JP2003521944A - Partner, manufacture and use of the PTB1 domain of FEB65 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は新規化合物と医薬用、診断用又は薬理ターゲットとしてのその使用に関する。特に、本発明はＦＥ６５タンパク質のパートナーの同定と、ＦＥ６５の活性、特にＡＰＰの細胞内輸送又はエンドサイトーシス現象を制御するための前記パートナー又はＦＥ６５とのその相互作用を少なくとも部分的に調節することが可能な任意化合物の使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to novel compounds and their use as medicinal, diagnostic or pharmacological targets. In particular, the present invention relates to the identification of a partner of the FE65 protein and at least in part to modulate the activity of FE65, in particular its interaction with said partner or FE65 for controlling the intracellular transport of APP or the phenomenon of endocytosis. The use of any compound capable of
Description
【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は多くの高齢者に発症する神経変性病である。この
疾病の特徴は臨床面では認識機能低下であり、神経病理面では細胞内原線維沈着
とアミロイド斑を形成するβアミロイド（Ａβ）ペプチドの細胞外沈着が脳に存
在することである（Ｙａｎｋｎｅｒ，１９９６）。アミロイド斑は主にβアミロ
イドペプチドの前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク分解プロセスにより生成
される４０〜４２アミノ酸のＡβペプチドから構成される（Ｇｏｌｄｅら，１９
９２）。Ａβの細胞外沈着はＡＤに特異的である。これは家族性を含む全種ＡＤ
に共通する早期特徴である。家族性アルツハイマー病は比較的早期（４０〜６０
歳）に発症し、ＡＰＰ遺伝子とプレセニリン−１（ＰＳ１）及びプレセニリン−
２（ＰＳ２）遺伝子の突然変異に起因する。これらの３種の遺伝子の突然変異は
ＡＰＰのタンパク分解を変質させ、Ａβの過剰生産をもたらすと共に、病変と散
発性ＡＤに似た症状の早期発症をもたらす。Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that affects many older people. A clinical feature of this disease is a decline in cognitive function, and a neuropathological aspect is the presence of intracellular fibril deposition and extracellular deposition of β-amyloid (Aβ) peptide forming amyloid plaques in the brain (Yankner, 1996). ). Amyloid plaques are composed primarily of Aβ peptides of 40-42 amino acids produced by the proteolytic process of the precursor protein (APP) of β-amyloid peptide (Golde et al., 19
92). Extracellular deposition of Aβ is specific to AD. This is all species AD including familial
It is an early feature common to all. Familial Alzheimer's disease is relatively early (40-60
, The APP gene and presenilin-1 (PS1) and presenilin-
2 (PS2) gene mutation. Mutations in these three genes alter the proteolysis of APP, leading to overproduction of Aβ, as well as early onset of lesions and sporadic AD-like symptoms.
【０００２】
膜ＡＰＰのインターナリゼーションはその細胞質領域に依存するＡＰＰのタン
パク分解プロセスに必要な段階である（ＫｏｏとＳｑｕａｚｚｏ，１９９４）。
即ち、タンパク質のこの領域が欠失するか又はＡＰＰの細胞質領域でＴｙｒ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ配列のレベルに点突然変異が存在すると
、βアミロイドペプチドの生産は著しく低下する（Ｐｅｒｅｚら，１９９９）。
ＡＰＰの細胞質領域と相互作用するタンパク質は数種のものが同定されており、
従って、これらはＡＰＰのタンパク分解プロセスの調節とβアミロイドペプチド
の生産に関与するのではないかと考えられる。ＡＰＰの細胞質領域のＴｙｒ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ配列と相互作用するタンパク質ファミリ
ーとしてＦＥ６５及びＸ１１の２種が挙げられる（Ｂｏｒｇら，１９９６，１９
９８；Ｂｒｅｓｓｌｅｒら，１９９６；Ｄｕｉｌｉｏら，１９９８；Ｆｉｏｒｅ
ら，１９９５；Ｇｕｅｎｅｔｔｅら，１９９６；ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎとＭｉｌ
ｌｅｒ，１９９６；Ｍｅｒｃｋｅｎら，１９９８；ＴａｎａｈａｓｈｉとＴａｂ
ｉｒａ，１９９９ａ，１９９９ｂ及び１９９９ｃ）。ＦＥ６５タンパク質ファミ
リーはＦＥ６５、ＣＯＦＥ６５／ＦＥ６５Ｌ１及びＦＥ６５Ｌ２と呼ばれる３種
から構成される。Ｘ１１タンパク質ファミリーもＸ１１α、Ｘ１１β及びＸ１１
γと呼ばれる３種から構成される。これらの２種のタンパク質ファミリーはβア
ミロイドペプチドの生産の調節に相反する効果をもつ。本発明者らや他の研究室
はＦＥ６５の過剰発現がＡβペプチドの生産増加を誘導し（Ｍｅｒｃｋｅｎら，
１９９８；Ｓａｂｏら，１９９９）、Ｘ１１の過剰発現がＡβペプチドの生産低
下を誘導する（Ｂｏｒｇら，１９９８；Ｓａｓｔｒｅら，１９９８）ことを明ら
かにした。Internalization of membrane APP is a necessary step in the proteolytic process of APP depending on its cytoplasmic domain (Koo and Squazzo, 1994).
That is, this region of the protein is deleted or Tyr-G in the cytoplasmic region of APP.
The presence of point mutations at the level of the lu-Asn-Pro-Thr-Tyr sequence markedly reduces β-amyloid peptide production (Perez et al., 1999).
Several types of proteins that interact with the cytoplasmic region of APP have been identified,
Therefore, it is considered that they are involved in the regulation of the proteolytic process of APP and the production of β-amyloid peptide. Tyr-G in the cytoplasmic region of APP
Two protein families that interact with the lu-Asn-Pro-Thr-Tyr sequence include FE65 and X11 (Borg et al., 1996, 19).
98; Bressler et al., 1996; Dulio et al., 1998; Fiore.
Guenette et al., 1996; McLoughlin and Mil.
Ler, 1996; Mercken et al., 1998; Tanahashi and Tab.
ira, 1999a, 1999b and 1999c). The FE65 protein family consists of three species called FE65, COFE65 / FE65L1 and FE65L2. The X11 protein family is also X11α, X11β and X11
It is composed of three types called γ. These two protein families have opposing effects on the regulation of β-amyloid peptide production. The present inventors and others have shown that overexpression of FE65 induces increased production of Aβ peptide (Mercken et al.,
1998; Sabo et al., 1999), and overexpression of X11 induces reduced production of Aβ peptide (Borg et al., 1998; Sastre et al., 1998).
【０００３】
ＦＥ６５の一次構造を分析すると、このタンパク質はアダプターの役割を果た
すように思われる。即ち、ＦＥ６５はタンパク質−タンパク質相互作用に関与す
る３つのタンパク質ドメインを含み、即ちアミノ末端部分の１個のＷＷドメイン
とカルボキシ末端部分の２つのＰＴＢドメイン（ＰｈｏｓｐｈｏＴｙｒｏｓｉｎ
ｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ホスホチロシン結合ドメイン）ＰＴＢ１及
びＰＴＢ２を含む。欠失を作製した処、ＰＴＢ２及びＦＥ６５ドメインはＡＰＰ
の細胞質領域との相互作用に関与していることが判明した。ＷＷドメインは少な
くとも５種のタンパク質と相互作用し、そのうちの２種はＭｅｎａ（Ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｅｎａｂｌｅｄ：イネーブルド哺乳動物
ホモログ）タンパク質であると同定された（Ｅｒｍｅｋｏｖａら，１９９７）。
更に、ＰＴＢ１及びＦＥ６５ドメインはＣＰ２／ＬＳＦ／ＬＢＰ１転写因子（Ｚ
ａｍｂｒａｎｏら，１９９７）及びＬＲＰ（ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｒｅｌ
ａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＬＤＬレセプター関連タンパク質）レセプター（
Ｔｒｏｍｍｓｄｏｒｆｆら，１９９８）と相互作用する。しかし、ＦＥ６５の生
理機能におけるこれらのタンパク質の役割はまだ分かっていない。When analyzing the primary structure of FE65, this protein appears to act as an adapter. That is, FE65 contains three protein domains involved in protein-protein interactions, one WW domain at the amino-terminal portion and two PTB domains at the carboxy-terminal portion (PhosphoTyrosin).
e Binding domain: phosphotyrosine binding domain) PTB1 and PTB2. When the deletion was made, the PTB2 and FE65 domains were APP
Were found to be involved in the interaction with the cytoplasmic region of. The WW domain interacts with at least five proteins, two of which are Mena (Mamma).
Lian homologue of Enabled: an enabled mammalian homolog) protein was identified (Ermekova et al., 1997).
Furthermore, the PTB1 and FE65 domains are associated with the CP2 / LSF / LBP1 transcription factor (Z
ambrano et al., 1997) and LRP (LDL receptor-Rel).
arated Proteins: LDL receptor-related protein) Receptor (
Trommsdorff et al., 1998). However, the role of these proteins in FE65 physiology is still unknown.
【０００４】
従って、βアミロイドペプチドの生産プロセスにおけるＦＥ６５タンパク質の
厳密な役割の解明は、アルツハイマー病と神経変性病一般の理解と治療アプロー
チに重要な課題である。Therefore, elucidation of the exact role of the FE65 protein in the production process of β-amyloid peptide is an important subject for understanding Alzheimer's disease and neurodegenerative diseases in general and therapeutic approaches.
【０００５】
本発明は生理的条件下でＦＥ６５タンパク質と相互作用するこのタンパク質の
パートナーの同定を主眼とする。これらのパートナーはＦＥ６５の活性、特にβ
アミロイドペプチドの生産に関するその活性を調節することが可能な化合物の製
造又は研究の新規薬理ターゲットである。これらのタンパク質、抗体、対応する
核酸及び特異的プローブ又はプライマーは生体試料、特に神経組織試料でこれら
のタンパク質を検出又は定量するためにも有用である。これらのタンパク質又は
核酸はＦＥ６５及びＦＥ６５と本発明のポリペプチドの相互作用を調節すること
が可能な本発明の任意化合物の活性を調節するために治療アプローチでも有用で
ある。The present invention focuses on the identification of partners of this protein that interact with the FE65 protein under physiological conditions. These partners are responsible for the activity of FE65, especially β
It is a novel pharmacological target for the manufacture or study of compounds capable of modulating its activity with respect to the production of amyloid peptides. These proteins, antibodies, corresponding nucleic acids and specific probes or primers are also useful for detecting or quantifying these proteins in biological samples, especially neural tissue samples. These proteins or nucleic acids are also useful in therapeutic approaches to modulate the activity of FE65 and any compound of the invention capable of modulating the interaction of FE65 with a polypeptide of the invention.
【０００６】
本発明は特に本発明者らがＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用する２種の
ヒトタンパク質（配列番号１及び２の配列に示す）を発見した結果である。即ち
、本発明はｈｎＲＮＰＬタンパク質の中心領域がＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと
相互作用することを立証する。本発明は更にＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互
作用することが可能なＦＥＢＰ１（ＦＥ６５ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＰＴＢ１：ＦＥ
６５結合ＰＴＢ１ドメインタンパク質）と呼ぶ新規タンパク質の同定にも関する
。The present invention is particularly the result of the discovery by the present inventors of two human proteins (shown in the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2) that interact with the PTB1 domain of FE65. Thus, the present invention demonstrates that the central region of the hnRNPL protein interacts with the PTB1 domain of FE65. The present invention further provides FEBP1 ( FE 65 B binding P TB 1 : FE capable of interacting with the PTB1 domain of FE65).
