JP2003516766A - 形態形成タンパク質応答阻害エレメントを用いた、形態形成タンパク質アナログを同定するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的に、形態形成タンパク質アナログを同定するための方法および組成物に関する。１つの実施形態において、本発明は、骨形成タンパク質応答転写阻害エレメントに関する。本発明はまた、遺伝子発現の調節および組織誘導能力に対する形態形成タンパク質の生物学的効果を模倣し得る、同定された形態形成タンパク質アナログ、特に、骨形成タンパク質（ＯＰ−１）のようなＢＭＰファミリーに関する形態形成タンパク質アナログに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的に形態形成タンパク質アナログを同定するための方法および
組成物に関する。１つの実施形態においては、本発明は、骨形成タンパク質応答
転写阻害エレメントに関する。本発明はまた、遺伝子発現および組織誘導性能力
の調節に関する形態形成タンパク質、特に、骨形成タンパク質（ＯＰ−１）のよ
うなＢＭＰファミリーに関するタンパク質の生物学的効果を模倣し得る同定され
た形態形成タンパク質アナログに関する。

【０００２】 （発明の背景） 骨形成タンパク質は、インビボで移植される場合に軟骨および軟骨性骨蓄積を
生じる発生的カスケードを誘導可能な、成長および天然の骨治癒間におそらく活
性である、哺乳動物骨抽出物に存在する活性として本来定義されている。この発
生的カスケードとしては、間葉細胞補充および増殖、前駆細胞分化、軟骨石灰化
、血管侵襲、骨形成、再構築および髄分化が挙げられる（Ｒｅｄｄｉ，Ｃｏｌｌ
ａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，１，２０９−２６頁（１９８１））。

【０００３】 軟骨性骨分化を誘導する骨マトリックス中の因子は、十分な骨誘導性活性を回
復するために、解離的に抽出され得、そして不活化コラーゲンで再構築される（
Ｒｅｄｄｉ，Ｒｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，７５９９
−７６０３頁（１９８１））。これは、インビボで軟骨性骨形成を誘導するそれ
らの能力についてのタンパク質抽出物をアッセイするための実験方法を提供する
。この再構築アッセイを使用して、種々の関連した骨形成タンパク質が、種を横
断するインプラントで骨および軟骨形成を誘導し得るいくつかの哺乳動物種から
単離されている（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，６５９１−９５頁（１９８３））。活性因子また
はこの活性を促進する因子が、文献中で最も一般的に骨形態形成タンパク質（Ｂ
ＭＰ）および骨形成タンパク質（ＯＰ）といわれる。

【０００４】 骨形成タンパク質および骨形態形成タンパク質は、トランスフォーミング増殖
因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する構造的および機能的に関連
した形態形成タンパク質のファミリーを示す（以下を参照のこと）。ＴＧＦ−β
スーパーファミリーは、次に、増殖、分化、ならびに組織形態形成および組織修
復に関与する多様な活性を有する大多数の進化的に保存されたタンパク質を示す
。ＢＭＰおよび骨形成タンパク質は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー
のように、それらのＣ末端の近くに位置する高度に保存された生理活性システイ
ンドメインを共有する分泌性ポリペプチド前駆体として発現される。多数のＢＭ
Ｐファミリータンパク質の別の特徴は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成す
るそれらの性向である。

【０００５】 ＢＭＰファミリーに属する多数の形態形成タンパク質がここで記載される。い
くつかは、上記のようなバイオアッセイと連結した精製技術を使用して単離され
た。他は、ＢＭＰファミリーに一般的な保存領域内のＤＮＡ配列相同性によって
同定およびクローン化された。これらのホモログは、明白な骨形成活性を有する
か否かに関わらず、継続的に数えられたＢＭＰをいう。代替的なアプローチを使
用して、骨形成活性を有する合成ＯＰを、天然に由来するＯＰとＢＭＰとの間の
配列比較に由来するアミノ酸コンセンサス配列を使用して設計した（以下を参照
のこと；Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３２４，８１９号）。

【０００６】 ＢＭＰファミリーの最も初期のメンバーのいくつかは、新しい軟骨および骨を
誘導するそれらの能力によって同定された骨形成タンパク質であるが、種々の種
におけるＢＭＰ関連遺伝子および遺伝子産物についての研究は、新しい形態形成
タンパク質を開示し、そのいくつかは、異なるかまたは付加的な組織誘導性能力
を有する。例えば、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３（ＤＮＡ配列相同性によっ
て同定された）は、報告によるとインビボにおける腱／靭帯様組織形成を誘導す
る（ＷＯ９５／１６０３５）。いくつかのＢＭＰは、神経細胞分化を誘導し得そ
して軸索再生を促進し得る（ＷＯ９５／０５８４６）。それらの骨形成活性に基
づいて本来単離されたいくつかのＢＭＰはまた、神経誘導性性質を有し得る（Ｌ
ｉｅｍら、Ｃｅｌｌ，８２，９６９−７９頁（１９９５））。従って、骨形成タ
ンパク質および他のＢＭＰは、その最終発現が発生的および環境的てがかりの複
雑なセットに依存し得る、種々の強力な組織誘導性能力を有し得るようである。
これらの骨形成タンパク質、ＢＭＰタンパク質およびＢＭＰ関連タンパク質は、
本明細書中で集合的に形態形成タンパク質といわれる。

【０００７】 さらに、骨形成タンパク質は、培養された造骨細胞中のインスリン様増殖因子
（ＩＧＦ）のようないくつかの増殖因子の合成を刺激し得る。ＩＧＦ−Ｉおよび
ＩＧＦ−ＩＩは、骨細胞において分裂促進的活性を示し、そして、造血細胞分化
を強化する（Ｈｏｃｋら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２，２５４−２６
０頁（１９８８）；ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２４
，３０１−３０９頁（１９８９）；Ｙｅｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１
３７，１９２１−１９３１頁（１９９６））。ＩＧＦの生物学的活性は、それら
の結合タンパク質（インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）によっ
て影響され得る。ＩＧＦＢＰは、骨形成に関して差次的な活性を有し、そして、
種々の因子（骨形成タンパク質、コルチゾール、プロスタグランジンＥ２、塩基
性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および
ＴＧＦ−βを含む）によって差次的に調節され得る（Ｃａｎａｌｉｓら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１０７７１−１０７７６頁（１９９５）；Ｄｏｎ
ｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２０００−２００６頁（１９９５
）；Ｙｅｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７５，７８−８８（１９９
８）；Ｐａｓｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，２３７５−２３８２
（１９９６）；Ｃａｎａｌｉｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２，２２
−２７（１９８８）；Ｇａｂｂｉｔａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１
，９０３３−９０３８（１９９６））。

【０００８】 上記の活性、およびＢＭＰファミリーに属する形態形成タンパク質のまだ未発
見の組織誘導性特性のような他の活性が、例えば、傷害または変性疾患によって
引き起こされた外傷を有する患者における組織再生を促進するために有用である
と予想されている。骨治癒および再生を促進するための哺乳動物骨形成タンパク
質を含む移植可能な骨形成デバイスが記載されている（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａ
ｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号を参照のこと）。いくつかの骨形成デ
バイスは、多孔性の生体適合性マトリックス中で分散される骨形成タンパク質を
含む。これらの天然に由来するかまたは合成のマトリックスは、代表的に、骨形
成タンパク質が、マトリックスから移植部位へと拡散しするのを可能にし、そし
て、細胞の流入および流出を可能にする。骨形成タンパク質は、前駆細胞が分化
および増殖するのを誘導する。前駆細胞は、マトリックス中に移動し、そして、
分化した細胞は、多孔性マトリックスからインプラント部位へと移動し得る。骨
形成細胞はまた、マトリックスを骨伝導のための物理的骨格としてマトリックス
を利用し得る。腱／靭帯様および神経組織再生ためにＢＭＰを送達するための同
様のデバイスが、記載されている（以下を参照のこと）。補綴と既存の骨との間
の結合強度を強化する骨形成タンパク質でコートした補綴デバイスがまた記載さ
れている（Ｒｕｅｇｅｒら、米国特許第５，３４４，６５４号、本明細書中で参
考として援用される）。

