JP2003521075A - フラットフィールド法、パネル平坦化法およびパネル接続法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数のパネルを組み立てて単一の画像にする。各パネルは、パネル全体にわたって異なる強度を有しかつパネル間が不均一である。これらパネルはフラットフィールド校正法、パネル平坦化法およびパネル接続法を使って改善される。これらの方法は不均一性を修正して一層きれいな単一画像を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願の相互参照 本願は、２０００年１月２７日付けで出願された米国仮特許願第６０／１７８
，４７６号の特典を主張するものである。

【０００２】 技術分野 本発明は画像分析に関し、さらに詳しく述べると、単一画像のいくつものパネ
ル間の不均一性を修正するのに画像分析を使用することに関する。

【０００３】 背景 生物医学の研究が、生物試料の逐次プロセシング（sequential processing）
に基づいて、急速に進歩している。逐次プロセシングによって、とりわけ遺伝学
、生化学、免疫学および酵素学を含む生物学に関する各種の分野で重要な発見が
もたらされている。歴史的に見ると、逐次プロセシングを行うには２、３の生物
学的に関連のある分子の試験を同時に行う必要があった。しかしこれらの最初の
逐次プロセシングは極めて遅くかつ面倒であった。必要な数の試料（何万個もの
）の試験は時間がかかりかつ高値であった。

【０００４】 蛍光標識化を利用して生物試料を平行処理する方法が開発されて、生物試料の
逐次プロセシング法が、飛躍的に進歩した。複数の試料が、基板のスライドガラ
スまたは類似の部材の上のフィールドに列と行を有する、本明細書でマイクロア
レイと呼称するアレイに配列される。上記スライドガラス上の試料は次に、平行
して生化学的にプロセスされる。これら試料分子は、その試料分子と他の生物物
質との相互作用によって蛍光で標識される。このような方法は、多数の試料のプ
ロセシングを迅速に行うことができる。

【０００５】 画像形成のためのいくつかの用途には、高い解像度と高い内容という二つの明
らかに相容れない特性が必要である。解像度の必要条件は、画像の細部が、画像
である物体の情報内容の少なくとも２倍を超えなければならないということによ
って推進される（いわゆるナイキストの限度）。内容の必要条件は、大きな面積
にわたる情報をもっていなければならないということによって推進される。この
ような要求を処理する一方法は、高い空間解像度の複数の個々の画像（パネル）
を獲得して、これらのパネルを隣接する領域に集めて、大きな望ましい領域を包
含させる方法である。次に、これら多数のパネルは、各パネルが集められた時の
光学器械と試料との相対的位置に基づいて、単一の大きな画像に組み立てること
ができる。複数のパネルを、単一のモンタージュに組み立てるとき、いくつもの
ステップを経て、各パネル内の強度の不均一性を修正する[本明細書では平坦フ
ィールド校正およびパネルの平坦化（flat-field calibration and Panel Flatt
ening）として知られている]ことができ、かつパネル内のパネル強度の不均一性
を修正できる。

【０００６】 本発明のこれらのおよびその外の特徴は、以下の詳細な説明を読んで添付図面
を参照すれば一層明らかになるであろう。

【０００７】 詳細な説明 大きい画像をつくるため、複数の小さい画像を検出器によって集めて単一の大
画像に組み立てる。検出器によって集められた複数の小画像は各々、光学器械と
検出器の不均一な応答の組合せによって影響を受けている。光学器械の場合、照
明の口径食および集光の口径食が検出器によって集められた画像に、顕著な強度
のひずみ（intensity curvature）をもたらす。検出器の不均一な応答は、検出
器のすべての素子間でゲインとオフセットが異なるという形態で起こる。

【０００８】 これらの誤差を修正するため、暗電流（露出なし）からフルウェル近く（near
full-well）までの範囲内の一連の画像を獲得する。検出器の各画素の線形回帰
分析を行うと、傾斜（ゲイン）とインターセプト（オフセット）が生じる。すな
わち、各画素について、下記式をｍとｂについて解く。

【数３】 測定された＿画像＝所望の＿画像＊ｍ＋ｂ 次に、平坦フィールド校正が下記計算によって（やはり各画素について）達成さ
れる。

【数４】 所望の＿画像＝（測定された＿画像−オフセット＿マップ）／ゲイン＿マップ 上記式中、ｍは「ゲイン＿マップ」で置き換えられ、かつｂは「オフセット＿マ
ップ」で置き換えられている。

