JP2003523204A - 蛍光共鳴エネルギー移動を用いる細胞融合アッセイ - Google Patents

蛍光共鳴エネルギー移動を用いる細胞融合アッセイ

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Abstract

(57)【要約】 とりわけ融合がウイルス性タンパク質並びにＣＤ４およびケモカインレセプタのごとき細胞性タンパク質の相互作用により媒介される場合の、２つの型の細胞の融合のインヒビターを同定する方法を開示する。方法はウイルス性疾患の処置および予防に有用な物質を同定するのに適している。とりわけ好ましい方法はＨＩＶ−１感染のインヒビターの同定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の相互参照） 適用されない。
【０００２】 （連邦政府により支援された研究開発についての記載） 適用されない。
【０００３】 （添付のマイクロフィッシュの参照） 適用されない。
【０００４】 （発明の分野） 本発明は蛍光共鳴エネルギー移動を用いて細胞の融合を検定する方法を示す。
かかる方法はかかる融合を阻止できる物質の同定に有用である。とりわけ、かか
る方法は特定のウイルス、例えばＨＩＶ−１とその標的細胞との融合を阻止でき
る物質を同定するのに有用である。
【０００５】 （発明の背景） ケモカインはＧタンパク質共役レセプタを介して作用し、種々の生物学的過程
、例えば免疫細胞の炎症、脈管形成、造血および器官形成の部位への動員を制御
する、約７０ないし１００個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖を有するタンパ
ク質の大きなファミリーである。「ケモカイン」なる名称は「ケモアトラクタン
ト（化学誘因物質）」および「サイトカイン」なる用語から派生し、ファミリー
のたいていのメンバーが白血球化学誘因物質およびサイトカイン様活性を有する
という観察に由来する。ケモカインの主要な機能は免疫および炎症中の白血球輸
送の過程のレギュレーターであると考えられている。サイトカインファミリーの
５０以上のメンバーが既知である（Ｗｏｌｐｅ ＆ Ｃｅｒａｍｉ，ＦＡＳＥＢ
Ｊ．３：２５６５−２５７３（１９８９）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、Ａｄｖ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９（１９９４）；Ｌｏｃａｔｉ ＆ Ｍｕ
ｒｐｈｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：４２５−４４０（１９９９）；Ｌｕ
ｓｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：４３６−４４５（１９９８）
）。
【０００６】 ケモカインは保存システイン残基の数およびスペーシングに基づいてサブファ
ミリーに分類されている。ＣＣおよびＣＸＣサブファミリーは４個のシステイン
を有し、始めの２つは隣接している（ＣＣサブファミリー）か、または単一のア
ミノ酸により分けられている（ＣＸＣサブファミリー）のいずれかである。これ
らのサブファミリーの双方は複数のメンバーを有し、広範なケモカインレセプタ
との相互作用により生物学的役割を果たす。加えて、さらに２つのケモカインフ
ァミリーがある：アミノ酸の介在のないＣファミリーおよび３個のアミノ酸が介
在するＣＸＸＸＣファミリーである。
【０００７】 少なくとも１５個の型のケモカインレセプタがあり、各々の型のレセプタは一
般に特定のケモカインのサブファミリーに結合することができる。レセプタの名
称はサブファミリーに限定的な結合特性を反映している。従って、ＣＸＣケモカ
インに結合するレセプタはＣＸＣＲとして既知であり；ＣＣケモカインに結合す
るこれらのレセプタはＣＣＲとして既知である。一般にサブファミリー特異的な
名称は特定のレセプタの発見順序を反映する数が後に続く。従って、ＣＸＣＲ４
は４番目に発見され、ケモカインのＣＸＣサブファミリーに特異的であった。ケ
モカインレセプタはロドプシン様７−膜貫通（７−ＴＭ）、Ｇタンパク質結合レ
セプタ（ＧＰＣＲ）の大きなクラスに属している。これらは一般にＧｉ型タンパ
ク質に結合する（Ｍｕｒｐｈｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９
３−６３３（１９９４）；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．７：４７−６４（１９９６）；Ｙｏｓｈｉｅら、Ｊ．Ｌｅ
ｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６２：６３４−６４４（１９９７））。
【０００８】 特定のケモカインがインビトロでＨＩＶ−１ウイルス感染を抑制し得るという
発見に伴ない、ケモカイン研究において重要な開発が為された。ウイルスエンベ
ロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）と特定のケモカインレセプタとの相互作用の遮断
によりこの効果を決定した。ＨＩＶ−１全ての株の１次レセプタは、Ｔ細胞およ
び特定のその他の細胞に見出される膜タンパク質であるＣＤ４であるが、株特異
的ケモカインレセプタもまたコレセプタとして必要である。Ｅｎｖ、ＣＤ４およ
びケモカインレセプタの相互作用により、ウイルスおよび標的細胞膜の融合に至
る（Ｆｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８７２−８７７（１９６６）；Ｃｏ
ｃｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１８１１−１８１５（１９９５）；Ｂｅ
ｒｇｅｒ、ＡＩＤＳ １１（Ｓｕｐｐｌｅ．Ａ）：Ｓ３−１６（１９９７）；Ｒ
ｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７１：８９９９−９００７（１９９７）；Ｗｙａ
ｔｔ ＆ Ｓｏｄｒｏｓｋｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１８８４−１８８８（
１９９８））。
【０００９】 最も広範に使用されているＨＩＶ−１のケモカインコレセプタはＣＣＲ５およ
びＣＸＣＲ４である。実際に全ての１次ＨＩＶ−１単離体はＣＸＣＲ４、ＣＣＲ
５のいずれかまたは双方共に用いる（Ｓｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３８３：７
６８（１９９６）；Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：６２１−６
２８（１９９７）；Ｂｊｏｒｎｄａｌら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７１：７４７８−７４
８７（１９９７）；Ｓｃａｒｌａｔｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２５
９−１２６５（１９９７）；Ｂａｚａｎら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７２：４４８５−４
４９１（１９９８））。興味深いが、未だ完全には説明されていない、ＨＩＶ−
１単離体に対する指向性がある。ＣＣＲ５特異的株は初期感染および臨床潜伏期
間に関係し、一方ＣＸＣＲ４特異的株は免疫系崩壊およびＡＩＤＳを含む感染の
後期段階に関係する。前者の株はインビトロで１次マクロファージに感染でき、
後者の株はＲ細胞系に感染できる。この細胞指向性は、２つの標的細胞型におけ
るケモカインレセプタ発現の異なるパターンに依るものと理解される；マクロフ
ァージはＣＣＲ５を発現するが、Ｔ細胞はＣＸＣＲ４を発現する。一般に、ＨＩ
Ｖ−１単離体のＥｎｖの特定のケモカインレセプタを認識する能力、およびＣＤ
４＋標的細胞におけるこれらのケモカインレセプタの発現パターンによりＨＩＶ
−１指向性を説明できる。実際に、指向性はＣＣＲ５（Ｒ５指向性ウイルス）、
ＣＸＣＲ４（Ｘ４指向性ウイルス）、またはＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４（Ｒ５Ｘ
４）の双方の使用に基づいて再決定された。有用ではあるが、この簡便化された
概念は時折混乱を招くことがある。例えば、マクロファージはＣＣＲ５に加えて
ＣＸＣＲ４を発現する。マクロファージのＸ４指向性ウイルスに対する遮断は侵
入後に生じる。ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４はインビボで利用される主要なコレセ
プタであるが、多くのその他のケモカインレセプタおよび関連するオーファンレ
セプタ、例えばＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ８、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＳＴＲＬ３３／
ＢＯＮＺＯ、Ｇｐｒ１、ＧＰＲ１５およびＡＰＪなどもまたインビトロでＨＩＶ
−１コレセプタ活性を有する（Ｂｅｒｇｅｒ、ＡＩＤＳ １１（Ｓｕｐｐｌｅ．
Ａ）：Ｓ３−１６；Ｒｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７１：８９９９−９００７
（１９９７））。
【００１０】 ＨＩＶ−１感染の病原性およびＡＩＤＳの進行におけるＣＣＲ５の役割が明確
に示されている。ＨＩＶ−１感染したヒトでは一般の集団よりも約２０倍低い頻
度で、トランケートされた不活性レセプタ（ＣＣＲ５ ｄ３２）に至る３２個の
塩基対の欠失を伴なう変異アレルがホモ接合形態で見出されており、これは実質
的な保護効果を示している（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ ８６：３５７−３７７（１９
９６）；Ｄｅａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１８５６−１８６２（１９９６
））。ケモカインまたはそのレセプタのその他の多形性はＨＩＶ−１病原性に対
する抵抗性の種々のレベルと関連することが解っている。特記すべきことはＳＤ
Ｆ−１ ｍＲＮＡの３‘非翻訳領域の多形性である。ＳＤＦ−１はＣＸＣＲ４の
ケモカインリガンドである（Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３８
９−３９３（１９９８））。分子疫学的研究に加えて、多くのインビトロでの証
拠がケモカインレセプタがＨＩＶ−１病原性において役割を果たすことを強く示
唆している。例えばＣＣＲ５リガンドＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡ
ＮＴＥＳは特定の培養細胞においてＨＩＶ−１複製を抑制できる（Ｃｏｃｃｊｏ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１８１１−１８１５（１９９５））。さらに、低
分子量ビシクラム化合物、ＡＭＤ３１００はＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいてＨＩ
Ｖ−１複製を阻止する（Ｄａｔｅｍａら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：７５０−７５４（１９９６））。ＡＭＤ３１００
はＣＸＣＲ４コレセプタとのウイルス相互作用を遮断することにより作用する（
Ｓｃｈｏｌｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１３８３−１３８８（１９９７
））。
【００１１】 ケモカインレセプタがＨＩＶ−１病原性に関与するので、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ
タンパク質およびケモカインレセプタの相互作用を阻止できる物質を同定するこ
とは非常に興味深いことである。しかしながら、今のところかかるインヒビター
を同定する満足できる方法が欠如している。
【００１２】 Ｎｕｓｓｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５４１１−５４２２（１９９４
）およびＦｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８７２−８７７（１９９６）は
第１の細胞がＨＩＶエンベロープタンパク質およびバクテリオファージＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼをコードするワクシナウイルスで感染させた系を開示した。第２
の細胞はＣＤ４、ケモカインレセプタ、およびＴ７プロモーター調節下の大腸菌
ＬａｃＺ遺伝子を発現した。２つの細胞の融合時に、第１の細胞からのＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼは第２の細胞からのＬａｃＺリポーター遺伝子を転写し、リポ
ーター遺伝子産物の活性を測定した。リポーターからの読み出しを抑制する能力
によりＨＩＶ融合のインヒビターを同定した。この系には多くの不利な点がある
：一般に、リポーターからの読み出しを生じる前に時間が過ぎるにはずである；
ワクシナウイルスの使用にはクラス２のバイオセーフティー条件が必要である；
ウイルス集合および複製を遮断する物質、例えばアラＣまたはリファマイシンを
使用しなければならない；並びにアッセイはＴ７プロモーターの転写活性に依存
するので、かかるインヒビターが融合に影響するかどうかには関係なく、一般に
転写のインヒビターを同定する。
【００１３】 蛍光に基づくいくつかのアッセイが開発されている。Ｗｅｉｓｓら、ＡＩＤＳ １０：２４１−２４６（１９９６）はリンパ球（懸濁液中で成長する細胞）を
細胞内蛍光染料で標識し、融合を生じる条件下で標識したリンパ球を未標識付着
細胞と混合した。走査顕微鏡視野により融合の発生を蛍光付着細胞の存在に関し
てモニター観察した。このアッセイは蛍光共鳴エネルギー移動を利用せず、使用
する２つの細胞型が形態学的に区別されなければならないという欠点がある。ま
た、アッセイは定量には困難である。
【００１４】 融合すべき２つの細胞が２つの異なる蛍光色素で、重複した発光および励起ス
ペクトルを有する色素で標識された類似のアッセイが開発された（Ｌｉｔｔｗｉ
ｎら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７０：６４３７−６４４１（１９９６）（Ｌｉｔｔｗｉｎ
）；国際特許出願ＷＯ９６／４１０２０）。第１の発光スペクトルが第２の吸収
スペクトルと重複するように第１および第２の色素を選択する。２つの細胞間で
融合がない場合、２つの色素が物理的に互いに近接する可能性があまりないので
、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がほとんど観察されない。しかしながら
２つの細胞が融合する条件下で混合する場合、２つの色素は融合膜内で極めて接
近し、従って２つの色素間でＦＲＥＴを生じることができる。融合のインヒビタ
ーの存在下２つの細胞を混合する場合、ＦＲＥＴはほとんどまたは全く観察され
ない。ＦＲＥＴを低減または防御できるこれらの化合物に関して化合物の収集物
をスクリーニングすることにより、融合のインヒビターである化合物を同定する
。Ｌｉｔｗｉｎおよび国際特許出願ＷＯ９６／４１０２０に記載されたアッセイ
は異なる色素が各細胞の膜に組み込まれなければならないので、２つの物理的に
異なる色素を使用する必要がある。またＬｉｔｗｉｎおよび国際特許出願ＷＯ９
６／４１０２０は融合過程におけるケモカインレセプタの重要性を開示していな
い。従って、Ｌｉｔｗｉｎおよび国際特許出願ＷＯ９６／４１０２０に記載され
た方法の成功は、ＣＤ４および適当なケモカインレセプタを同時発現する細胞型
の偶然の選別に依存する。加えて、このアッセイでは２つの異なる細胞型を各々
別個の蛍光色素で別個に標識する必要がある。
【００１５】 ＦＲＥＴに基づくシグナル伝達を研究するための非常に感受性の良いアッセイ
がＺｌｏｋａｒｎｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：８４−８８（１９９８）（
Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ）および米国特許第５７４１６５７号にも開示されている。
Ｚｌｏｋａｒｎｉｋおよび米国特許第５７４１６５７号に開示されているアッセ
イは、リガンド−レセプタ相互作用により活性化される細胞内シグナル発生経路
の結果として生じる転写活性化の研究のために設計される。アッセイでは誘導プ
ロモーターの調節下βラクタマーゼをコードするプラスミドを用いる。このプラ
スミドは、アゴニストを同定するの望ましいレセプタをコードするプラスミドと
一緒に細胞にトランスフェクトされる。βラクタマーゼの誘導プロモーターは、
アゴニストがレセプタに結合するときに生じる少なくとも１つの細胞内シグナル
に応答するように選択される。従って、アゴニストのレセプタへのかかる結合の
後、トランスフェクトされた細胞におけるβラクタマーゼレベルが増加する。β
ラクタマーゼのこの増加は、βラクタマーゼの基質である細胞透過性色素で細胞
を処理することにより測定できる。色素は２つの蛍光部分を含有する。無傷の色
素では、２つの蛍光部分は十分に互いに接近していて、両者間でＦＲＥＴを生じ
ることができる。βラクタマーゼにより色素を２つの部分に切断した後、２つの
蛍光部分は異なる部分に位置し、従って別個に拡散することができる。これは蛍
光部分間の距離増加させ、両者間で生じ得るＦＲＥＴの量を低下させる。アッセ
イで測定するのはこのＦＲＥＴの低下である。Ｚｌｏｋａｒｎｉｋはこのアッセ
イを用いてＭ１ムスカリンレセプタのインヒビターを同定した。Ｚｌｏｋａｒｎ
ｉｋは一般の膜融合並びにとりわけＨＩＶ−１および標的細胞の相互作用を研究
するためのこのアッセイの使用を開示しなかった。
