in the art can determine a dose that is sufficiently effective based on their ability.
【0175】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。For any composition, the therapeutically effective dose can be estimated initially either in tumor cell assays, eg, of tumor cells, or in animal models. Usually, a mouse, a rabbit, a dog, a pig, or the like is used as the animal model. Animal models can also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Based on such treatment, a beneficial dose and administration route for human can be determined.
【0176】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばHYDRL又はそ
の断片、HYDRLの抗体、HYDRLのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビター
などの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED50
(服用に対して集団の50%に医薬的効果がある)またはLD50(服用に対して
集団の50%に致命的である)統計を計算するなど、細胞培養または動物実験に
おける標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果と
の薬用量比は治療指数であり、LD50/ED50と示すことができる。高い治療指
数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られた
データが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。こ
のような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含
む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患
者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。A pharmaceutically effective dose is related to the amount of active ingredients, such as HYDRL or fragments thereof, HYDRL antibodies, HYDRL agonists or antagonists, inhibitors, etc. that ameliorates symptoms or conditions. Medicinal efficacy and toxicity can be calculated, for example, by calculating the ED 50 (50% of the population has a medicinal effect on dose) or LD 50 (50% of the population is fatal on dose) statistics. , Can be determined by standard drug techniques in cell culture or animal studies. Dosage ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as LD 50 / ED 50. Pharmaceutical compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. The data obtained from cell culture assays and animal studies are used in formulating a range of dosage for human applications. The dosage contained in such compositions is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED 50 with little or no toxicity. The dosage will vary within this range depending upon the dosage form employed, the patient sensitivity, and the route of administration.
【0177】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the patient that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Dosage factors considered include disease severity, general health of the patient, age, weight, and sex of the patient, time and frequency of administration, concomitant medications, response susceptibility, and treatment. Contains the response. Long-acting pharmaceutical compositions can be administered every three or four days, once a week, once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
【0178】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約0.1〜100,000μg
までの最大約1グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。The usual dosage varies depending on the route of administration, but is about 0.1-100,000 μg.
Up to about 1 gram. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and generally available to practitioners in the art. One of skill in the art will utilize formulations of nucleotides that are different than the protein or inhibitor. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide is
It will be specific to a particular cell, condition, location, etc.
【0179】
(診断)
別の実施例では、HYDRLに特異的に結合する抗体が、HYDRLの発現によって特徴
付けられる疾患の診断、またはHYDRLやHYDRLのアゴニストまたはアンタゴニスト
、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いら
れる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤され
る。HYDRLの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や
組織から採取されたものからHYDRLを検出する方法が含まれる。これらの抗体は
、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共
有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子
が用いられるが、その内の幾つかは上記した。(Diagnosis) In another embodiment, a patient whose antibody specifically binding to HYDRL is diagnosed with a disease characterized by the expression of HYDRL or treated with HYDRL or an agonist, antagonist or inhibitor of HYDRL. Used in an assay to monitor Antibodies useful for diagnosis are formulated in the same manner as described in treatment. HYDRL diagnostic assays include methods of detecting HYDRL from human body fluids or from cells and tissues using antibodies and labels. These antibodies, used with or without modification, can be labeled by covalent or non-covalent attachment of reporter molecules. Various reporter molecules known in the art are used, some of which have been mentioned above.
【0180】
HYDRLを測定するためのELISA,RIA,及びFACSを含む種々のプロトコルは、当
分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのHYDRLの発現を診断する元
となるものを提供する。正常或いは標準的なHYDRLの発現の値は、複合体の形成
に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液
または細胞とHYDRLに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的
な複合体形成の量は、測光法(photometric)などの種々の方法で定量され得る
。被験者のHYDRLの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値
と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターと
なる。Various protocols for measuring HYDRL, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide the basis for diagnosing altered or abnormal levels of HYDRL expression. The value of normal or standard HYDRL expression is determined by binding an antibody against HYDRL to a body fluid or cell collected from a subject such as a normal mammal, for example, a human under conditions suitable for complex formation. To do. The amount of canonical complex formation can be quantified by various methods such as photometric. The amount of HYDRL expression, control and disease in the subject, samples from biopsy tissue are compared to standard values. The deviation between the standard value and the subject is the parameter for diagnosing the disease.
【0181】
別の実施例によれば、HYDRLをコードするポリヌクレオチドを診断のために用
いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列
、相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用い
て、疾患と相関し得るHYDRLを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し
定量する。この診断アッセイを用いて、HYDRLの不在、存在、及び過度の発現を
調べ、治療中のHYDRLレベルの制御を監視する。According to another embodiment, the polynucleotide encoding HYDRL can also be used for diagnosis. The polynucleotides used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. This polynucleotide is used to detect and quantify the expression of genes in biopsy tissues that express HYDRL that can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to examine the absence, presence, and overexpression of HYDRL and monitor the regulation of HYDRL levels during treatment.
【0182】
ある実施形態では、HYDRLまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポ
リヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーション
によって、HYDRLをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば5'
調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特
異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅のストリンジェントは、プローブがHYDRLをコードする自然界の
配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列
のみを同定するかどうかによって決まるであろう。In certain embodiments, it is possible to identify a nucleic acid sequence encoding HYDRL by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising a gene sequence encoding HYDRL or a closely related molecule. is there. For example, 5 '
The specificity of the probe, whether it is a highly specific region that is a regulatory region or a region with a slightly low specificity that is a conserved motif, and the stringency of hybridization or amplification depends on the probe HYDRL. It will depend on whether to identify only the natural sequences that encode or whether to identify only the natural sequences that encode the allele or related sequence.
【0183】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、HYDRLをコードする任意の
配列と少なくとも50%の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイ
ゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:17−32の配
列、或いはHYDRL遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノ
ム配列に由来し得る。The probe may also be used for detection of related sequences and have at least 50% sequence identity with any sequence encoding HYDRL. The desired hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 17-32 or the genomic sequence of HYDRL gene including promoter, enhancer and intron.
【0184】
HYDRLをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、HYDRL及びHYDRL誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプ
ローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベク
ターは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好
適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを
合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば32P
或いは35Sなどの放射性核種、或いはアビジン/ビオチン(biotin)結合系に
よってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々の
レポーターの集団によって標識され得る。As a method for producing a hybridization probe specific to HYDRL-encoding DNA, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding HYDRL and a HYDRL derivative into a vector for producing an mRNA probe. Such vectors are commercially available, well known to those skilled in the art, and are used to synthesize RNA probes in vitro by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide. The hybridization probe is, for example, 32 P.
Alternatively, it may be labeled with a radionuclide such as 35 S, or a population of various reporters such as an enzyme label such as alkaline phosphatase linked to the probe by an avidin / biotin binding system.