【０００９】 ゲインマップとオフセットマップは、照明光学器械、集光光学器械および検出
器の不均一性を同時に修正する。

【００１０】 画像フィールドのひずみとオフセットの問題を修正する平坦フィールド校正マ
ップは、画像にノイズを付け加えるという犠牲をはらって修正を行う。両方のマ
ップは、測定ノイズを含有しており、次にそのノイズは校正された画像に送られ
る。ゲインマップは、ほとんどが光子のカウンティングノイズであるノイズ（シ
ョットノイズ）を含んでおり、一方、オフセットマップはＣＣＤカメラの電子読
取りノイズによって支配されている。

【００１１】 オフセットマップノイズを修正するため、平均暗電流マップ（露出なし）を線
形回帰分析の結果の代わりに利用できる。すなわち、平坦フィールド画像に使用
されるオフセット＿マップは、線形回帰分析によって計算されるインターセプト
よりむしろ、多くの暗電流画像の平均である。前記インターセプトは本来ノイジ
ーなものであることは経験によって分かっている（そのインターセプトはカメラ
レンジの低い信号／ノイズの部分で測定される）。計算されたオフセットマップ
を使用すると、ベースラインのノイズが増大することによって測定装置の感度が
低下する。図１と図２に示すオフセットマップは平均暗電流である。計算された
インターセプトは、平均暗電流のノイズの約２倍である。

【００１２】 各測定を行うのに用いる複数のフレームを平均すると、データのＳ／Ｎ比が改
善されて、得られるゲインマップとオフセットマップのノイズを減らす（計算さ
れたオフセットマップがフラットフィールディングのために用いられる場合）。

【００１３】 もう一つの方法は、ゲインマップを低域フィルターで平滑にする方法である。

【００１４】 完全に均一なフラットフィールド校正スライドガラスを組み立てることはほと
んど不可能である。不均一な蛍光は、非常に注意深く調製したスライドガラスで
もよくあることである。しかし、校正スライドガラスをカメラ露出中に移動させ
ると、そのスライドガラスの不均一な蛍光応答を均分する。フラットフィールド
校正マップは、かなり品質が低い校正スライドガラスから得ることができる。

【００１５】 図１と図２は、均一な蛍光校正スライドで製造したフラットフィールド校正マ
ップを示す。ゲインマップ１０５、２０５は約０．３％のノイズを含有し、一方
、オフセットマップ１１０、２１０は１.２４カウントを提供する（ゲイン修正
は乗法的であり、オフセットは加法的である）。

【００１６】 フラットフィールド校正は有効な方法であるが、この方法はノイズを導入する
。フラットフィールド校正マップのクリーニングを行うと、画像の質が大きく改
善される。特に、オフセットマップのノイズをさらに減らすと低末端の感度（lo
w-end sensitivity）が改善される。マップを集めるために使用したＣＣＤカメ
ラのリードノイズ（read-noise）は約１.７７カウントのリードノイズを有して
いる。オフセットマップノイズを（直角位相で）加えると、約２.２カウントの
ベースラインノイズが生じ、これは２４％の増加である。

【００１７】 もう一つの問題点は、パネルの強度のひずみが眼に見えるアーチファクトを生
じることである。図３はひずみを全く修正していない画像３００を例示している
。照明の口径食と集光の口径食の組合せが、より高い明るさまたは集光効率それ
ぞれを視野の中心にもたらす。フラットフィールディング法をパネルに適用した
場合でも、各種の因子が残留ひずみの原因になっている。例えばランプの揺らぎ
、カメラバイアスの不安定性が、獲得された画像の一般的な強度レベルを変化さ
せて、

【数５】 フラット＿画像＝（獲得された＿画像−オフセット＿マップ）／ゲイン＿マッ
プ という標準のフラットフィールディング計算に影響する。オフセットマップの小
さな誤差は、ゲインマップ（通常湾曲している）に、フィールドひずみを導入さ
せる。獲得された画像に存在するひずみが大きければ大きいほど、残留ひずみが
存在している可能性が大きい。

【００１８】 強度のひずみは一般に一つのパネルから次のパネルへと一貫して存在している
ので、各パネルの強度プロフィールを平均すると、平均ひずみマップが得られる
。各パネルをひずみマップで割り算することが、すべてのパネルに一貫して存在
している強度ひずみを平坦にする一方法である。ひずみマップを、ひずみマップ
の平均強度または類似の値で正規化すると、画像の正味の強度スケールを変える
ことなしに計算することができる。

【００１９】 各パネルの強度プロフィールを平均する方法の一例は、各パネル内の各画素に
ついて下記の処置を実施する方法である。第一に、現行パネルの画素が信号でな
い場合、下記式を適用する。

【数６】 アキュムレータ＿マップ＝アキュムレータ＿マップ＋画素＿強度

【数７】 アキュムレーション＿カウンター＿マップ＝アキュムレーション＿カウンター
＿マップ＋１ 第二に、アキュムレータ＿マップ内のすべての画素について、下記の方法を使
用してひずみマップを計算する。 カウンター＿マップがゼロより大きい場合、

