JP2003527099A - フォリスタチン関連タンパク質ｚｆｓｔａ４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、zfsta4、すなわちフォリスタチンファミリーの新規メンバーのポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する、それらをコードするポリペプチド及びポリヌクレオチドは、TGF−βファミリーのメンバーへの結合のために、及び中枢神経系、生殖、造血及び骨関連活性に介在するために有用である。本発明はまた、zfsta4ポリペプチドに対する抗体も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： フォリスタチンは、下垂体卵胞刺激ホルモン（FSH）合成及び分泌の可能性あ
るインヒビターとしてブタ卵胞流体において本来同定されているグリコシル化さ
れたモノマータンパク質であり、フォリスタチンはのちに、FSH−インデューサ
ーアクチビンを特異的に結合することによってその生物学的効果のいくらかを発
揮することが示されている。

【０００２】 他のファリスタチンファミリーメンバーは、フォリスタチン関連タンパク質又
はFRP（Zwijsenなど., Eur. J. Biochem. 225: 937-46, 1994）、 SPARC (また
、オステオネクチン又はEM−40、又はマスクTSC-36のヒトオルト体として知られ
ているSPARC)（Lane and Sage, 前記）、アグリン（Patthy and Nikolics, TINS
16: 76-81, 1993）、ヘビン（Girard and Springer, Immunity 2: 113-23, 199
5）、ニワトリのFlikタンパク質（Amthorなど., Dev. Biology 176: 343-62, 19
96）、及びラット脳タンパク質SC１（Mendis など., Brain Res. 730: 95-106,
1996） を包含する。

【０００３】 しかしながら、フォリスタチンは、遺伝子標的化により調製されたフォリスタ
チン欠失マウスがアクチビン遺伝子ノックアウト動物よりもより複雑で且つ異な
った表現型を有するので、“アクチビン結合体”であると思われる（Mazukなど.
, Nature 374: 360-3, 1995, 及びMazuk など., Nature 374: 356-9, 1995）。

【０００４】 アクチビン及びインヒビンは、下垂体FSH分泌のそれぞれの可能性ある活性化
因子及びインヒビターであり、そしてペプチド増殖因子のTGF−βファミリーの
メンバーである（Matherなど., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215: 209-22, 199
7）。アクチビン及びインヒビンファミリーのホルモンは、下垂体FSH分泌の生殖
腺生成されたレギュレーターとして本来記載されてきたが、現在、生殖システム
内で及びその外部で、広い範囲の効果を有することが知られている（Mather な
ど., 前記）。

【０００５】 インヒビンは、２種の異なったβサブユニット（インヒビンA：α/B_A；インヒ
ビンB：α/B_B）の1つに共有結合される通常のαサブユニットから成り；アクチ
ビンは２種のB−サブユニットの共有結合されたダイマーであり、そして従って
、３種の異なった形（アクチビンA：B_A/B_A；アクチビンB：B_B/B_B；アクチビンAB
：B_A/B_B）で存在するアクチビン及びインヒビンは、高い親和性でファリスタチ
ンに結合し、そしてアクチビン結合部位の構造は完全に定義されてはいないが、
予備データ（Inouyeなど., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 352-8, 1991
）は、最初のアミノ末端のシステイン富んでいるフォリスタチンドメインにおけ
る残基がホルモン結合に包含されることを示唆する。

【０００６】 従って、フォリスタチンへのアクチビンの結合は、ペプチドホルモンの遊離に
よりその生物学的効果を制限すると思われる。従って、アクチビン及びインヒビ
ンの広範囲の生物学的作用、及びTGF−βファミリーの可能性ある他のメンバー
は、フォリスタチンファミリーのタンパク質に結合することによって調節され得
る。

【０００７】 異なった結合タンパク質は、フォリスタチンが高い親和性（nM）でアクチビン
を結合し、低い親和性でインヒビンを結合し、そしてTGF−βをまったく結合し
ないように思えるので、個々のTGF−βファミリーメンバーのために必要とされ
得る（Matherなど., 前記）。フォリスタチンファミリーメンバーは、他の成長
因子の活性を調節することができ、例えばSPARC又はBM−40は血小板由来の生長
因子（PDGF−AB, PDGF−BB）を結合することが示されている（Lane and Sage, F
ASEB J. 8: 163-73, 1994）。

【０００８】 本出願は、TGF−β生長因子の生物学的活性の調節において主要の役割をたぶ
ん演じる、フォルスタチンファミリーの新規メンバー、すなわちzfsta4を提供す
る。フォリスタチンファミリーの他のメンバーのように、afsta4は、アテローム
硬化症の病因、生殖腺−下垂体−視床下部軸の調節、歯及び骨の形成、生殖腺ホ
ルモン生成の調節、精子形成、視床下部オキシトミン分泌、赤血球前駆体の増殖
及び分化、造血、宿主細胞及びニューロン生存において広い役割を演じることが
できる。 本発明は、当業者に明らかであるそれらの及び他の用途のためにそのようなポ
リペプチドを提供する。

【０００９】 発明の要約： 1つの観点においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基6
5〜133を含んで成るフォリスタチン相同ドメインを含んで成る単離されたポリペ
プチドを提供する。1つの態様においては、前記ポリペプチドは、前記フォリス
タチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在するαヘリックスリン
カー領域をさらに含んで成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域が配列番号
２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜173を含んで成る。もう1つの態様におい
ては、前記ポリペプチドは、αヘリックスリンカー領域、及び前記フォリスタチ
ン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在するカルモジュリン相同ド
メインをさらに含んで成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域及びカルモジ
ュリン相同ドメインが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜250を含ん
で成る。

【００１０】 さらにもう1つの態様においては、前記ポリペプチドは、αヘリックスリンカ
ー領域、カルモジュリン相同ドメイン、及び前記フォリスタチン相同ドメインに
対してカルボキシル末端位置に存在する２種のI−組Igドメインをさらに含んで
成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相同ドメイン、及
びI−組Igドメインが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜432を含ん
で成る。

【００１１】 さらにもう1つの態様においては、前記ポリペプチドは、αヘリックスリンカ
ー領域、カルモジュリン相同ドメイン、２種のI−組Igドメイン、及び前記フォ
リスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在するカルボキシ−
末端ドメインをさらに含んで成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域、カル
モジュリン相同ドメイン、２種のI−組Igドメイン、及びカルボキシ−末端ドメ
インが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜842を含んで成る。さらな
る態様においては、前記ポリペプチドは、前記フォリスタチン相同ドメインに対
してアミノ末端位置に存在する疎水性リンカー領域をさらに含んで成り、ここで
前記疎水性リンカー領域が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基23〜64を含
んで成る。もう1つの態様においては、前記ポリペプチドは、前記疎水性リンカ
ー領域に対してアミノ末端位置に存在する分泌シグナル配列をさらに含んでなり
、ここで前記分泌シグナル配列が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜
22を含んで成る。

【００１２】 本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特異的に結
合する抗体と特異的に結合する、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも
80％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。1つ
の態様においては、前記単離されたポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列
に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する。もう1つの態様にお
いては、前記アミノ酸配列と配列番号２の前記対応するアミノ酸配列との間のい
ずれかの差異は１又は複数の保存性アミノ酸置換による。

【００１３】 さらなる態様においては、前記アミノ酸の％同一性は、ktup＝1、 ギャップ開
放ペナルティー＝10、ギャップ延長ペナルティ＝１及び置換マトリックス＝blos
um62、並びに誤りとして設定される他のパラメーターを有するFASTAプログラム
を用いて決定される。 本発明はまた、配列番号２のアミノ酸残基23〜842を含んで成る単離されたポ
リペプチド、及び配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチ
ドを提供する。

【００１４】 本発明はさらに、 ａ）配列番号２の残基23〜64のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｂ）配列番号２の残基65〜133のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｃ）配列番号２の残基134〜173のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｄ）配列番号２の残基65〜173のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｅ）配列番号２の残基65〜250のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｆ）配列番号２の残基65〜334のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド；

【００１５】 ｇ）配列番号２の残基65〜432のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｈ）配列番号２の残基65〜842のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｉ）配列番号２の残基134〜250のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｊ）配列番号２の残基134〜334のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｋ）配列番号２の残基134〜432のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド；
及び ｌ）配列番号２の残基134〜842のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド から成る群から選択された、単離されたポリペプチドを提供する。

【００１６】 親和性標識又は結合ドメインをさらに含んで成る上記の単離されたポリペプチ
ドがまた提供される。 本発明はさらに、追加のポリペプチドに作用可能に結合される、配列番号２の
アミノ酸残基１〜22のアミノ酸配列を有する分泌シグナル配列を含んで成る融合
タンパク質えお提供する。ペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分
から実質的に成る融合タンパク質がまた提供され、ここで前記第1部分が上記ポ
リペプチドを含んで成り、そして前記第２部分がもう１つのポリペプチドを含ん
で成る。

【００１７】 もう１つの観点においては、本発明は、上記ポリペプチドコードする、単離さ
れたポリヌクレオチド分子を提供する。1つの態様においては、前記ポリヌクレ
オチド分子は、前記フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置
に存在するαヘリックスリンカー領域をさらに含んで成るポリペプチドをコード
し、ここで前記αヘリックスリンカー領域が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ
酸残基134〜173を含んで成る。

【００１８】 もう１つの観点においては、前記ポリヌクレオチドは、αヘリックスリンカー
領域、及び前記フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存
在するカルモジュリン相同ドメインをさらに含んで成るポリペプチドをコードし
、ここで前記αヘリックスリンカー領域及びカルモジュリン相同ドメインが配列
番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜250を含んで成る。さらにもう１つの
観点においては、前記ポリヌクレオチドは、αヘリックスリンカー領域、カルモ
ジュリン相同ドメイン、及び前記フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキ
シル末端位置に存在する２種のI−組Igドメインをさらに含んで成るポリペプチ
ドをコードし、ここで前記αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相同ドメ
イン、及びI−組Igドメインが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜43
2を含んで成る。

【００１９】 さらにもう１つの観点においては、前記ポリヌクレオチドは、αヘリックスリ
ンカー領域、カルモジュリン相同ドメイン、２種のI−組Igドメイン、及び前記
フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在するカルボキ
シ−末端ドメインをさらに含んで成るポリペプチドをコードし、ここで前記αヘ
リックスリンカー領域、カルモジュリン相同ドメイン、２種のI−組Igドメイン
、及びカルボキシ−末端ドメインが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基13
4〜842を含んで成る。関連する態様においては、前記ポリペプチドは、親和性標
識又は結合ドメインをさらに含んで成る。 本発明はまた、上記ポリペプチドコードする縮重ヌクレオチド配列である単離
されたポリヌクレオチドを提供する。

【００２０】 本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特異的に結
合する抗体と特異的な結合する、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも
80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドコードする単離されたポリヌ
クレオチドを提供する。もう１つの観点においては、前記単離されたポリペプチ
ドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配
列を有する。関連する態様においては、前記アミノ酸配列と配列番号２の前記対
応するアミノ酸配列との間のいずれかの差異は１又は複数の保存性アミノ酸置換
による。さらにもう１つの観点においては、前記アミノ酸の％同一性は、ktup＝
1、 ギャップ開放ペナルティー＝10、ギャップ延長ペナルティ＝１及び置換マト
リックス＝blosum62、並びに誤りとして設定される他のパラメーターを有するFA
STAプログラムを用いて決定される。

【００２１】 本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド183〜2632を含んで成る単離された
ポリヌクレオチド分子、及び配列番号１のヌクレオチド107〜2632のヌクレオチ
ド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。 配列番号１の単離されたポリヌクレオチド分子がまた、提供される。

【００２２】 本発明はさらに、 ａ）配列番号１のヌクレオチド107〜172から成るポリヌクレオチド； ｂ）配列番号１のヌクレオチド173〜297から成るポリヌクレオチド； ｃ）配列番号１のヌクレオチド298〜505から成るポリヌクレオチド； ｄ）配列番号１のヌクレオチド506〜625から成るポリヌクレオチド； ｅ）配列番号１のヌクレオチド298〜625から成るポリヌクレオチド； ｆ）配列番号１のヌクレオチド298〜856から成るポリヌクレオチド； ｇ）配列番号１のヌクレオチド298〜1108から成るポリヌクレオチド；

【００２３】 ｈ）配列番号１のヌクレオチド298〜1402から成るポリヌクレオチド； ｉ）配列番号１のヌクレオチド298〜2632から成るポリヌクレオチド； ｊ）配列番号１のヌクレオチド506〜856から成るポリヌクレオチド； ｋ）配列番号１のヌクレオチド506〜1108から成るポリヌクレオチド； ｌ）配列番号１のヌクレオチド506〜1402から成るポリヌクレオチド；及び ｍ）配列番号１のヌクレオチド506〜2632から成るポリヌクレオチド から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【００２４】 本発明はまた、追加のポリペプチドに作用可能に結合される、配列番号２のア
ミノ酸残基１〜22のアミノ酸配列を有する分泌シグナル配列を含んで成る融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ペプチド結合により連結さ
れる第１部分及び第２部分から実質的に成る融合タンパク質をコードするポリヌ
クレオチド分子がまた提供され、ここで前記第1部分が上記ポリペプチドを含ん
で成り、そして前記第２部分がもう１つのポリペプチドを含んで成る。

【００２５】 もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写
プロモーター；請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子
；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。１つの態様に
おいては、発現はさらに、前記ポリペプチドに作用可能に連結される分泌シグナ
ル配列をさらに含んで成る。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチド
は、親和性標識に対してアミノ末端で又はカルボキシ末端で共有結合されるポリ
ペプチドをコードする。

【００２６】 次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；上記ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド分子；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクタ
ーを導入されている、前記ポリヌクレオチドセグメントによりコードされる前記
ポリペプチドを発現する培養された細胞が提供される。 本発明はさらに、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；上記ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び転写ターミネーターを含ん
で成る発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞は、前
記ポリヌクレオチドセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現し；
そして前記発現されたポチペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチド
の生成方法を提供する。

【００２７】 もう１つの観点においては、本発明は、上記ポリペプチドに対して特異的に結
合する抗体又は抗体フラグメントを提供する。１つの態様においては、前記抗体
は、ａ）ポリクローナル抗体；ｂ）ネズミモノクローナル抗体；ｃ）ｂ）に由来
するヒト型化された抗体；及びｄ）ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択
される。関連する態様においては、前記抗体フラグメントは、F(ab’), F(ab),
Fab’, Fab, Fv, scFv及び最少認識単位から成る群から選択される。もう１つの
態様においては、上記抗体に対して特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体が
提供される。もう１つの態様においては、上記抗体に対して特異的に結合する抗
−イディオタイプ抗体が提供される。

【００２８】 本発明はまた、医薬的に許容できるビークルと組合して上記ポリペプチドを提
供する。 本発明のそれらの及び他の観点は、次の発明の特定の記載に基づいて明らかに
成るであろう。

【００２９】 発明の特定の記載： 本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助ける
ことができる： “親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質へ
の第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに
結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される
。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタン
パク質が親和性標識として使用され得る。

【００３０】 親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,
EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991)
, グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 19
88）, Glu-Glu親和性標識 （Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 7952-4, 1985）, 物質Ｐ、すなわちFlag^TM ペプチド（Hoppなど., Biotec
hnology 6: 1204-1210, 1988）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原
性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein E
xpression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。DNAコードの親和
性標識は、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman K
odak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。

【００３１】 用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の
遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対
立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現
象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされ
たポリペプチドにおいて変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子
の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書におい
て使用される。

【００３２】 用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位
置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それ
らの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は
一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末
端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置
するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではな
い。

【００３３】 用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される
安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又
はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の
典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプ
テン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同
様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その
相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０⁹Ｍ^-1の結合親和性を有する。 用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列
に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCAC
GGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。

【００３４】 用語“コンチグ（contig） ”とは、他のポリヌクレオチドに対する一連の連
続した同一の又は相補的な配列を有するポリヌクレオチドを示す。連続した配列
とは、ポリヌクレオチドの全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの
ポリヌクレオチド配列を“オーバーラップ”すると言われる。例えば、ポリヌク
レオチド配列5’-ATGGCTTAGCTT-3’ に対する代表的なcontig とは、5’-TAGCTT
gagtct-3’及び3’-gtcgacTACCGA-5’である。 用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示
す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じ
アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAsp
をコードする）。

【００３５】 用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能
に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又
は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロ
モーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選
択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含す
る。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は
両者の要素を含むことができる。

【００３６】 用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオ
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所
望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成シス
テム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された
分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを
含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を
含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロ
モーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業
者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を
参照のこと)。

【００３７】 “単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、
例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク
質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチ
ド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、
すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを
供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”と
は、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化
された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。

【００３８】 “作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグ
メントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを示す。 用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタ
ンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。

【００３９】 “ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリ
ヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロ
で合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレ
オチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド（“nt”）、又はキロ塩
基（“kb”）として表される。

【００４０】 ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記
載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すため
に使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本
鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端
が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、
二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そ
のような対になっていない末端は、長さ20ntを超えない。

【００４１】 “ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもい
ずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約
１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及
される。 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロ
モーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずし
もそうではない。

【００４２】 “タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。
タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭
水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加さ
れ、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主
鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特
定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。

【００４３】 用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細
胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、
細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに
関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づ
けられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと
他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化を
もたらす。

【００４４】 この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に
連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、
細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分
解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シ
トソール性又は核性であり；モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−
アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容
体、IL−３受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体
及びIL―6受容体)であり得る。

【００４５】 用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペ
プチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポ
リペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常
分解される。

【００４６】 用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を
示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA
分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライ
シング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写される
いくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異
体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタ
ンパク質を示すために本明細書において使用される。

【００４７】 不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子
量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が
“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確
には±１０％であることが理解されるであろう。 タンパク質のフォリスタチンファミリーの新規メンバー、すなわちzfata4は、
ヒト尿路ライブラリーから同定された。zfsta4タンパク質は、特異的なアミノ末
端システインに富んでいるフォリスタチンドメインを示す（Hohenester など.,
EMBO J. 16: 3778-86, 1997）。

【００４８】 他のフォリスタチンファミリーメンバーは、フォリスタチン関連タンパク質又
はFRP（Zwijsenなど., Eur. J. Biochem. 225: 937-46, 1994）、 SPARC (また
、オステオネクチン又はEM−40、又はマスクTSC-36のヒトオルト体として知られ
ているSPARC)（Lane and Sage, 前記）、アグリン（Patthy and Nikolics, TINS
16: 76-81, 1993）、ヘビン（Girard and Springer, Immunity 2: 113-23, 199
5）、ニワトリのFlikタンパク質（Amthorなど., Dev. Biology 176: 343-62, 19
96）、フォリスタチン関連タンパク質zfata2（Conklinなど., WO00/22126号、Ap
ril20, 2000）及びラット脳タンパク質SC１（Mendis など., Brain Res. 730: 9
5-106, 1996） を包含する。

【００４９】 本発明は、フォリスタチンのファミリーに対して相同性を有するポリペプチド
をコードする新規DNA配列の発現に一部基づかれている。Zfsta4ポリヌクレオチ
ド配列は、配列番号１に開示され、842個のアミノ酸（配列番号２）の多ドメイ
ン分泌性タンパク質をコードする。配列番号２により示されるように、zfsta4の
推定されるアミノ酸配列の配列分析は、22個のアミノ酸残基のシグナル配列（配
列番号２のアミノ酸残基１−22、配列番号１のヌクレオチド107−172）、続いて
知られている相同性を有さない優性的に親水性の短いリンカードメイン（配列番
号２のアミノ酸残基23−64、配列番号１のヌクレオチド173−297）、フォリスタ
チン相同ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基65−133、配列番号１のヌクレオ
チド298−505）、α−ヘリックスリンカー領域（配列番号２のアミノ酸残基134
−173、配列番号１のヌクレオチド506−625）、

