JP2003519476A - 融合タンパク質送達システムおよびその使用 - Google Patents

融合タンパク質送達システムおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質をコードするＤＮＡに融合した、ウイルスＶｐｘタンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物を提供する。本発明の別の実施形態において、タンパク質をコードするＤＮＡに融合した、ウイルスＶｐｒタンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物が提供される。本発明はさらに、レンチウイルスのｇａｇ−ｐｏｌとは無関係にレンチウイルスのｐｏｌ遺伝子をトランス作用で発現させるためのＤＮＡ、ベクターおよび方法を提供する。遺伝子形質導入エレメントは、必要に応じて、本発明によるレンチウイルスベクターに送達される。ウイルス阻害分子を動物体内の標的に送達する様々な方法もまた提供される。さらに薬学的組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ［関連出願］ 本出願は、１９９７年９月２９日に出願された一部継続特許出願番号第０８／
９４７，５１６号である１９９８年６月３日に出願された一部継続特許出願番号
第０９／０８９，９００号であり、そして特許出願第０８／４２１，９８２号の
包袋継続であり、その全ては、引用することにより本明細書の一部をなすものと
する。
【０００２】 ［発明の分野］ 本発明は、一般に、分子ウイルス学およびタンパク質化学の分野に関する。さ
らに詳細には、本発明は、ヒトおよびシミアン免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＳＩ
Ｖ）Ｇａｇタンパク質の使用、またはタンパク質／ペプチドのビリオンまたはウ
イルス様粒子への輸送のためのビヒクルとしてそれらのパッケージングを指向す
るアミノ酸残基およびその使用に関する。
【０００３】 ［発明の背景］ 単純レトロウイルスと異なり、ヒトおよびシミアン免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
／ＳＩＶ）は、ウイルス粒子にパッケージ化されるＧａｐ、ＰｏｌおよびＥｎｖ
に加えてタンパク質をコードする。これらには、全ての霊長類レンチウイルスに
存在するＶｐｒタンパク質、およびＨＩＶ−２／ＳＩＶSM／ＳＩＶMAC群のウイ
ルスに特徴的であるＶｐｘタンパク質が挙げられる。ＶｐｒおよびＶｐｘは、感
染ビリオンに存在するので、それらは、ウイルスのライフサイクルにおいて、初
期に重要な役割を果すと長年考えられた。実際に、ＨＩＶ−１の最近の研究では
、Ｖｐｒが、求核特性を示し、マトリックスタンパク質と一緒に、マクロファー
ジのような非分裂細胞におけるウイルス予備組込複合体の核輸送を促進すること
が示された。同様に、Ｖｐｘを欠損するＨＩＶ−２は、複製カイネティクスが遅
延されることを示し、そして末梢血単核細胞での生産感染を生じさせ、維持する
のに２〜３桁より多くのウイルスを必要とすることを示した。したがって、両方
のアクセサリータンパク質は、一次標的細胞における有効な複製およびＨＩＶ／
ＳＩＶの拡大のために重要であると考えられる。
【０００４】 レトロウイルス粒子への外来タンパク質の組込みは、ｇａｇとの融合により先
に報告されてきた。酵母レトロトランスポゾンＴｙｌは、ウイルス性の複製に干
渉するレトロウイルスアセンブリーモデルとして試験された。（Ｇ．Ｎａｔｓｏ
ｕｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６３２−５頁、１９９１年）。さらに最
近、ネズミのレトロウイルスのカプシド−ストレプトコッカスのヌクレアーゼ融
合タンパク質の発現は、組織培養細胞でのネズミ白血病ウイルスの複製を阻害す
ることが分かった。Ｇａｐ−ストレプトコッカスのヌクレアーゼの発現は、ウイ
ルス力価を減少させ、そして抗−ＨＩＶ攻略法を推進するウイルス感染性を減少
させる。（Ｇ．Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：４３２９３７頁
、１９９６年）。
【０００５】 レンチウイルスベクター、特にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶに基づく
ものは、非分裂細胞型への安定に組込まれるという魅力的な特性により、遺伝子
療法において有用である（Ｎａｌｄｉｎｉ、Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻
：２６３−２６７頁、１９９６年；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７１巻：５５７９−５５９２頁、１９９７年；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２５９巻：２３４−２３８頁、１９９３年）。ヒト治療法のためのレン
チウイルスに基づくベクター使用の利用性は、安全なレンチウイルスに基づくベ
クターの開発を必要とする。ＨＩＶビリオンに関連したアクセサリータンパク質
（ＶｐｒおよびＶｐｘ）は、ウイルスおよび非ウイルスの両方の起源のタンパク
質をＨＩＶ粒子に送達するビヒクルとして有用であることが知られている（Ｌｉ
ｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：７６３０−７６３８頁、１９９５年；Ｌ
ｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；
Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年；
Ｗｕ，Ｘ．ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １６巻：５１１３−５１２２頁、１
９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：３３７８−３３８４頁、１
９９６年）。最近、我々は、トランス−ＲＴおよびＩＮが、シス−ＲＴおよびＩ
Ｎ（Ｇａｇ−Ｐｏｌから由来した）を模倣することを示した。トランス−ＲＴお
よびＩＮタンパク質は、全てのライフサイクルを通してＲＴ−ＩＮマイナス・プ
ロウイルスに由来するビリオンの感染および複製を有効に救済する（Ｌｉｕ，Ｈ
．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ
．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。さらに
、これらの発見は、切断Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体ポリタンパク質（Ｇａｇ−Ｐｒｏ
）が、ＲＴおよびＩＮの機能がトランスで提供される場合に感染性粒子の形成を
支持することを示す。この発見は、全長のＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体が、感染性粒子
の形成に必要とされないことを、レンチウイルスについて最初に示した。我々の
データは、トランスＶｐｒ−ＲＴ−ＩＮ、またはＶｐｒ−ＩＮと一緒のＶｐｒ−
ＲＴが、十分に機能し、そしてウイルス感染性、プロウイルス性ＤＮＡの組込み
、およびＲＴ欠損、ＩＮ欠損およびＲＴ−ＩＮ欠損ウイルスの複製（１サイクル
の間に）を支持することも示す（Ｌｉｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７
７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６
１６１−６１６９頁、１９９４年）。我々のデータは、酵素活性のあるＲＴが、
ビリオンへの組込みのためにＶｐｒを必要としないことを示すことにも注目すべ
きである（図１９ＡおよびＢ）。ＲＴは、Ｖｐｒの融合パートナーとして発現す
ることなくとも、トランスで発現される場合にＨＩＶ−１ビリオンに組込まれう
る。これらのデータは、これらの重要な酵素の機能が、トランスで供され、発現
のためのそれらの正常な機構、およびＧａｇ−Ｐｏｌ前駆体タンパク質の成分と
してのビリオン組込みから独立していることを示す。
【０００６】 先行技術は、ビリオンに対して外来のタンパク質、すなわち毒性のタンパク質
を送達またはターゲティングする有効な手段が欠如している。本発明は、当分野
でのこの長年の必要および所望を満たす。
【０００７】 ［発明の要約］ 本発明は、Ｇａｇおよび／またはＧａｇ変異体が、ウイルスおよび非ウイルス
性起源のタンパク質を、ＨＩＶ／ＳＩＶビリオンに標的化するビヒクルとして使
用できる。Ｇａｇ遺伝子融合体は、細菌性ストレプトコッカスのヌクレアーゼ（
ＳＮ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（ＩＮ）
およびそれらの組合せで構築された。Ｇａｇ部分を含む融合タンパク質は、トラ
ンスでの発現により、生来のウイルス性ゲノムに対するＨＩＶ粒子にパッケージ
ングされる。
【０００８】 Ｇａｇ融合タンパク質が構築され、そしてＨＩＶ粒子に包装するそれらの能力
が示された。本発明は、Ｇａｇ融合体タンパク質は、哺乳類細胞で発現され、そ
して野生型Ｇａｇタンパク質の存在下でさえＨＩＶ粒子に組込まれることを示す
。本発明は、さらに、ビリオンに組込まれたＧａｇ融合体は、先行技術と対照的
に感染性があるままであることを示す（Ｇ．Ｓｃｈｕｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７０巻：４３７９−３７頁、１９９６年）。したがって、ビリオンに対する、
有害な酵素を含めた異種のＧａｇ融合タンパク質を標的とすることは、抗−ＨＩ
Ｖ薬剤の発見および遺伝子療法に向かう新たな道程を表す。
【０００９】 本発明では、Ｇａｇタンパク質およびその変異体は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ前駆体タ
ンパク質の成分としてそれらの正常な発現から独立して、トランスで十分に機能
性のあるＲＴおよびＩＮをレンチウイルス性およびレトロウイルス粒子に送達す
るビヒクルとして機能することが示されている。したがって、本発明は、正常な
パッケージング成分（Ｇａｐ−Ｐｒｏ）、およびレトロウイルスに基づくベクタ
ーのための酵素機能を供する新規のトランス酵素的な要素を発生する。本発明に
よって、これが、複数の異なるプラスミド、すなわち、ベクタープラスミド、パ
ッケージングプラスミド、トランス酵素発現プラスミドおよびエンベローププラ
スミドに由来する少なくとも３つの別個のＲＮＡの組換えを必要とし、そしてそ
れ自体は、起りそうにないので、本発明によって、感染の可能性がある形態／複
製中のレトロウイルス形態（ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ＬＴＲ）の発生が、低減
される。ビリオンＧａｇタンパク質は、Ｇａｐ−Ｐｏｌとは独立に、ＲＴおよび
ＩＮタンパク質をレンチウイルスベクターに送達するビヒクルとして本発明で活
用される。それ自体、「トランスレンチウイルス」または「トランスレトロウイ
ルス」ベクターは、遺伝子送達、および遺伝子療法のために活用される。
【００１０】 本発明の１つの実施形態では、ウイルス阻害性タンパク質をコードするＤＮＡ
に融合されたウイルス性Ｇａｇタンパク質をコードするＤＮＡを包含する物質の
組成物が提供される。
【００１１】 本発明のさらに別の実施形態では、ウイルス阻害性タンパク質をコードするＤ
ＮＡに融合されたウイルス性Ｇａｇタンパク質断片をコードするＤＮＡを含む物
質の組成物が提供される。
【００１２】 本発明のさらに別の実施形態では、動物に有効量の本発明の組成物を投与する
ステップを含むことを特徴とする、動物において、ウイルス阻害性分子を標的に
送達する方法が提供される。
【００１３】 本発明のなお別の実施形態では、本発明の組成物および医薬上許容しうる担体
を含むことを特徴とする治療用組成物が提供される。
【００１４】 本発明の他の、そして別の態様、特性および利点は、開示の目的のために付与
された本発明の現在のところ好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるで
あろう。
【００１５】 以下に明確される内容と同様に、本発明の上述の特性、利点および目的が達成
され、そして詳細に理解され得て、上に簡潔に要約される本発明のさらに特別な
説明は、添付される図面で示される特定の実施形態に対する文献によってなされ
得る。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかし、添付される図面が、
本発明の好ましい実施形態を示し、したがって、それらの範囲に限定すると考え
られるべきでないことには注目すべきである。
【００１６】 ［好ましい実施形態の詳細な説明］ ここに使用される場合、語句「融合タンパク質」は、Ｖｐｘ（任意のＨＩＶ−
２およびＳＩＶの）またはＶｐｒ（任意のＨＩＶ−１およびＳＩＶの）またはレ
トロウイルスのＧａｇの全ての生来のタンパク質アミノ酸配列のいずれか、また
は組換えＤＮＡ技術を通して結合され、そして生来のＨＩＶ／ＳＩＶビリオンま
たはレトロウイルス様粒子のいずれかと結合する能力のあるそれらの配列の任意
の削除に該当する。
【００１７】 ここに使用される場合、語句「ビリオン」は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および
ＳＩＶウイルス粒子に該当する。
【００１８】 ここに使用される場合、語句「レトロウイルス様粒子」は、これらのタンパク
質を発現する天然のまたは不死化した細胞のいずれかから構築し、そして放出す
る能力のある自然に感染した宿主で自然に存在するもの以外のＨＩＶ−１、ＨＩ
Ｖ−２、ＳＩＶまたはレトロウイルスタンパク質の任意の組成に該当する。
【００１９】 ここに使用される場合、語句「変異体」は、「配列比較および分析における最
新の方法」、（巨大分子配列決定および合成、選択方法およびアプリケーション
（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ）、１２７−１４９頁）どおり、fastＤＢによって計算されるとおり、その断
片を含めた生来の配列と少なくとも３０％の配列同一性を示すポリペプチドまた
はヌクレオチド配列をいう。
【００２０】 ここに使用される場合、語句「形質移入」は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのい
ずれか）の真核生物または原核生物の細胞または組織への導入に該当する。
【００２１】 ここに使用される場合、語句「遺伝子形質導入要素」は、細胞に遺伝子を形質
導入するための最少限の必要とされる遺伝的情報に該当する。
【００２２】 ここに使用される場合、語句「ウイルス阻害性タンパク質」は、Ｖｐｘまたは
Ｖｐｒで融合されたアミノ酸の任意の配列、または、任意の方法で個々の細胞（
原核生物および真核生物の）において、または高等生物でのいずれかで多重化さ
れ、拡大するレトロウイルスの能力を変える可能性のあるＧａｇ配列に該当する
。このような阻害性分子としては、酵素的活性（例としては、ＨＩＶ／ＳＩＶプ
ロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素、ＶｉｆおよびＮｅｆタンパク質が挙
げられうる）を保有しうるものを含めたＨＩＶ／ＳＩＶタンパク質または配列、
すなわち、任意の方法で、それらの正常な機能または酵素的活性および／または
特異性（例としては、ＨＩＶ／ＳＩＶプロテアーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵
素、ＶｉｆおよびＮｅｆタンパク質の突然変異が挙げられうる）を変えるために
、遺伝子操作技術によって改変されたＨＩＶ／ＳＩＶタンパク質またはタンパク
質／ペプチド配列、またはＶｐｒまたはＶｐｘまたはＧａｇとの融合タンパク質
として発現されるときに、ウイルス多重を変え、そしてインビトロまたはインビ
ボで拡大する任意の他の非ウイルスタンパク質が挙げられうる。
【００２３】 本発明では、ＨＩＶ ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質を、Ｇａｇポリタンパク
質前駆体とのウイルス型特異的相互作用を通してビリオンにパッケージ化させた
。ＨＩＶ−１ Ｖｐｒ（Ｖｐｒ１）およびＨＩＶ−２ Ｖｐｘ（Ｖｐｘ２）を、
それらのオープンリーディングフレームが、細菌性ストレプトコッカス・ヌクレ
アーゼ（ＳＮ）、ＳＮの酵素的に不活性な突然変異体（ＳＮ*）、およびクロラ
ムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子で
インフレーム融合されるときに、外来タンパク質を標的化するのに利用する。Ｔ
７基本のワクシニアウイルスシステムにおける一過性の発現は、それらの同種ｐ
５５Gagタンパク質と同時発現されるときに、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に有効
に組込まれ、適切にサイズ決定されたＶｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*およびＶｐｘ２ＳＮ
／ＳＮ*融合タンパク質の合成を示す。融合タンパク質のパッケージング化は、
野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質で先に見られたとおり、ウイルス型特異的
決定因子に依存性がある。粒子に結合したＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合
タンパク質は、ラムダファージＤＮＡのインビトロ消化によって測定される場合
に酵素的に活性であった。機能性Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質が、Ｈ
ＩＶ粒子に標的化されたことを示すために、遺伝子融合体を、ＨＩＶ−２ＬＴＲ
／ＲＲＥで制御した発現ベクターにクローニングさせ、そして野生型ＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２プロウイルスで同時形質移入させた。スクロース勾配精製され
たビリオンのウエスタンブロット分析は、Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク
質の両方が、ＳＮ、ＳＮ*またはＣＡＴが、Ｃ末端融合パートナーとして使用さ
れるかどうかにかかわらず有効にパッケージングされることを示した。さらに、
融合タンパク質は、酵素的に活性が残り、そして野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタン
パク質の存在下でパッケージングされた。興味深いことに、ビリオンは、アクセ
サリータンパク質に特異的な抗体、並びにＳＮおよびＣＡＴ融合パートナーと反
応するより小さいタンパク質をも含有した。同様のタンパク質は、Ｇａｇ由来の
ＶＬＰが不在であり、並びにビリオンでは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の存在下
で伝達されるので、それらは、ウイルス性プロテアーゼによって産生される開裂
産物を表すに違いない。一緒にして、これらの結果は、ＶｐｒおよびＶｐｘは、
ＨＩＶ／ＳＩＶ粒子に対して、強力に破壊的な酵素を含めた機能性タンパク質を
標的化するために使用されうることを示す。これらの特性は、新規な抗ウイルス
攻略法の開発のために有用である。
【００２４】 本発明では、遺伝子カセットは、遺伝子の融合タンパク質発現を誘導するトラ
ンス酵素プラスミド内のレトロウイルスＧａｇ変異体に結合される。遺伝子の選
択およびＧａｇヌクレオチド配列の修飾を通して、本発明のベクターは、パッケ
ージング、ベクターおよびエンベロープポリペプチドをコードする遺伝子または
その変異体と共同して宿主細胞に形質移入されるときに、抗ウイルス療法および
／または遺伝子送達ベクターとして作用する。本発明は、各々、様々なベクター
機能をコードするプラスミドとともに、ここに詳述されるときに、このような機
能は、宿主細胞に同時形質移入される１つ、２つおよび３つのプラスミドを含む
より少数のプラスミドと十分に組み合わせることができることが予想される。好
ましくは、複数のプラスミド遺伝子送達システムが、本発明によって利用される
。
【００２５】 Ｇａｇ基本のトランスレンチウイルスベクターは、２９３Ｔ細胞を、Ｇａｇ、
ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰ（トランスファーベクター）、およびｐＭＤ−Ｇ（エンベ
ローププラスミド）に基づいた様々のトランス酵素プラスミドである、ｐＣＭＶ
−ｇａｇ−ｐｒｏ（パッケージングプラスミド）で形質移入させることによって
産生される。本発明のＧａｇ基本のトランスレンチウイルスベクターは、Ｇａｇ
前駆体タンパク質が、機能性融合タンパク質を宿主細胞に送達する能力があるこ
とを示す。融合タンパク質は、実例として、ＲＴ、ＩＮ、ＲＴ−ＩＮ、ＧＦＰ、
ＣＡＴ、ＣＦＴＲおよび同等物が挙げられる。対照として、トランスレンチウイ
ルスベクター基本のＶｐｒは、２９３Ｔ細胞を、ｐＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｒｏ（パ
ッケージングプラスミド）、ｐＬＲ２Ｐ−Ｖｐｒ−ＲＴＩＮ（トランス酵素プラ
スミド）、ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰ（トランスファーベクター）、およびｐＭＤ−
Ｇ（エンベローププラスミド）で形質移入させることによって産生された（Ｗｕ
，Ｘ．ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９７、１６：５１１３−５１２２頁