It also relates to the identification of a novel protein called the 65-binding PTB1 domain protein).
【０００７】
本発明はＦＥ６５タンパク質の機能の調節に関与する上記ｈｎＲＮＰＬ及びＦ
ＥＢＰ１タンパク質の特定領域の同定と特性決定の結果でもある。これらのタン
パク質とその機能に関与する領域の存在を解明することにより、特に薬剤として
有用な新規化合物及び／又は組成物を製造し、このような化合物の工業的スクリ
ーニング方法を開発することが可能になる。The present invention relates to the above-mentioned hnRNPL and F involved in the regulation of FE65 protein function.
It is also the result of the identification and characterization of specific regions of the EBP1 protein. By elucidating the existence of these proteins and regions involved in their functions, it becomes possible to produce novel compounds and / or compositions particularly useful as drugs, and to develop an industrial screening method for such compounds. Become.
【０００８】
従って、本発明の第１の目的はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質
（又はそのホモログ）とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部
分的に調節するか又はこの相互作用のレベルに作用することが可能な化合物に関
する。Therefore, a first object of the present invention is to at least partially modulate the interaction of the hnRNPL and / or FEBP1 protein (or its homolog) with the PTB1 domain of FE65 or to act on the level of this interaction. Relating to a compound capable of
【０００９】
本発明の化合物の作用は種々の側面で発現することができる。本発明の化合物
はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質（又はそのホモログ）とＦＥ６
５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に抑制、阻害又は刺激する
ことができる。例えば二重ハイブリッド型系や２種のポリペプチド間の相互作用
の任意無細胞検出系でこの相互作用をｉｎ ｖｉｔｒｏ調節することが可能な化
合物が好ましい。本発明の化合物はこの相互作用を少なくとも部分的に調節し、
好ましくは化合物の不在下の対照に比較してこの相互作用を少なくとも２０％、
より好ましくは少なくとも５０％増加又は阻害することが可能な化合物が好まし
い。The action of the compounds of the invention can be manifested in various ways. The compound of the present invention comprises hnRNPL and / or FEBP1 protein (or a homolog thereof) and FE6.
The interaction of the 5 PTB1 domains can be at least partially suppressed, inhibited or stimulated. For example, compounds that are capable of modulating this interaction in vitro in a double hybrid system or any cell-free detection system for the interaction between two polypeptides are preferred. The compounds of the invention modulate this interaction, at least in part,
Preferably at least 20% of this interaction compared to a control in the absence of compound,
More preferably, compounds capable of increasing or inhibiting by at least 50% are preferred.
【００１０】
本発明の趣旨では、ｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とはこれらのタン
パク質自体とその全ホモログ形を意味する。ホモログ形とは該当タンパク質に等
価であり、種々の細胞起源、特にヒト又は他の生物起源の細胞に由来し、同一型
の活性をもつ全タンパク質を意味する。このようなホモログは指定タンパク質の
天然変異体、特に多形又はスプライシング変異体も含む。ホモログタンパク質（
又はポリペプチド）は例えばコーディング核酸間のハイブリダイゼーション実験
により取得することができる。本発明の趣旨では、請求するようなｈｎＲＮＰＬ
及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質に類似の生理的機能を生じるためにはこの種の
配列が有意一致度百分率を示せば十分である。For the purposes of the present invention, the hnRNPL and FEBP1 proteins mean these proteins themselves and all homologous forms thereof. The homologous form is equivalent to the protein of interest and means all proteins having the same type of activity, which are derived from cells of various cell origins, especially human or other biological origins. Such homologs also include naturally occurring variants of the designated protein, especially polymorphic or splicing variants. Homolog protein (
Or a polypeptide) can be obtained by, for example, a hybridization experiment between coding nucleic acids. For the purposes of the invention, as claimed, hnRNPL
And / or it is sufficient for this kind of sequence to exhibit a significant percentage of concordance in order to produce a similar physiological function to the FEBP1 protein.
【００１１】
特定実施態様によると、本発明の化合物はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１
タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用ドメインのレベルに結合す
ることができる。According to a particular embodiment, the compound of the invention is hnRNPL and / or FEBP1.
It can bind to the level of the interaction domain of the protein and the PTB1 domain of FE65.
【００１２】
本発明の化合物は種々の型及び起源のものでよい。特に、ペプチド、核酸（即
ち塩基鎖、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む）、脂質、糖、抗体等の型の化合物
とすることができ、一般には全有機又は無機分子とすることができる。The compounds of the present invention may be of various types and origins. In particular, it can be a compound of the type of peptides, nucleic acids (ie including base chains, especially DNA or RNA molecules), lipids, sugars, antibodies and the like, generally all organic or inorganic molecules.
【００１３】
第１の変形例によると、本発明の化合物はペプチド種である。ペプチドなる用
語は例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体（又は抗体フラグメント
もしくは誘導体）等のアミノ酸鎖を含む任意分子を意味し、場合により修飾され
ていてもよいし、別の化合物又は化学基と結合していてもよい。この点で、「ペ
プチド」なる用語は特に最大５０アミノ酸、より好ましくは最大４０アミノ酸の
鎖を含む分子を意味する。ポリペプチドは５０〜５００アミノ酸又はそれ以上を
含むものが好ましい。タンパク質は天然分子に対応するポリペプチドである。According to a first variant, the compounds of the invention are peptidic species. The term peptide refers to any molecule containing an amino acid chain, such as a peptide, polypeptide, protein, antibody (or antibody fragment or derivative), optionally modified or attached to another compound or chemical group. You may have. In this respect, the term "peptide" means a molecule which comprises a chain of especially up to 50 amino acids, more preferably up to 40 amino acids. It is preferred that the polypeptide comprises 50-500 amino acids or more. A protein is a polypeptide that corresponds to a naturally occurring molecule.
【００１４】
第１の好適実施態様によると、本発明のペプチド化合物はｈｎＲＮＰＬタンパ
ク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はその誘導体のペプチド配列の一
部を含む。夫々配列番号７及び配列番号９の配列を含むことを特徴とするｈｎＲ
ＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の配列の一部がより好ましい
。According to a first preferred embodiment, the peptide compound of the invention comprises part of the peptide sequence of the hnRNPL protein and / or the FEBP1 protein and / or its derivatives. HnR comprising the sequences SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 respectively
More preferred is a part of the sequence of NPL protein and / or FEBP1 protein.
【００１５】
本発明のペプチド化合物はｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タン
パク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用部位の全部又は機能的部分に対
応する配列をもつ領域を含む化合物がより好ましい。このような化合物、特にペ
プチドはｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１の競合体を構成し、ｈｎＲＮＰＬ及
び／又はＦＥＢＰ１タンパク質（又はそのホモログ形）とＦＥ６５のＰＴＢ１ド
メインの相互作用を少なくとも部分的に調節することができる。配列番号７の配
列の残基１〜３４９又は配列番号９の配列の残基１〜３３７を含むペプチド化合
物がより好ましい。実施例に示すように、これらの配列はｈｎＲＮＰＬタンパク
質の中心領域（残基１１６〜４６４）及びＦＥＢＰ１タンパク質の少なくとも一
部を含み、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと特異的に相互作用することができるが
、ＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインとは相互作用することができない。More preferably, the peptide compound of the present invention is a compound containing a region having a sequence corresponding to all or a functional portion of the interaction site of the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and the PTB1 domain of FE65. Such compounds, in particular peptides, may constitute hnRNPL and / or FEBP1 competitors and may at least partially modulate the interaction of hnRNPL and / or FEBP1 proteins (or homologues thereof) with the PTB1 domain of FE65. . More preferred is a peptide compound comprising residues 1 to 349 of the sequence SEQ ID NO: 7 or residues 1 to 337 of the sequence SEQ ID NO: 9. As shown in the examples, these sequences include the central region of the hnRNPL protein (residues 116-464) and at least a portion of the FEBP1 protein and are capable of specifically interacting with the PTB1 domain of FE65, although FE65. Cannot interact with the PTB2 domain of E. coli.
【００１６】
特定実施態様において、化合物はＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ配列（残基
５５〜５８）を含む少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも９アミノ酸か
らなる配列番号７の配列のフラグメントである。[0016] In a particular embodiment, the compound is a fragment of the sequence SEQ ID NO: 7 comprising at least 5 amino acids, preferably at least 9 amino acids, comprising the Asn-Pro-Ile-Tyr sequence (residues 55-58).
【００１７】
別の好適実施態様によると、本発明のペプチド化合物は非機能的になったエフ
ェクター領域をもつｈｎＲＮＰＬタンパク質又はＦＥＢＰ１タンパク質（及び／
又はホモログ形）から誘導される化合物である。このようなペプチド化合物はｈ
ｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はホモログ形の
少なくともこのエフェクター領域の欠失、突然変異又は破壊により取得すること
ができる。このような変異は例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、付加エレメ
ントもしくは合成配列の導入、又は元のエレメントの欠失もしくは置換により実
施することができる。従って、これらのポリペプチドはＦＥ６５タンパク質に結
合することができるが、少なくとも天然タンパク質と同程度の機能シグナルを誘
導することはできない。According to another preferred embodiment, the peptide compound of the invention comprises the hnRNPL protein or the FEBP1 protein (and / or the hnRNPL protein having a non-functionalized effector region).
Or a homolog form). Such a peptide compound is h
It can be obtained by deletion, mutation or disruption of at least this effector region in the nRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or homologous form. Such mutations can be carried out, for example, by in vitro mutagenesis, introduction of additional elements or synthetic sequences, or deletion or substitution of the original element. Thus, these polypeptides are able to bind to the FE65 protein, but at least not induce a functional signal comparable to the native protein.
【００１８】
特定実施態様によると、本発明の化合物は配列番号７又は配列番号９の配列を
含み、少なくともエフェクター領域に突然変異をもつポリペプチドである。According to a particular embodiment, the compound of the invention is a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and having a mutation in at least the effector region.
【００１９】
特定実施態様によると、本発明の化合物は配列番号７又は配列番号９の配列を
含み、少なくともエフェクター領域に欠失をもつポリペプチドである。According to a particular embodiment, the compound of the invention is a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and having a deletion in at least the effector region.
【００２０】
特定実施態様によると、本発明の化合物は配列番号７又は配列番号９の配列を
含み、少なくともエフェクター領域に挿入をもつポリペプチドである。According to a particular embodiment, the compound of the invention is a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 and having an insertion in at least the effector region.
【００２１】
本発明の別の目的はＦＥＢＰ１タンパク質又はその任意フラグメントもしくは
誘導体である。特に、配列番号９の配列又はその誘導体もしくはフラグメントを
含む任意ポリペプチドであり、配列番号９の配列又はその誘導体の少なくとも１
０個の連続残基を含む任意ポリペプチドがより好ましく、少なくともＦＥ６５の
ＰＴＢ１ドメインとの結合に関与する残基を含むものが更に好ましい。Another object of the invention is the FEBP1 protein or any fragment or derivative thereof. In particular any polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 9 or a derivative or fragment thereof, wherein at least one of the sequence of SEQ ID NO: 9 or its derivative
More preferred are any polypeptides containing 0 consecutive residues, even more preferred are those containing at least those residues involved in binding to the PTB1 domain of FE65.