【0185】
HYDRLをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、HYDRLの発現に関連する疾
患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例
には、細胞増殖異常症が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈
硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性
夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び
白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀
胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺
、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸
腺、子宮の癌などが含まれ、また、自己免疫異常症/炎症性疾患も含まれ、その
中には炎症、日光性角化症、後天性免疫不全症候群(AIDS)及び副腎機能不全、
成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬
化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺
炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支
炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮
膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結
節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブ
ス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大
腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病(MCTD)、多
発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗し
ょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関
節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマ
トーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウ
ェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感
染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷と、リンパ
腫、白血病、及び骨髄腫を含む造血系の癌が含まれ、また、神経障害も含まれ、
その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病
、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、
筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色
素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイ
ルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎
、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフ
ェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候
群を含むプリオン病(prion disease)と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養
病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫(cerebelloretin
al hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及
び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊
髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発
性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症
、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、季節性
の感情の障害(SAD)、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、
錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛
、及びトゥーレット病が含まれ、また、腎障害が含まれ、その中にはアミロイド
腎症、高血圧症、原発性アルドステロン症、副腎機能不全、腎不全、腎炎、慢性
腎炎、細管介在性腎炎(tubuloinserstitial nephritis)、多発生嚢胞性疾患な
どの腎臓の嚢胞性疾患、腎異形成などの形成異常性奇形、皮質性または髄質性嚢
胞症、常染色体優性及び劣性の先天性多嚢胞性腎異形成(PRD)などの先天性多
嚢胞性腎異形成(PRD)、髄質性嚢胞症、海綿腎及び管状の異形成、アルポート
症候群、肺の腫瘍や脳底部の腫瘍などの腎臓に生理学的な影響を及ぼす非腎癌、
多発性骨髄腫、腎臓の腺癌、転移性の腎癌が含まれ、また、副腎機能不全症も含
まれ、その中には、口峡炎、アナフィラキシー、不整脈、喘息、心血管ショック
、クッシング症候群、高血圧症、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、褐色細胞腫が含
まれ、また、遺伝障害も含まれ、その中には、GM1ガングリオシドーシス、ニー
マン‐ピック病、副腎白質ジストロトフィ、アルポート症候群、コロイデレミア
、デュシェンヌ−ベッカー型筋ジストロフィ、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢
性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、マルファン症候群、筋ジストロフィ
、筋緊張性異栄養、頻繁骨形成不全(pycnodysostosis)、レフサム症候群、網
膜芽腫、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、フォン‐ウィルブラ
ンド病、フォンヒッペル‐リンダウ症候群、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー
症候群、ペルオキシソームアシル-CoA酸化酵素欠損症(peroxisomal acyl-CoA o
xidase deficiency)、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム
2官能タンパク質欠損症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェ
ラーゼ及びカルニチン欠損症、ミトコンドリ超長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ
欠損症、ミトコンドリ短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリ電
子伝達フラボタンパク質及び電子伝達フラボタンパク質:ユビキノンオキシドレ
ダクターゼ欠損症、ミトコンドリ3官能タンパク質欠損症、ミトコンドリ短鎖3-
ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれる。HYDRLをコードする
ポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いは
その他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック(dipstick)、ピン(pin)、
ELISA式アッセイ、及び変異HYDRLの発現を検出するために患者から採取した体液
或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような
質的或いは量的方法は、当分野では周知である。Polynucleotide sequences encoding HYDRL can be used to diagnose disorders associated with expression of HYDRL. Examples of such disorders include, but are not limited to, cell proliferative disorders, including actinic keratoses and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed Type connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and malformations Cancer, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate, It includes salivary glands, skin, spleen, testes, thymus, uterine cancer, and also autoimmune disorders / inflammatory diseases, including inflammation, actinic keratosis, and acquired immunodeficiency syndrome ( AIDS) and adrenal insufficiency,
Adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, arteriosclerosis, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidiasis Ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, bursitis, cholecystitis, cirrhosis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphotoxin-induced temporary lymphopenia , Erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, hepatitis, hypereosinophilia, irritable colon Syndrome, lymphotoxin-induced transient lymphopenia, mixed connective tissue disease (MCTD), multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, myelofibrosis, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis , Polycythemia vera , Polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjögren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colon Inflammation, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation and viral and bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma and lymphoma, leukemia, and Includes hematopoietic cancers including myeloma, also includes neuropathy,
Among them are epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders,
Amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron disorders, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis , Brain abscess, subdural empyema, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and radiculitis, viral central nervous system disease and Kuru and Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann syndrome, Gerstmann -Prion disease including Straussler-Scheinker syndrome and fatal familial insomnia, neurotrophic and metabolic diseases, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastoma (cerebelloretin)
al hemangioblastomatosis), cerebral trigeminal neurovascular syndrome, central nervous system mental retardation and other developmental disorders, cerebral palsy, neuroskeletal disorders, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, myelopathy, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, Peripheral neuropathy, dermatomyositis and polymyositis, hereditary, metabolic, endocrine, and toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic quadriplegia, mood and anxiety psychosis, and delusional psychosis And seasonal affective disorder (SAD), akathisia, amnesia, catatonic disease, diabetic neuropathy,
Includes extrapyramidal terminal deficiency syndrome, dystonia, schizophrenia, postherpetic neuralgia, and Tourette's disease, and also includes renal impairment, including amyloid nephropathy, hypertension, primary Cystic disease of the kidney such as aldosteronism, adrenal insufficiency, renal failure, nephritis, chronic nephritis, tubuloinserstitial nephritis, polycystic disease, dysplastic malformations such as renal dysplasia, cortical or Congenital polycystic renal dysplasia (PRD), including medullary cystosis, autosomal dominant and recessive congenital polycystic renal dysplasia (PRD), medullary cystosis, cavernous and tubular dysplasia, Alport Non-renal cancers that have a physiological effect on the kidneys, such as the syndrome, tumors of the lungs and tumors of the fundus of the brain,
Includes multiple myeloma, adenocarcinoma of the kidney, metastatic renal cancer, and also adrenal insufficiency, including gut inflammation, anaphylaxis, arrhythmias, asthma, cardiovascular shock, Cushing's syndrome. , Hypertension, hypoglycemia, myocardial infarction, migraine headache, pheochromocytoma, and genetic disorders, including GM1 gangliosidosis, Niemann-Pick disease, adrenoleukodystrophy, Alport syndrome , Colloideremia, Duchenne-Becker muscular dystrophy, Down syndrome, cystic fibrosis, chronic granulomatosis, Gaucher disease, Huntington's disease, Marfan syndrome, muscular dystrophy, myotonic dystrophy, frequent bone dystrophy (pycnodysostosis), Refsum syndrome, retinoblastoma, sickle cell anemia, thalassemia, Werner syndrome, von Willebrand disease, von Hippel-li Dow syndrome, Wilms' tumor, Zellweger syndrome, peroxisomal acyl -CoA oxidase deficiency (peroxisomal acyl-CoA o
xidase deficiency), peroxisome thiolase deficiency, peroxisome bifunctional protein deficiency, mitochondrial carnitine palmitoyl transferase and carnitine deficiency, mitochondrial ultralong chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, mitochondrial short chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, mitochondrial electron transfer Flavoproteins and electron transfer flavoproteins: ubiquinone oxidoreductase deficiency, mitochondrial trifunctional protein deficiency, mitochondrial short chain 3-
Includes hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency. The polynucleotide sequence encoding HYDRL can be obtained by the Southern method, Northern method, dot blot method, or other membrane-based technology, PCR method, dipstick, pin,
It can be used in ELISA-based assays and microarrays that utilize body fluids or tissues collected from patients to detect the expression of mutant HYDRL. Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.
【0186】
特定の形態において、HYDRLをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患
、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。HYDRLをコード
するヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション
複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに
加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナ
ルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプ
ルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のHYDRLをコードするヌクレ
オチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このよう
なアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視にお
ける、特定の治療効果を推定することが可能である。In a particular form, the nucleotide sequences encoding HYDRL will be useful in assays to detect related disorders, in particular the disorders mentioned above. The nucleotide sequence encoding HYDRL could be labeled by standard methods and added to a body fluid or tissue sample taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the samples are washed and the signal is quantified and compared to standard values. If the amount of signal in the patient sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation of the nucleotide sequence encoding HYDRL in the sample reveals the presence of the associated disease. Such assays can be used to estimate the effectiveness of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or monitoring individual patient treatment.
【0187】
HYDRLの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常
あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或
いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出さ
れた体液或いは細胞と、HYDRLをコードする配列或いはその断片とを結合させる
ことにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者か
ら得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験か
らの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準
的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験
者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。Normal or canonical expression profiles are established to provide a basis for diagnosis of diseases associated with expression of HYDRL. This can be achieved by combining the HYDRL coding sequence or a fragment thereof with a body fluid or cell extracted from a normal subject, either animal or human, under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridizations can be quantitated by comparing the values obtained from normal subjects to those from experiments in which known amounts of substantially purified polynucleotides are used. Standard values obtained from normal samples can be compared with those obtained from subjects who exhibit symptoms of the disease. Deviation between standard and subject values is used to establish the presence of disease.
【0188】
疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。Once the presence of the disease is established and the treatment protocol is initiated, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to estimate whether the level of expression in the subject has begun to approach the values shown in normal patients. It is possible. The results of repeated assays can be used to see the effect of treatment over a period of days to months.
【0189】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。In cancer, abnormal amounts of transcripts in living tissue from an individual predispose to the development of the disease and may provide a method of detecting the disease before actual clinical symptoms develop. is there. This type of clearer diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive therapies early to prevent the development or progression of cancer.
【0190】
HYDRLをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断へ
の利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成
、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましく
はHYDRLをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはHYDRLをコードするポリヌ
クレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の
遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いスト
リンジェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び/または定量のた
め用いることが可能である。Further diagnostic uses for oligonucleotides designed from the HYDRL coding sequence may include the use of PCR. Such oligomers can be chemically synthesized, enzymatically produced, or produced in vitro . The oligomer preferably contains a fragment of a polynucleotide encoding HYDRL or a fragment of a polynucleotide complementary to the polynucleotide encoding HYDRL, and is used to identify a specific gene or condition under the optimum conditions. It Further, the oligomer can be used for detecting and / or quantifying a closely related DNA or RNA sequence under slightly mild stringent conditions.
