JP2003518514A - マクロファージ活性を阻害するための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、マクロファージの自己免疫疾病への関与を防止するための、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との間の相互作用を阻害することができる作用物質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、自己免疫疾病へのマクロファージの関与を阻害するための組成物、
および自己免疫へのマクロファージの関与におけるこのような組成物の使用に関
する。

【０００２】発明の背景 細胞増殖、活性化、分化、成長および生存は、多くの細胞外因子の影響を受け
る。免疫系および神経系において、このような細胞外因子としては、ケモカイン
類、細胞外マトリックスおよび隣接する細胞等が挙げられる。特異的細胞表面受
容体と、これらの因子との相互作用は、細胞内機構を刺激して、応答させる情報
伝達カスケードを始動させる。ＳＩＲＰ(シグナル制御タンパク質）ファミリー
は、最近、成長因子およびインスリンに対する細胞性応答を調節する一群の細胞
表面タンパク質として記述された(Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．
（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８６：１８１）。ＳＩＲＰの細胞外構造は、接
着分子および免疫受容体に共通のドメインが存在することを示す。免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）ドメインが存在することから、ＳＩＲＰは、特異的調節リガンドと相
互に作用して、その制御作用を達成することが示唆される。

【０００３】 最近、ＣＤ４７（インテグリン結合蛋白質、またはＩＡＰとしても知られる）
が、ＳＩＲＰファミリーのメンバーである、ネズミ神経接着分子のリガンドとし
て同定された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７４：５５９）。発現クローニング法を使用して、Ｊｉａｎｇらは、ＣＤ
４７が、Ｐ８４の主要な結合結合パートナーであることを証明することができた
。さらに、Ｓａｒｆａｔｉ（Ｗ０９９／４０９４０）は、ＣＤ４７のリガンドは
、自己免疫疾病の治療に有用な可能性があると考えた。この見解は、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで、Ｔ細胞および単球を用いて実施された実験結果に基づいており、（ｉ
）単球によるプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−２を含む）産生の阻害、およびＴ
−細胞によるＩＬ−２応答性の、ＣＤ４７またはＣＤ４７リガンドライゲーショ
ンによる阻害によって、慢性障害に対する新しい治療方式が根拠とし得る炎症反
応のダウンレギュレーションを可能にすることができる、（ｉｉ）Ｔｈ−１細胞
への分化および非反応性細胞またはアネルギー性細胞の産生の阻害は、臓器移植
または骨髄移植における同種移植片寛容を誘導するための、新規な方法を開発す
る基礎となり得る、（ｉｉｉ）ＣＬＬ患者を治療するための、ＣＤ−４７のリガ
ンドを開発することが可能である、（ｉｖ）ＣＤ４７ライゲーションによるＩｇ
Ｅ合成の阻害を利用して、ＩｇＥ介在性アレルギー性疾病を治療することが可能
である、という仮説を裏付けると、Ｗ０９９／４０９４０で力説されている。

【０００４】 これらの脱髄性障害におけるＣＮＳに見られる炎症性変化を考えれば、囓歯類
におけるＴ−細胞介在性自己免疫疾病である、実験的アレルギー性脳脊髄炎（Ｅ
ＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）に適した動物モデルとして受け入れられる。Ｅ
ＡＥは、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント等の強力なアジュバントの存在下で、
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を足蹠に注入することによって、マウスま
たはラットで誘導することができる。およそ１２日後、易罹患性動物は、免疫系
細胞の神経系への浸潤に起因する一連の神経学的症状を示す。ルイス系統等の、
ラットにおける疾病の通常の進行は、尾がだらっとし、後肢が麻痺し、最も重症
の場合には、ラットは失禁するという具合である。この疾病は、１（だらっとし
た尾）から５（失禁）までの得点が与えられる。この疾病は、通常、自然治癒し
、注入後約１８日で、ラットは回復する。

【０００５】発明の概要 我々は、以下に記載の通り、ＣＤ４７が、ＳＩＲＰ１α ＯＸ４１のリガンド
であることを確認した。ＯＸ４１は、当初、マクロファージに対して生じた抗体
を使用してクローニングした（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ５７：２３９−２４７）。ＯＸ４１の発現に関する広範囲の研究によ
って、ＯＸ４１は、マクロファージ、単球、顆粒球、樹状細胞およびニューロン
上に発現することが明らかにされた（Ａｄａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１８５３−９）。この観察結果に基づいて、我々
は、マクロファージ上でのＣＤ４７−ＯＸ４１相互作用を阻害することができる
物質は、マクロファージの関与を示す自己免疫疾病の重症度を有意に制限できる
という結論を下した。

【０００６】 従って、本発明の第１の態様では、マクロファージＳＩＲＰ１αとＣＤ４７と
の間の相互作用を阻害することができる作用物質を、マクロファージの自己免疫
疾病への関与を阻害するための組成物の調製に使用することができる。

【０００７】 マクロファージＳＩＲＰ１αは、マクロファージ上に存在するＳＩＲＰ１αペ
プチドであり、ラットでは、ＯＸ４１として知られる。このペプチドを、ＣＤ４
７／ＩＡＰで刺激すると、自己免疫疾病においてマクロファージの活性化を来た
すと推定される。

【０００８】 我々は、マクロファージＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との相互作用を阻害すること
によって、ＥＡＥ等の自己免疫病の重症度を有意に下げるかまたは防止すること
ができることを発見した。従って、我々は、ＳＩＲＰ１αは、自己免疫疾病中の
マクロファージ活性化において、重要な役割を果たすと推定した。

【０００９】 本明細書で使用する、「ＳＩＲＰ１α」、「ＯＸ４１」および「ＣＤ４７」は
、天然のタンパク質の特性を保持する、その突然変異体、たとえば、保存的アミ
ノ酸置換、付加または欠失を含む突然変異体、またはそのフラグメント、たとえ
ば、個々のドメインを含む、天然のタンパク質の変異形を含む。たとえば、ＳＩ
ＲＰ１αの細胞外メインは、ＣＤ４７への結合に関与するこのタンパク質の領域
を含むため、本発明によるアッセイに使用することが可能である。同様に、ＣＤ
４７のドメインを、当技術分野で周知の方法に従って単離し、単独で、または融
合タンパク質の形態で、本発明で使用することが可能である。

【００１０】 作用物質は、２種のタンパク質間の相互作用を阻害することができる、ＳＩＲ
Ｐ１αまたはＣＤ４７のリガンドであることが好ましい。たとえば、作用物質は
、ＣＤ４７またはＳＩＲＰ１αのいずれかの、不活性な模倣物または突然変異体
であってもよい。しかし、作用物質は、ＣＤ４７またはＳＩＲＰ１αに結合する
ことができ、ＣＤ４７／ＳＩＲＰ１α相互作用を阻害することができる抗体であ
ることが好ましい。

【００１１】 本明細書で使用する「作用物質」は、必要な機能、すなわち、ＣＤ４７／ＳＩ
ＲＰ１α結合の阻害、を達成することができる、実質的に任意の分子あるいは方
法であってよい。様々なタイプの阻害分子が当技術分野で知られており、本発明
による作用物質をデザインするための基礎として使用することができる。好まし
い作用物質は、当技術分野で周知の技術を使用することで、以下に記載の通りに
容易に調製して試験することが可能な抗体または抗体フラグメントである。

【００１２】 ＣＤ４７／ＳＩＲＰ１α相互作用を「阻害すること」は、ＣＤ４７による、マ
クロファージに対する活性化作用を低減または除去させるように、２分子間の機
能的関係を変えることを意味する。たとえば、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との間の
生物学的相互作用を低減または変化させてもよい。あるいは、２種のタンパク質
の結合を阻害または防止してもよい。

【００１３】 「マクロファージの関与を阻害すること」は、同様に、自己免疫疾病における
マクロファージの役割および／または作用の低減または防止を指す。たとえば、
本発明の方法で、ＣＤ４７によるマクロファージ活性化を防止または低減するこ
とが可能である。

【００１４】 「自己免疫疾病」は、当技術分野における通常の意味で使用される、すなわち
、免疫系が「自己」標的を攻撃することによって有害な役割を果たす疾病または
疾病の成分を指す。自己免疫疾病の例としては、多発性硬化症、関節炎および炎
症性腸疾病などが挙げられる。

【００１５】 さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ４７とＳＩＲＰ１αとの間の相互
作用を阻害する作用物質の有効量を、哺乳動物に投与することを含む、マクロフ
ァージが関与した自己免疫疾病を治療する方法に関する。