【００２２】 本発明の別の目的は配列番号７の配列を含むポリペプチドである。[0022] Another object of the invention is a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 7.
【００２３】
誘導体なる用語は特に本発明の趣旨では１カ所以上の遺伝及び／又は化学修飾
により得られる遺伝コードの縮重により該当配列と異なる任意配列と、配列番号
６又は８の核酸配列又はそのフラグメントとハイブリダイズする配列によりコー
ドされ、ｈｎＲＮＰＬタンパク質及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はそ
のホモログとＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用のレベルに作用することが
可能な任意ペプチドを意味する。遺伝及び／又は化学修飾とは、１個以上の残基
の任意突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾を意味する。誘導体なる用語
は該当配列に相同であり、他の細胞起源、特にヒト又は他の生物起源の細胞に由
来し、同一型の活性をもつ配列も含む。このような相同配列はハイブリダイゼー
ション実験により取得することができる。ハイブリダイゼーションは核酸ライブ
ラリーを使用し、種々のハイブリダイゼーション条件下で天然配列又はそのフラ
グメントをプローブとして使用することにより実施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
，一般分子生物学技術参照）。更に、「フラグメント」又は「部分」なる用語は
少なくとも５個の連続残基、好ましくは少なくとも９個の連続残基、より好まし
くは少なくとも１５個の連続残基を含む該当分子の任意部分を意味する。The term “derivative” particularly refers to any sequence which differs from the corresponding sequence due to the degeneracy of the genetic code obtained by one or more genetic and / or chemical modifications for the purpose of the present invention, and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6 or By any peptide encoded by a sequence that hybridizes to the fragment is meant a peptide capable of affecting the level of interaction of the FB65 PTB1 domain with the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or its homologs. Genetic and / or chemical modification means any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues. The term derivative is also homologous to the sequence of interest and also includes sequences having the same type of activity, which are derived from cells of other cellular origin, in particular of human or other biological origin. Such a homologous sequence can be obtained by a hybridization experiment. Hybridization can be performed using a nucleic acid library and using the native sequence or a fragment thereof as a probe under various hybridization conditions (see Sambrook et al., General Molecular Biology Techniques). Furthermore, the term "fragment" or "portion" means any part of the molecule of interest which comprises at least 5 contiguous residues, preferably at least 9 contiguous residues, more preferably at least 15 contiguous residues. .
【００２４】
このような誘導体又はフラグメントは種々の目的で作製することができ、例え
ば、特にその治療効果を増したり、その副作用を減らしたり、新規薬物動態学的
及び／又は生物学的性質を付与する目的で作製することができる。Such derivatives or fragments can be made for various purposes, eg to increase their therapeutic efficacy, reduce their side effects, impart new pharmacokinetic and / or biological properties, among others. It can be produced for the purpose of
【００２５】
上記のような誘導体又はフラグメントを作製すると、ｈｎＲＮＰＬタンパク質
及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質及び／又はそのホモログ形とＦＥ６５のＰＴＢ
１ドメイン結合部位との結合に及ぼすその生物活性を解明することができる。当
然のことながら、このためには実験の項に説明するような当業者に公知の任意技
術を利用することができる（二重ハイブリッド、カラム結合、無細胞系、細胞系
、等）。When the derivative or fragment as described above is prepared, the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and / or its homologous form and PTB of FE65 are prepared.
Its biological activity on binding to the one-domain binding site can be elucidated. Of course, any technique known to the person skilled in the art as described in the experimental section can be used for this (double hybrid, column binding, cell-free system, cell system, etc.).
【００２６】
一般に、本発明の化合物はｈｎＲＮＰＬ又はＦＥＢＰ１タンパク質又は上記ペ
プチド化合物の任意フラグメントとすることができる。このようなフラグメント
は種々の方法で作製することができる。特に、当業者に公知のペプチド合成機を
使用することにより本明細書に記載する配列に基づいて化学的に合成することが
できる。所望ペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞宿主で発現させるこ
とにより遺伝子工学的に合成することもできる。この場合には、ヌクレオチド配
列はオリゴヌクレオチド合成機を使用することにより、本明細書に記載するペプ
チド配列と遺伝コードに基づいて化学的に作製することができる。ヌクレオチド
配列は本明細書に記載する配列から当業者に公知の方法で酵素切断、ライゲーシ
ョン、クローニング等により作製してもよいし、これらの配列から作製したプロ
ーブでＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより作製してもよい。In general, the compounds of the invention can be hnRNPL or FEBP1 proteins or any fragment of the above peptide compounds. Such fragments can be made in a variety of ways. In particular, it can be chemically synthesized based on the sequences described herein by using a peptide synthesizer known to those skilled in the art. The nucleotide sequence encoding the desired peptide can also be synthesized by genetic engineering by expressing it in a cell host. In this case, the nucleotide sequence can be chemically produced by using an oligonucleotide synthesizer based on the peptide sequence and genetic code described herein. The nucleotide sequence may be prepared from the sequences described herein by a method known to those skilled in the art by enzymatic cleavage, ligation, cloning or the like, or prepared by screening a DNA library with a probe prepared from these sequences. You may.
【００２７】
本発明の他のペプチドはそれらの細胞ターゲットとの相互作用に関して上記ペ
プチドと競合することが可能なペプチドである。このようなペプチドは特に該当
ペプチドの配列に基づいて合成することができ、上記ペプチドと競合できるか否
かを調べることができる。Other peptides of the invention are peptides capable of competing with the above peptides for their interaction with cellular targets. Such a peptide can be specifically synthesized based on the sequence of the peptide of interest, and it can be examined whether or not it can compete with the peptide.
【００２８】
別の特定実施態様によると、本発明の化合物は抗体又は抗体フラグメントもし
くは誘導体である。即ち、本発明の別の目的は上記のようなペプチド化合物又は
タンパク質に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体又は抗体フラグメン
トである。このような抗体は当業者に公知の方法により作製することができる。
特に、これらの抗体は動物を本発明のペプチドに対して免疫し、採血して抗体を
分離することにより作製することができる。これらの抗体は当業者に公知の方法
によりハイブリドーマ作製により作製することもできる。According to another particular embodiment, the compounds of the invention are antibodies or antibody fragments or derivatives. That is, another object of the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody or antibody fragment against the peptide compound or protein as described above. Such an antibody can be produced by a method known to those skilled in the art.
In particular, these antibodies can be prepared by immunizing an animal against the peptide of the present invention, collecting blood, and separating the antibodies. These antibodies can also be prepared by hybridoma preparation by a method known to those skilled in the art.
【００２９】
本発明の抗体又は抗体フラグメントは上記ペプチド化合物又はｈｎＲＮＰＬ及
び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少な
くとも部分的に調節することができ、ＦＥ６５の活性を調節するために使用でき
ることがより好ましい。The antibody or antibody fragment of the present invention can at least partially modulate the interaction of the peptide compound or hnRNPL and / or FEBP1 protein with the PTB1 domain of FE65, and can be used to modulate the activity of FE65. Is more preferable.
【００３０】
更に、これらの抗体は生体試料における本発明のペプチドの発現を検出及び／
又は定量するため、従って、その活性化状態について調べるためにも使用するこ
とができる。Furthermore, these antibodies detect and / or express the peptides of the invention in biological samples.
Or it can also be used for quantification and thus for its activation status.
【００３１】
抗体フラグメント又は誘導体は例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２、１本鎖抗体（Ｓｃ
Ｆｖ）等である。特に元の抗体の抗原特異性を維持する任意フラグメント又は誘
導体が挙げられる。Antibody fragments or derivatives are, for example, Fab, Fab′2, single chain antibodies (Sc
Fv) and the like. In particular, any fragment or derivative that maintains the antigen specificity of the original antibody is included.
【００３２】
本発明の抗体は夫々配列番号７又は９の配列を含むｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦ
ＥＢＰ１タンパク質、特にＦＥ６５との相互作用に関与するこれらのタンパク質
の領域と結合できることがより好ましい。これらの抗体（又はフラグメントもし
くは誘導体）は配列番号７の残基１〜３４９又は配列番号６の残基１〜３３７に
含まれる配列中に存在するエピトープと結合できることがより好ましい。The antibody of the present invention comprises hnRNPL and / or F containing the sequence of SEQ ID NO: 7 or 9, respectively.
More preferably, it is able to bind to the regions of these proteins involved in the interaction with the EBP1 protein, especially FE65. More preferably, these antibodies (or fragments or derivatives) are capable of binding to an epitope present in the sequence contained in residues 1-349 of SEQ ID NO: 7 or residues 1-337 of SEQ ID NO: 6.
【００３３】
本発明は上記相互作用を抑制することが可能な非ペプチド又は非排他的ペプチ
ド化合物と、薬剤としてのその使用にも関する。即ち、特にペプチドの活性モチ
ーフを非ペプチド又は非排他的ペプチド種構造と組合せることにより、本明細書
に記載する活性タンパク質モチーフからｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タン
パク質の活性の調節分子として医薬用途に適合可能な非排他的ペプチド分子を作
製することができる。The present invention also relates to non-peptide or non-exclusive peptide compounds capable of inhibiting the above interactions and their use as drugs. Thus, in particular by combining the active motif of the peptide with a non-peptide or non-exclusive peptide species structure, the active protein motif described herein can be adapted for pharmaceutical use as a modulator of the activity of the hnRNPL and / or FEBP1 protein. Non-exclusive peptide molecules can be made.
【００３４】
本発明は本発明のペプチド化合物をコードする任意核酸にも関する。特に配列
番号６及び配列番号８に示す配列又はその誘導体の全部又は一部を含む配列が挙
げられる。誘導配列とは、本発明の趣旨では配列番号６及び配列番号８に示す配
列又は本発明のペプチドをコードするそのフラグメントとハイブリダイズする任
意配列と、遺伝コードの縮重によりこれらの配列から得られる配列を意味する。
本発明の種々のヌクレオチド配列は人工起源でもよいし、そうでなくてもよい。
ゲノム配列、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド配列又は合成もしくは半合成配列
が挙げられる。これらの配列はＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー、ゲ
ノムＤＮＡライブラリー）のスクリーニング、化学的合成、ライブラリースクリ
ーニングにより得られた配列の化学又は酵素修飾を含む混合法により得ることが
できる。上記ハイブリダイゼーションは高ストリンジェント条件下、特にクエン
酸三ナトリウム−２Ｈ２Ｏ ８．８２３ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１７．５３２ｇ
／ｌ及びドデシル硫酸ナトリウム１％を含む溶液中で５０℃の温度で１時間の条
件下、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，９．５２〜９．５５頁）に記載の条
件下で実施することが好ましい。The invention also relates to any nucleic acid encoding a peptide compound of the invention. In particular, the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or a sequence containing all or a part of the derivative thereof can be mentioned. Inducible sequences are, for the purposes of the invention, any sequences which hybridize to the sequences shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 or fragments thereof which encode the peptides of the invention, and to these sequences by degeneracy of the genetic code. Means an array.
The various nucleotide sequences of the present invention may or may not be of artificial origin.