【０００９】 大量の精製されたおよび高度に活性な形態形成タンパク質のバイオアベイラビ
リティーは、整形医薬品、特定の型の整形手術、歯および種々の歯周部および頭
蓋顔面再構築手順、ならびに骨、軟骨、腱、靭帯および神経再生を一般に含む手
順に革命を起こす。多数の哺乳動物ＯＰおよびＢＭＰコード遺伝子は、現在クロ
ーン化され、そして、細菌を含む種々の系において活性ホモ二量体またはヘテロ
二量体タンパク質として組換え的に発現され得る。形態形成タンパク質アナログ
（増加した生物活性を有する改変体および変異体を含む（以下を参照のこと））
を産生する能力は、ありうる形態形成タンパク質アナログを使用する潜在的な治
療的処置を行なう。

【００１０】 種々の異なった組織および組織型を処置する際に、形態形成タンパク質につい
て大多数の潜在的な治療用途を考えると、これらの形態形成タンパク質の治療的
に有効なアナログを同定するための必要性が存在する。従って、安価であり、長
い寿命を有し、そして増加した組織誘導活性を有し副作用がほとんどないアナロ
グを同定および産生することが望ましい。増加した組織誘導性活性を有する形態
形成アナログを用いる処置は、より迅速にかまたは組織特異的な様式で、組織形
成を誘導し得る。

【００１１】 （本発明の要旨） 本発明は、形態形成タンパク質アナログを同定するための方法および組成物を
提供することによって、これらの問題を解決する。本明細書中に開示される方法
に従って同定される化合物が提供される。本発明はまた、同定された形態形成タ
ンパク質アナログを産生する方法を提供する。形態形成タンパク質応答転写阻害
エレメントを含むＤＮＡ配列の調製のための方法および用途もまた提供される。
本発明のＤＮＡは、目的の遺伝子の発現を抑制するために使用され得る。さらに
、本発明のＤＮＡは、本発明の化合物によって誘導され得る検出可能な産物のイ
ンビボまたはインビトロ阻害のための細胞の調製において使用され得る。本発明
は、形態形成タンパク質アナログを含む薬学的組成物を提供する。同種間および
異種間インプラントにおける組織形成を誘導し得る形態形成タンパク質アナログ
を備える、移植可能な形態形成デバイスがまた提供される。

【００１２】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および請求の範囲か
ら明らかにされる。

【００１３】 （発明の詳細な説明） 本明細書中に記載される本発明が十分に理解され得るために、以下の詳細な説
明を示す。

【００１４】 用語「骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）」は、ＤＮＡおよびアミノ酸配列相同
性に基づく、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰファミリーに
属するタンパク質（ＢＭＰファミリー）のことをいう。ＢＭＰタンパク質ファミ
リーを特徴付ける保存されたＣ末端システインリッチドメイン内で、少なくとも
１つの既知のＢＭＰファミリーのメンバーと少なくとも５０％のアミノ酸配列同
一性を有する場合、タンパク質は本発明に従うＢＭＰファミリーに属する。ＢＭ
Ｐファミリーのメンバーは、全体で５０％未満のＤＮＡまたはアミノ酸配列同一
性を有し得る。

【００１５】 用語「形態形成タンパク質」は、形態形成活性を有するタンパク質のことをい
う（以下に示す）。好ましくは本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク
質ファミリーに属する少なくとも１つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク
質は、前駆細胞を誘導し得、増殖し、そして／または、局部的な環境の合図に依
存して、軟骨、骨、腱、靱帯、神経、または他の型の組織形成を導く分化経路を
開始し、従って、形態形成タンパク質は異なった環境において差次的に挙動し得
る。例えば、骨形成タンパク質は１つの処置部位での骨組織、および異なる処置
部位での神経組織を誘導し得る。

【００１６】 用語「骨形成タンパク質（ＯＰ）」は、軟骨および／または骨を形成するため
の前駆細胞を誘導し得る形態形成タンパク質のことをいう。骨は、膜内性骨また
は軟骨内性骨であり得る。ほとんどの骨形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質フ
ァミリーのメンバーであり、従ってまた、ＢＭＰである。しかしながら、その逆
は真実でない。ＢＭＰ（配列相同性によって同定された）は、機能的バイオアッ
セイにおける骨形成活性を実証し得、本発明に従う骨形成タンパク質であるはず
である。

【００１７】 用語「ＯＰ−１応答細胞」は、ＯＰ−１に結合し得、そしてＯＰ−１媒介生物
学的効果を誘導し得る、細胞表面上のレセプターを提示する任意の細胞をいう。
細胞表面レセプターは、内因性で発現され得るか、またはそのレセプターをコー
ドしているＤＮＡを標的細胞にトランスフェクションすることの結果として発現
され得る。

【００１８】 用語「形態形成タンパク質応答細胞」は、形態形成タンパク質に結合し得、そ
して形態形成タンパク質媒介生物学的効果を誘導し得る、細胞表面上のレセプタ
ーを提示する任意の細胞をいう。細胞表面レセプターは、内因性で発現され得る
か、またはそのレセプターをコードしているＤＮＡを標的細胞にトランスフェク
ションすることの結果として発現され得る。

【００１９】 用語「形態形成活性」、「誘導活性」、「組織誘導活性」、「形態形成タンパ
ク質媒介生物学的効果」および「形態形成タンパク質によって媒介される生物学
的効果」は、代替的に、標的細胞を刺激して、必要に応じて細胞分化を誘導し得
る１つ以上の細胞分裂（増殖）を行う、薬剤の能力をいう。このような標的細胞
は、本明細書中において一般的に、前駆細胞といわれる。細胞増殖は代表的に、
細胞周期の調節の変化によって特徴づけられ、そしてＤＮＡ合成速度もしくは細
胞増殖速度を測定することを含む多数の方法によって検出され得る。細胞分化の
初期段階は、代表的に、前駆細胞の遺伝子発現パターンに対する遺伝子発現パタ
ーンにおける変化によって特徴付けられ、これは特定の細胞発生運命（ｃｅｌｌ
ｆａｔｅ）または細胞型に対する委任（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）の指標であり
得る。細胞分化の後期段階は、遺伝子発現パターン、細胞生理学、および形態学
における変化によって特徴づけられ得る。遺伝子発現、細胞生理学または形態学
における再現可能な任意の変化は、形態形成タンパク質によって誘導される細胞
分化の開始および程度を評価するために使用され得る。

【００２０】 用語「形態形成タンパク質アナログ」は、骨形成タンパク質のような形態形成
タンパク質の特徴的な生物学的効果（形態形成活性、誘導活性、および組織誘導
活性を含む）を擬態し得る物質である。

【００２１】 （形態形成応答転写調節エレメント） 本発明は、形態形成タンパク質（ＯＰ−１を含む）が哺乳動物において遺伝子
発現を調節し得るという発見に基づく。骨形成タンパク質を用いた哺乳動物細胞
の刺激は、広範囲の多数の生物学的活性を誘導し、そして多数の細胞の遺伝子の
発現を調節する。少なくとも１つのこのような遺伝子のプロモーター領域は分析
され、そして骨形成タンパク質応答転写阻害エレメントを含むことが見出された
。