、１９９７年）。ＧＦＰ発現を監視するために蛍光顕微鏡を使用して、トランス
レンチウイルスベクター粒子の感染性は、ＨｅＬａ細胞の単層培養物で監視され
た。表１で示されるとおり、Ｇａｇに基づいたトランスレンチウイルスベクター
の力価は、０．４〜４×１０5／ｍｌに及んだ一方で、Ｖｐｒに基づくトランス
レンチウイルスベクターのものは、５〜９×１０5／ｍｌに及んだ。本発明によ
るＧａｇ前駆体タンパク質は、機能性タンパク質をベクター粒子に送達する能力
がある。Ｇａｇに基づくトランスレンチウイルスベクターの力価は、ＲＴ−ＩＮ
に関するトランスレンチウイルスベクターに基づくＶｐｒのものと比較しておよ
そ２〜５倍少なく、この結果は再現可能であった。
【００２６】
【表１】
【００２７】 レンチウイルス群（ＨＩＶ−１のＲＴ−ＩＮマイナス・プロウイルスＤＮＡか
ら由来するビリオン）またはレンチウイルスに基づくベクターのウイルス感染性
を支持するトランスＲＴ−ＩＮの能力は、トランス−ＲＴ−ＩＮ融合タンパク質
が、シス作用ＲＴ−ＩＮに十分に置換されることを示す。レンチウイルスのよう
な単純レトロウイルスのトランスＲＴ−ＩＮ（Ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮ融合タンパク
質から由来する）かどうかを測定するために、生来のＧａｇ−Ｐｏｌ構造（ＧＡ
Ｇ−ＰＲ−ＲＴ−ＩＮ）に由来するＣｉｓ作用ＲＴ−ＩＮも、Ｇａｇ−ＲＴおよ
びＧａｇ−ＩＮから由来するトランス−ＲＴ−ＩＮ、またはレンチウイルスのよ
うなレトロウイルス中のＧａｇ−ＲＴ−ＩＮの三重融合に置換される。したがっ
て、トランスレトロウイルスベクターに基づくＧａｇは、５ｕｇのパッケージン
グ構築物（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｒｏ）、２ｕｇのトランス酵素プラス
ミド（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮ）、５ｕｇのトランスファーベク
ター（ｐＲＴＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ）およびｐＭＤ−Ｇ（エンベローププ
ラスミド）で、２９３Ｔ細胞を形質移入させることによって産生された。対照と
して、レトロウイルスベクターは、ｐＣＭＶＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｏｌ（パッケー
ジングプラスミド）、５ｕｇのトランスファーベクター（ｐＲＴＣＭＶ−ｅＧＦ
Ｐ−ＷＰＲＥ）およびｐＭＤ−Ｇ（エンベローププラスミド）で、２９３Ｔ細胞
を形質移入させることによって産生された。ＧＦＰ発現を監視するために蛍光顕
微鏡を用いて、トランスレンチウイルスベクター粒子の感染性は、ＨｅＬａ細胞
の単層培養物で観察された。表２に示されるとおり、トランス−レトロウイルス
ベクターの力価は、０．６〜１．８×１０7／ｍｌに及んだ。レトロウイルスベ
クター力価は、０．８〜２．５×１０7／ｍｌに及んだ。この結果は、レトロウ
イルスの単純ｒｇａｇ前駆体タンパク質も、トランスで機能性タンパク質をベク
ター粒子に送達できることを示す。したがって、本発明によって、宿主細胞への
遺伝子送達は、目的のタンパク質に対する融合パートナーであるＧａｇ前駆体遺
伝子で起こり、それにより遺伝子送達ベクターシステムとして作用する多様なレ
トロウイルスを作り出す。
【００２８】
【表２】
【００２９】 ［方法］ （１）ベクター粒子は、２９３Ｔ細胞へのＤＮＡ形質移入によって産生された。 （２）ベクター力価は、ＨｅＬａ細胞を感染させることによって測定された。結
果は、形質移入された２９３Ｔ細胞から収集された培養上清の１ｍｌあたりの感
染性粒子として表現された。
【００３０】 Ｇａｇ融合は、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）、エーベルソンマウス白血
病ウイルス、ＡＫＲ（内因性）マウス白血病ウイルス、鳥類の癌腫、ミルヒル・
ビニス２、鳥類白血症ウイルス−ＲＳＡ、鳥類骨髄芽球症ウイルス、鳥類骨髄球
腫症ウイルス２９、ウシシンシチアルウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ニワ
トリ・シンシチアルウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ白血病ウイルス、
ネコ・シンシチアルウイルス、フィンケル−ビスキス−ジュンキンス・マウス肉
腫ウイルス、フレンド・マウス白血病ウイルス、フジナミ肉腫ウイルス、ガード
ナー−アルンステイン・ネコ肉腫、ギボンサル白血病ウイルス、モルモットＣ型
腫瘍ウイルス、ハーディー−ザッカーマン・ネコ肉腫ウイルス、ハーベイ・マウ
ス肉腫ウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、ヒト・スプマウイルス、ヒトＴ−リンパ
向性ウイルス１、ヒトＴ−リンパ向性ウイルス２、ジャグシエケット・ウイルス
、キルステン・マウス肉腫ウイルス、ランガーウイルス、マソン−ファイザー・
サルウイルス、モロニー・マウス肉腫ウイルス、マウス哺乳類腫瘍ウイルス、ヒ
ツジ肺性アデノ腺癌ウイルス、ブタＣ型腫瘍ウイルス、網内症ウイルス、ロス・
肉腫ウイルス、サル泡沫状ウイルス、サル肉腫ウイルス、サルＴリンパ向性ウイ
ルス、サルＤ型ウイルス１、シンダー−セイレン・ネコ肉腫ウイルス、リスザル
レトロウイルス、トラガーダック脾臓壊死ウイルス、ＵＲ２肉腫ウイルス、クサ
リヘビ・レトロウイルス、ビスナ／マエディウイルス、ウッディーモンキー肉腫
ウイルス、およびＹ７３肉腫ウイルス ヒト、サル、ネコ、およびウシ・免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ）（Moloney Leukemia Virus (ML
V), Abelson murine leukemia virus, AKR (endogenous) murine leukemia viru
s, Avian carcinoma, Mill Hill vinis 2, Avian leukosis virus - RSA, Avian
myeloblastosis virus, Avian myelocytomatosis virus 29, Bovine syncytial
virus, Caprine arthritis encephalitis virus, Chick syncytial virus, Equ
ine infectious anemia virus, Feline leukemia virus, Feline syncytial vir
us, Finkel-Biskis-Jinkins murine sarcoma virus, Friend murine leukemia v
irus, Fujinami sarcoma virus, Gardner-Arnstein feline sarcoma virus, Gib
bon ape leukemia virus, Guinea pig type C oncovirus, Hardy-Zuckerman fel
ine sarcoma virus, Harvey murinesarcoma virus, Human foamy virus, Human
spumavirus, Human T-lymphotropic virus1, Human T-lymphotropic virus 2, J
aagsiekte virus, Kirsten murine sarcoma virus, Langur virus, Mason-Pfize
r monkey virus, Moloney murine sarcoma virus, Mouse mammary tumor virus,
Ovine pulmonary adenocarcinoma virus, Porcine type C oncovirus, Reticul
oendotheliosis virus, Rous sarcoma virus, Simian foamy virus, Simian sar
coma virus, Simian T-lymphotropic virus, Simian type D virus 1, Snyder-T
heilen feline sarcoma virus, Squirrel monkey retrovirus, Trager duck spl
een necrosis virus, UR2 sarcoma virus, Viper retrovirus, Visna/maedi vir
us, Woolly monkey sarcoma virus, and Y73 sarcoma virus human-, simian-,
feline-, and bovine immunodeficiency viruses (HIV, SIV, FIV, BIV)）を含
めたレトロウイルスおよびレンチウイルスからここで作用性がある。Ｇａｇとの
ＲＴおよびＴＮ融合が、ここで作用性がある場合、多様な治療性および診断的融
合タンパク質は、ここに開示される方法およびベクターによって標的細胞に同様
に送達性されると理解される。
【００３１】 Ｇａｇ基本のトランスレンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス性Ｖ
ｐｒまたはＶｐｘタンパク質のものと同種の機能を示すレトロウイルスＧａｇ前
駆体タンパク質をコードする非霊長類レンチウイルス生殖能力および単純レトロ
ウイルスに基づいて開示される。先行技術と対照的に、本発明は、非分裂中の霊
長類細胞でウイルスの感染性を維持する。本発明のベクター内にコードされるＷ
ＰＲＥ配列は、そのために必要である。本発明のベクターの感受性は、ウッドチ
ャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の後期転写性調節要素を含む遺伝子トランスフ
ァーベクターの使用を通して増強される。調節中の後期転写の能力のあるＷＰＲ
Ｅ遺伝子または遺伝子断片を含めることは、トランスレンチウイルスの力価単独
で増加する場合、別のＰＰＴ−ＣＴＳ配列の包含は、ウイルス感染性における累
積の増強を作り出す。ＷＰＲＥは、同様のウイルスに基づくベクターにおけるル
シフェラーゼまたはＧＦＰ生成を増大することが示された（Ｒ．Ｚｕｆｆｅｒｅ
ｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３巻、２８８６−２８９２頁（１９９９年））。代わり
に、中央のターミネーター配列（ＣＴＳ）および中央ポリプリン路（ＰＰＴ）は
、１９９９年１１月１０日に提出された米国仮出願第６０／１６４，６２６号に
詳述されるとおり、力価を独立に増加する遺伝子トランスファーベクター、およ
び新たなウイルス性およびトランスウイルスベクターに導入される。ＰＰＴおよ
びＣＴＳが、ＨＩＶ−１逆転写に関わってきた。Ｐ．Ｃｈａｍｅａｕら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４１巻、６５１−６６２頁（１９９４年）。メッセンジャー
ＲＮＡを安定化させ、そしてそれによりタンパク質発現を促進する能力のある他
の対照配列が、本発明内のＷＰＲＥ、ＰＰＴおよびＣＴＳの代わりに作用性があ
ることも予想される。
【００３２】 ＷＰＲＥ配列は、ＰＰＴ−ＣＴＳより異なって機能する。後者が、逆転写およ
び核移入を促進すると考えられるのに対して、前者は、転写物を安定化させ、そ
れにより翻訳および産生シグナルが増加すると考えられる。同じ遺伝子トランス
ファーベクター内に操作的に配置される場合に、これら２つの配列の累積的効果
は、レンチウイルスまたはトランスレンチウイルスシステムのいずれかで使用さ
れるにもかかわらず観察された。これら２つの配列の機能性変動、またはこれら
の配列の機能的類似体は、過度の実験なしに存在するか、または製造でき、そし
て本発明に利益を示すことも予想される。レンチウイルスベクターおよびトラン
スレンチウイルスベクターシステムにこれらの配列（ｃｔｓ−ｐｐｔおよびＷＰ
ＲＥ）を含むことによって、力価、形質導入効率、したがって形質導入細胞につ
いての利用性が、特に、筋肉、神経単位、幹細胞、非刺激ＣＤ３４＋細胞、気道
細胞、肝細胞、眼の細胞、および他の体細胞のような非分裂細胞について増強さ
れる。非分裂細胞は、体細胞、限定的寿命を示す細胞、またはゆっくりと分裂す
る一次細胞と定義されうる。しかし、このような細胞は、刺激されて、例えばＣ
Ｄ３４＋骨髄細胞、すなわち、多能性血液生成幹細胞にみられるように、いっそ
う迅速に分裂しうる。
【００３３】 本発明は、それぞれ、ウイルスタンパク質、または遺伝子送達に対する結合を
通して、ウイルスベクターへのトランスタンパク質または遺伝子の送達を供給す
る。すなわちウイルスタンパク質は、ＶｐｒまたはＶｐｘまたはＧａｇであり、
そして遺伝子は、ＶｐｒまたはＶｐｘまたはＧａｇのいずれかをコードする。こ
れらのトランスタンパク質または遺伝子のある種の切断変異体は、完全な配列を
有するタンパク質または遺伝子の調節または酵素的機能を行う。例えば、プロテ
アーゼ、インテグラーゼ、逆転写酵素、Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴ、ＩＮお
よびＣＦＴＲをコードする核酸配列は、置換、付加、欠失または機能的に等価な
タンパク質または遺伝子を供給する多重発現によって改変されうる。核酸コード
配列の縮重により、天然に生じるタンパク質のものと実質的に同じアミノ酸配列
をコードする他の配列は、本発明の実施に使用されうる。これらとしては、それ
に限定されないが、上記タンパク質をコードする核酸配列の全部または一部を含
む核酸配列が挙げられ、そしてそれは、配列内で機能的に等価なアミノ酸残基を
コードする様々のコドンの置換によって改変され、それによりサイレント変化（
silent change）を生じる。例えば、配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸が
、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸に置換されて、サイレ
ント改変を生じうる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他
のメンバーから選択されうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、ア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ
プトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタ
ミンが挙げられる。正に荷電された（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、
リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電された（酸性）アミノ酸として
は、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。さらに、本発明の範囲内
に含まれるのは、例えば、グリコシル化（glycosolation）、タンパク質分解開
裂、抗体分子または他の細胞リガンドなどに対する連結によって、翻訳の間また
は後に様々に修飾されるタンパク質または断片またはその誘導体である。さらに
、本発明の核酸配列をコードする組換えリガンドは、リガンドのプロセシングま
たは発現を修飾するために操作されうる。例えば、シグナル配列は、リガンドの
分泌を可能にする配列をコードするリガンドの上流に挿入され、そしてそれによ
りアポトーシスを促進しうる。
【００３４】 さらに、核酸配列をコードするリガンドは、翻訳、開始、および／または終止
配列を作り出し、および／または破壊するため、またはコード領域での変動を作
り出し、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、また
は予め存在するものを破壊するために、インビトロまたはインビボで突然変異さ
せて、さらなるインビトロ修飾を促進しうる。当分野で知られる突然変異誘発の
ためのあらゆる技術が、使用されうる。インビトロ部位指向性突然変異（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３巻：６５５１頁）、Ｔａｂリンカーの使用（Ｐｈａｒ
ｍａｃｅａ）などが挙げられるが、それに限定されない。
【００３５】 以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的のために付与され、
そしてあらゆる形態で本発明を制限することが意図されない。
【００３６】 ［実施例１−細胞およびウイルス］ ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−ｔａｔ（ＨＬｔａｔ）、２９３ＴおよびＣＶ−１細胞を
、１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンで補足したダルベッコの修飾イーグル培地で維持した。ＨＬｔ
ａｔ細胞は、集約的に、ＨＩＶ−１ｔａｔの第一のエキソンを発現するものであ
り、Ｂ．ＦｅｌｂｅｒおよびＧ．Ｐａｖｌａｋｉｓ博士によって提供された。バ
クテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換えワクシニアウイ
ルス（ｒＶＴ７）を使用して、Ｔ７プロモーターの制御下に置かれたウイルス遺
伝子の発現を促進した。ｒＶＴ７のストックを作製し、そしてＷｕら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６６巻：７１０４−７１１２頁、１９９２年によって先に記述されると
おりに、ＣＶ−１細胞で力価測定した。ＨＩＶ−ＩYU2、ＨＩＶ−ＩｐＮＬ４−
３−Ｒ−およびｐＮＬ４−３、ＨＩＶ−Ｉ11XB2D、ＨＩＶ−２ST、およびＨＩＶ
−２7312Aプロウイルスクローンを、組換え発現プラスミドの構築および形質移
入由来のウイルスの発生のために使用した。
【００３７】 ［実施例２−抗体］ ＨＩＶ−１Ｖｐｒ特異的抗体を産生するために、ＨＩＶ−ＩYU2ｖｐｒオープ
ンリーディングフレームを、プライマー（センス：５’ＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴ
ＣＧＡＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡ ＡＣＴ−３’（配列番号１）およびアンチセンス：ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を含む ５’−ＧＴＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣ−３’）（配列番号
２） を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、そして原核生物の
発現ベクターｐＧＥＸに連結させ、それによりｐＧＥＸ−ｖｐｒ１を産生した。
この構築物は、Ｃ末端融合タンパク質としてＶｐｒ１およびグルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ（ｇｓｔ）の発現を可能にし、したがって、アフィニティー・
クロマトグラフィーを用いたタンパク質精製を可能にした。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ
５ａ）を、ｐＧＥＸ−ｖｐｒ１で形質転換させ、そしてタンパク質発現を、イソ
プロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。ｇｓｔ−Ｖｐ
ｒ１融合タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。溶解性ｇ
ｓｔ−Ｖｐｒ１タンパク質を精製し、そしてＶｐｒ１は、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎ
ｅ ６７巻：３１−４０頁、１９８８年）の先に記述された手段を用いてトロン
ビン開裂によって放出された。ニュージーランド白色ウサギを、フロイント完全
アジュバントで１：１に乳化させた０．４ｍｇの精製Ｖｐｒ１タンパク質で免疫
し、フロイント不完全アジュバントで１：１に混合した０．２５ｍｇのＶｐｒを
２週間隔で３回追加免疫し、そして第一の免疫化の８および１０週後に血液を採
取して、抗血清を収集した。使用された別の抗体としては、ＨＩＶ−１Ｇａｇ（
ＡＣＴ１）およびＨＩＶ２Ｇａｇ（６Ｄ２．６）に対するモノクローナル抗体、
ＨＩＶ−２Ｖｐｘタンパク質に対して生じたポリクローナルウサギ抗体、および
精製された細菌で発現されたＳＮタンパク質に対して生じた抗−ＳＮ抗血清が挙
げられる。
【００３８】 ［実施例３−Ｔ７に基づく発現プラスミドの構築］ HIV-1ＨＸＢ２Ｄgag（ヌクレオチド３３５−１８３７）を包含するＤＮＡ断片
は、プライマー（センス：５’−ＡＡＧＧＡＧＡＧ ＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡ
ＧＡＧＣＧ−３’（配列番号３） およびアンチセンス：ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位（下線付き）を含む ５’ＧＧＧ ＧＡＴＣＣ ＣＴＴＴＡＴＴＧ ＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号４））
を使用してＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、精製し、そしてｐＴＭ１ベクターのポリリンカーに連結して、そし
てｐＴＭ−ｇａｇ１を生じた。同様に、ＨＩＶ−２ST（ヌクレオチド５４７−２