【0191】
HYDRLの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標
識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅(coamplification)、及び標準的
な曲線に結果が加えられたものが含まれる(例えば、Melby, P.C.等(1993) J. I
mmunol. Methods, 159:235-44;Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を
参照)。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含ま
れ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速な高スループット型のアッセ
イを用いることで加速された。Methods that can be used to quantify the expression of HYDRL include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, coamplification of regulatory nucleic acids, and standard curves with the results added. (For example, Melby, PC et al. (1993) J. I.
mmunol. Methods, 159: 235-44; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). The quantitation rate of a large number of samples was accelerated by using a high throughput assay in which the oligomer of interest was included in different dilutions and quantified by spectrophotometry or non-color response.
【0192】
別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多型を識別する。この情報は、遺伝子機能の
決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び開
発に有用である。In another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein are used as targets in microarrays. Microarrays are used to monitor the expression levels of a large number of genes at the same time and identify gene mutations, mutations and polymorphisms. This information is useful in determining gene function, interpreting the genetic basis of disease, diagnosing disease, and monitoring and developing the activity of therapeutic agents.
【0193】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照)
本発明の別の実施例ではまた、HYDRLをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを
生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる
。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工
染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1生
成物或いは単一染色体cDNAライブラリである。(例えば、Harrington, 1.3. 他
(1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 5−87-134,
及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照)
in sit蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう(例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照)。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)のワー
ルドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上の
HYDRLをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に
対する素因が、このような疾患と関係するDNAの領域を決定するのに役立つ。本
発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝
子配列における違いを検出することもある。Microarrays are prepared, used, and analyzed by methods well known in the art. (For example, Brennan, TM et al. (1995) US Pat. No. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Pro.
c. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995) PCT application number W
O95 / 251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT application number WO95 / 35505; Heller, RA et al. (1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155; and Heller, MJ et al. (1997) U.S. Pat.No. 5,605,662) Another embodiment of the invention also uses a nucleic acid sequence encoding HYDRL. Thus, it is possible to generate hybridization probes useful for mapping naturally occurring genomic sequences. This array maps to: It is a specific chromosome, a specific region of the chromosome or an artificially generated chromosome, for example, a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 product or a single chromosome cDNA library. (Eg Harrington, 1.3. Etc.
(1997) Nat Genet. 15: 345-355; Price, CM (1993) Blood Rev. 5-87-134,
And Trask, BJ (1991) Trends Genet. 7: 149-154) in sit fluorescence hybridization (FISH) will correlate with other physical chromosome mapping techniques and genetic map data (eg Heinz- Ulrich, et al. (1995) in Meyers, supra, pp. 965-968.). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or the World Wide Web site of the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). On a physical chromosome map
The correlation between the location of the gene encoding HYDRL and a particular disease, or the predisposition to a particular disease, helps determine the region of DNA associated with such a disease. The nucleotide sequences of the present invention may also be used to detect differences in gene sequences between normal, carrier and infected individuals.
【0194】
染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す(例えば、Gatti, R.A.他による(1988)Nature 336:577-580
を参照)。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。The genetic map can also be extended using physical mapping techniques such as in sit hybridization of chromosomal preparations and binding analysis using established chromosomal markers. By placing the gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse,
Relevant markers are often revealed, even if the number or arm of a particular human chromosome is not known. The new array by physical mapping
It can also be assigned to a chromosome arm. This is valuable information for researchers studying genetic disorders using positional cloning or other gene discovery techniques. The location of the disease or syndrome is, for example, 11q22-
Once roughly determined by gene binding to a particular gene region such as 23, any sequence mapping for that region represents a relevant gene or regulatory gene for further investigation (eg, Gatti, RA et al. (1988). Nature 336: 577-580
See). Further, by using the nucleotide sequence of the present invention of interest, a normal person, a holder,
That is, a difference in chromosomal position due to translocation, inversion, etc. between infected persons may be detected.
【0195】
本発明の別の実施例では、HYDRL、その触媒作用断片或いは免疫原断片または
そのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物の
ライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニング
に用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは
細胞内に存在する。HYDRLとテストされる薬剤との複合体を結合することによる
形成は計測されることもある。In another embodiment of the invention, HYDRL, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof can be used to screen a library of compounds in any of a variety of drug screening techniques. Fragments used for such screening may be free in solution, immobilized on a solid support, retained on the surface of cells, or present intracellularly. Formation by binding the complex of HYDRL with the drug being tested may be measured.
【0196】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
(例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照)。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、HYDRL、或いはその断片と反応してから
洗浄される。次ぎに、結合されたHYDRLが、当分野で周知の方法で検出される。
精製されたHYDRLはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられる
プレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプ
チドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。Another method used for drug screening is used to increase the screening throughput of compounds with suitable binding affinities for the protein of interest (eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. See WO84 / 03564). In this method, a significant number of different small test compounds are synthesized on plastic pins or other substrates. The test compound is reacted with HYDRL, or a fragment thereof, and then washed. Bound HYDRL is then detected by methods well known in the art.
Purified HYDRL can also be coated directly onto the plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
【0197】
別の実施例では、HYDRLと結合可能な中和抗体がHYDRLと結合するため試験用化
合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる
。この方法では、抗体が、HYDRLと1つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプ
チドの存在も検出する。In another example, competitive drug screening assays can be used in which neutralizing antibodies capable of binding HYDRL specifically compete with the test compound for binding HYDRL. In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with HYDRL.
【0198】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にHYDRLをコードするヌクレオチ
ド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特
異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提
供することができる。In another embodiment, nucleotide sequences encoding HYDRL are used in developing molecular biology techniques, including, but not limited to, currently known nucleotides such as the triplet code and specific base pair interactions. New technologies can be provided that depend on the characteristics of the sequence.
【0199】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する好適な特定の実施例は
、例示目的であって本発明を限定するものではない。Those skilled in the art will be able to make full use of the present invention without further explanation given the preceding description. Therefore, the preferred specific embodiments described below are for purposes of illustration and not limitation of the invention.
【0200】
前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願[1998
年11月12日に提出した代理人整理番号PF-0643P]及び米国出願通し番号60/135,51
9に言及することをもって本明細書の一部とする。All patent applications, patents, publications, particularly US applications [1998] mentioned above and below.
No. PF-0643P filed on November 12, 2012 and US serial number 60 / 135,51
References to 9 are incorporated herein by reference.
【0201】
(実施例)
1 cDNAライブラリの作製
RNAは、Clontech社から購入、或いは表4に列記した組織から単離した。ある
組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した。一
方では、別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或いはTRIZOL (
Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相
溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおい
て遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリ
ウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物からRNAを沈殿させ
た。Example 1 Preparation of cDNA Library RNA was purchased from Clontech or isolated from the tissues listed in Table 4. A tissue was homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution. On the one hand, another tissue is homogenized and dissolved in phenol, or TRIZOL (
Life Technologies), guanidinium isothiocyanate and a suitable modifier such as a single phase solution of phenol. The lysate was centrifuged in cesium chloride or extracted with chloroform. RNA was precipitated from this lysate with either isopropanol or sodium acetate and ethanol, or otherwise.
【0202】
RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰
り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理する。殆どのライブラリで
は、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN
. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ(A+)RNAを
単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの
別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。RNA extraction with phenol and precipitation were repeated as many times as necessary to increase RNA purity. In some cases, RNA is treated with a DNA degrading enzyme. Most libraries have oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega) or OLIGOTEX latex particles (QIAGEN).
Valencia CA), OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN) was used to isolate poly (A +) RNA. Alternatively, another RNA isolation kit such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX) was used to isolate directly from tissue lysates.
【0203】
ある場合には、Stratagene社にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAラ
イブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)
またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分野で
公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。
(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は、オリゴd(T)
またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な1つの制限酵素或いは複数の制限酵素
でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S 1000または SEPHAROSE
CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech
)、アガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ(300〜1000bp)を選択した
。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT1プラスミド(Life Technolo
gies)、plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)などの好適なプラスミ
ドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラス
ミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIueMRF、SOLR、またはLife Technologi
es社のDH5αまたはDH 10B、ELECTROMAX DH 10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に
形質転換した。In some cases, RNA was provided to Stratagene and a cDNA library corresponding to Stratagene was created. Otherwise, UNIZAP vector system (Stratagene)
Alternatively, a cDNA library was prepared by using the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) to synthesize cDNA by a recommended method known in the art or a similar method.