【００２２】 本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質−５（ＩＧＦＢＰ−５）遺伝
子の転写阻害エレメントのＯＰ−１応答特性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ）を利用する。図１は、ＯＰ−１応答転写調節エレメントにおける
ＯＰ−１の作用の概略図である。図１は、本発明のＯＰ−１応答転写阻害エレメ
ントが、ＯＰ−１応答細胞中に存在していることを実証する。ＯＰ−１の非存在
下において、転写調節因子は、プロモーター領域（下流の遺伝子と作動可能に連
結して、その遺伝子の転写を行う）内に位置するＯＰ−１応答転写調節因子と相
互作用する。ＯＰ−１応答細胞とＯＰ−１の接触時には、その転写調節因子は、
ＯＰ−１媒介変化を受け、ＯＰ−１応答転写阻害エレメントに対する結合の失敗
を生じる。結合の欠如は、エレメントの下流に動作可能に結合される遺伝子およ
び位置される遺伝子の転写を、阻害またはダウンレギュレートする。

【００２３】 好ましい実施形態において、転写調節因子は、ＯＰ−１応答転写阻害エレメン
ト（インスリン様増殖因子結合タンパク質−５（ＩＧＦＢＰ−５）のプロモータ
ー領域内に位置する）と、Ｃ／ＥＢＰα様エレメント、ｃ−Ｍｙｂモチーフおよ
びＥ−ｂｏｘ様モチーフに類似する配列を含む２１ｂｐ領域で相互作用する。こ
のＯＰ−１応答転写阻害エレメントの変異分析および欠失分析は、このエレメン
トと作動可能に連結される下流エレメントのＯＰ−１応答転写阻害の欠如を生じ
る（図４および図６を参照のこと）。

【００２４】 本発明の方法および組成物は、骨形成タンパク質転写阻害エレメントのＯＰ−
１応答特性を利用して、形態形成タンパク質アナログを同定する。本発明の１つ
の実施形態において、ラットＩＧＦＢＰ−５遺伝子のプロモータ領域に位置する
ＯＰ−１応答転写阻害エレメントが使用され、ＯＰ−１のような形態形成タンパ
ク質によって誘導される生物学的効果を擬態し得る形態形成タンパク質アナログ
が同定される。

【００２５】 従って、この開示を考慮して、当業者は、新規の形態形成タンパク質アナログ
を同定および評価し得、それによって、形態形成タンパク質が臨床的に有用であ
ると考えられる損傷および疾患の処置における使用のために、可能性のある多く
の治療化合物が増加する。

【００２６】 （形態形成タンパク質） 本発明の形態形成タンパク質は、前駆細胞を刺激して、細胞分裂および細胞分
化に達する生物学的現象のカスケードを行い得る。多くの哺乳動物の形態形成タ
ンパク質が記載されている。いくつかは、胚形成の間の体節の表現型の発現およ
び同定に関与するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホメオボックス遺伝子に対する相同性の
ために命名された「ホメオドメインタンパク質」と称される産物のクラス内に属
する。他の形態形成タンパク質は、ペプチド増殖因子として分類され、これらは
細胞増殖、細胞分化、または両方に対して効果を有する。

【００２７】 ペプチド増殖因子は、配列類似性に主に基づく多くのスーパーファミリーまた
はファミリーに分類され得る（Ｍｅｒｃｏｌａ および Ｓｔｉｌｅｓ、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０２、ｐｐ．４６１−６０（１９８８））。これらのファ
ミリーとしては、以下が挙げられる：上皮増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−
α、ｎｏｔｃｈおよびｄｅｌｔａ）、トランスホーミング増殖因子β（例えば、
ＴＧＦ−β、インヒビン、アクチビン、ＭＩＳ、ＢＭＰ、ｄｐｐおよびＶｇ−１
）；ヘパリン結合増殖因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＣＤＧＦ、およびｉｎｔ−２）
；血小板由来増殖因子；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）；
および神経発育因子。

【００２８】 （ＢＭＰファミリー） 本発明の形態形成タンパク質は、好ましくは、ＴＧＦ−βタンパク質スーパー
ファミリーに属している。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、それら
の構造的または機能的類似性の程度に基づいて、さらにファミリーに分類される
。ＭＢＰファミリーは１つのこのようなファミリーであり、その代表的な骨形態
形成／骨形成タンパク質ファミリーメンバーに対して命名される。主に配列相同
性に基づいて単離された既報の「ＢＭＰ」（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８）のうち
、ＢＭＰ−１を除く全てが、形態形成タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバー
として分類されたままである（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ Ｊ．，９，ｐｐ
．２０８５−９３（１９９０））。

【００２９】 ＢＭＰファミリーは、構造的に関連している形態形成タンパク質である他のメ
ンバー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ遺伝子複合体
（ＤＰＰ）産物、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉｓのＶｇｌ産物、およびそのネズ
ミのホモログ（Ｖｇｒ−１）を含む）を含む（例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．
，「Ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β Ｆ
ａｍｉｌｙ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．５９７−
６４１（１９９０）を参照のこと）。

【００３０】 本発明に従う形態形成タンパク質は、少なくとも１つの既知のＢＭＰファミリ
ーメンバーと、ＢＭＰタンパク質ファミリーを特徴付ける保存されたＣ末端シス
テインリッチドメイン内で、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するポ
リペプチドを含む場合、ＢＭＰファミリーに属する。この定義は、一つには、実
証可能な形態形成活性を有する他のＢＭＰファミリーメンバーのＣ末端ドメイン
間のアミノ酸配列の同一性を比較することに由来する。

【００３１】 Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＰＰおよびＸｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１遺伝子産物は
、互いに５０％同一である（そしてＴＧＦ−βに対して３５−４０％同一である
）。Ｄｐｐ産物およびＶｇ−１産物の両方は、各々の宿主の胚形成の間、初期の
パターン化現象（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ）に関係する形態形成タ
ンパク質である。これらの産物は、哺乳動物の骨形態形成タンパク質であるＢＭ
Ｐ−２およびＢＭＰ−４（それらのＣ末端はＤｐｐのＣ末端ドメインと、７５％
同一である）に最も密接に関係しているようである。

【００３２】 ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末
端ドメインは、ＢＭＰ−２のＣ末端ドメインに対して約６０％同一であり、ＢＭ
Ｐ−６およびＯＰ−１のＣ末端ドメインは８７％同一である。ＢＭＰ−６は、ネ
ズミＶｇｒ−１のヒトホモログのようであり（Ｌｙｏｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６、ｐｐ．４５５４−５９（１９８９
））；これら２つのタンパク質はアミノ酸配列レベルで全体で９２％同一である
（米国特許第５，４５９，０４７号（本明細書中において参考として援用される
）。ＢＭＰ−６は、ＸｅｎｏｐｕｓＶｇ−１産物と５８％同一である。

【００３３】 これらのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびに他のＢＭＰファミリーメンバーの
ＤＮＡおよびアミノ酸配列は公開されて、そして当業者によって使用され得、候
補の形態形成タンパク質アナログがＢＭＰファミリーに属するか否かを決定し得
る。新しいＢＭＰ関連遺伝子産物は、少なくとも１つの形態形成活性を有する類
推によって予測され、そして従って形態形成タンパク質アナログとして分類され
る。

【００３４】 ＢＭＰタンパク質ファミリーメンバーの別の特徴は、それらの２量体化の明白
な能力である。いくつかの骨由来骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、ホ
モダイマーおよびヘテロダイマーとして、活性型で、見出された。ヘテロダイマ
ーを形成するＯＰおよびＢＭＰの能力は、形態形成タンパク質における、さらな
るまたは変化した形態形成誘導能力を与え得る。ヘテロダイマーは、ホモダイマ
ーと比べて、ＯＰレセプターおよびＢＭＰレセプター分子に対して定性的または
定量的に異なる結合活親和性を示し得る。変化した結合親和性は、異なるシグナ
ル伝達経路を媒介するレセプターの差次的活性化を順々に誘導し得、これは、結
局、異なる生物学的活性または生物学的結果を誘導し得る。変化した結合親和性
はまた、組織特異的または細胞型特異的な様式で現れ、それによって特定の前駆
細胞型のみを誘導して、増殖および／または分化を行い得る。