Mention may be made of genomic sequences, cDNA, RNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. These sequences can be obtained by a screening method of a DNA library (cDNA library, genomic DNA library), chemical synthesis, a mixing method including chemical or enzymatic modification of the sequences obtained by the library screening. The above hybridization was carried out under high stringent conditions, especially trisodium citrate-2H 2 O 8.823 g / l, sodium chloride 17.532 g.
/ L and sodium dodecylsulfate 1% in a solution at a temperature of 50 ° C for 1 hour, or under the conditions described in Sambrook et al. (1989, 9.52-9.55). .
【００３５】
本発明の趣旨で特定核酸は配列番号９の配列を含むポリペプチド又はそのフラ
グメントもしくは誘導体、特にヒトＦＥＢＰ１タンパク質をコードする。配列番
号８の核酸配列を含む核酸が有利である。For the purposes of the present invention, the specific nucleic acid encodes a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 9 or a fragment or derivative thereof, in particular the human FEBP1 protein. A nucleic acid comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 8 is advantageous.
【００３６】
本発明の核酸は本発明のペプチド化合物の製造に使用することができる。従っ
て、本願はペプチド化合物の製造方法として、本発明の核酸を含む細胞を前記核
酸の発現条件下で培養し、生産されたペプチド化合物を回収する方法にも関する
。この場合には、一般に前記ポリペプチドをコードする部分を、細胞宿主でのそ
の発現を可能にするシグナルの制御下におく。これらのシグナル（プロモーター
、ターミネーター、分泌「リーダー」配列等）の選択は使用する細胞宿主により
異なる。更に、本発明の核酸はベクターの一部でもよく、ベクターは自律複製型
でも組込み型でもよい。特に、自律複製ベクターは選択した宿主で自律複製配列
を使用することにより作製することができる。組込みベクターについては、例え
ば宿主のゲノムの所定領域に相同であり、相同組換えによりベクターの組込みが
可能な配列を使用することにより作製することができる。ベクターとしてはプラ
スミド、エピソーム、染色体、ウイルス等の型のベクターが挙げられる。The nucleic acid of the present invention can be used for producing the peptide compound of the present invention. Therefore, the present application also relates to a method for producing a peptide compound, which comprises culturing cells containing the nucleic acid of the present invention under the expression condition of the nucleic acid, and recovering the produced peptide compound. In this case, the part which codes for said polypeptide is generally under the control of signals which allow its expression in the cellular host. The choice of these signals (promoter, terminator, secretory "leader" sequences, etc.) will depend on the cell host used. Furthermore, the nucleic acid of the present invention may be part of a vector, and the vector may be autonomously replicating or integrative. In particular, autonomously replicating vectors can be made by using the autonomously replicating sequences in the host of choice. The integration vector can be prepared, for example, by using a sequence that is homologous to a predetermined region of the genome of the host and can integrate the vector by homologous recombination. Examples of the vector include plasmid, episome, chromosome, virus and other types of vectors.
【００３７】
組換えによる本発明のペプチドの製造に使用可能な細胞宿主は真核宿主でも原
核宿主でもよい。適切な真核宿主としては、動物細胞、酵母、又は真菌類を挙げ
ることができる。特に、酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ又はＨａｎ
ｓｅｎｕｌａ属の酵母を挙げることができる。動物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨ
Ｏ、Ｃ１２７、ＰＣ１２等の細胞を挙げることができる。真菌類としては、特に
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を挙げることができる
。原核宿主としては大腸菌、バチラス又はストレプトミセス等の細菌を使用する
ことが好ましい。The cell host that can be used for recombinant production of the peptide of the present invention may be a eukaryotic host or a prokaryotic host. Suitable eukaryotic hosts can include animal cells, yeast, or fungi. Particularly, as yeasts, Saccharomyces, Kluy
veromyces, Pichia, Schwanniomyces or Han
The yeast of the genus senula can be mentioned. Animal cells include COS, CH
Examples thereof include cells such as O, C127 and PC12. Among the fungi, mention may be made in particular of Aspergillus species or Trichoderma species. It is preferable to use bacteria such as Escherichia coli, Bacillus or Streptomyces as the prokaryotic host.
【００３８】
本発明の核酸は薬剤又は診断薬として使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオ
チド又は遺伝子アンチセンスの作製にも使用することができる。アンチセンス配
列は所定遺伝子のコーディング鎖に相補的な小寸法のオリゴヌクレオチドであり
、従って、転写ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしてそのタンパク質翻訳を阻
害することができる。従って、本発明はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タン
パク質とＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に阻害する
ことが可能なアンチセンス配列にも関する。このような配列は上記ヌクレオチド
配列の全部又は一部から構成することができる。このような配列は一般にＦＥ６
５のＰＴＢ１ドメインと相互作用するペプチドをコードする配列に相補的な配列
又は配列フラグメントである。このようなオリゴヌクレオチドは分画又は化学的
合成等により取得することができる。The nucleic acid of the present invention can also be used for producing an antisense oligonucleotide or gene antisense that can be used as a drug or a diagnostic agent. Antisense sequences are small oligonucleotides that are complementary to the coding strand of a given gene and are therefore capable of specifically hybridizing to transcribed mRNA and inhibiting its protein translation. Accordingly, the present invention also relates to antisense sequences capable of at least partially inhibiting the interaction of the hnRNPL and / or FEBP1 protein with the PTB1 domain of FE65. Such a sequence can consist of all or part of the above nucleotide sequence. Such sequences are generally FE6
5 is a sequence or sequence fragment complementary to a sequence encoding a peptide that interacts with the PTB1 domain of 5. Such an oligonucleotide can be obtained by fractionation, chemical synthesis or the like.
【００３９】
核酸配列はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５のＰＴＢ
１ドメインの相互作用を調節することが可能なアンチセンス配列又はペプチドを
転写及びｉｎ ｖｉｖｏ発現させるために治療範囲内で使用することもできる。
この点では、ウイルス又は非ウイルスベクターに配列を組込むと、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ投与することができる（Ｋａｈｎ，Ａ．ら，１９９１）。本発明のウイルスベ
クターとしては、特にアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（
ＡＡＶ）又はヘルペスウイルス型のベクターを挙げることができる。本願は本発
明の（ポリ）ペプチドをコードする核酸を含む組換え欠損ウイルスにも関する。The nucleic acid sequence is hnRNPL and / or FEBP1 protein and PTB of FE65.
Antisense sequences or peptides capable of modulating single domain interactions can also be used within therapeutic range for transcription and in vivo expression.
In this regard, integration of the sequence into viral or non-viral vectors allows in vivo
can be administered (Kahn, A. et al., 1991). Examples of the viral vector of the present invention include adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus (
AAV) or herpesvirus type vectors. The present application also relates to a recombinant defective virus comprising a nucleic acid encoding the (poly) peptide of the invention.
【００４０】
本発明によると、上記核酸又はその相補鎖とハイブリダイズすることが可能な
合成又は非合成ヌクレオチドプローブを作製することもできる。このようなプロ
ーブはｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の発現もしくは過剰発現の
検出、又は遺伝異常（スプライシング異常、多形、点突然変異等）の検出用診断
ツールとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ使用することができる。これらのプローブは他の
細胞起源、好ましくはヒト起源細胞から上記のようなペプチドをコードする相同
核酸配列を検出及び単離するためにも使用することができる。本発明のプローブ
は一般に少なくとも１０塩基を含み、例えば上記配列又はその相補鎖の１種の全
体までを含むことができる。これらのプローブはその使用前に標識することが好
ましい。このためには、当業者に公知の種々の方法（放射能、蛍光、酵素、化学
標識等）を利用することができる。According to the present invention, a synthetic or non-synthetic nucleotide probe capable of hybridizing with the above nucleic acid or its complementary strand can also be prepared. Such a probe can be used in vitro as a diagnostic tool for detecting the expression or overexpression of hnRNPL and / or FEBP1 protein, or detecting a genetic abnormality (splicing abnormality, polymorphism, point mutation, etc.). These probes can also be used to detect and isolate homologous nucleic acid sequences encoding peptides as described above from cells of other cell origin, preferably of human origin. The probe of the present invention generally comprises at least 10 bases and can include, for example, the entire sequence above or one of its complements. These probes are preferably labeled prior to their use. For this purpose, various methods known to those skilled in the art (radioactivity, fluorescence, enzyme, chemical labeling, etc.) can be used.
【００４１】
本発明は少なくとも１種の上記のような化合物、特にペプチド化合物を有効成
分として含む任意医薬組成物にも関する。The present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least one compound as described above, in particular a peptide compound.
【００４２】
本発明は特に少なくとも１種の上記のような抗体及び／又は抗体フラグメント
を有効成分として含む任意医薬組成物と、少なくとも１種の上記のような核酸又
はベクターを有効成分として含む任意医薬組成物に関する。The present invention particularly relates to any pharmaceutical composition containing at least one antibody and / or antibody fragment as described above as an active ingredient, and any pharmaceutical composition containing at least one nucleic acid or vector as described above as an active ingredient. It relates to a composition.
【００４３】
本発明はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５タンパク質
の相互作用を増減することが可能な化学分子を有効成分として含む任意医薬組成
物にも関する。The present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a chemical molecule capable of increasing or decreasing the interaction between hnRNPL and / or FEBP1 protein and FE65 protein.
【００４４】
更に、本発明は上記ペプチド、抗体、化学分子及びヌクレオチド配列を併有す
るか又は他の有効成分と併有する医薬組成物にも関する。Furthermore, the present invention also relates to a pharmaceutical composition having the above-mentioned peptide, antibody, chemical molecule and nucleotide sequence in combination or in combination with other active ingredients.
【００４５】
本発明の医薬組成物はｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の活性を
調節し、従って、ＡＰＰの機能、その細胞内輸送、その成熟及びβアミロイドペ
プチドへのその変換を調節するために使用することができる。特に、これらの医
薬組成物はｈｎＲＮＰＬ又はＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５タンパク質の相互
作用を調節するために使用される。例えばアルツハイマー病等の神経変性病を治
療するための医薬組成物がより好ましい。本発明の組成物（又は化合物）は特に
ＦＥ６５タンパク質とｈｎＲＮＰＬ及び／又はＦＥＢＰ１タンパク質の相互作用
を少なくとも部分的に阻害するために使用される。The pharmaceutical composition of the present invention is used to modulate the activity of hnRNPL and / or FEBP1 protein and thus regulate the function of APP, its intracellular trafficking, its maturation and its conversion to β-amyloid peptide. be able to. In particular, these pharmaceutical compositions are used to modulate the interaction of the hnRNPL or FEBP1 protein with the FE65 protein. More preferred are pharmaceutical compositions for treating neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. The composition (or compound) of the invention is used in particular to at least partially inhibit the interaction of the FE65 protein with the hnRNPL and / or FEBP1 protein.
【００４６】
本発明はＦＥ６５タンパク質の活性を調節するため又は神経変性病の型別のた
めの上記分子の使用にも関する。特に、本発明はＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの
活性を少なくとも部分的に調節するためのこれらの分子の使用に関する。The present invention also relates to the use of the above molecules for modulating the activity of FE65 protein or for typing of neurodegenerative diseases. In particular, the invention relates to the use of these molecules to at least partially modulate the activity of the PTB1 domain of FE65.