【００５０】 カルモジュリンドメイン（配列番号２のアミノ酸残基177−250、配列番号１の
ヌクレオチド635−856）、I−組IGドメイン＃１（配列番号２のアミノ酸残基251
−334、配列番号１のヌクレオチド857-1108）、I−組IGドメイン＃２（配列番号
２のアミノ酸残基335−432、配列番号１のヌクレオチド1109−1402）、及び知ら
れている相同性を有さないC−末端ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基433−84
2、配列番号１のヌクレオチド1403-2632）の存在を示す。当業者は、予測される
ドメイン境界が主要配列含有に基づく近似値であり、そしてわずかに変化するこ
とができることを認識するであろうが、しかしながらそのような推定は一般的に
、±５個のアミノ酸残基内で正確である。

【００５１】 フォリスタチン相同ドメインは、SPARC (BM-40又はオステオネクチンとしても
知られている、Swiss-Prot SPRC_HUMAN, PDB 1BMO, Hohenester など., 1997)
においてフォリスタチン相同ドメインについて決定された構造に類似する構造に
折りたたむことが予測される。これは、βヘアーピン構造、続くα/β構造の小
さな疎水性コアである。Asn99でグリコシル化されるSPARCとは異なって、zfsta4
には予測されるグリコシル化部位は存在しない。

【００５２】 SPARCにおけるジスルフィド結合パターンに基づけば、zfsta4におけるジスル
フィド対環は次の通りである：配列番号２のCys65-Cys76, Cys70-Cys87, Cys89-
Cys119, Cys93-cysll2及びCys101-Cys133。Zfsta4フォリスタチン相同ドメイン
は、ヒトフォリスタチン関連タンパク質におけるフォリスタチンドメインに対し
て49％の同一性を有し（Swiss−Prot FRP_HUMAN, Zwijsenなど., Eur. J. Bioch
em. 255: 937-46, 1994; Tanakaなど., Int. Immunol. 10: 1305-14, 1998））
；このタンパク質のマウスオルト体はTSC−36として知られている（Swiss-Prot
FRP_MOUSE, Shibanumaなど., Eur. J. Biochem. 217: 13-19, 1993）。

【００５３】 フォリスタチン相同ドメインは、セリンプロテイナーゼインヒビターのKazal
ファミリー（Bode and Huber., Eur. J. Biochem. 204, 433-51, 1992）に対し
て実質的な配列類似性を有する。セリンプロテイナーゼインヒビターは、活性部
位を支配することによって標的プロテイナーゼのタンパク質分解活性を調節し、
そしてそれにより、通常の基質による支配を妨げる。セリンプロテイナーゼイン
ヒビターはいくつかの関連のない構造類似に分類されるが、それらはすべて、結
合ループ及びタンパク質コアを端に有する残基間の分子間相互作用により安定化
される暴露されたループ（“インヒビターループ”、“反応コア”、“反応部位
”,“結合ループ”と証する）を有する（Bode and Huber, 前記）。

【００５４】 インヒビターと酵素の間の相互作用は、非常にゆっくりと解離し、結合ループ
の分裂しやすい結合で分解される、そのままの又は修飾されたインヒビターのい
ずれかを生成する安定した複合体を生成する。プロテイナーゼインヒビターPEC
−60（PDB 1PCE）及びオボムコイド（PDB 1OVO）についての結晶構造との類似性
に基づけば、zfsta4のフォリスタチン相同ドメインにおける推定上のプロテイナ
ーゼ結合部位は、配列番号２のアミノ酸残基Cys93 (P3), Lys94 (P2), Arg95 (P
1), His96 (P1’) 及びTyr97（P2’）を含む。従って結合ループの分裂しやすい
結合は、配列番号２のP１及びP1’残基、Arg95及びHis96間に存在するであろう
。

【００５５】 カルモジュリン相同ドメインは、SPARC（Hohnesterなど., RMBO J. 16: 3778-
86, 1997）においてEC（EFハンドカルシウム結合；カルモジュリン−様）につい
て決定された構造に類似する構造に折りたたむことが予測される。カルモジュリ
ン（Swiss−Prot CALM_HUMAN, PDB 1CLI）は、EFハンドとして知られるヘリック
ス−ループ−ヘリックス副構造のループを通してカルシウムイオンを結合するα
−ヘリックスタンパク質である。カルモジュリンは２種の構造的に類似する領域
を有し、それぞれは結合するヘリックスセグメントにより結合される２種のEFハ
ンドを含む。

【００５６】 本明細書において使用される場合、“カルモジュリン相同ドメイン”とは、そ
れらの２種の領域の1つを説明することを意味する。zfsta4のカルモジュリン相
同ドメインは、２種のEFハンド型及び従って、２種の予測されるカルシウムイオ
ン結合部位を含むことが予測される。その型の分析に基づけば、それらの２種の
EFハンドのループは、配列番号２のアミノ酸残基187（Asp）とアミノ酸残基199
（Leu）との、及び配列番号２のアミノ酸残基226（Asp）とアミノ酸残基238（ph
e）との間に存在することが予測される。

【００５７】 EFハンドルループの最後の残基は常に疎水性であり、すなわちzfsta4において
は、それらの残基は配列番号２のアミノ酸残基199（Leu）及びアミノ酸残基238
（ Phe）である。配列相同性に関しては、zfsta4のカルモジュリン相同ドメイン
は、ヒトタンパク質ホスファターゼPPEE−２（GenBank受託AFO23456）の二重EF
ハンドセグメントに対して、アミノ酸レベルで32％の同一性を有する。Zfsta4カ
ルモジュリン相同ドメインは、SPARCのカルボジュリンドメインに対して検出で
きる配列相同性を有さない。

【００５８】 SPARCのカルモジュリンドメインの第２のEFハンドは、EFハンドループを延長
するジスルフィド結合により安定化される。このEFハンドにおける２種のCys残
基がLeu残基に突然変異誘発される場合、カルシウムイオン親和性の100倍の低下
が示された（Hohenesterなど., Nat. Struct. Biol., 3: 67-73, 1996）。本出
願はまた、第２のEFハンドが配列番号２のアミノ酸残基225 （Asp）及びアミノ
酸残基241 （Ala）を、システイン残基により置換することによって安定化され
る、zfsta4の突然変異誘発された形も提供する。この突然誘発された形は、より
高いカルシウム親和性を有する。

【００５９】 フォルスタチンとカルモジュリンとの間の相同ドメインは、２種のセグメント
間で短いリンカーペプチドを形成することができるα−ヘリックスリンカーと呼
ばれる短いセグメントである。このリンカーは、配列番号２のアミノ酸残基144
（Glu）〜アミノ酸残基166（Asp）のαヘリックス構造を有することが予測され
る。このリンカーのC−末端で、タンパク質分解部位の位置であり得る３種の塩
基性残基が存在する。分泌されたタンパク質のこの部位でのプロセッシングが、
タンパク質の残りから、フォリスタチン相同ドメインを含むドメインB及びCを開
放する。

【００６０】 α−ヘリックスリンカーペプチドの配列番号２のアミノ酸残基140 （Cys）は
、zfsta4のカルモジュリン相同ドメインにおける第２のEFハンドの先に存在する
、配列番号２のアミノ酸残基216（Cys）と共にジスルフィド結合を形成すること
ができる。

【００６１】 zfsta4のI−組IGドメイン＃１及び＃２は、テロキンペプチドについて決定さ
れた構造に類似する構造に折りたたむ予測される（Swiss-Prot KMLS_HUMAN, PDB
1TLK）。テロキンペプチドは、β−サンドイッチ様構造に折りたたむすべての
βタンパク質である免疫グロブリンの種類に分類される（Borkなど., J. Mol. B
iol. 242: 309-20, 1994）。それらは、３＋４β鎖を含んで成る２種のβシート
を有する。さらに、テロキンペプチドは、“I”組免疫グロブリン（IG）ドメイ
ンとして細かく分類されている。

【００６２】 I組免疫グロブリンドメインを有する他のタンパク質は、チチン（titin）、血
管及び神経細胞付着分子、及びツイチシン（twitchin）を包含する。Zfsta4ドメ
インI−組IG＃１及び＃２においては、２種のドメイン内ジスルフィド結合が存
在し、１つはI−組IGドメイン＃１における配列番号２のシステイン残基270と32
1との間に存在し、そしてもう1つはI−組IGドメイン＃２における配列番号２の
システイン残基362と413との間に存在する。

【００６３】 zfsta4のC−末端ドメインは、いずれかの既知のタンパク質に対して認識でき
る配列又は構造類似性を示さない。このセグメントは、細胞外マトリックスに、
又は細胞表面膜にタンパク質を固定するよう作用することができる。 種々のヒト組織のノザンブロット分析は、脳、胎盤及び脊髄に見られる約4kb
の転写体をもたらした。RNAドットブロット分析は、zfsta4が偏在的に発現した
ことを示した。

【００６４】 本発明はさらに、zfsta4タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、例え
ばDNA及びRNA分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、センス鎖；アンチ
センス鎖；及びそれらのそれぞれの水素結合により一緒にアニーリングされるセ
ンス及びアンチセンス鎖の両者を有する二本鎖としてのDNAを含む。zfsta4タン
パク質をコードする代表的なDNA配列は、配列番号１に示される。他のzfsta4タ
ンパク質をコードするDNA配列は、遺伝子コードに基づいて、当業者により容易
に生成され得る。カウンターパートのRNA配列は、Tの代わりにUに置換により生
成され得る。

【００６５】 当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌ
クレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号４は、
配列番号２のzfsta4ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配
列である。当業者はまた、配列番号４の変性配列がUとTとを置換することによっ
て、配列番号2をコードするすべてのRNA配列も供給することを理解するであろう
。

【００６６】 従って、配列番号４のヌクレオチド１-2526を含んで成るzfsta4ポリペプチド
−コードのポリヌクレオチド及びそれらのRNA相当物は、本発明により包含され
る。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３内に使用される1
文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。
“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードY
はC又はTのいずれかを示し、そしてその補体RはA又はGを示し、AはTに対して相
補的であり、そしてGはCに対して相補的である。

【００６７】

【表１】 所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号４に使
用される縮重コドンが表２に示される。

【００６８】

【表２】

【００６９】 当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可
能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するで
あろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギ
ニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コ
ドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関
係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って
、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配
列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列へ
の参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列
は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。

【００７０】 当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するで
あろう。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980;
Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 199６; Wain−Hobson、など.,Gene 1
3：355−64，1981；Grosjean and Fiera，Gene 18：199−209、1982；Holm,N
uc．Acids Res．14：3075−87、1986；Ikemura，Ｊ．Mol．Biol．158：573−97
，1982を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン
使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従
って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパ
ク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(表２を参照のこと)。

【００７１】 例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコー
ドされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドン
であり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌において
は、異なったThrコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界
において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入さ
れ得る。

【００７２】 例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内
でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を
増強する。従って、配列番号４に開示される縮重コドン配列は、当業界において
通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種において
ポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む
配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される
官能性について試験され得る。

【００７３】 本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号
１の類似するサイズの領域、他のポリヌクレオチドプローブ、プライマー、本明
細書に引用されるフラグメント及び配列、又はそれに対して相補的配列に対して
ハイブリダイズするであろう。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、当
業界において良く知られており、そして多くの用途のために広く使用される；

【００７４】 例えばSambrook など., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second E
dition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel など., eds., Current Proto
cols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; Berger a
nd Kimmel, eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzym
ology, Volume 152, 1987 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 2
27-59, 1990。参照のこと。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、二重
鎖ハイブリッドを形成する一本鎖相補的配列の能力を開発する。そのようなハイ
ブリッドは、DNA−DNA, RNA−RNA及びDNA−RNAを包含する。

【００７５】 ハイブリダイゼーションは、いくらかの程度の相補性を含む配列間で生じるで
あろう。ハイブリッドは二重ヘリックスにおけるミスマッチの塩基対を許容でき
るが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度に影響される。ミスマッ
チされたハイブリッドのT_mは、あらゆる１〜1.5％の塩基対ミスマッチについて
１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の懸縮性の変更は、ハイブリッドに
存在するであろうミスマッチの程度に対する調節を可能にする。ハイブリダイゼ
ーション温度が低下し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低
下するにつれて、緊縮性の程度は上昇する。

【００７６】 ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばDenhardt溶
液（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）、変性されたサケ精子DNA、粉乳（B
LOTTO）、ヘパリン又はSDS、及びNa⁺源、例えばSSC（１×SSC：0.15：NのNaCl、
15mMのクエン酸ナトリウム）又はSSPE（１×SSPE：1.8MのNaCl、10mMのNaH₂PO₄
、1mMのEDTA、pH7.7）を含む。緩衝液のイオン濃度を低めることによって、ハイ
ブリッドの安定性は低められる。典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は
、10mM〜１MのNa⁺を含む。

【００７７】 予備混合されたハイブリダイゼーション溶液はまた、市販源、例えばClonech
Laboratories (Palo Alto, CA) 及びPromega Corporation (Madison, WI) から
、製造業者の説明書に従って使用のために入手できる。不安定剤又は変性剤、例
えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又
はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリ
ッドのT_mを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低
い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、50％までの濃度で使
用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる場合、非特異的バッググ
ラウンドを低めるためにも作用する。

【００７８】 緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（T_m）よりも約
５〜25℃低い温度、及び１MまでのNa⁺を有するハイブリダイゼーション緩衝液を
包含する。より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の
１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのTmを低めるホルムアミドの添
加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、20〜70℃の温度、及
び６×SSC及び０〜50％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。

【００７９】 高い程度の緊縮性は、40〜70℃の温度で及び４×SSC及び０〜50％のホルムア
ミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。高い緊縮条件
は典型的には、42〜70℃の温度、及び１×SSC及び０〜50％のホルムアミドを有
するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的
配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗
浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハ
イブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプ
ローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。

【００８０】 上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペ
プチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当
業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのT_mは、標的配列の50％が
完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された
条件下での）である。T_mに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプロ
ーブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及
びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。

【００８１】 Tmを計算するための多くの等式は、当業者において知られており（例えば、Sa
mbrookなど., 前記；Ausubel など., 前記；Berger and Kimmel, 前記及びWetmu
r, 前記）、そしてDNA, RNA及びDNA−RNAハイブリッド及び種々の長さのポリヌ
クレオチドプローブ配列に対して特異的である。配列分析用ソフトウェア、例え
ばOligo 4.0 及びPrimer Premier, 並びにインターネット上でのサイトが、所定
の配列を分析し、そして使用者により定義される基準に基づいてT_mを計算するた
めの利用できる用具である。

【００８２】 そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配列を分析し、そし
て適切なプローブ配列を提供する。典型的には、50bp以上の長いポリヌクレオチ
ド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたT_mよりも約20〜25℃低い温度で
行われる。50bp以下のそれよりも短いプローブに関しては、ハイブリダイゼーシ
ョンは典型的には、T_mで、又はそれよりも５〜10℃低い温度で行われる。これは
、DNA−DNA及びDNA−RNAハイブリッドについての最大速度のハイブリダイゼーシ
ョンを可能にする。

【００８３】 これまでに示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及
びRNAを包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知
られている。一般的には、RNAは、多量のzfsta4 RNAを生成する組織又は細胞か
ら単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Thomas, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980）により同定され、そして脳、精巣、腎臓
、膵臓、前立腺及び副腎を包含する。

【００８４】 全RNAは、グアニジウム イソチオシアネート抽出、続くCsClグラジエントに
おける遠心分離による単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 1
8:52−94, 1979）。ポリ（A）⁺ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sc
i.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA
(ｃDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ（A）⁺ RNAから調製される。他方では、
ゲノムDNAが単離され得る。次に、zfsta4ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定さ
れ、そして単離される。

【００８５】 zfsta4ポリペプチドをコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニン
グ方法により得られる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、但し、いく
つかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノ
ムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようcDNAク
ローンを修飾することが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方
法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブ
ラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一
部の使用を包含する。発現ライブラリーは、zfsta4に対する抗体、受容体フラグ
メント、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。

【００８６】 本発明のポリヌクレオチドはまた、自動装置を用いても合成され得る。現在、
選択の方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖DNAが
遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的
鎖が別々に製造される。短い遺伝子（60〜80bp）の生成は技術的に直接的であり
、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る
。しかしながら、より長い遺伝子（300bp以上）の生成に関しては、化学的にDNA
合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、
特定の方法が所望される。

【００８７】 この問題を克服するためには、合成遺伝子（二本鎖）が、20〜100個の長さの
ヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。遺伝子
合成方法は、当業界において良く知られている。たとえば、Glick and Pasterna
k, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA
, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura など., Annu.Rev. Biochem.
53: 323-56, 1984及びClimie など., Proc. Natl. Acad. Sa. USA 87: 633-7, 1
990を参照のこと。

【００８８】 本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオ
チドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及
び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ
、馬及び他の霊長類リガンドからのzfsta4ポリペプチドである。ヒトzfsta4ポリ
ペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給
される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃDNAは、zfsta4
を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用いてクローン化され得る。mRN
Aの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザ
ンブロットをプローブすることによって同定され得る。

【００８９】 次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。次に、z
fsta4ポリペプチドコードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒト
ｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブによ
り、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示さ
れる代表的なヒトzfsta4ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用い
て、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用い
てもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNAライブラリーが宿主
細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味ある
ｃDNAの発現がzfsta4ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する
技法がまた、ゲノム クローンの単離に適用され得る。

【００９０】 当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトzfsta4の単一の対立遺伝子を表
し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測される
ことを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って
、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによって
クローン化され得る。配列番号１に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体、例え
ばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更を
もたらすそれらの変異体は、配列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質と
同じように、本発明の範囲内である。

【００９１】 Zfsta4ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたmRNAから
生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと
同じように、本発明の範囲内に包含される。スプライス変異体は、フォリスタチ
ンファミリーにおいて知られており、フォリスタチンは他のスプライシングのた
めに、少なくとも３種の形（32,000, 35,000及び39,000 Da）で存在する。それ
らの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られて
いる標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラ
リーをプローブすることによってクローン化され得る。

【００９２】 本発明はまた、配列番号２ポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質
的に同一である単離されたzfsta4ポリペプチドも提供する。用語“実質的に同一
である”とは、配列番号２に示される配列又はそれらのオルト体に対して、50％
，好ましくは60％、及びより好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するポ
リペプチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチド
は、より好ましくは、配列番号２又はそのオルト体に対して、少なくとも 90％
、及び最も好ましくは95％又はそれ以上同一であろう。％配列同一性は、従来の
方法により決定される。

【００９３】 例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikof
f and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照の
こと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティ
ー、１のギャップ延長ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コード
により示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum
62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される
。次に、％同一性が次のようにして計算される：

【００９４】

【数１】

【００９５】

【表３】

【００９６】 ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて
、類似する方法により決定される。 当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズ
ムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査
アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体zfsta4
のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパ
ク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. N
at’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 6
3 (1990) により記載される。

【００９７】 手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミ
ノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１であ
る場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列に
より共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度
の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対
合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域
の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。

【００９８】 “カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算
される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられ
た初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結
合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配
列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch
アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers
, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。