【００３５】 当該分野で公知の適切なインビトロ、エクスビボおよびインビボバイオアッセ
イ（本明細書中で記載されるのもを含む）は、新しいＢＭＰ関連遺伝子産物また
は新しいヘテロマーの種が、既知または新しい形態形成活性を有するか否かを確
かめるために使用され得る。どこで、そして、いつ、その遺伝子および遺伝子産
物が発現するかを定義する発現研究および局在研究はまた、潜在的な形態形成の
活性を同定するために、使用され得る。核酸およびタンパク質の局在決定の手順
は、当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）。

【００３６】 同定されたＢＭＰの多くは骨形成性で、そして哺乳動物に移植されるとき、骨
および軟骨の形成を誘導し得る。骨形成タンパク質に対する配列相同性に基づい
て同定されたいくつかのＢＭＰは、他の形態形成活性を有する。例えば、報告さ
れたところによれば、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３は、哺乳動物に移植され
たとき、腱／靱帯様組織の異所性形成（ｅｃｔｏｐｉｃ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
を誘導する（Ｃｅｌｅｓｔｅら、ＷＯ９５／１６０３５）。このバイオアッセイ
、または当業者によって選択される任意の他の適切なアッセイを使用して、腱／
靱帯様組織の形成を誘導し得る一つ以上の形態形成タンパク質が同定され得、そ
して本明細書に記載される方法に従って最適化され得る。

【００３７】 骨形成性であることが公知である特定のＢＭＰはまた、神経細胞分化を誘導し
得る。ＢＭＰ−２またはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）を用いて処理された胚性マウス
細胞は、星状細胞様（神経膠の）細胞へ分化し、そしてＢＭＰ−２を使用する末
梢神経再生が最近報告された（Ｗａｎｇら、ＷＯ９５／０５８４６）。さらに、
ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）は、神経板細胞に隣接す
る表皮外胚葉において発現される。異所性の組換えＢＭＰ−４およびＯＰ−１（
ＢＭＰ−７）タンパク質は、神経板細胞が背神経細胞（ｄｏｒｓａｌ ｎｅｕｒ
ａｌ ｃｅｌｌ）の発生運命の分化（ｆａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ
）を開始するように誘導し得る（Ｌｉｅｍら、Ｃｅｌｌ、８２、ｐｐ．９６９−
７９（１９９５））。脊髄レベルでは、ＯＰ−１および他のＢＭＰは、神経堤細
胞の分化を誘導し得る。ＯＰ−１およびこれらのＢＭＰは多くまたは全ての背神
経細胞型（上衣板細胞、神経堤細胞、および交連ニューロンを含む）を、局在化
された位置の合図に依存して、誘導し得る。

【００３８】 元来骨基質由来のいくつかの骨形成タンパク質は、胚神経系に局在化され、そ
して神経原性誘導特性を有するようであり、ＢＭＰタンパク質ファミリーのこれ
らおよび他のメンバーは、まだ開示されていないさらなる組織誘導特性を有する
可能性が高い。本明細書中に記載したような、形態形成タンパク質のアナログを
用いて形態形成タンパク質の組織誘導特性を擬態する能力は、既知の形態形成タ
ンパク質の新しい組織誘導特性を擬態するために有用であることが想到される。

【００３９】 （形態形成タンパク質の生成） 本発明の形態形成タンパク質は種々の起源由来であり得る。形態形成タンパク
質は天然起源から単離され得、または宿主細胞中の適切な組換えＤＮＡ分子を発
現することによって産生され得る。さらに、本発明の形態形成タンパク質は、合
成により得られ得、そして合成形態形成タンパク質は、必要に応じて宿主細胞中
の組換えＤＮＡ分子から発現され得る。

【００４０】 （好ましい形態形成タンパク質） 本発明の１つの実施形態において、形態形成タンパク質アナログによって活性
を擬態される形態形成タンパク質は、２量体種を生産するようにジスルフィド結
合した対を含み、ここでサブユニットの少なくとも１つは、ＢＭＰタンパク質フ
ァミリーに属する組換えポリペプチドを含む。哺乳動物の前駆細胞に利用可能で
ある場合、２量体種はホモ２量体またはへテロ２量体であり得、そして細胞増殖
および／または組織形成を誘導し得る。前駆細胞は、好ましくは軟骨内性骨また
は膜内性骨、軟骨、腱／靱帯様組織神経組織および他の器官の組織型（腎臓組織
を含む）からなる群から選択される、一つ以上の組織型の形成を誘導し得る。別
の好ましい実施形態において、形態形成タンパク質は、前駆細胞を誘導して、軟
骨内性骨または膜内性骨および軟骨からなる群から選択される一つ以上の組織型
を形成し得る、骨形成タンパク質である。

【００４１】 本発明の、好ましい形態形成タンパク質および骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−
２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−
９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４
、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＣＯＰ−５およ
びＣＯＰ−７からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。
好ましくは、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、Ｂ
ＭＰ−４、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６；さらに好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ
−７）およびＢＭＰ−２；そして最も好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）から
なる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。

【００４２】 当業者によって理解されるように、本発明の形態形成タンパク質アナログによ
って活性が模倣される好ましい形態形成タンパク質は、産生される組織型、およ
び選択されるインプラント部位または処置部位に部分的に依存する。これらの変
異体は、経験的に試験され得る。

【００４３】 （形態形成タンパク質アナログ） 本発明に従う形態形成タンパク質アナログは、標的細胞もしくは組織において
、形態形成タンパクによって誘導または媒介される、少なくとも１つの生物学的
効果を模倣する能力のある化合物である。１つの実施形態において、標的細胞ま
たは組織は、形態形成タンパク応答細胞または形態形成タンパク応答性組織であ
る。この形態形成タンパク応答細胞または形態形成タンパク応答性組織は、形態
形成タンパク質に、内因的に応答性であり得るか、または、細胞への形態形成タ
ンパク質に結合し得るレセプターをコードするＤＮＡのトランスフェクトの結果
として、応答性であり得る。形態形成タンパク質が媒介する効果は、細胞応答お
よび分子応答（例えば、前駆細胞からの組織形成の誘導）を含み、これは、形態
形成タンパク質への細胞または組織の暴露に起因する。

【００４４】 本発明の形態形成タンパク質により増殖および／または分化へ誘導される前駆
細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。好ましい前駆細胞は、哺乳動物の軟骨
芽細胞、骨芽細胞および神経芽細胞、それらの全てのより早い発生前駆体、およ
びこれらから発生した全ての細胞（例えば、軟骨芽細胞、前軟骨芽細胞および軟
骨細胞）を含む。しかし、形態形成タンパク質は、進化を通じて高度に保存され
ており、そして非哺乳動物前駆細胞もまた、同じ種または異なる種の形態形成タ
ンパク質および形態形成タンパク質アナログによって刺激されるようである。し
たがって、有害な免疫応答を起こすことなく、ヒトへ異種細胞を移植するための
スキームが利用可能になった場合、本明細書に示される手順に従って形態形成タ
ンパク質アナログによって刺激された非哺乳動物前駆細胞は、ヒトにおける組織
の再生および修復に有用である。

【００４５】 好ましい実施形態において、形態形成タンパク質媒介生物学的効果は、ＯＰ−
１媒介生物学的効果である。ＯＰ−１媒介生物学的効果は、インビボまたはイン
ビトロのいずれかにおける、ＯＰ−１応答細胞または組織の、ＯＰ−１との接触
から生じる任意の生物学的効果である。詳細には、ＯＰ−１に媒介される生物学
的効果は、軟骨芽細胞、骨芽細胞および神経芽細胞、それらの全てのより早い発
生前駆体およびこれらから発生した全ての細胞（例えば、軟骨芽細胞、前軟骨芽
細胞および軟骨細胞）の増殖および分化の誘導に関する効果を含む。この生物学
的効果は生化学的または分子的であり得る。本発明の好ましい生物学的効果は、
遺伝子発現の阻害、およびＯＰ−１応答転写阻害エレメントに結合する転写調節
因子の不全である。