(See, eg, Ausubel, 1997, supra, Units 5.1-6.6). Reverse transcription is oligo d (T)
Or started with random primers. A synthetic oligonucleotide adapter was attached to the double-stranded cDNA and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme or restriction enzymes. For most libraries, SEPHACRYL S 1000 or SEPHAROSE
CL2B, SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech
), And the size of the cDNA (300-1000 bp) was selected by agarose gel electrophoresis. PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene) or pSPORT1 plasmid (Life Technolo
gies), plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA), etc., and the cDNA was ligated to the compatible restriction enzyme site of the polylinker of a suitable plasmid. Use this recombinant plasmid with Stratagene XL1-Blue, XL1-BIueMRF, SOLR, or Life Technologi.
The cells were transformed into competent E. coli cells containing es DH5α or DH10B and ELECTROMAX DH10B.
【0204】
2 cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも1つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、0.1mlの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。 2 Isolation of cDNA clones Plasmids were recovered from host cells by in vivo excision utilizing the UNIZAP vector system (Stratagene) or cell lysis. Magic or WIZARD Minipreps
DNA purification system (Promega) and AGTC Miniprep purification kit (Edge Biosystems, G
aithersburg MD), QIAGEN's QIAWELL 8 Plasmid, QIAWELL 8 Plus Plasmid, QI
Plasmids were purified using at least one of the AWELL 8 Ultra Plasmid Purification System, REAL Prep 96 Plasmid Kit. After precipitation, it was resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without freeze-drying.
【0205】
別法では、高スループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプラ
スミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細
胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理し
てから384−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度
をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャ
ナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates by a high throughput direct ligation PCR method. (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). Host cell lysis and thermal cycling processes were performed in a single reaction mixture. Samples are processed and transferred to 384-well plates for storage and the concentration of amplified plasmid DNA is quantified using PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and Fluoroskan II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Measured.
【0206】
3 シークエンシング及び分析
cDNAのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cyclerまたはPTC-200 thermal cycler (MJ Research)と
HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200 (Ham
ilton) 液体転移システムとの組み合わせなどの高スループット装置で行った。c
DNAのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech社の試薬
、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキッ
ト(Perkin-Elmer)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた。c
DNAのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチド
の検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics
)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373
または377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、当分野で周知のその他の
配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997
, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例
の5に記載した方法で配列を延長した。 3 Sequencing and Analysis cDNA sequencing reactions can be performed using standard methods or ABI CATALYST 800 (
Perkin-Elmer) thermal cycler or PTC-200 thermal cycler (MJ Research)
HYDRA Microdispenser (Robbins Scientific) or MICROLAB 2200 (Ham
ilton) High throughput equipment such as combination with liquid transfer system. c
For the preparation of a DNA sequencing reaction, a reagent from Amersham Pharmacia Biotech or a reagent contained in an ABI sequencing kit such as ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Perkin-Elmer) was used. c
For electrophoretic separation of DNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamics
), ABI PRISM 373 using standard ABI protocol and base pair calling software
Alternatively, the 377 Sequencing System (Perkin-Elmer), other sequence analysis systems well known in the art, was used. The open reading frame of the cDNA sequence is standard (Ausubel, 1997
, Unit 7.7), supra. Some of the cDNA sequences were selected and extended by the method described in 5 of this example.
【0207】
cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当
分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。
表5は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文
献、閾値パラメーターの概要を示す。表5の列1は用いたツール及びプログラム
、アルゴリズム、列2はそれらの簡単な説明、列3は引用することで本明細書の
一部とした引用文献、列4の記載部分は2つの配列の一致度の評価に用いたスコ
ア及び確率値、他のパラメータを示す(確率値が高ければ高いほど配列間の相同
性が高くなる)。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)
を用いた。The construction and analysis of the polynucleotide sequences obtained from the sequencing of the cDNA was carried out in combination with software utilizing algorithms well known to those skilled in the art.
Table 5 outlines the tools, software, algorithms utilized, their description, references, and threshold parameters used. Column 1 of Table 5 is the tools and programs used, algorithms, column 2 is a brief description thereof, column 3 is a reference cited as part of this specification by reference, column 4 is a sequence of two sequences. The score, probability value, and other parameters used in the evaluation of the degree of coincidence are shown (the higher the probability value, the higher the homology between sequences). MACDNASIS PRO software (Hitachi Softwa
re Engineering, S. San Francisco CA) and LASER GENE software (DNASTAR)
Was used.
【0208】
ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリA配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配
列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基
づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を
構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディン
グフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して
対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwi
ssProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、また
はPFAMなどのHidden Markov Model (HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデー
タベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確率
を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する(例えば、Eddy
, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照)。Confirmation of polynucleotide sequences is accomplished by using BLAST and dynamic programming, programs and algorithms based on dinucleotide nearest neighbor analysis to remove vectors and linkers, poly A sequences and mask ambiguous base pairs. I went there. next,
Using databases based on BLAST, FASTA and BLIMPS, public databases such as GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotic databases and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and PFAM databases. Annotations were obtained by querying these sequences against sequences selected from. These sequences were constructed into full-length polynucleotide sequences using programs based on Phred and Phrap, Consed and screened for open reading frames with programs based on BLAST and FASTA, BLIMPS. The full-length polynucleotide sequence is translated to derive the corresponding full-length amino acid sequence, and the GenBank database (above) and Swi
These full-length sequences were analyzed by querying databases such as ssProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, or Hidden Markov Model (HMM) based protein family databases such as PFAM. HMMs use probabilities to analyze the consensus primary structure of gene families (eg, Eddy
, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365).
【0209】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:17−32からのポリヌクレオチド配列の断片の同定に
も使用できる。約20から4000までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼ
ーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。The programs described above for the construction and analysis of full length polynucleotide and amino acid sequences can also be used to identify fragments of the polynucleotide sequence from SEQ ID NO: 17-32. Fragments of about 20 to 4000 nucleotides are useful for hybridization and amplification and have been described in the invention above.
【0210】
4 ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識され
たヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出,
7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。 4 Northern Analysis Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcripts of a gene, labeled nucleotides on the membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. With sequence hybridization (see, for example, Sambrook, supra,
Chapter 7; and Ausubel. FM et al., Supra, Chapters 4 and 16).
【0211】
BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ(Inc
yte Pharmaceuticals)のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連
する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に
速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、
厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができ
る。検索の基準は、
(%配列同一性×%最大BLASTスコア)/100
として定義される積スコアである。積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2
%誤差の範囲内で正確であり、70ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、15〜40の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。Using similar computer technology for BLAST, GenBank or LIFESEQ (Inc
Search for identical or related molecules in nucleotide databases such as yte Pharmaceuticals). This assay is much faster than many membrane-based hybridizations. You can also change the sensitivity of the computer search so that any particular match
It can be established whether it is classified as an exact match or a homologous match. The search criterion is the product score defined as (% sequence identity x% maximum BLAST score) / 100. The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length of the sequence match. For example, if the product score is 40, the match is 1 to 2
Exact within% error, at 70 the match would be exact. Similar molecules are usually identified by selecting those molecules that show a product score in the range of 15-40, although lower scores may identify related molecules.
【0212】
ノーザン分析の結果は、HYDRLをコードする転写物が発生したライブラリの分
布割合として報告される。分析には、器官/組織及び疾患によるcDNAライブラリ
の分類も含まれる。器官/組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌
、胃腸、造血/免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリ
ーには、癌、炎症/外傷、細胞増殖、神経、貯留(pooled)が含まれる。カテゴリ
ー別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のラ
イブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合(パーセント)と各疾患
で発現する割合を表3に示した。Results of Northern analysis are reported as the percent distribution of the library in which transcripts encoding HYDRL occurred. The analysis also includes classification of the cDNA library by organ / tissue and disease. Organ / tissue categories include cardiovascular, skin, development, endocrine, gastrointestinal, hematopoietic / immune, musculoskeletal, neural, reproductive, urological. Disease categories include cancer, inflammation / trauma, cell proliferation, nerves, pooled. By category, the number of libraries expressing the sequence of interest was counted and divided by the number of libraries in the entire range. Table 3 shows the ratio (percentage) of specific expression in each tissue and the ratio of expression in each disease.