１１３）のｇａｇコード領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれ、センスおよびアン
チセンスプライマー５’−ＡＴＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＡＧＡＡ ＡＣ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＧＧＧＧ ＣＣＣＣＴＡＣＴＧＧＴ
ＣＴＴＴＴＣＣ −３’（配列番号６）を用いたＰＣＲによって増幅させた。反応生成物を、Ｎｃ
ｏＩおよびＳｍａＩ（下線付き）で切断し、精製し、そしてｐＴＭＩのポリリン
カーに連結させて、ｐＴＭ−ｇａｇ２を生成した。
【００３９】 Ｔ７プロモーターの制御下でのＶｐｒ１の発現のために、ＨＩＶ−ＩYU2ｖｐ
ｒコード領域を含むＤＮＡ断片（ヌクレオチド５１０７−５４００）を、それぞ
れ、ＮｃｏＩおよびＨｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位（下線付き）を含むプライマー（
センス：５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧ Ｇ ＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡ−３’（配列番号７）およびアンチセンス：５
’−ＣＧＣＧＧ ＡＴＣＣＧＴＴＡＡ ＣＡＴＣＴ ＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣ−
３’（配列番号８） を用いたＰＣＲによって増幅させた。反応生成物を、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ
で切断し、そしてｐＴＭ１に連結させて、ｐＴＭ−ｖｐｒ１を生成した（図１２
Ａ）。インフレームでＳＮおよびＳＮ*を、ｖｐｒ１と融合させるために、それ
らのコード領域を、それぞれ、ｐＧＮ１５６１．１およびｐＧＮ１７０９．３か
ら、そして一連のサブクローニング段階を通して切取り、そしてｐＴＭ−ｖｐｒ
１のＳｍａＩ／ＸｈｏＩ部位に連結させ、そしてｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐ
ＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*を生成した。このアプローチは、Ｖｐｒ１の翻訳終止コド
ンをＴｒｐコドンに、そしてＣ末端Ｓｅｒ残基をＣｙｓに変化させた。ｖｐｒ１
およびＳＮ／ＳＮ*の間の生じた結合点は、図１２Ｃに描かれている。
【００４０】 Ｔ７制御下でのＶｐｘ２の発現のために、ＨＩＶ−２STｖｐｘコード配列を含
むＤＮＡ断片（ヌクレオチド５３４３−５６９１）を、それぞれ、ＮｃｏＩおよ
びＢｇｌＩＩ部位（下線付き）を含むプライマー（センス：５’ＧＴＧＣＡＡＣ
ＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡ−３’ （配列番号９）およびアンチセンス：５’−ＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴ ＣＴＴ ＡＧＡＣ ＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧ ＧＡＧＧ−３’（配列番号１０） を用いたＰＣＲによって増幅させた。ＢｇｌＩＩおよびクレノウ代用品で開裂さ
せた後に、ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩで切断し、精製し、そしてｐＴＭ１のＮｃｏ
ＩおよびＳｍａＩ部位に連結させて、それによりｐＴＭ−ｖｐｒ２を生成した（
図１２Ｂ）。インフレームで、ｖｐｒ２との融合体を構築させるために、Ｂａｍ
ＨＩ／ＸｈｏＩ、ＳＮおよびＳＮ *含有ＤＮＡ断片を、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮお
よびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*から切取り、そしてｐＴＭ−ｖｐｒ２に連結させ、
そしてそれにより、それぞれ、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２Ｓ
Ｎ*を生成した。このアプローチは、Ｖｐｘ（ＶａｌからＡｒｇまで）のＣ末端
で１つのアミノ酸置換を導入し、ｖｐｘの翻訳終止コドンをＳｅｒに変化させ、
そしてｐＴＭ１プラスミドポリリンカーの５つのアミノ酸残基を残した。ｖｐｘ
２およびＳＮ／ＳＮ*の間の生じた結合点は、図１Ｄに描かれている。
【００４１】 ［実施例４−ＨＩＶ ＬＴＲに基づくＶｐｒまたはＶｐｘ発現プラスミドの構築
］ ＨＩＶの存在下でのＶｐｒおよびＶｐｘ融合タンパク質の有効な発現のために
、ＨＩＶ−２ＬＴＲ（ＨＩＶ−２ST、関連（coordinates）−５４４から４６６
まで）およびＨＩＶ−２ＲＲＥ（ＨＩＶ−２ROD、関連７３２０から７９７２ま
で）要素を含む真核生物の発現ベクター（ｐＬＲ２Ｐと称される）を構築した（
図７Ａ）。これらのＨＩＶ−２ＬＴＲおよびＲＲＥ要素は、それらがＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２ＴａｔおよびＲｅｖタンパク質の療法に応答するので選択され
た。ｖｐｒ１、ｖｐｒ１ＳＮ、ｖｐｘ２およびｖｐｘ２ＳＮコード領域は、Ｎｃ
ｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で、それらの別個のｐＴＭ発現プラスミド（図１参
照）から切取られ、そしてｐＬＲ２Ｐに連結されて、それにより、それぞれ、ｐ
ＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２および
ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮを生じた（図７Ａ）。ｖｐｒ−およびｖｐｘ−ＣＡＴ
遺伝子融合の構築および発現のために、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＬＲ
２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮのＳＮ含有領域（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片）を除去し、そ
してＣＡＴを含む、ＰＣＲで増幅されたＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩＤＮＡ断片で置換
して、それにより、それぞれ、ｐＬＲ２ＰＶｐｒ１ＣＡＴおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖ
ｐｘ２ＣＡＴを生成した（図９Ａ）。
【００４２】 ［実施例５−レンチウイルス性プラスミドが関与するＧａｇ融合の構築］ ｐＨＲＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミドは、記述された（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻：２６３−２６７頁、１９９６年）ｐＨＲＣＭＶ−
Ｌａｃｚを修飾することによって誘導された。ｐＨＲＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミ
ドは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いた消化によりｌａｃｚを除去した後、ｅ
ＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｃｌから誘導された）；（クローンテック・ラボラトリー
ズ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州パロア
ルト）を含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ｐＨＲＣＭＶ−Ｉａｃｚプ
ラスミドに連結させることによって構築された。ｐＰＣＭＶ−ｅＧＦＰを構築す
るために、（配位４３２７−４４８３を伴う）そして中央ＰＰＴおよび中央終結
部位（ＣＴＳ）を含む１５０ｂｐ配列を、ＰＣＲによりＳＧ３分子クローンから
増幅させ、そしてＣｌａＩで切断されたｐＨＲＣＭＶ−ｅＧＦＰに連結させた。
Ｔｅｔ誘発性発現プラスミドを構築するために、ｐＴＲＥから誘導される４３０
ｂｐのＴＲＥ誘導性プロモーター（クローンテック・ラボラトリーズ、カリフォ
ルニア州パロアルト）を、平滑末端に充填されたＸｈｏＩ、およびＢａｍＨＩに
よって節単した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（インビトロゲン、カリフ
ォルニア州）のＣＭＶプロモーターを、ＳｐｅＩ１（平滑末端で充填された）お
よびＢａｍＨＩを用いて置換させ、それによりｐＴＲＥ−ネオを生成した。ｐＣ
ＭＶｇａｇ−ｐｏｌから誘導されたＨＩＶ−基本のパッケージング成分を含む６
．７ｋｂの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＴＲＥ−ネオにクロー
ニングさせて、それにより、機能性ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｇａｇおよびｐｏ
ｌ遺伝子を含むｐＴＲＥ−ｇａｇ−ｐｏｌを生成した。図２３Ａで示されるＲＴ
−ＩＮマイナスプラスミドを構築するために、ｐＴＲＥｇａｇ−ｐｏｌの領域（
１９７５から５３３７まで）を、ｐＳＧ３Ｓ−ＲＴのＲＴ−ＩＮ含有ＢｃｌＩ／
ＳａｌＩ ＤＮＡ断片（１９７５から５３３７まで）で置換させ、ｐＴＲＥｇａ
ｇ−ｐｏｌプラスミドのＢｃｌＩおよびＳａｌＩ部位に連結させて、それにより
ｐＴＲＥｇａｇ−ｐｒｏを生成した。ＲＴ−ＩＮ配列は、ＲＴおよびＩＮコード
領域の第一のアミノ酸位置に、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）を含有し、そしてＣＭ
Ｖプロモーターの制御下にあった。４配列にある３９塩基対の内部欠失が、導入
され、エンベロープ遺伝子の内部領域（１３５７ｂｐ）を、５８２７から７１８
４までに欠失させ、それによりｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌを生成した。ＲＴ−ＩＮ
マイナスプラスミドを構築するために、ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌの領域（１９７
５から５３３７まで）を、ｐＳＧ３Ｓ−ＲＴのＲＴ−ＩＮ含有ＢｃｌＩ／Ｓａｌ
ＩＤＮＡ断片（１９７５から５３３７まで）に置換させ、ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏ
ｌプラスミドのＢｃｌＩおよびＳａｌＩ部位に連結させ、それにより表２に示さ
れるｐＣＭＶｇａｇ−ｐｒｏを生成した。ＲＴ−ＩＮ配列は、ＲＴおよびＩＮコ
ード領域の第一のアミノ酸位置に、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）を含有した。図２
４Ａ−Ｃおよび表２に示される一連のトランス酵素プラスミドを構築するために
、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子の様々の断片を、ＰＣＲによって増幅させ、そしてＮ
ｃｏＩおよびＢｇｌＩＩを用いてｐＬＲ２ＰｖｐｒＲＴＩＮにクローニングさせ
て、それにより一連のｇａｇ−ＲＴＩＮ融合発現プラスミドを生成した。構築物
Ｄとして表１に示されるｐＬＲ２ｇａｇＮＣ−ＲＴＩＮは、欠失したｐ６位置を
有するＧａｇ遺伝子を含有した。図２４Ｂで示されるｐＬＲ２ＰｇａｇＮＣ（１
ＺＦ）−ＲＴＩＮおよび構築物は、ＮＣの第二の１ＺＦおよび欠失ｐ１−ｐ６断
片を示すＧａｇ遺伝子を含有した。図２４Ｃとして、そして構築物として表１で
示されるｐＬＲ２ＰｇａｇＣＡ−ＲＴＩＮは、ＮＣ−ｐ１−ｐ６断片を欠失する
Ｇａｇ遺伝子を含有した。ｐＬＲ２ＰＶｐｒＲＴＩＮ構築は、図１２に関して記
述される。ｐＭＤ−Ｇは、現存する技術によって構築される（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９７、１６：５１１３−５１２２（１９９７年）
）。
【００４３】 ［実施例６−レトロウイルス性プラスミドが関与するＧａｇ融合の構築］ ＲＴ−ＩＮマイナス・パッケージング構築物は、モロニー・マウス白血病ウイ
ルスｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｏｌに基づいて形成され、ＳａｌＩで切断さ
れ、そしてクレノウで充填され、それによりｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｒｏ
を生成し、そしてＲＴ遺伝子は、図２１Ａで示されるとおり３６６ａａの位置で
のリーディングフレーム移行によって突然変異された。プロテアーゼ領域を含む
３１２ｂｐの断片であるトランス酵素プラスミドを、ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ
−ｐｏｌのｇａｇ−ｐｏｌから欠失させ、それにより図２１Ｂで示されるとおり
ｐＣＭＶＡＴＧ／ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮを生成した。ＧＦＰトランスファーベクタ
ーは、モロニー・マウス白血病ウイルスに基づき、ＧＦＰ−ＷＰＲＥはｐＰＣＭ
Ｖ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥから得られ（Ｍ．Ｈ．Ｆｉｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８３
：４３−５０頁、１９９４年）、そしてＢａｍＨＩおよびＡｐｏｌ１を用いてｐ
ＲＴＣＭＶにクローニングし、それにより図２１Ｃに示されるとおりｐＲＴＣＭ
Ｖ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥを生成した。
【００４４】 ［実施例７−ベクター保存液の作製および感染］ トランスレンチウイルスベクター保存液は、リン酸カルシウム沈殿法によって
、５ｕｇのパッケージング構築物（ｐＴＲＥｇａｇ−ｐｏｌ）、２ｕｇのＶＳＶ
−Ｇ構築物（ＰＭＤ−Ｇ）、および５ｕｇのトランスファーベクター（ｐＰＣＭ
Ｖ−ｅＧＦＰ ＷＰＲＥ）およびＩｕｇのｐＴｅｔ−ｏｆｆ（クローンテック・
ラボラトリーズ、カリフォルニア州パロアルト）および様々のトランス酵素プラ
スミドを、予備融合２９３Ｔ細胞に形質移入させることによって作製された。５
ｕｇのパッケージング構築物（ｐＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ｐｒｏ）、２ｕｇの
ＶＳＶ−Ｇ構築物（ｐＭＤ−Ｇ）、および５ｕｇのトランスファーベクター（ｐ
ＲＴＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ）および２ｕｇのトランス酵素プラスミド（ｐ
ＣＭＶ−ＡＴＧ／ｇａｇ−ＲＴ−ＩＮ）を形質移入させることによって、トラン
ス−レトロウイルスベクター保存液を作製した。およそ１×１０6個の細胞を、
形質移入の２４時間前に、６ウエルのプレートに播いた。ベクター保存液を、形
質移入の６０時間後に採取した。形質移入された培養物の上清を、低速遠心分離
（１０００ｇ、１０分）によって区分けし、そして０．４５ｕｍの穴サイズのフ
ィルターで濾過し、適量を取り、そして続いて−８０℃に凍結した。標的細胞を
、３７℃で、４時間、１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥＴエステロンを含むＤＭＥＭ−
Ｉ％ＦＢＳに感染させた。続いて、培地を、新鮮なＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳまた
は予備調整培地に交換した。ｅＧＦＰベクターの力価を決定するために、１．０
、０．２、０．０４および０．００８ｕｌの上清保存液は、ＨｅＬａ細胞の培養
物を感染させるために使用された。２から３日後、正（緑）細胞コロニーは、蛍
光顕微鏡を使用して計数された。
【００４５】 ［実施例８−形質移入］ プロウイルスクローンの形質移入は、製造業者（ストラテジーン（Ｓｔｒａｔ
ｅｇｅｎｅ）によって記述されるとおり、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を用い
てＨＬｔａｔ細胞で行われた。Ｔ７−基本（ＰＴＭ１）の発現構築物を、先に記
述されるとおり、リポフェクチン（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて、ｒ
ＶＴ７感染ＨｅＬａ細胞に形質移入させた；（Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻
：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。これらの方法は、リポフェクチン試薬
の製造業者によって推奨されたものであった。
【００４６】 ［実施例９−ウエスタン免疫ブロット分析］ ビリオンおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、２０％スクロースのクッション
を通した超遠心分離（１２５，０００×ｇ、２時間、４℃）によって、形質移入
または感染された細胞の上清から濃縮させた。ペレットおよび感染／形質移入細
胞を、ローディング緩衝液［６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．
２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５％の２−メルカプトエタノール、１
０％グリセロール］に可溶化させ、油状化させ、そしてＳＤＳを含む１２．５％
ポリアクリルアミドゲルで分離させた。電気泳動に続いて、タンパク質を、電気
ブロッティングによってニトロセルロース（０．２ｕｍ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
およびＳｃｈｕｅｌｌ）に移行させ、封鎖緩衝液（リン酸塩緩衝食塩水［ＰＢＳ
］中脱脂粉乳５％）中で、室温で、１時間、そしてその後、２時間、封鎖緩衝液
中で希釈された適切な抗体を用いてインキュベートさせた。タンパク質結合抗体
を、製造業者（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の指示によって、ＥＣＬ法を
用いてＨＲＰで連結された特異的二次抗体で検出した。
【００４７】 ［実施例１０−ＳＮヌクレアーゼ活性アッセイ］ 細胞およびウイルスペレットを、ヌクレアーゼ溶解緩衝液（４０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ
−１００）に再浮遊させ、そして、低速遠心分離（１０００×ｇ、１０分）で区
分させた。ヌクレアーゼ反応用緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８
、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１％ＮＰ４０）中で１０倍希釈を行い、そして１
分間煮沸させた。５ｕｌの各希釈液を、５００ｎｇのラムダファージＤＮＡ（Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片）を含む１４ｕｌの反応用緩衝液に添加し、そして２時間、３
７℃でインキュベートさせた。反応生成物を、０．８％アガロースゲルで電気泳
動し、そしてＤＮＡを、臭化エチジウム染色によって可視化させた。
【００４８】 ［実施例１１−哺乳類細胞におけるＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ * 融合タンパク質の発現］ 哺乳類細胞におけるＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質
の発現を、組換えワクシニアウイルス−Ｔ７システム（ｒＶＴ７）を使用して評
価した。ＨｅＬａ細胞を、７５−８０％周密まで育成し、そして組換えプラスミ
ドｐＴＭ−ｖｐｒ、ｐＴＭ−ｖｐｘ、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*、およびｐ
ＴＭｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*で形質移入させた（図１）。形質移入の２４時間後、
細胞を、ＰＢＳで二回洗浄し、そして溶解させた。可溶性タンパク質を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって分離させ、そして免疫ブロット分析にかけた。結果は、図２
に示される。ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*の形質移入は
、抗−Ｖｐｒおよび抗−ＳＮ抗体の両方を使用して検出できる３４ｋＤａ融合タ
ンパク質の発現を生じた（Ａ）。同様に、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭｖ
ｐｘ２ＳＮ*の形質移入は、抗−Ｖｐｘおよび抗−ＳＮ抗体を使用して検出され
る３５ｋＤａ融合タンパク質の発現を生じた（Ｂ）。両方の融合タンパク質は、
それぞれ、Ｖｐｒ１（１４．５ｋＤａ）およびＳＮ（１６ｋＤａ）およびＶｐｘ
２（１５ｋＤａ）およびＳＮの合わせた分子量に基づいて、予測されるよりわず
かに遅く移動することが分かった。ｐＴＭ−ｖｐｒ１およびｐＴＭ−ｖｐｘ２の
形質移入は、単独で、適切なサイズにされた野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク
質を生じた。抗−Ｖｐｒ、抗−Ｖｐｘおよび抗−ＳＮ抗体は、対照として含まれ
るｐＴＭ１で形質移入された細胞の溶解液に対し、反応性がなかった。したがっ
て、ＳＮおよびＳＮ*融合タンパク質の両方は、哺乳類細胞で発現されうる。
【００４９】 ［実施例１２−ウイルス様粒子へのＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ * 融合タンパク質の組込み］ ワクシニアおよびバキュロウイルスシステムでは、ＨＩＶＧａｇの発現は、Ｖ
ＬＰの構築および細胞外放出に十分である。Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２は、他のウ
イルス性遺伝子産物の発現なしにＧａｇ粒子に有効に組込まれ得る。Ｖｐｒ１お
よびＶｐｘ２融合タンパク質が、ＶＬＰにパッケージングされうることを示すた
めに、組換えプラスミドを、ｒＶＴ７システム中でＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
Ｇａｇタンパク質と同時発現させた。ｐＴＭ−ｖｐｒ１、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ
およびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*を、ＨｅＬａ細胞単独、およびＨＩＶ−１Ｇａｇ
発現プラスミド、ｐＴＭ−ｇａｇ１と組合せて形質移入させた。形質移入の２４
時間後、細胞およびＶＬＰ抽出液を作製し、そして免疫ブロット分析によって分
析した（図３Ａ）。抗−Ｖｐｒ抗体は、細胞溶解物（上部パネル）で、そしてｐ
ＴＭ−ｇａｇ１との同時発現によって誘導されたペレット化されたＶＬＰ（中央
パネル）で、Ｖｐｒ１、Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｒ１ＳＮ*を検出した。ＨＩＶ
−１Ｇａｇ発現の不在下で、Ｖｐｒ１およびＶｐｒ１ＳＮは、培養上清のペレッ
ト（中央パネル）で検出されなかった。予想されるとおり、ＶＬＰも、ｐ５５Ｇ
ａｇを含有した（下部パネル）。したがって、Ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*融合タンパ
ク質は、ＶＬＰに首尾よくパッケージ化された。
【００５０】 Ｖｐｘ２ＳＮが、同様に、ＨＩＶ−２ＶＬＰにパッケージングする能力のある
ことを示すために、ｐＴＭ−ｖｐｘ２、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖ
ｐｘ２ＳＮ*を、ＨｅＬａ細胞単独、およびＨＩＶ−１Ｇａｇ発現プラスミド、
ｐＴＭ−ｇａｇ１と組合せて形質移入させた。ウエスタンブロットを、細胞の溶
解液および遠心分離による培養上清から濃縮されたＶＬＰで作製した（図３Ｂ）
。抗−Ｖｐｘ抗体は、細胞溶解物（上部パネル）で、そしてｐＴＭ−ｇａｇ２と
の同時発現によって誘導されたＶＬＰ（中央パネル）で、Ｖｐｘ２、Ｖｐｘ２Ｓ
ＮおよびＶｐｘ２ＳＮ*を検出した。抗−Ｇａｇ抗体は、ＶＬＰペレット中にｐ
５５Ｇａｇを検出した（下部パネル）。関連タンパク質シグナル密度の比較は、
Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ*融合タンパク質が、野生型Ｖｐｒ１
およびＶｐｘ２タンパク質と同様の量で、ＶＬＰにパッケージ化されることを示
唆した。Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮを含むＶＬＰのスクロース勾配分析は
、ＶＬＰとのこれらの融合タンパク質の同時沈降を示した（データは示されず）
。
【００５１】 ＧａｇＣ末端領域は、Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２のビリオンへの組込みのために
必要とされる。しかし、パッケージングは、ウイルス型に特異的であることが分
かり、つまり、トランスで発現される場合、Ｖｐｘ２は、ＨＩＶ−２ビリオンお
よびＨＩＶ−２ＶＬＰに有効に組込まれるのみであった。同様に、ＨＩＶ−１Ｖ
ｐｒは、ＨＩＶ−１ＶＬＰへの組込みのために、ＨＩＶ−１Ｇａｇ前駆体との相
互作用を必要とした。ＶＬＰとのＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮの結合が、Ｓ
Ｎ部分によって指向されなかったが、しかしＶｐｒおよびＶｐｘに特異的なパッ
ケージングシグナルのためであったことを示すために、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮお
よびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮを、ｐＴＭ−ｇａｇ１またはｐＴＭ−ｇａｇ２のいず
れかと個別に同時形質移入させた。対照として、ｐＴＭ−ｖｐｒ１およびｐＴＭ
−ｖｐｘ２も、単独で形質移入させた。２４時間後、細胞の溶解物およびペレッ
ト化ＶＬＰを、免疫ブロッティングによって試験した（図４）。Ｖｐｒ１ＳＮが
、全ての細胞で発現される場合（図４Ａ、上部パネル）、それは、ｐＴＭ−ｇａ
ｇ１で形質移入された細胞から誘導されたＶＬＰと結合されるのみである。同様
に、Ｖｐｘ２ＳＮは、全てのｐＴＭ−ｖｐｘ２で形質移入された細胞で検出され
た（図４Ｂ、上部パネル）が、しかし、ｐＴＭ−ｇａｇ２と同時形質移入によっ
て誘導されたＶＬＰと結合されるのみであった（図４Ｂ、中央パネル）。ＨＩＶ
−１およびＨＩＶ−２Ｇａｇモノクローナル抗体は、各ＶＬＰペレット中でＧａ
ｇ前駆体タンパク質の存在を確認した（図４Ｂ、下部パネル）。したがって、Ｖ
ｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮのＶＬＰへの組込みは、ちょうど生来のＶｐｒ１
およびＶｐｘ２のような、隣接Ｇａｇ前駆体タンパク質の相互作用を必要とした
。
【００５２】 Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質が、ＶＬＰと明らかに結合し
た（図３）場合、生来のアクセサリータンパク質の存在下でそのようにすること
を継続するかどうかという問題が残った。Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮパッ
ケージングの効率は、競合分析によって比較された（図５）。ｐＴＭ−ｖｐｒ１
ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮは、１：４から４：１までに及ぶ比を用いて、
それぞれ、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭ−ｖｐｒ１およびｐＴＭ−ｇａｇ２／ｐＴ
Ｍ−ｖｐｘ２と同時形質移入された（図５Ａおよび図５Ｂ、左パネル）。比較の
ために、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１は、ｐＴＭ−ｇａｇ１（
図５Ａ、それぞれ、中央および右パネル）およびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮと個別に
形質移入され、そしてｐＴＭ−ｖｐｘ２は、ｐＴＭ−ｇａｇ２で形質移入された
（図５Ｂ、それぞれ、中央および右パネル）。ＶＬＰを、スクロースクッション
を通してペレット化させ、溶解させ、ＰＡＧＥによって分離させ、ニトロセルロ
ースにブロットを取り、そして抗−ＳＮ抗体をプローブとして探索した。結果は
、同じ細胞に同時形質移入された場合に、ＶＬＰ中のＶｐｒ１およびＶｐｒ１Ｓ
Ｎの存在を示した（図５Ａ、左パネル）。同様に、同時発現されたＶｐｘ２およ
びＶｐｘ２ＳＮも、同時パッケージ化された（図５Ｂ、左パネル）。相対量のＶ
ＬＰ結合ＶＰｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮの比較は、明らかなパッケージング差
異がないことを示した。したがって、Ｖｐｒ１／Ｖｐｘ２融合タンパク質は、ビ
リオン組込みのために野生型タンパク質と効果的に競合しうる。
【００５３】 ［実施例１３−Ｖｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質は、ヌクレアー
ゼ活性を保持する］ ビリオン結合ＳＮ融合タンパク質が、酵素的に活性であったことを示すために
、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｇａｇ２／ｐＴＭ−
ｖｐｘ２ＳＮで形質移入されたＨｅＬａ細胞の培養上清からの超遠心分離により
濃縮されたＶＬＰは、インビトロＤＮＡ消化アッセイを用いてヌクレアーゼ活性
について分析された。この分析の前に、免疫ブロッティングは、ｖｐｒ１ＳＮお
よびｖｐｘ２ＳＮのＶＬＰとの結合を確認した（データは示されず）。図６は、
Ｖｐｒ１−またはＶｐｘ２−ＳＮ融合タンパク質を含んだＶＬＰ溶解物の希釈物
とのインキュベーション後の０．８％アガロースゲル中のラムダファージＤＮＡ
断片を示す。Ｖｐｒ１ＳＮ*またはＶｐｘ２−ＳＮ*を含むＶＬＰは、負の対照と
して含まれ、そして精製されたＳＮの希釈物は、参照標準として役割を果した（
図６Ａ）。ビリオンに結合したＶＰｒ１ＳＮ（図６Ｂ）およびＶｐｘ２ＳＮ（図
６Ｃ）融合タンパク質の両方は、ラムダファージＤＮＡの分解によって示される
とおり、ヌクレアーゼ活性を示した。細胞結合したＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２
ＳＮ融合タンパク質も、このシステムで分析されたときにヌクレアーゼ活性を保
有した（データは示されず）。ＳＮ特異性について制御するために、この分析は
、Ｃａ＋＋を欠いている緩衝液中でも行われ、そしてこれらの条件下で、ＳＮ活
性は検出されなかった（データは示されず）。したがって、ＳＮは、融合タンパ
ク質として発現され、そしてＶＬＰにパッケージングされたときに、酵素的に活
性を残す。
【００５４】 ［実施例１４−Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質のＨＩＶ−２ビリオンへの組込み］ Ｖｐｘは、トランスで発現されたときに、ＨＩＶ−２ビリオンに組込まれる。
Ｖｐｘ２融合タンパク質が、同様に、野生型ＨＩＶ−２ビリオンにパッケージン
グする能力があったことを示すために、ＨＩＶ−２ＬＴＲおよびＲＲＥ要素の制
御下にｖｐｘ２ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮ*コード領域を置く発現プラスミド（ｐ
ＬＲ２Ｐ）が構築された。ＨＩＶ−２ＲＲＥは、融合遺伝子の下流に配置されて
、ｍＲＮＡ安定性および有効な翻訳を確保した（図７Ａ）。融合タンパク質が、
トランスで発現されるときにパッケージ化されうることを示すために、ＨＩＶ−
２STプロウイルス性ＤＮＡ（ＰＳＸＢＩ）を、単独で、そしてｐＬＲ２Ｐ−ｖｐ
ｘ２ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*と組合せて形質移入させた。４８時
間後、細胞外ウイルスは、２０％スクロースのクッションを通した超遠心分離に
よって培養上清からペレット化され、そして免疫ブロット分析によって試験され
た（図７Ｂ）。複写ブロットを、抗−Ｖｐｘ（左）、抗−ＳＮ（中央）および抗
−Ｇａｇ（右）抗体を用いて釣上げた。抗−Ｖｐｘ抗体は、全ウイルスペレット
中に１５ｋＤａ Ｖｐｘ２タンパク質を検出した。ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮお
よびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*とのＨＩＶ−２STの同時形質移入によって誘導
されたビリオンでは、およそ３５および３２ｋＤａの別のタンパク質が、明らか
に見えた。同じ２つのタンパク質は、抗−ＳＮ抗体で釣上げられた複写ブロット
でも明らかであり、そしてそれらは、Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質を表すことが
示された（図７Ｂ，中央パネル）。全長のＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の推定分
子量は、３３ｋＤａである。生来のＶｐｘおよびＳＮは、推定されたものよりわ
ずかにゆっくりと動いたので、３５ｋＤａ種は、全長Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク
質を表すようである。抗−ＳＮ抗体は、およそ２１および１７ｋＤａの別のタン
パク質を検出した（これらのタンパク質は、長期間露出された後、いっそう明ら
かであった）。唯一３５ｋＤａタンパク質が、Ｐｏｌタンパク質（図２）を欠く
Ｇａｇ誘導ＶＬＰで検出されたので、より小さいタンパク質は、ウイルス性プロ
テアーゼによって生じたｖｐｘ２ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮ*の開裂産物を表した
。抗−Ｇａｇ抗体は、各形質移入から得られたおよそ等価な量のビリオンの分析
を確認した。
【００５５】 ｖｐｘ２ＳＮのＨＩＶ−２ビリオンへのパッケージングを示すために、スクロ
ース勾配分析が行われた。ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびＨＩＶ−２STとの同
時形質移入の４８時間後にＨＬｔａｔ細胞の培養上清から収集された細胞外ウイ
ルスは、２０％スクロースのクッションを通してペレット化された。ペレットを
、ＰＢＳ中に再浮遊させ、そしてその後、線形勾配の２０−６０％スクロース上
で、１８時間遠心分離にかけた。分画を収集し、そして免疫ブロッティングで分
析した（図７Ｃ）。複写ブロットを、抗−ＳＮ（上部）および抗−Ｇａｇ（下部
）抗体で別個に釣上げた。Ｖｐｘ２ＳＮおよびＧａｇの両方のピーク濃度は、分
画８−１１で検出され、そしてＶｐｘ２ＳＮのＨＩＶ−２ビリオンへの直接結合
およびパッケージングを示した。これらの同じスクロース分画（８−１１）は、
屈折率測定分析によって測定される場合、１．１６および１．１７ｇ／ｍｌの間
の密度を示すことが分かった（データは示されず）。さらに、Ｖｐｘ２ＳＮの３
５ｋＤａおよび３２ｋＤａ形態の両方が、検出され、そしてウイルス粒子へのパ
ッケージングに続くプロテアーゼ開裂についての別の証拠を提供した。
【００５６】 ＨＩＶ−２STは、ｖｐｒを欠くので、これは、Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の
パッケージングに影響を及ぼしうる。短期ＰＢＭＣ培養物からクローン化された
ＨＩＶ−２7312Aと称される第二株のＨＩＶ−２を分析し、そして全遺伝子につ
いてのオープンリーディングフレームを含み、そして無傷のｖｐｒおよびｖｐｘ
遺伝子（未公開）を含む。ＨＩＶ−２7312AプロウイルスＤＮＡ（ｐＪＫ）のプ
ラスミドクローンを、単独で、そしてｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮとの組合せで、
ＨＬｔａｔ細胞に形質移入させた。比較のために、ＨＩＶ−２STも、ｐＬＲ２Ｐ
−ｖｐｘ２ＳＮで同時形質移入された。子孫ウイルスは、スクロースクッション
を通した超遠心分離によって濃縮され、そして免疫ブロット分析によって試験し
た（図７Ｄ）。複写ブロットを、抗−Ｖｐｘ（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体
をプローブとして探索した。結果は、ｖｐｒ−欠損ウイルス（ＨＩＶ−２ST）と
比較したｖｐｒコンピテントウイルス（ＨＩＶ−２7312A）への相対的レベルの
Ｖｐｘ２ＳＮ組込みを示した。さらに、３５ｋＤａおよび３２ｋＤａタンパク質
が、また、ＨＩＶ−２7312Aビリオンで検出された。したがって、Ｖｐｘ２Ｓｎ
タンパク質の複写コンピテント野生型ＨＩＶ−２の有効な組込みが、生来のＶｐ
ｒおよびＶｐｘタンパク質の存在下でさえ示された。
【００５７】 ［実施例１５−Ｖｐｒ１ＳＮのＨＩＶ−１ビリオンへの組込み］ 同じＬＴＲ／ＲＲＥ基本の発現プラスミドを用いて、Ｖｐｒ１ＳＮが、ＨＩＶ
−１プロウイルスとの同時発現（上で検討されるとおり、ＨＩＶ−２ＬＴＲは、
ＨＩＶ−１Ｔａｔによって転写促進され、そしてＨＩＶ−２ＲＲＥは、ＨＩＶ−
１Ｒｅｖタンパク質に感受性がありうる）により、ＨＩＶ−１ビリオンにパッケ
ージ化させうることも示された。ｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１）およびｐＮＬ４−
３−Ｒ−（ＨＩＶ−１−Ｒ−）単独で、およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮとの組
合せでのＨＬｔａｔ細胞の形質移入の４８時間後に培養培地に放出されたビリオ
ンを、超遠心分離によって濃縮し、そして免疫ブロット分析によって試験した（
図８）。ＨＩＶ−２との同時形質移入実験で観察されるとおり、抗−ＳＮ抗体は
、およそ３４から３１ｋＤａまでの２つの主要なＶｐｒ１ＳＮ融合タンパク質を
同定した。これらのタンパク質は、ｐＮＬ４−３およびｐＮＬ４−ｅ−Ｒ−単独
の形質移入によって産生されるビリオンで検出されなかった。ｒＶＴ７システム
での発現から、全長Ｖｐｒ１ＳＮ融合タンパク質は、３４ｋＤａで移行すると予
想された。したがって、３１ｋＤａタンパク質は、開裂産物を表しそうである。
抗−ＳＮ抗体は、１７ｋＤａで移行するタンパク質をも検出した。抗−Ｖｐｒ抗
体は、同時形質移入された細胞から誘導されたビリオンにおける３４および３１
ｋＤａタンパク質を検出した。抗−Ｖｐｒおよび抗−ＳＮ抗体の両方が、最も強
力に３１ｋＤａタンパク質を検出たこと、そして抗−Ｖｐｒ抗体が、抗−ＳＮ抗
体によって認識された１７ｋＤａタンパク質を検出しなかったことは、注目に値
する。これらの結果は、生来のＶｐｒタンパク質がパッケージ化されたビリオン
でさえ、Ｖｐｒ１ＳＮも、多量に組込まれたことをも示す。Ｇａｇモノクローナ
ル抗体は、全てのウイルスペレットで、同様の量のＧａｇタンパク質を検出し、
そしてｐ５５Ｇａｇ前駆体のプロセシングを示した（図８Ｃ）。
【００５８】 Ｖｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ融合タンパク質の開裂が、ＨＩＶプロテアー
ゼにより指向されたことをより直接的に示すために、ウイルスは、１ｕＭのＨＩ
Ｖプロテアーゼ阻害剤Ｌ−６８９，５０２（Ｅ．Ｅｍｉｎｉ博士によって提供さ
れた、メルク・アンド・シーオー．インク．）の存在下で培養されたｐＮＬ４−
３−Ｒ−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＳＸＢＩ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２
ＳＮで形質移入された細胞から濃縮された。予想されるとおり、ビリオンの免疫
ブロット分析は、ｐ５５Ｇａｇの実質的に少ないプロセシングを示した（図９Ａ
）。同様に、Ｌ−６８９，５０２の存在下で産生されたビリオンも、Ｖｐｒ１Ｓ
ＮおよびＶｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の多量の無核種を含んだ（図９Ｂ）。総合
して、これらの結果は、Ｖｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ融合タンパク質が、ウ
イルス構築の間、あるいは構築に続いてプロテアーゼ開裂にかけられることを示
す。
【００５９】 ［実施例１６−ＨＩＶウイルスへのＶｐｒ１−ＣＡＴおよびＶｐｒ−２−ＣＡＴ
融合タンパク質組込み］ Ｖｐｘ２およびＶｐｒ１が、ＨＩＶ粒子に対する別のタンパク質を標的化しう
ることを示すために、全長の７４０ｈｐＣＡＴ遺伝子を、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２
ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮベクター中でＳＮに置換し、それによりｐ
ＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴを生成した（図１
０Ａ）。ｐＮＬ４−３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴ、ｐｎ１４−３−Ｒ−／ｐ
ＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＳＸＢＩ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴを、
ＨＬｔａｔ細胞に同時形質移入させた。対照として、ｐＮＬ４−３、ｐＮＬ４−
３−Ｒ−およびｐＳＸＢＩを、単独で形質移入させた。培養上清から濃縮された
子孫ビリオンを、免疫ブロッティングによって分析した（図１０Ｂおよび１０Ｃ
）。抗−Ｖｐｒ抗体を用いて、４０ｋＤａ融合タンパク質を、ｐＮＬ４−３およ
びｐＮＬ４−３−Ｒ−の両方とのｐＲＬ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴの同時形質移入に
よって誘導されたウイルスペレット中で検出した（図１０Ｂ）。このサイズは、
全長Ｖｐｒ１ＣＡＴ融合タンパク質の推定分子量と一致する。さらに、抗−Ｖｐ
ｒ抗体も、生来のＶｐｒ１タンパク質（ｐＮＬ４−３で形質移入した細胞から誘
導されるビリオンでの１４．５ｋＤａ）の分子量に対応しない１７ｋＤａタンパ
ク質を検出した。同じタンパク質は、抗−ＣＡＴ抗体を用いて毎週確認され、そ
してそれにより、融合タンパク質産物がほとんどのＶｐｒ配列を含むことが示唆
された。非常に似た結果が、ＨＩＶ−２STおよびｐＲＬ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴと
同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から誘導されるビリオンで得られ、そこで、