【００４６】 軟骨性骨形成に関する特定のＯＰ−１媒介生物学的効果は、細胞増殖または有
糸分裂誘発の誘導、分化、遺伝子発現調節の表現型マーカーの誘導を含む。好ま
しい実施形態において、ＯＰ−１媒介効果は、遺伝子発現の阻害またはダウンレ
ギュレーションである。

【００４７】 （推定される形態形成タンパク質アナログの同定） 本発明の１つの実施形態において、形態形成タンパク質媒介生物学的効果を誘
導し得る化合物を同定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を
含む。ａ）レポーター遺伝子または検出可能な産物をコードする遺伝子に作動可
能に連結される形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントを含むＤＮＡ配列を
含む標的細胞を提供する工程であって、ここで、このＤＮＡ配列は、形態形成タ
ンパク質に曝露される形態形成タンパク質応答細胞中に存在する場合、このＤＮ
Ａ配列が制御する遺伝子の転写をダウンレギュレーションする工程；ｂ）標的細
胞を試験化合物にさらす工程；およびｃ）検出可能な産物の産生レベルを、試験
化合物不在下において観察されるレベルと比較する工程。本発明の形態形成タン
パク質（ＯＰ−１）応答転写阻害エレメントは、形態形成タンパク質応答細胞に
おける制御エレメントの下流に位置する遺伝子の発現を調節するシス作用性エレ
メントである。好ましい実施形態において、シス作用性エレメントは、ラットＩ
ＧＦＢＰ−５プロモーター由来のＯＰ−１応答転写阻害エレメントである。

【００４８】 本発明のＯＰ−１応答転写阻害エレメントは、遺伝子転写開始部位の上流約２
５塩基対〜３キロ塩基対の間に位置し得る。１つの実施形態において、このＯＰ
−１応答転写阻害エレメントは、遺伝子転写開始部位の上流約２５塩基対〜２キ
ロ塩基対の間に位置する。別の実施形態においては、このＯＰ−１応答転写阻害
エレメントは、遺伝子の転写開始部位の上流約２５塩基対〜１キロ塩基対の間に
位置する。好ましい実施形態において、このＯＰ−１応答転写阻害エレメントは
、遺伝子転写開始部位の上流約２０〜５００塩基対の間に位置する。より好まし
い実施形態において、このＯＰ−１応答転写阻害エレメントは、遺伝子の転写開
始部位の上流約２５〜１５０塩基対の間に位置する。

【００４９】 従って、ある実施形態において、このＯＰ−１応答転写阻害エレメントは、配
列番号１のヌクレオチド８１７〜８３７を含む。別の実施形態において、このＯ
Ｐ−１応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌクレオチド８０７〜８４７を
含む。さらなる別の実施形態において、このＯＰ−１応答転写阻害エレメントは
、配列番号１のヌクレオチド７９９〜８５７を含む。

【００５０】 さらに、本発明のＯＰ−１応答転写阻害エレメントは、検出可能な産物をコー
ドする下流遺伝子に作動可能に連結し、ＯＰ−１がＯＰ−１応答細胞上の細胞表
面レセプターと相互作用する場合、細胞内イベントのカスケードが誘導される。
細胞内カスケードの誘導の１つの結果は、ＯＰ−１応答転写阻害エレメントから
下流に位置し、そしてＯＰ−１応答転写阻害エレメントに作動可能に結合する遺
伝子の転写のダウンレギュレーションである。

【００５１】 本発明の標的細胞は、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子に作動可
能に連結した形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントを含むＤＮＡ配列を含
む任意の細胞である。このＤＮＡは、標的細胞中に天然に存在し得るか、または
標的細胞にトランスフェクトされ得るかのいずれかである。形態形成タンパク質
アナログの特徴である、誘導された細胞内イベントのカスケードは、様々な細胞
内シグナル伝達分子（例えば、環状ヌクレオチド、プロテインキナーゼ、ジアシ
ルグリセロール、ＳＭＡＤ、プロテインフォスファターゼ）を含む。これらの細
胞内シグナル伝達分子は、転写および／または翻訳における修飾を含む遺伝子発
現の調節を引き起こす。

【００５２】 本発明の標的細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、そして骨形成前駆細胞
、頭蓋冠細胞、骨肉腫細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨および神経細胞を含むが
、これらに限定されない。ＯＰ−１を含む形態形成タンパク質に応答性の任意の
細胞は、試験化合物が形態形成タンパク質アナログであるか否かを決定するため
に用いられ得る。さらに、標的細胞は、形態形成タンパク質または形態形成タン
パク質アナログを結合する能力のある形態形成タンパク質レセプターの内因性発
現に起因して本来応答性であり得るか、あるいは形態形成タンパク質または形態
形成タンパク質アナログに結合し得るレセプターをコードするＤＮＡの標的細胞
へのトランスフェクションの結果として本来応答性であり得る。

【００５３】 形態形成タンパク質アナログを同定する方法は、レポーター遺伝子システムを
用いることにより、ここで、標的細胞は、試験化合物にさらされて、そして本発
明のＯＰ−１応答転写阻害エレメントに作動可能に連結する検出可能な遺伝子の
発現のダウンレギュレーションを測定する。この遺伝子産物のダウンレギュレー
ションは、試験化合物がＯＰ−１媒介生物学的効果を誘導し得、そしてそれゆえ
試験化合物が形態形成タンパク質アナログであることを示す。

【００５４】 形態形成タンパク質アナログを同定するために有用な、いくつかのレポーター
遺伝子が利用可能である。これらレポーターシステムの様々な技術的局面の特徴
的詳細は、Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら編 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に見出される。さらに当業者に理解されるよ
うに、検出可能な産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をコードする任意の遺伝子が
、形態形成タンパク質アナログを同定するためのレポーター遺伝子システムとし
て用いられ得る。したがって、本発明における検出可能な産物は、ＲＮＡまたは
タンパク質であり得る。

【００５５】 本発明の１つの実施形態において、レポーター遺伝子システムは、ホタルのル
シフェラーゼレポーターシステムであり、そして検出可能な産物は、ルシフェラ
ーゼである。組換えＤＮＡ技術を用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連
結されたＩＧＦＢＰ−５プロモーターの様々な融合物が、構築された（実施例２
）。このアッセイは、プロモーター活性の測定のために、高感度な、迅速な、非
放射性アッセイを提供する（Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．ら Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，７，５〜１３（１９８８）；Ｂｒａｓｉｅｒ，Ａ．Ｒ．ら Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，７，１１１６〜１１２２（１９８９））。標的細胞を、レポー
タータンパク質ルシフェラーゼを放出するために溶解した。次いで、この溶解物
をＡＴＰおよび基質ルシフェリンと合わせた。ルシフェラーゼ酵素は、基質の迅
速なＡＴＰ−依存性酸化を触媒し、次いでこれが光を発する。総光線出力量を測
定し、そしてこれは、酵素濃度の広い範囲にわたって、存在するルシフェラーゼ
量に比例する。

【００５６】 別の有用なレポーターシステムは、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）システムである。したがって、別の実施形態において、検出
可能な産物は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである。この
システムは、最も頻繁に用いられるレポーターシステムである。したがって、こ
のシステムの主な利点は、広く有効であり、そして広く受け入れられたプロモー
タ活性の測定であることである。ＣＡＴは、アセチルＣｏＡからクロラムフェニ
コールへのアシル基の転位を触媒する酵素である。このアッセイにおいて、標的
細胞は、ＣＡＴを放出するよう溶解させ、そして溶解物を、アセチルＣｏＡおよ
び放射活性で標識したクロラムフェニコールとインキュベートする。クロラムフ
ェニコールのアセチル化誘導体を、薄層クロマトグラフィまたは相抽出（ｐｈａ
ｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）のいずれかを用いて、非アセチル化形態から分離
する。アセチル化の程度はＣＡＴ遺伝子活性の量を反映する。