【００１６】 （発明の概要） 本発明は、その一方は酵素βラクタマーゼを含有し、他方はβラクタマーゼの
蛍光基質を含有する、２つの型の細胞の融合のインヒビターを同定する方法を示
す。基質は、βラクタマーゼにより切断できるリンカーにより連結された２つの
部分を含んでなる化合物である。各々の部分は独立した蛍光であり、一方の部分
の発光スペクトルは他方の部分の吸収スペクトルと重複する。基質の分子の立体
配置は、リンカーが無傷である場合、２つの蛍光部分間で蛍光吸収エネルギー移
動（ＦＲＥＴ）を生じ得るようにする。リンカーがβラクタマーゼにより切断さ
れている場合、２つの部分はもはや物理的に連結されておらず、従って別個に拡
散できる。これによりＦＲＥＴは完全に無くなるか、または非常に低減されるか
のいずれかになる。
【００１７】 ２つの細胞間の融合が存在しないとき、２つの細胞の細胞質が別個である場合
、蛍光基質のリンカーが無傷であるのでＦＲＥＴが観察されない。融合後、２つ
の細胞質が混合された場合、一方の細胞からのβラクタマーゼが他方の細胞から
の基質を切断し、ＦＲＥＴを低減するかまたは完全に無くする。従って、ＦＲＥ
Ｔの測定を、２つの型の細胞間で生じた融合の量の測定として提供できる。
【００１８】 方法の説明では、２つの細胞型は付着細胞および懸濁細胞である。懸濁細胞は
βラクタマーゼを含有するが、付着細胞は含有しない。２つの細胞間で融合を生
じるのに適した条件および時間で懸濁細胞を付着細胞のローンの上に積層する。
適当な時間の後、いずれかの融合していない懸濁細胞を洗い流し、融合した懸濁
および付着細胞のローン、並びにいずれかの融合していない付着細胞を残す。次
いで融合した懸濁および付着細胞並びにいずれかの融合していない付着細胞の細
胞質に基質が侵入するような時間および条件下でβラクタマーゼの基質にこのロ
ーンを暴露する。融合を生じていた場合、融合した懸濁および付着細胞の細胞質
は懸濁細胞からのβラクタマーゼを含有する。βラクタマーゼは基質のリンカー
を切断し、基質からのＦＲＥＴを完全に無くするかまたは低減させる。融合が生
じていなかった場合、βラクタマーゼが懸濁細胞により分配されていないので、
基質のリンカーは切断されず、ＦＲＥＴは生じる。
【００１９】 この方法を用いて２つの細胞型の細胞質膜の特定のタンパク質の存在に依存す
る融合をモニター観察できる。特定の実施形態では、この方法を用いて一方の細
胞の細胞質膜のＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質並びに他方の細胞の細胞質膜のＣ
Ｄ４およびケモカインレセプタにより媒介される融合のインヒビターを同定する
。この実施形態では、ＨＩＶ−１感染中に生じる融合過程のモデルとして２つの
細胞を提供する。従って、本発明を用いて同定されるインヒビターはＨＩＶ−１
感染およびＡＩＤＳの影響を防御または改善する薬物として有用であると期待さ
れる。
【００２０】 （図面の簡単な説明） 図１は、第１の細胞の細胞質膜のウイルスタンパク質および第２の細胞の細胞
質膜の２つの細胞表面タンパク質により媒介される本発明の一般的な特徴を示す
。
【００２１】 図２は無傷のＣＣＦ２（点線）およびβラクタマーゼによりフルオレセインが
切断された後のＣＣＦ２（実線）の発行スペクトルを示す。
【００２２】 図３はＣＸＣＲ４の天然のリガンドであるＳＤＦ−１による、ＣＤ４、ＣＸＣ
Ｒ４、およびＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質ｇｐ１４３により媒介される融合の
用量依存的阻止を示すグラフである。
【００２３】 図４は可溶性ＣＤ４による、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、およびＨＩＶ−１ Ｅｎｖ
タンパク質ｇｐ１４３により媒介される融合の用量依存的阻止を示すグラフであ
る。
【００２４】 図５Ａ−Ｄは発現ベクターｐＶ１ＪｎｅｏのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す
。
【００２５】 （発明の詳細な説明） 本発明は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定により２つの細胞型の融
合をモニター観察する方法を提供する。ＦＲＥＴは分子内ロングレンジ双極子間
カップリングの手段によりエネルギーが励起供与蛍光試薬から受容蛍光試薬にエ
ネルギーが移動する過程である。ＦＲＥＴは典型的には約１０Åないし１００Å
の距離を越えて生じ、供与試薬の発光スペクトルおよび受容試薬の吸収スペクト
ルが十分に重複し、供与体の収量および受容体の吸収係数が十分に高いことが必
要とされる。理想的には、供与体の蛍光収量は高く（好ましくは１００％に近い
）、受容体は供与体の発光波長と一致する波長で大きな吸光係数を有する。加え
て、供与および受容蛍光試薬の遷移双極子は互いに相対して適切に配向しなけれ
ばならない。ＦＲＥＴの概説および生物学的な系におけるその適用にはＣｌｅｇ
ｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１０３−１１０（１９９５）を参照のこと。
【００２６】 最も一般的な実施形態では、本発明は一方の細胞型のみがβラクタマーゼを発
現し、基質がβラクタマーゼにより切断されやすいリンカーにより連結されてい
る２つの蛍光部分を含んでなる化合物である、βラクタマーゼの蛍光基質からＦ
ＲＥＴが測定され、２つの蛍光部分を一方の発光スペクトルが他方の吸収スペク
トルと重複するように選択する、ＦＲＥＴの測定により２つの細胞型の融合をモ
ニター観察する方法を提供する。２つの細胞型が融合していない場合、ＦＲＥＴ
は基質の２つの蛍光部分間に生じる。２つの細胞型が融合している場合、蛍光基
質はβラクタマーゼにより切断され、２つの蛍光部分が分離され、ＦＲＥＴが低
減または全く無くなる。このようにＦＲＥＴの量の測定により融合を生じている
量が提示される。
【００２７】 従って、本発明は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定により２つの細
胞間で生じる融合の量を決定する方法であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む物質であり、
一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカー
が無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができる
が、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｃ）第１および第２の細胞間の融合が存在しない場合に第２の細胞の基質か
らＦＲＥＴの量を測定するステップ； （ｄ）融合を生じるような条件下で第１および第２の細胞を接触させるステッ
プ； （ｅ）融合を生じた後、基質からのＦＲＥＴの量を測定するステップ； を含み、 ここでステップ（ｃ）で測定されたＦＲＥＴの量がステップ（ｅ）で測定された
ＦＲＥＴの量と異なり、より多い場合、次に融合を生じ、差異が大きいほど融合
の量が多いことを示している。
【００２８】 本発明はさらに第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法を
包含し； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
るが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）前記物質の存在下および不在下で工程（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定する
ステップ； を含み、ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い
場合、前記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである。
【００２９】 またβラクタマーゼの蛍光基質を含有する第２の細胞を用いるよりもむしろ融
合を生じた後、融合した第１および第２の細胞に基質を添加する方法で本発明を
実施することもできる。本発明のかかる見解はとりわけ第１の細胞が懸濁培養物
中で成長する細胞であり（本明細書では「懸濁細胞」と称する）、第２の細胞は
組織培養プレート上単層で付着細胞として成長する細胞である（本明細書では「
付着細胞」と称する）場合に適している。
【００３０】 従って、本発明は第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法
を包含し； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
１の細胞が懸濁細胞であるステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しない第２の細胞を提供するステップであって、
第２の細胞が付着細胞であるステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）融合していない第１の細胞を洗い流すステップ； （ｅ）基質が融合した細胞の細胞質および融合していない付着細胞の細胞質に
取りこまれるような条件および十分な時間で、ステップ（ｄ）後の細胞をβラク
タマーゼの蛍光基質に曝露するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼ
により切断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合
物であり、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し
、リンカーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるこ
とができるが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｆ）融合した細胞中の基質からＦＲＥＴの量を測定するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである。
【００３１】 特定の実施形態では、融合は細胞の細胞質膜中または膜上で見出されるタンパ
ク質により媒介される。「媒介される」とはタンパク質の不在下では著明な程度
に融合を生じないことを意味する。タンパク質は（ａ）通常のウイルス感染の進
行中にウイルスタンパク質がウイルスとその標的細胞との融合を通常媒介する細
胞の１つの型の細胞質膜中または膜上のウイルスタンパク質；（ｂ）ウイルスに
よる標的細胞の天然の感染の進行中にウイルスタンパク質により認識される標的
細胞からのタンパク質または複数のタンパク質でよい。これらの実施形態では、
本発明の方法はウイルス疾患を処置または防御できる物質である、融合のインヒ
ビターを同定するのに有用である。
【００３２】 図１は本発明の実施形態の図式的な説明であり、ここで融合は第１の細胞の細
胞質膜のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１４３）および第２の細胞
の細胞質膜のＣＤ４およびＣＸＣＲ４タンパク質の存在により媒介される。蛍光
基質ＣＣＦ２（本明細書にて記載）は第１の細胞に存在し、一方βラクタマーゼ
酵素は第２の細胞に存在する。融合細胞のＣＣＦ２の受容対蛍光部分上の「Ｘ」
はＦＲＥＴが完全に無くなったかまたは低減したことを示している。
【００３３】 本発明は第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法を包含し
； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
１の細胞が、ＣＤ４およびケモカインレセプタをも発現するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
るが、リンカーが切断されている場合には生じず、第２の細胞が融合を媒介する
ウイルスタンパク質をも発現するステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）前記物質の存在下または不在下でステップ（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定
するステップ； を含み、ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い
場合、前記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである。
【００３４】 本発明は第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法を包含し
； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
１の細胞が融合を媒介するウイルス性タンパク質をも発現するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
るが、リンカーが切断されている場合には生じず、第２の細胞がＣＤ４およびケ
モカインレセプタをも発現するステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）前記物質の存在下または不在下でステップ（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定
するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである。
【００３５】 本発明は第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法を包含し
； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
１の細胞がＣＤ４およびケモカインレセプタをも発現する懸濁細胞であるステッ
プ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しない第２の細胞を提供するステップであって、
第２の細胞が第１および第２の細胞の融合を媒介するウイルス性タンパク質を発
現する付着細胞であるステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、当該物
質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）融合していない第１の細胞を洗い流すステップ； （ｅ）基質が融合した細胞の細胞質および融合していない付着細胞の細胞質に
取りこまれるような条件および十分な時間で、融合細胞をβラクタマーゼの蛍光
基質に曝露するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切断され
やすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり、一方
の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカーが無
傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができるが、
リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｆ）融合した細胞中または融合していない付着細胞中の基質からＦＲＥＴの
量を測定するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである。
【００３６】 本発明の特定の実施形態では融合を媒介するタンパク質またはポリペプチド（
例えばＣＤ４、Ｅｎｖ、ケモカインレセプタ）は天然に（すなわちヒトの介入な
しに）細胞により発現される。別の実施形態では、融合を媒介するタンパク質ま
たはポリペプチドは細胞において組換え的に発現される。組換え発現は当業者に
既知のトランスフェクション方法により達成できる。融合を媒介するタンパク質
またはポリペプチドをコードする発現ベクターで一過性にまたは安定してトラン
スフェクトされている細胞で本発明の方法を実施できる。トランスフェクション
とは当業者に既知のいかなる方法をも包含することを意味する。例えばトランス
フェクションにはリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム媒介のトランスフェク
ション、インフェクション、リポフェクション、レトロウイルス構築物での感染
、およびエレクトロポレーションなどが含まれる。一過性にトランスフェクトさ
れている細胞を用いる場合、トランスフェクションの後７２時間以内に、好まし
くは約２４時間以内にかかる細胞を融合するのがしばしば好ましい。
【００３７】 特定の実施形態では、Ｅｎｖタンパク質の過剰発現に随伴するいずれかの潜在
する毒性問題を打破するために、誘導プロモーターの調節下ＨＩＶ−１Ｅｎｖタ
ンパク質を発現するのが望ましい。適する誘導プロモータは当業者に既知である
。
【００３８】 特定の実施形態では、ケモカインレセプタはヒトケモカインレセプタである。
種々のケモカインレセプタを本発明で用いることができる。表１．６６３頁およ
び添付のＢｅｒｇｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：６５７−７
００（１９９９）の文献は適切な多くのケモカインレセプタを列挙する。これら
には：ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＲ８、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ９
、ＣＣＲ３、ＳＴＲＬ３３／ＢＯＮＺＯ、ＧＰＲ１５／ＢＯＢおよびＡＰＪなど
がある。ロイコトリエンＢ４レセプタであるＢＬＴＲは、オーファンレセプタＣ
ｈｅｍ Ｒ２３を有するので（Ｓｍｓｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