【００９９】 FASTA 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギャ
ップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリック
ス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前記)
に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラ
ム中に導入され得る。

【０１００】 FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性
を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は
、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは４〜６
であり得る。

【０１０１】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に比較して、１又は複数の保存性アミノ
酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。保存性アミノ酸
置換は、アミノ酸の化学的性質に基づかれ得る。すなわち、配列番号２の１又は
複数のアミノ酸置換を含む変異体が得られ、ここでアルキルアミノ酸がzfsta4ア
ミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に代わって置換され、芳香族アミノ酸がzf
sta4アミノ酸における芳香族アミノ酸に代わって置換され、硫黄含有アミノ酸が
zfsta4アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に代わって置換され、ヒドロキシ
含有アミノ酸zfsta4アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に代わって置
換され、酸性アミノ酸がzfsta4アミノ酸配列における酸性アミノ酸に代わって置
換され、塩基性アミノ酸がzfsta4アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に代わっ
て置換され、又は二塩基性モノカルボン酸アミノ酸zfsta4アミノ酸配列における
二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に代わって置換される。

【０１０２】 通常のアミノ酸の中で、“保存性アミノ酸置換”は、次のグループの個々内の
アミノ酸間の置換により示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシ
ン及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、
（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）
グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。 BLOSUM62表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領
域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するア
ミノ酸置換マトリックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad.
Sci. USA 89: 10915 (1992) ］。

【０１０３】 従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性
アミノ酸置換を定義するために使用され得る。単に化学的性質に基づいてのアミ
ノ酸置換を企画することが可能であるが（上記で論じられたように）、用語“保
存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言
及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値に
より特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存
性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により
特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、
２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。

【０１０４】 zfsta4遺伝子における保存性アミノ酸変化が、配列番号１のいずれか１つに列
挙されるヌクレオチドに代わってヌクレオチドを置換することによって導入され
得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図
された突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いて
の突然変異誘発及び同様の方法により得られる（Ausubel（1995）pages8-10〜8-
22; 及びMcPhrson（ed.）, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL
Press 1991) を参照のこと）。本明細書に記載されるような野生型タンパク質
の細胞性相互作用又は他の性質を調節するそのような変異体の能力は、標準の方
法、例えば本明細書に記載されるようなアッセイを用いて決定され得る。他方で
は、変異体zfsta4ポリペプチドが、抗−zfsta4抗体を特異的に結合する能力によ
り同定され得る。

【０１０５】 zfsta4における保存性アミノ酸変化が、配列番号１に列挙されるヌクレオチド
に代わってヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保
存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図された突然変異誘発、
リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いての突然変異誘発及び同
様の方法により得られる（Ausubel（1995）pages8-10〜8-22; 及びMcPhrson（ed
.）, Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) を参照
のこと）。野生型タンパク質の性質を有する変異体について選択するためには、
標準方法、例えば本明細書に記載されるアッセイを用いて行われ得る。他方では
、変異体zfsta4ポリペプチドが、抗−zfsta4抗体を特異的に結合する能力により
同定され得る。

【０１０６】 ポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小
さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又は
カルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５
個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長存在する
。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、zfsta4ポリペプチドと親和性
標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビ
ン分解部位及び第Xa因子分解部位を含む。

【０１０７】 本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、zfsta4
ポリペプチドは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示される
ようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好まし
いダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫グ
ロブリン−zfsta4ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーzfsta4類似体を生成
するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。補助ドメインは
、特定の細胞、組織又は高分子に対してそれらを標的化するためにzfsta4ポリペ
プチドに融合され得る。

【０１０８】 例えば、zfsta4ポリペプチド又はタンパク質が、標的細胞の表面上の受容体に
特異的に結合するリガンドにzfsta4ポリペプチドを融合せしめることによって、
予定された細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は
、治療又は診断目的のために標的化され得る。Zfsta4ポリペプチドは、複数の成
分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペ
プチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができ
る。Tuanなど., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996を参照のこと。

【０１０９】 本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天
然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２,４−メタプロ
リン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N
−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシ
ステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミ
ン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−
メチルプロリン、３,３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２
−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニ
ン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。

【０１１０】 天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方
法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノ
アシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用
され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔRNAをアミノアシル化するための方法は
、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及
び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリ
ーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製
される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman
など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09,
1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を
参照のこと。

【０１１１】 第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノ
アミル化されたサプレッサ−ｔRNAのマイクロインジェクションによりアフリカ
ツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271:
1991−98, 1996 )。

【０１１２】 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸
（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ
酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザ
フェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入
される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存在
するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換
され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変
異誘発と組み合わされ得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403, 19
93)。

【０１１３】 限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ
酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、zfsta4アミノ酸によ
り置換され得る。 本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている
方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同
定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassな
ど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991）。後者の技法におい
ては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得ら
れる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定す
るために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。

【０１１４】 また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異
に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法
により決定され得る。例えば、de Vos など.,Science 255: 306−312, 1992; Sm
ith など., J. Mol. Biol. 224: 899−904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett.
309: 59−64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連するタンパク
質、例えばヒトCMRF35による相同体の分析からも推定され得る。

【０１１５】 複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばRe
idhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer
（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を
用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペ
プチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリー
ンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異
誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。

【０１１６】 使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 3
0 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WI
PO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire な
ど., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。

【０１１７】 開示されるzfsta4 DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 3
70 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1
994及びWIPO公開WI97／20078により開示されるように、DNA シャフリングを通
して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNAが、ランダムに導入された点
突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリ
ーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追
加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対
立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリ
ーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に
対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、
配列の急速な“進化”を提供する。

【０１１８】 本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン
化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自
動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコード
する突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近
代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおけ
る個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポ
リペプチドに適用され得る。

【０１１９】 本明細書において論じられた方法を用いて、当業者は、野生型zfsta4タンパク
質の性質を保持する、配列番号２の種々のポリペプチドフラグメントを同定し、
そして/又は調製することができる。そのようなポリペプチドフラグメントは、N
−末端領域、フェリスタチン及び／又はカルモジュリン相同ドメイン、I−組IG
ドメイン＃１及び/又は＃２、α−ヘリックスリンカー及びC−末端領域を含むこ
とができる。アミノ酸切断又は付加がまた、存在することができる。

【０１２０】 本発明のポリペプチドは、配列番号２に示されるようなタンパク質のエピトー
プ−担持部分を含んで成るポリペプチドである。“エピトープ”とは、抗体が結
合できるタンパク質の領域である。例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 81: 3998-4002, 1984を参照のこと。エピトープは、線状又は、配座的
であり得、後者はタンパク質の折りたたみに基づいてエピトープを形成する、タ
ンパク質の断続的領域から構成される。線状エピトープは一般的に、少なくとも
６個の長さの断続的領域から構成される。線状エピトープは一般的に、少なくと
も６個の長さのアミノ酸残基である。

【０１２１】 タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドは通常、その部分的
に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘発することができる。Sutclifeな
ど., Science 219: 660-6, 1983を参照のこと。短い線状エピトープを認識する
抗体は、変性されたタンパク質を使用する分析及び診断用途、例えばウェスター
ンブロットにおいて（Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4356, 197
9）、又は固定された細胞又は組織サンプルの分析において特に有用である。線
状エピトープに対する抗体はまた、zfsta4のフラグメントの検出するためにも有
用であり、例えば体液又は細胞培養培地において生じることができる。

【０１２２】 本発明はまた、本明細書に記載されるzfsta4ポリペプチドのエピトープ−担持
の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのよ
うなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される
場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含ん
で成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得
る。（例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad Sci. USA81: 3988, 1983を参照
のこと）。本発明の抗原性、エピトープ−担持のポリペプチドは、zfsta4タンパ
ク質に対して特異的に結合する抗体、たとえばモノクローナル抗体の生成のため
に有用である。

【０１２３】 対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合す
ることができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る
。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてその
ようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピト
ープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激
するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Sutcli
ffeなど., Science 219: 660, 1983を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エ
ピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプ
チドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。

【０１２４】 抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは配列番号２
のアミノ酸配列の少なくとも４〜10個のアミノ酸、少なくとも10〜15個のアミノ
酸、又は約15〜約30個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチ
ド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、zfsta4ポリペプチドのフ
ラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープ
は、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば
、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, 及びCortese など.
, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996を参照のこと）。

【０１２５】 エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体
を生成するための標準の方法は、例えばMole, “Epitope Mapping,” in Method
s in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Pages 105-16 (The Humana
Press, Inc., 1992), Price, “Production and Characterization of Syntheti
c Peptide-Derived Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Production, En
gineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), page 60-
84 (Cambridge University Press 1995), 及びColigan など. (eds.), Current
Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John
Wiley & Sons, 1997)により記載される。

【０１２６】 好ましくは、エピトープ−担持のポリペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒に
おける実質的な溶解性を提供するために選択され、すなわち前記配列は比較的親
水性の残基を包含し、そして疎水性残基は実質的に回避される。

【０１２７】 変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのzfsta4ポリペプチドに関して
は、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードす
る十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当
業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々
のZfsta4変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明
は、次の配列、すなわち配列番号１、２及び４の少なくとも1つの配列を提供す
るデータ構造によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する
。

【０１２８】 適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り
可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライブ、ランダ
ムアクセス記憶（ＲＡＭ）チップ、フロッピー（登録商標）ディスク、デジタル
リニアーテープ（ＤＬＴ）、ディスクカーシ及びＺＩＰディスクを包含する。光
学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、ＣＤ−読み取りのみ
記憶（ＲＯＭ）、ＣＤ−再書き込みできる（ＲＷ）及びＣＤ−再記録できる）、
及びデジタル可転性／ビデオディスク（ＤＶＤ）（例えば、ＤＶＤ−ＲＯＭ，
ＤＶＤ−ＲＡＭ及びＤＶＤ＋ＲＷ）により例示される。

【０１２９】 本発明のzfsta4ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的に
活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構
築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより
形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれら
の細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含す
る。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化された
DNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は
次の文献に開示される：Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory M
anual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989, 及びAusubel など., eds., Current Protocol in Molecular Biolog
y, John Wiley and Sons, Ins., NY, 1987。

【０１３０】 一般的に、本発明のzfsta4ポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現の
ために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写
プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通
常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、
しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給さ
れ得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され
得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、
ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多く
のそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手で
きる。

【０１３１】 zfsta4ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグ
ナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列とし
ても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、zfst
a4の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばt−PA ）に由
来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、zfsta4 DNA配列に作用可
能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そ
して宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるよ
うに配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードする
DNA配列の5’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配
列の他の場所に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,0
37,743号；Hollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。

【０１３２】 他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に
他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリ
ペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが製造され得、ここで配列番号
２のアミノ酸残基1−22に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られて
いる方法及び本明細書に開示される方法を用いて、もう１つのポリペプチドに作
用可能に連結されている。

【０１３３】 本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路
中に追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融
合される。そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有す
る。例えば、そのような新規の分泌シグナル配列融合構造体は通常分泌されない
タンパク質の活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分
泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得
る。

【０１３４】 培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性DNAを 、
哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランス
フェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Som
atic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973）,
エレクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE
−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel など., 前記）、及びリポ
ソーム−仲介トランスフェクション（Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 1
993; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 ）を包含する。

【０１３５】 培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばlevinson
など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950
号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ
特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、COS−
1（ATCC No. CRL 165）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 16
32）、BHK 570 （ATCC No. CRL 10314 ）、293（ATCC No. CRL 1573 ; Graham
など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 ）、及びチャイニーズ ハムスター卵
巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。

【０１３６】 追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例
えば American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手できる。一般的
に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルスからのプ
ロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照のこと。他
の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリ
カ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号）、アデノウィルス主要後期プロモー
ターを包含する。

【０１３７】 薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞を
選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”
として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある
遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として
言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ
ードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様の
もの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは
、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。

【０１３８】 増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして
次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選
択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、
メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他
の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイ
シン アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表現型
を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質
、例えばCD4, CD8,クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又
は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞
とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。

【０１３９】 他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主とし
て使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのア
グロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes ）の使用は、Sinka
rなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている。
昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarino
など.,アメリカ特許第5,162,222号；及びWIPO公開WO94／06463号により公開され
る。昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Autographa californica ）
核多角体病ウィルス（AcNPV）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感
染され得る。

【０１４０】 zfsta4 ポリペプチドをコードするDNAは、２種の方法の１つにより、AcNPVポ
リヘドリン遺伝子コード配列の代わりにバキュロウィルスゲノム中に挿入される
。第１の方法は、野生型AcNPVと、AcNPV配列を端に有するzfsta4を含むトランス
ファーベクターとの間の相同DNA組換えの従来の方法である。適切な昆虫細胞、
例えばSF９細胞が野生型AcNPVにより感染され、そしてAcNPVポリヘドリン遺伝子
プロモーター、ターミネーター及びフランキング配列に作用可能に連結されるzf
sta4ポリヌクレオチドを含んで成るトランスファーベクターによりトランスフェ
クトされる。

【０１４１】 King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion System: A Lab
oratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. ., Baculovirus E
xpression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press
., 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. M
ethods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照のこと
。昆虫細胞内の天然組換えは、ポリヘドリンプロモーターにより駆動されるzfst
a4を含む組換えバキュロウィルスをもたらすであろう。組換えウィルスストック
は、当業界において通常使用される方法により製造される。

【０１４２】 組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luckow, V
A, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポゾンに
基づくシステムを利用する。このシステムは、Bac−to−Bac ( TM )キット（Lif
e Technologies, Rockville, MD）として市販されている。このシステムは、
“bacmid” と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持されるバキュロ
ウィルスゲノム中に、zfsta4 ポリペプチドをコードするDNAを移動せしめるため
に、Tn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBacI (TM ) (Life
Technologies )を利用する。PFastBacl^TM トランスファーベクターは、興味あ
る遺伝子、この場合、zfsta4の発現を誘導するためにAcNPVポリヒドリンプロモ
ーターを使用する。

【０１４３】 しかしながら、pFastBacl^TMは相当の程度まで修飾され得る。前記ポリヒドリ
ンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現
され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られ
ているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Pcor, p6.9又は
MPプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Hill−Perkins, M
.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. な
ど., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapop
ort, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。そのようなトラン
スファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又
は長いバージョンが使用され得る。

【０１４４】 さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のzfsta4分泌
シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、
エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチMelittin
(Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67（PharMingem, San Die
go, CA)は、生来の分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る
。さらに、トランスファーベクターは発現されたzfsta4ポリペプチドのC−又はN
−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu エピトープ標識をコードするDNAと
のイン−フレーム融合体を含むことができる（Grussenmeyer, T. など., Peoc.
Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）。

【０１４５】 当業界において知られている技法を用いて、zfsta4を含むトランスファーベク
ターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示であ
る断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロ
ウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離され、そしてス
ポドプテラ・フルギペルダ（ Spodoptera frugiperda ）細胞、例えばSf9 細胞
をトランスフェクトするために使用される。Zfsta4を発現する組換えウィルスが
結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常使用さ
れる方法により製造される。

【０１４６】 組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ
・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には
、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applicati
on of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994を参照のこと。も
う１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するH
igh FiveO^TM細胞系(Invitrogen)である（アメリカ特許第5,300,435号）。市販の
血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。適切な培
地は、Sf9細胞のためには、SF900II^TM (Life Technologies),又はEST 921^TM(Ex
pression Systems); 及びT. ni 細胞のためには、Ex−CellO405^TM（JRH Biosci
ences, Lenza, KS）又はExpress FiveO^TM(Life Technologies )である。

【０１４７】 細胞は、約２〜５×１０⁵個の細胞〜１〜２×１０⁶個の細胞の接種密度から増
殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.1〜10,より典型的にはほぼ
３の感染の多重度（MCI）で添加される。組換えウィルス−感染された細胞は典
型的には、感染後12〜72時間で、組換えzfsta4ポリペプチドを生成し、そして培
地中にそれを、種々の効率を伴って分泌する。培養物は通常、感染後48時間で収
穫される。遠心分離が、培地（上清液）から細胞を分離するために使用される。
Zfsta4ポリペプチドを含む上清液は、微小孔、通常0.45μmの孔サイズのフィル
ターを通して濾過される。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュ
アルに記載されている（King, L. A. and Possee, R. D., 前記; O’Reilly, D.
R. など., 前記；Richardson, C. D., 前記）。上清液からのzfsta4ポリペプチ
ドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。

【０１４８】 菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、
特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ(pich
ia methanolica) を包含する。外因性DNAによりS. セレビシアエ細胞を形質転
換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawa
saki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373
号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,74
3号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転
換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えば
ロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。

【０１４９】 サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは
、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にす
る、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベク
ターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネー
ターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kin
gsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,0
92 号を参照のこと）及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包
含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号
；及び第4,661,454号を参照のこと。

【０１５０】 他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾ
サッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス
・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluy
veromyces fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア
・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolic
a）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マ
ルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知ら
れている。

【０１５１】 例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCr
egg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mckni
ght など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモ
ニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は
、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（N
eurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,53
3号により開示される。

【０１５２】 例えば、組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの
使用は、Raymond, アメリカ特許第5,716,808号、Raymond, アメリカ特許第5,736
,383号、Raymond など.,Yeast 14: 11-23, 1998、及びWIPO公開WO97／17450, W
O97／17451、WO98／02536及びWO98／02565に開示される。P.メタノリカの形質転
換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、
二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.メタノリカにおけるポリ
ペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーター
は、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ アルコール利用遺伝子（AUG１
又はAUG２）のものであることが好ましい。

【０１５３】 他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸
デヒドロゲナーゼ（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のものを包含する。宿
主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有する
プラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア メタノリ
カへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主細胞
の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラー
ゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。

【０１５４】 メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、
両メタノール利用遺伝子（AUG１及びAUG２）が欠失されている宿主細胞を使用す
ることが好ましい。分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ
遺伝子（PEP４及びPRB１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレー
ションが、P.メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを
含むプラスミドの導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは
約3.75kV/cmの電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数（ｒ
）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレー
ションによりP.メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。

【０１５５】 原核宿主細胞、例えば細菌E.コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明
において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクロ
ーン化される外来性DNA配列を発現するための技法は、当業界において良く知ら
れている（例えば、Sambrookなど., 前記を参照のこと）。細菌、例えばE.コリ
においてzfsta4ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には
不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に
向けられ得る。

【０１５６】 前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジ
ンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペ
プチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタ
チオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前
記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチド
は、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は
浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔
から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性
を回避することができる。

【０１５７】 アデノウィルス システムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも
使用され得る。アデノウィルス感染された非−293細胞を、その細胞が急速に分
裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質
を生成することができる。たとえば、BHK細胞は、細胞工場において集密性まで
増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルス ベ
クターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された
細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。

【０１５８】 他方では、アデノウィルス ベクター感染された293細胞が、有意な量のタン
パク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として又は懸濁培養
において増殖せしめられ得る（ Garnier など., Cytotechnol. 15: 145−55, 19
94 を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異
種タンパク質が、細胞培養物の上清液から反復して単離され得る。感染された29
3細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得
られる。

【０１５９】 形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の
増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の
方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培
地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須
アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子
又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加
されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーによ
り補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における
薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。