【００５７】 さらに別の有用なレポーターシステムは、免疫学を基礎にするヒト成長ホルモ
ン（ｈＧＨ）レポーターシステムである。このシステムは、相対的に迅速かつ簡
便に用いられる。ｈＧＨは、細胞抽出液よりもむしろ培地中でアッセイされる。
このことは、トランスフェクトされた細胞の単一集団によって指向される発現の
経時的のモニタリングを、細胞を破壊せずに可能にする。したがって、なおさら
なる別の実施形態において検出可能な産物は、ｈＧＨである。

【００５８】 試験化合物が形態形成タンパク質アナログであるか否かを決定するために、上
記のような特定の遺伝子のダウンレギュレーションをアッセイする前に、標的細
胞を、ＯＰ−１媒介生物学的効果を誘導するに十分な時間の間、細胞培養条件下
に試験化合物にさらす。好ましいＯＰ−１応答転写阻害エレメント、および胎児
ラット頭蓋冠（ＦＲＣ）細胞を用いて、ＯＰ−１媒介生物学的効果は、少なくと
も２４時間で誘導される（実施例３）。本発明の特定の実施形態において、形態
形成タンパク質媒介生物学的効果は、形態形成タンパク質アナログへの暴露の少
なくとも１６〜７２時間後で検出される。好ましくは、この生物学的効果は、形
態形成タンパク質アナログへの暴露の２４時間後に検出される。当業者に理解さ
れるように、正確な細胞培養条件および培養の時間の決定は、慣用的な実験によ
って確認され得る。

【００５９】 １つの実施形態において、本発明の方法によって同定された試験化合物の有効
性は、形態形成タンパク質応答細胞を試験化合物に晒す工程、および形態形成タ
ンパク質によって媒介される生物学的効果を検出する工程によって確認され得る
。したがって本発明の方法は、形態形成タンパク質によって媒介される生物学的
効果の、試験化合物による誘導を検出する工程をさらに包含する。この生物学的
効果は、形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントへの細胞内分子の結合にお
ける変化、分化の表現形マーカーの誘導、軟骨性骨または膜性骨を形成する前駆
細胞の誘導、軟骨を形成する前駆細胞の誘導、または組織／靭帯様または神経様
組織を形成する前駆細胞の誘導化した群から選択される。好ましくは、形態形成
タンパク質により媒介される生物学的効果は、１つ以上の組織型（好ましくは、
軟骨性骨または膜性骨、軟骨、腱／靭帯様組織、神経組織および他の器官組織型
（腎組織を含む）から選択される）を形成する前駆細胞の誘導である。さらに好
ましくは、形態形成タンパク質は、軟骨性骨または膜性骨、および軟骨からなる
群から選択される１つ以上の組織型を形成する前駆細胞を誘導し得る骨形成タン
パク質である。

【００６０】 別の実施形態において、形態形成タンパク質応答細胞は、ＯＰ−１応答細胞で
あり、そして形態形成タンパク質媒介影響は、ＯＰ−１媒介効果である。生物学
的効果は、胎児ラット頭蓋冠細胞において、軟骨細胞および骨芽細胞分化にとも
なう表現型マーカーの誘導（例えば、アルカリフォスファターゼ活性、骨小節の
形成、オステオカルシン発現）を含むがこれに限定されない。さらに、生物学的
効果は、細胞内分子（例えば、転写調節因子）のＯＰ−１応答転写阻害エレメン
トへの結合における変化を含む。

【００６１】 なおさらに別の実施形態において、本発明の方法によって同定された試験化合
物の有効性は、細胞内分子（例えば、転写調節因子）のＯＰ−１応答転写阻害エ
レメントへの結合を測定することにより確認され得る。

【００６２】 細胞内分子のＯＰ−１応答性エレメントへの結合は、ゲル移動度シフト分析を
用いて決定され得る（実施例４）。このアッセイは、低イオン強度ポリアクリル
アミドゲルを通って、ＤＮＡ−タンパク質複合体が、非結合のＤＮＡフラグメン
トよりゆっくり移動するという観察に基づく。このアッセイは、細胞抽出液物に
おいてタンパク質による配列特異的ＤＮＡ結合を検出するための高感度な方法で
ある。このアッセイはまた、親和性、豊富さ、会合速度定数、解離速度定数およ
びＤＮＡ結合タンパク質の結合特異性の定量的測定することを可能にする。末端
ラベルしたＤＮＡフラグメントに特異的に結合するタンパク質は、電気泳動の間
フラグメントの移動度を遅らせ、その結果、個々のＤＮＡ−タンパク質複合体に
対応する分離したバンドを生じる。

【００６３】 さらなる実施形態において、本発明の方法により同定された試験化合物の有効
性は、哺乳動物における組織部位を、本発明の形態形成タンパク質のアナログへ
晒す工程、および誘導された組織を形態形成を検出する工程によって確認され得
る。したがって、本発明の方法は、試験化合物の不在下で観察されるレベルより
少ない、検出可能な産物の産生レベルを誘導する試験化合物を、組織部位に晒す
工程、および哺乳動物において組織形成を誘導する形態形成タンパク質アナログ
の能力を検出する工程をさらに包含する。

【００６４】 （ＯＰ−１転写阻害エレメント） 本発明の実施形態において、ＯＰ−１媒介生物学的効果を誘導するためのＤＮ
Ａ配列が提供される。このＤＮＡ配列は、レポーター遺伝子に作動可能にに連結
されたＯＰ−１応答転写阻害エレメントを含み、その結果、ＯＰ−１と接触した
ＯＰ−１応答細胞中に存在する場合、このＤＮＡ配列に作動可能に連結されたこ
のエレメントの下流に位置するレポーター遺伝子の転写がダウンレギュレーショ
ンされるか、または阻害される。１つの実施形態において、形態形成タンパク質
応答転写阻害エレメントを含むＤＮＡ配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜１
００２（図２における−８８８〜＋１１４）を含む。別の実施形態において、形
態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌクレオチド４９８
〜１００２（図２における−３９０〜＋１１４）を含む。さらに別の実施形態に
おいて、形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌクレオ
チド５９１〜１００２（図２における−２９７〜＋１１４）を含む。別の実施形
態において、形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌク
レオチド７３２〜１００２（−１５１〜＋１１４）を含む。さらに別の実施形態
において、形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌクレ
オチド７５７〜１００２（−１３１〜＋１１４）を含む。好ましい実施形態にお
いて、形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌクレオチ
ド８０７〜８４７（−８１〜−４１）を含む。最も好ましい実施形態において、
形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番号１のヌクレオチド８１
７〜８３７（−７１〜−５１）を含む。

【００６５】 したがって、好ましい形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントは、配列番
号１のヌクレオチド８１７〜８３７（−７１〜−５１）を含む。このＤＮＡ配列
は、ＣＡＡＴ様配列（配列番号６のヌクレオチド１〜５）、Ｃ／ＥＢＰα様エレ
メント（配列番号６のヌクレオチド５〜１５）、およびｃ−ｍｙｂまたはＥ−ｂ
ｏｘ様モチーフ（配列番号６のヌクレオチド１４〜２０）として公知のヌクレオ
チド配列を含む。これらの各配列は、そのそれぞれのＤＮＡ結合性タンパク質に
結合し得る。したがって、ＣＡＡＴ様配列は、ＣＡＡＴ結合性タンパク質を結合
し、Ｃ／ＥＢＰα様エレメントは、Ｃ／ＥＢＰαを結合し、ｃ−ｍｙｂモチーフ
は、ｃ−ｍｙｂを結合し、そしてＥ−ｂｏｘ様モチーフは、Ｅ−ｂｏｘ結合タン
パク質を結合する。ＯＰ−１応答転写阻害エレメントのこの２１塩基対ヌクレオ
チド配列（配列番号６のヌクレオチド１〜２１）内の変異は、ＯＰ−１応答性の
損失を生じる（実施例５）。詳細には、Ｃ／ＥＢＰα変異体（配列番号９）およ
びＥ−ｂｏｘ変異体（配列番号１０）は、遺伝子発現のＯＰ−１媒介ダウンレギ
ュレーションの損失を生じる。さらに、ＣＡＡＴ変異体（配列番号７）およびＣ
変異体（配列番号８）もまた、遺伝子発現をダウンレギュレーションする。しか
し、ＣＡＡＴ変異体およびＣ変異体のダウンレギュレーションは、ＯＰ−１に媒
介されない。