８：１６８９−１７００（１９９８））、ＨＩＶ−１コレセプタ活性を有すると
報告されている（Ｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｃｈ
ｅｍ．ＵＳＡ ９５：９５３０−９５３４（１９９８））。従ってこれらのレセ
プタもまた適している。
【００３９】 本発明の使用に適する融合を媒介するタンパク質は通常ヒトタンパク質である
が、同様に別の種のタンパク質の使用も適している。例えば、ネズミＣＸＣＲ４
は特定のＨＩＶ−１株のコレセプタとして機能でき、従ってこれらの株のインヒ
ビターを同定する方法に使用するのに適している。しかしながら、ネズミＣＣＲ
５はコレセプタとして機能せず、従って適していない。
【００４０】 融合のインヒビターを同定する前記の方法を、明確に説明するために、「１つ
の」物質が融合のインヒビターであるかどうかを試験するように明示的に指示す
るが、物質コレクション（例えばコンビナトリアルライブラリー、ファージディ
スプレイライブラリー、天然生成物のコレクション、または最適化プログラムに
導かれた医薬品化学のの生成物）のいずれかのメンバーが融合のインヒビターで
あるかどうかを決定するために、かかる方法をかかるコレクションの試験に適用
できることは当業者には明白であろう。従って、物質のコレクションの使用、ま
たはかかるコレクションのサブセット、またはかかるコレクションの個々のメン
バーは前記の方法における物質として本発明の範囲内である。
【００４１】 本発明の方法は一般に「１つの」第１の細胞および「１つの」第２の細胞を利
用すると記載されている。明確に説明するために単一の物質を使用する。細胞を
組織培養で成長させ、次いで該方法で使用するので、通常複数の、しばしば数千
または数百万もの第１細胞および第２細胞を用いて該方法を実施することは当業
者に理解されよう。
【００４２】 本発明の特定の実施形態では、使用した細胞は天然にはケモカインレセプタを
発現しない。代わりに、細胞表面上でケモカインレセプタを発現させるために、
ケモカインレセプタをコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトする。ケモカ
インレセプタをコードするＤＮＡを当業者に既知の方法により入手することがで
きる。例えば、適当なプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を
用いてｃＤＮＡライブラリーからケモカインレセプタをコードするｃＤＮＡフラ
グメントを単離することができる。かかるプライマー対を入手が望まれるケモカ
インレセプタの既知のＤＮＡ配列に基づいて選別することができる。例えば、Ｒ
ａｎｄｏｌｐｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：２１５９−２１６２（１９９９）
の２１６２頁では、ネズミＴＨ１細胞からＰＣＲによりＣＣＲ７をコードするｃ
ＤＮＡをクローニングするための以下のプライマーの使用について開示している
： ５’−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧ−３’（
配列番号２）および ５‘−ＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧ−３’ （配列番号３）。
【００４３】 類似の方法で、当業者はヒトケモカインレセプタをコードするＤＮＡを得るた
めに、（そこからｃＤＮＡライブラリーを作成するための適当な組織を選別する
ための）公開されたケモカインレセプタ配列、および公開されたヒトケモカイン
レセプタ発現の研究を使用することができる。以下の文献はこの観点から有用で
ある： ・ゲンバンクアクセッション番号ＡＦ００５０５８（ヒトＣＸＣＲ４） ・ゲンバンクアクセッション番号Ｄ４９９１９（ヒトＣＣＲ２） ・Ｋａｔｏら、Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．１：９７−１０４（１９９９）および
ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ０２３８８７（ヒトＣＣＲ３） ・Ｋａｔｏら、Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．１：９７−１０４（１９９９）および
ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ０２３８８８（ヒトＣＣＲ４） ・Ｋａｔｏら、Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．１：９７−１０４（１９９９）および
ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ０２３８８９（ヒトＣＣＲ４） ・Ｍｕｍｉｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０６６２−３０６７１
（１９９７）およびゲンバンクアクセッション番号ＨＳＣＣＲ５ＡＢ２（ヒトＣ
ＣＲ５） ・Ｂａｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４８９３−１４８９８（１
９９７）およびゲンバンクアクセッション番号ＨＳＵ４５９８４（ヒトＣＣＲ６
） ・Ｔｉｆｆａｎｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１６５−１７０（１９９７
）およびゲンバンクアクセッション番号ＨＳＵ４５９８３（ヒトＣＣＲ８） ・Ｚａｂａｌｌｏｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５６７１−５６７５（１
９９９）およびゲンバンクアクセッション番号ＨＳＡ１３２３３７（ヒトＣＣＲ
９） ・Ｂｏｎｉｎｉら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：１２４９−１２５６（
１９９７）およびゲンバンクアクセッション番号ＨＳＵ９４８８（ヒトＣＣＲ１
０） 種々の耐熱性酵素、非限定例としてはＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＧｏｌｄまたはＶｅｎｔポリメラーゼなどを用いてＰＣＲ反応を実施できる。Ａ
ｍｐｌｉＴａｑに関しては、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、２．０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、５０ｍＭ ＫＣｌ、各プライマー
０．２μＭ、ＤＮＡ鋳型 １０ｎｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ０．０５単位／μｌ
中で反応を実施できる。反応物を９５℃で３分間加熱し、適当なサイクリングパ
ラメーター、非限定例としては９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で
３分間などを用いて３５回循環させる。これらの条件に加えて、種々の適当なＰ
ＣＲプロトコルをＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１
９９５）；またはＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｉｃｈａｅｌら編、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に見出すことができる。
【００４４】 望ましいケモカインレセプタが実際に得られたことを確認するために、本明細
書に記載する方法により得られたクローンをシークエンシングするのが望ましい
。ｃＤＮＡクローンを適当なクローニングベクターまたは発現ベクター、例えば
哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ
、カリフォルニア州）または当業界で既知のもしくは本明細書に記載のその他の
発現ベクターにサブクローニングできる。
【００４５】 前記のＰＣＲ法の別法として、ケモカインレセプタをコードするｃＤＮＡクロ
ーンをプローブとして望ましいケモカインレセプタに特異的なオリゴヌクレオチ
ドを用いてｃＤＮＡライブラリーから単離でき、オリゴヌクレオチドプローブで
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は当該分野で既知である。かか
る方法はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ；Ｃｌｏｖｅｒ Ｄ．Ｍ．（編）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，
Ｕ．Ｋ．Ｉ，ＩＩ巻に記載されている。特定のケモカインレセプタに特異的であ
り、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができるオリ
ゴヌクレオチドをケモカインレセプタの既知のＤＮＡ配列に基づいて容易に設計
でき、当業者に既知の方法により合成できる。
【００４６】 類似の方法では、ＣＤ４およびウイルスタンパク質を本発明を用いて細胞の表
面に組換え的に発現できる。公開された配列を用いてＣＤ４およびウイルスタン
パク質を単離し、ケモカインレセプタに関してはＰＣＲまたはオリゴヌクレオチ
ドヌクレオチドハイブリダイゼーションにより適当な発現ベクターにクローニン
グできる。ヒトＣＤ４をコードするｃＤＮＡの配列はＭａｄｄｏｎら、Ｃｅｌｌ
４２：９３−１０４（１９８５）に開示されている。ＨＩＶ−１ ＢＨ８株か
らのＥｎｖ遺伝子の配列はＲａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２
８４（１９８５）に開示されている。ＨＩＶ−１ ＳＦ２株からのＥｎｖ遺伝子
の配列はＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：４８
４−４９２（１９８５）に開示されている。ＨＩＶ−１ ＪＲ−ＦＬ株からのＥ
ｎｖ遺伝子の配列はＯ’Ｂｒｉｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：６９−７３（１
９９０）に開示されている。ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２株からのＥｎｖ遺伝子の配
列はＣｈｅｎｇ−Ｍａｙｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４３９０−４３９８（
１９９０）に開示されている。ＨＩＶ−１ ＪＲ−ＦＬ株からのＥｎｖタンパク
質の発現、およびＨｅｌａ細胞においてＥｎｖタンパク質を発現させるためのベ
クターでのＨｅＬａ細胞のトランスフェクションは国際特許出願ＷＯ９６／４１
０２０に記載されている。
【００４７】 特定の実施形態では、前記の方法のウイルスタンパク質はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ
タンパク質である。関連するＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質の多くはＨＩＶ−１
の異なる株に由来し、本発明の使用に適している。特定の実施形態では、ＨＩＶ
−１ Ｅｎｖタンパク質は：Ｍ指向性株ＪＲ−ＦＬ、ＪＲ−ＣＳＦ、ＢａＬ、Ｓ
Ｆ１６２、ＹＵ２；ＡＤＡ；Ｔ指向性株ＬＡＩ、ＩＩＩＢ、ＭＮ、ＳＦ２、ＮＬ
４−３、ＳＦ３３、ＮＤＫおよびデュアルトロピック株、例えば８９．６、６９
．６Ｐ、ＤＨ１２３；からなる群から選択されるＨＩＶ−１の株に由来するＥｎ
ｖタンパク質である。また、ウイルスタンパク質はＨＩＶ−２株（例えばＲＯＤ
、ＧＵＮ、ＵＣ１、ＳＴ）からおよび／またはＳＩＶ株（例えばＳＩＶｍａｃ２
５１，ＳＩＶａｇｍ，ＳＩＶｍａｃ２３９）に由来してもよい。
【００４８】 ＨＩＶの毒性の１次フィールド単離体からのＥｎｖ遺伝子は本発明で使用する
のに適している。ウイルスからのＥｎｖ遺伝子のｃＤＮＡコピーを調製し、次い
で適当な発現ベクターに遺伝子をサブクローニングすることによりこれを達成す
る。これらのウイルスを利用するために、多くのＨＩＶ株のＥｎｖ遺伝子配列は
現在ゲンバンクで公に入手可能であり、ＨＩＶの１次フィールド単離体はＱｕａ
ｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，７５８１ Ｌｉｎｄｂｅｒｇｈ
Ｄｒｉｖｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８７９と契約
しているアレルギーおよび感染性疾患研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ（ＮＩＡＩＤ））から入手可能である。かかる株はまた世界保健機構（ＷＨ
Ｏ）［ＨＩＶ単離および特徴づけのためのネットワーク、ワクチン開発ユニット
、研究所事務所、ＡＩＤＳに関するグローバルプログラム、ＣＨ−１２１１ Ｇ
ｅｎｅｖａ ２７，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］からも入手可能である。
【００４９】 また別に、ＨＩＶ Ｅｎｖ遺伝子を、ＨＩＶ患者に由来するＣｏｎＡ処置によ
り活性化した感染ＰＢＭＣからクローニングすることができる。ウイルスゲノム
を入手するための好ましい方法は、望ましいＥｎｖ遺伝子をフランキングする特
異的オリゴマーを用いて感染細胞ゲノムからＰＣＲ増幅することによる。ウイル
スゲノムを入手するための第２の方法は、感染細胞の上澄からウイルスＲＮＡを
精製し、続くＰＣＲでこの物質からｃＤＮＡを調製することによる。
【００５０】 ＳＴＥ溶液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）での溶解により感染細胞ペレットからゲノムＤＮＡを精
製し、これにプロテイナーゼＫおよびＳＤＳを加え、各々最終濃度０．１ｍｇ／
ｍｌおよび０．５％にする。この混合物を５６℃で一晩インキュベートし、フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の０．５容量
で抽出する。次いで最終濃度０．３Ｍになるように酢酸ナトリウム、および冷エ
タノール２容量を添加してして水相を沈殿させる。溶液からＤＮＡをペレット化
した後、ＤＮＡを０．１Ｘ ＴＥ溶液に再懸濁する（１Ｘ ＴＥ＝１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）。この点でＳＤＳをＲＮアー
ゼＡ ２単位と共に加えて０．１％にし、３７℃で３０分間インキュベートする
。この溶液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次い
で前記のようにエタノールで沈殿させる。ＤＮＡを０．１Ｘ ＴＥに再懸濁し、
２６０ｎｍでその紫外吸収を測定することにより定量する。ＰＣＲで使用するま
でサンプルを−２０℃で保存する。
【００５１】 Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓキット、並びに以下のｇｐ１６０のセ
ンスおよびアンチセンスオリゴマー：５’ＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＧ
Ａ ＣＡＧ ＴＧＧ ＣＡＡ ＴＧＡ−３’（配列番号４）および５’−ＧＧＧ
ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＡＡ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ＣＣＣ
ＧＧＧ Ｃ ＡＴＧ ＴＧＧ−３’（配列番号５）を各々用いる方法を用いて
ＰＣＲを実施する。これらのオリゴマーは得られたＤＮＡフラグメントの３’末
端でＳｒｆＩ部位を付け加える。ＰＣＲ誘導されたセグメントを適当なベクター
にクローニングする。
【００５２】 本発明の好ましい実施形態では、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質をコードする
ＤＮＡでトランスフェクトした細胞を使用して、細胞の表面にＥｎｖタンパク質
を発現される。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖはｇｐ１６０前駆体の切断により生じる、２
つの非共有結合的に会合したサブユニットからなる。一方のサブユニット、ｇｐ
１２０は多量にグリコシル化されており、細胞膜の外側で見出される。ｇｐ１２
０は前駆体のＮ末端部分から誘導され、ＣＤ４の結合部位を含有する。他方のサ
ブユニット、ｇｐ４１は細胞膜に広がり、前駆体のＣ末端部分から誘導される。
ｇｐ４１のアミノ末端部分は疎水性融合ペプチドを含有し、これは細胞膜および
ＨＩＶ−１膜の融合に関与する。Ｅｎｖはビリオンまたは感染細胞の表面上で三
量体として見出される。三量体はｇｐ４１により媒介される非共有結合相互作用
により結合している。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質の構造および生物学の詳細
にわたる知識により、以下に記載するこのタンパク質の多くの変種の使用が可能
になる。
【００５３】 ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質の元来の野生型形態に加えて、ケモカインレセ
プタ、およびＣＤ４、組換え的に生成した、これらのタンパク質の変異または変
種形態を本発明の方法に使用することができる。これらの変異体および変種は野
生型とは幾分異なるアミノ酸配列を有するが、膜融合を媒介する能力は保持して
いる。かかる変異体および変種を当業界で既知の方法により作ることができる。