抗−Ｖｐｘ抗体は、４１および１５ｋＤａタンパク質を検出した（図１０Ｃ）。
これらの結果は、Ｖｐｒ１ＣＡＴおよびＶｐｘ２ＣＡＴ融合タンパク質が、ビリ
オンにパッケージ化されることを示す。しかし、ＳＮ融合タンパク質の場合と同
様に、ＣＡＴ融合タンパク質も、ＨＩＶプロテアーゼによって開裂された（Ｖｐ
ｘ２ＣＡＴ開裂産物は、生来のＶｐｘタンパク質との同時移行のため見えない）
。ＣＡＴ開裂は、免疫ブロットでの全長ＣＡＴ融合タンパク質の密度に基づいて
、集約性が低くみえた。
【００６０】 ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルス粒子の溶解物を、２０ｍＭトリス塩基中
で１：５０に希釈し、そしてＡｌｌｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：８６４−
８６９頁、１９７９年の方法によって、ＣＡＴ活性について分析した。図１０Ｄ
は、Ｖｐｒ１ＣＡＴおよびＶｐｘ２ＣＡＴタンパク質を含むビリオンがＣＡＴ活
性を保有したことを示す。これらの結果は、活性なＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−
ＣＡＴ融合タンパク質のパッケージングを示す。
【００６１】 ［実施例１７−ビリオンに組込まれたＳＮおよびＣＡＴ融合タンパク質は、酵素
的に活性である。］ 機能的に活性なタンパク質を、ウイルス粒子に送達するＶｐｒ１およびＶｐｘ
２の能力は、さらに、スクロース勾配分析によって確認された。ＨＩＶ−２STお
よびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２で同時形質移入さらたＨＬｔａｔ細胞から誘導された
ビリオンは、上述されるとおり、２０−６０％スクロースの線形勾配で沈降され
た。分画を収集し、そしてウイルス性Ｇａｇタンパク質（図１１）および対応の
ＣＡＴ活性（図１１Ｂ）について分析した。ピーク量のＧａｇタンパク質が、分
画６および７（それぞれ、密度１．１６および１．１７）で検出された。同様に
、ピーク量のアセチル化クロラムフェニコール（Ａｃ−ｃｍ）も、分画６および
７で検出された。
【００６２】 ビリオン結合ＳＮ融合タンパク質が、ヌクレアーゼ活性を保持するかどうかも
、示された。ＨＩＶ−１SG3ビリオン含有Ｖｐｒ１ＳＮは、スクロースの線形勾
配での沈降の後に分析された（図１１）。本発明は、ＳＮ融合タンパク質のプロ
テアーゼ開裂が（図７、８および９）、Ｖｐｒ１ＳＮヌクレアーゼ活性を際立っ
て減少させたこと（データは示されず）を示したので、これらの実験は、上に記
述されるとおり、Ｌ−６８９，５０２の存在下でｐＳＧ３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ
１ＳＮで同時形質移入された細胞を培養することによって行われた。セディニメ
ンテッド（ｓｅｄｉｎｉｅｎｔｅｄ）ビリオンの免疫ブロット分析は、分画６お
よび７でのＧａｇのピーク濃度を示し、そしてｐ５５プロセシングを実質的に減
少させた（図１１Ｃ）。ピークＳＮ活性は、最高濃度のウイルスを含有する分画
に関連した（図１１Ｄ）。したがって、これらの結果は、ウイルスプロテアーゼ
による開裂が、融合パートナーを不活性にしうるが、ビリオン組込みそれ自体が
、Ｖｐｒ／Ｖｐｘ融合タンパク質の酵素的活性を終らせないことに証拠を提供す
る。
【００６３】 ［実施例１８−ｇａｇ−ｐｒｏ（ＲＴ−ＩＮマイナス）パッケージングプラスミ
ドの構築および設計］ 数種の異なる攻略法が、Ｇａｇ−Ｐｒｏを発現させるために使用された。同じ
リーディングフレームにＧａｇおよびＰｒｏを置くことで、Ｐｒｏの過剰発現お
よび標識細胞毒性を導く。より小さい欠失した突然変異を含めたＲＴおよびＩＮ
コード領域内での欠失が、それぞれ、Ｇａｇ−ＰｒｏおよびＧａｇ−Ｐｏｌタン
パク質の発現レベルで際立った欠損を起しうることが知られている（Ａｎｓａｒ
ｉ−Ｌａｒｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１１巻：３３２−３３５頁、
１９９５年；Ａｎｓａｒｉ−Ｌａｒｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：
３８７０−３８７５頁、１９９６年；Ｂｕｋｏｖｓｋｙ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７０巻：６８２０−６７２５頁、１９９６年；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ａ．ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：２７２９−２７３６頁、１９９５年；Ｓｃｈｎｅｌｌ
，Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ ９０巻：８４９−８５７頁、１９９７年
）。重要なことだか、これらの環境下で産生されるウイルス粒子は、タンパク質
分解プロセシングが欠けており、そしてＲＴおよびＩＮがトランスで供される場
合でさえ、感染性がない（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−
６１６９頁、１９９４年）。発現およびビリオンに結合したＧａｇ−Ｐｏｌタン
パク質のレベルが減ったことは、明らかに、Ｇａｇ−Ｐｒｏフレームシフトの頻
度における影響のためである。Ｇａｇ−Ｐｏｌフレームシフトは、ＲＴおよびＩ
Ｎの翻訳が終らされるときに際立って影響されはせず、そしてそれは、ウイルス
性ＤＮＡ断片の欠失と異なっている。ＲＴおよびＩＮタンパク質合成が、翻訳終
止コドンによって終らせられる場合に、Ｇａｇ−Ｐｒｏを構成するビリオンは、
成熟し、そしてＲＴおよびＩＮが、トランスで供される場合に、感染性がある（
Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）
。したがって、本発明のＧａｇ−Ｐｒｏパッケージングプラスミドは、好ましく
は、Ｐｒｏの下流の配列の翻訳を終らせる（ＲＴ−ＩＮ）ことによって構築され
る。ＧａｇおよびＰｏｌでの他の突然変異は、それらが、粒子構築および感染性
において、主要な欠損を起さない場合に、トランスレンチウイルスのパッケージ
ングシステムの一部として機能もする。ＲＴの一次アミノ酸残基に翻訳終止コド
ン（ＴＡＡ）を導入することに加えて、少なくとも１つの別の「致命的」突然変
異が、ＲＴおよびＩＮ内に位置決めされる（図１２Ｂ）。この突然変異は、さら
に、パッケージング（ｇａｇ−ｐｒｏ）および酵素的（ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ）プ
ラスミドの間の遺伝子組換えによって、完全なＧａｇ−Ｐｏｌコード領域を再樹
立する見込みを減少させる。終止コドンが、タンパク質の一次アミノ酸残基につ
いての第一コドンで以外の位置で、遺伝子配列内に挿入され、そしてなお、感染
性を避ける有効な手段でありうることが予想される。終止コドンは、翻訳配列の
開始について選択的ではあるが、核酸残基をコードするアミノ酸の前半分で一般
に挿入された終止コドン有効である。ここで使用される場合、致命的な突然変異
は、コードされたポリペプチド配列を、広範なタンパク質の生物学的役割を行う
上で機能的に効果的でなくさせる遺伝子配列内の突然変異に該当する。
【００６４】 Ｇａｇ−Ｐｒｏ発現プラスミド（ｐＣＲ−ｇａｇ−ｐｒｏ）としては、ＣＭＶ
プロモーターおよびＨＩＶ−２Ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）（図１２Ｃ）が挙げ
られる。ＲＲＥは、ｍＲＮＡ阻害配列を含むＨＩＶタンパク質（Ｇａｇ、ＰＲ、
ＲＴ、ＩＮを含めた）の有効な発現に対処する。ＲＴおよびＩＮは、ｐＬＲ２Ｐ
−ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ発現プラスミドとのトランス発現によって供給される（図
１２Ｃ）。このベクターは、トランスで、ＨＩＶ−１ビリオン／ベクターに組込
まれるＶｐｒ−ＲＴ−ＩＮ融合タンパク質を発現し、そしてウイルス性プロテア
ーゼによってタンパク質分解的に加工されて、機能的形態のＲＴ（ｐ５１および
ｐ６６）およびＩＮを生じる（Ｗｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６
１−６１６９頁、１９９４年）。これらの初期の研究は、機能的ＲＴおよびＩＮ
が、別個に供給されうることを示す（Ｖｐｒ−ＲＴおよびＶｐｒ−ＩＮ）（Ｌｉ
ｕ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：７７０４−７７１０頁、１９９７年；Ｗ
ｕ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１９９４年）。
好ましくは、融合タンパク質のＶｐｒ構成要素は、Ｖｐｒ細胞サイクル停止機能
をノックアウトするＨｉｓ７１Ａｒｇ置換を含む。
【００６５】 ［実施例１９−トランスレンチウイルスベクターの産生］ ｐＣＲ−ｇａｇ−ｐｒｏ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮ（酵素的プラスミ
ド）の各々４ｕｇ、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（マーカー遺伝子形質移入プラ
スミド）およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（ｅｎｖプラスミド）を、２９３Ｔセルラ
インに形質移入させた。２９３Ｔ細胞は、それらが、ＨＩＶ粒子／ベクターの高
い力価の保存液を生じ、そして形質移入に鋭敏に感受性があり、そして複数プラ
スミド形質移入を含むので使用された。対照として、並行した実験では、ｐΔ８
．２パッケージングプラスミドも、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌおよびＰＣＭＶ
−ＶＳＶ−Ｇで形質移入された（図１２Ｂ）。ｐΔ８．２プラスミドは、Ｄ．Ｔ
ｒｏｎｏ博士から得られたレンチウイルス・パッケージング・ベクターである。
ｐΔ８．２は、ｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌおよびＰＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇとの形
質移入により、高い力価のベクター保存液を生じる（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻：２６３−２６７頁、１９９６年；Ｓｈａｎｇ，Ｊ．
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９巻：２３４−２３８頁、１９９３年）、（おそよ１
−５×１０5感染性粒子／ｍｌ上清、１５０−８００ｎｇ／ｍｌのｐ２４抗原濃
度で）。形質移入のおよそ７２時間後に、培養上清を回収し、低速遠心分離によ
って区分し、０．４５ミクロンのフィルターで濾過し、そしてＥＬＩＳＡによっ
てｐ２４抗原濃度について分析した。トランスレンチウイルスベクターの力価を
測定するために、２５、５、１および０．２ｕｌの上清保存液を、ＨｅＬａ細胞
およびＩＢ３細胞の培養物を感染させるために使用した。２日後、細胞を、Ｘ−
ｇａｌで染色し、そして正（青色）細胞を、光学顕微鏡を用いて計数した。表３
は、トランスレンチウイルスベクターの力価を示す。その力価は、レンチウイル
スベクターのものより首尾一貫して低い（２−５倍少ない）が、これらの結果は
、トランスレンチウイルスベクターは、２×１０5／ｍｌと同程度に高い力価を
達成しえた。生きている細胞での形質導入の直接試験について、形質導入プラス
ミドは、ＧＦＰ遺伝子／マーカーを含むように構築もされた。（図１２Ｂおよび
１２Ｃ）。トランスレンチウイルスおよびレンチウイルスベクターの保存液は、
上に記述されるとおり産生され、そしてＨｅＬａ細胞を感染させるために使用さ
れた。２日後、細胞を、蛍光顕微鏡によって試験された。図１３および１４は、
それぞれ、トランス−レンチおよびレンチウイルスベクターとの正の遺伝子形質
導入を示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】 ［実施例２０−超遠心分離によるトランスレンチウイルスベクターの濃度］ トランスレンチウイルスベクターが、超遠心分離による濃縮の間じゅう安定で
あるかどうかを試験するために、上清−トランスレンチウイルスベクターは、超
遠心分離（ＳＷ２８、２３，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）により濃縮された。
対照として、上清−レンチウイルスベクターは、同様に濃縮された。両方の力価
は、濃縮の前後の両方に測定された。表４は、我々の結果を示し、そしてトラン
スレンチウイルスベクターが、超遠心分離による濃縮の間安定であることを示す
。
【００６８】
【表４】
【００６９】 ［実施例２１−ＣＦＴＲ遺伝子形質導入のためのトランスレンチウイルスベクタ
ー］ レンチウイルスに基づくベクターは、非分裂細胞を形質導入するそれらの能力
により肺での用途に魅力的である。この特徴的な特性は、ＣＦの遺伝子療法のた
めのレンチウイルスベクターの重要な利益を表しうる。トランスレンチウイルス
ベクターは、ＣＦＴＲ遺伝子を、ＨｅＬａ細胞に送達するために使用された。Ｃ
ＦＴＲ遺伝子を、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩ部位を用いて、ｐＨＲ形質導入プラス
ミドにクローニングさせた（図１５）。トランスレンチウイルスおよびレンチウ
イルス性（対照として）ベクターは、上に記述されるとおり形質移入によって生
成され、そしてスライドカバー上で育成されたＨｅＬａ細胞を形質導入するため
に使用された。２日後、細胞は、ポリクローナル（図１６）およびモノクローナ
ル抗体（図１７）の療法を用いて、免疫蛍光顕微鏡によって試験された。結果は
、ＣＦＴＲ発現および細胞表面でのＣＦＴＲの配置を示す。さらに、ＳＰＱ（ハ
ロゲン化物感受性発蛍光団）によって試験された形質導入したＨｅＬａ細胞は、
ＣＦＴＲ機能を取り戻したことを示した（図１８）。
【００７０】 本発明は、異種融合分子として発現される場合に、外来タンパク質のＨＩＶビ
リオンへのパッケージングを指示するＨＩＶ−１ＶｐｒおよびＨＩＶ−２Ｖｐｘ
の許容性を示した。ＨＩＶプロウイルス性ＤＮＡを用いたトランス相補試験は、
Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質も、複製能のあるウイルスに組み込まれ
たことを示した。さらに、野生型Ｖｐｘおよび／またはＶｐｒタンパク質（図１
６および１７）の存在下での融合タンパク質のパッケージングは、それらのパッ
ケージングを指向するウイルス性シグナルが、融合分子の外来構成要素によって
妨害されないことを示した。同様に、ビリオンに結合したＳＮおよびＣＡＴ融合
タンパク質は、酵素的活性を残した。
【００７１】 ＶＬＰおよびビリオンの免疫ブロット分析に基づいて、本発明は、ビリオン結
合ＣＡＴおよびＳＮ／ＳＮ*の両方が、ウイルス性プロテアーゼによって開裂す
ることが疑わしい。ＣＡＴ中に少なくとも１つの開裂部位、ＳＮ／ＳＮ*タンパ
ク質で２つの開裂部位であるようだ。主要なＳＮ／ＳＮ*開裂産物の計算された
分子量に基づいて、ＳＮ／ＳＮ*が開裂され、それらのＣ末端に近い１つの部位
、および融合タンパク質結合点にかつて近かったようである。Ｖｐｒ１ＳＮおよ
びＶｐｘ２ＳＮの融合タンパク質結合点は、同一でないので、これらの領域は、
ウイルスプロテアーゼに対するそれらの感受性に関して異なる可能性がある。Ｖ
ｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*は、Ｖｐｒ１ＳＮより少ない範囲まで加工されたが（図７お
よび８）、主要な開裂部位は保存されるようである。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２プロテアーゼの両方が、融合パートナー中のプロセシング部位を認識すること
、および開裂を可能にするのに十分な物理的接触があることには疑問がない。こ
れは、免疫ブロットでの開裂産物強度の減少によって、並びにＨＩＶプロテアー
ゼ阻害剤の存在下での酵素的活性が増加されることによって証明される。
【００７２】 Ｖｐｒ１およびＶｐｘ２融合タンパク質が、ＶＬＰおよびビリオンの両方に結
合する能力があることの例示は、一般に、これらのアクセサリータンパク質にお
ける、そしてＨＩＶ組立での研究を促進する。タンパク質構造／機能関係を研究
するために欠失変異体を生じるアプローチは、これが、タンパク質安定性を減少
させるか、またはタンパク質の三次元構造を変化させるので、しばしば、限られ
た価値のものである。Ｖｐｒの場合には、残基７６での単独アミノ酸置換は、感
染細胞におけるそれの発現を不安定化させることが示された。研究は、ｖｐｒお
よびｖｐｘでの欠失突然変異が、発現に続くタンパク質の時期尚早な分解を起す
ことを示した。本発明によって示されるとおり、例えばＳＮまたはＣＡＴとのＶ
ｐｒおよびＶｐｘ変異体タンパク質の融合は、安定性を増加させる。
【００７３】 ビリオンへのＶｐｒ１Ｖｐｘ２ＳＮ融合タンパク質の首尾よくいくパッケージ
ングは、アクセサリータンパク質のためのそれらの使用が、ウイルス性不活性化
を標的にしたことを示す。本発明は、ＶｐｒおよびＶｐｘが、ＳＮを含めたウイ
ルス阻害分子の特異的ターゲティングのためのビヒクルとして役割を果し得るこ
とを示す。ＨＩＶＧａｇと対照的に、ＶｐｒおよびＶｐｘは、ウイルス複製を変
えることなく、比較的容易に操作されうるより小さいタンパク質であり、したが
って、このような抗ウイルス攻略法に対する用途のための相当な多才さを示すビ
ヒクルを表しうる。
【００７４】 ［実施例２２−ＨＩＶアクセサリータンパク質から独立のレンチウイルスへのト
ランスでのＲＴの組込み］ ＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｐｒおよびＶｐｘは、Ｐｒ５５Gag前駆体タ
ンパク質のｐ６部分との特異的相互作用を通してビリオンに組み込まれる（Ｋａ
ｐｐｅｓら、１９９３年；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：２７５９−
２７６４頁、１９９５年；Ｌｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：６８７３−６８７
９頁、１９９５年；Ｐａｘｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻：７２２９７２３
７、１９９３年；Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：６１６１−６１６９頁、１
９９４年）。同様に、ＶｐｒおよびＶｐｘ融合タンパク質（Ｖｐｒ−およびＶｐ
ｘ−ＳＮおよびＣＡＴ）は、野生型ＶｐｒおよびＶｐｘタンパク質のものに類似
して、ｐ６Gagとの特異的相互作用を通してビリオンに組み込まれることが示さ
れた（Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９巻：３３８９−３３９８頁、１９９５年）
。ビリオンへのＶｐｒ−ＲＴ融合タンパク質の組込みについてのＶｐｒの寄与を
分析するために、ＨＩＶ−１プロウイルス性クローンは、ｐ６Gagで突然変異し
、そしてＰＲ（ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagと称される、Ｍｉｎｇｊｕｎ Ｈｕａｎ
ｇによって提供される）は、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒＲＴと、２９３Ｔ細胞に同時形
質移入された。この変異体は、ｐ６Gagの第一アミノ酸残基位置に、ＴＡＡ翻訳
終止コドンを含む。これは、Ｖｐｒビリオン組込みについて要求されるＧａｇ配
列を終らせた。ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagクローンも、ＰＲの活性部位中に変異体
（Ｄ２５Ｎ）をも含有し、そしてそれは、細胞表面膜からのｐ６Gag変異体ウイ
ルスの放出を促進する（Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒら、１９９１年；Ｈｕａｎｇら、
１９９５年）。対照として、ＨＩＶ−１ＰＲ変異体ＰＭ３（Ｋｏｈｌら、１９８
８年）は、同じｐＮＬ４−３親のクローンから誘導され、分析についても含まれ
た。ｐＮＬ４３−Δｐ６Gagで形質移入された細胞培養物から精製された子孫ビ
リオンは、ＰＭ３から誘導されるビリオンと比べて、少ない量ではあるが、検出
可能な量のＲＴタンパク質（Ｖｐｒ−ｐ６６として標識された）を含んだ（図１
９）。細胞溶解液の分析は、配列を確認し、そしてＰＭ３、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ
ＲＴ／ｐＮＬ４３−Δｐ６GagでのＶｐｒ−ＲＴの蓄積、同時形質移入された細
胞と比べた。ＶｐｒS−ＲＴは、追加の対照として含まれ、そしてＶｐｒを、ｐ
ＮＬ４３−Δｐ６Gagとの同時発現によって誘導されるものではなく、ＰＭ３ビ
リオンに有効に組み込むことが示された。野生型Ｖｐｒタンパク質は、Δｐ６Ga g ビリオンに不在でもあった。およそ等しい量のＧａｇタンパク質が、様々のウ
イルスペレットで検出され、それにより類似の量の様々なビリオンが、量的に比
較されたことが確認された。これらの結果は、ＲＴタンパク質は、Ｖｐｒ−ｐ６
指向性相互作用から独立にビリオンに組込まれうることを示す。これらのデータ
は、Ｇａｇ−Ｐｏｌから独立に、トランスでのＲＴの発現（および推論によりＩ
Ｎ）は、それらの組込みおよび機能に十分であることも示す。
【００７５】 ［実施例２３−ＨＩＶアクセサリーから独立のレンチウイルスベクターでのトラ