【００４７】
本発明はＦＥ６５タンパク質の機能に関して活性な分子のスクリーニング又は
特性決定方法として、配列番号７の配列又は配列番号９の配列又はそのフラグメ
ント（又は誘導体）と結合することが可能な分子を選択する方法にも関する。本
方法は、配列番号７の配列又は配列番号９の配列又はそのフラグメント（又は誘
導体）を含むポリペプチドと試験分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ接触させ、配列番号７
の配列（特に残基１〜３４９に含まれる領域）又は配列番号９の配列（特に残基
１〜３３７に含まれる領域）と結合することが可能な分子を選択すると有利であ
る。試験分子は種々のものとすることができる（ペプチド、核酸、脂質、糖等、
又はこれらの分子の混合物、例えば組合わせライブラリー等）。上述のように、
こうして同定された分子はＦＥ６５タンパク質の活性を調節するために使用する
ことができ、神経変性病の治療の潜在的治療剤となる。The present invention provides a method for screening or characterizing molecules active with respect to the function of the FE65 protein by selecting a molecule capable of binding to the sequence of SEQ ID NO: 7 or the sequence of SEQ ID NO: 9 or a fragment (or derivative) thereof. It also relates to how to do it. This method comprises contacting a polypeptide containing a sequence of SEQ ID NO: 7 or a sequence of SEQ ID NO: 9 or a fragment (or derivative) thereof with a test molecule in vitro, and
It is advantageous to select a molecule capable of binding to the sequence (in particular the region contained in residues 1 to 349) or the sequence of SEQ ID NO: 9 (in particular the region contained in residues 1 to 337). Test molecules can be of various types (peptides, nucleic acids, lipids, sugars, etc.
Or mixtures of these molecules, such as combinatorial libraries). As mentioned above,
The molecule thus identified can be used to modulate the activity of the FE65 protein and is a potential therapeutic agent for the treatment of neurodegenerative diseases.
【００４８】
本発明の他の利点は以下の実施例から理解されよう。これらの実施例は例示で
あり、発明を制限するものではない。Other advantages of the invention will be understood from the examples below. These examples are illustrative and not limiting of the invention.
【００４９】
使用した材料と方法
１）使用した酵母株：
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属Ｌ４０株（Ｍａｔａ，ｈｉｓ３Ｄ２００，ｔｒｐ
１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２，ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｏｐ）
４−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：（ｌｅｘＡｏｐ）８−ＬａｃＺ，ＧＡＬ４，ＧＡＬ
８０）を二重ハイブリッド系により脳融合ライブラリーのスクリーニングツール
として使用した。この株はタンパク質パートナーの一方をＬｅｘＡタンパク質に
融合するとタンパク質−タンパク質相互作用を検出することができる（Ｖｏｊｔ
ｅｋら，１９９３）。この株を以下の培地、即ち、
−酵母窒素ベース（無アミノ酸）（６．７ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）、
−グルコース（２０ｇ／ｌ）（Ｍｅｒｃｋ）
からなる最少ＮＹＢ培地で培養した。Materials and Methods Used 1) Yeast Strain Used: cerevisiae L40 strain (Mata, his3D200, trp
1-901, leu2-3,112, ade2, LYS2: :( lexAop)
4-HIS3, URA3: :( lexAop) 8-LacZ, GAL4, GAL
80) was used as a screening tool for the brain fusion library by the double hybrid system. This strain can detect protein-protein interactions by fusing one of its protein partners to the LexA protein (Vojt
ek et al., 1993). This strain was cultivated in a minimal NYB medium consisting of the following medium: yeast nitrogen base (no amino acids) (6.7 g / l) (Difco), glucose (20 g / l) (Merck).
【００５０】 この培地は寒天（Ｄｉｆｃｏ）２０ｇ／ｌを加えて固体にすることができる。[0050] The medium can be solidified by adding 20 g / l of agar (Difco).
【００５１】
この培地で栄養要求性酵母を増殖させるためには、酵母が依存するアミノ酸又
は窒素塩基５０ｍｇ／ｍｌを加える必要がある。細菌汚染を避けるためにアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを加える。In order to grow auxotrophic yeast in this medium, it is necessary to add 50 mg / ml of amino acid or nitrogen base on which the yeast depends. Add 100 μg / ml ampicillin to avoid bacterial contamination.
【００５２】
２）使用した細菌株：
遺伝子型ｓｕｐＥ，ｈｓｄΔ５，ｔｈｉ，Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），Ｆ’［
ｔｒａ Ｄ３６ Ａ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］の大腸菌ＴＧ１株をプ
ラスミド構築、増幅及びプラスミド単離に使用した。この株を以下の培地、即ち
−ＮａＣｌ（５ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ）、
−バクトトリプトン（１０ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）、
−酵母抽出物（５ｇ／ｌ）（Ｄｉｆｃｏ）
からなるＬＢ培地で培養した。2) Bacterial strain used: genotype supE, hsdΔ5, thi, Δ (lac-proAB), F ′ [
The E. coli strain TG1 of tra D36 A + B + lacI q lacZΔM15] was used for plasmid construction, amplification and plasmid isolation. Culture this strain in the following medium: LB medium consisting of-NaCl (5g / l) (Sigma),-Bactotryptone (10g / l) (Difco),-Yeast extract (5g / l) (Difco). did.
【００５３】 この培地は寒天（Ｄｉｆｃｏ）２０ｇ／ｌを加えて固体にすることができる。[0053] The medium can be solidified by adding 20 g / l of agar (Difco).
【００５４】
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを使用し、この抗生物質に耐性の遺伝子をマー
カーとしてもつプラスミドが組込まれた細菌を選択した。Ampicillin 100 μg / ml was used to select bacteria in which a plasmid having a gene resistant to this antibiotic as a marker was integrated.
【００５５】
３）使用したプラスミド：
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）から市販されているベクターｐＧＡＤ１０を使
用し、ＧＡＬ４のトランスアクチベータードメインと脳ライブラリーからのｃＤ
ＮＡによりコードされるタンパク質の融合タンパク質を酵母で発現させる。3) Plasmids used: The vector pGAD10, commercially available from Clontech®, was used, and the transactivator domain of GAL4 and cD from the brain library.
A fusion protein of the protein encoded by NA is expressed in yeast.
【００５６】
ベクターｐＬｅｘ９（ｐＢＴＭ１１６）（Ｂａｒｔｅｌら，１９９３）を使用
し、タンパク質ＬｅｘＡとの融合タンパク質を酵母で発現させる。The vector pLex9 (pBTM116) (Bartel et al., 1993) is used to express a fusion protein with the protein LexA in yeast.
【００５７】
ベクターｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を使用し、ＧＡＬ
４のトランスアクチベータードメインとの融合タンパク質を酵母で発現させる。Using the vector pGAD424 (Clontech®), GAL
A fusion protein with the transactivator domain of 4 is expressed in yeast.
【００５８】
ｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１はＦＥ６５タンパク質のＰＴＢ１ドメイン（アミ
ノ酸３９５〜５４３）をコードする配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９である。こ
のプラスミドを使用してＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインのタンパク質パートナーを
スクリーニングした。PLex-FE65PTB1 is a plasmid pLex9 containing a sequence encoding the PTB1 domain of the FE65 protein (amino acids 395-543). This plasmid was used to screen for protein partners in the PTB1 domain of FE65.
【００５９】
ｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ２はＡＰＰ（βアミロイドペプチドの前駆体）の細
胞質領域と相互作用するとして知られるＦＥ６５タンパク質のＰＴＢ２ドメイン
（アミノ酸５６５〜６９８）をコードする配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９であ
る。このプラスミドを使用してｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６
５のＰＴＢドメインの相互作用の特異性を試験した。PLex-FE65PTB2 is a plasmid pLex9 containing a sequence encoding the PTB2 domain (amino acids 565-698) of the FE65 protein, which is known to interact with the cytoplasmic region of APP (a precursor of β-amyloid peptide). Using this plasmid, hnRNPL and FEBP1 proteins and FE6
The specificity of the interaction of the 5 PTB domains was tested.
【００６０】
ｐＬｅｘ−ＨａＲａｓＶａｌ１２は哺乳動物のＲａｆタンパク質と相互作用す
るとして知られるＶａｌ１２位に突然変異をもつＨａＲａｓタンパク質をコード
する配列を含むプラスミドｐＬｅｘ９である（Ｖｏｊｔｅｋら，１９９３）。こ
のプラスミドを使用してｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５の相
互作用の特異性を試験した。PLex-HaRasVal12 is a plasmid pLex9 containing sequences encoding the HaRas protein with a mutation at position Val12 known to interact with mammalian Raf proteins (Vojtek et al., 1993). This plasmid was used to test the specificity of the interaction of FE65 with the hnRNPL and FEBP1 proteins.
【００６１】
ｐＧＡＤ−ＲａｆはＲａｆタンパク質をコードする配列を含むプラスミドｐＧ
ＡＤ４２４である（Ｖｏｊｔｅｋら，１９９３）。このプラスミドを使用してｈ
ｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５の相互作用の特異性を試験した
。PGAD-Raf is a plasmid pG containing a sequence encoding the Raf protein.
AD424 (Vojtek et al., 1993). Using this plasmid
The specificity of the interaction of FE65 with nRNPL and FEBP1 proteins was tested.
【００６２】
ｐＧＡＤ−ＡｐｐはＦＥ６５のＰＴＢ２ドメインと相互作用するとして知られ
るＡＰＰタンパク質の細胞質ドメインをコードする配列を含むプラスミドｐＧＡ
Ｄ１０である（Ｍｅｒｃｋｅｎら，１９９８）。このプラスミドを使用してｈｎ
ＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク質とＦＥ６５の相互作用の特異性を試験した。PGAD-App is a plasmid pGA containing sequences encoding the cytoplasmic domain of the APP protein known to interact with the PTB2 domain of FE65.
D10 (Mercken et al., 1998). Hn using this plasmid
The specificity of FE65 interaction with the RNPL and FEBP1 proteins was tested.
【００６３】
４）使用した合成オリゴヌクレオチド：
オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ ＡＢＩ３９４−０８装
置で合成する。アンモニアで合成担体から分離し、ｎ−ブタノール１０倍容量で
２回沈殿させた後、水に取る。光学密度の測定により定量する。4) Synthetic Oligonucleotides Used: Oligonucleotides are synthesized on an Applied System ABI 394-08 instrument. It is separated from the synthetic carrier with ammonia, precipitated twice with 10 volumes of n-butanol and then taken up in water. Quantify by measuring optical density.
【００６４】 配列番号３：ＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣＧＧＡＡＴＡＣＣＡＡＣ 配列番号４：ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＣＧＴＴＣＧＧＣ。SEQ ID NO: 3: CTT CCCGGG TCCCCCACGGAATACCAAC SEQ ID NO: 4: GGG GTCGAC GGCATTACCGCCGTTCCGC.
【００６５】
これらのオリゴヌクレオチドを使用し、末端にＸｍａＩ及びＳａｌＩ部位（下
線）を導入したＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインに対応するＰＣＲフラグメント（配
列番号１の配列に示す）を得た。Using these oligonucleotides, a PCR fragment (shown in the sequence of SEQ ID NO: 1) corresponding to the PTB1 domain of FE65 having XmaI and SalI sites (underlined) introduced at the ends was obtained.
【００６６】 配列番号５：ＣＣＡＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ。[0066] SEQ ID NO: 5: CCACTACAATGGATGATG.