【０１６０】 P.メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地に
おいて、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例
えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーショ
ンを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD（２％D−グ
ルコース、２％のBacto^TMペプトン（Difco Laboratories, Detroit, MI）, 1%の
Bacto^TM 酵母抽出物（Difco Laboratories）, 0.004%のアデニン及び0.006％の
L−ロイシン）である。

【０１６１】 本発明のポリペプチドを80％以上の純度、より好ましくは90％以上の純度、さ
らに好ましくは95％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子
、特に他のタンパク質及び核酸に対して、99.9％以上の純度であり、そして感染
性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精
製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチド
を実質的に有さない。

【０１６２】 発現された組換え体zfsta4ポリペプチド（又はキメラzfsta4ポリペプチド）は
、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニ
ウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用され
る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高
性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、
誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、
特別なシリカ及び同様のものを包含する。

【０１６３】 PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好ましい。典型的なクロマトグラフィー用媒体
は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニ
ル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl ブチル650（Toso Haas, Montgomeryvi
lle, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharmacia)及び同様のもの；又はポリアク
リル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。

【０１６４】 適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、ア
ガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋され
たポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様の
ものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリ
ル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能に
する反応性基より変性され得る。カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性
化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル
活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミドカップリング化学物質のためのカ
ルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。

【０１６５】 それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使
用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受
容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特
定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部
決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharma
cia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。

【０１６６】 本発明のポリペプチドは、結合された標識又はエピトープの物理的な性質の活
用により単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグ
ラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含
んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば
、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される( Sulkow
ski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。ヒスチジンに富んでいるタンパク質
が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリック
スに吸着され、そして競争溶出、ｐHの低下、又は強いキレート化剤の使用によ
り溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及
びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を
包含する（Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification
”, M. Deutscher, ( ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529−39）。

【０１６７】 本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（
例えばマルトース−結合タンパク質、FLAG標識、Glu-Gku標識、免疫グロブリン
ドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。N−末端又はC−末
端親和性標識を有するタンパク質構造体の典型的な精製方法は、当業界において
知られているクロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製するために、親和性
標識エピトープに対する抗体の使用を包含する。SDS−PAGE、ウェスターン分析
、アミノ酸分析及びN−末端配列決定が、精製されたタンパク質の同一性を確認
するために行われ得る。

【０１６８】 タンパク質再生（及び任意には、再酸化）方法が好都合には、使用され得る。
タンパク質を８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ま
しくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に
他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性
及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製
されたタンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的
に有さない。

【０１６９】 zfsta4を結合するタンパク質/ポリペプチド（例えば、zfsta4−結合受容体）
がまた、zfsta4の精製のためにも使用され得る。zfsta4−結合タンパク質/ポリ
ペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、
セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルア
ミド、又は使用の条件下で安定する同様の材料のビーズ上に同定される。固体支
持体にポリペプチドを連結するための方法は、当業界において知られており、そ
してアミン化学、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エ
ポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。

【０１７０】 得られる媒体は一般的に、カラムの形で形成され、そしてzfsta4ポリペプチド
を含む流体がカラムを通して１又は複数回、通され、リガンド−結合又は受容体
ポリペプチドへのzfsta4ポリペプチドの結合を可能にされる。次に結合されたzf
sta4ポリペプチドは、塩濃度、カオトロピック（グアニジンHCl）、又はpHの変
化を用いて溶解され、リガンド−受容体結合が破壊される。

【０１７１】 さらに、当業界において記載される方法に従って、ポリペプチド融合又はハイ
ブリッドzfsta4タンパク質が、他のタンパク質、特に他のフォリスタチンファミ
リータンパク質（例えば、FRP、SPARC、アグリン又はヘビン）、又は異種タンパ
ク質と組合して、本発明のzfsta4の領域又はドメインを用いて構成される（Samb
rook など., 前記；Altschul など., 前記；Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 5
11-5, 1994及びそれらにおける引例）。それらの方法は、興味あるポリペプチド
における大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのよ
うなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡
張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在せいを変更し、そして未知の構造の
ポリペプチドに適用される。

【０１７２】 融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれら
を化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得
る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードす
るポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載さ
れる方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部
又はすべてが、本発明のzfsta4と、もう１つのファミリーメンバー、例えばFRP
からのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。

【０１７３】 そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されな
い：分泌シグナル配列、フォリスタチン相同ドメイン、カルモジュリン相同ドメ
イン、I−組IGドメイン＃１及び＃２、N又はC−末端ドメイン及びαヘリックス
リンカー。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明
のポリペプチド又は本明細書に記載される他の既知のフォリスタチンファミリー
のタンパク質と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予
測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように
、他の性質も示すことができる。

【０１７４】 zfsta4ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成により調製され
得る。zfsta4ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり；グリコシル化され
ても又はグリコシル化されなくても良く；ペギレート化されても又はペギレート
化されなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を包含しても又はしな
くても良い。ポリペプチド、特に本発明のポリペプチドはまた、Merrifield, J.
Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963, Stewartなど., “Sold Phase Peptide Synth
esis” (2^nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984), Bayer &
Rapp Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986, 及びAtherton など., Solid Phase Pepti
de Synthesis: A Practical APProach, IRL Press, Oxford, 1989により記載の
ようにしても合成され得る。

【０１７５】 上記のように、開示されるポリペプチドは、zfsta4 変異体及びzfsta4 の機能
的フラグメントを構成するために使用され得る。そのような変異体及び細胞外ド
メインは、zfsta4 アゴニストであると思われる。もう1つの型のzfsta4 アゴニ
ストは、zfsta4 の細胞外ドメインを模倣する、抗−イディオタイプ抗体及びそ
のフラグメントにより提供される。さらに、zfsta4 細胞外ドメインを模倣する
抗−イディオタイプ可変ドメインを含んで成る組換え抗体がアゴニストとして使
用され得る（例えば、Monfardini など., Proc. Assoc. Am. Physidians 108: 4
20, 1996を参照のこと）。

【０１７６】 zfsta4 アゴニストはまた、結合ライブラリーを用いても構成され得る。ファ
ージ表示及び他の結合ライブラリーを構成し、そしてスクリーニングするための
方法は、例えばKeyなど., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic
Press 1996), Verdine, アメリカ特許第5,783,384号、Key, など., アメリカ特
許第5,7477,334号及びKauffmanなど., アメリカ特許第5,723,323号により提供さ
れる。

【０１７７】 本発明はまた、zfsta4 ポリペプチドに結合するか、又はzfsta4 ポリペプチド
が結合し、それによりzfsta4の機能を阻害し、又は排除する受容体に結合するア
ンタゴニストも提供する。そのようなzfsta4 アンタゴニストは、抗体；zfsta4
ポリペプチド又はその受容体のいずれかに結合するオリゴヌクレオチド；受容体
を結合する能力を保持するが、しかしリガンド又は受容体シグナル化のいずれも
もたらさないzfsta4ポリペプチドの天然又は合成類似体を包含する。そのような
類似体は、ペプチド又はペプチド様化合物であり得る。zfsta4 ポリペプチドの
受容体に結合し、そしてシグナル化を妨げる天然又は合成の小分子もまた、アン
タゴニストとして企画される。それ自体、zfsta4 アンタゴニストは、zfsta4リ
ガンド又は受容体のいずれかからのシグナルの阻止が有益である一定の疾病を処
理するための治療剤として有用であろう。

【０１７８】 zfsta4はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するために
も使用され得る。試験化合物は、zfsta4の活性を阻害する化合物を同定するため
に、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれら
のアッセイの他に、サンプルが、受容体結合又はzfsta4−依存性細胞応答の刺激
／阻害を測定するよう企画された種々のアッセイにより、zfsta4活性の阻害につ
いて試験され得る。例えばzfsta4−応答性細胞系は、zfsta4−刺激された細胞経
路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る。

【０１７９】 このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そし
て一般的に、アッセイできるタンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺
伝子に作用可能に連結されるzfsta4−DNA応答要素を含むであろう。DNA応答要素
は、サイクリックAMP応答要素（CRE）、ホルモン応答要素（HRE）、インスリン
応答要素（IRE）（Nasrin など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273−7, 1
990）及び血清応答要素（SRE）（Shaw など., Cell 56: 563−72, 1989）を包含
するが、但しそれらだけには限定されない。サイクリックAMP応答要素は、Roest
ler など., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063−6, 1988及びHabener, Molec. End
ocrinol. 4 (8): 1087−94, 1990に再考される。

【０１８０】 ホルモン応答要素は、Beato, Cell 56: 335−44l, 1989に再考される。候補体
化合物、溶液、混合物又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のzfsta4刺激の低下
により明らかなように、標的細胞に対するzfsta4の活性を阻害する能力について
試験される。このタイプのアッセイは、細胞表面受容体に結合するzfsta4を直接
的にブロックする化合物、及びレポーターリガンド結合に続く細胞経路における
工程をブロックする化合物を検出するであろう。

【０１８１】 他方では、化合物又は他のサンプルが、検出できるラベル（例えば¹²⁵I、 ビ
オチン、ホースラディシュ ペルオキシダーゼ、FITC、及び同様のもの）により
標識されるzfsta4を用いて、受容体へのzfsta4結合の直接的なブロッキングにつ
いて試験され得る。このタイプのアッセイにおいては、受容体へのラベルされた
zfsta4の結合を阻害する試験サンプルの能力は、二次アッセイを通して確かめら
れ得る阻害活性の表示である。結合アッセイ内に使用される受容体は、細胞受容
体、又は単離され、固定された受容体であり得る。

【０１８２】 本発明はまた、単離され、そして精製されたzfsta4ポリヌクレオチド プロー
ブ及び／又はプライマーを提供する。前記プローブ及び／又はプライマーは、RN
A又はDNAである得る。DNAは、cDNA又はゲノムDNAのいずれかであり得る。ポリヌ
クレオチド プローブ及びプライマーは、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA、一般
的には合成オリゴヌクレオチドであるが、しかしクローン化されたｃDNA又はゲ
ノム配列又はその補体から生成され得る。

【０１８３】 分析用プローブは一般的には、少なくとも20個のヌクレオチドであるが、とこ
ろが幾分短いプローブ(14−１７個のヌクレオチド)が、使用され得る。PCRプラ
イマーは、少なくとも5個の長さのヌクレオチド、好ましくは15個又はそれ以上
のｎｔ、より好ましくは20−30個のｎｔである。より短いポリヌクレオチドプロ
ーブが、遺伝子の小さな領域が分析のために標的化される場合、使用され得る。
遺伝子の全体の分析に関しては、ポリヌクレオチドプローブは、全エキソン又は
それ以上のものを含んで成る。

【０１８４】 そのようなプローブはまた、サンプル中のzfsta4遺伝子又はｍＲＮＡ転写体の
存在を検出し、又はその量を定量化するためにハイブリダイゼーションにおいて
使用され得る。zfsta4ポリヌクレオチド プローブは、蛍光現場ハイブリダイゼ
ーション（FISH）又は免疫組織化学のような技法を用いて、診断目的のためにDN
A又はRNA標的物にハイブリダイズするために使用され得る。ポリヌクレオチド
プローブは、zfsta4−様タンパク質をコードする遺伝子を同定するために使用さ
れ得る。そのようなプローブはまた、関連するzfsta4配列のためのライブラリー
をスクリーンするためにも使用され得る。

【０１８５】 そのようなスクリーニングは、プローブ配列に対して、実質的に相同であるが
、しかし完全な相同性を必要としない配列の同定を可能にする低い緊縮条件下で
実施される。そのような方法及び条件は、当業界において良く知られており、た
とえば、Sambrook など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor, NY,1989 を参照のこと。そのような緊縮条件は
、本明細書に記載される。ライブラリーは、ゲノムDNA又はDNAから製造され得る
。ポリヌクレオチド プローブはまた、サザン、ノザン、又はスロット ブロッ
ト、コロニー及びプラーク ハイブリダイゼーション及び現場ハイブリダイゼー
ションのためにも有用である。感度、又は低コピー数の標的物の検出を、スクリ
ーニングシステムにおいて高める、異なったzfsta4ポリヌクレオチドプローブの
混合物が調製され得る。

【０１８６】 核酸分子は、生物学的サンプルにおけるzfsta4遺伝子の発現を検出するために
使用され得る。基本的アッセイにおいては、一本鎖プローブ分子が、プローブと
標的zfsta4 RNA種との間の塩基対合を促進する、温度及びイオン強度の条件下で
、生物学的サンプルから単離されたRNAと共にインキュベートされる。末結合の
プローブをハイブリダイズされた分子から分離した後、ハイブリッドの量が検出
される。

【０１８７】 生物学的サンプルにおけるzfsta4 RNAの存在を検出するための方法が促進され
、ここで前記方法は、 ａ）緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、zfsta4核酸プローブと、 ｉ）生物学的サンプルから単離された試験RNA分子、又は ii）前記単離されたRNA分子から合成された核酸分子のいずれかとを接触せし
め、ここで前記プローブは配列番号１又は３、又はそれらの補体のヌクレオチド
配列の一部を含んで成るヌクレオチド配列を有し、そして ｂ）前記核酸プローブ及び前記試験RNA分子又は合成された核酸分子のいずれ
かのハイブリッドの形成を検出することを含んで成り、 ここで前記ハイブリッドの存在が生物学的サンプルいおけるzfsta4 RNAの存在
を示す。

【０１８８】 RNA検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法は、ノザン分析及び
ドット/スロット ブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、Ausub
el 前記、p４−１〜４−27、及びWuなど. (eds.)、”Analysis of Gene Express
ion at the RNA Level”, in Methods in Gene Biotechnology, p. 225-39, CRC
Press, Inc., 1997を参照のこと）。核酸プローブは、放射性同位体、例えば³² P又は³⁵Sにより検出できるようラベルされ得る。他方では、zfsta4 RNAは、非放
射性ハイブリダイゼーション方法により検出され得る（例えば、Isaac (ed.), P
rotocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Pres
s, Inc., 1993を参照のこと）。典型的には、非放射能性検出は、クロモゲン又
は化学ルミネセンス基質の酵素転換により達成される。例示的な非放射性成分は
、ビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニンを包含する。

【０１８９】 zfsta4 オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断のためにも有用で
ある。例示として、¹⁶F−ラベルされたオリゴヌクレオチドが対象に投与され、
そして陽電子射出断層撮影法により可視可され得る（Tavitian など., Nat. Med
. 4: 467, 1998）。

【０１９０】 多くの診断方法は、検出方法の感度を高めるために、ポリメラーゼ鎖反応（PC
R）を利用する。PCRを実施するための標準技法は良く知られている（一般的には
、Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc
., 1991; White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications, H
umana Press, Inc., 1993; Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer, Hu
mana Press, Inc., 1996; Hanausek and Walaszed (eds.), Tumor Marker Proto
cols, Humana Press, Inc., 1998; Lo (ed.), Clinical Applications of PCR,
Humana Press, Inc., 1998及びMeltzer (ed.), PCR in Bioanalysis, Humana Pr
ess, Inc., 1998を参照のこと）。PCRプライマーは、特定のzfsta4領域、例えば
配列番号１のヌクレオチド298 -505 によりコードされるフォリスタチン相同ド
メイン、及び配列番号１のヌクレオチド635 -856 によりコードされるカルモジ
ュリンをコードする配列を増幅するよう企画され得る。

【０１９１】 診断アッセイについてのPCRの１つの変法は、逆転写酵素−PCR（RT−PCR）で
ある。RT−PCR技法においては、RNAが生物学的サンプルから単離され、cDNAに逆
転写され、そしてそのcDNAがzfsta4プライマーと共にインキュベートされる（例
えば、Wuなど. (eds.), “Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR
”, in Methods in Gene Biotechnology, P. 15-28, CRC Press, Inc. 1997を参
照のこと）。次に、PCRが行われ、そして生成物が標準技法を用いて分析される
。

【０１９２】 例示のように、RNAは、例えば上記グアニジニウム−チオシアネート細胞溶解
を用いて、生物学的サンプルから単離される。他方では、固相技法が、細胞溶解
物からmRNAを単離するために使用され得る。逆転写反応は、ランダムオリゴヌク
レオチド、dTの短いホモポリマー、又はzfsta4アンチセンスオリゴマーを用いて
、単離されたRNAにより感作され得る。オリゴ−dTプライマーは、対照の標的配
列を提供することができる種々のmRNAヌクレオチド配列が増幅される利点を提供
する。zfsta4 配列は、典型的には20個の長さの塩基である２種のフランキング
オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により増幅される。

【０１９３】 PCR増幅方法は、種々のアプローチを用いて検出され得る。例えば、PCR生成物
は、ゲル電気泳動により分別され、そして臭化エチジウム染色により可視化され
る。他方では、分別されたPCR生成物は、膜に移行され、検出できるようにラベ
ルされたzfsta4プローブによりハイブリダイズされ、そしてオートラジオグラフ
ィーにより試験され得る。追加の他のアプローチは、化学ルミネセンス検出及び
C−TRAK比色アッセイを提供するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデ
オキシリボ核酸三ミリ酸の使用を包含する。

【０１９４】 もう1つのアプローチは、同時定量的PCRである（Perkin-Elmer Cetus, Norwal
k, CT)。結合されるレポーター及び消光剤色素の両者と共にオリゴヌクレオチド
から成る蛍光源プローブは、前方向及び逆方向プライマー間で特異的にアニーリ
ングする。Taq DNA ポリメラーゼの5’側エンドヌクレアーゼ活性を用いる場合
、レポーター色素は消光剤色素から分離され、そして配列−特異的シグナルが生
成され、そして増幅の上昇と共にそれは上昇する。蛍光強度は、PCR反応の間、
連続してモニターされ、そして定量化され得る。

【０１９５】 zfsta4発現の検出のためのもう1つのアプローチは、サイクリングプローブ技
法（CDT）であり、ここで一本鎖DNA標的物が過剰のDNA−RNA−DNAキメラプロー
ブと結合し、複合体を形成し、RNA部分がRNアーゼHにより分化され、そして分解
されたプローブの存在が検出される（例えば、Beggsなど., J. Clin. Microbiol
. 34: 2985, 1996, 及び Bekkuouiなど., Biotechniques 20: 240, 1996を参照
のこと）。zfsta4配列番号の検出のための他の方法は、核酸配列に基づく増幅（
NASBA）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（CATCH）及びリガ
ーゼ鎖反応（LCR）のようなアプローチを利用することができる（例えば、Marsh
allなど., アメリカ特許第5,686,272号（1997）、Dyerなど., J. Virol. Method
s 60: 161, 1996; Ehrichtなど., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997; 及びChad
wickなど., J. Viro. Methods 70:59, 1998を参照のこと）。他の標準方法も当
業者に知られている。

【０１９６】 zfsta4 プローブ及びプライマーはまた、組織サンプルにおけるzfsta4 遺伝子
発現を検出し、そして位置決定するためにも使用され得る。そのような現場ハイ
ブリダイゼーションのための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Choo
(ed.), In situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; We な
ど. (eds.), “Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioacti
ve In Situ Hybridization (RISH), “ in Methods in Gene Biotechnology, pa
ges 259-278, CRC Press, Inc., 1997; 及びWuなど. (eds.), “Localizaion of
DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH),
” in Methods in Gene Biotechnology, pages 279-289, CRC Press, Inc., 199
7を参照のこと）。

【０１９７】 種々の追加の診断アプローチも当業者に良く知られている（例えば、Mathew (
ed.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; C
oleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996;
及びElles, molecular Diagnosis of Genetics Diseases, Humana Press Inc.,
1996を参照のこと）。