ンスでのＲＴの発現］ 機能性のＲＴは、Ｖｐｒに対して融合することなくとも、トランスでのそれの
発現により、ＨＩＶ−１ビリオンに組込まれうることが示された（実施例１９）
。トランスで発現されたＲＴが、レンチウイルスベクターにパッケージ化でき、
そしてマーカー遺伝子の形質導入を支持するかどうかを決定するために、ＲＴを
、ＨＩＶ ＬＴＲおよびＲＲＥの制御下でｐＬＲ２Ｐ発現プラスミドに連結し、
それにより、ｐＬＲ２Ｐ−ＲＴ発現プラスミドを生じた。ｐＬＲ２Ｐ−ＲＴ、ｐ
ＨＲ−ＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＨＲＣＭＶ−β−ｇａｌ、およびｐΔ８．２−Ｒ
ＴD185Nは、２９３Ｔ細胞と一緒に形質移入された。ｐΔ８．２−ＲＴD185Nプラ
スミドは、アミノ酸残基位置１８５（Ｄ１８５Ｎ）でＲＴでの点突然変異を含み
、そしてそれは、ポリメラーゼ活性を根絶し、そして遺伝子形質導入を支持する
それの能力を破壊する。対照として、Ｖｐｒ−ＲＴ（ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−ＲＴ
）を、並行実験で、ｐＬＲ２Ｐ−ＲＴに置換させた。別の対照として、ＲＴまた
はＶｐｒ−ＲＴのいずれも供給されなかった。形質移入によって産生されたビリ
オンは、ＨｅＬａ細胞を感染させるために使用された。２日後、形質導入された
正の細胞を計数した。図２０は、Ｖｐｒ−ＲＴおよびＲＴの両方は、トランスで
提供されたときに、ベクター形質導入を支持することを示す。ベクター力価は、
ＲＴが、Ｖｐｒとの融合なしに提供される場合に、約１０分の１にまで減少され
た。これらの結果は、酵素的機能（ＲＴおよびＩＮ）は、Ｇａｇ−Ｐｏｌとは独
立に、トランスで提供されうることを示す。
【００７６】 本発明は、ＶｐｒおよびＶｐｘが、機能的に活性な酵素をＨＩＶビリオンに送
達するビヒクルとして役割を果しうることを示し、そしてそれは、ＳＮのような
抗ウイルス活性を発揮しうるものが含まれる。本発明は、アクセサリータンパク
質標的ウイルス不活性化の概念が、実行可能であることを示した。
【００７７】 本明細書で明記される任意の特許および出版物は、本発明が関与する当業者の
レベルの例示である。これらの特許および出版物は、各個別の出版物が、参照し
て組込まれるべきと特に、そして個別に示されるように同じ範囲まで参照してこ
こに組込まれる。
【００７８】 当業者は、本発明が、対象を行い、そして明記された結末および利点、並びに
そこに固有のものを得るのに十分に適合されていることを容易に理解する。ここ
に記述される方法、手段、処理、分子および特定化合物と共に本実施例は、現在
、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲における制
限として意図されない。請求項の範囲によって定義されるとおり本発明の概念の
中に含まれるここでの変化および他の用途は、当業者に思い出される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ−Ｄは、ｖｐｒ１、ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*、ｖｐｘ２およびｖｐｘ２Ｓ
Ｎ／ＳＮ*発現プラスミドの構築を示す。図１Ａは、ｐＴＭ−Ｖｐｒ１発現プラ
スミドの例示を示す。ＨＩＶ−１YU2ｖｐｒコード領域は、ＰＣＲによって増幅
され、そしてＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩ制限部位でｐＴＭ１に連結された。図１
Ｂは、ｐＴＭ−ｖｐｘ２発現プラスミドの例示を示す。ＨＩＶ−２STｖｐｘコー
ド領域は、ＰＣＲにより増幅され、そしてＮｃｏｌおよびＢｇｌＩＩ／ＳｍａＩ
部位でｐＴＭ１に連結された。図１Ｃは、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ／ＳＮ*発現プ
ラスミドの結合点の例示を示す。ＳＮ／ＳＮ*を含むＳｍａＩ／ＸｈｏＩ ＤＮ
Ａ断片は、ＨｐａＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＴＭ−ｖｐｒ１に連結される。ＨｐａＩお
よびＳｍａＩ部位での平滑末端ライゲーションは、ｖｐｒ翻訳終止コドン（ＴＡ
Ａ）をＴｒｐに変化させ、そしてＣ末端Ｓｅｒを、Ｃｙｓ残基に置換した。図１
Ｄは、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*発現プラスミドの結合点の例示を示す。Ｓ
ＮおよびＳＮ*を含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／Ｘｈ
ｏＩ切断ｐＴＭ−ｖｐｘ２に連結させた。これらのプラスミドの構築で、Ｖｐｘ
Ｃ末端Ａｒｇコドンを、Ｖａｌコドンに変化させ、そしてＳｅｒ残基を、Ｖｐｘ
翻訳終止コドン（ＴＡＡ）の代わりに導入させた。ＢａｍＨＩ部位でのｖｐｘと
ＳＮ／ＳＮ*の融合は、２つのコード領域の間のｐＴＭ１ポリリンカー（二重下
線付き）の短いアミノ酸配列を残した。
【図２】 図２ＡおよびＢは、哺乳類細胞でのＶｐｒ１−およびＶＰＸ２−ＳＮ／ＳＮ*
融合タンパク質の発現を示す。図２Ａは、ｐＴＭ１、ｐＴＭ−ｖｐｒ１、ｐＴＭ
ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*が、ｒＶＴ７を用いた感染の１時間
後にＨｅＬａ細胞に形質移入されたことを示す（ＭＯＩ＝１０）。２４時間後、
細胞溶解物を作成し、そして免疫ブロット分析によって試験した。レプリカのブ
ロットを、抗−Ｖｐｒ１（左）および抗−ＳＮ（右）抗体をプローブとして探索
した。図２Ｂは、ｐＴＭ１、ｐＴＭ−ｖｐｘ２、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐ
ＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*で形質移入された、ｒＶＴ７に感染したＨｅＬａ細胞から
作製されたレプリカのブロットを、抗−Ｖｐｒ２（左）および抗−ＳＮ（右）抗
体をプローブとして探索した。結合した抗体は、製造業者によって記述されると
おりＥＣＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））法によって検出された。
【図３】 図３ＡおよびＢは、Ｖｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＳＮ／ＳＮ*融合タンパク質
がウイルス様粒子（ＶＬＰ）に組込まれることを示す。図３Ａ、ｐＴＭ−ｖｐｒ
１、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ、およびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*単独を用いたＴ７発
現（ｒＶＴ７感染）ＨｅＬａ細胞の形質移入。ｐＴＭ１も、対照のために形質移
入された。培養上清を、形質移入の２４時間後に収集し、遠心分離（１０００Ｘ
ｇ、１０分）により清澄にされ、そして２０％スクロースのクッションで超遠心
にかけられた（１２５，０００Ｘｇ、２時間）。ペレット（ＶＬＰ、中央および
下部パネル）および細胞（上部パネル）を、ローディング緩衝液に溶解させ、そ
してプローブとして抗−Ｖｐｒ１（上部および中央）および抗−Ｇａｇ（下部）
抗体を用いて、免疫ブロット分析によって試験した。図３Ｂ、ｐＴＭ−ｖｐｘ２
、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*単独、ｐＴＭ−ｇａｇ２
と一緒に用いたＴ７発現ＨｅＬａ細胞の形質移入。ペレット（ＶＬＰ、中央およ
び下部パネル）および細胞（上部パネル）を、溶解させ、タンパク質を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって分離させ、そして上に記述されたとおりニトロセルロースに
電気ブロットさせた。レプリカブロットを、抗−Ｖｐｘ２（上部および中央パネ
ル）および抗−Ｇａｇ（下部パネル）抗体をプローブとして探索した。結合抗体
を、ＥＣＬ法を用いて検出させた。
【図４】 図４ＡおよびＢは、ウイルス特異的シグナルが、Ｖｐｒ−およびＶｐｘ−ＳＮ
をＶＬＰに組み込むことを指向することを示す。図４Ａは、ＨＩＶ−１Ｇａｇが
、Ｖｐｒ１ＳＮのパッケージングを指向することを示す。ｒＶＴ７に感染された
（Ｔ７発現）ＨｅＬａ細胞を、ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ単独で、そしてｐＴＭ−ｇ
ａｇ２およびｐＴＭ−ｇａｇ１との組合せで形質移入させた。ペレット（ＶＬＰ
、中央および下部パネル）および細胞（上部パネル）を、形質移入の２４時間後
に作製し、そしてプローブとして抗−Ｖｐｒ１（上部および中央）および抗−Ｇ
ａｇ（下部）抗体を用いて、免疫ブロット分析によって試験した。（Ｂ）ＨＩＶ
−２Ｇａｇは、Ｖｐｘ２ＳＮのパッケージングを指向する。Ｔ７発現ＨｅＬａ細
胞を、ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ単独およびｐＴＭ−ｇａｇ１およびｐＴＭ−ｇａｇ
２と組合せて形質移入させた。ペレット（ＶＬＰ、中央および下部パネル）およ
び細胞（上部パネル）を、形質移入の２４時間後に作製し、そしてプローブとし
て抗−Ｖｐｘ２（上部および中央）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体を用いて、免
疫ブロット分析によって試験した。
【図５】 図５ＡおよびＢは、ＶＬＰへの組込みについてのＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２
ＳＮの拮抗分析を示す。図５Ａは、様々の量のｐＴＭ−ｖｐｒ１（２．５、５お
よび１０ｕｇ）およびｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ（２．５、５および１０ｕｇ）を、
個別に、またはｐＴＭｇａｇ１（１０ｕｇ）と組合せて用いるかのいずれかでの
Ｔ７発現ＨｅＬａ細胞の形質移入を示す。図５Ｂは、ＨｅＬａ細胞が、様々な量
のｐＴＭ−ｖｐｘ２（２．５、５および１０ｕｇ）およびｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ
（２．５、５および１０ｕｇ）を、個別に、またはｐＴＭ−ｇａｇ２（１０ｕｇ
）と組合せて用いるかのいずれかで形質移入されたことを示す。形質移入の２４
時間後、粒子を、スクロースクッションを通した超遠心分離によって濃縮させ、
そして抗−Ｖｐｒ１（Ａ）または抗−Ｖｐｘ２（Ｂ）抗体を用いた免疫ブロッテ
ィングによって分析した。
【図６】 図６Ａ−Ｃは、ＶＬＰに関連したＶｐｒ１ＳＮおよびＶｐｘ２ＳＮタンパク質
のヌクレアーゼ活性を示す。ウイルス様粒子は、スクロースの２０％クッション
を通した超遠心分離（１２５，０００×ｇ、２時間）によって、ｐＴＭ−ｇａｇ
１／ｐＴＭｖｐｒ１ＳＮ、ｐＴＭ−ｇａｇ１／ｐＴＭ−ｖｐｒ１ＳＮ*、ｐＴＭ
−ｇａｇ２／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＴＭｇａｇ２／ｐＴＭ−ｖｐｘ２Ｓ
Ｎ*で同時形質移入されたＴ７発現ＨｅＬａ細胞の培養上清から濃縮された。Ｖ
ｐｒ１−ＳＮおよびＳＮ*（Ｂ）およびＶｐｘ２−ＳＮおよびＳＮ*（Ｃ）を含む
ペレットを、ＰＢＳに再浮遊させた。ヌクレアーゼ反応用緩衝液（１００ｍＭト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１％ＮＰ４０）で、１
０倍希釈を行い、そして１分間煮沸した。５ｕｌの各希釈液を、５００ｎｇのラ
ムダ・ファージＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ断片）を含む１４ｕｌの反応用緩衝液に
添加し、そして２時間、３７℃でインキュベートした。反応産物を、０．８％ア
ガロースゲル上で電気泳動にかけ、そしてＤＮＡを、臭化エチジウム染色により
可視化させた。標準（Ａ）は、精製ストレプトコッカスのヌクレアーゼ（Ａ．Ｍ
ｉｌｄｖａｎによって提供された）をカクテル緩衝液に希釈することによって作
製され、そして分析された。
【図７】 図７Ａ−Ｄは、トランス相補性によるＨＩＶ−２へのＶｐｘ２ＳＮの組込みを
示す。図７Ａは、ｐＬＲ２Ｐｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*発現プラスミドの構築を示す
。ＨＩＶ位の有効な発現を促進するために、ＨＩＶ−２ＬＴＲおよびＲＲＥを、
ｐＴＺ１９Ｕのポリリンカーに操作して、それによりｐＬＲ２Ｐを生じた。ｐＴ
Ｚ１９Ｕポリリンカー内のこれらの構成要素の組織が示される。ＮｃｏＩ／Ｘｈ
ｏＩｖｐｘ２ＳＮおよびｖｐｘ２ＳＮ*（ｖｐｘ２ＳＮ／ＳＮ*）含有ＤＮＡ断片
を、ｐＬＲ２Ｐに連結させ、それによりｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＬＲ
２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*（ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘＳＮ／ＳＮ*）を生じた。図７Ｂは、
ＨＩＶ−２ビリオンとのＶｐｘ２ＳＮの結合を示す。ＨＬｔａｔ細胞の単層培養
を、ＨＩＶ−２STプロウイルス性ＤＮＡ（ｐＳＸＢ１）で形質移入させ、そして
ｐＳＸＢ１／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮおよびｐＳＸＢ１／ｐＴＭ−ｖｐｘ２ＳＮ*
で同時形質移入させた。余剰細胞ウイルスを、２０％スクロースのクッションを
通した超遠心分離（１２５，０００×ｇ、２時間）による形質移入の４８時間後
に培養上清から濃縮させた。ウイルス性ペレットの複写ウエスタンブロットを、
作製し、そして抗−Ｖｐｘ２（左）抗−ＳＮ（中央）および抗−Ｇａｇ（右）抗
体で独立に釣上げた。図７Ｃは、スクロース勾配分析を示す。ｐＳＸＢ１／ｐＴ
Ｍ−ｖｐｘ２ＳＮで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から作製された上清−ウ
イルスのペレットを、ＰＢＳ中に再浮遊させ、２０−６０％線形勾配のスクロー
スに積層させ、そして１２５，０００×ｇで、１８時間遠心分離させた。分画（
０．５ｍｌ）を、試験管の底から収集し、ＰＢＳ中で１：３に希釈し、再沈殿さ
せ、そして免疫ブロット分析用の電気泳動緩衝液に溶解させた。レプリカブロッ
トを、抗−ＳＮ（上部）および抗−Ｇａｇ（下部）抗体をプローブとして探索し
た。分画１は、勾配の底からの第一の収集物を表し、そして分画１９は、最後の
収集物を表す。タンパク質検定の頂点でを除き、唯一の代替分画が示される。図
７Ｄは、ＨＩＶ−２7312AＶｐｒおよびＶｐｘコンピテントウイルスへのＶｐｘ
２ＳＮの組込みを示す。ＨＩＶ−２7312Aプロウイルス性ＤＮＡ（ｐＪＫ）で形
質移入されるか、またはｐＪＫ／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮまたはｐＪＫ／ｐＬ
Ｒ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*で同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞の上清から濃縮さ
れたウイルスを、上に記述されるとおり免疫ブロット分析から作製した。対照と
して含まれるのは、ｐＳＸＢ１／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＳＮ*同時形質移入によ
って誘導されるビリオンである。複写ブロットを、抗−Ｖｐｘ（左）および抗−
Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。
【図８】 図８Ａ−Ｃは、トランス相補性によるＨＩＶ−１ビリオンへのＶｒ１ＳＮの組
込みを示す。ｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１）およびｐＮＬ４−３Ｒ−（ＨＩＶ−１
ｖｐｒ突然変異体）で形質移入されるか、またはｐＮＬ４−３／ｐＬＲ２Ｐ−ｖ
ｐｒ１ＳＮおよびｐＮＬ４−３−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮで同時形質移入さ
れたＨＬｔａｔ細胞から得られる培養上清ウイルスを、上述のとおり免疫ブロッ
ト分析のために作製した。ブロットを、抗−ＳＮ（図８Ａ）、抗−Ｖｐｒ１（図
８Ｂ）および抗−Ｇａｇ（図８Ｃ）抗体をプローブとして探索した。
【図９】 図９は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤によるＶｐｒ１／Ｖｐｘ２−ＳＮプロセシ
ングの阻害を示す。ＨＩＶ−１（ｐＳＧ３）およびＨＩＶ−２（ｐＳＸＢ１）プ
ロウイルス性ＤＮＡを、それぞれ、ｐＬＲ２Ｐｖｐｒ１ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−
ｖｐｘ２ＳＮを用いたＨＬｔａｔ細胞のレプリカ培養に別個に同時形質移入させ
た。各形質移入を含んだ培地の１つの培養物を、１ｕＭのＨＩＶプロテアーゼ阻
害剤Ｌ６９９−５０２で補足した。ビリオンを、２０％スクロースのクッション
を通した超遠心分離により、培養上清から濃縮させ、そして抗−Ｇａｇ（図９Ａ
）および抗−ＳＮ（図９Ｂ）抗体を用いた免疫ブロット分析によって試験した。
【図１０】 図１０Ａ−Ｄは、酵素的に活性なＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＣＡＴ融合タン
パク質のＨＩＶビリオンへの組込みを示す。図１０Ａは、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１
ＣＡＴおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２ＣＡＴ発現プラスミドの結合点の例示を示す
。ＰＣＲで増幅された、ＣＡＴを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、Ｂ
ｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮおよびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２
ＳＡＮに連結させ、それによりＳＮを置換した（図１参照）。この構造は、ｖｐ
ｒ１／ｖｐｘ２ＣＡＴコード領域の間の２つの別のアミノ酸残基（Ａｓｐおよび
Ｌｅｕ、上記黒塗り棒線）を誘導した。図１０Ｂは、Ｖｐｒ１ＣＡＴのＨＩＶ−
１ビリオンへの組込みを示す。ｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１）およびｐＮＬ４−３
Ｒ−（ＨＩＶ−１−Ｒ−）で形質移入されるか、またはｐＮＬ４３／ｐＬＲ２Ｐ
−ｖｐｒ１ＣＡＴおよびｐＮＬ４−３Ｒ−／ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴで同時
形質移入されたＨＬｔａｔ細胞から産生されるウイルスを上述のとおり作製し、
そして免疫ブロット分析によって試験した。レプリカブロットを、抗−Ｖｐｒ１
（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。図１０Ｃは、Ｖ
ｐｘ２ＣＡＴのＨＩＶ−２ビリオンへの組込みを示す。ｐＳＸＢ１（ＨＩＶ−２
）で形質移入されるか、またはｐＳＸＢ１／ｐＬＲ２Ｐｖｐｘ２ＣＡＴで同時形
質移入されたＨＬｔａｔ細胞から産生されるウイルスは、上述のとおり作製され
、そして免疫ブロット分析によって試験された。レプリカブロットを、抗−Ｖｐ
ｘ２（左）および抗−Ｇａｇ（右）抗体をプローブとして探索した。図１０Ｄは
、ビリオンを組込まれたＶｐｒ１−およびＶｐｘ２−ＣＡＴ融合タンパク質は、
酵素的活性を保有することを示す。ｐＳＸＢＩ（ＨＩＶ−２）で形質移入される
か、またはｐＳＸＢ１／ｐＬＲ２Ｐｖｐｘ２ＣＡＴおよびｐＮＬ４−３／ｐＬＲ
２Ｐ−ｖｐｒ１ＣＡＴで同時形質移入されたＨＬｔａｔ細胞からペレット化され
たウイルスを溶解させ、そしてＣＡＴ分析によって試験された。ＨＩＶ−２が、
負の対照として含まれた。
【図１１】 図１１Ａ−Ｄは、酵素的に活性なＣＡＴおよびＳＮ融合タンパク質のビリオン
結合を示す。図１１Ａは、ｐＳＸＢ１およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｘ２で同時形質移
入されたＨＬｔａｔ細胞の培養上清から収集されるＨＩＶ−２ビリオンが、２０
−６０％スクロースの線形勾配で沈殿されたことを示す。０．７ｍｌ分画を収集
し、そしてプローブとしてＧａｇモノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分
析によって分析した。図１１Ｂは、ＣＡＴ酵素活性が、標準法によって各分画で
測定されることを示す。非アセチル化［14Ｃ］クロラムフェニコール（Ｃｍ）お
よびアセチル化クロラムフェニコール（Ａｃ−Ｃｍ）の位置が示される。図１１
Ｃは、ｐＳＧ３およびｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ１ＳＮで同時形質移入され、そしてＬ
６８９，５０２の存在下で培養されたＨＬｔａｔ細胞から由来するＨＩＶ−１ビ
リオンが、２０−６０％スクロースの線形勾配で沈殿されたことを示す。分画を
収集し、そしてＧａｇモノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分析によって
、ウイルス含有量について分析した。図１１Ｄは、ＳＮ活性が、図６で記述され
るとおり各分画で測定されたこをと示す。
【図１２】 図１２Ａ−Ｃは、ＨＩＶ−１ゲノム、ｐΔ８．２、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐ
ＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、ｐＣＲ−ｇａｇ−ｐｒｏ、ｐＬＲ２Ｐ−ｖｐｒ−Ｒ
Ｔ−ＩＮ，ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ＧおよびｐＨＲ−ＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミド
の構築を示す。図１２Ａは、ＨＩＶ−１ゲノムの例を示す。図１２Ｂは、レンチ
ウイルスベクタープラスミド発現システムを示す。図１２Ｃは、ＲＴおよびＩＮ
が、Ｖｐｒ融合パートナーとして隣接するトランスレンチウイルスベクター発現
システムの例を示す。
【図１３】 図１３は、蛍光顕微鏡によって測定されるとおり本発明のトランスレンチウイ
ルスベクターとの正の遺伝子トランスダクションを示す。
【図１４】 図１４は、蛍光顕微鏡によって測定されるとおり対照としてレンチウイルスベ
クターとの正の遺伝子トランスダクションを示す。
【図１５】 図１５は、本発明のｐＨＲ−ＣＦＴＲトランスレンチウイルスベクターの構築
を示す。
【図１６】 図１６は、トランスレンチウイルスベクターを、および対照としてレンチウイ
ルスベクター用いたＨｅＬａ細胞でのＣＦＴＲの発現を示す。トランスダクトし
た細胞を、免疫蛍光顕微鏡でポリクローナル抗体を用いて釣上げた。
【図１７】 図１７は、免疫蛍光顕微鏡でのモノクローナル抗体を用いたＨｅＬａ細胞での
ＣＦＴＲの発現を示す。
【図１８】 図１８は、ハロゲン化物感受性発蛍光団によって測定されるとおり、トランス
レンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞でのＣＦＴＲ機能の保存を示す。
【図１９】 図１９ＡおよびＢは、Ｖｐｒ依存性組込みなしに、トランスでのＲＴの子孫ビ
リオンにおける存在を示す。
【図２０】 図２０は、Ｖｐｒ−ＲＴおよびＲＴの療法が、トランスで供される場合にベク
ター形質導入を支持することを示す。
【図２１】 図２１は、本発明によるトランスレンチウイルスベクターの構成要素構築物を
示す。図２１Ａは、ｐＣＭＶ、Ｇａｇ−Ｐｒｏパッケージングプラスミドを示す
。図２１Ｂは、ｐＣＭＶ、ＧａｇＮＣ−ＲＴ−ＩＮトランス−酵素発現プラスミ
ドを示す。図２１Ｃは、ベクタープラスミドを示す。図２１Ｄは、本発明で操作
性のあるエンベローププラスミド構築物を示す。
【図２２】 図２２は、本発明によるレトロウイルスベクターの構成要素構築物を示す。図
２２Ａは、ｐＣＭＶ、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−ＲＴ−ＩＮレトロウイルス性パッケージ
ングプラスミドを示す。図２２ＢおよびＣは、それぞれ、図２１ＣおよびＤのベ
クタープラスミドおよびエンベローププラスミドである。
【図２３】 図２３は、本発明によるレンチウイルスベクターの構成要素構築物を示す。図
２３Ａは、ｐＴＲＥ、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−ＲＴ−ＩＮパッケージングプラスミドを
示す。図２３Ｂは、ｐＨＲ−ＣＴＳ、ＣＭＶ、ＧＦＰ、ＷＰＲＥレンチウイルス
ベクタープラスミドを示す。図２３Ｃは、図２１Ｄでのエンベローププラスミド
である。
【図２４】 図２４Ａ−Ｃは、Ｐｒｏ切断部位およびジンクフィンガー位置を示す、本発明
による代表的トランスレンチウイルストランス酵素プラスミドを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA14 BA32 BA35 CA04 CA07 DA02 EA02 FA02 GA11 GA18 HA03 HA17 HA20

Claims (53)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも
    １の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも
    １つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントを含む
    トランスレンチウイルスベクターシステムであって、前記セグメントは、哺乳動
    物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作用で
    発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記細胞内で産生され
    るトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／または前記インテ
    グラーゼの取り込みをもたらすことができる、トランスレンチウイルスベクター
    システム。
  2. 【請求項２】 少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテ
    アーゼの機能性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントをさら
    に含み、前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドま
    たは前記第１のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２の
    セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に
    対してトランス作用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前
    記機能性部分が、ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切
    断を行う、請求項１に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  3. 【請求項３】 ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む
    少なくとも１の第３の核酸セグメントをさらに含み、前記第３のセグメントが前
    記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストラ
    ンドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核
    酸ストランド上に設けられる、請求項２に記載のトランスレンチウイルスベクタ
    ーシステム。
  4. 【請求項４】 少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含
    む少なくとも１の第４の核酸セグメントをさらに含み、前記第４のセグメントが
    、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列を
    さらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物
    が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸
    配列をさらに含む、請求項３に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム
    。
  5. 【請求項５】 核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内へ
    の形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項４に記載のトランスレン
    チウイルスベクターシステム。
  6. 【請求項６】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよび
    ＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項５に記載のトランスレンチウイルス
    ベクター。
  7. 【請求項７】 前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの前
    記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来する
    、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  8. 【請求項８】 前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ
    、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される請求項７に記載のトランスレン
    チウイルスベクターシステム。
  9. 【請求項９】 （ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少な
    くとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少な
    くとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメント
    であって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイ
    ルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性
    部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記
    逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことができ
    る、少なくとも１の第１の核酸セグメントと、 （ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能
    性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２
    のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセ
    グメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺
    乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作
    用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、
    ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の
    核酸セグメントと を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
  10. 【請求項１０】 ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含
    む少なくとも１の第３の核酸セグメントをさらに含み、前記第３のセグメントが
    前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸スト
    ランドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ
    核酸ストランド上に設けられる、請求項９に記載のトランスレンチウイルスベク
    ターシステム。
  11. 【請求項１１】 少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を
    含む少なくとも１の第４の核酸セグメントをさらに含み、前記第４のセグメント
    は、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列
    をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産
    物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核
    酸配列をさらに含む、請求項１０に記載のトランスレンチウイルスベクターシス
    テム。
  12. 【請求項１２】 核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内
    への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項１１に記載のトランス
    レンチウイルスベクターシステム。
  13. 【請求項１３】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよ
    びＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項１２に記載のトランスレンチウイ
    ルスベクター。
  14. 【請求項１４】 前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの
    前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来す
    る、請求項９〜１１のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステ
    ム。
  15. 【請求項１５】 前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩ
    Ｖ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される、請求項１４に記載のトラン
    スレンチウイルスベクターシステム。
  16. 【請求項１６】 （ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少
    なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少
    なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも第１の核酸セグメントで
    あって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイル
    ス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部
    分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆
    転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことができる
    、第１の核酸セグメントと、 （ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能
    性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２
    のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセ
    グメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺
    乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作
    用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、
    ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の
    核酸セグメントと、 （ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１
    の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグ
    メントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第
    １の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に
    設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントと を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を
    含む少なくとも１の第４の核酸セグメントをさらに含み、前記第４のセグメント
    は、パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列
    をさらに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産
    物が宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核
    酸配列をさらに含む、請求項１６に記載のトランスレンチウイルスベクターシス
    テム。
  18. 【請求項１８】 核酸プロモーター配列と、前記第４のセグメントの細胞内
    への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請求項１７に記載のトランス
    レンチウイルスベクターシステム。
  19. 【請求項１９】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよ
    びＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項１８のトランスレンチウイルスベ
    クター。
  20. 【請求項２０】 前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの
    前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来す
    る、請求項１６または１７のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクター
    システム。
  21. 【請求項２１】 前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩ
    Ｖ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される、請求項２０に記載のトラン
    スレンチウイルスベクターシステム。
  22. 【請求項２２】 （ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少
    なくとも１の逆転写酵素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少
    なくとも１つの融合タンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメン
    トであって、前記セグメントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウ
    イルス核酸配列に対してトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能
    性部分はさらに、前記細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前
    記逆転写酵素および／または前記インテグラーゼの取り込みをもたらすことがで
    きる、第１の核酸セグメントと、 （ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能
    性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２
    のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセ
    グメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺
    乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作
    用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、
    ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、第２の
    核酸セグメントと、 （ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１
    の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグ
    メントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第
    １の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に
    設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントと、 （ｄ）少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも
    １の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントは、パッケージング