【0213】
5 HYDRLをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:18−32を構築するために用いたcDNA配列を、BLASTまたはSmith-Wat
ermanアルゴリズムを使用して、インサイト社LIFESEQデータベース及び公共のデ
ータベースの配列と比較する。SEQ ID NO:18−32と一致するこれらのデータベー
スの配列を、Phrap(表5)などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複
したクラスター配列に組み入れた。Stanford Human Genonse Center (SHGC)、Wh
itehead Institute for Genome Research (WIGR)及びGe'ne'thonなどの公共の放
射線ハイブリッド(radiation hybrid)及び遺伝子マッピングのデータを用いて
、クラスター化した配列がすでにマッピングされているかを調べる。クラスター
にマッピングされた配列が含まれている場合は、そのクラスターの全ての配列(
特定のSEQ ID NOを含む)をそのマップ位置に割り当てた。 Chromosomal Mapping of the Polynucleotide Encoding 5 HYDRL The cDNA sequence used to construct SEQ ID NO: 18-32 was prepared using BLAST or Smith-Wat.
The erman algorithm is used to compare sequences with the Insight LIFESEQ database and public databases. Sequences from these databases that match SEQ ID NO: 18-32 were incorporated into contiguous and overlapping cluster sequences using construction algorithms such as Phrap (Table 5). Stanford Human Genonse Center (SHGC), Wh
Public radiation hybrid and gene mapping data such as theitehead Institute for Genome Research (WIGR) and Ge'ne'thon will be used to determine if the clustered sequences have already been mapped. If the cluster contains mapped sequences, all sequences in that cluster (
A specific SEQ ID NO) was assigned to that map position.
【0214】
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25、及びSEQ ID NO:28の遺伝子マップの位置は、ヒ
ト染色体の区間即ち範囲として本明細書に記載した。SEQ ID NO:18及びSEQ ID N
O:25については、2つ以上のマップ位置が記載してあるが、それはSEQ ID NO:18
及びSEQ ID NO:25に類似しているが完全には同一でない先にマッピングされた配
列が、それぞれのクラスターに含まれていることを意味する。センチモルガンで
示したマップ位置の範囲は、染色体のp腕(p-arm)の端部から測定した(セン
チモルガン(cM)は、同一染色体上の遺伝子間の乗換え率に基づいた距離を表す
単位である。平均すると、1cMはヒトの染色体の1メガベースに概ね等しいいが
、組換え率の激しい部分とそうでない部分があるため、大きく変化し得る)。cM
の距離は、それぞれのクラスターに配列が含まれている放射線ハイブリッドマー
カーの境界を示すGe'ne'thonによってマッピングされた遺伝子マーカーに基づい
ている。示した範囲内に位置する公共及びインサイト社の配列に関連する疾患が
ある場合は、発明の部分に記載した。The positions of the gene maps of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 28 have been described herein as sections or ranges of the human chromosome. SEQ ID NO: 18 and SEQ ID N
For O: 25, more than one map position is listed, which is SEQ ID NO: 18.
And that the previously mapped sequence similar to SEQ ID NO: 25 but not completely identical is included in each cluster. The range of map positions indicated in centimorgan was measured from the end of the p-arm of the chromosome (centimorgan (cM) is a unit that represents the distance based on the transfer rate between genes on the same chromosome). On average, 1 cM is approximately equal to 1 megabase of human chromosomes, but can vary significantly due to the high recombination rate and the low recombination rate). cm
The distances are based on the genetic markers mapped by Ge'ne'thon which delineate the boundaries of the radiation hybrid markers containing sequences in each cluster. Where there are diseases associated with the public and insight sequences located within the indicated range, they are listed in the invention section.
【0215】
6 HYDRLをコードするポリヌクレオチドの延長
SEQ ID NO:17−32の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計し
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長し
て作製した。一方のプライマーは既知の断片の5'の延長を開始するために合成
し、他方のプライマーは既知の断片の3'の延長を開始するために合成した。開
始プライマーは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)或いは他
の適切なプログラムを用いて、約22個から約30個のヌクレオチドの長さで約
50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜72℃の温度で標的配列にアニール
するように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じな
いようにヌクレオチドを延長した。 6 Extending the Polynucleotide Encoding HYDRL The full-length nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 17-32 is prepared using oligonucleotide primers designed from suitable fragments of the full-length molecule. The fragment was extended and produced. One primer was synthesized to initiate the 5'extension of the known fragment and the other primer was synthesized to initiate the 3'extension of the known fragment. The starting primer has a GC content of about 50% or more and a length of about 22 to about 30 nucleotides and a pH of about 68 using OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or other suitable program. It was designed to anneal to the target sequence at a temperature of ~ 72 ° C. The nucleotides were extended so that hairpin structures and primer-primer dimers did not occur.
【0216】
選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を延長した。2段階以上の延
長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組
を設計する。This sequence was extended with selected human cDNA libraries. If more than one extension is required or desired, additional or nested primer sets are designed.
【0217】
当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC-200
thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った
。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg2+と(NH4)2SO4とβ
−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pha
rmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(St
ratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーター
で増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管
別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行っ
た。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 57℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。Amplification was performed with high fidelity by the PCR method using a method known in the art. PCR is PTC-200
It was performed in a 96-well block plate using a thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture consisted of template DNA, 200 nmol of each primer, Mg 2+ and (NH 4 ) 2 SO 4 and β.
− Buffer containing mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pha
rmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), Pfu DNA polymerase (St
ratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters. Step 1 94 ° C. for 3 minutes Step 2 94 ° C. for 15 seconds Step 3 60 ° C. for 1 minute Step 4 68 ° C. for 2 minutes Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6 68 ° C. for 5 minutes Step 7 Storage at 4 ° C Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters. Step 1 94 ° C. for 3 minutes Step 2 94 ° C. for 15 seconds Step 3 57 ° C. for 1 minute Step 4 68 ° C. for 2 minutes Step 5 Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6 68 ° C. for 5 minutes Step 7 Store at 4 ° C.
【0218】
各ウェルのDNA濃度は、1X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した
100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分
配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan
II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計
測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを1%のア
ガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長す
ることに成功したかを決定する。The DNA concentration in each well was dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product.
100 μl PICOGREEN quantification reagent (0.25% (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugen
e OR) is distributed to each well of an opaque fluorometer plate (Coming Costar, Acton MA) to allow the DNA to bind to the reagent and be measured. Fluoroskan this plate
Scan with II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) and measure the fluorescence of the sample to quantify the concentration of DNA. A 5-10 μl aliquot of the reaction mixture is analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reaction succeeded in extending the sequence.
【0219】
延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、Cvi
JIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音
波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化し
たヌクレオチドを低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上に分離して断
片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England B
iolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pha
rmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延
び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を
選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカ
ルベニシリン培養液の384ウェルプレートに37℃で一晩培養した。The extended nucleotides are desalted and concentrated before being transferred to a 384 well plate and Cvi
JI Cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison W
Digested with I) and sonicated or sheared before religation to pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech). For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel to cut the fragments and the agar was digested with Agar ACE (Promega). T4 Ligase (New England B
clones extended with iolabs, Beverly MA) were cloned into pUC 18 vector (Amersham Pha
rmacia Biotech) and treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene) for restriction site extension to transfect competent E. coli cells. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing antibiotics, each colony was cut off, and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture solution at 37 ° C. overnight.
【0220】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 72℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す
ステップ6 72℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収
率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20%のジメチル
サルホサイド(dimethysulphoxide)(1−15, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTキ
ット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle
sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシングし
た。The cells were lysed and Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu
DNA was PCR amplified using DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure. Step 1 94 ° C. for 3 minutes Step 2 94 ° C. for 15 seconds Step 3 60 ° C. for 1 minute Step 4 72 ° C. for 2 minutes Step 5 Repeat Steps 2, 3 and 4 29 times Step 6 72 ° C. for 5 minutes Step 7 Store at 4 ° C. DNA was quantified with PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with poor DNA recovery were amplified again under the above conditions. Dilute the sample with 20% dimethysulphoxide (1-15, v / v) and use the DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle.
Sequencing was performed using the sequencing ready reaction kit (Perkin-Elmer).
【0221】
同様に上述の手順で、SEQ ID NO:17−32のヌクレオチド配列を利用し、この延
長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて5′
調節配列を得た。Similarly, following the procedure described above, utilizing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17-32 and using the oligonucleotide designed for this extension and a suitable gene library, 5 '
The regulatory sequence was obtained.