【０１９８】 リガンド−結合受容体(又は抗体、補体／抗補体対の１つのメンバー)、又はそ
の結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（BIAcore, Pharmacia Bio
sensor, Piscataway, NJ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され
得る。そのような受容体、抗体、相補体／抗相補体対のメンバー、又はフラグメ
ントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Karlsson, J.
Immunol. Methods 145: 229−40, 1991 及びCunningham and Wells, J. Mol.Bi
ol. 234: 554−63,1993により開示される。受容体、抗体、メンバー又はフラグ
メントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに
結合されるデキストラン繊維に共有結合される。

【０１９９】 試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は補体／抗補体対の
反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体
、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として
検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオ
フ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化
学量の評価が可能にされる。

【０２００】 リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のア
ッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定
のためのスカチャード分析（Scatchard, Ann. NY. Acad. Sci. 51:660−72, 194
9）及び熱量測定アッセイ（Cunningham など., Science 253: 545−48, 1991;Cu
nningham など., Science 245: 821−25, 1991）を包含する。

【０２０１】 ゲノム走査は、染色体５上でのzfsta4を定める。本明細書に開示される配列か
ら生成されるプローブ及びプライマーは、ヒト染色体５にzfsta4遺伝子をマッピ
ングするために使用される。放射腺ハイブリッドマッピングは、哺乳類染色体の
高い解像度の連続地図を構成するために開発された体細胞遺伝子技法である（Co
xなど., Science 250; 245-50, 1990）。遺伝子配列の部分的又は完全な知識は
、染色体放射線ハイブリッドマッピングパネルによる使用のために適切なPCRプ
ライマーの企画を可能にする。完全なヒトゲノムをカバーする放射線ハイブリッ
ドマッピングパネル、例えばStanford G3 RHパネル及びGeneBridge 4 RHパネル
は市販されている（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL）。

【０２０２】 それらのパネルは、遺伝子、配列−標識された部位（STS）、及び興味ある領
域内の他の非多型現象及び多型現象マーカーの急速な、PCRに基づく染色体位置
決定及び整列を可能にする。これは、興味ある新しく発見された遺伝子と前にマ
ッピングされたマーカーとの間を直接的に比例する物理的距離の確立を包含する
。遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）
配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばYA
C, BAC又はcDNAクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体
領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３
）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照
。

【０２０３】 配列標識された部位（STS）はまた、染色体位置決定のために独立的に使用さ
れる。STSは、ヒトゲノムにおいてユニークであるDNA配列であり、そして特定の
染色体又は染色体の領域のための参照点として使用され得る。STSは、すべての
他のゲノム配列の存在下でこの部位を特異的に検出するためにポリメラーゼ鎖反
応に使用される一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより定義される。STSは
、DNA配列に単独で基づかれているので、それらは電子データベース、例えばDat
abase of Sequence Tagged Sites (dbSTS)、GenBank (National Center for Bio
logical Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD,http://
www.ncbi.nlm.nih.gov)内に完全に記載され得、そしてそれらの短いゲノムラン
ドマークSTS配列内に含まれるマッピングデータにより、興味ある遺伝子配列を
調べられ得る。

【０２０４】 本発明はまた、診断用途のためへのそのような染色体位置決定の使用も企画す
る。手短には、zfsta4遺伝子、すなわちzfsta4 DNA, 又はその副配列を含んで成
るプローブは、そのzfsta4遺伝子がヒト染色体４上に存在するか、又は突然変異
が生じたかどうかを決定するために使用され得る。zfsta4 遺伝子座での検出で
きる染色体異常型は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
異数体、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化及び転位。そのよ
うな異数体は、分子遺伝子技法、例えば制限フラグメントの長さの多型現象（RF
LP）分析、PCR技法を用いての短いタンデム反復体（STR）分析、及び当業界にお
いて知られている他の遺伝子連鎖分析技法を使用することにより、本発明のポリ
ヌクレオチドを用いて検出され得る（Sambrook など., 前記。；Ausubel など.,
前記；Marian, Chest 108: 255-65, 1995）。

【０２０５】 一般的に、それらの診断方法は、 （ａ）患者から遺伝的サンプルを獲得し； （ｂ）前記遺伝的サンプルと、上記で開示されたようなポリヌクレオチド プ
ローブ又はプライマーとを、前記ポリヌクレオチドが第１反応生成物を生成する
ために、相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう条件下で
、インキュベートし；そして （ｃ）前記第１反応生成物と対照反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、患者における遺伝子異常性の
表示である。 本発明に使用するための遺伝的サンプルは、ゲノムDNA，cDNA，及びRNAを包含
する。

【０２０６】 ポリヌクレオチド プローブ又はプライマーは、RNA又はDNAであり得、そして
配列番号１の一部、配列番号１の補体、又はそれらのＲＮＡ相等物を含んで成る
であろう。これに関する適切なアッセイ方法は、当業界において知られている分
子遺伝学技法、たとえば制限フラグメント長さ多型現象（RFLP）分析、PCR技法
を用いる短いタンデム反復体（STR）分析、連結鎖反応（Barany, PCR Methods a
nd Applications 1; 5-16, 1991）、リボヌクレオチド保護アッセイ、及び当業
界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法（Sambrook など., 前記；Ausu
bel ., 前記；Marian, Chest : 255-65, 1995）を包含する。

【０２０７】 リボヌクレアーゼ保護アッセイ（たとえば、Ausubel など., 前記, ch. 4）は
、患者のRNAサンプルへのRNAプローブのハイブリダイゼーションを包含し、この
後、反応生成物（RNA−RNAハイブリッド）がRNアーゼに暴露される。RNAのハイ
ブリダイズされた領域が、消化から保護される。RCRアッセイにおいては、患者
の遺伝的サンプルが、1対のポリヌクレオチド プライマーと共にインキュベー
トされ、そしてプライマー間の領域が増幅され、そして回収される。回収された
生成物のサイズ又は量の変化が、患者における突然変異の表示である。使用され
得るもう１つのPCRに基づく技法は、単鎖コンホメ-ション多型現象（SSCP）分析
（Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 1991）である。

【０２０８】 本発明はまた、抗−zfsta4抗体も提供する。zfsta4に対する抗体は、抗原とし
て、zfsta4発現ベクターの生成物又は天然源から単離されたzfsta4を用いて得ら
れる。特に有用な抗−zfsta4抗体は、zfsta4を“特異的に結合する”。抗体が、
10⁶M^-1又はそれ以上、好ましくは10⁷M^-1又は又はそれ以上、より好ましくは10⁸M ^-1 又はそれ以上及び最も好ましくは10⁹M^-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴
って、zfsta4ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、抗体は特
異的に結合すると思われる。

【０２０９】 抗体の結合親和性は、当業者により、例えばScatchard分析（Scatchard, Ann.
NY Acad. Sci. 51: 660, 1949）により容易に決定され得る。適切な抗体は、特
定のドメイン、例えばzfsta4フォリスタチン相同ドメイン（配列番号２のアミノ
酸残基65〜約133）、カルモジュリン相同ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基1
75〜250にほぼ位置する）、又はI−組 IGドメイン＃１又は＃２（配列番号２の
アミノ酸残基251〜334及び配列番号２のアミノ酸残基335〜432にほぼ位置する）
におけるzfsta4と結合する抗体を包含する。

【０２１０】 抗−zfsta4抗体は、抗原性zfsta4エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチ
ドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリ
ペプチドは、配列番号２内に含まれる、少なくとも９個、好ましくは15〜約30個
のアミノ酸の配列を含む。しかしながら、30〜50個のアミノ酸、又は本発明のポ
リペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのアミノ酸を含む、本発明の
アミノ酸配列の大部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、zfsta4を
結合する抗体を誘発するのに有用である。エピトープ担持のペプチドのアミノ酸
配列は、水性溶媒における実質的な溶解性を提供するよう選択されることが所望
される（すなわち、前記配列は比較的親水性の残基を含み、そして疎水性残基は
好ましくは、回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列がまた、
抗体生成のために所望される。

【０２１１】 組換えzfsta4タンパク質、又は天然源から単離されたzfsta4に対するポリクロ
ーナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。例えば、
Green など., “Production of polyclonal Antisera,” in Immunochemical Pr
otecols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 及びWilliams など.
, “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and
purification of specific polyclonal antibodies,” in DNA Cloning 2: Expr
ession Systems, 2^nd Edition, Glover など., (eds.), page 15 (Oxford Unive
rsity press 1995を参照のこと。

【０２１２】 zfsta4ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化
アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高め
られ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例え
ばzfsta4又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タン
パク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はそ
の一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのよう
な部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモ
シアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に結合さ
れるか又は連結され得る。

【０２１３】 ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マ
ウス、ウサギ、ハムスター、テンジュクネズミ、ヤギ又は羊において生ぜしめら
れるが、本発明の抗−zfsta4抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得
る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な
技法は、例えばGoldenbergなど., 国際特許出願番号WO91/11465号及びLosmanな
ど., Int. J. Cancer 46: 310, 1990に見出され得る。抗体はまた、トランスジ
ェニック動物、例えばトランスジェニック羊、牛、ヤギ又はブタにおいて生ぜし
められ得る、そして変性された形で、酵母及び菌類において、及び哺乳類及び昆
虫細胞において発現され得る。

【０２１４】 他方では、モノクローナル抗−zfsta4抗体が生成され得る。特定抗原に対する
囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例
えば、Kohler など., Nature 256: 495 (1975), Coliga など., (eds.), Curren
t Protocols in Immunology, Vol. 1, page 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1
991), Picksley など., “Production of monoclonal antibodies against prot
eins expressed in E. coli,” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2^nd E
dition, Glover など. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995を参照
のこと)。

【０２１５】 手短には、モノクローナル抗体は、zfsta4遺伝子生成物を含んで成る組成物を
マウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、
B−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記
リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に
対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクロ
ーンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる
。

【０２１６】 さらに、本発明の抗−zfsta4抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得
る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成する
よう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、
ヒトH鎖及びL鎖遺伝子座の要素が、内因性H鎖及びL鎖遺伝子座の標的化された破
壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマ
ウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記
マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トラ
ンスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Greenなど., Nat. Gen
et. 7: 13, 1994, Lonberg など., Nature 368: 856, 1994, 及びTaylorなど.,
Inc. Immun. 6: 576, 1994により記載される。

【０２１７】 モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ
培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン
−Aセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフ
ィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Coligan, page 2.
7.1-2.7.12及びpage 2.9.1^2.9.3; Bainesなど.,” Purification of Imunoglob
ulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, vol, 10, p. 79-104 (The Hu
mana Press, Inc. 1992) を参照のこと）。

【０２１８】 特定の用途に関しては、抗−zfsta4抗体のフラグメントを調製することが所望
される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解によ
り得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又は
パパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、F(ab’)₂と
して示される５Sフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解
により生成され得る。このフラグメントはさらに、3.5S Fab’ 単価フラグメン
トを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。

【０２１９】 任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリ
ル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシン
を用いての酸素分解が２種の単位Fabフラグメント及びFcフラグメントを直接的
に生成する。それらの方法は、例えば、Goldenberg, アメリカ特許第4,331,647
号、Nisonoff など., Arcg Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Bioche
m. J. 73: 119, 1959, Edelman など., in Methods in Enzymology vol. 1, p.
422 (Academic Press 1967), 及びColigan, 前記により記載される。

【０２２０】 抗体を分解する他の方法、例えば単価L−H鎖フラグメントを形成するためへの
H鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技
法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結
合する限り、使用され得る。 例えば、Fvフラグメントは、V_H及びV_L鎖の会合を含んで成る。この会合は、In
bar など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972により記載のように、
非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結
され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例え
ば、Sandhu, Crit. Rew. Biotech. 12: 437, 1992を参照のこと）。

【０２２１】 Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるV_H及びV_L鎖を含んで成
る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドにより
連結されるV_H及びV_LドメインをコードするDNA配列を含んで成る構造遺伝子を構
成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばE.コ
リ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のVド
メインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ScFv
を生成するための方法は、例えばWhitlow など., Methods: A Companion to Met
heds in Enzymology 2:97, 1991により記載される。Bird など., Science 242:4
23, 1988, Ladner など., アメリカ特許第4,946,778号、Packなど., Bio/Techno
logy 11: 1271, 1993及びSandhu, 前記も参照のこと。

【０２２２】 例示のように、scFvは、インビトロで、zfsta4ポリペプチドにリンパ球を暴露
し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択
すること（例えば、固定された又はラベルされたzfsta4タンパク質又はペプチド
の作用を通して）によって得られる。可能性あるzfsta4ポリペプチド結合ドメイ
ンを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は
細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリー
ニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチ
ド合成を通して得られる。

【０２２３】 それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチド
であり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子
、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために
使用され得る。そのようなランダム ペプチド表示ライブラリーを創造し、そし
てスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladner な
ど., アメリカ特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778
号；Ladner など., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特
許第5,571,698 号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins
(Academic Press, Inc. 1996)）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及
びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClonte
ch (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs
, Inc. (Beverly, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, M
J) から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、zfsta4に結合
するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるzfsta4配列を用いてス
クリーンされ得る。

【０２２４】 抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性−決定領域（CDR）をコー
ドするペプチドである。CDRペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のD
CRをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、
例えば抗体−生成細胞のRNAから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応
を用いることによって調製される（例えば、Larrick など., Methods: A Compan
ion to Methods in Enzymology 2:106, (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Ma
nipulation of Monoclonal Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Product
ion, Engineering and Clinical Application, Ritter など., (eds.), page 16
6 (Cambridge University Press 1995), 及びWard など., “Genetic Manipulat
ion and Expression of Antibodies,” in Monoclonal Antibodies: Principles
and Applications, Birch など., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)
を参照のこと）。

【０２２５】 他方では、抗−zfsta4抗体は、“ヒト型化された”モノクローナル抗体から誘
導され得る。ヒト型化されたモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンH及
びL可変鎖からのマウス相補的決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行すること
により生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ相対物の骨格領域に
おいて置換される。ヒト型化されたモノクローナル抗体に由来する抗体成分の使
用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。ネズミ
免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、
Orlandiなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989により記載される
。

【０２２６】 ヒト型化されたモノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Jones
など., Nature 321:522, 1986, Carter など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rey. Biotech. 12: 437, 1992, Singer など., J
. Tmmun. 150: 2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (
Humana Press, Inc. 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,
” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland など. (eds.)
, pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 及びQueen など., アメリ
カ特許第5,693,762号（1997）により記載される。

【０２２７】 ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準技法を用いて、抗−zfsta4抗
体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することにより調製され得る。例え
ば、Greenなど., “Production of Ployclonal Antisera” in Methods in Mole
cular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), P. 1-2 (Humana Pr
ess 1992) を参照のこと。また、Coligan, 前記、p.2.4.1-2.4.7も参照のこと。

【０２２８】 他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗
−zfsta4抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。もう1
つの方法として、ヒト型化された抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類
抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイ
プ抗体を調製するための方法は、例えばIrie, アメリカ特許第5,208,146号, Gre
eneなど., アメリカ特許第5,637,677号、及びVarthakovi and Minocha, J. Gen.
Virol 77: 1875, 1996により記載される。

【０２２９】 本明細書に記載される抗体又はポリペプチドはまた、薬物、トキシン、放射性
核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体
はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。例えば、本発明のポリペプ
チド又は抗体は、対応する抗−相補的分子（例えば、それぞれインテグリン又は
抗原）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。よ
り特定には、zfsta4ポリペプチド又は抗−zfsta4抗体、又はその生物活性フラグ
メント又は一部は、検出可能又は細胞毒性分子に結合され、そして抗−相補的分
子を発現する、細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。

【０２３０】 適切な検出可能分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合さ
れ得、そして放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、
化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子
は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は
植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリ
ン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばI−131、レニウム−188又
はイットニウム−90（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ
−ト成分により間接的に結合される）を包含する。

【０２３１】 ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合
され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は
細胞毒性分子は相補的/抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメ
ンバーはポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビ
オチン/ストレプタビジンが典型的な相補的/抗相補的対である。 zfsta4ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子として使用され得る。zfsta4ポ
リヌクレオチドは、興味ある遺伝子により同時トランスフェクトされる。上記の
ような検出可能分子は、トランスフェクション成功のインジケーターとしての同
時トランスフェクトされたzfsta4の発現を検出するために使用される。

【０２３２】 zfsta4 mRNAの発現は、主として脳、腎臓、膵臓、副腎、前立腺及び精巣に制
限され、そして低レベルの発現が広範囲の種類の他の組織において見出される。
これは、フォリスタチン遺伝子転写体及び多くの他のフォリスタチンファミリー
メンバーの転写体の報告される分布と一致する。この分布は、zfsta4がCNS内で
のニューロンの再生及び修復において役割を演じることができることを示す。成
人哺乳類脳又は脊髄に対する損傷は、炎症、星状細胞の増幅、脈管形成、及びグ
リア−中胚葉性瘢痕の形成を導く一連の細胞現象を生成する（Loganなど., Brai
n Res. 587: 216-25, 1992; Wangなど., Res. Bull. 36: 607-9, 1995及びLindh
olmなど., J. Cell. Biol. 117: 395-400, 1992）。

【０２３３】 CNS内での瘢痕組織の生成は、ニューロンの再生のための物理的バリャーを提
供し、そして損傷の後、回復する成人CASの能力を制限すると思われる。CNSにお
ける瘢痕組織形成は、末梢における瘢痕組織形成のために見出されるものに類似
する、細胞外マトリックス成分の局在化されたTGF−β刺激された生成に依存す
ると思われる。実際、TGF−β mRNA及びタンパク質はCNSにおける損傷の部位で
星状細胞側に局在化されており（Loganなど., 前記、Wongなど., 前記、及びLin
dholmなど., 前記）、このことは、フォリスタチンファミリーメンバー、例えば
zfsta4がニューロン再生及びTGF−βを配列決定することによる新規シナプス接
触の確立を促進することを示唆する。

【０２３４】 SC1、すなわちフォリスタチンファミリーのメンバーは、損傷の後、脳星状細
胞において発現され（Mendisなど., Brain Res. 730: 95-106, 1996）、そして
フォリスタチン関連タンパク質（FRP）は培養物においてグリオーム細胞により
分泌される（Zwijsenなど., J. Biochem. 225: 937-46, 1994）。

【０２３５】 TGFβを封鎖し、そしてニューロン再生を刺激することができるタンパク質は
、脊髄及び知覚軸索生長性を高めることによって末梢神経障害の処理において有
用である。そのようなポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストは、発作に
続く軸索生長、頭部外傷により引き起こされる脳損傷及び脊髄損傷により引き起
こされる麻痺を再生するための治療処理に包含され得る。神経変性患者、例えば
アルツハイマー病、パーキンソン病及び多発性硬化症において、ニューロン生長
を刺激することによる処理にも使用され得る。追加の用途は、多発性硬化症の損
傷において共通する断裂され軸索の修復を包含する。

【０２３６】 zfsta4ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストは、脳及び脊髄損傷
の処理のために治療的に有用である。本発明のzfsta4ポリペプチド、アゴニスト
又はアンタゴニストにおけるこの能力の存在を確かめるために、そのようなzfst
a4ポリペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストは、ニューロン再生を刺激する
それらの能力及び新規シナプス接触を確立するそれらの能力に関して、当業界に
おいて知られている方法に従って評価される。