【００１６】 本明細書で言及する、自己免疫疾病の「治療」は、上記自己免疫疾病の症状お
よび／または原因の軽減または除去を含む。

【００１７】 さらなる実施形態において、本発明は、１つ以上の試験化合物を、ＣＤ４７お
よび／またはＳＩＲＰ１αに曝露するステップと、試験化合物がそれらの相互作
用を阻害できる力をモニタリングするステップとを含む、ＣＤ４７とＳＩＲＰ１
αとの間の相互作用を阻害することができる作用物質を同定する方法に関する。
本アッセイは、多数の方式で設計することが可能である。たとえば、本アッセイ
における第１のステップは、その化合物が、ＣＤ４７またはＳＩＲＰ１αに結合
すことができるかどうか、すなわち、ＳＩＲＰ１αリガンドまたはＣＤ４７リガ
ンドであるかどうかを決定することにあってもよい。第２のステップでは、ＳＩ
ＲＰ１α／ＣＤ４７相互作用を阻害できる力について、ＣＤ４７リガンドまたは
ＳＩＲＰ１αリガンドを評価してもよい。あるいは、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７と
の間の相互作用を調節することができる力について、化合物を直接試験してもよ
い。

【００１８】 従って、本発明によれば、化合物、たとえば、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との間
の相互作用を調節することができる医薬用の最重要化合物を同定するための標的
として、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７が使用される。従って、本発明は、 （ａ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７を、評価すべき化合物類と共にインキュベー
トするステップと、 （ｂ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に結合する化合物を同定するステップと、 （ｃ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に結合する化合物を、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４
７との間の相互作用を調節することができる力について評価するステップと、 を含む、アッセイに関し、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との相互作用を、直接または
間接的に、調節することができる化合物を同定する方法を提供する。ＳＩＲＰ１
αとＣＤ４７との間の相互作用が、細胞ベースのアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏ
で、評価されることが有利である。

【００１９】発明の詳細な説明 １．ＳＩＲＰ１α／ＣＤ４７相互作用を阻害する作用物質 １ａ．ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合性化合物 本発明のこの態様の第１の実施形態によれば、本アッセイは、ＣＤ４７または
ＳＩＲＰ１αに直接結合するポリペプチドを検出するように設計される。

【００２０】 従って、本発明は、 （ａ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７と、評価すべき化合物および化合物類とをイ
ンキュベートするステップと、 （ｂ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に結合する化合物を同定するステップと、 を含む、ＣＤ４７−ＳＩＲＰ１α相互作用のモジュレーターを同定する方法を提
供する。

【００２１】 本方法は、 （ｃ）ＳＩＲＰ１α−ＣＤ４７相互作用を調節できる力について、ＳＩＲＰ１α
またはＣＤ４７に結合する化合物を、細胞ベースのアッセイで評価するステップ
をさらに含むことが好ましい。

【００２２】 当業者に周知のいずれかの技術で、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７への結合を評
価することが可能である。適当なアッセイの例としては、ｉｎ ｖｉｖｏで相互
作用を測定する、２ハイブリッドアッセイシステム、たとえば、カラム上に固定
されたポリペプチドへの結合を含む、アフィニティクロマトグラフィアッセイ、
化合物とＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７との結合が、結合対における一方または両
方のパートナーの蛍光の変化と関連している蛍光アッセイ、表面プラスモン共鳴
分析等々が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞で実施されるアッセイ、たとえ
ば、２−ハイブリッドアッセイ等が好ましい。２−ハイブリッドアッセイで使用
される結合対は、ＣＤ４７およびＳＩＲＰ１αに基づいてもよいため、このよう
なアッセイは、ＣＤ４７−ＳＩＲＰ１α相互作用を同時に評価するように設計す
ることが可能である。

【００２３】 従って、本発明は、 試験すべき化合物が存在しなければ、ＣＤ４７がＳＩＲＰ１αと基準アフィニ
ティで結合する条件で、試験すべき化合物を、ＳＩＲＰ１αおよびＣＤ４７と共
にインキュベートするステップと、 試験すべき化合物の存在下で、ＳＩＲＰ１αに対するＣＤ４７の結合アフィニ
ティを決定するステップと、 基準結合アフィニティに関して、ＳＩＲＰ１αに対するＣＤ４７の結合アフィ
ニティを調節する化合物を選択するステップと、 を含む、自己免疫疾病へのマクロファージの関与を治療するのに有用な医薬の最
重要化合物を同定する方法も提供する。

【００２４】 このような方法は、試験化合物が、ＣＤ４７／ＳＩＲＰ１α相互作用を調節で
きる力を決定するが、その化合物が、相互作用を機能レベルで制御できる力を評
価しない。このようなアッセイは、ＳＩＲＲＰ１αの活性化が確認できるシステ
ムに基づくことが好ましい。

【００２５】 ＳＩＲＰ１αのＮ末端ドメインは、ＣＤ４７との結合に関与する。従って、Ｓ
ＩＲＰ１αと相互に作用する作用物質は、そのＮ末端と相互に作用することが好
ましい。

【００２６】 １ｂ．機能的ＣＤ４７−ＳＩＲＰ１α相互作用を調節する化合物 さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ４７とＳＩＲＰ１αとの間の機能
的相互作用を検出するように設計することが可能である。このような相互作用は
、試験すべき化合物の存在下で、この情報伝達分子が、ＣＤ４７に応答して、そ
れ自体が活性化されることにより、ＳＩＲＰ１αの制御レベルで生じるか、また
は、マクロファージまたはＳＩＲＰ１αを発現する他の細胞に対するＣＤ４７の
生物学的作用の調節レベルで生じる。本明細書で使用する、「活性化」および「
不活化」は、化合物の、酵素的なまたは別の、活性の調節を含む。

【００２７】 ＣＤ４７とＳＩＲＰ１αとの間の機能的相互作用の調節を検出するアッセイは
、細胞ベースのアッセイであることが好ましい。たとえば、本アッセイは、ＣＤ
４７−ＳＩＲＰ１α相互作用に起因する活性化の程度を示す、ＳＩＲＰ１αによ
る情報伝達活性の評価に基づいてもよい。

【００２８】 好ましい実施形態において、ＳＩＲＰ１αをコードする核酸をベクターにライ
ゲートし、適当な宿主細胞に導入して、ＳＩＲＰ１αを発現する形質転換細胞系
を生成する。次いで、このようにして得られる細胞系を、ＣＤ４７−ＳＩＲＰ１
α相互作用に影響を及ぼす潜在的化合物の作用の、再現性のある定性分析および
／または定量分析のために、生成することができる。あるいは、ＳＩＲＰ１αを
自然に発現する細胞、たとえば、マクロファージを、同じ目的で使用してもよい
。

【００２９】 従って、たとえば、ＣＤ４７のＳＩＲＰ１αへの結合を調節する化合物、特に
低分子量化合物の同定に、ＳＩＲＰ１α発現細胞を使用することが可能である。

【００３０】 レポータータンパク質、すなわち、容易にアッセイできるタンパク質、たとえ
ば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼの発現が、ＣＤ４７によるＳＩＲＰ１αの活性
化に依存する細胞系を構築することによって、細胞ベースのスクリーニングアッ
セイをデザインすることができる。たとえば、上記ポリペプチドの１つをコード
するレポーター遺伝子を、ＳＩＲＰ１α経路によって特異的に活性化されるＳＩ
ＲＰ−反応性プロモーターの管理下に置くことができる。このようなアッセイは
、ＣＤ４７−ＳＩＲＰ１α相互作用を直接調節する化合物、たとえば、ＳＩＲＰ
１αへのＣＤ４７結合を防止する化合物の検出を可能にする。

【００３１】 代替アッセイ形式は、生物系で、マクロファージ活性化を直接評価するアッセ
イを含む。ＳＩＲＰ１αをＣＤ４７で活性化することにより、マクロファージの
自己免疫疾病への関与を来たす。

【００３２】２．作用物質 またさらなる態様において、本発明は、本発明の先の態様に記載の分析方法で
同定できる作用物質に関する。従って、本明細書に記載のアッセイで同定できる
作用物質を、自己免疫疾病におけるマクロファージの活性の調節に使用すること
ができる。

【００３３】 ＣＤ４７−ＳＩＲＰ１α相互作用に影響を及ぼす化合物は、ほぼ全ての一般的
性状であってもよく、直鎖状、環式、多環式またはそれらの組合せのペプチド類
、抗体を含むポリペプチド類、またはタンパク質であってもよい有機化合物を含
む低分子量化合物を含む。一般に、本明細書で使用する「ペプチド類」、「ポリ
ペプチド類」および「タンパク質」は、同意義と考えられる。

【００３４】 ２ａ．抗体 本明細書で使用する抗体は、完全抗体か、または選択された標的に結合するこ
とができる抗体フラグメントであり、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ′およびＦ（ａｂ
′）₂、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗
体およびヒト化抗体を含む工作された抗体、およびファージ展示技術または代替
技術を使用して生成した、人工的に選択された抗体などがある。小さいフラグメ
ント、たとえば、ＦｖおよびＳｃＦｖは、サイズが小さく、その結果、優れた組
織分布を示すため、診断用途および治療用途に有利な特性を有する。

【００３５】 本発明による抗体は、診断用途および治療用途に特に望ましい。従って、本発
明による抗体は、毒素または標識等のエフェクタータンパク質を含む、改造され
た抗体であってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで、抗体の分布を画像処理することが可
能な標識が特に好ましい。このような標識は、放射性標識であってもよく、また
は患者の体内で容易に可視化できる金属粒子等の放射線不透過性標識であっても
よい。さらに、このような標識は、蛍光標識であってもよく、または患者から取
り出した組織サンプル上で可視化できる他の標識であってもよい。

