JP2003527574A - 液体中の第１のバイオポリマの検出・定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、液体中の第１のバイオポリマ（１）を検出・定量する方法に関する。検出対象である第１のバイオポリマ（１）に対して特定の親和力を有する第２のバイオポリマ（２）が、第１の電極（Ｅ１）の表面に付着する。第１および少なくとも１つの第２の電極を液体に浸す。本発明の方法によれば、ａ）第１の電極（Ｅ１）と第２の電極（Ｅ２）とに、変更可能な電圧および／または電流を印加するステップと、ｂ）電圧および／または電流の直接的な変化を測定するステップとを備え、この変化が、第１の生体分子（１）と第２の生体分子（２）の積算結果となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、液体中の第１のバイオポリマの検出・定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

ＤＮＡなどのようなポリヌクレオチド配列は、ボルタンメトリ法により検出可
能であることが従来技術で知られている。その検出を行う際、レドックス活性分
子を溶液に付加することが米国特許第５，３１２，５７２号で提案されている。
これら分子は、ハイブリダイゼーションが行われると、ポリヌクレオチド配列か
ら成る２本鎖分子と結合する。レドックス活性分子は、可測なレドックス信号を
発生させる。これに類似の方法が、米国特許第５，８７１，９１８号でも提案さ
れている。

【０００３】 国際公開番号ＷＯ９６／０１８３６では、ポリヌクレオチド配列を検出するた
めのチップが開示されている。このチップ上には、小型リアクションキャビティ
が多数配置されている。各リアクションキャビティ内部には、それぞれ特定のポ
リヌクレオチド配列が付着している。このチップを検出対象のポリヌクレオチド
配列を含む溶液に浸すと、ある特定のポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼー
ションが行われる。ハイブリダイゼーションは蛍光により検出される。

【０００４】 国際公開番号ＷＯ９５／１２８０８も同様に、チップを用いた検出方法に関す
る。この方法では、電極のようにチップ全体に電圧が印加される。その結果、溶
液中の電荷ポリヌクレオチド配列の濃度が、チップの表面または内部の小型リア
クションベセル（Ｖｅｓｓｅｌｓ）内で増加する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】

従来の技術は複雑であり、さらに特定のレドックス活性分子の付加、あるいは
製造工程が複雑なチップを必要とする。検出対象のバイオポリマを正確に定量す
るには、従来の技術では不可能である。光学検知を必要とする場合が多く、その
場合、装置が複雑化する。

【０００６】 本発明の目的は、従来技術の不都合を克服することにある。特に、液体中のバ
イオポリマの検出・定量方法であって、可能な限り簡易で安価な方法を提供する
ことを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段および発明の効果】

本目的は、請求項１の特徴により達成される。本発明の好適な成果は、請求項
２から１４の特徴により明らかである。

【０００８】 本発明によれば、液体中の第１のバイオポリマを検出・定量する方法であって
、検出対象である第１のバイオポリマに対して特定の親和力を有する第２のバイ
オポリマが第１の電極の表面に付着し、さらに第１および少なくとも１つの第２
の電極が液体と接触しており、 ａ）第１の電極と第２の電極との間にわたって、電圧および／または電流を印
加するステップ、および ｂ）第２の生体分子に第１の生体分子を付加することにより生じる電圧および
／または電流の直接的な変化を測定するステップとを備える、方法。

【０００９】 上記提案方法は、簡便かつ迅速に実行可能である。電圧および／または電流の
変化が直接的に測定される。すなわち、特定のレドックス活性分子を付加する必
要がない。特に、検出対象である液体中の第１のバイオポリマの定量も簡単に行
うことができる。

【００１０】 印加電圧または電流は変更可能である。すなわち交流であってもよい。ステッ
プｂにおいて直接電流信号が測定され、その際、測定が好適にサイクリックボル
タンメトリ測定で行われる。この場合、第２のバイオポリマに付加される第１の
バイオポリマのレドックスプロセス、および所定の電圧または所定の電圧範囲で
の、第１の電極の表面におけるファラデー電子移動が利用される。

【００１１】 第１のバイオポリマを検出および定量するには、好適には、測定電流または測
定電圧を時間に対してプロットし、少なくとも１つのピークにわたって積算する
。この積算は、バックグラウンド除去法により好適に行われる。第１のバイオポ
リマの付加を通じて移動する移動電荷量が、この積算結果値から決定され得る。
この値を、第１のバイオポリマの付加数として結論づけることも可能である。キ
ャリブレーションを行ってもよい。検出対象である液体中の第１のバイオポリマ
の濃度も決定され得る。ここに提案される方法は極めてシンプルであり、従来の
サイクリックボルタンメトリ同様、第１の電極と参照電極との間にのみ傾斜直線
状の電圧が周期的に通過する。電荷移動のためにレドックス活性分子を用いる必
要はない。