【０２３７】 例えば、Mendisなど., Brain Res. 730: 95-106, 1996; Lindholmなど., J. C
ell Biol. 117: 395-400, 1992; 及びLoganなど., Brain Res. 587: 216-25, 19
92を参照のこと。所望には、これに関するzfsta4ポリペプチド性能が、他のフォ
リスタチン、例えばSC１及びFRP、並びに同様のものに比較され得る。さらに、z
fsta4ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストは、相乗効果を同定す
るために、１又は複数のフォリスタチンと組合して評価され得る。所望には、こ
れに関するzfsta4の性能は、他の抗−炎症性化合物、例えばデキサメタゾン及び
ヒドロコルチゾン、並びに同様のものに比較され得る。

【０２３８】 CNSに対する損傷の処理におけるその可能性ある役割の他に、zfsta4はまた、
宿主防御においても役割を有することができる。ヒト骨髄支質細胞は、抗−アク
チビンA抗体と反応することが示されており、そしてB_A−サブユニットmRNAの生
成が、多くの前−炎症性サイトカイン/レギュレーター、例えばインターロイキ
ン１α、リポ多糖、腫瘍壊死因子−α又は12−O−テトラデカノイルホルボール1
3−アセテートによりそれらの細胞において高められる（Shaoなど., Cytokine 1
0: 227-35, 1998）。それらの剤の刺激効果とは対照的に、抗−炎症化合物デキ
サメタゾン及びヒドロコルチゾンは、アクチビンB_A−mRNAの構成的及びサイトカ
イン−刺激された発現を阻害した（Shaoなど., 前記）。

【０２３９】 本発明のポリペプチドは、炎症性応答を阻害し、炎症性細胞の数及び活性の低
下を刺激し、そして水腫及び炎症を低めるために利用され得る。そのような抗−
炎症性ポリペプチドは、急性炎症状態、滑液包炎、慢性炎症性脱髄性多発性神経
障害、種々の形の接触性皮膚炎、接触性外陰部膣炎、筋炎、敗血症及び潰瘍性大
陽炎の処理に適用される。急性腎不全、膵炎及び新生児気管支肺形成不全を処理
するための治療剤としても使用され得る。眼の損傷、例えば火傷又は外来性物体
からの角膜損傷、又は炎症性疾病、例えばブドウ膜炎に対して適用できる。

【０２４０】 皮膚化学的状態及び皮膚疾患、例えば湿疹、神経皮膚炎、アレルギー、乾癬、
乾燥症、昆虫のかみ傷及び熱傷、例えば熱、化学的及び放射線熱傷、特に日焼け
に関連する慢性かゆみ及び炎症を緩和するためにも適用され得る。 痛風、ぜん息、手根管症候群、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症及び重
症筋無力症に関連する症候がまた、本発明の化合物を用いて緩和され得る。

【０２４１】 炎症の部位からの生物活性アクチビンの、zfsta4ポリペプチド、アゴニスト又
はアンタゴニスト−介在性除去は、広範囲の種類の炎症性障害の処理のための有
用な治療である。zfsta4ポリペプチド又はそのポリペプチドフラグメントにおけ
るこの能力の存在を確かめるために、そのようなポリペプチド及びポリペプチド
フラグメントが、急性炎症を阻害するそれらの能力に関して評価される。そのよ
うな方法は当業界において知られており、特にzfsta4ポリペプチドがカラゲナン
−誘発されたラットフットパット水腫モデルのおいて抗−炎症活性について試験
され得る（Winterなど., J. Pharmac. Exp. Ther. 141: 369-76, 1963及びMiele
など., Nature 335: 726-30, 1988）。

【０２４２】 他のモデルは、内毒素−誘発されたブドウ膜炎（EIU）モデルを包含する（Cha
nなど., Arch. Ophthalmol. 109: 279-81, 1991）。オキサゾロン−誘発された
炎症モデル（Lloret and Moreno, Biochem. Pharmocol. 44: 1437, 1992）、ハ
ズ油−誘発された炎症モデル、PMA−誘発された炎症モデル（Micleなど., 前記
）、及び抗−炎症性剤についてのデキストラン−誘発された水腫アッセイ（Iale
ntiなど., Agents Actions 29: 48-9, 1990 及びRosa and Willoughby, J. Phar
m. Pharmac. 23: 297-8, 1971）を包含する。

【０２４３】 疾病、例えばリウマチ様関節炎を処理するための効率は、炎症の低下及び苦痛
又は硬直性の緩和を包含するインジケーターを用いて評価され、そして動物モデ
ルにおいては、表示は関節の肉眼検査及び後脚の腫大の変化に由来する。所望に
は、これに関するzfsta4ポリペプチド性能が、他の抗炎症剤、特にデキサメタゾ
ン及びヒドロコルチゾンに比較され得る。さらに、zfsta4ポリペプチドが、相乗
効果を同定するために、１又は複数の抗−炎症剤と組合して評価され得る。

【０２４４】 赤血球分化因子（EDF）、及びアクチビン及びインヒビンのB_Aサブユニットの
配列同一性の最近の構造（Murataなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2434
, 1988）は、造血及び赤血球前駆体の分化の調節におけるzfsta4の役割を示唆し
ている。EDFは、培養された赤白血病細胞に対する可能性ある分化−誘発活性を
示し、そしてインビトロ及びインビボでの正常な赤血球前駆体細胞の増殖を強め
（Yuなど., Nature 330: 765, 1987, Shiozakiなど., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 165: 1155, 1989）、そしてアクチビンA/EDFが活性化されたマクロファ
ージにおいて発現される（Eramaaなど., J. Exp. Med. 176: 1449-52, 1992）。

【０２４５】 正常なマウスへのフォリスタチンの連続した腹腔内投与は、骨髄及び脾臓にお
ける赤血球前駆体の低下をもたらし（Shiozakiなど., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 1553-6, 1992）、このことは、フォリスタチンがネズミ赤血球生成を調
節することを示す。ヒトにおいては、さらに、フォリスタチン関連遺伝子は、B
−細胞慢性リンパ球性白血病における染色体転移の標的物である（Hayette など
., Oncogene 16: 2949-54, 1998）。

【０２４６】 EDF−結合タンパク質、例えばzfsta4ポリペプチド、アゴニスト又はアンタゴ
ニストは、造血及び赤血球前駆体の分化を調節するための有用な治療剤を提供す
る。この能力の存在を確かめるために、本発明のzfsta4ポリペプチド及びアゴニ
ストが、当業者において知られている方法に従って、骨髄及び脾臓における赤血
球前駆体を低めることによって赤血球生成を変えるそれらの能力について評価さ
れる。zfsta4アンタゴニストが、フォリスタチン及びフォリスタチン−様分子を
不活性化することにより造血及び赤血球前駆体の分化を増強することに関して評
価される。所望には、これに関するzfsta4性能が、他のフォリスタチン又は造血
性因子、例えばエリトロポイエチン又はトロンボポイエチン及び同様のものに比
較され得る。さらに、zfsta4ポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニ
ストが、相集効果を同定するために、１又は複数のフォリスタチンと組合して評
価され得る。

【０２４７】 生殖腺/視床部下/下垂体軸に対するアクチビン及びインヒビンの多形質発現性
作用は、フォリスタチン、及びzfsta4がホルモン生成の異常性により特徴づけら
れる受胎能障害の処理において有用であることを示す。例えば、アクチビンAは
、視床下部オキシトシン分泌を刺激することが示されている（Sawchenkoなど.,
Nature 334: 615-7, 1988）。オキシトシンは子宮収縮を刺激する。アクチビンA
を結合するタンパク質は、早熟妊娠における分娩を遅延するための有用な治療剤
として作用する。

【０２４８】 毛胞形成は、小胞の形態学的及び機能的変化により特徴づけられる生理学的現
象である。それらの現象の中で、洞形成が、この経路、すなわち下垂体ホルモン
FSHにより支配される標識と思われる。FSHは卵巣の正常な機能のために必要とさ
れ、そしてアクチビンはFSH合成及び分泌の活性化のために必要とされるので、
フォリスタチンは卵巣機能の重要なレギュレーターであることは、驚くべきこと
ではない。フォリスタチンmRNAが、原始小胞に存在し、そしてそのレベルは、増
殖する二次又は三次小胞の顆粒層細胞において劇的に高められ、そして次に、前
排卵小胞において低下する（Shimasakiなど., Mol. Endocrinol. 3: 651-9, 198
9）。

【０２４９】 最近のインビトロアッセイシステムはまた、アクチビンが成熟においてではな
いが、未熟マウスにおいて直接的に毛胞形成性であり、成熟マウスにおける毛胞
形成の阻害はさらに、フォリスタチンにより逆転されることを示している（Yoko
taなど., Endocrinology 138: 4572-6, 1997）。アクチビンとフォリスタチンと
の間のバランスは、雌のトランスジェニックマウスにおけるマウスフォリスタチ
ンの過剰発現が多くの生殖欠点を有するので、正常な卵巣機能のために決定的で
あると思われる（Gunoなど., Mol. Endocrinol. 12: 96-106, 1998）。

【０２５０】 フォリスタチン、例えばzfsta4は、小胞細胞の増殖又は分化に影響を及ぼし、
細胞−細胞相互作用に影響を及ぼし、前記工程に関与するホルモンを調節し、そ
して同様のことを行うことによって、毛胞形成の調節において役割を演じる。標
的組織及び器官、例えば子宮、乳房、脂肪細胞、骨及び肝臓に対する性ステロイ
ド、例えばFSHの役割が、治療用途のために所望されるそれらの活性のモデュレ
ーターを製造して来た。そのような用途は、性的早熟、子宮内膜症、子宮平滑筋
腫、多毛症、不妊症、月経前症候群（PMS）、無月経のための及び避妊剤として
の処理を包含する。

【０２５１】 血液におけるゴナドトロピン及びステロイドホルモンのレベル及び割合は、疾
病に関連するホルモン不均衡の存在を評価し、そして正常なホルモンバランスが
、治療剤の投与の後、回復されたかどうかを決定するために使用され得る。血清
からのエストラジオール、プロゲステロン、LH及びFSHレベルの決定は、当業者
により知られている。そのようなアッセイは、インビボで、又はzfsta4遺伝子が
発現され、又はネズミオルト体が欠失されているトランスジェニックマウスモデ
ルにおいて、zfsta4の投与の後、ホルモンレベルに対する効果をモニターするた
めに使用され得る。

【０２５２】 本発明のzfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストは、生殖障害を
処理するために、直接的に使用され、又は治療剤中に組み込まれ得る。ホルモン
ー調節分子として、zfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストは、例
えば妊娠維持のための治療レジメの一部として、閉経期出血を処理するための、
又は多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、PMS及び閉経に関連する症候を処理するため
の治療用途を有する。さらに、他のインビボ囓歯モデルは、例えば多嚢胞性卵巣
症候群（PCOS）に対するzfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストの
効果をアッセイすることが当業界において知られている。

【０２５３】 アクチビン、インヒビン及びフォリスタチンはまた、精巣においても見出され
る。フォリスタチンをコードするmRNAは、多くの胚芽細胞、例えばB型精原細胞
、第一精母細胞、及び段階１〜11での精子細胞に位置する（Meinhardt など., J
. Reprod. Fertil. 112: 233-41, 1998）。それはまた、Sertoli細胞及び内皮細
胞に見出されるが、しかしLeyding 細胞においては見出されない。抗−フォリス
タチン抗体に関する免疫組織化学は、そのタンパク質がすべての段階での精子細
胞に位置し、そしてそれはまた、内皮細胞及びLeyding細胞にも位置することを
示した。アクチビンの活性を中和するフォリスタチンの能力と共に、この広い位
置決定は、フォリスタチンが精子形成及び広範囲の他の精巣機能を調節すること
を示す。

【０２５４】 アクチビンとフォリスタチンとの間のバランスは、雄における正常な生殖にお
いて重要な役割を演じ、これは、マウスフォリスタチントランスジェニックマウ
スにおいて示され、すなわち雄は種々の程度のLeyding細胞過形成を示し、精子
形成が抑制され、そして不妊症を誘発する輸精管が変性される。これは、過剰の
アクチビン又は他のTGF−βファミリーメンバーによる生殖障害がフォリスタチ
ンファミリーのメンバーによる処理の影響を受けやすいことを示す。さらに、フ
ォリスタチンアンタゴニストは、雄性受胎能を増強するための処理レジメにおい
て有用である。

【０２５５】 精巣に対するzfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストの効果を評
価するためのインビボアッセイは、当業界において良く知られている。例えば、
化合物が、特定の期間、腹腔内注入され得る。その処理期間の後、動物は殺され
、そして精巣が除去され、そして計量される。精巣が均質化され、そして精子の
頭が計数される（Meistrichなど., Exp. Cell Res. 99: 72-78, 1976）。

【０２５６】 他の活性、例えば本発明のタンパク質に関連する走化性活性が分析され得る。
例えば、精子形成における後期段階の因子が、卵−精子相互反応及び精子運動性
に関与されている。活性、例えば低温保存された精子の生存性を高め、アクロソ
ーム反応を刺激し、精子運動性を高め、そして卵−精子相互作用を高める活性が
、本発明のタンパク質に関与している。

【０２５７】 そのような活性を評価するアッセイは知られている(Rosenberger, J. Androl.
11: 89-96, 1990, fuchs, Zentralbl 11:117-120, 1993; Neurwinger など., A
ndrologia 22: 335-9, 1990; Harris など., Human Reprod. 3:856-60, 1988;
及びJockenhovel. Andrologia 22: 171-178, 1990; Lesing など., Fertil. Ste
ril. 44: 406-9 (1985); Zaneveld, In Male Infertility Chapter 11, Comhair
e Ed., Chapman & Hall, London 1996)。それらの活性は、増強された受胎能及
び好結果をもたらす生殖をもたらすことが予測される。

【０２５８】 zfsta4ポリペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストは、生殖ホルモンを調節
するための有用な治療剤を提供する。この能力の存在を確かめるために、本発明
のzfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストが、当業界において知ら
れている方法に従って、生殖に関連するホルモンを調節するそれらの能力に関し
て評価される。例えば、Guoqetal, Mol. Endocrinol. 12: 96-106, 1998は、血
清LH, FSH, テストステロン、エストラジオール、アクチビン及びフォリスタチ
ンのRIA測定を記載する。

【０２５９】 zfsta4ポリペプチド及びアゴニストは、雄性及び雌性生殖障害を処理するため
に有用である。zfsta4アンタゴニストはまた、避妊剤としても有用である。所望
には、これに関してのzfsta4性能が、他のフォリスタチン及び同様のものに比較
され得る。さらに、zfsta4ポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニス
トは、相乗効果を同定するために、１又は複数のフォリスタチンと組合して評価
され得る。

【０２６０】 本発明のzfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストはまた、ヒト及
び動物における助力された生殖の間、受精を高めるためにも使用され得る。その
ような助力された生殖方法は、当業界において知られており、そして人工受精、
インビトロ受精、胚移行、及び配偶子ファロピアン内移行を包含する。そのよう
な方法は、天然の概念を妨げ又は阻止する生理学的又は代謝障害を有する人々を
助けるために有用である。そのような方法はまた、例えば家畜、競争馬、家庭用
及び野生動物のために動物飼育プログラムにおいて使用され、そしてトランスジ
ェニック動物の創造のための方法としても使用され得る。

【０２６１】 zfsta4ポリペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストは、独立して、又はゴナ
ドトロピン又は剤、例えばクエン酸クロミフェン又はブロモクリプチンと共に、
排卵の誘発において使用され得る（Speroffなど., Induction of Ovulation, Cl
inical Gynecologic Endocrinology and Infertility, 5^th ed., Baltimore, Wi
lliams & Wilkins, 1994）。

【０２６２】 zfsta4ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストはまた、独立して、又は
他のゴナドトロピン又は性ステロイド、例えばテストステロンと共に、精子形成
の刺激において使用され得る。それ自体、本発明のタンパク質は、受精の前、受
容体に投与され、又はインビトロ又はインビボ受精の前、精子、卵又は卵−精子
混合物と共に組み合わされ得る。そのようなタンパク質はまた、助力された生殖
への使用のために保存された組織の生存性を高めるために、低温保存の前、卵母
細胞又は精子と共に混合され得る。

【０２６３】 骨及び歯の形成は、TGF−βスーパーファミリー、例えばTGF−βs及び骨形態
発生タンパク質（BMPs）のファミリーにより開始され、そして促進されることが
知られている多段階工程である。蓄積する出来事は、アクチビン及びフォリスタ
チンが歯及び骨形成の両者において調節的役割を演じることを示す。前ぞうげ芽
細胞におけるアクチビン及びフォリスタチンの時間−空間的発現は、アクチビン
がそれらの細胞の増殖のために必要とされ、そしてぞうげ芽細胞末端分化がそれ
らの増殖効果のフォリスタチン不活性化により、少なくとも一部、介在されるこ
とを示唆する（Heikinheimoなど., J. Dent. Res. 76: 1625-36, 1997: Heikinh
eimoなど., Eur. J. Oral. Sci. 106: 167-73, 1998）。

【０２６４】 フォリスタチンはまた、骨においても発現され（Inoue など., Calcif. Tiss.
Int. 55: 396-7, 1994）、そしてアクチビン及びフォリスタチンはラットにお
ける骨折の治療における免疫組織化学により検出されている（Nagamine など.,
J. Orthopaed. Res. 16: 314-21, 1998）。フォリスタチンはまた、生長する骨
においても検出されており、そして鉱物質除去された骨マトリックス−誘発され
た軟骨内骨生長の間、フォリスタチン及びアクチビンA遺伝子の発現は、骨形成
の間、フォリスタチン及びアクチビン間の協力的相互作用を示す（Funaba, など
., Endocrinology 137: 4250-9, 1996）。

【０２６５】 そのような治療剤は、閉鎖、開放及び非結合骨折において生じる、骨欠損及び
欠乏の修復；閉鎖及び開放骨折の低下への予防的使用；形成外科における骨治療
の促進；非セメント合着された補てつ関節及び歯用移植体中への骨形成の刺激；
前閉経期女性におけるピーク骨質量の上昇；成長欠乏の処理；歯周病及び欠損の
処理、及び他の骨修復工程；伸延性骨形成の間の骨形成の上昇；及び他の骨格障
害、例えば年齢関連のオステオポローシス、後閉経オステオポローシス、グルコ
コルチコイド誘発されたオステオポローシス、糖尿病関連のオステオポローシス
又は不使用性オステオポローシス及び関節炎の処理のために使用される。本発明
の化合物はまた、骨の先天的な、外傷−誘発された又は手術切開の修復（例えば
、癌の処理のための）において、及び美容手術においても有用であり得る。さら
なる使用は、軟膏損傷又は障害の制限又は処理、及び創傷治療及び組織修復の刺
激を包含する。

【０２６６】 充分に確立された動物モデルが、骨形成のモジュレーターのインビボ効率を試
験するために利用できる。例えば、低カルシウム血症ラット又はマウスモデルが
、血清カルシウムに対する試験化合物の効果を決定するために使用され得、そし
て卵巣摘出されたラット又はマウスがオステオポローシスについてのモデルシス
テムとして使用され得る。エストロゲン欠損の初期段階の間、それらのモデル及
びヒトに見られる骨の変化は、性質的に類似する。

【０２６７】 TGF−βファミリーのメンバー、例えばzfsta4ポリペプチド、アゴニスト又は
アンタゴニストの効果を調節することができる分子は、歯及び骨形成のために有
用な分子を提供する。この能力の存在を確かめるために、本発明のzfsta4ポリペ
プチド、アゴニスト及びアンタゴニストは、当業界において知られている方法に
従って、歯又は骨形成を刺激するそれらの能力に関して評価される。所望には、
これに関するzfsta4性能が、他のフォリスタチン及び同様のものに比較され得る
。さらに、zfsta4ポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、相
乗効果を同定するために、１又は複数のフォリスタチンと組合して評価され得る
。