【0222】
7 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ ID NO:17−32から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなる
オリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの
場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフト
ウェア(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用いてデザイ
ンし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐32P]アデノシン三リン酸(A
mersham, Chicago, IL)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN、Bost
on MA)とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレ
オチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビードカラム(Amersham Phar
macia Biotech)を用いて実質的に精製する。毎分107カウントの標識された
プローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco R
I、Pst I、Xba1或いはPvu II(DuPont NEN)の1つを用いて切断したヒトゲノム
DNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。 7 Labeling and Use of Individual Hybridization Probes Hybridization probes derived from SEQ ID NO: 17-32 are used to screen cDNA, mRNA, or genomic DNA. Special mention is made of labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs, but essentially the same procedure is used for larger cDNA fragments. Oligonucleotides were designed using state-of-the-art software, such as OLIGO 4.06 software (National Bioscience), with 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ- 32 P] adenosine triphosphate (A
mersham, Chicago, IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Bost)
on MA) and used in combination for labeling. The labeled oligonucleotide was loaded onto a SEPHADEX G-25 ultrafine exclusion dextran bead column (Amersham Phar
Substantially purified using macia Biotech). An aliquot containing the labeled probe at 10 7 counts per minute was added to the following endonucleases: Ase I, Bgl II, Eco R.
Human genome cleaved with one of I, Pst I, Xba1 or Pvu II (DuPont NEN)
Used in typical membrane-based hybridization analysis of DNA.
【0223】
各切断物からのDNAを、0.7%アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブ
ラン(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリ
ダイゼーションは40℃で16時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くた
め、例えば、最大0.1xクエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸
ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して
比較する。DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blots are sequentially washed at room temperature, eg, under conditions of max 0.1 × sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. The hybridization patterns are visualized and compared by autoradiography or another imaging means.
【0224】
8 マイクロアレイ
化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である(例えば、上記Baldeschweilerを参照)。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、UV、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量/発現レベルを調べること
が可能である。 8 It is possible to synthesize array elements on the surface of a substrate using a microarray chemical bonding method and an inkjet device (see eg Baldeschweiler, supra). Using an array similar to dot blotting or slot blotting, heat, UV,
It is placed and bonded to the surface of the substrate using mechanical or chemical bonding methods. A typical array can be made manually or using available methods and machines and can include any suitable number of elements. After hybridization, unhybridized probe is removed and a scanner is used to determine the level and pattern of fluorescence. Scanned images can be analyzed to determine the degree of complementarity and the relative amount / expression level of each probe that hybridizes to the element on the microarray.
【0225】
完全長のcDNA、発現遺伝子配列断片(EST)、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERG
ENEソフトウェア(DNASTAR)などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択す
ることが可能である。本発明の核酸配列の1つに対応する完全長のcDNA、EST、
或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから任意に選択さ
れたcDNAを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。cDNAは、例えばUV
交差結合(UV cross-linking)を利用してスライドに固定してから、熱処理及び
化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他. (1995) Science
270:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照)。蛍
光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼーションするために用い
る。上記した方法でこの基質を分析する。Full-length cDNAs, expressed gene sequence fragments (ESTs), or fragments thereof, may form part of the microarray. A fragment suitable for hybridization is LASERG
Selection can be made using software known in the art such as ENE software (DNASTAR). A full-length cDNA corresponding to one of the nucleic acid sequences of the invention, EST,
Alternatively, those fragments, or cDNA arbitrarily selected from the cDNA library related to the present invention, are aligned on a suitable substrate such as a glass slide. cDNA is, for example, UV
It is immobilized on slides using UV cross-linking, then heat and chemical treated and finally dried (eg Schena, M. et al. (1995) Science.
270: 467-470; and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645). A fluorescent probe is prepared and used to hybridize to the element on the substrate. This substrate is analyzed as described above.
【0226】
9 相補的ポリヌクレオチド
HYDRLをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然
発生のHYDRLの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約15〜約30個の
塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより
大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.0
6ソフトウェア(National Biosciences)及びHYDRLのコーディング配列を用いて
、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な
5′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーター
がコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的
なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがHYDRLをコードする転写物に結
合するのを阻害する。 9 A sequence complementary to the sequence encoding the complementary polynucleotide HYDRL, or any portion thereof, is used to reduce or inhibit the expression of naturally occurring HYDRL. Although the use of oligonucleotides containing from about 15 to about 30 base pairs is described, essentially the same method can be used with smaller or larger sequence fragments. Oligo4.0
6 Use software (National Biosciences) and HYDRL coding sequences to design appropriate oligonucleotides. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5'sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent the ribosome from binding to the HYDRL-encoding transcript.
【0227】
10 HYDRLの発現
HYDRLの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行う
ことができる。細菌でHYDRLが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニ
ングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節要素に関連するT
5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロ
モーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、
BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、
イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとHYDRLを発現す
る。真核細胞でのHYDRLの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバ
キュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイル
ス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を
、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移の
どちらかによって、HYDRLをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維
持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例え
ば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; S
andig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。 10 Expression of HYDRL Expression and purification of HYDRL can be performed using a bacterial or virus-based expression system. For HYDRL expression in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an antibiotic resistance and an inducible promoter that enhances the transcription level of the cDNA. Such promoters include a T associated with the lac operator regulatory element.
5 or T7 bacteriophage promoters and trp-lac (tac) hybrid promoters, but are not limited thereto. Recombinant vector,
Transform into a suitable bacterial host such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance
It expresses HYDRL when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of HYDRL in eukaryotic cells is accomplished by infecting insect or mammalian cell lines with the Autographica californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), commonly known as baculovirus. The nonessential polyhedrin gene of baculovirus is replaced with the cDNA encoding HYDRL by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer involving transfer plasmid mediated. Viral infectivity is maintained and the strong polyhedrin promoter results in high levels of cDNA transcription. Recombinant baculovirus is often used to infect Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells, but can also be used to infect human hepatocytes. In the case of the latter infection, further genetic modification of the baculovirus is required. (For example, Engelhard.EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227; S
andig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).
【0228】
殆どの発現系では、HYDRLが、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く1回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの26キ
ロダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で
固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharma
cia Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でHYDRLからタンパク分解的
に切断できる。アミノ酸8個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクロナール及
びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能
となる。6個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって、金属キレー
ト樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausu
bel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したHYDRL
を直接用いて以下のアッセイを行うことができる。In most expression systems, HYDRL is used, for example glutathione S transferase (GST).
, Or a fusion protein synthesized with a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, the affinity-based purification of the recombinant fusion protein from crude cell lysate can be performed rapidly in one step. The 26-kilodalton enzyme GST from Schistosoma japonicum enables purification of fusion proteins with immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharma
cia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from HYDRL at specific manipulation sites. FLAG, a peptide of 8 amino acids, allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His in which 6 histidine residues are continuously extended enables purification with a metal chelate resin (QIAGEN). The method of protein expression and purification is described by Ausu
bel (1995, supra, ch 10, 16). HYDRL purified by these methods
Can be used directly to perform the following assays.
【0229】
11 HYDRL活性の実証
例示目的で、HYDRL分子のβグルコシダーゼ活性及びリゾチーム活性を測定す
るアッセイを記載する。βグルコシダーゼ活性のアッセイでは、様々な量のHYDR
Lを50 mM 酢酸ナトリウムバッファ(pH5.0)における1 mM 4-ニトロフェニルβ-
D-glycopyranoside(基質)で、37℃で様々な時間(通常は1〜5分間)イン
キュベートする。反応は、100℃で2分間加熱して終了する。410 nmにおける
吸収度を分光光度計で測定する。この値が、サンプルのHYDRLのβグルコシダー
ゼ活性に比例する(Hrmova, M 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:11134-11143を参
照)。 11 Demonstration of HYDRL Activity For purposes of illustration, an assay for measuring β-glucosidase and lysozyme activity of the HYDRL molecule is described. Assays for β-glucosidase activity showed varying amounts of HYDR
L to 1 mM 4-nitrophenyl β-in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)
Incubate with D-glycopyranoside (substrate) at 37 ° C for various times (typically 1-5 minutes). The reaction is terminated by heating at 100 ° C for 2 minutes. The absorbance at 410 nm is measured with a spectrophotometer. This value is proportional to the β-glucosidase activity of HYDRL in the sample (see Hrmova, M et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 11134-11143).