【数８】 ひずみ＿マップ＝アキュムレータ＿マップ／アキュムレーション＿カウンター
＿マップ その外の場合、

【数９】 ひずみ＿マップ＝隣接するひずみ値の平均値 これによって、ひずみ平坦化マップ（curvature flattening map）がつくられ
、そのマップは

【数１０】 ひずみ＿フラットナー（flattener）＝１／ひずみ＿マップ と定義される。

【００２０】 上記処置はいくつもの方式で改善することができる。第一に、ひずみマップを
平滑化して、平均ひずみ画像のノイズとスプリアス信号に対する感度を低下させ
ることができる。第二に、バックグランドの強度よりそれほど大きくない各パネ
ルからの画素だけを平均する。各パネルのヒストグラムを利用して、バックグラ
ンド領域（所望の）を画像信号（望ましくない）から区別する。すべてのパネル
がひずみマップの各画素に情報を提供するわけではないので、ひずみマップの各
点に加えられた画素の数のマップが、前記平均値を計算するために必要である。
情報を全く含んでいない画素は、隣の画素の平均値から合成することができる。
第三に、ひずみマップは、比較的低い強度値を強調する重みづけ法を利用して曲
線当てはめを行うことができる。曲線当てはめはノイズを減らすのに有用である
。曲線当てはめの目的は、バックグランドのひずみだけを測定して画像信号の影
響を減らすことである。その外の改善としては、小パネルのロットを平均すると
、画像信号の汚染（image signal corruption）と所望の画像領域の過剰走査（o
ver-scanning）を減らして、平均を行うパネルおよびバックグランドの強度のゆ
がみだけを含むパネルをより多く提供する。

【００２１】 複数の小さい画像を組み合わせて一つの大きい画像をつくる場合の別の問題点
は、隣接するパネル間の小さな不連続点が目視可能になることである。１〜２カ
ウントのランダムノイズの存在下においてさえも重要な情報が非常に強力である
場合には、１〜２カウントの強度の差は人の眼によって容易に検知できる。残っ
ている不連続点は目視可能な縫目上のアーチファクトをつくる。不連続点の例を
図３の画像３００に示す。

【００２２】 この問題点を修正するため、パネル端縁の接続法を実施する。この方法では、
各パネルの境界（border）を、左、右、頂部および底部のすべての隣りと比較す
る。この比較によって、各パネルの全境界線（boundary）に対し、境界強度のス
ケーリング値（scaling value）が生成する。次にその境界線は、結果が現行パ
ネルと隣接パネルの境界線の間の中間になるように度合いを合わせる（scaled）
ことができる。次に前記強度は、隣接境界の強度間の中間点で接続される。境界
線のスケーリングは前記四つの境界線からの距離に基づいて、パネルの各画素に
適用される。スケーリング因子の重みづけ組合せ法を利用して、連続強度のラン
プ（ramp）を一つの境界線から次の境界線へ適用する（画像の中央におけるスケ
ーリング因子は左、右、頂部および底部のスケーリング因子の平均値でなければ
ならない）。重みづけ法のいくつかの例としては逆２乗重みづけ法（inverse sq
uare weighting）と逆重みづけ法がある。これらの方法は下記式を利用して実施
できる。

【００２３】 逆２乗重みづけ法：

【数１１】 左＿重み＝１／（ｉ＋１）＾２ 右＿重み＝１／（ｎｘ−ｉ＋１）＾２ 底部＿重み＝１／（ｊ＋１）＾２ 頂部＿重み＝１／（ｎｙ−ｊ＋１）＾２

【００２４】 逆重みづけ法：

【数１２】 左＿重み＝１／（ｉ＋１） 右＿重み＝１／（ｎｘ−ｉ＋１） 底部＿重み＝１／（ｊ＋１） 頂部＿重み＝１／（ｎｙ−ｊ＋１） 全＿重み＝左＿重み＋右＿重み＋頂部＿重み＋底部＿重み

【００２５】 スケーリング因子：

【数１３】 左＿スケール（ｊ）＝１／２＊[左＿境界（ｊ）＋左＿パネル（ｊ）の＿右＿
境界]／左＿境界（ｊ） 右＿スケール（ｊ）＝１／２＊[右＿境界（ｊ）＋右＿パネル（ｊ）の＿左＿
境界（ｊ）]／右＿境界（ｊ） 頂部＿スケール（ｉ）＝１／２＊[頂部＿境界（ｉ）＋頂部＿パネル（ｉ）の
＿底部＿境界]／頂部＿境界（ｉ） 底部＿スケール（ｉ）＝１／２＊[底部＿境界（ｉ）＋底部＿パネル（ｉ）の
＿頂部＿境界]／底部＿境界（ｉ） 画素（ｉ、ｊ）の強度スケーリング因子＝[左＿スケール（ｊ）＊左＿重み＋
右＿スケール（ｊ）＊右＿重み＋底部＿スケール（ｉ）＊底部＿重み＋頂部＿ス
ケール（ｉ）＊頂部＿重み]／全＿重み