【０２６８】 フォリスタチン及びアクチビンはまた、たぶん、アテローム硬化症の病因にお
いて役割を演じると思われる。脈管壁細胞においては、アクチビン−Aは、内皮
細胞増殖を阻害し、そして平滑筋細胞増殖を促進することが示されており（Koji
maなど., Exp. Cell Res. 206: 152-6, 1993; McCarthy and Bicknell, J. Biol
. Chem. 268: 23066-71, 1993）、そしてTHP−１マクロファージにおけるスカベ
ンジャー受容体、すなわちSRB１、発現及びフォーム細胞形成の適度な障害を生
成することが示されている（Kozakiなど., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.
17: 2389-94, 1997）。

【０２６９】 それらの効果は、フォリスタチンによりアンタゴナイズされる。アクチビン−
A、フォリスタチン及び骨形態発生学的プロテイン−２がヒトアテローム硬化症
障害により生成され、そして最初の２種の発現が疾病の動脈の新生内膜に局在化
された（Inoue など., Biochem. Biophys, Res. Commun. 205: 441-8, 1994）。
それらのデータは、アクチビンとその結合タンパク質フォリスタチンとの間の相
対的バランスが、アテローム硬化症外傷の開始及び進行において重要であること
を示す。

【０２７０】 zfsta4 ポリペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストは、TGF−βファミリー
メンバーの活性を中和するために有用である。そのような分子は、血管形成の後
、再狭窄の処理のための新規療法を提供するであろう。さらに、TGF−βは、ア
テローム硬化症の処理のために有用である。そのような分子の使用はまた、発作
の処理のためにも適用できる。

【０２７１】 フォリスタチン及びアクチビンは、生長において重要な役割を演じるように思
える。２種の種類のTGF−βファミリーメンバーが、アフリカツメガエルにおけ
る初期生長における中胚葉の背側/腹側パターンを決定すると思われる。最初の
メンバーは、アクチビンに関連し、そして背側中胚葉の形成を誘発し、これは筋
肉及び背索を生ぜしめ（Asashima など., Roux’s Arch. Dev. Biol. 198: 330-
5, 1990）、そして第２のメンバーは、背側中胚葉形成を阻害し、そして腹側運
命上に存在する細胞、例えば血液細胞を誘発する骨形態発生学的タンパク質（BM
P）に関連する（Maenoなど., Dev. Biol. 161: 522-9, 1994）。

【０２７２】 フォリスタチンは、それらのシステムにおいて、アクチビン（Fukuiなど., De
v. Biol. 159: 131-9, 1993）、及びBMP (Iemuraなど., Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 95: 9337-42, 1998) の活性を阻止することができる。一緒に考えると、
それらの発見は、TGF−β結合タンパク質のフォリスタチンファミリーのメンバ
ーとして、zfsta4が、広範囲の生長障害のための治療剤として有用であることを
示す。

【０２７３】 本発明のタンパク質をアッセイするための別のインビボアプローチは、ウィル
ス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィ
ルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV）
を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種拡散の
供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（T. C.
Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D
.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと）。

【０２７４】 アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ i ）アデノウ
ィルスは比較的大きなDNA挿入体を適応せしめることができ；（ ii ）高い力価
に増殖され得；（ iii ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ iv ）
異なったプロモーターを含む多数の利用できるベクターと共に使用され得る。ま
た、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射によ
り投与され得る。

【０２７５】 アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAのより大きな
挿入体（７kbまでの）が適応され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により
又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスDN
A中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須E1遺伝子がウィルス
ベクターから欠失され、そしてウィルスは、E１遺伝子が宿主細胞（ヒト293細胞
系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。

【０２７６】 損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓
を標的化する。アデノウィルス供給システムがE１遺伝子欠失を有する場合、ウ
ィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織
（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするので
あろう(そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する)。分泌されたタン
パク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対
する効果が決定され得る。

【０２７７】 zfsta4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zfsta4活性を高め、又
は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異
誘発されたzfsta4遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、zfsta4遺伝子
が哺乳類の細胞中に導入され得る。1つの態様においては、zfsta4ポリペプチド
をコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのよ
うなベクターは、弱毒化された又は欠陥DNAウィルス、例えばヘルペス単純ウィ
ルス(HSV)、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス(EBV)、アデノウィ
ルス、アデノ関連ウィルス(AAV)及び同様のものを包含するが、但しそれらだけ
には限定されない。

【０２７８】 ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好まし
い。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベク
ターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在
化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次の
ものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１
(HSV1)ベクター（Kaplitt など., Molc. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991）、
弱毒化されたアデノウィルス ベクター、例えばStratford-Perricaudat など.
(J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992) により記載されるベクター、及び欠陥ア
デノ−関連ウィルスベクター（Samulski など., J. Virol. 61: 3096-101, 1987
; Samulski など., J. Virol. 63: 3822-28,1989）。

【０２７９】 もう1つの態様においては、zfsta4遺伝子は、次の文献に記載のようにして、
レトロウィルスベクターに導入され得る：Anderson など., アメリカ特許第5,39
9,346号；Mann など., Cell 33: 153, 1983; Temin など., アメリカ特許第4,65
0,764号；Temin など., アメリカ特許第4,980,289号；Markowitz など., J. Vir
ol. 62: 1120, 1988; Temin など., アメリカ特許第5,124,263 号；Dougherty
など., WIPO Publication WO95/07358 号；及びkuo など., Blood 82: 845-52,
1993。

【０２８０】 他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションによ
り導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボ
トランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felg
ner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器官
中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な
利点を有する。

【０２８１】 特定細胞へのリポソームの分子標的化は、1つの領域の利点を表す。特定細胞
へのトランスフェクションの方向づけが1つの領域の利点を表すことは明白であ
る。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組
織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である
。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド
、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチ
ド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。

【０２８２】 身体から細胞を除去し、そして裸DNAプラスミドとしてベクターを導入し、そ
して次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子
治療のための裸DNAベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られ
ている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸
カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はDNAベクタートランスポーターの使用
により導入され得る（例えば、Wu など., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; W
u など., J. Biol. Chem. 263: 14621-24, 1988）。

【０２８３】 アンチセンス方法は、zfsta4遺伝子転写を阻害するために、例えばインビボで
の細胞増殖を阻害するために使用され得る。zfsta4−コードのポリヌクレオチド
のセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１に示
されるようなポリヌクレオチド）は、zfsta4−コードのmRNAに結合し、そしてそ
のようなmRNAの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスポリヌ
クレオチドは、細胞培養物又は対象において、zfsta4ポリペプチド−コードの遺
伝子の発現を阻害するために使用される。

【０２８４】 zfsta4遺伝子を発現するよう構築されたトランスジェニックマウス、及び“ノ
ックアウトマウス”（Snouwaert など., Science 257：1083, 1992 ）として言
及される、zfsta4遺伝子機能の完全な不在を示すマウスはまた、当業者により生
成され得る（Lowellなど., Nature 366: 740-42, 1993 ）。それらのマウスは、
zfsta4 遺伝子フラグメント、及びそれによりコードされるタンパク質をインビ
ボシステムにおいて研究するために使用される。

【０２８５】 トランスジェニックマウスは、すべての組織において、又は組織−特異的又は
組織に好ましい調節要素の制御下で、zfsta4遺伝子を過剰発現するよう構築され
得る。zfsta4のそれらの過剰生成体は、過剰発現に起因する表現型を特徴づける
ために使用され得、そしてトランスジェニック動物は過剰zfsta4により引き起こ
されるヒト疾病のためのモデルとして作用することができる。zfsta4を過剰発現
するトランスジェニックマウスはまた、大きな動物の乳汁又は血液におけるzfst
a4、例えば可溶性zfsta4の生成のためのモデル生物反応体を提供する。

【０２８６】 トランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に良く知られてい
る（例えば、Jacob, “Expression and Knockout of interferons in Transgeni
c Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice
, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky an
d Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995),
and Abbud and Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgeic Mic
e,” in Gen Expression Systems: using Nature for the Art of Expression,
Fernandez and Hoeffler (eds.), pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)
を参照のこと）。

【０２８７】 例えば、zfsta4遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを生成するための
方法は、成熟した受精能雄（種マウス）（B6C3f1, 生後２−８ヶ月（Tacomic Fa
rms, Germantown, NY））、精管切除された雄（duds）(B6D2f1, ２−８ヶ月(Tac
onic Farms）)、 思春期直前受胎能雌（ドナー）（B6C3f1, 4-5週（Taconic Far
ms））、及び成熟した受胎能雌（受容体）（B6D2f1, ２−４ヶ月（taconic farm
s））により開始することができる。

【０２８８】 ドナーは、１週間、気候順応化され、そして次に、約８IU/マウスのPregnant
Mare’s Serum ゴナドトロピン（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）I.P
. により、及び46−47時間後、8IU/マウスのヒトChorionic Gonadotropin (hCG
(Sigma)) L.P. により注射され、過剰排卵を誘発された。ドナーが、ホルモン注
射に続いて、種マウスにより交配される。排卵は一般的に、hCG注射の13時間以
内に生じる。交接は、交配の次の朝、膣栓の存在により確認される。

【０２８９】 受精された卵を手術用スコープ下で集める。卵管を集め、そして卵を、ヒアル
ロニダーゼ（Sigma）を含む尿検査用スライド中に開放する。卵を、１度、アヒ
ルロニダーゼにより洗浄し、そして２度、Whitten’s W640 媒体（Menino and O
’cloray, Biol. Reprod. 77: 159 (1986), 及びDienhart and Downs, Zygote 4
: 129 (1996) により記載される）により洗浄し、これを５％CO₂、5％O₂及び90
％N₂と共に37℃でインキュベートする。次に、卵を、マイクロインジェクション
まで、37℃/5％CO₂のインキュベーターに貯蔵する。

【０２９０】 zfsta4コード配列を含むプラスミドDNA10〜12μgを、線状化し、ゲル精製し、
そしてマイクロインジェクションのために５−10ng/μlの最終濃度で、10mMのト
リス−HCl (pH7.4), 0.25mMのEDTA（pH8.0）の溶液に再懸濁する。例えば、Zfst
a4コード配列は、配列番号２のアミノ酸残基をコードすることができる。プラス
ミドDNAを、暖かな、CO₂平衡化された鉱油により被覆された1度のW640媒体に含
まれる、収穫された卵中にマイクロインジェクトする。

【０２９１】 DNAを注射用針中に吸い込み（0.75mmのID, 1mmのOD硼珪酸塩ガラス細管から引
き抜かれる）、そして個々の卵中に注入する。注射用針により、個々の卵の、ハ
プロイド前核の１つ又は両者中に貫通する。数ピコリットルのDNAを前核中に注
入し、そして注射用針を、核と接触しないよう引き抜く。前記方法を、すべての
卵が注入されるまで、反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、前
もってガス抜きされたW640媒体を有する器官組織−培養皿中に移し、37℃/5％CO ₂ のインキュベーターにおいて一晩、貯蔵する。

【０２９２】 次の日、２細胞の胚を、偽妊娠受容体中に移す。受容体は、精管切除されたdu
dsとの交接の後、膣栓の存在により同定される。受容体に麻酔をし、そして背面
左側上の毛を剃り、そして手術用顕微鏡に移す。切開を、皮膚において、及び胸
郭、背部及び後脚により概略される腹部の中央、すなわち膝と脾臓との間の中途
まで筋肉壁を通して行う。生殖器官を、小さな手術用ドレープ上に切除する。脂
肪パッドを、手術用ドレープ上に広げ、そして子供用止血小鉗子（Roboz, Rockv
ille, MD）を、脂肪パットに取り付け、そしてマウスの背部上をつるし、器官が
腹部にスライドすることを防ぐ。

【０２９３】 鉱油、続いて交互にW640及び空気気泡を含む精巧なトランスファーピペットに
より、前日の注入からの12〜17個の健康な２−細胞胚を、受容体中に移す。膨張
した膨大部を位置決定し、そしてその膨大部と包との間の卵管を保持し、卵管の
刻み目を前記包に隣接して、28gの針により行い、膨大部又は包を裂かないこと
を確かめる。

【０２９４】 ピペットを、卵管における刻み目に移し、そして胚を吹き込み、最初の空気気
泡のピペットからの除去を可能にする。脂肪パッドを軽く、腹膜中に押し込み、
そして生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を、１つの縫合により閉じ、そして皮膚
を傷口用クリップにより閉じる。マウスは、少なくとも４時間、37℃の暖かなス
ライド上で回復した。受容体を、対でカゴに戻し、そして19−21日の妊娠を可能
にする。誕生後、19−21日の産後を、離乳の前に可能にする。離乳子供の性別を
鑑別し、そして別々の性別のカゴに入れ、そして0.5cmの生検（遺伝子型識別の
ために使用される）を、尾から、無菌のハサミにより取る。

【０２９５】 ゲノムDNAを、QIAGEN DNEASYキットを用いて、その製造業者の説明書に従って
、切り取られた尾から調製する。ゲノムDNAを、同じプラスミドに導入されたzfs
ta4遺伝子又は選択マーカー遺伝子を増幅するために企画されたプライマーを用
いて、PCRにより分析する。動物がトランスジェニックであることが確かめられ
た後、それらは、トランスジェニック雌を野生型雄と共に、又はトランスジェニ
ック雄を１又は複数の野生型雌と共に配置することによって、近交系に戻し交雑
する。子供が生まれ、そして離乳され、性別を分け、そしてそれらの尾を、遺伝
子型識別のために切り取る。生存動物におけるトランスジーンの発現について調
べるために、部分肝切除を行う。

【０２９６】 手術準備を、zyphoid工程下で直接的に上部腹部に行う。無菌技法を用いて、
小さな1.5−2cmの切開を、胸骨下で行い、そして肝臓の左側葉を取り出す。４−
０絹糸を用いて、下部葉を体腔外に確保するために、その下部葉の回りを縛る。
クランプを用いて、その結び目を保持し、そして吸収性Dexon (American Cyanam
id; Wayne, N. J.) の第２ループを、最初の結び目に隣接して配置する。遠位切
断をDexon結び目から行い、そして約100mgの切除された肝臓組織を、無菌ペトリ
皿に配置する。

【０２９７】 切除された肝臓切片を、14mlのポリプロピレン丸底管に移し、そして液体窒素
において凍結し、そして次に、ドライアイス上に貯蔵する。手術部位を、縫合及
び傷口用クリップにより閉じ、そして動物のカゴを、37℃で加熱されるパッド上
に、手術の後、24時間、配置する。動物を手術の後、毎日調べ、そして傷口用ク
リップを、手術の７−10日後に取り除く。zfsta4 mRNAの発現レベルを、RNA溶液
ハイブリダイゼーションアッセイ又はポリメラーゼ鎖反応を用いて、個々のトラ
ンスジェニックマウスについて試験する。

【０２９８】 zfsta4を過剰発現するトランスジェニックマウスを生成する他に、その遺伝子
を異常に低く発現するか、又はまったく発現しないトランスジェニックマウスを
構築することは有用である。そのようなトランスジェニックマウスは、zfsta4の
欠失に関連する疾病のための有用なモデルを提供する。上記で論じられたように
、zfsta4遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、又は外部案内
配列遺伝子を用いて阻害され得る。zfsta4遺伝子を過少発現するトランスジェニ
ックマウスを生成するためには、そのような阻害配列がzfsta4 mRNAに標的化さ
れる。特定の遺伝子の異常に低い発現をトランスジェニックマウスを生成するた
めの方法は、当業者に知られている（例えば、Wuなど., “Gene Under Expressi
on in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and DNA Strategies” i
n Methods in Gene Biotechnology, p. 205-224 (CRC Press 1997) を参照のこ
と）。

【０２９９】 zfsta4遺伝子発現をほとんどか又はまったく有さないトランスジェニックマウ
スを生成するための他のアプローチは、非官能性zfsta4遺伝子により置換された
、少なくとも１つの正常Zfsta4対立遺伝子を有するマウスを生成することである
。非官能性zfsta4遺伝子を企画する１つの方法は、もう１つの遺伝子、例えば選
択マーカー遺伝子を、zfsta4をコードする核酸分子内に挿入することである。い
わゆるそれらの“ノックアウトマウス”を生成するための標準の方法は、当業者
に知られている（例えば、Jacob, “Expression and Knockout of Interferons
in Transgenic Mice,” in Overexpression and Knockout of Cytokines in Tra
nsgenic Mice, Jacob (ed.), Pages 111-124 (Academic Press, Ltd, 1994), 及
びWuなど., “New Strategies for Gene Knockout,” in Methods in Gene Biot
echnology, Pages 339-365 (CRC Press 1997)を参照のこと）。

【０３００】 本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、さらに、遺伝学及び分子生物
学、タンパク質化学、及び抗体生成及び分析に関連する実験用実習キットにおい
て教育用用具として有用であろう。その独得のポリヌクレオチド及びポリペプチ
ド配列のために、zfsta4の分子は、試験のための標準として、又は“未知”とし
て使用され得る。

【０３０１】 例えば、zfsta4ポリヌクレオチドは、zfsta4が発現されるべき遺伝子である、
融合構造体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構造体をい
かにして調製するかを学生に教授するために；ポリヌクレオチドの制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位を決定するために；組成におけるzfsta4ポリヌクレオチドの
mRNA及びDNA位置を決定するために（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及
びポリメラーゼ鎖反応による）；そして核酸ハイブリダイゼーションにより関連
するポリヌクレオチド及びポリペプチドを同定するために、補助体として使用さ
れ得る。

【０３０２】 zfsta4ポリペプチドは、抗体の調製；ウェスターンブロットによるタンパク質
の同定；発現された合計のタンパク質に対する割合としての発現されたzfsta4ポ
リペプチドの重量の決定；ペプチド分解部位の同定；アミノ及びカルボキシル末
端標識のカップリング；アミノ酸配列分析；及び生来の及び標識されたタンパク
質の生物学的活性（すなわち、受容体結合、シグナルトランスダクション、増殖
及び分化）のインビトロ及びインビボでのモニターリングのための補助体として
使用され得る。

【０３０３】 zfsta4ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、質量分析学、特に４個のαヘ
リックスのコンホメーションを決定するために、円ニ色性を、原子の立体構造を
詳細に決定するために、X−線結晶学を、溶液におけるタンパク質の構造を表す
ために、核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、zfsta4を
含むキットが、学生の分析熟練を開発するために与えられ得る。アミノ酸配列は
教授によって知られており、すなわちタンパク質は学生の熟練を決定し、又は熟
練を進行せしめるための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリ
ペプチドを正しく分析したか否かを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニ
ークであるので、zfsta4の教育的利用はそれ自体ユニークであろう。

【０３０４】 zfsta4に対して特異的に結合する抗体は、zfsta4を精製するために親和性カラ
ムクロマトグラフィーをいかにして調製し、抗体をコードするポリペプチドをい
かにしてクローニングし、そしていかにして配列決定するか、及び従って、ヒト
型化された抗体をいかにして企画するかを学生に教授するための実習として使用
され得る。次に、zfsta4遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、分子生物学の技術に
おける熟練の学生による獲得を可能にするために、試薬会社によりパッケージン
グされ、そして大学により市販されている。個々の遺伝子及びタンパク質はユニ
ークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は、実験実習における学生のため
にユニークな挑戦及び学習経験を創造する。zfsta4遺伝子、ポリペプチド又は抗
体を含むそのような教育キットは、本発明の範囲内にあると思われる。