例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、第８章（１９８９）および補遺（Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ｏｘｅｎｄｅｒ＆Ｆｏｘ，編、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８７）（Ａ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）
；Ｅｈｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９）（Ｓｔｏｃｋ
ｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）。
【００５４】 当業者は融合の媒介において重要な役割を有さないこれらのアミノ酸のみを変
化させることによりかかる変異体および変種を生成する。かかるアミノ酸は例え
ばＣＤ４またはケモカインレセプタ結合に重要であるＥｎｖタンパク質のアミノ
酸である。かかる変異体および変種の生成において、当業者は、融合の媒介に重
要であるＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質およびケモカインレセプタの種々の領域
を決定した多くの研究を指針とするであろう。ＣＤ４結合に重要なｇｐ１２０の
残基はＬａｓｋｙら、Ｃｅｌｌ ５０：９７５−９８５（１９８７）；Ｃｏｒｄ
ｏｎｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：５７１−５７４（１９８９）；Ｃｏｒ
ｄｏｎｎｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：４４６４−４４６８（１９８９）；
Ｏｌｓｈｅｖｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５７０１−５７０５（１９９０
）；Ｋｏｗａｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１３５１−１３５５（１９
８７）。ケモカインレセプタ結合に重要なｇｐ１２０の残基はＦｅｎｇら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７２：８７２−８７７（１９９６）；Ｃｈｏｅら、Ｃｅｌｌ ８
５：１１３５−１１４８（１９９６）；Ｄｅｎｇら、ＮａｔｕｒｅＮａｔｕｒｅ
３８１：６６１−６６６（１９９６）；Ｄｒａｇｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１
：６６７−６７３（１９９６）；Ｄｏｒａｎｚら、Ｃｅｌｌ ８５：１１４９−
１１５８（１９９６）；Ａｌｋｈａｔｉｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９５
５−１９５８（１９９６）；Ｃｏｃｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１２
４４−１２４７（１９９６）；Ｂｉｅｎｉａｓｚら、ＥＭＢＯ Ｊ：１６：２５
９９−２６０９（１９９７）；Ｓｐｅｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１３６
−７１３９（１９９７）（ここでは第３の可変ループ（Ｖ３）がケモカインレセ
プタ結合に重要であることが開示されている）に開示されている。
【００５５】 本明細書にて具体例を示すｇｐ１４３ ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質変種は
本発明に使用できる変種タンパク質の例である。
【００５６】 とりわけ好ましい変異体および変種は、１個またはそれ以上の保存置換により
変異体および変種のアミノ酸配列が野生型配列とは異なるものである。「保存ア
ミノ酸置換」とは１個のアミノ酸残基と別の化学的に類似したアミノ酸残基との
置換を意味する。かかる保存置換の例としては：１個の疎水性残基（イソロイシ
ン、ロイシン、バリン、またはメチオニン）と別の残基との置換；１個の極性残
基と同一の電荷の別の極性残基との置換（例えばアルギニンをリジンと；グルタ
ミン酸をアスパラギン酸と）がある。
【００５７】 ある状況では、ウイルスの特定の株との、ウイルス性タンパク質およびケモカ
インコレセプタにより媒介される融合はＣＤ４とは独立して観察されている。例
えばＨＩＶ−２のＣＤ４独立性融合に関しては、Ｅｎｄｒｅｓら、Ｃｅｌｌ ８
７：７４５−７５６（１９９６）；Ｒｅｅｖｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３１
：１３０−１３４（１９９７）；Ｐｏｔｅｍｐａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４
４１９−４４２４（１９９７）；Ｒｅｅｖｅｓ＆Ｓｃｈｕｌｚ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７１：１４５３−１４６５（１９９７）を参照されたい。ＳＩＶのＣＤ４独立
性融合に関しては、Ｐｏｔｅｍｐａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４４１９−４４
２４（１９９７）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４７０−１４
７３（１９９７）；Ｅｄｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９４：１４７４２−１４７４７を参照されたい。ＨＩＶ−１のＣＤ４
独立性融合に関しては、Ｂａｎｄｒｅｓら、Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．７２：２５００−
２５０４（１９９８）；Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｒｏｌ．
７：１１２−１２１（１９９７）；Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
７２：５１２−５１９（１９９８）を参照されたい。従って、本発明の方法を特
定のウイルス性タンパク質を用いて実施する場合、ＣＤ４を発現する細胞を使用
しないでこれらの方法を実施できる。
【００５８】 ＨＩＶ−１のインヒビターに加えて、本発明を用いて別のウイルスのインヒビ
ターを同定することができる。例えば、ポックスウイルスは感染した細胞と感染
していない細胞との融合を含む過程により細胞を感染するウイルスのファミリー
である。ミキソーマウイルスはウサギの致死全身疾患を引き起こすポックスウイ
ルスファミリーのメンバーである。齧歯類繊維芽細胞、例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞
はミキソーマウイルスに感染されない。しかしながら、かかる齧歯類細胞をヒト
ＣＤ４およびヒトケモカインレセプタをコードするＤＮＡ、例えばＣＣＲ１、Ｃ
ＣＲ５、またはＶＸＶＲ４でトランスフェクトすると、細胞はミキソーマウイル
スにより感染され得る細胞に変化する（Ｌａｌａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８
６：１９６８−１９７１（１９９９））。従って、第１の細胞がミキソーマウイ
ルスで感染された細胞であるか、または細胞融合を媒介するミキソーマウイルス
タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトされている細胞である実施形
態で本発明を実施でき、ここで第１の細胞はβラクタマーゼの蛍光基質を含有し
、ヒトケモカインレセプタを含有し、βラクタマーゼをも発現する第２の細胞と
第１の細胞とを混合する。本明細書に記載する別の実施形態と同様に、２つの細
胞の融合をβラクタマーゼの基質からのＦＲＥＴの比率を測定することにより検
出する。
【００５９】 細胞性タンパク質相互作用のインヒビターを同定する実施形態で本発明を用い
ることができる。例えば、細胞レセプタを第１の細胞で発現でき、この第１の細
胞はまたウイルス性タンパク質（例えばシミアンウイルス５Ｆタンパク質）をも
発現する。第１の細胞を第２の細胞と共にインキュベートすると、この第２の細
胞は細胞性レセプタのための適当な細胞性リガンドを発現し、細胞性レセプタお
よびそのリガンドにより媒介される相互作用により第１および第２の細胞が近接
する。これによりＳＶ５ Ｆタンパク質が第１および第２の細胞の膜融合を媒介
できるようになる。本明細書に記載する別の実施形態と同様に、第１または第２
の細胞の一方がβラクタマーゼを発現し、他方の細胞がβラクタマーゼの蛍光基
質を含有する場合、βラクタマーゼの基質からのＦＲＥＴの量を測定することよ
り２つの細胞の融合を検出できる。細胞レセプタおよびそのリガンド間の相互作
用のインヒビターである物質の存在下でこの実施形態を実施する場合、第１およ
び第２の細胞はインヒビターの存在のために近接されない。従って、ウイルスタ
ンパク質は融合を媒介できないであろう。インヒビターによるこの融合の欠如を
ＦＲＥＴの測定により検出できる。
【００６０】 従って、本発明は細胞レセプタおよびそのリガンドの相互作用のインヒビター
を同定する方法を提供することであって； （ａ）細胞レセプタを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）細胞レセプタのリガンドを発現する第２の細胞を提供するステップ； ここで （ｉ）第１の細胞はβラクタマーゼを発現し、第２の細胞は発現せず、第２の
細胞はβラクタマーゼの蛍光基質を含有し、ここで基質はβラクタマーゼにより
切断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含み、一方の部
分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカーが無傷で
ある場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができるが、リン
カーが切断されている場合には生じない化合物である；または （ｉｉ）第２の細胞はβラクタマーゼを発現し、第１の細胞は発現せず、第１
の胞はβラクタマーゼの蛍光基質を含有し、ここで基質はβラクタマーゼにより
切断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含み、一方の部
分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカーが無傷で
ある場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができるが、リン
カーが切断されている場合には生じない化合物である； のいずれかでありここで、第１および第２の細胞が細胞レセプタおよびそのリガ
ンドの相互作用により近接する場合のみ、第１の細胞または第２の細胞のいずれ
かが第１および第２の細胞の融合を媒介できるウイルスタンパク質を発現する； （ｃ）物質の不在下で、細胞レセプタおよびそのリガンドの相互作用により第
１および第２の細胞が近接するような物質の存在下および不在下で第１および第
２の細胞を混合するステップ； （ｄ）物質の存在下および不在下で、工程（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定するス
テップ； を含み、 ここで物質の存在下のＦＲＥＴの量が物質の不在下のＦＲＥＴの量より多い場合
、物質は細胞レセプタおよびそのリガンドの相互作用のインヒビターである。
【００６１】 特定の実施形態では、細胞レセプタ／リガンド対を：Ｆａｓ／ＦａｓＬ；Ｔ細
胞レセプタ／ＭＨＣ Ｉタンパク質；Ｔ細胞レセプタ／ＭＨＣ ＩＩタンパク質
；ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプタ／フィブリノーゲン；プレセニリン−１／ＡＴ
Ｐ；およびプレセニリン−２／ＡＰＰからなる群から選択する。
【００６２】 Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：８４−８８（１９９８）に
記載された転写活性化のアッセイにおいて使用された蛍光基質はＣＣＦ２／ＡＭ
として既知である。ＣＣＦ２／ＡＭは本発明の好ましい実施形態で使用される。
ＣＣＦ２／ＡＭの構造は；
【００６３】
【化１】 であり、 ここでＡｃ＝アセチル；Ｂｔ＝ブチリル；およびＡＭ＝アセトキシメチルである
。
【００６４】 ＣＣＦ２／ＡＭはいくつかのエステル官能基を含有する。これらのエステルに
よりＣＣＦ２／ＡＭが膜透過性となる。この膜透過特性のためにＣＣＦ２／ＡＭ
は培地に添加した後、組織培養中で成長している細胞に取りこまれる。取り込ま
れた後、細胞内エステラーゼがエステルを切断し、その多くの負電荷のために細
胞内に捕捉されているＣＣＦ２を上昇させる。ＣＣＦ２の構造は：
【００６５】
【化２】 である。
【００６６】 ＣＣＦ２はセファロスポリン基の７位でＦＲＥＴ供与体として７−ヒドロキシ
クマリンを含有する。７−ヒドロキシクマリンはＣＣＦ２のｐＫａを５．１まで
低下させるために６−クロロ置換基を有し、従って６以上のｐＨ値でｐＨとは独
立した蛍光およびクマリンおよびセファロスポリン基間でグリシンスペーサーを
作る。蛍光受容体はフルオレセインであり、これはセファロスポリン基の７位置
にチオエーテル結合を介して結合する。
【００６７】 ４０９ｎｍでの無傷のＣＣＦ２のクマリン供与体の励起により、５２０ｎｍで
ピークを有するフルオレセイン受容体からのＦＲＥＴ発光が上昇する。ＣＣＦ２
の切断、並びにクマリンおよびフルオレセインの分離の後、クマリン供与体の励
起により、４４７ｎｍでピークを有するクマリンからの蛍光発光が上昇する。図
２は無傷のＣＣＦ２およびβラクタマーゼ活性によりフルオレセインを切り離し
た後のＣＣＦ２の発光スペクトルを説明する。もちろん、前記の正確な波長で励
起し、発光を測定する必要はない。例えば、３９５ｎｍで励起し、５３０ｎｍお
よび４６０ｎｍで発光を測定することができる。
【００６８】 一般に、受容体発光に対する供与体発光の比率はＦＲＥＴの量を測定する方法
で決定できる。低比率は無傷のＣＣＦ２構造、従ってほとんど融合していないこ
とを示し；高比率はＣＣＦ２がβラクタマーゼにより切断されており、従って相
対的により融合していることを示す。従って、好ましい実施形態では、発光比率
を用いてＦＲＥＴを測定することにより本発明を実施する。原理的には（ａ）供
与体の吸収波長で刺激した後の供与体蛍光試薬の発光の低下、および／または（
ｂ）供与体の吸収波長で刺激した後の受容体試薬の発光の増加のいずれかをモニ
ター観察することによりＦＲＥＴを測定できる。実際には、ＦＲＥＴは発光比率
化することによりＦＲＥＴが最も効果的に測定される。発光比率化することは、
供与体による発光に対する受容体による発光の比率の変化を測定することを意味
する。この比率の増加はエネルギーが供与体から受容体へ移行し、従ってＦＲＥ
Ｔを生じていることを意味する。共焦点レーザー顕微鏡を用いることにより測定
できる。サンプルからの発光をダイクロイックミラーで分割し、２つの検出器で
同時に２つの波長のバンド（供与体および受容体発光波長に対応する）を測定す
ることにより発光比率化するのが好ましい。また別に、各波長で（適当なフィル
ターを用いることにより）単一の検出器で発光を連続的にサンプリングすること
ができる。いずれの場合も、ＦＲＥＴ測定のこれらのおよびその他の方法は当業
界で既知である。
【００６９】 本発明の方法の発光比率化の使用により、以前の方法で正確な定量を妨害する
多くの変動要素、例えば細胞サイズ、細胞数、プローブ濃度および高度などが排
除される。本発明の方法は蛍光顕微鏡またはプレートリーダーにより容易にモニ
ター観察される。加えて、読み出しは遺伝子転写に依存せず、従って転写インヒ
ビターの選択による偏りを避けることができる。読み出しは即座に行われるので
、たいていの転写を基盤とするアッセイで必要とされるような細胞溶解は必要で
ない。本発明を９６ウェルマイクロタイタープレートまたはさらに高密度のウェ
ルプレートでの使用に容易に適応させることができ、高速大量処理スクリーニン
グプログラムでのその使用が可能になる。
【００７０】 本発明は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定により２つの細胞間で生
じる融合の量を決定する方法を提供し； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼにより切断されやすい
リンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含み、一方の部分の発光スペク
トルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカーが無傷である場合にＦＲ
ＥＴを生じることができるが、リンカーが切断されている場合には生じない化合
物である、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する第２の細胞を提供するステップ
； （ｃ）第１および第２の細胞間の融合が存在しない場合に第２の細胞の基質か
らの供与体／受容体発光比率を測定するステップ； （ｄ）融合を生じるような条件下で第１および第２の細胞を接触させるステッ
プ； （ｅ）融合を生じた後、基質からの供与体／受容体発光比率を測定するステッ
プ； を含み ここで工程（ｃ）で測定された供与体／受容体発光比率に対する工程（ｅ）で測
定された供与体／受容体発光比率の比率は生じた融合の量を表し、比率が大きけ
れば融合の量が多いことを示している。
【００７１】 本発明はまた第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法をも
提供し； （ａ）第１の細胞が懸濁細胞である、βラクタマーゼを発現する第１の細胞を
提供するステップ； （ｂ）第２の細胞が付着細胞である、βラクタマーゼを発現しない第２の細胞
を提供するステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