【００６６】 本発明の別の実施形態において、このＤＮＡ配列は、ストリンジェンな条件下
において、上記のいずれの配列にもハイブリダイズする。ストリンジェンなハイ
ブリダイゼーション条件の１つの例は、６５℃における４×ＳＳＣ中のハイブリ
ダイゼーション（またはプローブと核酸配列の間のミスマッチ塩基対を含まない
ハイブリッドのために算出された溶解温度より１０℃高い）であり、続いてハイ
ブリダイゼーション温度で０．１×ＳＳＣ中で洗浄する。別のストリンジェンな
ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃での
ハイブリダイゼーションである（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ．３８７〜８
９（１９８２）を参照）。

【００６７】 形態形成タンパク質媒介生物学的効果を誘導する試験化合物の能力を評価する
ために適切であるベクターと宿主細胞は、当該分野において周知である。有用な
宿主細胞は、培養にある初代の、形質転換された真核生物細胞または不死化した
真核生物細胞、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｉａのような酵母、昆
虫バキュロウイルス細胞系を含むが、これらに限定されない。好ましい真核生物
宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、霊長類ブタまたはハムスターの細胞を含む
哺乳動物細胞である。

【００６８】 本発明の単離されたＤＮＡ配列は、レポーター遺伝子または検出可能な遺伝子
産物をコードする選択される任意の他の遺伝子に作動可能に連結された形態形成
タンパク質応答転写阻害エレメントを含む。１つの実施形態において、このＤＮ
Ａ配列は、レポーター遺伝子または選択される他の遺伝子の挿入のためのクロー
ニング部位をさらに含む。クローニング部位におけるレポーター遺伝子または選
択される他の遺伝子の挿入は、形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントをレ
ポーター遺伝子または選択範囲の他の遺伝子に作動可能に連結する。哺乳動物細
胞へのトランスフェクトのためのＤＮＡベクター設計は、目的の遺伝子（これは
、以下を含む：適切な転写開始配列、適切な転写終了配列、および適切な転写エ
ンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルのよう
な効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；
翻訳効率を増大する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列）；タンパ
ク質安定性を亢進する配列）；および所望する場合に、タンパク質分泌を増大す
る配列）の発現を促進するための適切な配列を含むべきである。本発明のベクタ
ーを調製する技術的局面のさらなる詳細は、当該分野における多くの教科書およ
び実験室マニュアルに見出され得る。例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照。

【００６９】 （形態形成タンパク質アナログの産生） 本発明の１つの実施形態において、形態形成タンパク質の少なくとも１つの生
物学的効果を模倣し得る任意の化合物は、その化学的性質または生化学的性質に
関わらず、形態形成タンパク質アナログとして用いられ得る。本発明の形態形成
タンパク質アナログは、様々な供給源に由来し得る。形態形成タンパク質アナロ
グは、天然の供給源から単離され得るか、または宿主細胞において適切なＤＮＡ
分子を発現することによって産生され得る。さらに、本発明の形態形成タンパク
質アナログは、合成的に誘導され得る。本発明の合成形態形成タンパク質アナロ
グは、合理的な薬物設計にしたがって産生され得る。本発明の合成形態形成タン
パク質アナログは、必要に応じて宿主細胞において組換えＤＮＡ分子から任意に
発現され得る。さらに、本発明の方法にしたがって同定される形態形成タンパク
質アナログは、商業的に有用な量で産生され得る。

【００７０】 本発明に従う形態形成タンパク質アナログの商業的に有用な量は、任意の適切
な方法を使用して産生され得る。これらの方法としては、宿主細胞からの発現お
よび精製、合成プロセス、発酵または細胞培養が挙げられるがこれらに限定され
ない。

【００７１】 形態形成タンパク質アナログの組換え発現について適切な宿主ベクター系は、
当該分野で周知である。有用な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、
ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｉａのような酵母、昆虫−バキュロウ
イルス細胞系、および培養中の原発性、形質転換されたかまたは不死化真核生物
細胞が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては
、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢＳＣ細胞が挙げられる。

【００７２】 適切なベクターが、選択された宿主系に従って選択される。有用なベクターと
しては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、レトロウイルスベクター
を含む昆虫および動物ウイルスベクター、および他の単鎖および二重鎖ＤＮＡウ
イルスが挙げられるがこれらに限定されない。

【００７３】 本発明の１つの実施形態において、形態形成タンパク質アナログは、原核生物
宿主において発現される組換えＤＮＡ分子に由来し得る。組換えＤＮＡ技術を使
用して、Ｅ．ｃｏｌｉ中で天然供給源の骨形成配列の組換え発現を誘導するため
の種々の融合遺伝子を構築した（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５
，３５４，５５７号、本明細書中で参考として援用される）。類似した手順を使
用して、天然供給源の形態形成タンパク質アナログをコードするＤＮＡが、酸不
安定な切断部位（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）をＥ．ｃｏｌｉ中での発現を促進するために
適切なリーダー配列（例えば、「ＭＬＥリーダー」）によって連結された融合構
築物として調製され得る。

【００７４】 本発明の別の実施形態において、形態形成タンパク質アナログは、哺乳動物宿
主／ベクター系を使用して発現される。その構造が天然物質の構造に密接に似て
いるタンパク質を産生するために、哺乳動物細胞培養系における治療用途のため
の哺乳動物タンパク質を組換え産生することが好ましくあり得る。トランスフェ
クトが容易である適切な細胞および細胞株の樹立を必要とする、哺乳動物細胞に
おける組換えタンパク質産生は、再配列されていない配列を有する外来ＤＮＡを
安定して維持し得、これは、効率的な転写、翻訳、翻訳後修飾およびタンパク質
の分泌のために必要な細胞性成分を有する。さらに、目的の遺伝子を保有する適
切なベクターが必要である。

【００７５】 哺乳動物細胞へのトランスフェクションのためのＤＮＡベクター設計は、以下
を含む目的の遺伝子の発現を促進するための適切な配列を含むべきである：適切
な転写開始、終結およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル
化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安
定化する配列；翻訳効率を強化する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配
列）；タンパク質安定性を強化する配列；ならびに所望の場合にタンパク質分泌
を強化する配列。

【００７６】 好ましいＤＮＡベクターはまた、マーカー遺伝子および目的の遺伝子のコピー
数を増幅するための方法を含む。ＤＮＡベクターはまた、安定化配列（例えば、
ｏｒｉ様配列またはＡＲＳ様配列およびテロメア様配列）を含み得るか、あるい
は宿主ゲノムへの指向されたかまたは指向されていない組み込みを助けるように
設計され得る。

【００７７】 哺乳動物細胞発現系の開発における実質的な進歩は最近１０年でなされ、そし
て、この系の多数の局面は、十分に特徴付けられている。有用な細胞を含む哺乳
動物細胞における外来タンパク質の産生、タンパク質発現促進配列、マーカー遺
伝子、および遺伝子増幅法の詳細な概説は、Ｍ．Ｍ．Ｂｅｎｄｉｇ，Ｇｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７、９１−１２７頁（１９８８）において開示さ
れる。

【００７８】 組換えタンパク質のトランスフェクション、発現および精製の特定の詳細は十
分に実証されていて、そして、当業者によって理解されている。哺乳動物細胞発
現系における外来遺伝子の組換え生成において使用される各工程のの種々の技術
的な局面に関するさらなる詳細は、当該分野の多数の教科書および研究室マニュ
アルにおいて見出され得る。例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。