【0230】
HYDRLのリゾチーム活性は、Micrococcus lysodeikticus細菌細胞を溶解する能
力によって実証できる(例えば、Enzymatic Assay of Lysozyme 1, Sigma Aldri
ch, St. Louis MOを参照)。25℃の66 mM リン酸カリウムバッファ(pH6.24)
(バッファA)で、凍結乾燥したMicrococcus lysodeikticus細胞(ATCC 4698)
を0.015%懸濁液に調製する。細胞懸濁液の2.5 mlのアリコットをピペットでキ
ュベット(optical cuvette)の中に入れ、25℃にする。450 nmにおける吸収
度が、0.6〜0.7の間で一定するまで、サーモスタット分光光度計で監視する。反
応が起こらないように2.5 mlのバッファAを含む第2のキュベットで調製する。H
YDRLを冷却したバッファAに溶解する。HYDRL溶液の0.1 mlのアリコットを試験用
キュベットに加え、0.1 mlのバッファAを空のキュベットに加える。キュベット
を逆さにして素早く混合し、450 nmにおける吸収度の低下を約5分間記録する。
細菌が溶解すると、濁度が低下し、450 nmにおける吸収度も低下する。試験用キ
ュベットの450 nmにおける吸収度の低下率が、もとのサンプルにおけるHYDRLの
リゾチーム活性に比例する。The lysozyme activity of HYDRL can be demonstrated by its ability to lyse Micrococcus lysodeikticus bacterial cells (eg, Enzymatic Assay of Lysozyme 1 , Sigma Aldri.
ch, St. Louis MO). 66 mM potassium phosphate buffer (pH6.24) at 25 ℃
Lyophilized Micrococcus lysodeikticus cells (ATCC 4698 ) in (buffer A)
To 0.015% suspension. Pipet a 2.5 ml aliquot of the cell suspension into an optical cuvette and bring to 25 ° C. Monitor with a thermostat spectrophotometer until the absorbance at 450 nm is constant between 0.6 and 0.7. Prepare in a second cuvette containing 2.5 ml Buffer A to prevent reaction. H
Dissolve YDRL in chilled buffer A. Add a 0.1 ml aliquot of the HYDRL solution to the test cuvette and 0.1 ml Buffer A to the empty cuvette. The cuvette is inverted and mixed quickly, and the decrease in absorbance at 450 nm is recorded for about 5 minutes.
When bacteria lyse, the turbidity decreases and the absorbance at 450 nm also decreases. The rate of decrease in absorbance of the test cuvette at 450 nm is proportional to the HYDRL lysozyme activity in the original sample.
【0231】
12 機能的アッセイ
機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのHYDRL
をコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現す
る強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。この
ようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (Invitr
ogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを
含んでいる。5〜10μgの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来のヒ
ト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。更
に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形
質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入され
ていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組
換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、
緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質
が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)
を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細
胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或い
は同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これ
らの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA内
容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測される
DNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及
び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンVタンパク質の細
胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞
計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, N
Y.に記載されている。 12 Functional assay function is HYDRL at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems.
Is evaluated by the expression of the sequence encoding The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Such vectors include pCMV SPORT ™ (Life Technologies.) And pCR 3.1 (Invitr
ogen, Carlsbad, CA), both containing the cytomegalovirus promoter. For example, 5 to 10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line derived from endothelium or hematopoiesis by liposome preparation or electroporation. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein allows to distinguish between transfected and non-transfected cells. Moreover, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. Such labeled proteins include
Includes green fluorescent protein (GFP; Clontech), and CD64 or CD64-GFP fusion protein. Automated flow cytometry (FCM) using technology based on laser optics
Are used to identify transfected cells expressing GFP or CD64-GFP and to assess their apoptotic status and other cellular characteristics. In addition, FCM detects and weighs uptake of fluorescent molecules that diagnoses the phenomenon of preceding or simultaneous cell death. These phenomena are measured by changes in nuclear DNA content as measured by DNA staining with propidium iodide and by a decrease in bromodeoxyuridine uptake.
Down-regulation of DNA synthesis, changes in cell surface and intracellular protein expression measured by reactivity with specific antibodies, and cytoplasm measured by binding of fluorescent complex annexin V protein to cell surface And changes in film composition. Flow cytometry by Ormerod, MG (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, N
It is described in Y.
【0232】
遺伝子発現におけるHYDRLの影響は、HYDRLをコードする配列とCD64またはCD64
-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価するこ
とができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫
グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換
されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビ
ードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分
野で公知の方法で細胞から精製することができる。HYDRL及び目的の他の遺伝子
をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析すること
ができる。[0232] The effect of HYDRL on gene expression depends on the sequence encoding HYDRL and CD64 or CD64.
-A highly purified cell population transfected with either GFP can be evaluated. CD64 or CD64-GFP is expressed on the surface of transformed cells and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or antibodies against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods known in the art. Expression of mRNA encoding HYDRL and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
【0233】
13 HYDRLに特異的な抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE;例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製
されたHYDRLを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出
す。 13 Production of Antibodies Specific for HYDRL Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; eg, Harrington, MG (1990)
Methods Enzymol. 1816-3088-495) or substantially purified by other purification techniques, and HYDRL is used to immunize rabbits using standard protocols to generate antibodies.
【0234】
別法では、HYDRLアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて
解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれ
を用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。C末端付近の、或いは隣接す
る親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野
で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。Alternatively, the HYDRL amino acid sequence can be analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine highly immunogenic regions and the corresponding oligopeptides synthesized and used to determine which methods are well known to those of skill in the art. To produce antibodies. Selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or within adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, supra, Chapter 11).
【0235】
通常、約15残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザABI 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin-Elmer)を用いてfmoc法
のケミストリにより合成し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル(MBS)を用いた反応によりKLH(Sigma-Aldrich, St. Louis M
O)に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フ
ロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−KLH複合体を用いてウ
サギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗HYDRL活性を検査す
るには、ペプチドまたはHYDRLを基板に結合し、1%BSAを用いてブロックし、ウ
サギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIg
Gと反応させる。Generally, oligopeptides of about 15 residues in length were synthesized by fmoc chemistry using an Applied Biosystems peptide synthesizer ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin-Elmer), and N-maleimidobenzoyl-N-hydroxy was synthesized. KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis M by reaction with succinimide ester (MBS)
O) to enhance immunogenicity (see, eg, Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in Freund's complete adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-HYDRL activity of the obtained antiserum, the peptide or HYDRL was bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum and washed, and then radioactive iodine was added. Labeled goat anti-rabbit Ig
React with G.
【0236】
14 特異的抗体を用いる自然発生HYDRLの精製
自然発生HYDRL或いは組換えHYDRLを、HYDRLに特異的な抗体を用いるイムノア
フィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティー
カラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biotech)のような活性
化クロマトグラフィー用レジンと抗HYDRL抗体とを共有結合させることにより構
築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄
する。 14 Purification of Spontaneous HYDRL Using Specific Antibodies Spontaneous HYDRL or recombinant HYDRL is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for HYDRL. The immunoaffinity column is constructed by covalently linking an anti-HYDRL antibody with a resin for activation chromatography such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
【0237】
HYDRLを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、HYDRLを優先的に吸
着できる条件で(例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファ
ーで)そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とHYDRLとの結合を切るよう
な条件で(例えば、pH2〜3のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシ
アン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで)溶出させ、HYDRLを回収する
。A culture solution containing HYDRL is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions capable of preferentially adsorbing HYDRL (for example, with a high ionic strength buffer in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that break the binding between the antibody and HYDRL (for example, a buffer of pH 2-3 or a high concentration of chaotropic ion such as urea or thiocyanate ion), and HYDRL is recovered.
【0238】
15 HYDRLと相互作用する分子の同定
HYDRL又は生物学的に活性なその断片を、125Iボルトンハンター試薬(例
えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照)で標
識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したHY
DRLと共にインキュベートし、洗浄して、標識したHYDRL複合体を有する全てのウ
ェルをアッセイする。様々なHYDRL濃度で得られたデータを用いて、候補の分子
とHYDRLとの関連、親和性、数について数値を計算する。 15 Identification of Molecules that Interact with HYDRL HYDRL, or a biologically active fragment thereof, was labeled with 125 I Bolton-Hunter reagent (see, eg, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529). Label with. Candidate molecules pre-arranged in multiwell plates were labeled with HY
Incubate with DRL, wash and assay all wells with labeled HYDRL complex. The data obtained at various HYDRL concentrations are used to calculate numerical values for the association, affinity, and number of candidate molecules with HYDRL.