【００６７】
このオリゴヌクレオチド（ＧＡＬ４ＴＡ）を使用して脳ｃＤＮＡ二重ハイブリ
ッドライブラリーのプラスミドに含まれるインサートを配列決定した。This oligonucleotide (GAL4TA) was used to sequence the insert contained in the plasmid of the brain cDNA double hybrid library.
【００６８】
５）プラスミドＤＮＡの作製
ＤＮＡ精製キット：
−Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、ｒｅｆ：２７１０６
、
−Ｑｕｉａｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット、ｒｅｆ：１２
１６３
の製造業者であるＱｕｉａｇｅｎにより推奨されているプロトコールに従ってプ
ラスミドＤＮＡの少量及び大量生産を行った。5) Preparation of plasmid DNA DNA Purification Kit: -Quiaprep Spin Miniprep Kit, ref: 27106
-Quiaprep Plasmid Maxiprep Kit, ref: 12
Small and large scale production of plasmid DNA was performed according to the protocol recommended by 163 manufacturer Quiagen.
【００６９】
６）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＤＮＡの酵素増幅
ＤＮＡ鋳型、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ８．５，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％ゼラチ
ン）、オリゴヌクレオチド各０．５μｇ及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）２．５ＩＵの存在下でホルムアミド（５％
）を加えるか又は加えずに終容量５０μｌでＰＣＲ反応を行う。混合物をパラフ
ィン油２滴で覆い、試料の蒸発を抑える。使用した装置はＡｐｐｌｉｇｅｎｅの
「Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ ＩＩ」である。6) Enzymatic Amplification of DNA by PCR (Polymerase Chain Reaction) DNA template, dNTP (0.2 mM), PCR buffer (10 mM Tris-
HCl, pH 8.5, 1 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 0.01% gelatin), 0.5 μg each of oligonucleotides and 2.5 IU of Ampli Taq DNA polymerase (Perkin Elmer) formamide (5%).
PCR reaction is performed in a final volume of 50 μl with or without addition of). Cover the mixture with 2 drops of paraffin oil to prevent evaporation of the sample. The device used is an Appligene "Crocodile II".
【００７０】
鋳型変性温度９０℃、ハイブリダイゼーション温度５０℃及び酵素伸長温度７
２℃を使用した。Template denaturation temperature 90 ° C., hybridization temperature 50 ° C. and enzyme extension temperature 7
2 ° C was used.
【００７１】
７）ライゲーション
全ライゲーション反応はベクター１００〜２００ｎｇ、インサート０．５〜２
μｇ、酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）４０ＩＵ及びライゲーショ
ン緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，
１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ）の存在下に終容量１０μｌで一晩＋１４℃
で実施する。7) Ligation All ligation reactions were 100-200 ng of vector, 0.5-2 inserts.
μg, enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) 40 IU and ligation buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl 2 ,
10 mM final volume in the presence of 10 mM DTT, 1 mM ATP) overnight + 14 ° C
To implement.
【００７２】
８）細菌形質転換：
プラスミドによる細菌の形質転換は以下のプロトコールに従って実施する。総
ライゲーション容量（１０μｌ）を使用し、Ｃｈｕｎｇら（１９８８）の方法に
よりコンピテントにした細菌ＴＧ１を形質転換する。8) Bacterial transformation: Transformation of bacteria with a plasmid is performed according to the following protocol. The total ligation volume (10 μl) is used to transform competent bacterial TG1 by the method of Chung et al. (1988).
【００７３】
９）ＤＮＡの分離と抽出：
ＤＮＡフラグメントの分離と抽出はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従って
実施する。9) Separation and extraction of DNA: Separation and extraction of DNA fragments is performed according to Sambrook et al. (1989).
【００７４】
１０）プラスミドＤＮＡの蛍光シーケンシング
使用したシーケンシング法はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開
発され、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）の方法を蛍光シーケンシングに合うように
改変した方法である。使用したプロトコールはシステム設計者（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）により記載されているものである。10) Fluorescent Sequencing of Plasmid DNA The sequencing method used was developed by Applied Biosystems and is a modification of the method of Sanger et al. (1977) adapted to fluorescent sequencing. The protocol used is the system designer (Perkin
Elmer).
【００７５】
１１）脳ライブラリーのプラスミド作製
この作製は製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））の指示に従って行った
。11) Plasmid preparation of brain library This preparation was performed according to the manufacturer's instructions (Clontech®).
【００７６】
１２）プラスミドによる酵母の形質転換
Ｇｉｅｔｚら（１９９５）により記載されている方法に従ってＬｉＡＣ／ＰＥ
Ｇ処理により酵母をコンピテントにする。12) Transformation of yeast with plasmids LiAC / PE according to the method described by Gietz et al. (1995).
G treatment makes yeast yeast competent.
【００７７】
脳ｃＤＮＡライブラリーにより酵母を形質転換する特定例では、プラスミドｐ
Ｌｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１を含む酵母を最少培地ＹＮＢ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄ
ｅ＋Ｌｅｕで培養した培養液２５０ｍｌ（細胞１０７個／ｍｌ）を使用する。上
記プロトコールに従ってコンピテントにした酵母を脳ライブラリーのｃＤＮＡ３
０μｇで形質転換する。形質転換段階後に酵母を２８℃でＹＮＢ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙ
ｓ＋Ａｄｅ＋Ｌｅｕ２５０ｍｌ中で１６時間再培養した後、遠心分離により回収
し、ＹＮＢ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ培地にプレーティングし、３日間２８℃で培養する
。形質転換効率と増幅率の測定はＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）のプロトコール
に従って実施した。In a specific example of transforming yeast with a brain cDNA library, plasmid p
The yeast containing Lex-FE65PTB1 was used as a minimal medium YNB + His + Lys + Ad.
Use 250 ml of culture medium cultured in e + Leu (10 7 cells / ml). Yeasts made competent according to the above protocol were cloned into cDNA3 of the brain library.
Transform with 0 μg. After the transformation step, the yeast was incubated at 28 ° C. with YNB + His + Ly.
After culturing for 16 hours in 250 ml of s + Ade + Leu, they are recovered by centrifugation, plated on YNB + Lys + Ade medium, and cultured at 28 ° C. for 3 days. The transformation efficiency and the amplification rate were measured according to the Clontech (registered trademark) protocol.
【００７８】
１３）酵母ＤＮＡ（ゲノム及びプラスミド）の抽出
３０℃で１６時間培養した酵母培養液３ｍｌを遠心分離し、溶解用緩衝液（１
Ｍソルビトール，０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４，１２．
５ｍｇ／ｍｌサイモリアーゼ）２００μｌにとり、３７℃で１時間培養する。次
に、ＤＮＡ精製キットＱｕｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、
ｒｅｆ：２７１０６の製造業者であるＱｕｉａｇｅｎにより推奨されているプロ
トコールに従って溶解液を処理する。13) Extraction of yeast DNA (genome and plasmid) 3 ml of the yeast culture cultivated at 30 ° C. for 16 hours was centrifuged and the lysis buffer (1
M sorbitol, 0.1M KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4, pH7.4,12.
5 mg / ml simolyase) (200 μl) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Next, DNA purification kit Quiaprep Spin Miniprep kit,
The lysate is processed according to the protocol recommended by the manufacturer, Qiagen, ref: 27106.
【００７９】
１４）β−ガラクトシダーゼの活性試験
各酵母クローンを含むペトリ皿にまずニトロセルロースシートを載せる。この
シートを次に液体窒素に３０秒間浸して酵母を破砕し、こうしてβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を放出させる。解凍後、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）（４０ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド）１５μｌを加えたＰＢＳ溶液（６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，４０ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，ｐＨ７）１．５ｍ
ｌに予め浸したＷｈａｔｍａｎ紙を入れた別のペトリ皿にコロニーを上にしてニ
トロセルロースシートを載せる。次に、ペトリ皿を３７℃のオーブンに入れる。
コロニーが６時間後に膜上で青色に変色した場合に試験は陽性であると言う。14) β-Galactosidase Activity Test First, a nitrocellulose sheet is placed on a Petri dish containing each yeast clone. The sheet is then immersed in liquid nitrogen for 30 seconds to disrupt the yeast and thus release β-galactosidase activity. After thawing, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-
Indolyl-β-D-galactoside) (40 mg / ml N, N-dimethylformamide) in PBS solution (60 mM Na 2 HPO 4 , 40 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , pH 7) 1.5 m
Place the nitrocellulose sheet, colony up, in another Petri dish containing Whatman paper presoaked in 1. The Petri dish is then placed in a 37 ° C oven.
The test is said to be positive if the colonies turn blue on the membrane after 6 hours.
【００８０】
実施例１：ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインとＬｅｘＡタンパク質の融合タンパク
質の発現ベクターの構築
二重ハイブリッド系を使用してライブラリーをスクリーニングするには、ＦＥ
６５のＰＴＢ１ドメイン（ＦＥ６５ＰＴＢ１）をＬｅｘＡタンパク質に融合する
必要がある。この融合タンパク質は、ＬｅｘＡタンパク質に対応する配列と同一
のオープンリーディングフレームにＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインをコードする配
列（配列番号１〜２）を導入したベクターｐＬｅｘ９により発現される。Example 1: Construction of expression vector for fusion protein of PTB1 domain of FE65 and LexA protein To screen library using double hybrid system, FE
The PTB1 domain of 65 (FE65PTB1) needs to be fused to the LexA protein. This fusion protein is expressed by the vector pLex9 in which the sequence encoding the PTB1 domain of FE65 (SEQ ID NOS: 1 to 2) was introduced in the same open reading frame as the sequence corresponding to the LexA protein.
【００８１】
配列番号３及び配列番号４のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによりヒト
ＦＥ６５タンパク質のアミノ酸３９５〜５４３に対応する４４８ｂｐのＤＮＡフ
ラグメント（配列番号２）を得ると共に、配列の末端にＸｍａＩ及びＳａｌＩ部
位を導入した。ＬｅｘＡに対応する配列の下流でプラスミドｐｌｅｘ９の多重ク
ローニング部位のＸｍａＩ及びＳａｌＩ部位間にこのＰＣＲフラグメントを導入
し、ベクターｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１を得た。PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 to obtain a 448 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 2) corresponding to amino acids 395 to 543 of the human FE65 protein, and XmaI and SalI at the ends of the sequences. The site was introduced. This PCR fragment was introduced downstream of the sequence corresponding to LexA between the XmaI and SalI sites of the multiple cloning site of plasmid plex9, resulting in vector pLex-FE65PTB1.
【００８２】
構築物をＤＮＡシーケンシングにより確認した。この確認の結果、このフラグ
メントはＰＣＲ反応中に突然変異が発生しておらず、ＬｅｘＡに対応するフラグ
メントと同一のオープンリーディングフレームに融合していることが判明した。The construct was confirmed by DNA sequencing. As a result of this confirmation, it was revealed that this fragment was not mutated during the PCR reaction and fused to the same open reading frame as the fragment corresponding to LexA.