【００３６】 本発明の抗体を改良するために、組換えＤＮＡ技術を使用することが可能であ
る。従って、診断用途または治療用途において、その免疫原性を低下させるため
に、キメラ抗体を構築した。さらに、ＣＤＲ移植［欧州特許出願第０ ２３９
４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）参照］および、任意に、フレームワーク修飾［欧州特
許出願第０ ２３９ ４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）および国際特許出願第ＷＯ９０
／０７８６１号（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）で検討されている
技法を参照］によって、抗体をヒト化することにより、免疫原性を最小限に抑え
ることが可能である。

【００３７】 本発明による抗体は、動物血清から得てもよく、あるいは、モノクローナル抗
体またはそのフラグメントの場合、細胞培養で生成してもよい。組換えＤＮＡ技
術を使用し、確立された手順に従って、細菌または好ましくは哺乳動物の細胞培
養で、抗体を産生することができる。選択された細胞培養系は、抗体産物を分泌
することが好ましい。

【００３８】 従って、本発明は、宿主、たとえば、適当なリーディングフレーム内で、前述
のタンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に連結された、シグナルペプチドを
コードする第１のＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カ
セットを含むハイブリッドベクターで形質転換された宿主、たとえば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉまたは哺乳動物細胞を培養するステップ、および前述のタンパク質を単離す
るステップを含む、本発明による抗体を産生する方法を含む。

【００３９】 ｉｎ ｖｉｔｒｏで、通常使用される標準培地、たとえば、ダルベッコ変法イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ １６４０培地に、任意に、哺乳動物血
清、たとえばウシ胎仔血清、または微量元素および成長維持サプリメント、たと
えば、正常なマウス腹膜浸出液細胞等の支持細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ
、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク
質、オレイン酸等々を加えた、適当な培地中で、ハイブリドーマ細胞または哺乳
動物宿主細胞を、増殖させる。当技術分野で周知の適当な培地、たとえば、細菌
の場合には、培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒ
ｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ ｘ ＹＴ、またはＭ９最小培地で、酵母の場合に
は、培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、または完全最小ドロップアウト培地（Ｃ
ｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｄｒｏｐｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ）で、細菌細
胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖を、同様に実施する。

【００４０】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ生成は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗
体を与えるためにスケールアップすることが可能である。細菌細胞、酵母または
哺乳動物細胞を培養する技術は、当技術分野で周知であり、たとえば、エアーリ
フト反応器または連続スターラー反応器内での均質な懸濁培養、または、たとえ
ば中空繊維内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上またはセラミ
ックカートリッジ上に固定されたまたは捕捉された細胞培養などがある。

【００４１】 哺乳動物細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることによって、大量の所望の抗体
を得ることもできる。このために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
、組織適合性哺乳動物に注入し、抗体産生腫瘍を成長させる。任意に、注入前に
、動物を、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）等の鉱油
で準備刺激する。１〜３週間後、これらの哺乳動物から抗体を体液から単離する
。たとえば、適当な骨髄腫細胞と、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾細胞と
の融合によって得られるハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクション細胞を、任意にプ
リスタンで前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、１〜２週間後に、腹
水を動物から採取する。

【００４２】 たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏ
ｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（参照により
本明細書に援用する）で、前述のおよび他の技術が論じられている。組換え抗体
分子を作製する技術は、上記参考文献、およびたとえば、ＥＰ ０６２３６７９
号；ＥＰ ０３６８６８４号およびＥＰ ０４３６５９７号（参照により本明細
書に援用する）にも記載されている。

【００４３】 細胞培養上澄を、優先的に、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７を発現する細胞の免
疫蛍光染色で、免疫ブロットで、酵素イムノアッセイ、たとえばサンドイッチア
ッセイまたはドットアッセイで、またはラジオイムノアッセイで、所望の抗体に
ついてスクリーニングする。

【００４４】 抗体を単離するために、たとえば、硫酸アンモニウムによる沈澱、ポリエチレ
ングリコール等の吸湿性材料での透析、選択的膜を通過する濾過等々で、培養上
澄または腹水中の免疫グロブリンを濃縮することが可能である。必要および／ま
たは所望に応じて、通常使用されるクロマトグラフィ法、たとえばゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィおよ
び／または（イムノ）アフィニティクロマトグラフィ、たとえばＳＩＲＰ１α、
ＣＤ４７またはプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィで、抗体を
精製する。

【００４５】 本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞
に関する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞は、遺伝学的に安定であり、所
望の特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を分泌し、且つ解凍および再ク
ローニングによって冷凍培養から活性化することができる。

【００４６】 本発明は、適当な哺乳動物、たとえばＢａｌｂ／ｃマウスを、精製したＳＩＲ
Ｐ１αまたはＣＤ４７、精製したＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７を含む抗原性担体
、あるいはＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７を担持する細胞で免疫化し、免疫化され
た哺乳動物の抗体産生細胞を適当な骨髄腫細胞系の細胞と融合し、融合で得られ
たハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選
択する点で特徴的な、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に向けてのモノクローナル抗
体を分泌するハイブリドーマ細胞系を作製する方法にも関する。たとえば、ＳＩ
ＲＰ１αまたはＣＤ４７を担持する細胞で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾
細胞を、骨髄腫細胞系ＰＡＩまたは骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４の細胞と
融合し、得られたハイブリッド細胞を、所望の抗体の分泌についてスクリーニン
グし、陽性のハイブリドーマ細胞をクローニングする。

【００４７】 適当なアジュバントを含む、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７を発現するヒト腫瘍
起源の１０〜１０⁷および１０⁸細胞を、数ヵ月、たとえば、２〜４ヶ月にわたっ
て、数回、たとえば、たとえば４〜６回、皮下および／または腹腔内に注入する
ことによってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、最後の注入の２〜４日後に、免疫
化されたマウス由来の脾細胞を採取し、融合プロモーター、好ましくはポリエチ
レングリコールの存在下で、骨髄腫細胞系ＰＡＩの細胞と融合するする点で特徴
的な、ハイブリドーマ細胞系を作製する方法が好ましい。分子量がおよそ４００
０のポリエチレングリコールを約３０％〜約５０％含む溶液で中で、骨髄腫細胞
を３〜２０倍過剰の、免疫化マウスからの脾細胞と融合することが好ましい。融
合後、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より成長しすぎるのを防止
するために、選択培地、たとえばＨＡＴ培地を一定間隔で加えた、前述の適当な
培地で、細胞を増殖させる。

【００４８】 本発明は、前述の、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に向けられた抗体の、重鎖可
変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えＤ
ＮＡにも関する。定義により、このようなＤＮＡは、コード一本鎖ＤＮＡ、前述
のコードＤＮＡおよびそれに相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれ
らの相補的（一本鎖）ＤＮＡそれ自体を含む。

【００４９】 さらに、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に向けられた抗体の重鎖可変ドメインお
よび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび
／または軽鎖可変ドメインをコードする真正ＤＮＡ配列、またはその突然変異体
を有する、酵素的にまたは化学的に合成された、ＤＮＡであってもよい。真正Ｄ
ＮＡの突然変異体は、１つ以上のアミノ酸が欠失するか、または１つ以上の他の
アミノ酸と交換された、上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変
ドメインをコードするＤＮＡである。前述の修飾は、その抗体の重鎖可変ドメイ
ンおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲＳの外であることが好ましい。この
ような突然変異体ＤＮＡは、１つ以上のヌクレオチドが、同一アミノ酸をコード
する新しいコドンを含む他のヌクレオチドと置き換えられている沈黙突然変異体
であることも目的とする。このような突然変異体配列は、変性配列でもある。変
性配列は、もともとコードされていたアミノ酸配列の変化を来たさずに、限定さ
れていない数のヌクレオチドが他のヌクレオチドと置き換えられているため、遺
伝暗号の意味の範囲内で変性している。このような変性配列は、それらの異なる
制限部位および／または特定の宿主、特にＥ．ｃｏｌｉによって好まれる、ある
特定のコドンの頻度のため、重鎖ネズミ可変ドメインおよび／または軽鎖ネズミ
可変ドメインの最適発現を得るのに有用な可能性がある。

【００５０】 用語突然変異体は、当技術分野で周知の方法に従って、真正ＤＮＡのｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ変異誘発で得られるＤＮＡ突然変異体を含むことを意図する。

【００５１】 完全な四量体免疫グロブリン分子を組立て、キメラ抗体を発現させるためには
、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡを、ｓ重
鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインをコードする、対応するＤＮＡと融合さ
せ、次いで、たとえば、ハイブリッドベクターに組込んだ後、適切な宿主細胞に
移入する。

【００５２】 従って、本発明は、ヒト定常ドメインｇ、たとえばγ１、γ２、γ３またはγ
４、好ましくは、γｌまたはγ４に融合された、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に
向けられた抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入物を含む組換えＤＮ
Ａに関する。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに
融合された、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に向けられた抗体の軽鎖ネズミ可変ド
メインをコードする挿入物を含む組換えＤＮＡに関する。