【0239】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変
は、特許請求の範囲に含まれる。Those skilled in the art will be able to make various modifications of the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. Although the present invention has been described with reference to particular preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such particular embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are within the scope of the following claims.
【0240】
(表の簡単な説明)
表1は、HYDRLをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプ
チド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローン識別番号、cDN
Aライブラリ、及びcDNA断片を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE TABLES Table 1 lists the polypeptide and nucleotide sequences used to generate the full length sequence encoding HYDRL (SEQ ID NO), clone identification number, cDN
A library and a cDNA fragment are shown.
【0241】
表2は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、並びに
HYDRLの解析に用いた方法、アルゴリズム、及び検索可能なデータベースを示す
。Table 2 lists the characteristics of each polypeptide sequence, including latent motifs and homologous sequences, and
The method, algorithm and searchable database used for HYDRL analysis are shown.
【0242】
表3は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症及
び症状と、各DNAがクローニングされたベクターとを示す。Table 3 shows selected fragments of each nucleic acid sequence, tissue-specific expression patterns of each nucleic acid sequence determined by Northern analysis, diseases, disorders and conditions associated with these tissues, and each DNA. Shows the cloned vector.
【0243】
表4は、HYDRLをコードするcDNAクローンを単離したcDNAライブラリの作製に
用いた組織を示す。Table 4 shows the tissues used to create the cDNA library in which the cDNA clone encoding HYDRL was isolated.
【0244】
表5は、HYDRLの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並び
にその説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。Table 5 shows the tools, programs, and algorithms used in the analysis of HYDRL, along with a description, references, and threshold parameters.
【表1】 [Table 1]
【表2】 [Table 2]
【表3】 [Table 3]
【表4】 [Table 4]
【表5】 [Table 5]
【表6】 [Table 6]
【表7】 [Table 7]
【表8】 [Table 8]
【表9】 [Table 9]
【表10】 [Table 10]
【表11】 [Table 11]
【表12】 [Table 12]
【表13】 [Table 13]
【図1】
LASERGENEソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラム(DNASTE
R, Madison WI)を用いて作成した、HYDRL-1 (インサイト社クローン番号 229376
4; SEQ ID NO: 1)と、Colobus guerezaリゾチームc 前駆体 (GI 1790927; SEQ I
D NO:33)と、Colobus angolensisリゾチームc 前駆体 (GI 1790967; SEQ ID NO:
34)と、Nasalis larvatisリゾチームc 前駆体(GI 1790984; SEQ IDNO:35)との間
のアミノ酸配列アラインメントを示す。Figure 1: LASERGENE software multi-sequence alignment program (DNASTE
R, Madison WI), HYDRL-1 (Incyte clone number 229376)
4; SEQ ID NO: 1) and Colobus guereza lysozyme c precursor (GI 1790927; SEQ I
D NO: 33) and Colobus angolensis lysozyme c precursor (GI 1790967; SEQ ID NO:
34) and an amino acid sequence alignment between Nasalis larvatis lysozyme c precursor (GI 1790984; SEQ ID NO: 35).
【配列表】 [Sequence list]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 25/28 A61P 35/00 4C084 29/00 37/02 4H045 35/00 43/00 111 37/02 C07K 16/40 43/00 111 C12N 1/15 C07K 16/40 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 9/14 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z 9/14 33/50 Z C12Q 1/68 33/53 M G01N 33/15 33/566 33/50 33/573 A 33/53 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A 33/573 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BA, BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,C Z,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,GE ,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS, JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,L R,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN ,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU, SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,T R,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・#12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・#30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95136・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 ヤング、ジュンミング アメリカ合衆国カリフォルニア州95129・ サンノゼ・クラレンドンストリート 7136 Fターム(参考) 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA02 DA05 EA03 EA04 GA11 HA01 HA14 HA15 4B050 CC01 CC03 DD11 FF16E LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ30 QQ44 QR32 QR40 QR56 QR84 QS34 QS39 QX07 4B065 AA01X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA22 CA18 NA14 ZA02 ZA20 ZA81 ZB02 ZB11 ZB26 ZC20 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA89 EA20 EA21 EA22 EA28 EA50 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61P 25/28 A61P 35/00 4C084 29/00 37/02 4H045 35/00 43/00 111 37/02 C07K 16/40 43/00 111 C12N 1/15 C07K 16/40 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 9/14 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z 9/14 33/50 Z C12Q 1/68 33/53 MG01N 33/15 33/566 33/50 33/573 A 33/53 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A 33/573 A61K 37/02 (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ) , TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, C Z, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE , GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU , ZW (72) Inventor Hillman, Jennifer El, USA 94040. Mountain View # 12 Monrode Live 230 (72) Inventor Yue, Henry 94087, California, USA 94087, Sunnyvale Lewis Avenue 826 (72) Inventor Lal, Pretty, 95054, California, Santa Clara Russ Drive 2382 (72) Inventor Bandman, Olga 94043, California, USA Mountainview Anna Ave 366 (72) Inventor Coley, Neil Sea 94040, California USA Mountain View # 30 Dale Ave 1240 (72) Inventor Gegler, Karl Jay United States California 94025 Menlo Park Oakland Avenue 1048 (72) Inventor Bogun, Mariah Earl United States California 94577 San Leandro Santiago Road 14244 (72) Akira Ryu, Dung Aina Em United States California 95136 San Jose Park Belmont Place 55 (72) Inventor Azimzai, Yalda United States California 94545 Hayward Rock Springs Drive 2045 (72) Inventor Young, Junming United States California State 95129 San Jose Clarendon Street 7136 F-term (reference) 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA02 DA05 EA03 EA04 GA11 HA03 HA03 QAQBQ CC16 CC03 DD1111 QQ44 QR32.
Claims (20)
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID
NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、及びSEQ
ID NO:16、並びにそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む
実質的に精製されたポリペプチド。1. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, and SEQ
A substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 16, and fragments thereof.
列同一性を有する実質的に精製された変異体。2. A substantially purified variant having at least 90% amino acid sequence identity with the amino acid sequence of claim 1.
ポリヌクレオチド。3. An isolated and purified polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1.
クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。4. An isolated and purified polynucleotide variant sequence having at least 90% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide of claim 3.
ドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。5. An isolated and purified polynucleotide which hybridizes with the polynucleotide of claim 3 under stringent conditions.
され精製されたポリヌクレオチド。6. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 3.
イブリダイズさせて、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
と、 (b)前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプル内の前記ポリヌクレオチドの
存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出法。7. A method of detecting a polynucleotide comprising: (a) hybridizing the polynucleotide of claim 6 with at least one nucleic acid in a sample, thereby forming a hybridization complex; b) a step of detecting the hybridization complex, the step of detecting the presence of the hybridization complex correlating with the presence of the polynucleotide in the sample. Law.
の増幅過程をさらに含むことを特徴とする請求項7に記載の検出法。8. The detection method according to claim 7, further comprising a step of amplifying the polynucleotide before the hybridization.
されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。9. An isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17-32 and fragments thereof.
クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。10. An isolated and purified polynucleotide variant sequence having at least 90% polynucleotide sequence identity with the polynucleotide of claim 9.
離され精製されたポリヌクレオチド。11. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 9.
含む発現ベクター。12. An expression vector comprising at least one fragment of the polynucleotide of claim 3.
培養する過程と、 (b)前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
を特徴とする製造方法。14. A method for producing a polypeptide, comprising: (a) culturing the host cell according to claim 13 under conditions suitable for expression of the polypeptide; and (b) a medium for the host cell. And a step of recovering the polypeptide from the same.
医薬品組成物。15. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 1 together with a suitable medical carrier.
抗体。16. A purified antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1.
関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項15の医薬品組成物を効
果的な量投与する過程を含む、HYDRLの発現または活性の低下に関連する疾患を
治療または予防する方法。19. A method of administering HYDRL, which comprises the step of administering an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 15 to a patient in need of treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of human hydrolase protein. A method of treating or preventing a disease associated with decreased activity.
たは予防が必要な患者に、請求項18のアンタゴニストを効果的な量投与する過
程を含む、HYDRLの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する
方法。20. In order to increase the expression or activity of HYDRL, which comprises the step of administering an effective amount of the antagonist of claim 18 to a patient in need of treatment or prevention of a disease associated with the increase in expression or activity of HYDRL. A method of treating or preventing a related disorder.
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