【００２６】 諸定義： ｎｘ 画素の列の数 ｎｙ 画素の行の数 ｉ 列の番号（ゼロベース） ｊ 行の番号（ゼロベース）

【００２７】 接続とひずみの平坦化はともに、かなりのバックグラウンド強度を有するパネ
ルにとって重要である。ひずみが平坦化されている画像を図３に示してある。さ
らなる改善法は、境界線のスケーリング値の中央値フィルタリングを行って、外
れ値に対する感度を低下させる方法である。パネルの配列を誤まると、スケーリ
ング因子の計算間違いを起こす。計算まちがいは、明るい（または暗い）スポッ
トが隣接パネルの境界にそってオーバーラップしないときにかなり起こる。その
上に、中央値をフィルタされた境界線スケーリング値を平滑化する方法を使って
、配列の問題で起こったスパイクを除くことができる。最終的に、境界線スケー
リング値の曲線当てはめを行って、一般的な傾向を見つけて、ノイズと配列の誤
りを避けることができる。

【００２８】 本発明の多くの変型と改良は、当業技術者には容易に明らかになるであろう。
したがって、本発明は、その精神と不可欠の特徴から逸脱することなく、他の特
別な形態で実施することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の一実施態様による全体のひずみマップとオフセットマップを
示すフラットフィールド校正マップである。

【図２】 図１の逆のゲインマップとオフセットマップの２０×２０領域の近接
図である。

【図３】 本発明の一実施態様による、ひずみ平坦化を適用する前と適用した後
の画像を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G043 BA16 EA01 FA01 LA03 MA01 NA01 5B057 AA10 CA08 CA12 CA16 CB08 CB12 CB16 CE02 CE05 CF05 CH08

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の画像を獲得し、 前記複数の画像についての線形回帰を実施してゲインとオフセットを獲得し、
   次いで 前記ゲインとオフセットを使用して所望の画像を決定することを含んでなる、
   画像をフラットフィールド校正する方法。
2. 【請求項２】 暗電流からフルウェルまでの範囲内の複数の画像を獲得すること
   をさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記複数の画像の各画素について線形回帰を実施することをさら
   に含む請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 下記式： 【数１】 所望の＿画像＝（測定された＿画像−オフセット＿マップ）／ゲイン＿マップ を使用して所望の画像を計算することをさらに含む請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記複数の画像を獲得しながら校正スライドガラスを移動させる
   ことをさらに含む請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 複数の画像を獲得し、 前記複数の画像の平均暗電流を獲得し、次いで ゲインと平均暗電流を使用して所望の画像を決定する、 ことを含むオフセットマップのノイズを減少させる方法。
7. 【請求項７】 暗電流からフルウェルまでの範囲内の複数の画像を獲得すること
   をさらに含む請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 下記式： 【数２】 所望の＿画像＝（測定された＿画像−平均暗電流）／ゲイン＿マップ を利用して所望の画像を計算することをさらに含む請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 多数のフレームを平均して所望の画像を決定することをさらに含
   む請求項６に記載の方法。
10. 【請求項１０】 複数の画像パネルの平均ひずみマップを獲得し、 各パネルを前記ひずみマップで割算する、 ことを含む画像中にファイルされたひずみを低下させる方法。
11. 【請求項１１】 前記ひずみマップを、そのひずみマップの平均強度によって正
    規化することをさらに含む請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ひずみマップを平滑化することをさらに含む請求項１０に
    記載の方法。
13. 【請求項１３】 バックグランドの強度を超える画素だけを使用して平均ひずみ
    マップを獲得することをさらに含む請求項１０に記載の方法。
14. 【請求項１４】 画像の画素を曲線に当てはめることによって、画像のノイズを
    減らすことをさらに含む請求項１０に記載の方法。
15. 【請求項１５】 各パネルのすべての辺の境界を比較して、境界強度スケーリン
    グ値をつくり出し、次いで 各パネルの境界線を、現行パネルと隣接パネルの間のほぼ中間の点にスケール
    する、 ことを含む画像の隣接パネル間の不連続性を減らす方法。
16. 【請求項１６】 逆２乗重みづけ法を利用して各パネルの境界線をスケールする
    ことをさらに含む請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 逆重みづけ法を利用して各パネルの境界線をスケールすること
    をさらに含む請求項１５に記載の方法。