【００５３】 別の実施形態において、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン
がスペーサー基で連結されている組換えポリペプチドをコードし、宿主細胞にお
ける抗体のプロセッシングを容易にするシグナル配列および／または抗体の精製
を容易にするペプチドおよび／または切断部位および／またはペプチドスペーサ
ーおよび／またはエフェクター分子をコードするＤＮＡを任意に含む、組換えＤ
ＮＡに関する。

【００５４】 エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断用途または治療用途で有用なエ
フェクター分子をコードするＤＮＡであることを意図する。従って、毒素または
酵素であるエフェクター分子、特に、プロドラッグの活性化を触媒することがで
きる酵素であるエフェクター分子が、特に望ましい。このようなエフェクター分
子をコードするＤＮＡは、天然の酵素または毒素をコードするＤＮＡ、またはそ
の突然変異体を有し、好ましくは、当技術分野で周知の方法で作製することがで
きる。

【００５５】 本発明による抗体および抗体フラグメントは、診断および治療に有用である。
従って、本発明は、本発明による抗体を含む、治療用または診断用の組成物を提
供する。

【００５６】 診断用組成物の場合、抗体は、抗体を検出する手段と一緒に提供されることが
好ましく、その手段は、酵素的、蛍光的、放射性同位元素的またはその他の手段
であってもよい。抗体および検出手段は、同時使用、同時に別々に使用、または
逐次使用に適するように、診断向けの診断用キット内に提供することが可能であ
る。

【００５７】 ２ｂ．ペプチド類 本発明によるペプチド類は、機能的ＳＩＲＰ１α−ＣＤ４７相互作用に関与す
るＳＩＲＰ１α、ＣＤ４７または別のポリペプチドから有効に誘導される。ペプ
チド類は、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ４７相互作用に関与するＳＩＲＰ１αまたはＣＤ
４７内のドメインから誘導されることが好ましい。たとえば、Ｔｈｏｒｎｂｅｒ
ｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：３９３４
−３９４０ ａｎｄ Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒ
ｏｎ １５：３８５−３９３は、ＩＣＥプロテアーゼを阻害するために、修飾し
たテトラペプチドを使用することについて論じている。類似した様式で、ＳＩＲ
Ｐ１α−ＣＤ４７相互作用を阻害するために、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に由
来するペプチドを、たとえば、アルデヒド基、クロロメチルケトン、（アシルオ
キシ）メチルケトンまたはＣＨ₂ＯＣ（Ｏ）−ＤＣＢ基で修飾してもよい。

【００５８】 ペプチド化合物を細胞に送達しやすくするためには、ペプチド化合物が細胞膜
を横切る能力を改良するために、ペプチドを修飾してもよい。たとえば、米国特
許第５，１４９，７８２号には、細胞膜を横切るタンパク質輸送を増大させるた
めに、融合誘導性ペプチド、イオンチャネル形成性ペプチド、膜ペプチド、長鎖
脂肪酸および他の膜ブレンディング剤を使用することが開示されている。ＷＯ９
７／３７０１６号および米国特許第５，１０８，９２１号（参照により本明細書
に援用する）にも、これらの方法および他の方法が記載されている。

【００５９】 本発明による多くの化合物は、薬品開発に有用な最重要化合物である可能性が
ある。有用な最重要化合物は、特に抗体およびペプチド類、特に、遺伝子療法の
場面で、細胞内に発現される細胞内抗体であり、これを、ペプチドまたは低分子
量治療薬の開発用モデルとして使用することが可能である。本発明の好ましい態
様では、最重要化合物で観察される相互作用によく似た適当な低分子量化合物の
デザインを容易にするために、最重要化合物とＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７とを
共結晶化することが可能である。

【００６０】 結晶化は、たとえば、好ましくは１：１比の、ペプチドまたはペプチド複合体
との溶液と「貯蔵所緩衝液」と、結晶形成に必要な低濃度の沈澱剤とを、混合す
ることによって、結晶化緩衝液を調製することを含む。結晶形成のために、たと
えば、沈澱剤を加えることによって、たとえば、滴定によって、または結晶化緩
衝液と貯蔵所緩衝液との間の拡散によって沈澱剤の濃度を釣り合わせることによ
って、沈澱剤の濃度を高める。適当な条件で、沈澱剤の勾配に沿って、たとえば
、より高い濃度の沈澱剤を有する貯蔵所緩衝液から、より低濃度の沈澱剤を有す
る結晶化緩衝液中に、このような沈澱剤の拡散が起こる。拡散は、たとえば、共
通の気相で拡散させる、蒸気拡散技術によって達成することが可能である。周知
の技術は、たとえば、「ハンギングドロップ」法、「シッティングドロップ」法
等の蒸気拡散法である。蒸気拡散法では、タンパク質を含む結晶化緩衝液一滴が
、はるかに大きい貯蔵所緩衝液のプールの上に垂れ下がっているか、近くにある
。あるいは、結晶化緩衝液と貯蔵所緩衝液とを分離し、タンパク質の貯蔵所緩衝
液内への希釈を防止する半透膜を介して、沈澱剤の平衡を実現することができる
。

【００６１】 結晶化緩衝液の場合、ペプチドまたはペプチド／結合パートナー複合体は、３
０ｍｇ／ｍｌまで、好ましくは、約２ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度を有す
ることが好ましい。

【００６２】 以下のパラメーターによって本質的に決定される様々な条件で、結晶を形成さ
せることができる：ｐＨ、塩類および添加物の存在、沈澱剤、タンパク質濃度お
よび温度。ｐＨは、約４．０〜９．０の範囲であってもよい。緩衝液の濃度およ
びタイプは、どちらかといえば重要ではなく、従って、たとえば、所望のｐＨに
応じて変えることができる。適当な緩衝液系としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝
液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液およびＨＥＰＥＳ緩衝液など
がある。有用な塩類および添加物としては、たとえば塩化物、硫酸塩および他の
当業者に周知の他の塩類などがある。緩衝液は、水混和性有機溶媒、好ましくは
、１００〜２００００、優先的に、４０００〜１００００の分子量を有するポリ
エチレングリコール、または適当な塩、たとえば、硫酸塩、特に硫酸アンモニウ
ム、塩化物、クエン酸塩または酒石酸塩からなる群から選択される沈澱剤を含む
。

【００６３】 本発明によるペプチドまたはペプチド／結合パートナー複合体の結晶は、たと
えば、重原子誘導体化によって、化学的に修飾することができる。簡単に説明す
ると、このような誘導体化は、結晶を通過して拡散し、タンパク質の表面に結合
することができる、重金属原子塩類、またはａ有機金属化合物、たとえば塩化鉛
、チオリンゴ酸金、チメロサールまたは酢酸ウラニルを含む溶液に、結晶を浸漬
することによって達成できる。結合した重金属原子の位置は、浸漬した結晶のＸ
線回折分析によって決定することができ、その情報を、たとえば、ペプチドの三
次元モデルの構築に使用することができる。

【００６４】 三次元モデルは、たとえば、結晶の重原子誘導体および／または結晶化によっ
て提供される構造データの全部または一部から得られる。好ましくは、このよう
なモデルの構築は、相同モデリングおよび／または分子の置換を含む。

【００６５】 予備的相同モデルは、構造が判明しているＳＩＲＰとの配列アラインメント、
二次構造予測および構造ライブラリーのスクリーニングの組合せによって、作成
することができる。

【００６６】 計算用ソフトウェアを使用して、ペプチドまたはペプチド複合体の二次構造を
予測することも可能である。ペプチド配列を、ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７構造
に組み込むことが可能である。所望の長さおよび適当なコンフォメーションを有
するペプチドについて、構造ライブラリーをスクリーニングすることによって、
構造的矛盾、たとえば挿入／欠失の周囲の構造フラグメントをモデル化すること
ができる。側鎖コンフォメーションの予測には、側鎖回転異性体を使用すること
が可能である。

【００６７】 適当なコンピューターソフトウェアを使用した分子の置換によってペプチドの
結晶構造を解明するために、最終的な相同モデルを使用する。相同モデルを、分
子置換の結果に従って適所に置き、結晶化に使用されるインヒビターの分子力学
計算およびモデル化を含む、電子密度へのさらなる精密な推論に付す。

【００６８】３．医用組成物 好ましい実施形態において、本発明の前述の態様に記載の分析方法で同定でき
る化合物を含む医用組成物が提供される。

【００６９】 本発明による医用組成物は、ＣＤ４７のＳＩＲＰ１α活性化活性を調節するこ
とができる化合物を有効成分として含む重要な組成物である。本発明による有効
成分を含む医用組成物の有効成分は、個々の症例に応じた量で投与すると、たと
えば、腫瘍または細胞増殖関連の他の疾病、感染症および炎症状態の治療におい
て、優れた治療活性を示すと考えられる。最適治療応答を提供するように、投薬
計画を調整することが可能である。たとえば、数回に分割して毎日投与してもよ
く、または治療状況の窮迫が示す通りに、比例して用量を減らしてもよい。