【０３０５】 zfsta4ポリペプチドはまた、医薬使用のために企画される。医薬的有効量の本
発明のzfsta4ポリペプチド、アゴニスト又はzfsta4アンタゴニストは、非経口、
経口、鼻腔内、直腸、局所、経皮投与又は同様のもののために、医薬的に許容で
きるキャリヤーと共に配合され得る。配合物は、さらに、１又は複数の希釈剤、
充填剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、腑形剤及び同様のものを含むことができ、そ
して液体、粉末、エマルジョン、坐剤、リポソーム、経皮用パッチ及び錠剤のよ
うな形で供給される。

【０３０６】 多くのバイオポリマー（生物学的基材システム）のいずれかを含む遅延又は延
長された開放性システム、リポソームを用いるシステム、及びポリマー供給シス
テムがまた、zfsta4ポリペプチド又はアンタゴニストの連続した又は長期源を提
供するために本明細書に記載される組成物と共に使用され得る。そのような遅延
システムは、経口、局所及び非経口使用のために、配合物に適用でき得る。用語
“医薬的に許容できるキャリヤー”とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨
害せず、そして宿主又は患者に対して毒性ではないキャリヤー媒体を言及する。
当業者は、本発明の化合物を、適切な態様で、及び許容された実施、たとえばRe
mington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro (ed.), Mack Publishing Co.,
Easton, PA, 1990 に開示されるそれらの実施に従って配合することができる。

【０３０７】 本明細書において使用される場合、zfsta4ポリペプチド、アゴニスト又はアン
タゴニストの“医薬的に有効な量”は、所望する生物学的結果を誘導するのに十
分な量である。その結果は、疾病の徴候、症状又は原因の解決、又は生物学的シ
ステムのいづれか他の所望する変異であり得る。たとえば、有効量のzfsta4ポリ
ペプチドは、臨床医又は他の資格のある観察者により示されるように、徴候の主
観的軽減又は客観的に同定できる改良点のいずれかを提供する量のポリペプチド
である。有効量のzfsta4ポリペプチドは、処理されるべく疾病又は徴候に依存し
て、広く変化することができる。

【０３０８】 投与されるべきポリペプチドの量、及び配合物におけるその濃度は、選択され
るビークル、投与の経路、特定のポリペプチドの能力、患者の臨床学的状態、副
作用、及び配合物における化合物の安定性に依存する。従って、臨床医は、問題
の患者又は類似する患者による臨床実験に依存して、配合物における適切な濃度
、及び投与される配合物の量を包含する適切な調製物を用いるであろう。

【０３０９】 そのような量は、患者の処理される特定の状態、年齢、体重、及び一般的な健
康、及び当業者に明らかな他の要因に一部、依存するであろう。典型的には、用
量は、対象ｋｇ当たり０．１〜１００ｍｇの範囲であろう。特定の化合物のため
の用量は、実験動物に基づく研究と組み合わせて、インビトロ又はエクソビボ研
究から決定され得る。インビトロ又はエクソビボで有効であることが見出されて
いる化合物の濃度が動物研究のためのガイドを提供し、ここで用量が、作用の部
位での類似する濃度を提供するよう計算される。

【０３１０】 本発明を実施するために使用される本発明の化合物の投与量は、所望する効果
をもたらすのに効果的な投与量を包含する。個々の患者のために効果的な適切な
投与量の評価は、医者又は他の適切なヘルスケア-実施者の範囲内である。ガイ
ドとして、臨床医は、Physician’s Desk Reference, 48^th Edition, Medical E
conomics Data Production Co., Montvale, New Jersey 07645-1742 (1994) か
らの装置を、便利には、入手して使用することができる。

【０３１１】 好ましくは、本発明の組成物は、単位投与量形での投与のために提供される。
用語“単位投与形”とは、ヒト対象及び動物のために単位投与されるのに適切な
物理学的に別個の単位を言及し、個々の単位は必要とされる医薬的希釈剤、キャ
リヤー又はビークルと共に、所望する医薬的効果を生成するために計算された、
予定された量の活性材料を含む。単位投与形の例は、バイアル、アンプル、錠剤
、カプレット、ピル、粉末、顆粒、眼薬、経口又は眼内溶液又は懸濁液、眼内軟
膏、及び水中油型エマルジョンを包含する。調製、配合及び投与の手段は、当業
者に知られており、一般的には、Remington: The Science and Practice of Pha
rmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19^th ed., 1995 を
参照のこと。

【０３１２】 本発明は、次の非限定的例により、さらに示される。 実施例 例１．EST配列の延長 本発明のzfsta4ポリペプチド−コードのポリヌクレオチドを、フォリスタチン
相同体について、ESTデータベースに質問することによって、まず同定した。EST
配列の他に、zfsta4ポリペプチドをコードする十分な長さのヌクレオチド配列を
生成するために、PCRをまた使用した。18種の組織サンプルからのcDNAを含むPCR
パネルを、zfsta4についてスクリーンした。

【０３１３】 PCR反応を、プライマーとしてオリゴZC23578（配列番号８）及びZC23580（配
列番号９）を用いて、設定した。増幅を次の通りに行った：94℃で２分間（１サ
イクル）、94℃で30秒間、70℃で30秒間、及び72℃で30秒間、続いて72℃で５分
間（35サイクル）。陽性の組織サンプルは、前立腺及び精巣を包含した。

【０３１４】 ABIPRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Perkin-
Elmer Corp.) を用いて、ABIPRISM^TM モデル377DNA配列決定（Perkin−Elmer Ce
tus, Norwalk, Ct.）上で、製造業者の説明書に従って、配列決定することによ
って、5’RACEを行った。配列決定反応を、Hybaid OmniGene Temperature Cycli
ng System (National Labnet Co., woodbridge, MY) において行った。SEQUENCH
ER^TM 3.0配列分析ソフトウェア（Gene Code Corporation, Ann Arbor, MI）を、
データ分析のために使用した。zfsta4ポリペプチドをコードするその得られる27
46bpのヌクレオチド配列が、配列番号１で供給される。

【０３１５】 例２．組織分布 ヒト多組織ノザンブロット（MTN I, MTN II及びMTN III；Clontech）をプロー
ブし、ヒトzfsta4発現の組織分布を決定した。約115bpのPCR由来のプローブ（配
列番号４）を、鋳型としての胎児脳、脳、脊髄及び網膜Marathon^TM cDNA ライブ
ラリー（Clontech）、及びプライマーとしてのオリゴヌクレオチドZC23578(配列
番号７)及びZC23588 (配列番号８) を用いて増幅した。増幅を次の通りに行った
：94℃で1.5分間、１サイクル、94℃で15秒間及び60℃で30秒間、35サイクル、
続いて72℃で10分間、１サイクル。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動により
可視化し、そして胎児脳からの115bpのPCR生成物を、ゲル抽出キット（Qiagen,
Chatsworth, CA）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。

【０３１６】 プローブを、Rediprime II DNA ラベリングキット（Amersham, Arlington Hei
ghts, IL）を用いて、製造業者の説明書に従って、放射性ラベルした。プローブ
を、NUCTRAPプッシュカラム（Stratagene）を用いて精製した。EXPRESSHYB (Clo
ntech) 溶液を、プレハイブリダイゼーションのために、及びノザンブロットの
ためのハイブリダイゼーション溶液として使用した。ハイブリダイゼーション及
び洗浄を、適切な緊縮条件下で行った。約４kbの強い転写体を、主に精巣におい
てに見出し、そしてそれよりも弱い転写体を脳、腎臓、膵臓、前立腺及び副腎に
おいて検出した。

【０３１７】 ８個のハウスキーピング遺伝子に標準化された種々の組織からのRNAを含むRNA
Master Dot Blot (Clontech) をまたプローブし、そして上記のようにしてハイ
ブリダイズした。zfsta4は偏在的に発現された。 前述から、本発明の特定の能様が例示目的のために記載されて来たが、種々の
修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、明らかであろう。従って、本発明は
、請求の範囲を除いて限定されない。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/10 Ａ６１Ｐ 7/06 5/24 9/10 １０１ 7/06 15/08 9/10 １０１ 19/08 15/08 25/00 19/08 43/00 １０７ 25/00 Ｃ０７Ｋ 14/495 43/00 １０７ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/495 16/42 16/22 19/00 16/42 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｅ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シェパード，ポール オー． アメリカ合衆国，ワシントン 98252，グ ラニット フォールズ，ツーハンドレッド セブンティーエイス ドライブ ノースイ ースト 13532 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA21 CA03 CA09 CA12 HA14 4B064 AG02 AG27 CA19 CC24 DA13 4B065 AA93Y AB01 CA24 CA46 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA19 BA20 BA21 BA22 CA53 DB03 DB10 DB26 DB28 DB51 DB52 DB55 NA14 ZA01 ZA45 ZA55 ZA67 ZA81 ZA96 ZC03 ZC10 ZC11 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 DA76 EA50 FA74

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基65〜133を含んで
   成るフォリスタチン相同ドメインを含んで成る単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが、前記フォリスタチン相同ドメインに対
   してカルボキシル末端位置に存在するαヘリックスリンカー領域をさらに含んで
   成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域が配列番号２のアミノ酸配列のアミ
   ノ酸残基134〜173を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが、αヘリックスリンカー領域、及び前記
   フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在するカルモジ
   ュリン相同ドメインをさらに含んで成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域
   及びカルモジュリン相同ドメインが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基13
   4〜250を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが、αヘリックスリンカー領域、カルモジ
   ュリン相同ドメイン、及び前記フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシ
   ル末端位置に存在する２種のI−組Igドメインをさらに含んで成り、ここで前記
   αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相同ドメイン、及びI−組Igドメイ
   ンが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜432を含んで成る請求項１記
   載の単離されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが、αヘリックスリンカー領域、カルモジ
   ュリン相同ドメイン、２種のI−組Igドメイン、及び前記フォリスタチン相同ド
   メインに対してカルボキシル末端位置に存在するカルボキシ−末端ドメインをさ
   らに含んで成り、ここで前記αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相同ド
   メイン、２種のI−組Igドメイン、及びカルボキシ−末端ドメインが配列番号２
   のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜842を含んで成る請求項１記載の単離された
   ポリペプチド。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが、前記フォリスタチン相同ドメインに対
   してアミノ末端位置に存在する疎水性リンカー領域をさらに含んで成り、ここで
   前記疎水性リンカー領域が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基23〜64を含
   んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
7. 【請求項７】 前記ポリペプチドが、前記疎水性リンカー領域に対してアミ
   ノ末端位置に存在する分泌シグナル配列をさらに含んでなり、ここで前記分泌シ
   グナル配列が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜22を含んで成る請求
   項６記載の単離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特異的に
   結合する抗体と特異的に結合する、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくと
   も80％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 前記単離されたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列
   に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する請求項８記載の単離さ
   れたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 前記アミノ酸配列と配列番号２の前記対応するアミノ酸配
    列との間のいずれかの差異が１又は複数の保存性アミノ酸置換による請求項８記
    載の単離されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 前記アミノ酸の％同一性が、ktup＝1、 ギャップ開放ペナ
    ルティー＝10、ギャップ延長ペナルティ＝１及び置換マトリックス＝blosum62、
    並びに誤りとして設定される他のパラメーターを有するFASTAプログラムを用い
    て決定される請求項８記載の単離されたポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸残基23〜842を含んで成る単離され
    たポリペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペ
    プチド。
14. 【請求項１４】 ａ）配列番号２の残基23〜64のアミノ酸残基の配列から成
    るポリペプチド； ｂ）配列番号２の残基65〜133のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｃ）配列番号２の残基134〜173のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｄ）配列番号２の残基65〜173のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｅ）配列番号２の残基65〜250のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｆ）配列番号２の残基65〜334のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｇ）配列番号２の残基65〜432のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｈ）配列番号２の残基65〜842のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｉ）配列番号２の残基134〜250のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； ｊ）配列番号２の残基134〜334のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド；
    及び ｋ）配列番号２の残基134〜432のアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド から成る群から選択された、単離されたポリペプチド。
15. 【請求項１５】 親和性標識又は結合ドメインをさらに含んで成る請求項１
    記載の単離されたポリペプチド。
16. 【請求項１６】 追加のポリペプチドに作用可能に結合される、配列番号２
    のアミノ酸残基１〜22のアミノ酸配列を有する分泌シグナル配列を含んで成る融
    合タンパク質。
17. 【請求項１７】 ペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分から
    実質的に成る融合タンパク質であって、前記第1部分が請求項１記載のポリペプ
    チドを含んで成り、そして前記第２部分がもう１つのポリペプチドを含んで成る
    融合タンパク質。
18. 【請求項１８】 請求項１記載のポリペプチドコードする、単離されたポリ
    ヌクレオチド分子。
19. 【請求項１９】 前記フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末
    端位置に存在するαヘリックスリンカー領域をさらに含んで成るポリペプチドを
    コードし、ここで前記αヘリックスリンカー領域が配列番号２のアミノ酸配列の
    アミノ酸残基134〜173を含んで成る請求項１８記載の単離されたポリヌクレオチ
    ド分子。
20. 【請求項２０】 前記ポリヌクレオチドが、αヘリックスリンカー領域、及
    び前記フォリスタチン相同ドメインに対してカルボキシル末端位置に存在するカ
    ルモジュリン相同ドメインをさらに含んで成るポリペプチドをコードし、ここで
    前記αヘリックスリンカー領域及びカルモジュリン相同ドメインが配列番号２の
    アミノ酸配列のアミノ酸残基134〜250を含んで成る請求項１8記載の単離された
    ポリヌクレオチド。
21. 【請求項２１】 前記ポリヌクレオチドが、αヘリックスリンカー領域、カ
    ルモジュリン相同ドメイン、及び前記フォリスタチン相同ドメインに対してカル
    ボキシル末端位置に存在する２種のI−組Igドメインをさらに含んで成るポリペ
    プチドをコードし、ここで前記αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相同
    ドメイン、及びI−組Igドメインが配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134
    〜432を含んで成る請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド。
22. 【請求項２２】 αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相同ドメイン
    、２種のI−組Igドメイン、及び前記フォリスタチン相同ドメインに対してカル
    ボキシル末端位置に存在するカルボキシ−末端ドメインをさらに含んで成るポリ
    ペプチドをコードし、ここで前記αヘリックスリンカー領域、カルモジュリン相
    同ドメイン、２種のI−組Igドメイン、及びカルボキシ−末端ドメインが配列番
    号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基134〜842を含んで成る請求項18記載の単離さ
    れたポリヌクレオチド。
23. 【請求項２３】 前記ポリペプチドが、親和性標識又は結合ドメインをさら
    に含んで成る請求項２２記載の単離されたポリヌクレオチド。
24. 【請求項２４】 請求項１記載のポリペプチドコードする縮重ヌクレオチド
    配列である単離されたポリヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特異的
    に結合する抗体と特異的な結合する、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なく
    とも80％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドコードする単離されたポ
    リヌクレオチド。
26. 【請求項２６】 前記単離されたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配
    列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する請求項２５記載の単
    離されたポリヌクレオチド。
27. 【請求項２７】 前記アミノ酸配列と配列番号２の前記対応するアミノ酸配
    列との間のいずれかの差異が１又は複数の保存性アミノ酸置換による請求項25記
    載の単離されたポリヌクレオチド。
28. 【請求項２８】 前記アミノ酸の％同一性が、ktup＝1、 ギャップ開放ペナ
    ルティー＝10、ギャップ延長ペナルティ＝１及び置換マトリックス＝blosum62、
    並びに誤りとして設定される他のパラメーターを有するFASTAプログラムを用い
    て決定される請求項25記載の単離されたポリヌクレオチド。
29. 【請求項２９】 配列番号１のヌクレオチド183〜2632を含んで成る単離さ
    れたポリヌクレオチド分子。
30. 【請求項３０】 配列番号１のヌクレオチド107〜2632のヌクレオチド配列
    を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
31. 【請求項３１】 配列番号１の単離性ポリヌクレオチド分子。
32. 【請求項３２】 ａ）配列番号１のヌクレオチド107〜172から成るポリヌク
    レオチド； ｂ）配列番号１のヌクレオチド173〜297から成るポリヌクレオチド； ｃ）配列番号１のヌクレオチド298〜505から成るポリヌクレオチド； ｄ）配列番号１のヌクレオチド506〜625から成るポリヌクレオチド； ｅ）配列番号１のヌクレオチド298〜625から成るポリヌクレオチド； ｆ）配列番号１のヌクレオチド298〜856から成るポリヌクレオチド； ｇ）配列番号１のヌクレオチド298〜1108から成るポリヌクレオチド； ｈ）配列番号１のヌクレオチド298〜1402から成るポリヌクレオチド； ｉ）配列番号１のヌクレオチド298〜2632から成るポリヌクレオチド； ｊ）配列番号１のヌクレオチド506〜856から成るポリヌクレオチド； ｋ）配列番号１のヌクレオチド506〜1108から成るポリヌクレオチド； ｌ）配列番号１のヌクレオチド506〜1402から成るポリヌクレオチド；及び ｍ）配列番号１のヌクレオチド506〜2632から成るポリヌクレオチドから成る
    群から選択された、単離されたポリヌクレオチド。
33. 【請求項３３】 追加のポリペプチドに作用可能に結合される、配列番号２
    のアミノ酸残基１〜22のアミノ酸配列を有する分泌シグナル配列を含んで成る融
    合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
34. 【請求項３４】 ペプチド結合により連結される第１部分及び第２部分から
    実質的に成る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記
    第1部分が請求項１記載のポリペプチドを含んで成り、そして前記第２部分がも
    う１つのポリペプチドを含んで成るポリヌクレオチド分子。
35. 【請求項３５】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び 転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター。
36. 【請求項３６】 前記ポリペプチドに作用可能に連結される分泌シグナル配
    列をさらに含んで成る請求項３５記載の発現ベクター。
37. 【請求項３７】 前記ポリヌクレオチドが、親和性標識に対してアミノ末端
    で又はカルボキシ末端で共有結合されるポリペプチドをコードする請求項３５記
    載の発現ベクター。
38. 【請求項３８】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び 転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを導入されている、前記ポリヌ
    クレオチドセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現する培養され
    た細胞。
39. 【請求項３９】 ポリペプチドの生成方法であって、 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び 転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを導入されている細胞を培養し
    、それにより前記細胞は、前記ポリヌクレオチドセグメントによりコードされる
    前記ポリペプチドを発現し；そして 前記発現されたポチペプチドを回収することを含んで成る方法。
40. 【請求項４０】 請求項１記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗
    体又は抗体フラグメント。
41. 【請求項４１】 前記抗体が、 ａ）ポリクローナル抗体； ｂ）ネズミモノクローナル抗体； ｃ）ｂ）に由来するヒト型化された抗体；及び ｄ）ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択される請求項40記載の抗体。
42. 【請求項４２】 前記抗体フラグメントが、F(ab’), F(ab), Fab’, Fab,
    Fv, scFv及び最少認識単位から成る群から選択される請求項41記載の抗体フラグ
    メント。
43. 【請求項４３】 請求項40記載の抗体に対して特異的に結合する抗−イディ
    オタイプ抗体。
44. 【請求項４４】 医薬的に許容できるビークルと組み合わされる請求項１記
    載のポリペプチド。