在下、第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
質の存在下、第１および第２の細胞の部分を接触させ、その物質の不在下、第１
および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）いずれかの融合していない第１の細胞を洗い流すステップ； （ｅ）βラクタマーゼにより切断されやすいリンカーにより連結されている２
つの蛍光部分を含み、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクト
ルと重複し、リンカーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
を生じることができるが、リンカーが切断されている場合には生じない化合物で
ある、βラクタマーゼの蛍光基質に、基質が融合した細胞の細胞質およびいずれ
かの融合していない付着細胞の細胞質に取りこまれるような条件および十分な時
間で、融合した細胞を暴露するステップ； （ｆ）融合した細胞の基質から供与体／受容体発光比率を測定するステップ；
を含み、 ここで供与体／受容体発光比率が物質の不在下よりも物質の存在下で小さい場合
、物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである。
【００７２】 ＣＣＦ２は本発明の特定の好ましい実施形態の実例であることを意味する。本
発明はまた別の蛍光基質ででも実施できる。
【００７３】 本発明の使用に適したβラクラマーゼの蛍光基質の一般式は：
【００７４】
【化３】 式中： ＸおよびＹの一方は蛍光供与基または該蛍光供与基のエステル誘導体であり、他
方は蛍光供与体または該蛍光供与基のエステル誘導体であり；ここで該蛍光供与
基および該蛍光受容基間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じることができ； Ｒ’はＨ、低級アルキルおよび（ＣＨ２）ｎＯＨからなる群から選択され、ここ
でｎは０または１ないし５の整数であり； Ｒ”はＨ、生理学的に許容される金属およびアンモニウムカチオン、−ＣＨＲ２ ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−ＣＨＲ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、−アシルチオメ
チル、−アシロキシ−アルファ−ベンジル、−デルタ−ブチロールアクトニル、
−メトキシカルボニルオキシメチル、−フェニル、−メチルスルフィニルメチル
、−ベータ−モルホリノエチル、−ジアルキルアミノエチル、−アシロキシアル
キル、−ジアルキルアミノカルボニルオキシメチルおよび−アルキルからなる群
から選択され、ここでＲ２はＨおよび低級アルキルからなる群から選択され、こ
こでｎは０または１ないし５の整数であり；ＡはＳ、Ｏ、ＳＯ、ＳＯ２およびＣ
Ｈ２からなる群から選択され；並びにＺ’およびＺ”は蛍光供与および受容基の
リンカーである。
【００７５】 好ましくはＺ’は直接結合−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−、−（Ｃ
Ｈ２）ｎＮＲ２ＣＯ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ２ＣＯＮＲ２（ＣＨ２ ）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ３ＣＳＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯ
ＮＲ３（ＣＨ２）ｐＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ ）ｎＮＲ３ＣＯ（ＣＨ２）ｐＳ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎＳ（ＣＨ２）ｍ −、−（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−、
−（ＣＨ２）ｎＳＣＯ２ＮＲ２（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２（ＣＨ２ ）ｍ−、
【００７６】
【化４】 からなる群から選択され、ここでＲ２はＨおよび低級アルキルからなる群から選
択され；Ｒ３は水素および低級アルキルからなる群から選択され；ｎ、ｍおよび
ｐの各々は０および１ないし４の整数からなる群から別個に選択される。
【００７７】 好ましくは、Ｙ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲ２（ＣＨ ２ ）ｎ−、−Ｎ＋Ｒ２ ２（ＣＨ２）ｎ−、−ＯＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ ２ Ｃ（ＣＨ２）ｎ−、−ＳＣＳＮＲ２（ＣＨ２）ｎ−、−ＳＣＳＯ（ＣＨ２）ｎ −、および
【００７８】
【化５】 のヘテロ原子への直接結合からなる群から選択され、ここでＲ２はＨおよび低級
アルキルからなる群から選択され；ｎおよびｍの各々は０および１ないし４の整
数からなる群から別個に選択される。
【００７９】 本明細書に記載するβラクタマーゼ基質に適した蛍光部分および本明細書にて
開示するβラクタマーゼ基質を作る方法は米国特許第５７４１６５７号に開示さ
れており、その開示は出展明示により本明細書の一部とする。
【００８０】 βラクタマーゼにより切断される蛍光基質のリンカーはセファロスポリンであ
るのが好ましい。これはセファロスポリンの３’置換基に化学的に結合できるい
ずれかの分子（例えば蛍光部分）がβラクタマーゼによりセファロスポリンのβ
ラクタム環の切断時に放出されるためである（Ａｌｂｅｒｃｈｔら、Ｊ．Ｍｅｄ
．Ｃｈｅｍ．３４：６６９−６７５（１９９１））。従って３’置換基に結合し
た蛍光部分は切断時に放出され、基質の残りの部分に結合したままである別の蛍
光部分から拡散される。
【００８１】 種々のβラクタマーゼが当業界で既知であり、本発明の方法における使用に適
している。とりわけよく研究されているβラクタマーゼの形態は大腸菌のＡｍｐ ｒ 遺伝子産物であるＴＥＭ−１ βラクタマーゼである（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７３７−３７４１（
１９７８））。１つの配列が削除され、細胞質で蓄積されるＴＥＭ−１の変種が
Ｋａｄｏｎａｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：２１４９−２１５４（
１９８４）に開示されている。
【００８２】 βラクタマーゼは種々の細菌により生成され、多くのβラクタマーゼはよく研
究されている。例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）はＰＣ１ βラクタマーゼを生成し；バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）はβラクタマーゼＩとして既知のβラクタマーゼを生成
し；および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）はＲＴＥＭ βラクタ
マーゼを生成する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２６６：
８５３−８６１（１９９０））。本発明で使用するのに適した特定のβラクラマ
ーゼに必要なのは、基質の２つの蛍光部分が切断後にお互いから拡散できるよう
な方法で蛍光基質を切断できることのみである。これは容易に試験でき、従って
特定のβラクタマーゼの適性を容易に決定できる。
【００８３】 種々の適当なβラクタマーゼのアミノ酸配列はＡｍｂｌｅｒ、Ｐｈｉｌ．Ｔｒ
ａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．（Ｓｅｒ．Ｂ）２８９：３２１−３３１（１９
８０）に開示されている。当業者はこれらのβラクタマーゼをコードする合成Ｄ
ＮＡ配列を容易に合成することができる。また別に、これらのβラクタマーゼを
天然の供給源からクロンーン化できる。βラクタマーゼをコードするＤＮＡ配列
を適当な発弁ベクターに配置し、本発明の方法で使用するための細胞にトランス
フェクトすることができる。本発明の方法で使用できる特定のβラクタマーゼを
コードするＤＮＡ配列は米国特許第５７４１６５７号の配列番号１で示されてお
り、対応するアミノ酸配列は米国特許第５７４１６５７号の配列番号２で示され
ている。このＤＮＡ（ｐＴＧ２ｄｅｌ１）を含有するプラスミドはＫａｄｏｎａ
ｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：２１４９−２１５４（１９８４）に
記載されている。
【００８４】 Ｍｏｏｒｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：２０３−２０９（１９９
７）は真核細胞により細胞内で保持されるＲＴＥＭ１βラクタマーゼの形態を操
作する方法について記載している。ＲＴＥＭ１βラクタマーゼの天然のシグナル
配列をコードするＤＮＡを除去し、メチオニンコドンで置換する。ＰＣＲにより
真核細胞で最適な翻訳効率を提供する配列をこのメチオニンのすぐ上流に配置す
る。この修飾βラクタマーゼコーディング配列を次いで発現ベクターｐＲｃ−Ｃ
ＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）にクローニン
グする。これによりヒト媒介初期サイトメガロウイルスプロモーターの調節下い
コーディング配列が配置され、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列が提供され
る。この構築物はｐＣＭＶ−ＢＬとして既知であり、哺乳動物細胞の細胞質で活
性なβラクタマーゼの発現を指示できる。
【００８５】 種々の発現ベクターを用いて、本発明で使用するためのβラクタマーゼ、ＨＩ
Ｖ−１ Ｅｎｖタンパク質タンパク質、ケモカインレセプタ、およびＣＤ４をコ
ードするＤＮＡを組換え的に発現することができる。適当な、市販により入手可
能な発現ベクターには、非限定例としてはｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａ
ｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３
７５９３）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４
）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１
９８）ｐＣＩ．ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロ
アルト、カリフォルニア州）、ｐＶ１Ｊｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア州）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｐＳＣ１１、およびｐＳＶ２−ｄｈｆｒ
（ＡＴＣＣ３７１４６）などがある。ベクターの選択はβラクタマーゼ、ＨＩＶ
−１ Ｅｎｖタンパク質タンパク質、ケモカインレセプタ、およびＣＤ４を発現
するのが望ましい細胞型、並びに望ましい発現レベル等に依存する。
【００８６】 発現ベクターを用いて遺伝子を一過性に発現または安定して移動させることが
できる。遺伝子を一過性に発現または安定した細胞への移動は当業界で既知であ
る。例えばＡｕｓｕｂｅｌら、「ＤＮＡの哺乳動物細胞への導入」Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、セクシ
ョン９．５．１−９．５．６（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
）を参照されたい。
【００８７】 本発明で用いられるβラクタマーゼの蛍光基質は一般に、融合すべき細胞が存
在する培地またはバッファー中、約５０ｎＭから約５０μＭ、好ましくは約５０
０ｎＭから約５μＭの最終濃度で、および最も好ましくは約１μＭの濃度で用い
られる。一般に、細胞に負荷した後、基質の細胞内濃度が約５０ないし１００μ
Ｍであるようにこの濃度を調整する。
【００８８】 慣用される組織培養培地および／またはバッファー、例えば修飾ダルベッコ培
地、ＲＰＭＩ １６４０（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有または不含）、ハンクス平
衡塩類溶液、ダルベッコ修飾イーグル培地、リン鎖緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に
存在する細胞で本発明を実施できる。その細胞内形態の基質がポリアニオンであ
る場合、非特異的アニオン輸送のインヒビター、例えばプロベネシドを２．５ｍ
Ｍで添加して細胞内での基質の保持を促すことができる。
【００８９】 当業者はウイルスにより媒介される細胞の融合が報告されている多くの文献を
指標として、融合を生じるのに適した条件を容易に決定できる。とりわけ、科学
文献にはＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介融合の研究に関する報告が多くある。当業者は
本発明の実施に適した条件の選別においてかかる報告を指標とできる。
【００９０】 本発明の方法は高速大量処理に適している。従って、多ウェルマイクロタイタ
ープレートで方法を実施するのに有利である。かかるプレートの例としては：Ｃ
ｏｓｔａｒ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｏｐｔｉｃｓ プレート；Ｃｏｓｔａｒ ブラッ
ククリアボトムプレート（カタログ番号３６０３または３９０４）がある。
【００９１】 多くの異なる細胞を本発明で用いることができる。本発明で用いられる細胞の
２つの型は完全に異なっている必要はない。２つの細胞型が、融合を媒介する異
なるタンパク質を発現することで十分である。例えば細胞の単一のラインで開始
し、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質およびβラクタマーゼを細胞の第１の部分に
トランスフェクトし、ＣＤ４およびケモカインレセプタを細胞の第２の部分にト
ランスフェクトすることにより、２つの細胞型の要件を有するであろう。もちろ
ん本発明を完全に区別される２つの細胞型で実施することができる。本明細書で
記載する実施形態に関しては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およ
びジャーカット細胞を使用するような場合である。融合を媒介できるタンパク質
を天然に発現する細胞、例えばジャーカット細胞を使用することができる。また
βラクタマーゼでトランスフェクトされているヒト１次リンパ球を用いてエンベ
ロープ発現細胞と融合することもできる。これによりこの方法の利用性が拡張さ
れ、インビボ誘導細胞の研究が含まれる（すなわち本発明は細胞系の使用に限定
されない）。
【００９２】 使用できる細胞には、非限定例としては哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サルおよび齧歯類起源の細胞系などがある。適当な哺乳動物種に由来する細
胞系は市販により入手可能であり、非限定例としてはＬ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（
ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２
９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、
ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５
０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ ６１）などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、Ｈ
ｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）
、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０９）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ
ＨＴＢ−８５）、Ａｒｐｅ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３０
２）、ジャーカット細胞、ＧＨ３細胞、およびベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細
胞などがある。とりわけ好ましい細胞はＴ細胞である。とりわけ好ましいＴ細胞
はジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）および修飾ジャーカットＴ細
胞系ＪＫ．ＣＭＶ−ｂｌａＭ．Ｓ１．Ｃ１（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）である。
【００９３】 ジャーカット細胞は天然にＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現し、従って本発明で
の使用にとりわけ適している。また特に適しているのは２９３Ｔ細胞である。２
９３Ｔ細胞はＳＶラージＴ抗原を発現するので高レベルの一過性発現に一般に使
用される。その使用の実例はＰｅａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９０：８３９２−８３９６（１９９３）に見出すことができる。
【００９４】 本発明で使用できる別の細胞には：Ｋｏｙａｎａｇｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３６：８１９−８２２（１９８７）に記載されるＨＩＶ−１のＭ指向性ＪＲ−Ｆ