【００７０】 有効成分を、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋内、皮下、鼻腔内、皮内また
は座薬経路または移植（たとえば徐放性分子を使用）等による便利な方法で、投
与することが可能である。投与経路に応じて、前述の成分を不活化する可能性が
ある酵素、酸およびその他の自然条件の作用から前述の成分を保護する材料で、
有効成分をコーティングすることが必要な場合がある。

【００７１】 有効成分を非経口投与以外によって投与するためには、有効成分を、コーティ
ングするか、または、その不活化を防止する物質と共に投与する。たとえば、有
効成分は、酵素インヒビターと同時投与されるアジュバント、またはリポソーム
を使用して、投与することが可能である。アジュバントは、その最も広い意味で
使用され、インターフェロン等の、免疫刺激性化合物を含む。本明細書で考えら
れるアジュバントとしては、レゾルシノール、非イオン系界面活性剤、たとえば
、ポリオキシエチレンオレイルエーテおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエー
テルなどがある。酵素インヒビターとしては、膵トリプシンなどがある。 リポソームとしては、従来のリポソームのみならず、水中油中水ＣＧＦエマル
ジョンなどがある。

【００７２】 有効成分を、非経口的にまたは腹腔内に、投与することが可能である。グリセロ
ール、液体ポリエチレングリコール類、およびそれらの混合物、および油を使用
して、分散体を調製することができる。通常の貯蔵条件および使用条件で、これ
らの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存料を含む。

【００７３】 注射用に適した医薬剤形としては、水性溶液（水溶性の場合）または分散体、
および処方箋に従って調合される、無菌の注射用液または分散体調製のための無
菌粉末などがある。全ての場合に、この剤形は無菌でなければならず、且つ容易
な注入可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。この剤形は、製造
条件および貯蔵条件で安定でなければならず、また、細菌および真菌等の微生物
の汚染作用から保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール
、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポ
リエチレングリコール等々）、その適当な混合物、および植物油を含む、溶媒ま
たは分散媒体であってもよい。適当な流動性は、たとえば、レシチン等のコーテ
ィングを使用することによって、分散体の場合には必要な粒子サイズを維持する
ことによって、また、スーパーファクタント（ｓｕｐｅｒｆａｃｔａｎｔ）を使
用することによって、維持することができる。

【００７４】 様々な抗菌薬および抗真菌薬、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、ソルビン酸、チメロサール、等々によって、微生物の作用の防止をもた
らすことができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖類または塩化ナトリウ
ムを含むことが好ましい。吸収遅延剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウ
ムおよびゼラチンを組成物に使用することによって、注射用組成物の長期吸収を
もたらすことができる。

【００７５】 無菌注射用液は、必要な量の有効成分を、上述の様々な他の成分と共に、適切な
溶媒に組込み、必要に応じて、その後、濾過滅菌することによって調製する。一
般に、滅菌した有効成分を、基本的分散媒および上述のものからの必要な他成分
を含む無菌媒体に組込むことによって、分散体を調製する。無菌注射用液を調製
するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分に、その予め滅菌濾
過した溶液からのさらなる所望の成分を加えた粉末を生成する、真空乾燥技術お
よび凍結乾燥技術である。

【００７６】 有効成分が、上述のように適切に保護されているとき、有効成分を、たとえば
、不活性な希釈剤または吸収性食用担体と共に経口投与してもよく、あるいは、
硬殻ゼラチンカプセルまたは軟殻ゼラチンカプセル内に封入してもよく、または
圧縮して錠剤にしてもよく、食餌の食物と直接混合してもよい。経口治療的投与
の場合、有効成分を賦形剤と混合して、服用可能な錠剤、バッカル錠剤、トロー
チ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハス等々の剤形で
使用することができる。適当な投与方式での、このような治療上有用な組成物中
の有効成分の量を得る。

【００７７】 錠剤、トローチ剤、ピル剤、カプセル剤等々は、以下の物も含んでもよい：ト
ラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤；リ
ン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸等
々の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；および蔗糖、乳糖またはサ
ッカリン等の甘味剤、または、ペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチ
ェリー香味等の香味剤を加えてもよい。服用単位剤形がカプセル剤であるとき、
そのカプセル剤は、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含んでもよい。

【００７８】 コーティングとして、または他の方法で物理的服用単位剤形を改変するするた
めに、様々な他の材料が存在してもよい。たとえば、錠剤、ピル剤、またはカプ
セル剤を、セラック、糖または両者でコーティングしてもよい。シロップ剤また
はエリキシル剤は、有効成分、甘味剤としての蔗糖、保存料としてのメチルパラ
ベンおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジ香味等の色素および香味
料を含んでもよい。もちろん、服用単位剤形の調製に使用される材料はいずれも
、薬学的に純粋で且つ使用量で実質的に無毒である。加えて、徐放性製剤および
処方に有効成分を組込むことが可能である。

【００７９】 本明細書で使用される「製薬上許容できる担体および／または希釈剤」は、あ
りとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張化剤お
よび吸収遅延剤等々を含む。このような媒体および作用物質を薬学的に活性な物
質に使用することは、当技術分野で周知である。従来の媒体または作用物質が有
効成分と配合禁忌である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が考えられ
る。補助的有効成分も本組成物に組込むことができる。

【００８０】 投与しやすく且つ投与量を均一にするために、投与単位剤形で非経口組成物を
調合することは、特に有利である。本明細書で使用する投与単位剤形は、治療す
べき哺乳動物対象にとって、単位となる投与量として都合がよい、物理的に不連
続な単位を指し；各単位は、必要な製薬上の担体と関連して、所望の治療効果を
もたらすように計算された、予め決定された量の有効物質を含む。本発明の新規
な投与単位剤形の規格は、（ａ）有効物質独特の特徴および成すべき個々の治療
効果、および（ｂ）身体的健康が損なわれる病気を有する生存対象における疾病
の治療に有効な物質等を調合する技術分野に固有の制限によって決定され、直接
左右される。

【００８１】 主要な有効成分を、適当な製薬上許容できる担体と共に、便利で且つ効果的に
有効量で投与するために、投与単位剤形で調合する。補足的有効成分を含む組成
物の場合、投与量は、前述の成分の通常の用量および投与方式を参照することに
よって決定される。

【００８２】 さらなる態様において、疾病の治療に使用するための、前述の、本発明の有効
成分が提供される。結果として、ＮＦκＢ誘導または阻止と関連した疾病を治療
するための医薬の製造に、本発明の有効成分を使用することができる。

【００８３】 さらに、上述の分析方法を使用して同定できる化合物の治療有効量を対象に投
与するステップを含む、ＮＦκＢ誘導または阻止と関連した病気を治療する方法
が提供される。

【００８４】 単に実例を挙げて説明する目的で、本発明を、以下の実施例でさらに説明する
。

【００８５】実験的手順 動物およびモノクローナル抗体 以下のモノクローナル抗体を使用した；抗ラットＳＩＲＰ ｍＡｂ ＳＩＲＰ
１α（Ａｄａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：
１８５３−９；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ ５７：２３９−４７）およびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ
，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｇ．Ｂ．）に参照しやすく掲載されている抗ラットＣＤ
２ ｍＡｂＯＸ３４および抗ラットＣＤ４ドメイン ３＋４ ｍＡｂ ＯＸ６８
。Ｂａｌｂ／Ｃマウスで生じたビオチニル化ラット胸腺細胞に対する抗体パネル
から、ＯＸ１０１（ＩｇＧ１）抗体を選択した。ｈＣＤ４７ ｍＡｂは、ＢＲＩ
Ｃ １２６（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）およびｍＡｂ １
７９６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）であった。

【００８６】 胸腺細胞および他の細胞調製物は、４〜９週齢の両性の、Ｏｘｆｏｒｄアルビ
ノ（ＡＯ）ラットから調製した。活性化脾細胞は、３．５×１０⁶細胞／ｍｌを
、５％ウシ胎仔血清および５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを含むＲＰＭＩ中で、
４８〜７２時間培養することによって作製した。