【００８３】
実施例２：脳ｃＤＮＡ融合ライブラリーの二重ハイブリッド法によるスクリー
ニング
二重ハイブリッド法（ＦｉｅｌｄｓとＳｏｎｇ，１９８９）を使用した。融合
ライブラリーをスクリーニングし、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用する
ことが可能なＧＡＬ４のトランスアクチベータードメインに融合したタンパク質
を生産するクローンを同定することができた。この相互作用により、Ｌ４０株で
リポーター遺伝子Ｈｉｓ３及びＬａｃＺの発現を誘導することが可能なトランス
アクチベーターを再構成することができる。このスクリーニングを行うために、
ヒト脳ｃＤＮＡから作製した融合ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）
）を選択した。Example 2 Screening of Brain cDNA Fusion Library by Double Hybrid Method The double hybrid method (Fields and Song, 1989) was used. The fusion library could be screened to identify clones producing a protein fused to the transactivator domain of GAL4 capable of interacting with the PTB1 domain of FE65. By this interaction, it is possible to reconstitute a transactivator capable of inducing the expression of the reporter genes His3 and LacZ in the L40 strain. To do this screening,
Fusion library made from human brain cDNA (Clontech®)
) Was selected.
【００８４】
スクリーニング中は、融合ライブラリーの各独立プラスミドがプラスミドｐＬ
ｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１と同時に少なくとも１個の酵母に存在するように保つこ
とが必要である。このように保つためには、酵母の形質転換効率を上げることが
重要である。このために、ＤＮＡ１μｇ当たり形質転換細胞１０５個の効率を与
える酵母形質転換プロトコールを選択した。更に、２種の異なるプラスミドによ
る酵母の同時形質転換はこの効率を下げるので、プラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５
ＰＴＢ１により予め形質転換した酵母を使用した。表現型Ｈｉｓ−，Ｌｙｓ−，
Ａｄｅ−，Ｌｅｕ−のこのＬ４０−Ｆｅ６５ＰＴＢ１株を融合ライブラリーのプ
ラスミドＤＮＡ３０μｇで形質転換した。このＤＮＡ量から推定後に２．８×１
０６個の形質転換細胞が得られ、これはライブラリーを構成する独立プラスミド
数よりもやや大きい数に対応する。この結果、ライブラリーのプラスミドのほぼ
全体が酵母の形質転換に使用されたと考えられる。機能的ＧＡＬ４トランスアク
チベーターを再構成することが可能な形質転換細胞をＹＮＢ＋Ｌｙｓ＋Ａｄｅ培
地で選択した。During screening, each independent plasmid in the fusion library was cloned into plasmid pL.
It is necessary to keep present in at least one yeast at the same time as ex-FE65PTB1. In order to maintain this, it is important to increase the transformation efficiency of yeast. To this end, a yeast transformation protocol was selected that gave an efficiency of 10 5 transformed cells per μg of DNA. Furthermore, co-transformation of yeast with two different plasmids reduces this efficiency, so the plasmid pLex-FE65
Yeast pre-transformed with PTB1 was used. Phenotype His-, Lys-,
This L40-Fe65PTB1 strain of Ade- and Leu- was transformed with 30 µg of the plasmid DNA of the fusion library. 2.8 × 1 after estimating from this DNA amount
0 6 transformed cells were obtained, which corresponds to a number slightly higher than the number of independent plasmids that make up the library. As a result, it is considered that almost all of the plasmids in the library were used for transformation of yeast. Transformants capable of reconstituting a functional GAL4 transactivator were selected on YNB + Lys + Ade medium.
【００８５】
この選択後に表現型Ｈｉｓ＋のクローン９７個が得られた。これらの形質転換
体でβ−ガラクトシダーゼ活性試験を実施し、他方のリポーター遺伝子ＬａｃＺ
を発現するクローン数を調べた。得られた９７個のクローンのうち、２７個がＨ
ｉｓ＋，βＧａｌ＋二重表現型であり、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用
することが可能なタンパク質を発現することが判明した。After this selection, 97 phenotypic His + clones were obtained. The β-galactosidase activity test was carried out on these transformants, and the other reporter gene LacZ
The number of clones expressing G. Of the 97 clones obtained, 27 were H
It has been found to express a protein that is is +, βGal + double phenotype and is capable of interacting with the PTB1 domain of FE65.
【００８６】
実施例３：選択した酵母クローンからの脳ライブラリープラスミドの単離
ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用することが可能なタンパク質を同定す
るために、二重ハイブリッドスクリーニング時に選択した酵母に含まれる融合ラ
イブラリーのプラスミドを抽出した。プラスミドが大量に得られるようにするた
めには、単離の前に陽性酵母株のＤＮＡ抽出物で大腸菌を予め形質転換する必要
がある。この抽出物に含まれるライブラリーのプラスミドは酵母／大腸菌シャト
ルプラスミドであるので、細菌で容易に複製することができる。Example 3 Isolation of Brain Library Plasmids from Selected Yeast Clones Included in the yeast selected during the double hybrid screen to identify proteins capable of interacting with the PTB1 domain of FE65. The fusion library plasmid was extracted. In order to obtain large quantities of plasmid, it is necessary to transform E. coli with a DNA extract of a positive yeast strain prior to isolation. Since the library plasmid contained in this extract is a yeast / E. Coli shuttle plasmid, it can be easily replicated in bacteria.
【００８７】
酵母ＤＮＡ抽出物による形質転換後に得られた細菌コロニーのプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素消化とアガロースゲルでのＤＮＡフラグメントの分離により分析し
た。２３個のクローンを分析した処、６種の異なる制限プロフィルが得られ、そ
のうちの２種は高度に発現された。これらの結果から明らかなように、このスク
リーニング中に少なくとも６種の異なるプラスミドが単離され、本発明者らは最
高発現レベルの２種のプラスミド（８及び４倍）に含まれるｃＤＮＡライブラリ
ーに由来するＤＮＡフラグメントに特に注目した。Plasmid DN of bacterial colonies obtained after transformation with yeast DNA extract
A was analyzed by restriction enzyme digestion and separation of DNA fragments on an agarose gel. Analysis of 23 clones yielded 6 different restriction profiles, 2 of which were highly expressed. As is evident from these results, at least 6 different plasmids were isolated during this screening and we found that the cDNA libraries contained in the highest expression level of the two plasmids (8 and 4 fold). Particular attention was paid to the DNA fragments derived.
【００８８】
実施例４：同定されたプラスミドのインサートの配列決定
脳ｃＤＮＡライブラリーの挿入部位近傍でＥｃｏＲＩ部位から５２ｂｐのＧＡ
Ｌ４ＴＡ領域に相補的なＧＡＬ４ＴＡオリゴヌクレオチド（配列番号５）を使用
して、最高発現レベルの２種のプラスミドの配列決定を行った。Example 4: Sequencing of the identified plasmid inserts 52 bp GA from the EcoRI site near the insertion site of the brain cDNA library.
The GAL4TA oligonucleotide (SEQ ID NO: 5) complementary to the L4TA region was used to sequence the two plasmids with the highest expression levels.
【００８９】
選択した第１のプラスミドの配列をデータバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）に含まれ
る配列と比較した処、この第１のプラスミドに存在するｃＤＮＡ配列は受託番号
ＮＰ＿００１５２４／ｇ４５５７６４５のｈｎＲＮＰＬタンパク質をコードする
ヒト遺伝子とヌクレオチドレベルで９９％を越える一致度を示すことが判明した
。二重ハイブリッド系によりクローニングしたこの遺伝子の配列はｈｎＲＮＰＬ
タンパク質の１１６番目のアミノ酸に対応するヌクレオチド３４６から開始し、
最後の５８アミノ酸に位置する４６４番目のアミノ酸に対応するヌクレオチド１
３９２で終結している（配列番号６及び７）。この結果から明らかなように、ｈ
ｎＲＮＰＬとヒトＦＥ６５タンパク質の相互作用ドメインはｈｎＲＮＰＬの中心
領域に含まれる。この領域はＰＴＢドメインの結合コンセンサス部位であるとし
て知られるＮＰＸＹ型の配列を含む（Ｂｏｒｇら，１９９６）。クローニングし
たｈｎＲＮＰＬ配列（配列番号６及び７）は、７４８位のグアニンがチミジンに
置換し、その結果、完全ｈｎＲＮＰＬタンパク質のヌクレオチド１０９３とアミ
ノ酸３６５に対応する配列番号６の配列の２５０番目のアミノ酸のレベルでグリ
シンがシステインに置換している点が公開配列（Ｐｉｎｏｌ−Ｒｏｍａら，１９
８９）と異なる。The sequences of the selected first plasmid are shown in the data banks GENBank and EMBL.
When compared with the sequence contained in (European Molecular Biology Lab), the cDNA sequence present in this first plasmid showed a degree of identity of more than 99% at the nucleotide level with the human gene encoding the hnRNPL protein with accession number NP_001524 / g4557645. Turned out to show. The sequence of this gene cloned by the double hybrid system is hnRNPL
Starting at nucleotide 346, which corresponds to amino acid 116 of the protein,
Nucleotide 1 corresponding to the 464th amino acid located at the last 58 amino acids
It ends at 392 (SEQ ID NOS: 6 and 7). As is clear from this result, h
The interaction domain of nRNPL and human FE65 protein is contained in the central region of hnRNPL. This region contains NPXY-type sequences known to be the binding consensus site for the PTB domain (Borg et al., 1996). The cloned hnRNPL sequence (SEQ ID NOS: 6 and 7) has guanine at position 748 replaced by thymidine, resulting in the level of the 250th amino acid of the sequence of SEQ ID NO: 6 corresponding to nucleotides 1093 and amino acid 365 of the complete hnRNPL protein. In the published sequence (Pinol-Roma et al., 19
89).
【００９０】
選択した第２のプラスミドの配列をデータバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）に含まれ
る配列と比較した処、このプラスミドに含まれるｃＤＮＡ配列はこれらのデータ
バンクに含まれる配列と有意相同を示さないことが判明した。The sequences of the second plasmid of choice are shown in the databanks GENBank and EMBL.
When compared with the sequences contained in (European Molecular Biology Lab), it was found that the cDNA sequences contained in this plasmid do not show significant homology to the sequences contained in these databanks.
【００９１】
特許出願ＷＯ９９／２６９６１の配列番号４の配列のタンパク質とは有意相同
が認められた。しかし、本願の主題である配列番号９の配列のタンパク質は特許
出願ＷＯ９９／２６９６１の配列番号４の配列のタンパク質と異なる。特に、配
列番号９の配列のタンパク質のほうが４２アミノ酸短い。配列の他の部分では多
少の相同が存在するが、顕著な相違もある。特に、１、４８、６１、３０５位ア
ミノ酸は特許出願ＷＯ９９／２６９６１の配列番号４の配列のタンパク質の所定
相同を示す部分で対応位置のアミノ酸と異なる。Significant homology was observed with the protein of sequence SEQ ID NO: 4 of patent application WO 99/26961. However, the protein of sequence SEQ ID NO: 9 which is the subject of the present application differs from the protein of sequence SEQ ID NO: 4 of patent application WO 99/26961. In particular, the protein of sequence SEQ ID NO: 9 is 42 amino acids shorter. There is some homology in other parts of the sequence, but there are also significant differences. In particular, amino acids 1, 48, 61 and 305 differ from the amino acid at the corresponding position in the portion showing the predetermined homology of the protein of the sequence of SEQ ID NO: 4 of patent application WO99 / 26961.