Ｌ株に由来するＥｎｖタンパク質を安定して発現するＨｅＬａ細胞系；Ｌｕｓｓ
ｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３７１２−３７２０（１９９５）に記載されるＰ
Ｍ１ Ｔリンパ芽球細胞系などがある。
【００９５】 好ましい実施形態では、細胞はヒト細胞である。ヒト以外の細胞を用いて本発
明を実施する場合、一般には内因性ＣＤ４およびケモカインレセプタに依存する
よりむしろ、ヒトＣＤ４およびヒトケモカインレセプタを発現するようにヒト以
外の細胞をトランスフェクトするのが好ましい。昆虫細胞系、例えばドロソフィ
ラ・シュナイダーＳ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６３）、ＳＦ９、（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１７１１）およびＳＦ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ
、カリフォルニア州）もまた適している。
【００９６】 本発明は従来技術の方法よりもいくつかの利点を提供する： ・本発明は融合をモニター観察するために遺伝子転写の活性化に依存しない； ・融合細胞におけるβラクタマーゼ活性の読み出しは非常に速く、１時間ほどの
短い時間で記録できる（通常は約２ないし３時間）； ・βラクタマーゼ活性の決定は感受性が高く、容易に定量される； ・２つの異なる蛍光色素を使用する必要はなく；１つの蛍光色素を使用する。
【００９７】 さらに好ましい実施形態で、安定した細胞系を生じるために、操作されたＨＩ
Ｖエンベロープ構築物ｇｐ１４３の使用により、エンベロープタンパク質の高レ
ベル発現が提供され、アッセイの信頼性および再現性の双方が増す。
【００９８】 国際特許出願ＷＯ９６／４１０２０に記載されるアッセイは２つの異なる色素
の使用が必要とされ、その各々は２つの細胞型の細胞膜に組み込まれることがで
きなければならない。アッセイの成功は同一の脂質膜内で色素間でＦＲＥＴを生
じ得るように互いに適当に短い距離で近接して並置されている２つの色素に依存
する。対照的に、本発明は１つの色素のみを必要とし、ここで１つの色素は細胞
の細胞質に本来存在する。
【００９９】 本発明は前記の方法により同定されたウイルス（例えばＨＩＶ−１）感染のイ
ンヒビターを含んでなる医薬用組成物を包含する。インヒビターは一般に医薬用
組成物を形成するための医薬上許容される担体と組み合わせる。かかる担体およ
びインヒビターおよび担体を含有する医薬用組成物の製剤方法はＲｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅに見出すことができる
。有効な投与に適した医薬上許容される組成物を形成するために、かかる組成物
は治療上有効量のインヒビターを含有する。
【０１００】 治療用または予防用組成物をウイルス感染を処置または防御するのに十分な量
で投与する。例えば個体の症状、体重、性別、および年齢などの種々の因子に従
って有効量は変化し得る。その他の因子には投与様式がある。熟練した内科医は
適量を決定できる。
【０１０１】 組成物を適当な用量で単独で使用できる。また別に、別の物質との同時投与ま
たは連続投与も望ましい。
【０１０２】 投与用の慣用されるベヒクル中広範な治療用投与形態で組成物を投与できる。
例えば、錠剤、カプセル（各々持効性および徐放性製剤を含む）、丸剤、粉末、
顆粒、エリキシル、チンキ、溶液、懸濁液、シロップおよび乳液のような経口投
与形態で、または注射により組成物を投与できる。同様に、静脈内（ボーラスお
よび注入の双方）、腹腔内、皮下、密閉したもしくはしない局所、または筋肉内
形態でも組成物を投与でき、全て医薬品業界の通常の業者に既知の形態を用いる
。
【０１０３】 有利には、組成物を１日１回で投与でき、または１日量を１日２、３、４もし
くはそれ以上の回数で分割して投与することができる。さらに、適当な鼻腔内用
ベヒクルの局所使用により鼻腔内用形態で、または通常の当業者に既知の経皮パ
ッチの形態を用いて経皮経路により組成物を投与できる。もちろん経皮分配系の
形態で投与するためには、投与量を投与計画中断続的よりもむしろ連続的にする
。
【０１０４】 組成物を利用する投与計画は、型、種、年齢、体重、性別および患者の医学的
症状；処置すべき症状の重篤度；投与経路；患者の肝および心臓血管機能；並び
に用いるその特定の組成物などの種々の因子に従って選択される。通常の内科医
は症状の進行を防御、対抗または阻止するのに必要な有効量の組成物を容易に決
定し、および処方を書くことができる。毒性がなく効果を生じる範囲内で組成物
の濃度を達成するのに最適な精密性には、標的部位への組成物の利用性の動態に
基づく投与計画が必要である。これは組成物の分配、平衡および排泄を考慮に入
れる。
【０１０５】 本発明をよりよく説明するために以下の非限定的な実施例を提示する。
【０１０６】 実施例１ 本発明のＣＨＯ細胞／ジャーカット細胞の実施形態 本発明の特定の実施形態はＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を発現するようにトラン
スフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（付着細胞系）およ
びβラクタマーゼを発現するようにトランスフェクトしたジャーカットＴ細胞（
懸濁細胞系）を利用する。この実施形態の特定の変法ではＴ指向性Ｅｎｖのトラ
ンケート体（ｇｐ１４３（ＨＸＢ２））を発現するＣＨＯ細胞系を９６ウェル、
ブラック、クリアボトムマクロタイタープレートに配置し、３７℃で一晩インキ
ュベートした。細胞を付着させた、βラクタマーゼを発現するジャーカット細胞
（そしてこれは天然にＣＸＣＲ４およびＣＤ４を発現する）をＣＨＯ細胞に加え
、３７℃で十分な時間インキュベートし、融合を生じさせた。洗浄により非融合
細胞を除去し、蛍光発生βラクタマーゼ基質ＣＣＦ２／ＡＭを残りの細胞に加え
た。室温で１時間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーの蛍光により細
胞融合を測定した。受容体色素（フルオレセイン）の発光に対する供与体色素（
７−ヒドロキシクマリン）の発光の比率を測定した。
【０１０７】 ＣＣＦ２／ＡＭは膜透過性であるＣＣＦ２のエステル形態である。一度細胞内
で、細胞内エステラーゼがＣＣＦ２／ＡＭのエステル官能基を加水分解すると、
高レベルの負電荷のために細胞に捕捉されて残っているポリアニオン性ＣＣＦ２
が放出される。ＣＣＦ２はセファロスポリンβラクタム環に結合した２つの蛍光
体、７−ヒドロキシクマリンおよびフルオレセインを含有する。無傷の基質では
、３９５ｎｍでのクマリン基の励起により、フルオレセイン基への蛍光共鳴エネ
ルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるに至り、５３０ｎｍでフルオレセインの緑色蛍
光の発光を引き起こす。ＣＣＦ２がβラクタマーゼにより切断されている場合、
ＦＲＥＴは崩壊されている。その場合、クマリンの励起により４６０ｎｍで発光
に至り、青色蛍光が上昇する。青色蛍光はジャーカット細胞およびＣＨＯ細胞の
細胞質のプーリングによるものであり、融合細胞すなわちシンシチウムの形成を
示し、これによりＣＨＯ細胞からのβラクタマーゼ基質ＣＣＦ２を、ジャーカッ
ト細胞からのβラクタマーゼに暴露することになる。緑色蛍光の持続はＣＨＯ細
胞が融合しておらず、ＣＨＯ細胞細胞質のＣＣＦ２がβラクタマーゼに暴露され
ていないことを示している。緑色発光（５３０ｎｍ）に対する青色発光（４６０
ｎｍ）の比率を観察することにより融合を測定する。高比率はより多く融合して
いることを示し；低比率はあまり融合していないことを示す。
【０１０８】 本発明のこのＣＨＯ細胞／ジャーカット細胞の実施形態の詳細なプロトコルは
以下のとおりである： １．ｇｐ１４３／ＨＸＢ２を発現するＣＨＯ細胞を、各ウェルあたり２００μ
ｌの培地中、各ウェルあたり５ｘ１０４セルで９６ウェルブラック、クリアボト
ムプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３６０３）に配置した。培地は１０％
ウシ胎児血清、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）、１ｍｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレ
プトマイシン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５１４０−１２２）、グルタミン（２
ｍＭ）、およびＨＴ（ＡＴＣＣ ７１−Ｘ）を補充したイスコフ修飾ダルベッコ
培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２４４０−０４６）であった。
【０１０９】 ２．細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【０１１０】 ３．ウェルあたり１００μｌのイスコフ修飾ダルベッコ培地（Ｇｉｂｃｏカタ
ログ番号１２４４０−０４６）で細胞を１回洗浄した。
【０１１１】 ４．βラクタマーゼを発現するジャーカットＴ細胞を血清不含培地（イスコフ
修飾ダルベッコ培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２４４０−０４６））中１．６
ｘ１０６セル／ｍｌに希釈し、およびこの希釈物（８００００セル）１００μｌ
をＣＨＯ細胞を含有する各ウェルに加えた。
【０１１２】 ５．ＣＨＯ細胞およびジャーカット細胞を３７℃で２時間インキュベートした
。
【０１１３】 ６．ウェルあたり１００μｌの血清不含培地（イスコフ修飾ダルベッコ培地（
Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２４４０−０４６））でＣＨＯ細胞およびジャーカッ
ト細胞を２回洗浄した。
【０１１４】 ７．各ウェルに１００μｌの血清不含培地（イスコフ修飾ダルベッコ培地（Ｇ
ｉｂｃｏカタログ番号１２４４０−０４６））を加えた。
【０１１５】 ８．１１％ ＥＳＳバッファー中６倍濃縮したＣＣＦ２／ＡＭ（２μＭ）２０
μｌを各ウェルに加えた。
【０１１６】 ９．ＣＣＦ２／ＡＭを負荷された融合細胞を穏やかに揺らしながら室温で１時
間インキュベートした。
【０１１７】 １０．Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ＩＩ蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で２スキャン／サイクルでプレートを読んだ。３９
５ｎｍまたは４０５ｎｍでの発光および４６０ｎｍでの発光で１回スキャンを行
い、３９５ｎｍまたは４０５ｎｍでの励起および５３０ｎｍでの励起で別のスキ
ャンを行った。
【０１１８】 前記した本発明のＣＨＯ細胞／ジャーカット細胞の実施形態は、融合がＣＸＣ
Ｒ４の天然リガンドであるＳＤＦ−１（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、ロッ
キーヒル、ニュージャージー州）により１３．４±２．６ｎＭのＩＣ５０で用量
依存的に阻止されることを示すことにより確認されている（図３）。また可溶性
ＣＤ４（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、ボ
ストン、マサチューセッツ州）により、および３．３ｎＭのＩＣ５０で、および
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（組換えＣＨＯ細
胞にから生成されたＩｇＧ１ ｂ１２と称する組換えＭａｂ）により融合が阻止
される。
【０１１９】 実施例２ 本発明の２９３Ｔ細胞／ジャーカット細胞の実施形態 ６ウェルポリＤリジン・マイクロタイタープレートでアッセイを実施した。Ｇ
ｉｂｃｏ／ＢＲＬ ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）キット
を用いて、ウェルあたり２μｇのｐＶＩＪｎｅｏ／ｇｐ１４３ＨＸＢ２で２９３
Ｔ細胞（ウェルあたり０．７ｘ１０６セル；全面成長の約７０％）を一過性にト
ランスフェクトし、２４時間後、構造的にβラクタマーゼを発現するジャーカッ
ト細胞ウェルあたり２ｘ１０６で３７℃で１時間積層した。非付着ジャーカット
細胞を組織培養培地で３ないし４回洗浄し、２９３Ｔ細胞および残りのジャーカ
ット細胞を３７℃で３ないし４時間融合させた。次いで細胞にＣＣＦ２／ＡＭ（
ウェルあたり２μＭ、最終濃度）を負荷した。対照としてこの実験を擬似トラン
スフェクトした２９３細胞で繰り返し、従ってｇｐ１４３を発現しなかった。結
果を蛍光顕微鏡で可視化し、写真により記録した。これは擬似トランスフェクト
した対照細胞が緑色蛍光を発したことを示し、これは無傷のＣＣＦ２、従って融
合の欠如を示している。対照的に、ｐＶＩＪｎｅｏ／ｇｐ１４３ＨＸＢ２でトラ
ンスフェクトし、従ってｇｐ１４３を発現した２９３Ｔ細胞は青色蛍光を発し、
シンシチウム形成を示した。これはＣＣＦ２が２９３Ｔ細胞に融合したジャーカ
ット細胞からのβラクタマーゼにより切断されていることを示した。
【０１２０】 ２９３Ｔ細胞を１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ
番号１０４３８−０２６）、２ｍＭ グルタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ番
号２５０３０−０８１）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタ
ログ番号１１１４０−０５０）および１ｍｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマ
イシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ番号１５１４０−１２２）を補充した、高グ
ルコース培地であるＤＭＥＭ中で保持した。
【０１２１】 ジャーカットβラクタマーゼ細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
カタログ番号２２４００−０７１）、１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬカタログ番号１０４３８−０２６）、２ｍＭ グルタミン（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬカタログ番号２５０３０−０８１）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬカタログ番号１１１４０−０５０）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリ
ウム（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ番号１１３６０−０７０）、５５μＭ ２−メ
ルカプトエタノール（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ番号２１９８５−０２３）およ
び８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬカタログ番号１０１３１−０
２７）を含有するＲＰＭＩ １６４０中で保持した。
【０１２２】 前記したアッセイを９６ウェル様式でも実施した。トランスフェクションの２
４時間前に２９３Ｔ細胞（３００００セル／ウェル）をＣｏｓｔａｒ Ｓｐｅｃ
ｉａｌ Ｏｐｔｉｃｓプレート（カタログ番号３６１４）に播種した。ＬＩＰＯ
ＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、製造者の
プロトコルに従って、細胞を０．２μｇ ＤＮＡでトランスフェクトした。２４
時間後、細胞を培地（１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ）１
００μｌで２回洗浄し、８００００個のジャーカット細胞（同一培地中）で３７
℃で１時間積層した。非付着ジャーカット細胞を洗い流し（培地１００μｌで３
回すすぐ）、培地１００μｌを加え、３７℃で４時間細胞を融合させた。可視化
し、融合を測定するために、次いで細胞にβラクタマーゼ基質であるＣＣＦ２／
ＡＭを負荷した。既存の培地を１００μｌ／ウェルの血清不含培地（２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ含有イスコフ修飾ダルベッコ培地）で置換した。６倍の添加バッファ
ー２０μｌを加えて最終濃度を２μＭ ＣＣＦ２／ＡＭ、および２．５ｍＭ プ
ロベネシドにした。細胞を穏やかに揺らしながら室温で１時間インキュベートし
た。１００Ｗ水銀ランプを装備し、ロングパズ・ディクロイックミラー（４２５
ｎｍ、急に始まる）を装着したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００ Ｍｉｃ
ｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を利用して、４０５±１０
ｎｍ励起フィルターおよび４３５ｎｍロングパス発光フィルターを利用して蛍光
顕微鏡により結果を記録した。擬似トランスフェクトした２９３Ｔ細胞はジャー
カット細胞と融合できず、従ってβラクタマーゼを欠き、緑色の蛍光を発する。
ＨＸＢ２ Ｅｎｖ発現細胞はジャーカット細胞と融合し、βラクタマーゼの発現
の結果である青色のシンシチウムの発現により可視化された。ＣｙｔｏＦｌｕｏ
ｒ４０００蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）で融合を定量化し、全ての測定値はウェルの底部から記録した。３９５／２
０ｎｍでの励起の後、４６０／４０ｎｍでの発光を記録することにより青色チャ