【００８７】 可溶性融合タンパク質構築物および全長構築物 ラットＣＤ４ドメイン３＋４ビオチンキメラタンパク質の構築については、既
述の通りである（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１８８：２０８３−９０；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ，（１９９４
）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：５１５−２１）。Ｐｓｔ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ
で消化することによってｐＣＤＭ８からＳＩＲＰ１α ｃＤＮＡ（Ａｄａｍｓ，
ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１８５３−９）を切
除し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＧＭＶＨ，Ｈｅ
ｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングした。一本鎖変異誘発
（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅｄ，Ｈｅｒｔｓ．ＵＫ）によって
、Ｓａｌ Ｉ部位を細胞外領域の末端に導入した。ＳＩＲＰ１αの細胞外領域を
コードするＸｂａＩ−Ｓａｌ Ｉフラグメントを、ＣＤ４ドメイン３＋４−ビオ
チン（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：
２０８３−９０；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ，（１９９４）Ｐｒｏｔ
．Ｅｎｇ．７：５１５−２１）の上流にあるｐＥＦ−ＢＯＳ−ＸＢ（Ｂｒｏｗｎ
ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０８３−９０）
に挿入した。このようにして得られたＣＤ４ｄ３との接合部はｇｔｃａｃｃａａ
ｇｇｇｔｃｇａｃａｔｃｃａｔｃａｃｇ（ＶＴＱＧＳＴＳＩＴ）であった。ヒト
ＣＤ４７の細胞外ドメインを、プラスミドＤＮＡ（Ｄｒ Ｉａｎ Ｃａｍｐｂｅ
ｌｌ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫにより寄贈）からＰＣＲで増幅し、ＣＤ４
ｄ３＋４−ビオチンｐＥＦ−ＢＯＳ−ＸＢベクターに挿入し、以下の接合部ｃｇ
ｔｇｔｔｇｔｔｔｃａｔｇｇｔｃｇａｔｃｃａｔｃ（ＲＶＶＳＷＳＴＳＩ−ヒト
ＣＤ４７）が得られた。安定した系を生成するために、ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３
＋４をコードするＸｂａ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩフラグメントをｐＥＥ１４（１８）
に移入した。ＣＤ４ｄ３＋４融合タンパク質を構築するために、プライマーａｔ
ａａａｇｃｇｔｃｔａｇａｇｃｇｇａｔａｔｇｔｇｇｃｃｃｃｔｇ（センス）お
よびｃａｔｔｔｇｇａｇｔｃｇａｃｃａｔｇａａａｃａａｃａｃ（アンチセンス
）を用いたＰＣＲで、１つのＳＩＲＰ Ｖドメインを増幅した。プライマーｇｃ
ａａｇｃｔｔａｔｇｇａｇｃｃｃｇｃｃｇｇｃ（センス）およびｃａｇａｔｔｃ
ｇｔｃｃｃａｔｔｃａｃｔｔｃｃ（アンチセンス）を用いたＰＣＲで、ＨＴ１０
８０線維肉腫ｃＤＮＡライブラリーから、ＳＩＲＰ−１αを増幅した。ＰＣＲ産
物をＨｉｎｄ ＩＩＩ ＥｃｏＲ Ｉで消化し、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮ
Ａ ３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ
ｄｓ）に挿入した。ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ適合末端を用いてＳＩＲＰ−１α
の細胞外ドメインを増幅し、消化したＰＣＲ産物を、ｐＩｇ ＰＬＵＳ（Ｒ&Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）に挿入することによって、ＳＩＲＰを
ヒトＩｇＧ Ｆｃに結合する組換え融合タンパク質を作製した。細胞外領域の３
′末端における接合部は、ｃａｃｔｇｇａｔｃｔａａｔｇａａｃｇｇ（ＴＧＳＮ
ＥＲ）に一致する。

【００８８】 細胞培養発現 ビオチニル化実験のために、ＤＥＡＥ−デキストラン（１９）を使用してＣＯ
Ｓ−１細胞（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ）
（２０μｇ ＤＮＡ／１０⁷細胞）で、またはリン酸カルシウムを使用して２９
３Ｔ細胞で、融合タンパク質構築物を一時的に発現させた。細胞表面発現用の構
築物でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、トランスフェクション後２４時間継
代し、トランスフェクション後７２〜９６時間、フローサイトメトリーで使用し
た。可溶性ＣＤ３＋４タンパク質の発現を、阻害ＥＬＩＳＡ（Ｂｒｏｗｎ ａｎ
ｄ Ｂａｒｃｌａｙ，（１９９４）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：５１５−２１）で検
出した。上澄を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０に対して透析し、１
０，０００ＭＷカットオフセントリコン（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｍ
Ａ，ＵＳＡ）を使用して濃縮した。製造業者の勧告通りに、１μｇ（５，０００
単位）の組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，
ＣＯ，ＵＳＡ）を使用して、酵素的ビオチニル化を実施した。ＰＢＳに対する透
析によって、余分のビオチンを除去した。ＢＩＡｃｏｒｅ実験で使用するために
、グルタミンシンセターゼ系（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０４１０−８）を使用して生成した安定なチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞系から、ＯＸ６８ｍＡｂを用いたアフィニティクロマ
トグラフィーで、ＨＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４を精製した。吸光計数（１．０ｃ
ｍ²／ｍｇ）を、アミノ酸組成物から実験的に決定し、２８０ｎｍにおける吸収
によって濃度を測定した。後続のゲル濾過を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ）を使用して実施し、分画を、それ以上
濃縮せずにＢｌＡｃｏｒｅ分析で使用した。

【００８９】 小球体（ビーズ）結合アッセイ 結合実験を実施し、記載（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２２２−８；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９
９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０８３−９０）通りに、フローサイトメ
トリーで分析した。一般に、胸腺細胞５×１０⁵個を丸底マイクロタイタープレ
ートにプレーティングし、適切な場合、５０μｌハイブリドーマ組織培養上澄と
共に、４℃にて１時間インキュベートした。蛍光性ストレプトアビジン被覆小球
体１．５×１０⁸ １５μｌ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌ
ｅ，ＩＬ，ＵＳＡ カタログ番号ＶＦＰ−０５５２−５）を、組換えＯＸ ４１
−ＣＤ４ｄ３＋４タンパク質（２μｇ／サンプル）と、４℃にて１時間混合した
。ブロッキングＣＤ２ ｍＡｂで予め被覆した細胞に結合する、ラットＣＤ４ｄ
３＋４、ラットＣＤ５−ＣＤ４ｄ３＋４またはラットＣＤ４８−ＣＤ４ｄ３＋４
で被覆したビーズを、上書き可能な陰性対照として使用した（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０８３−９０）。ビー
ズを０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄することによって、非結合タンパク質を除去
した。被覆ビーズを１分間、超音波処理し、次いで、記載（Ｂｒｏｗｍ ｅｔ
ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０８３−９０）通りに、
細胞と共に、４℃にて１時間インキュベートした。

【００９０】 ＯＸ １０１抗原のアフィニティ 記載（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，４^th Ｅ
ｄ．，ｐｐ．２２．１−２２．２４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ，Ｏｘｆｏｒｄ）通りに、精製胸腺細胞膜を調製し、２％デオキシコール酸ナ
トリウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２．５ｍＭのヨードアセトアミド、０
．２ｍＭのＰＭＳＦを含む０．０２％のＮａＮ₃緩衝液ｐＨ８に可溶化した。可
溶化した膜調製物を、ＣＮＢｒ−セファロース（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏ
ｒｓｅｔ，ＵＫ）に結合させたＯＸ１０１ ｍＡｂに加え、Ａ₂₈₀ｎｍが０．０
２未満に低下するまで洗浄し、ＯＸ１０１抗原を高ｐＨ緩衝液（０．０５Ｍのジ
エチルアミン−ＨＣＩ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．０２％の
ＮＡＮ₃、ｐＨ１１．５）で溶離した。

【００９１】 抗原分析 溶離した分画を、還元条件で、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる電気泳動
にかけ、その後のウエスタンブロッティングで、ＯＸ１０１ ｍＡｂとの免疫反
応性を試験した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏ
ｒｓｅｔ，ＵＫ）に結合させたヤギ抗マウス抗体および化学発光性ペルオキシダ
ーゼ基質（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｓ．ＵＫ）で、反応性バンドを
可視化した。１／１０倍量の７２％のトリクロロ酢酸を加え、室温で５分間イン
キュベートし、１００００ｇで１０分間遠心分離することにより、反応性分画を
沈澱させた。ペレット化したタンパク質を、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび銀染色で分
析した。ＯＸ１０１ウェスタンブロット上の免疫反応性領域に対応する染色バン
ドを切除し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４
Ａタンパク質シーケンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｔｄ．，ＵＫ）を使用
したＥｄｍａｎ分解によるＮ末端配列決定に使用した。

【００９２】 ＢＩＡｃｏｒｅ分析 既述（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８
：２０８３−９０，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１０１４８９−６０）通りに、ＣＭ５研究用
品質等級のチップを使用し、ＢＩＡｃｏｒｅ^TM２０００バイオセンサー機器（Ｂ
ｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施した。１０ｍＭの
酢酸ナトリウム ｐＨ４．５中、５０μｇ／ｍｌにて、アミンカップリングによ
り、ｈＳＩＲＰ−ＦｃおよびｈＣＴＬＡ−４Ｆｃタンパク質を直接固定した。凝
集性物質の寄与を最小限に抑えるために、３秒（１００μ／分で５μｌ）という
短い注入時間で、平衡アフィニティおよび動力学的測定を３７℃にて実施した。
平衡結合の場合、単量体ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋の濃度を上昇および低下させ
て、ｈＳＩＲＰ−Ｆｃ（６５００ＲＵ）を通過させた。動力学的測定の場合、ｈ
ＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４（１８．３０μＭ）を、６５００ＲＵおよび３０００
ＲＵにて固定したｈＳＩＲＰ−Ｆｃおよび対照ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（６３００ＲＵ
）を通過させた。ＣＤ４７ｍＡｂブロッキング実験およびＶ−ＳＩＲＰ−ＣＤ４
ｄ３＋４結合実験を、それぞれ、１０μｌ／分および５μｌ／分で、２５℃にて
実施した。