    、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記
    第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核
    酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む
    、少なくとも１の第４の核酸セグメントと、 を含むトランスレンチウイルスベクターシステム。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の（ｄ）に関して、核酸プロモーター配
    列と、前記第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさら
    に含む、請求項２２に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  24. 【請求項２４】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよ
    びＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項２３のトランスレンチウイルスベ
    クター。
  25. 【請求項２５】 前記Ｇａｇタンパク質および／または前記プロテアーゼの
    前記機能性部分がレトロウイルスのＧａｇ配列およびプロテアーゼ配列に由来す
    る請求項２２に記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  26. 【請求項２６】 前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩ
    Ｖ、ＦＩＶおよびＭＬＶからなる群から選択される、請求項２５に記載のトラン
    スレンチウイルスベクターシステム。
  27. 【請求項２７】 前記タンパク質が少なくともウイルスアセンブリーおよび
    核酸パッケージングに関してトランス作用で発現したときに、前記融合タンパク
    質が、レトロウイルスビリオン、ビリオン様粒子またはトランスレンチベクター
    粒子に取り込まれ得る、請求項１、９、１６または２２のいずれかに記載のトラ
    ンスレンチウイルスベクターシステム。
  28. 【請求項２８】 前記（ａ）の核酸セグメントが、発現可能なｒｅｖタンパ
    ク質をコードするｒｅｖ核酸配列をさらに含む請求項１、９、１６または２２の
    いずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  29. 【請求項２９】 薬学的に受容可能な担体と関連して前記ベクターの効果的
    な量を含み、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の感染性を低下させることができる、
    請求項１、９、１６または２２のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベク
    ターシステム。
  30. 【請求項３０】 前記第４のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第
    ４のセグメントとは異なる核酸ストランド上に設けられる核酸セグメントであっ
    て、マーカータンパク質をコードする遺伝子を含む核酸セグメントをさらに含み
    、前記遺伝子が、β−ｇａｌ、蛍光タンパク質およびルシフェラーゼからなる群
    から選択される、請求項４、１１、１７または２２のいずれかに記載のトランス
    レンチウイルスベクターシステム。
  31. 【請求項３１】 前記目的タンパク質をコードする前記配列が前記第４のセ
    グメント上に設けられ、前記コードされるタンパク質が、ウイルス阻害性タンパ
    ク質および治療タンパク質からなる群から選択される、請求項４、１１、１７ま
    たは２２のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  32. 【請求項３２】 （ａ）と同じ核酸ストランドまたは（ａ）とは異なる核酸
    ストランド上に設けられる核酸セグメントであって、ｇａｇ、エンベロープ、ｎ
    ｅｆおよびｖｉｆからなる群から選択されるウイルス遺伝子に由来する抗原タン
    パク質をコードする遺伝子を含む核酸セグメントをさらに含む、請求項１、９、
    １６または２２のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステム。
  33. 【請求項３３】 前記コードされる目的タンパク質が、ネオマイシン、ヒグ
    ロマイシンおよびピューロマイシンからなる群から選択される細菌の耐性タンパ
    ク質である、請求項４、１１、１７または２２のいずれかに記載のトランスレン
    チウイルスベクターシステム。
  34. 【請求項３４】 前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、
    前記第３の核酸セグメントまたは前記第４の核酸セグメントの少なくとも１つに
    作動可能に結合されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが、ＨＩＶ
    プロモーター、非ＨＩＶプロモーター、構成的プロモーターおよび誘導性プロモ
    ーターからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１、４、９、１１、１
    ６、１７または２２のいずれかに記載のトランスレンチウイルスベクターシステ
    ム。
  35. 【請求項３５】 前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、
    前記第３の核酸セグメントまたは前記第４の核酸セグメントの少なくとも１つに
    作動可能に結合されたポリＡシグナルをさらに含み、前記ポリＡが、非ＨＩＶポ
    リＡ、ＳＶ４０ポリＡおよび非レンチウイルスポリＡからなる群から選択される
    、請求項４、１１、１７または２２のいずれかに記載のトランスレンチウイルス
    ベクターシステム。
  36. 【請求項３６】 トランスレンチウイルスベクターシステムを産生する方法
    であって、 （ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵
    素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タ
    ンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグ
    メントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対し
    てトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記
    細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／
    または前記インテグラーゼの取り込みをもたらし得る、第１の核酸セグメントを
    提供するステップと、 （ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能
    性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２
    のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセ
    グメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺
    乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作
    用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、
    ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、少なく
    とも１の第２の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む第３の核酸セ
    グメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグメントおよび前
    記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第１の核酸セグメ
    ントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に設けられる、少
    なくとも１の第３の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｄ）前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前記核酸を哺乳動物細胞と接触させ、
    前記細胞を前記核酸でトランスフェクションするステップと （ｅ）前記融合タンパク質を含有するウイルス粒子を前記細胞から産生させるス
    テップと を含む方法。
  37. 【請求項３７】 少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を
    含む少なくとも１の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントは、
    パッケージング、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさ
    らに含み、前記第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が
    宿主ゲノムの核酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配
    列をさらに含む、少なくとも１の第４の核酸セグメントを提供するステップを含
    む、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記第４のセグメントが、核酸プロモーター配列と、前記
    第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請
    求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよ
    びＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 トランスレンチウイルスベクターシステムを作製する方法
    であって、 （ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵
    素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タ
    ンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグ
    メントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対し
    てトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記
    細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／
    または前記インテグラーゼの取り込みをもたらし得る、少なくとも１の第１の核
    酸セグメントを提供するステップと、 （ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能
    性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２
    のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセ
    グメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺
    乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作
    用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、
    ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、少なく
    とも１の第２の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｃ）少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも
    １の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントは、パッケージング
    、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記
    第３のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核
    酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む
    、少なくとも１の第３の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｄ）前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前記核酸を哺乳動物細胞と接触させ、
    前記細胞を前記核酸でトランスフェクションするステップと、 （ｅ）前記融合タンパク質を含有するウイルス粒子を前記細胞から産生させるス
    テップと を含む方法。
  41. 【請求項４１】 ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含
    む少なくとも１の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントが前記
    第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストラン
    ドまたは前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸
    ストランド上に設けられる、少なくとも１の第４の核酸セグメントを提供するス
    テップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記第３のセグメントが、核酸プロモーター配列と、前記
    第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請
    求項４０に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよ
    びＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 トランスレンチウイルスベクターシステムを作製する方法
    であって、 （ａ）少なくとも１のＧａｇタンパク質の機能性部分と少なくとも１の逆転写酵
    素および／またはインテグラーゼの機能性部分とを含む少なくとも１つの融合タ
    ンパク質をコードする少なくとも１の第１の核酸セグメントであって、前記セグ
    メントは、哺乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対し
    てトランス作用で発現することができ、Ｇａｇの前記機能性部分はさらに、前記
    細胞内で産生されるトランスレンチウイルス粒子内への前記逆転写酵素および／
    または前記インテグラーゼの取り込みをもたらし得る、少なくとも１の第１の核
    酸セグメントを提供するステップと、 （ｂ）少なくとも１のＧａｇの機能性部分と少なくとも１のプロテアーゼの機能
    性部分とをコードする少なくとも１の第２の核酸セグメントであって、前記第２
    のセグメントが前記第１のセグメントと同じ核酸ストランドまたは前記第１のセ
    グメントとは異なる核酸ストランド上に設けられ、前記第２のセグメントは、哺
    乳動物細胞において、前記細胞に存在するウイルス核酸配列に対してトランス作
    用で発現することができ、前記Ｇａｇおよびプロテアーゼの前記機能性部分が、
    ＲＮＡのパッケージング、粒子形成およびタンパク質分解的切断を行う、少なく
    とも１の第２の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｃ）ウイルスのエンベロープ遺伝子をコードする核酸配列を含む少なくとも１
    の第３の核酸セグメントであって、前記第３のセグメントが前記第１の核酸セグ
    メントおよび前記第２の核酸セグメントとは異なる核酸ストランドまたは前記第
    １の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメントと同じ核酸ストランド上に
    設けられる、少なくとも１の第３の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｄ）少なくとも１つの目的タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも
    １の第４の核酸セグメントであって、前記第４のセグメントは、パッケージング
    、逆転写および組み込みのためにシス的に作用する核酸配列をさらに含み、前記
    第４のセグメントは、該セグメントの逆転写されたＤＮＡ産物が宿主ゲノムの核
    酸配列に組み込まれることを支援し得る十分な長末端反復核酸配列をさらに含む
    、第４の核酸セグメントを提供するステップと、 （ｅ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の核酸を哺乳動物細胞と接触さ
    せ、前記細胞を前記核酸でトランスフェクションするステップと、 （ｆ）前記融合タンパク質を含有するウイルス粒子を前記細胞から産生させるス
    テップと を含む方法。
  45. 【請求項４５】 前記第４のセグメントが、核酸プロモーター配列と、前記
    第４のセグメントの細胞内への形質導入を促進する核酸配列とをさらに含む、請
    求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記形質導入を促進する核酸配列が、ＰＰＴ−ＣＴＳおよ
    びＷＰＲＥからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記（ａ）の核酸セグメントがｒｅｖタンパク質をさらに
    コードする、請求項３６または４０に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 薬学的に受容可能な担体と関連して前記ベクターの効果的
    な量を含み、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の感染性を低下させることができる、
    請求項３７、４０または４４に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記第４のセグメント上に設けられる核酸セグメントであ
    って、マーカータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸セグメントをさらに
    含み、前記マーカータンパク質が、β−ｇａｌ、蛍光タンパク質およびルシフェ
    ラーゼからなる群から選択される、請求項３７、４０または４４に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記第４の核酸セグメントが、ウイルス阻害性タンパク質
    および治療タンパク質からなる群から選択される目的タンパク質をコードする、
    請求項３７、４０または４４に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記第４の核酸セグメントが、ネオマイシン、ヒグロマイ
    シンおよびピューロマイシンからなる群から選択される少なくとも１つの薬物耐
    性タンパク質をコードする、請求項３７、４０または４４に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記第１の核酸セグメントおよび前記第２の核酸セグメン
    トの少なくとも１つに作動可能に結合されたプロモーターであって、ＨＩＶプロ
    モーター、非ＨＩＶプロモーター、構成的プロモーターおよび誘導性プロモータ
    ーからなる群から選択される核酸配列を含むプロモーターを提供するステップを
    さらに含む、請求項３７、４０または４４に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記第１の核酸セグメント、前記第２の核酸セグメント、
    前記第３の核酸セグメントまたは前記第４の核酸セグメントの少なくとも１つに
    作動可能に結合されたポリＡシグナルであって、非ＨＩＶポリＡ、ＳＶ４０ポリ
    Ａおよび非レンチウイルスポリＡからなる群から選択されるポリＡを提供するス
    テップをさらに含む、請求項３７、４０または４４に記載の方法。
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