ネルの蛍光を測定した。３９５／２０ｎｍでの励起の後、５３０／２５ｎｍでの
発光を記録することにより緑色チャネルの蛍光を測定した。同一培地およびＣＣ
Ｆ２を含有するが、細胞を欠くウェルからの類似の発光データを記録することに
より双方のチャネルのバックグラウンドを得、これを双方のチャネルに関して減
じた。５３０発光（緑色チャネル）値で４６０発光（青色チャネル）値を割るこ
とにより融合比率を生じた。典型的な結果により擬似トランスフェクト細胞に関
して０．５８±０．０３対、ｇｐ１４３／ＨＸＢ２を発現する細胞に関して１．
５４±０．００３の融合比率で２．６倍のウィンドウが示された。
【０１２３】 実施例３ Ｅｎｖ発現ベクターｐＶＩＪｎｅｏ／ｇｐ１４３ＨＸＢ２の構築 発現ベクターｐＶ１Ｊは国際特許出願ＷＯ９４／２１７９７に記載されている
。ｐＶ１ＪｎｅｏはｐＶ１Ｊからアンピシリン遺伝子（ａｍｐｒ）を除去し、そ
れをネオマイシン抵抗性遺伝子と置換することによりｐＶ１Ｊから誘導した。Ｓ
ｓｐＩおよびＥａｍ１１０５１Ｉ制限酵素で消化することによりｐＶ１ＪのｐＵ
Ｃバックボーンからａｍｐｒ遺伝子を除去した。残りのプラスミドをアガロース
ゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端化し、次
いで子牛腸管アルカリ性ホスファターゼと反応させた。トランスポゾン９０３か
ら誘導され、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）内に含まれる、市販
により入手可能なｋａｎｒ遺伝子をＰｓｔＩ制限酵素を用いて切除し、アガロー
スゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端化した
。このフラグメントをｐＶ１Ｊバックボーンでライゲートし、いずれかの配向で
ｋａｎｒ遺伝子を有するプラスミドを誘導し、これをｐＶ１Ｊｎｅｏ＃１および
３と称した。これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、接合領域のＤＮＡ
シークエンシングにより確認し類似の量のプラスミドｐＶ１Ｊを生成することが
示された。異種性遺伝子生成物の発現はまたこれらのｐＶ１Ｊｅｎｏベクターの
ｐＶ１Ｊにも匹敵した。我々は専断的にｐＶ１Ｊｅｎｏ＃３を選択し、これを本
明細書ではｐＶ１Ｊｅｎｏと称し、これはｇｐ１４３に関する発現構築物である
ｐＶ１Ｊにおけるａｍｐｒ遺伝子と同一の配向でｋａｎｒ遺伝子を含有する。ｐ
Ｖ１ＪｅｎｏのＤＮＡ配列（配列番号１）を図５に示す。
【０１２４】 ｐＶ１Ｊｅｎｏをさらにヒト組織特異的プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰ
Ａ）リーダーを含むように修飾した。２つの合成相補的オリゴマーをアニーリン
グさせ、次いでＢｇ１ＩＩ消化したｐＶ１Ｊｅｎｏにライゲートした。センスお
よびアンチセンスオリゴマーは５’−ＧＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣ
Ａ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴ
Ｇ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣ
Ｇ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＡ３’（配列番号６）および５’−ＧＡＴ ＣＴＣ Ｇ
ＣＴ ＧＧＧ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＣＡ Ｃ
ＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣＣ ＴＣＴ Ｃ
ＴＴ ＣＡＴ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＧＴ−３’（配列番号７）であった
。これらのオリゴマーはＢｇ１ＩＩ切断配列へのライゲーションに適合する張り
出し塩基を有する。ライゲーションの後、Ｂｇ１ＩＩ部位の上流は破壊されてい
るが、Ｂｇ１ＩＩの下流は続くライゲーションのために保持されている。双方の
接合部位および全ｔＰＡリーダー配列をＤＮＡシークエンシングにより確認した
。
【０１２５】 ＨＩＶ−１ＨＸＢ２株からのＥｎｖ（ｇｐ１６０）遺伝子のカルボキシル末端
トランケーション形態であるｇｐ１４３をプラスミドｐＳＰ６２で見出されたＥ
ｎｖ遺伝子から生成した。ｐＳＰ６２は国立保健研究所（ベセズダ、メリーラン
ド州）のＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏの研究室で構築され、Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より入手可能である
。ｐＳＰ６２はラムダＨＸＢ２からサブクロニングしたＨＸＢ２ゲノムの１２．
５ｋｂのＸｂａＩフラグメントを有する。ｐＳＰ６２のＳａｌＩおよびＸｂａ
Ｉ消化により２つのＨＸＢ２フラグメントを生じる：５’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ
、６．５ｋｂおよび３’−ＳａｌＩ／ＸｂａＩ、６ｋｂ。３’−ＳａｌＩ／Ｘｂ
ａＩフラグメントをＳａｌＩ部位でｐＵＣ１８にサブクローニングし、ｐＦ４１
２を生じた。ｐＦ４１２はＨＸＢ２からのｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖ／ｎｅｆを含
有する。鋳型としてｐＦ４１２を使用し、以下のセンスおよびアンチセンスを用
いてＰＣＲによりｇｐ１４３を調製した：５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣ
Ａ ＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’（
配列番号８）および５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ Ｇ ＣＣＣ ＧＧ
Ｇ Ｃ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＡＣ
ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＡＣ−３’（配列番号９）。得られたＤＮＡフラグメントは
いずれかの末端でｐＶ１ＪｅｎｏのＢｃ１Ｉ部位へのクローニングのためのＢｃ
１Ｉ制限部位を含有する。ライゲーション接合部のＤＮＡシークエンシングおよ
びトランスフェクトされた細胞のイムノブロット分析により構築物を確認した。
【０１２６】 ＨＩＶ構造遺伝子、例えばＥｎｖは一般に、効果的にタンパク質全長を生成す
るためにＨＩＶ制御遺伝子ｒｅｖの発現に必要とされる。これは恐らくｒｅｖに
ｇｐ１６０転写への依存性を付与する阻止領域（ＩＮＳと称する）がｇｐ１６０
内の−ＣＯＯＨ末端を含む多数の部位で生じたためである。これらの阻止ハイブ
リダイゼーションを排除することによりＥｎｖの全体の発現レベルを上昇させる
ためにｇｐ１４３が設計された。ｇｐ１４３はまた、細胞表面よりむしろリソソ
ームへの膜タンパク質の移転を引き起こすことが知られているペプチドモチーフ
（例えばロイシン−ロイシン）を含有する細胞内ｇｐ４１領域をも欠如する。従
って、本発明でｇｐ１４３を使用することにより、ｇｐ１６０全長に比較して、
ｒｅｖ依存性を減少させ、しかもタンパク質を細胞表面へより効率的に輸送させ
ることにより、Ｅｎｖタンパク質の発現を増加させる。
【０１２７】 実施例４ ｇｐ１４３を発現するＣＨＯ細胞の生成 組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダーハイブリダイ
ゼーションおよびｇｐ１４３／ＨＸＢ２を含有する２．１ｋｂのＮｃｏＩ／Ｓｒ
ｆＩフラグメントをｐＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３ＨＸＢ２ ｏｐｔＢ（ｐ
Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３ＨＸＢ２ ｏｐｔＢの生成の記載に関しては国
際特許出願ＷＯ９４／２１７９７を参照されたい）から単離し、ｐＬｉｔｍｕｓ
２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ部位
にサブクローニングした。２．２ｋｂのＸｂａＩ／ＳｐｅＩフラグメントをこの
ベクターから除去し、ｐＢＪ．Ｎｅｏ発現ベクターのＸｂａＩ部位にサブクロー
ニングした（ｐＢＪ．Ｎｅｏの生成の記載に関しては国際特許出願ＷＯ９７／４
１１５４を参照されたい）。次いでＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登
録商標）を使用し、製造者のプロトコルに従って、得られたプラスミド、ｐＢＪ
．Ｎｅｏ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３ＨＸＢ２をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞にトランスフェクトした。簡単には、トランスフェクションの２４時間前
に６ｘ１０５ＣＨＯ細胞／ウェルを６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種した。
トランスフェクションの前に細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ カ
タログ番号３１９８５）１ｍｌで１回洗浄し、同一培地をウェルあたり０．８ｍ
ｌ残した。プラスミドＤＮＡ（２μｇ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭＩで１００μｌに希
釈し、ＰＬＵＳ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）６μｌと混合し、室温で１５分間イン
キュベートした。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）（Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭＩで１００μｌに希釈）４μｌをプレ複合型ＤＮＡに加えた。この最
終混合物を室温で１５分間インキュベートし、各ウェルに加えた。３７℃で３時
間後、５％ ＣＯ２、２０％ ウシ胎児血清を補充したＯｐｔｉ−ＭＥＭＩウェ
ルあたり１ｍｌを各ウェルに加えた。４８時間後、培地を、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４
１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ、１０％ ウシ胎児血
清と置換した。Ｇ４１８抵抗性の単一の細胞クローンを選択し、単一の細胞をク
ローニングし、増殖させた。
【０１２８】 実施例５ βラクタマーゼを発現するジャーカット細胞の生成 βラクタマーゼを発現するジャーカット細胞を哺乳動物に適したβラクタマー
ゼの発現ベクターを利用して標準的な方法により作成できる。例えば、以下の方
法を用いることができる。ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１６５−２０８８）で、培地（ＨＥＰＥＳ不含ＲＰＭ
Ｉ １６４０：ＧＩＢＣＯ番号１１８７５）中、ＤＮＡ ２０μｇ、ｐｃＤＮＡ
３−ＢｌａＭ（Ａｕｒｏａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォ
ルニア州）をジャーカット細胞（６．２５ｘ１０６／ｍｌ）０．８ｍｌに加え、
氷上で１０分間インキュベートさせた。２９０ボルト、９６０μＦで約１８秒間
細胞にエレクトロポレーションを行った。氷上で１０分間インキュベートした後
、細胞を２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＲＰＭＩ １６４０、１０％ 熱不活性化ウ
シ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム、よび５５Ｍ ２−メルカプトエタノールの入ったＴ７５
フラスコに移し、３７℃で培養した。３６時間後、細胞を０．７ｍｇ／ｍｌ Ｇ
４１８を補充した新鮮培地に移した。個々のクローンを単一の細胞クローニング
により選別した。前記したＣＣＦ２／ＡＭを負荷した後、蛍光顕微鏡下で可視化
した場合に青色蛍光を発するクローンである、βラクタマーゼを発現するクロー
ンを選別した。
【０１２９】 本発明は本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定するものではな
い。実際に、本明細書に記載したものに加える種々の修飾は、前記の記載より当
業者に明らかであろう。かかる修飾は添付の請求の範囲の範囲内になることを意
図する。
【０１３０】 本明細書に引用した種々の文献は出展明示によりその全てを本明細書の一部と
する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１の細胞の細胞質膜のウイルスタンパク質および第２の細胞の細胞質膜の２
つの細胞表面タンパク質により媒介される本発明の一般的な特徴を示す。
【図２】 無傷のＣＣＦ２（点線）およびβラクタマーゼによりフルオレセインが切断さ
れた後のＣＣＦ２（実線）の発行スペクトルを示す。
【図３】 ＣＸＣＲ４の天然のリガンドであるＳＤＦ−１による、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、
およびＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質ｇｐ１４３により媒介される融合の用量依
存的阻止を示すグラフである。
【図４】 可溶性ＣＤ４による、ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、およびＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパ
ク質ｇｐ１４３により媒介される融合の用量依存的阻止を示すグラフである。
【図５Ａ】 発現ベクターｐＶ１ＪｎｅｏのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図５Ｂ】 発現ベクターｐＶ１ＪｎｅｏのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図５Ｃ】 発現ベクターｐＶ１ＪｎｅｏのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図５Ｄ】 発現ベクターｐＶ１ＪｎｅｏのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ベニンカーサ，ダイアナ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 カシーリ，マーガレツト・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 ミトナウル，リンドン・ジエイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 シヤオ，リン−リン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 トタ，マイケル・アール アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA01 DA02 EA01 FA02 HA09 JA03 KA02 KA03 KA05 2G045 AA40 CB01 FB07 FB12 4B024 AA01 AA11 BA11 BA63 CA04 DA02 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ10 QQ13 QQ14 QQ79 QQ96 QR58 QR72 QR77 QS02 QS36 QS39 QX02

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定により２つの細
    胞間で起こる融合の量を決定する方法であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
    第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
    断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
    、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
    ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
    るが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｃ）第１および第２の細胞間の融合が存在しない場合に第２の細胞の基質か
    らＦＲＥＴの量を測定するステップ； （ｄ）融合を生じるような条件下で第１および第２の細胞を接触させるステッ
    プ； （ｅ）融合を生じた後、基質からのＦＲＥＴの量を測定するステップ； を含み、 ここでステップ（ｃ）で測定されたＦＲＥＴの量に対する工程（ｅ）で測定され
    たＦＲＥＴの量の比率が生じた融合の量を表し、比率が小さいほど融合の量が多
    いことを示す、前記方法。
  2. 【請求項２】 第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法
    であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
    第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
    断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