【００９３】実施例１：ＯＸ４１は、ＣＤ４７のリガンドである ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４小球体は、胸腺細胞およびコンカナバリンＡ処理脾
細胞と結合する ラットＯＸ４１抗原のリガンドを同定するために、ラットＣＤ４ドメイン３お
よび４の上流にあるＯＸ４１細胞外ドメインおよびＥ．ｃｏｌｉビオチニル化酵
素ＢｉｒＡ（Ｓｃｈａｔｚ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１
１３８−４３）により認識される短いペプチドを発現させることによって、組換
え融合タンパク質を作製した（図１Ａ）。ビオチニル化されたＯＸ４１−ＣＤ４
ｄ３＋４タンパク質は、正確に折り畳まれているＯＸ４１ ｍＡｂと一致するＯ
Ｘ４１ ｍＡｂを結合した。

【００９４】 ビオチニル化ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４（図１Ｂ）で標識した蛍光性Ｓｐｈｅ
ｒｏ^TMアビジン被覆小球体を使用して、ＳＩＲＰリガンドを担持する細胞型を同
定した。ラット胸腺細胞およびコンカナバリンＡに結合したこれらのＯＸ４１−
ＣＤ４ｄ３＋４ビーズは、フローサイトメトリーで評価された通り、ラット脾細
胞を活性化し（図１ＣおよびＤ）。結合は、先に特性決定された、これらの細胞
上のリガンドＣＤ２に結合する、ラットＣＤ４８−ＣＤ４ｄ３＋４被覆ビーズ間
の相互作用で確認されたものに類似していた（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１
９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２２２８）。これらの相互作用
は、ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４ビーズをＯＸ４１ｍＡｂとインキュベートするこ
とによってある程度ブロックされたが、関連のない対照ｍＡｂ、ＯＸ２１または
ＩｇＧ２ａアイソタイプマッチド対照ＯＸ３４ ｍＡｂによってブロックされな
かったとして特定化されると判断された。

【００９５】 ＯＸＩ０１ ｍＡｂは、ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４の細胞への結合を特異的にブ
ロックする。 ＯＸ４ｌ−ＣＤ４ｄ３＋４ビーズとの細胞結合データから、ラット胸腺細胞は
、ＯＸ４１のリガンドを発現することが示唆される。このリガンドを同定するた
めに、ラット胸腺細胞に対して生じさせておいた、およそ５０のマウスｍＡｂの
パネルを、ＯＸ４１ビーズ結合アッセイで、ブロッキング活性についてスクリー
ニングした。１つの抗体、ＯＸ１０１は、ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４標識ビーズ
と胸腺細胞との相互作用を、明らかに阻害した（図２Ａ）。胸腺細胞と反応する
他のｍＡｂは、ＣＤ４８ ｍＡｂからわかるように、全く阻害を示さず（図２Ａ
）、これは、特異的な作用である公算が高いことを示した。ＯＸ１０１は、ＯＸ
４１−ＣＤ４ｄ３＋４ビーズ コンカナバリンＡ処理細胞の結合もブロックした
（図２Ｂ）。フローサイトメトリーは、ＯＸ１０１が、大多数の胸腺細胞、脾細
胞、頚部リンパ節細胞および腹膜細胞を標識することを示し、大多数のリンパ球
およびマクロファージにＯＸ１０１が存在したことがわかる（表示せず）。さら
に、脳組織の粗調製物もＯＸ１０１抗原を含むことが、フローサイトメトリーで
明らかになった（表示せず）。

【００９６】 ラットＣＤ４７としてのＯＸ１０１抗原の単離および同定 ＯＸ１０１ ｍＡｂアフィニティカラムを使用して、ＯＸ１０１抗原を精製し
た。特異的に結合したタンパク質を、高ｐＨで、ＯＸ１０１ ｍＡｂカラムから
溶離した（図３Ａ）。ＯＸ１０１ ｍＡｂを用いたウエスタンブロッティングで
、ＯＸ１０１抗原について、分画をスクリーニングした（図３Ｂ）。およそ６０
ｋＤおよび４５ｋＤの分子量に対応する２つの反応性バンドが確認された。反応
性タンパク質を含む分画を再沈澱させ、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。４５〜６
ＯｋＤの領域内で、沈澱物質が、１つの広がったバンドとして続いていた。この
領域を切除し、配列決定した（図３Ｃ）。得られた１つの配列は、ラットＣＤ４
７のＮＨ₂末端配列インテグリン結合タンパク質としても知られる（Ｇｅｎｂａ
ｎｋ寄託番号Ｄ８７６５９，ＡＦ１７４３７）と実質的に同一であった。配列決
定の結果は、異なるグリコシル化形から生じるウエスタンブロッティングで確認
された２つのバンドまたはＣ末端における分解に起因する低い方のバンドと一致
する。

【００９７】 ＳＩＲＰ／ＯＸ４１は、ＣＤ４７に直接結合する ラットでのＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４細胞結合データ、およびＣＤ４７として
のＯＸ１０１抗原の同定の意義を確立するためには、ＯＸ４１／ＳＩＲＰとＣＤ
４７タンパク質との間の直接相互作用があるかどうか、また、この相互作用は、
ヒトで保存されるかどうかが必要であった。ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、ヒトＣ
Ｄ４７とＣＤ４ｄ３＋４（ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４）との１つの細胞外Ｉｇ
ＳＦドメインの、ヒトＳＩＲＰαの細胞外領域およびＩｇＧからのＦｃ領域（ｈ
ＳＩＲＰ−Ｆｃ）を含む、精製した組換えキメラタンパク質を、結合について試
験した。

【００９８】 ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４を、ＣＤ４ｍＡｂ（ＯＸ６８）によって、２つの
フローセル内に固定した。１つのフローセルをｈＣＤ４７ ｍＡｂで飽和した。
二量体のｈＳＩＲＰ−Ｆｃを、両フローセルおよび対照フローセル（図４）を通
過させた。ｈＳＩＲＰ−Ｆｃは、ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４に特異的に結合し
た。ｈＣｄ４７ ｍＡｂ、ＢＲＩＣ１２６（図４）および１７９６（データ示さ
ず）と共にプレインキュベートすることによって、ＨＳＩＲＰ−Ｆｅの結合を、
対照フローセルのレベルまでブロックしたことを示すことにより、相互作用の特
異性を確認した。

【００９９】 相互作用のアフィニティを測定するために、ｈＳＩＲＰ−Ｆｃを直接固定し、
単量体ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４を、通過させた。図５Ａに示す通り、ｈＣＤ
４７−ＣＤ４ｄ３＋４は、用量依存的様式で、ｈＳＩＲＰ−Ｆｃに特異的に結合
した。３７℃で収集したデータの非線形曲線フィッティングにより、ｋ_d=８．５
μＭ（図５Ｂ）が得られた。スキャッチャード分析で、類似した結果が得られた
（図５Ｂ差し込み図）。固定化ＳＩＲＰ−Ｆｃの２レベルのｋ_dの８測定値は、
２〜９μＭの範囲内に入った。見掛けの速度定数は、高レベルのｈＳＩＲＰ−Ｆ
ｃの場合、ｋ_off=１．３ｓ^-1であり、低レベルの場合、ｋ_off=２．１ｓ^-1である
と、算出された。（図５Ｃ)。この、みかけのｋ_offの増加は、解離後に、再結合
作用が存在することを表す公算が高く、結果として、真のｋ_offの過少評価を招
く。従って、真のｋ_offは、≧２．１ｓ^-1である。解離速度定数ｋ_offおよびｋ_d
から、会合速度定数は、ｌ．７×ｌ０^-5Ｍ^-1ｓ^-1であると計算された。急速会合
速度Ｋ_onを測定することは困難であるが、図５Ｃに示す結合データの会合相への
曲線フィッティングによって推定することができる。ＳＩＲＰ（６５００ＲＵ）
へのｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４（１８．３μＭ）結合の場合、Ｋｏｎは、１．
９×ｌ０^-5Ｍ^-1Ｓ^-1であると測定された。

【０１００】 ＳＩＲＰ／ＯＸ４１のＮＨ₂末端のＶ−様ドメインは、ＣＤ４７に直接結合する
。 ＳＩＲＰ上のＣＤ４７結合部位を定位するために、ｈＳＩＲＰのＮＨ₂末端の
Ｖ様ドメインのみを、ＣＤ４ｄ３＋４とインフレームで含む構築物を作製した。
Ｖ−ＳＩＲＰ−ＣＤ４ｄ３＋４を、ＣＤ４ｍＡｂ（ＯＸ６８）によって、１つの
フローセル内に固定した。このフローセル内の結合していないＯＸ６８、および
対照フローセル内の全てのＯＸ６８を、可溶性ラットＣＤ４でブロックした。可
溶性ラットＣＤ４の注入を繰返すことによって、ブロッキングを検証した（図６
）。次いで、可溶性ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４を、両フローセルに注入した。
２つのフローセルの間に、ＣＤ４結合の差はなかったが、ＳＩＲＰのＶ様ドメイ
ン１つへの、ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４の特異的結合が認められた（図６）。