【００１２】 電流の流れは第３の電極、または対抗電極を介して測定することができる。測
定電流または測定電圧を時間に対してプロットすると、第１のバイオポリマの付
加または吸着、および脱着に対応して特徴的なピークが観察される。

【００１３】 さらなる実施形態によれば、交流信号の位相敏感測定が行われる。その末端が
第１の電極に付着している第２のバイオポリマに第１のバイオポリマを付加する
と、電荷されたバイオポリマの付加および反発により、二重層のキャパシタンス
に変化が生じる。位相敏感測定を行うことにより、交流信号の容量比が決定され
る。この容量比から、液体中で検出される第１のバイオポリマの濃度が結論づけ
られる。

【００１４】 これに関連して、交流信号の周期的直流信号への重畳が可能になる。本方法の
さらなる実施形態によれば、ボルタンメトリ信号をさまざまな周波数で測定する
ことによりインピーダンスが測定される。これにより、第１の電極の表面がどの
程度第１のバイオポリマによって覆われているか、直接的に定量することが可能
になる。

【００１５】 好適には、ステップａの前に電圧および／または電流を印加して、第１の電極
の表面における第１のバイオポリマの濃度を増加させる。濃度の増加は、極性が
周期的に反転される場合に特に有効である。その結果、第２のバイオポリマに相
補的でない分子が表面から除去される。

【００１６】 さらにデザイン面の特徴によれば、濃度が増加された第１の生体分子が付着す
る第１の電極を液体から取り除き、必要に応じて洗浄ステップを経て、測定のた
めに規定の測定溶液と接触させる。これにより、液体中に存在するであろうさら
なる電気化学活性種による干渉影響が実質的に抑制され得る。測定に先立ち、あ
る程度の精製処理を行ってもよい。

【００１７】 好適には、第２のバイオポリマの一端が、共有結合またはリンカを介して第１
の電極の表面に付着する。もちろん、付着のために間にスペーサ分子を挿入して
もよい。第１の電極は、プラスチック、セラミックス、ガラス、または金属のい
ずれか１つの材料から好適に形成される。特に、ポリカーボネートと金とは電極
材料として好適であることが判っている。

【００１８】 用語で第１のバイオポリマおよび第２のバイオポリマは、特にプロテイン、ペ
プチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を意味する。特に、第１のバイオポリマは、第２のバ
イオポリマに対して相補的な１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。ステップｂでは
、これらバイオポリマのハイブリダイゼーションにより生じる電圧および／また
は電流の変化が好適に測定される。

【００１９】

【発明の実施の形態】

本発明の方法について、以下に図面を参照してさらに詳しく説明する。 図１は、サイクリックボルタンモグラムを示す。 図２は、周波数に対してプロットされた交流の変化を示す。 図３は、測定のための装備を示す。

【００２０】 実施例１：直接電圧ボルタンメトリ測定 ヒト成長ホルモンにコードされるＤＮＡ配列（ＨＧＨ１）は、その５’末端が
、第１の電極Ｅ１、またはポリカーボネート／カーボンファイバから成る作用電
極に付着する。相補的ＤＮＡ配列（ＨＧＨ１に相補的なＨＧＨ）を５ｆＭ／μｌ
、ＴＢＥバッファを８０ｍＭ、およびＮａｃｌ伝導塩を１００ｍＭ含む溶液に第
１の電極Ｅ１を浸す。

【００２１】 電圧を、１０ｍＶ／ｓの変化率で０Ｖから１．３Ｖに直線的に増加させる。そ
の後、−１．３Ｖに戻し、最終的には０Ｖまで上げる。この操作による測定結果
のサイクリックボルタモグラムを図１に示す。２つのピークが見て取れる。陽極
電位領域において、第１のピークＰ１がＡｇ／ＡｇＣｌに対してＵ＝７４９．５
ｍＶで発生し、陰極電位領域において、第２のピークＰ２がＡｇ／ＡｇＣｌに対
してＵ＝−８６４．３ｍＶで発生する。これらピークは、電極の表面に付着した
第１のバイオポリマに対して相補的な第２のバイオポリマが溶液中に存在する場
合にのみ発生する。本実施例において、ピークＰ１およびＰ２は、ＨＧＨ１とＨ
ＧＨ１に相補的なＨＧＨとのハイブリダイゼーションによって引き起こされるレ
ドックスプロセスにのみ起因する。陽極領域における第１のピークＰ１は、ＨＧ
Ｈ１をＨＧＨ１に相補的なＨＧＨに吸着、または付加することにより引き起こさ
れるレドックスプロセスの結果として生じる。陰極領域で観察される第２のピー
クＰ２は、ハイブリッド形成された核酸の脱着に関連する。第１のピークＰ１の
長さは、電極表面上の移動電荷量に対応する。これにより、第１の電極表面上で
のハイブリダイゼーションの度合いが導き出せる。