【００９２】
この１２７５ヌクレオチドの配列（配列番号８〜９）は１０１２位に終結コド
ンをもち、３３７アミノ酸のペプチドをコードする。この配列に対応するタンパ
ク質をＦＥ６５ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＰＴＢ１（ＦＥ６５結合ＰＴＢ１）ドメイン
タンパク質の意でＦＥＢＰ１と命名した。This 1275 nucleotide sequence (SEQ ID NOs: 8-9) has a stop codon at position 1012 and encodes a 337 amino acid peptide. The protein corresponding to this sequence was named FEBP1 for FE 65 B binding P TB 1 (FE65 binding PTB1) domain protein.
【００９３】
実施例５：ＦＥ６５のＰＴＢドメインとｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１タンパク
質の相互作用特異性の分析
ヒトＦＥ６５タンパク質のＰＴＢ１及びＰＴＢ２ドメインとｈｎＲＮＰＬ及び
ＦＥＢＰ１タンパク質の相互作用の特異性を調べるために、プラスミドｐＬｅｘ
−ＦＥ６５ＰＴＢ１の代わりにＬｅｘＡタンパク質に融合したＦＥ６５のＰＴＢ
２ドメインをコードするプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ２を使用して二重
ハイブリッド法により相互作用試験を行った。ＰＴＢ２ドメインとこれらの２種
のタンパク質が相互作用しないならば、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインと相互作用
特異性があると考えられる。Example 5: Analysis of interaction specificity of PTB domain of FE65 and hnRNPL and FEBP1 protein To examine the specificity of interaction of hnRNPL and FEBP1 protein with PTB1 and PTB2 domains of human FE65 protein, plasmid pLex was analyzed.
-PTB of FE65 fused to LexA protein instead of FE65PTB1
The interaction test was performed by the double hybrid method using the plasmid pLex-FE65PTB2 encoding two domains. If the PTB2 domain does not interact with these two proteins, it is considered to have interaction specificity with the PTB1 domain of FE65.
【００９４】
この試験を実施するために、脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング中に単
離したプラスミドとプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ２によりＬ４０株を形
質転換した。表１に示すように種々のプラスミドでこの株を形質転換することに
より相互作用特異性比較試験も実施した。種々のプラスミドで形質転換した細胞
でβＧａｌ活性試験を実施し、タンパク質−タンパク質相互作用を検出した。二
重ハイブリッド系で試験したプラスミド組合せ、従って、相互作用の全体を表１
に示す。プラスミド組合せと対応ベクター種（ｐＬｅｘ又はｐＧＡＤ）を「プラ
スミド組合せ」の欄に示す。「相互作用」の欄の＋と−の符号はβＧａｌ試験の
結果に対応し、夫々タンパク質−タンパク質相互作用が検出されたか否かを示す
。To carry out this test, the L40 strain was transformed with the plasmid isolated during the screening of the brain cDNA library and the plasmid pLex-FE65PTB2. An interaction specificity comparison test was also performed by transforming this strain with various plasmids as shown in Table 1. A βGal activity test was performed on cells transformed with various plasmids to detect protein-protein interactions. The plasmid combinations tested in the double-hybrid system, and thus the overall interactions, are shown in Table 1.
Shown in. The plasmid combination and the corresponding vector species (pLex or pGAD) are shown in the "Plasmid combination" column. The + and-signs in the "Interaction" column correspond to the results of the βGal test, and indicate whether or not a protein-protein interaction was detected, respectively.
【００９５】
試験結果（表１参照）によると、脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した２種の
プラスミドとプラスミドｐＬｅｘ−ＦＥ６５ＰＴＢ１で形質転換した酵母のみが
βＧａｌ＋活性を示し、従って、ＦＥ６５の２種のＰＴＢドメインのうちでＰＴ
Ｂ１ドメインのみがｈｎＲＮＰＬの中心部分又はＦＥＢＰ１タンパク質のフラグ
メントと相互作用することが判明した。ＨａＲａｓＶａｌ１２タンパク質又はＡ
ＰＰのＣ末端ドメインとは二重ハイブリッド法により相互作用を検出できなかっ
たので、ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインはｈｎＲＮＰＬ及びＦＥＢＰ１と特異的に
相互作用すると思われる。According to the test results (see Table 1), only the two plasmids isolated from the brain cDNA library and the yeast transformed with the plasmid pLex-FE65PTB1 showed βGal + activity and thus the two PTBs of FE65. PT out of the domain
Only the B1 domain was found to interact with the central part of hnRNPL or a fragment of the FEBP1 protein. HaRasVal12 protein or A
The PTB1 domain of FE65 appears to interact specifically with hnRNPL and FEBP1, as no interaction could be detected with the C-terminal domain of PP by the double hybrid method.
【００９６】[0096]
【表１】 [Table 1]
【００９７】[0097]
【表２】 [Table 2]
【配列表】 [Sequence list]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 25/28 16/18 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 7/04 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フルニエ，アラン フランス国、エフ−92290・シヤトネー・ マラブリ、アブニユ・ロジエ・サレング ロ・28 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA06 DA12 EA04 GA11 HA08 4B064 AF01 AF27 AG01 AG26 CA02 CA06 CA10 CA19 CA20 DA01 DA13 4B065 AA01X AA72X AA93Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA21 BA22 CA18 NA14 ZA162 4C085 AA13 AA14 BB11 BB41 BB43 CC03 CC22 CC23 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA16 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA16 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 BA53 BA54 BA55 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61K 39/395 A61P 25/28 4C085 48/00 C07K 14/47 4C086 A61P 25/28 16/18 4C087 C07K 14 / 47 C12N 7/04 4H045 16/18 C12P 21/02 C C12N 7/04 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02 (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE, TR), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, L) , MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU , AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN , MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Fournier, Alain F-92290, France Yatonay Malaburi, Abunyu Roger Sarengro 28 F-term (reference) 2G045 AA40 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA06 DA12 EA04 GA11 HA08 4B064 AF01 AF27 AG01 AG26 CA02 CA06 CA10 CA19 CA20 DA01 DA13 4B065 AA01A44A02A02XAA72X AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA21 BA22 CA18 NA14 ZA162 4C085 AA13 AA14 BB11 BB41 BB43 CC03 CC22 CC23 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA16 4C087 AA01 AA02 BC83 CA20 NA40 ZA16 4H045 A75 BA73 FA40 BA20 FA83 BA20 AA BABA11
Claims (26)
ログとＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に調節するこ
とが可能な化合物。1. A compound capable of at least partially modulating the interaction between the hnRNPL and / or FEBP1 protein or a homolog thereof and the PTB1 domain of FE65.
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。2. A compound according to claim 1, characterized in that it at least partially suppresses, inhibits or stimulates said interaction.
ログとＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用ドメインに結合できることを特徴
とする請求項１又は２に記載の化合物。3. The compound according to claim 1 or 2, which is capable of binding to the interaction domain of the PTB1 domain of FE65 with hnRNPL and / or FEBP1 protein or a homologue thereof.
徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。4. The compound according to any one of claims 1 to 3, which is a peptide, nucleic acid, lipid, sugar or antibody type compound.
び／又はその誘導体のペプチド配列の一部を含むペプチド化合物であることを特
徴とする請求項４に記載の化合物。5. The compound according to claim 4, which is a peptide compound containing a part of the peptide sequence of the hnRNPL protein and / or the FEBP1 protein and / or a derivative thereof.
する請求項５に記載の化合物。6. The compound according to claim 5, comprising a part of the sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9.
ＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用部位の全部又は機能的部分に対応する配
列をもつ領域を含むペプチド化合物であることを特徴とする請求項４に記載の化
合物。7. The peptide compound comprising a region having a sequence corresponding to all or a functional portion of the interaction site of the hnRNPL protein and / or FEBP1 protein and the PTB1 domain of FE65. Compound of.
パク質又はＦＥＢＰ１タンパク質（及び／又はホモログ形）から誘導されるペプ
チド化合物であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。8. The compound according to claim 4, which is a peptide compound derived from the hnRNPL protein or FEBP1 protein (and / or homologous form) having a non-functionalized effector region.
つポリペプチド。9. A polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 9 or a derivative or fragment thereof.
列から誘導されるポリペプチド。10. A polypeptide derived from the sequence SEQ ID NO: 7 with a non-functionalized effector region.
をコードする核酸。11. A nucleic acid encoding the peptide compound according to any one of claims 4 to 10.
の全部又は一部を含むことを特徴とする請求項１１に記載の核酸。12. The nucleic acid according to claim 11, comprising all or part of the sequence of SEQ ID NO: 6 or 8 or a sequence derived from said sequence.
相補鎖とハイブリダイズすることが可能な核酸。14. A nucleic acid capable of hybridizing with the nucleic acid according to any one of claims 11 to 13 or a complementary strand thereof.
クター。15. A vector comprising the nucleic acid according to any one of claims 11 to 14.
換え欠損ウイルス。16. A recombinant defective virus comprising the nucleic acid according to any one of claims 11 to 14.
に対する抗体であることを特徴とする抗体又は抗体フラグメントもしくは誘導体
。17. An antibody or antibody fragment or derivative, which is an antibody against the peptide compound according to any one of claims 4 to 10.
モログとＦＥ６５のＰＴＢ１ドメインの相互作用を少なくとも部分的に調節する
ことが可能な非ペプチド化合物又は非排他的ペプチド種化合物。18. A non-peptidic compound or non-exclusive peptidic compound capable of at least partially modulating the interaction of the hnRNPL and / or FEBP1 protein or homologue thereof with the PTB1 domain of FE65.
チーフを非ペプチド又は非排他的ペプチド種構造と組合せたことを特徴とする請
求項１８に記載の化合物。19. A compound according to claim 18, characterized in that the active motif of the peptide according to any one of claims 5 to 8 is combined with a non-peptide or non-exclusive peptide species structure.
少なくとも１種の化合物又は請求項１７に記載の抗体を含む医薬組成物。20. A pharmaceutical composition comprising at least one compound according to any one of claims 1 to 10, 18 and 19 or an antibody according to claim 17.
種の核酸又は請求項１５もしくは１６に記載のベクターを含む医薬組成物。21. At least one according to claim 11.
A pharmaceutical composition comprising a nucleic acid of a species or the vector of claim 15 or 16.
を含む医薬組成物。22. A pharmaceutical composition comprising the peptide compound according to any one of claims 4 to 10.
ク質の相互作用を少なくとも部分的に調節するための請求項２０から２２のいず
れか一項に記載の組成物。23. A composition according to any one of claims 20 to 22 for at least partially modulating the interaction of the FE65 protein with the hnRNPL or FEBP1 protein.
一項に記載の組成物。24. The composition according to any one of claims 20 to 22, which is used for treating a neurodegenerative disease.
ントと結合することが可能な分子を選択する段階を含む活性分子のスクリーニン
グ又は特性決定方法。25. A method of screening or characterizing an active molecule comprising the step of selecting a molecule capable of binding to the sequence of SEQ ID NO: 7 or the sequence of SEQ ID NO: 9 or fragments thereof.
の製造方法であって、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の核酸又は請求
項１５もしくは１６に記載のベクターを含む細胞を前記核酸の発現条件下で培養
し、生産されたペプチド化合物を回収する前記方法。26. A method for producing the peptide compound according to any one of claims 4 to 10, wherein the nucleic acid according to any one of claims 11 to 14 or the method according to claim 15 or 16 is used. The above method, wherein cells containing the vector are cultured under the expression conditions of the nucleic acid, and the produced peptide compound is recovered.
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