【０１０１】 実施例２：抗ＣＤ４７抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＥＡＥの重症度を低下させる
。 実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導するために、ルイスラットの足
蹠に、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）をＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント
と共に注入した。約０．５ｍｇのＯＸ１０１（抗ＣＤ４７モノクローナル抗体）
を１０日に注入し、動物５匹の疾病進行を追跡した（Ｂｒｏｓｔｏｆｆ ａｎｄ
Ｍａｓｏｎ，（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１９３８−４２参照
）。同じサブクラス（ＩｇＧ１）の対照抗体、ＯＸ２１を、さらなるシリーズの
動物に同時に投与し、また、さらなるシリーズに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
を投与した。

【０１０２】 この疾病を毎日モニタリングし、疾病スコアを平均した。下表から、対照（Ｐ
ＢＳおよびＯＸ２１）では疾病の発生率が高かったが、ＯＸ１０１治療動物では
、疾病が遅延し、重症度が有意に低かったことがわかる。

【０１０３】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４は、細胞と結合する。Ａ）組換えキメラＯＸ４１−
ＣＤ４ｄ３＋４タンパク質。Ｂ）リガンド同定に使用したＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３
＋４蛍光性ビーズ。ＣおよびＤ）ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４は、ラット（Ｃ）胸
腺細胞または（Ｄ）コンカナバリンＡ活性化脾細胞に結合するが、対照蛍光性ビ
ーズは結合しない。ビーズをＯＸ４１ ｍＡｂと共にプレインキュベートするこ
とにより、ビーズを対照（ＯＸ２１）ｍＡｂと共にプレインキュベートした場合
と比較して、ＯＸ４１−ＣＤ３＋４の細胞への結合をある程度ブロックした。

【図２】 ＯＸ１０１ ｍＡｂは、ＯＸ４１−ＣＤ４ｄ３＋４ビーズの細胞への結合を阻
害する。（Ａ）ラット胸腺細胞または（Ｂ）コンカナバリンＡ活性化脾細胞を、
ＯＸ１０１ ｍＡｂと共にプレインキュベートすることにより、ＯＸ４１−ＣＤ
４ｄ３＋４ビーズの結合を、陰性対照ビーズで見られるレベルまでブロックした
。細胞を両細胞集団と反応する別のｍＡｂ、ＣＤ４８ ｍＡｂ（ＯＸ４５）と共
にプレインキュベートしても、結合をブロックしなかった。

【図３】 ＯＸ１０１ ｍＡｂは、ラットＣＤ４７を結合する。Ａ）カラムから溶離した
、ウエスタンブロッティングでＯＸ１０１と反応した分画の、タンパク質の例。
タンパク質を、還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色で可視化した。Ｂ
）ＯＸ１０１ ｍＡｂを使用した、反応性分画からのタンパク質のウェスタンブ
ロット。Ｃ）ＯＸ１０１抗原およびラットＣＤ４７のＮＨ₂末端配列の比較。

【図４】 ｈＳＩＲＰ−Ｆｃと固定化ｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４ ＣＤ４ ｍＡｂ Ｏ
Ｘ６８との相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ^TMの３つのフローセルと結び付けた。２
つのフローセル内で、ＨＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４をＯＸ６８に、同レベルで結
合させた。これらのフローセルの１つをｈＣＤ４７ｍＡｂ、ＢＲＩＣ１２６で飽
和した。ＳＩＲＰ−Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ）を、３つのフローセル全てを通過さ
せた。ＳＩＲＰ−ＦｃはｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４（実線）に結合したが、ｈ
ＣＤ４７で飽和したとき、対照フローセル（点線）で見られるレベルまで、ｍＡ
ｂ結合が減少した（破線）。

【図５】 可溶性ヒトＣＤ４７-ＣＤ４ｄ３＋４のヒトＳＩＲＰ-Ｆｃへの結合のアフィニ
ティおよび解離速度。（Ａ）３７℃で、可溶性単量体ｈＣＤ４７-ＣＤ４ｄ３＋
４を、ｈＳＩＲＰ-Ｆｃ（６５２５ＲＵ）（実線）、あるいは、陰性対照として
ＣＴＬＡ-４-Ｆｃ（６２９０ＲＵ）（点線）が固定化されたフローセルを通して
、μＭで指示された濃度で注入した。（Ｂ）平衡時におけるｈＳＩＲＰ-Ｆｃフ
ローセルおよび対照フローセルの間の応答の差を、ｈＣＤ４７-ＣＤ４ｄ３＋４
濃度に対してプロットした。ｋ_d＝８．５μＭおよび１４００ＲＵである最大結
合は、陰性対照を減算したＡのデータ（丸）への、Ｌａｎｇｍｕｉｒ等温（実線
）の非線形曲線フィッティングによって算出した。差し込み図は、Ｂのデータの
スキャッチャードプロット、および算出されたＫｄ＝７．６μＭを示す。（Ｃ）
高レベル（６５００ＲＵ）（●）および低レベル（３０００）（上向きの黒三角
）で固定化した、固定化ｈＳＩＲＰ-Ｆｃ、およびｈＣＴＬＡ-４-Ｆｃ（６２９
０ＲＵ）（下向きの黒三角）上に、可溶性ｈＣＤ４７（１８．３μＭ）を注入し
た。高レベルｈＳＩＲＰ-Ｆｃのｋ_off＝１．６ｓ^-1、低レベルｈＳＩＲＰ-Ｆｃ
のｋ_off＝２．１ｓ^-1、およびｈＣＴＬＡ-４-Ｆｃのｋ_off＝７．０ｓ^-1の値は、
解離データ（符号）への指数減衰曲線フィッティング（実線）によって算出した
。

【図６】 ＳＩＲＰのＮＨ₂末端のＶドメインは、ＣＤ４７と結合する。可溶性ラットＣ
Ｄ４およびｈＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４を、固定化Ｖ-ＳＩＲＰ-Ｃｄ４ｄ３＋４
（実線）または対照ラットＣＤ４（破線）と共に、フローセルに注入した。

【図７】 ラットＯＸ４１／ＳＩＲＰおよびヒトＳＩＲＰαおよびＣＤ４７を示す概略図
である。潜在的Ｎ連結部位の種差を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 37/02 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA53 CA03 DA02 GA03 4C084 AA17 NA14 ZA012 ZA682 ZA962 ZB072 4C085 AA13 AA14 AA16 AA19 BB41 BB43 EE01

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マクロファージの自己免疫疾病への関与を阻害するための組
   成物の調製における、ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との間の相互作用を阻害すること
   ができる作用物質の使用。
2. 【請求項２】 前記作用物質が、ＣＤ４７のリガンドである、請求項１に記
   載の使用。
3. 【請求項３】 前記作用物質が、ＳＩＲＰ１αのリガンドである、請求項１
   に記載の使用。
4. 【請求項４】 前記作用物質が抗体である、請求項２または３に記載の使用
   。
5. 【請求項５】 前記抗体がＯＸ１０１である、請求項４に記載の使用。
6. 【請求項６】 前記自己免疫疾病が、関節炎、炎症性腸疾病および多発性硬
   化症からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 【請求項７】 ＣＤ４７とＳＩＲＰ１αとの間の相互作用を阻害する作用物
   質の有効量を、哺乳動物に投与するステップを含む、マクロファージが関与した
   自己免疫疾病を治療する方法。
8. 【請求項８】 ＣＤ４７とＳＩＲＰ１αとの間の相互作用を阻害することが
   できる作用物質を同定する方法であって、１つ以上の試験化合物をＣＤ４７およ
   び／またはＳＩＲＰ１αに曝露するステップと、試験化合物が、それらの相互作
   用を阻害できる力をモニタリングするステップとを含む方法。
9. 【請求項９】（ａ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７を、評価すべき化合物およ
   び化合物類とインキュベートするステップと、 （ｂ）ＳＩＲＰ１αまたはＣＤ４７に結合する化合物を同定するステップと、 （ｃ）ＳＩＲＰ１αとＣＤ４７との間の相互作用を調節できる力について、ＳＩ
   ＲＰ１αまたはＣＤ４７に結合する化合物を評価するステップと を含む、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 ステップ（ａ）および（ｂ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施
    される、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】（ｉ）ＳＩＲＰ１αと、（ｉｉ）ＣＤ４７との間の相互作用
    を分断することができる物質を同定する方法であって、 （ａ）シグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）、またはその相同体、変異体または
    誘導体を、第１の成分として提供するステップと、 （ｂ）ＣＤ４７タンパク質、またはその相同体、変異体または誘導体を、第２の
    成分として提供するステップと、 （ｃ）試験すべき物質が存在しなければ、２成分が相互に作用できるであろう条
    件で、２成分を、試験すべき物質と接触させるステップと、 （ｄ）前記物質が、第１の成分と第２の成分との間の相互作用を分断するかどう
    かを判定するステップと を含む、請求項９に記載の方法。
12. 【請求項１２】 ステップ（ｃ）がｉｎ ｖｉｖｏで実施される、請求項９
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 ステップ（ｃ）が、自己免疫疾病用動物モデルで実施され
    る、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記動物モデルがＥＡＥである、請求項１３に記載の方法
    。