    、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
    ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
    るが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
    在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
    質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
    で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）前記物質の存在下および不在下でステップ（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定
    するステップ； を含み、ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも物質の存在下で多い場合
    、前記物質が第１および第２の細胞の融合のインヒビターである、前記方法。
  3. 【請求項３】 第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法
    であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
    １の細胞が懸濁細胞であるステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しない第２の細胞を提供するステップであって、
    第２の細胞が付着細胞であるステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
    在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
    質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
    で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）融合していない第１の細胞を洗い流すステップ； （ｅ）基質が融合した細胞の細胞質および融合していない付着細胞の細胞質に
    取りこまれるような条件および十分な時間で、ステップ（ｄ）後の細胞をβラク
    タマーゼの蛍光基質に曝露するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼ
    により切断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合
    物であり、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し
    、リンカーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるこ
    とができるが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｆ）融合した細胞および融合していない付着細胞により取り込まれなかった
    基質を洗い流すステップ； （ｇ）融合した細胞中および融合していない付着細胞中の基質からＦＲＥＴの
    量を測定するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
    記物質が第１および第２の細胞の融合のインヒビターである、前記方法。
  4. 【請求項４】 （ｉ）第１の細胞がジャーカットＴ細胞であり； （ｉｉ）第２の細胞がＣＨＯ細胞または２９３Ｔ細胞であり； （ｉｉｉ）第１の細胞がヒトＣＤ４および、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＸ３Ｃ
    Ｒ１、ＣＣＲ８、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ９、ＣＣＲ３、ＳＴＲＬ３３／ＢＯＮＺＯ
    、ＧＰＲ１５／ＢＯＢおよびａｐｊからなる群から選択されるヒトケモカインレ
    セプタを発現し； （ｉｖ）第２の細胞がＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質を発現し； （ｖ）βラクタマーゼの基質がＣＣＦ２／ＡＭである； 請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＣＣＦ２／ＡＭが該方法で用いられる唯一の蛍光色素であり
    、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖタンパク質がｇｐ１４３である、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法
    であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
    １の細胞が、ＣＤ４およびケモカインレセプタをも発現するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
    第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
    断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
    、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
    ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
    るが、リンカーが切断されている場合には生じず、第２の細胞が融合を媒介する
    ウイルスタンパク質をも発現するステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
    在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
    質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
    で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）前記物質の存在下または不在下でステップ（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定
    するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
    記物質が第１および第２の細胞の融合のインヒビターである、前記方法。
  7. 【請求項７】 第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法
    であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
    １の細胞が融合を媒介するウイルス性タンパク質をも発現するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
    第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
    断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
    、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
    ーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができ
    るが、リンカーが切断されている場合には生じず、第２の細胞がＣＤ４およびケ
    モカインレセプタをも発現するステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
    在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
    質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
    で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）前記物質の存在下または不在下でステップ（ｃ）のＦＲＥＴの量を測定
    するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
    記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである、前記方法。
  8. 【請求項８】 第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方法
    であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
    １の細胞がＣＤ４およびケモカインレセプタをも発現する懸濁細胞であるステッ
    プ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しない第２の細胞を提供するステップであって、
    第２の細胞が第１および第２の細胞の融合を媒介するウイルス性タンパク質を発
    現する付着細胞であるステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
    在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、当該物
    質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
    で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）融合していない第１の細胞を洗い流すステップ； （ｅ）基質が融合した細胞の細胞質および融合していない付着細胞の細胞質に
    取りこまれるような条件および十分な時間で、融合細胞をβラクタマーゼの蛍光
    基質に曝露するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切断され
    やすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり、一方
    の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカーが無
    傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができるが、
    リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｆ）融合した細胞または融合していない付着細胞に取り込まれていない基質
    を洗い流すステップ； （ｇ）融合した細胞中または融合していない付着細胞中の基質からＦＲＥＴの
    量を測定するステップ； を含み、 ここでＦＲＥＴの量が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で多い場合、前
    記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである、前記方法。
  9. 【請求項９】 蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定により２つの細
    胞間で起こる融合の量を決定する方法であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しないが、βラクタマーゼの蛍光基質を含有する
    第２の細胞を提供するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切
    断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり
    、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカ
    ーが無傷である場合にＦＲＥＴを生じることができるが、リンカーが切断されて
    いる場合には生じないステップ； （ｃ）第１および第２の細胞間の融合が存在しない場合に第２の細胞中の基質
    から供与体／受容体発光比率を測定するステップ； （ｄ）融合を生じるような条件下で第１および第２の細胞を接触させるステッ
    プ； （ｅ）融合を生じた後、基質から供与体／受容体発光比率を測定するステップ
    ； を含み ここでステップ（ｃ）で測定された供与体／受容体発光比率に対するステップ（
    ｅ）で測定された供与体／受容体発光比率の比率が生じた融合の量を表し、比率
    が大きければ融合の量が多いことを示している、前記方法。
  10. 【請求項１０】 第１および第２の細胞の融合のインヒビターを同定する方
    法であって； （ａ）βラクタマーゼを発現する第１の細胞を提供するステップであって、第
    １の細胞が懸濁細胞であるステップ； （ｂ）βラクタマーゼを発現しない第２の細胞を提供するステップであって、
    第２の細胞が付着細胞であるステップ； （ｃ）第１および第２の細胞の融合のインヒビターであると疑われる物質の不
    在下で第１および第２の細胞間で融合を生じるような条件および時間で、その物
    質の存在下で第１および第２の細胞の部分を接触させ、およびその物質の不在下
    で第１および第２の細胞の部分を接触させるステップ； （ｄ）融合していない第１の細胞を洗い流すステップ； （ｅ）基質が融合した細胞の細胞質および融合していない付着細胞の細胞質に
    取りこまれるような条件および十分な時間で、融合細胞をβラクタマーゼの蛍光
    基質に曝露するステップであって、当該基質が、βラクタマーゼにより切断され
    やすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物であり、一方
    の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、リンカーが無
    傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じることができるが、
    リンカーが切断されている場合には生じないステップ； （ｆ）融合した細胞中の基質から供与体／受容体発光比率を測定するステップ
    ； を含み、 ここで供与体／受容体発光比率が前記物質の不在下よりも前記物質の存在下で小
    さい場合、前記物質は第１および第２の細胞の融合のインヒビターである、前記
    方法。
  11. 【請求項１１】 細胞レセプタ／リガンド対の相互作用のインヒビターを同
    定する方法であって； （ａ）細胞レセプタを発現する第１の細胞を提供するステップ； （ｂ）細胞レセプタのリガンドを発現する第２の細胞を提供するステップ； ここで （ｉ）第１の細胞がβラクタマーゼを発現し、第２の細胞は発現せず、第２の
    細胞はβラクタマーゼの蛍光基質を含有し、ここで当該基質がβラクタマーゼに
    より切断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合物
    であり、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し、
    リンカーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じること
    ができるが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ；または （ｉｉ）第２の細胞がβラクタマーゼを発現し、第１の細胞は発現せず、第１
    の細胞はβラクタマーゼの蛍光基質を含有し、ここで当該基質がβラクタマーゼ
    により切断されやすいリンカーにより連結されている２つの蛍光部分を含む化合
    物であり、一方の部分の発光スペクトルが他方の部分の吸収スペクトルと重複し
    、リンカーが無傷である場合に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じるこ
    とができるが、リンカーが切断されている場合には生じないステップ； のいずれかであり ここで、第１および第２の細胞が細胞レセプタおよびそのリガンドの相互作用に
    より近接する場合にのみ、第１の細胞または第２の細胞のいずれかが第１および
    第２の細胞の融合を媒介できるウイルスタンパク質を発現し； （ｃ）前記物質の不在下で、細胞レセプタおよびそのリガンドの相互作用によ
    り第１および第２の細胞が近接するように前記物質の存在下および不在下で第１
    および第２の細胞を混合するステップ； （ｄ）前記物質の存在下および不在下で、ステップ（ｃ）のＦＲＥＴの量を測
    定するステップ；を含み、 ここで前記物質の存在下のＦＲＥＴの量が前記物質の不在下のＦＲＥＴの量より
    多い場合、前記物質が細胞レセプタおよびそのリガンドの相互作用のインヒビタ
    ーである、前記方法。
  12. 【請求項１２】 細胞レセプタ／リガンド対が、Ｆａｓ／ＦａｓＬ；Ｔ細胞
    レセプタ／ＭＨＣ Ｉタンパク質；Ｔ細胞レセプタ／ＭＨＣ ＩＩタンパク質；
    ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプタ／フィブリノーゲン；プレセニリン−１／ＡＰＰ
    ；およびプレセニリン−２／ＡＰＰからなる群から選択する、請求項１１に記載
    の方法。
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