【００２２】 実施例２：交流ボルタンメトリ測定 実施例１と同様の電極および溶液を使用する。 Ａｇ／Ａｇｃｌに対して０Ｖから１Ｖの直接電圧走査を行い、２５０Ｈｚの交
流電圧をこの直接電圧に印加する。交流は、交流電圧に対して９０度の位相シフ
トで測定する。溶液中の検出第１バイオポリマに対して相補的な第２のバイオポ
リマが第１の電極上に存在する場合、図２に示す第２のピークが２５０ｍＶで発
生する。このピークは、ハイブリダイゼーションの最中に、第１の電極表面に陰
電荷が移動することに起因するキャパシタンスの変化により生じるものである。
二重層のキャパシタンスの変化により容量性電流の流れが生じ、この流れは交流
フラクションを位相敏感測定することにより検出される。上の曲線は、第１の電
極の表面にバイオポリマが付着していない場合の交流信号を示す。この場合、ピ
ークは観察されない。

【００２３】 図３は、測定に使用する装備を図示したものである。第１の電極Ｅ１、第２の
電極Ｅ２、および第３の電極Ｅ３を液体に浸す。第１の電極Ｅ１は作用電極であ
り、第２のバイオポリマ、例えばＤＮＡが、リンカーにより共有結合されている
。液体中には、第２のバイオポリマ（２）に対して相補的な第１のバイオポリマ
（１）が存在する。第２の電極（Ｅ２）は対抗電極として作用し、第３の電極（
Ｅ３）は参照電極として作用する。

【００２４】 配列表は、ＨＧＨ１およびＨＧＨ１に相補的なＨＧＨの配列を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、サイクリックボルタンモグラムを示す。

【図２】 図２は、周波数に対してプロットされた交流の変化を示す。

【図３】 図３は、測定のための装備を示す。

【符号の説明】

１ 第１のバイオポリマ ２ 第２のバイオポリマ Ｅ１ 第１の電極 Ｅ２ 第２の電極 Ｅ３ 第３の電極

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｍ ３３６Ｂ ３８６Ｇ ３８６Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベルトリンク ウォルフ ドイツ連邦共和国 エルランゲン 91056 マイゼンヴェーク 22 (72)発明者 シューライン ユールゲン ドイツ連邦共和国 エルランゲン 91054 ノイエシュトラーセ 26 (72)発明者 ハスマン イエルク ドイツ連邦共和国 エルランゲン 91052 ホフマンシュトラーセ 118ａ Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 DA36 FA34 FB02 FB05 GC20 4B063 QA01 QQ42 QR33 QS34 QS39 QX05

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 液体中の第１のバイオポリマ（１）を検出・定量する方法で
   あって、検出される第１のバイオポリマ（１）に対して特定の親和力を有する第
   ２のバイオポリマ（２）が第１の電極（Ｅ１）の表面に付着し、さらに第１およ
   び少なくとも１つの第２の電極（Ｅ２）が液体と接触しており、 ａ）第１の電極（Ｅ１）と第２の電極（Ｅ２）との間にわたって、電圧および
   ／または電流を印加するステップ、および ｂ）第２のバイオポリマ（２）に第１のバイオポリマ（１）を付加することに
   より生じる電圧および／または電流の直接的な変化を測定するステップとを備え
   る、方法。
2. 【請求項２】 ステップｂ）において、直接電圧信号を測定することを特徴
   とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 測定がサイクリックボルタンメトリ測定で行われることを特
   徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 第１のバイオポリマ（１）の検出および定量のために、測定
   電流または測定電圧を時間に対してプロットし、少なくとも１つのピークにわた
   って積算することを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
5. 【請求項５】 交流信号が位相敏感に測定されることを特徴とする、請求項
   １に記載の方法。
6. 【請求項６】 交流信号が周期的直流信号に重畳されることを特徴とする、
   請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 ボルタンメトリ信号をさまざまな周波数で測定することによ
   り、インピーダンスを測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 ステップａ）の前に電圧および／または電流を印加して、第
   １の電極（Ｅ１）の表面における第１のバイオポリマ（１）の濃度を増加させる
   ことを特徴とする、上記請求項のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】 極性が周期的に反転されることを特徴とする、請求項８に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 濃度が増加された第１の生体分子（１）が付着する第１の
    電極（Ｅ１）を液体から取り除き、測定のために規定の測定溶液と接触させるこ
    とを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 第２のバイオポリマ（２）の一端が、共有結合またはリン
    カを介して第１の電極（Ｅ１）の表面に付着することを特徴とする、上記請求項
    のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 第１の電極（Ｅ１）が、プラスチック、セラミックス、ガ
    ラス、または金属のいずれか１つの材料から形成されることを特徴とする、請求
    項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 第１のバイオポリマ（１）が、第２のバイオポリマ（２）
    に対して相補的な１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする、上記請求
    項のいずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 ステップｂ）において、バイオポリマ（１、２）のハイブ
    リダイゼーションにより生じる電圧および／または電流の変化が測定されること
    を特徴とする、請求項１３に記載の方法。