【００７９】 手短に言うと、特定の哺乳動物細胞中で外来遺伝子を発現するために有用な最
も特徴付けられた転写プロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウ
イルスの主要な遅発型プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、マウスメタロチオネイン−
Ｉプロモーター（ｍＭＴ−Ｉ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長い末端反復（
ＬＴＲ）、マウス乳腺癌ウイルス長い末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、およびヒ
トサイトメガロウイルスの主要な中間−初期プロモーター（ｈＣＭＶ）がある。
これらのプロモーターのすべてについてのＤＮＡ配列は、当該分野で公知であり
、そして市販されている。

【００８０】 哺乳動物細胞系における遺伝子増幅の１つの方法は、ｄｈｆｒ−細胞株中での
選択可能なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＥＲ）遺伝子の使用である。一般的
に、ＤＨＦＲ遺伝子は、目的の遺伝子を運搬するベクター上に提供され、そして
漸増濃度の細胞障害性薬物メトトレキセート（ＭＴＸ）の添加は、ＤＨＦＲ遺伝
子コピー数の増幅ならびに物理的に関連した目的の遺伝子のコピー数の増幅を生
じる。トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ細胞
）における選択可能な、増幅可能なマーカー遺伝子としてのＤＨＦＲは、当該分
野で特に十分に特徴付けられている。他の有用な増幅マーカー遺伝子としては、
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝
子が挙げられる。

【００８１】 好ましい発現系において、遺伝子の増幅は、産生されるマーカータンパク質の
レベルを減少するように、マーカー遺伝子発現調節配列（例えば、エンハンサー
、プロモーター、および転写開始配列または翻訳開始配列）を改変することによ
って、さらに増強される。ＤＨＦＲ転写のレベルを低くすることは、トランスフ
ェクトされた細胞が、メトトレキセート（例えば、０．１μＭ ＭＴＸ）のさら
に低いレベルにおける増殖に適合し得るように、ＤＨＦＲ遺伝子コピー数（およ
び、物理的関連遺伝子）を増加させる。好ましい発現ベクター（例えば、ｐＨ７
５４およびｐＨ７５２（Ｏｐｐｅｒｍａｎら、米国特許第５，３５４，５５７号
、図１９Ｃおよび図１９Ｄ））は、弱いＤＨＦＲプロモーターを生成するように
、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて操作されている。当業者によって考慮され
るように、他の有用な弱いプロモーター（開示されているプロモーターおよび本
明細書における好ましいプロモーターとは異なる）が、標準的ベクター構築の方
法論を用いて構築され得る。さらに、他の、種々の調節配列もまた、同じ効果を
達成するよう改変され得る。

【００８２】 別の遺伝子増幅スキーム（ｓｃｈｅｍｅ）は、ＳＶ４０ベクターを用いてトラ
ンスフェクトされたＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８細胞の温度感受性（ｔｓ）に依存す
る。３３℃までの温度の低下は、温度感受性ＳＶ４０ Ｔ抗原を安定化し、この
抗原は、組み込んでトランスフェクトされたベクターＤＮＡの切断および増幅を
引き起こし、これによって目的の物理学的関連遺伝子を増幅する。

【００８３】 細胞／細胞株の選択はまた、重要であり、そして熟練した開業医の必要性に依
存する。サル腎臓細胞（ＣＯＳ）は、ベクター構築およびクローン化遺伝子の発
現を迅速に試験するための有用な手段を提供して、一過性の高いレベルの遺伝子
発現を提供する。ＣＯＳ細胞は、目的の遺伝子を保有するシミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）ベクターを用いてトランスフェクトされる。トランスフェクトされ
たＣＯＳ細胞は、最終的には死ぬため、所望のタンパク質産物の長期産生を妨げ
る。しかし、一過性の発現は、安定な細胞株の発生ために必要な時間を浪費する
プロセスを必要としない。

【００８４】 ＣＨＯ細胞は、広範囲な細胞型由来の多種多様なタンパク質を首尾よく発現す
ることを可能にする。従って、哺乳動物細胞発現系において産生される組換えタ
ンパク質におけるグリコシル化パターンが、天然のタンパク質と同一であり得な
い場合、オリゴ糖の側鎖の違いは、しばしば発現されたタンパク質の生物学的活
性に必須ではないことである。

【００８５】 いくつかの種々の哺乳動物細胞発現系を用いて、本発明に従う組換え形態形成
タンパク質アナログを発現し得る。安定な細胞株は、骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎ
ｉｃ）タンパク質ＯＰ−１の長期産生のための、ＣＨＯ細胞およびＢＳＣ細胞の
温度感受性（ｔｓ）株（シミアン腎臓細胞、ＢＳＣ４０−ｔｓＡ５８；Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９２−９６頁（１９８８））を用いて発現されて
いる。確立した細胞株の中で、とりわけＣＨＯ細胞はこれまで最も良く特徴付け
られ得、そして組換え形態形成タンパク質の哺乳動物細胞発現のための好ましい
細胞株である。

【００８６】 （薬学的組成物） 本発明の形態形成タンパク質アナログは、薬学的組成物の一部として処方され
得る。本発明によって提供される薬学的組成物は、患者に投与されるか、または
移植される場合、形態形成タンパク質の生物学的効果を模倣し得る少なくとも１
つの形態形成タンパク質アナログを含む。本発明の組成物は、取り込まれた特定
の臨床的状態に従って選択された処置部位で特定の型の組織を誘導するのに効果
のある用量で投与される。所定の適用に対する好ましい薬学的処方および治療学
的に効果のある用量の投薬計画の決定は、十分に、当業者の考慮する範囲（例え
ば、投与形態、患者の状態および体重）内であり、所望の処置の範囲であり、そ
して処置のための患者に寛容である。

【００８７】 本発明の形態形成タンパク質アナログの投与（単離され、そして精製された形
態の、形態形成タンパク質アナログ、それらの塩、または薬学的に受容可能なそ
れらの誘導体を含む）は、従来の投与形態のいずれかを用いて達成され得る。

【００８８】 本発明の形態形成タンパク質アナログを含む薬学的組成物は、種々の形態であ
り得る。これらの形態としては、例えば、固体、半固体、および液体の投与形態
（例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、座剤、ならびに注射可能
な溶液および注入溶液）が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与形態お
よび治療上の適用に依存し、当業者によって選択され得る。投与形態としては、
経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与、または局所投与が
挙げられ得る。多くの場合、本発明の薬学的組成物は、組織の再生または修復が
必要な処置部位付近に投与される。

【００８９】 本発明の形態形成タンパク質アナログを含む薬学的組成物は、例えば、取り込
みまたは安定性を刺激する補因子を含むかまたは含まない、滅菌、等張処方物中
に入れられ得る。処方としては、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥粉末
であり得る。例えば、本発明の形態形成タンパク質アナログは、５．０ｍｇ／ｍ
ｌのクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌのクエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／
ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのグリシン、および１ｍｇ／ｍｌのポリソル
ベート２０を含む処方緩衝液を用いて希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され
得、冷却下で保存され得、そして、滅菌注射用水（Ｗａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊ
ｅｃｔｉｏｎ）（ＵＳＰ）を用いて投与前に再構成され得る。

【００９０】 組成物としてはまた、好ましくは当該分野で周知の慣用的な薬学的に受容可能
なキャリアが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャ
リアとしては、他の薬剤、キャリア、遺伝キャリア、アジュバント、賦形剤など
（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）が挙げられ得る。組成物は、
単位用量の形態にあるのが好ましく、そして通常、特定の組織の処置に依存する
用量の投薬計画で投与される。

【００９１】 本発明の薬学的組成物はまた、例えば、微粒子、リポソーム、他の微粒子送達
系、あるいは、患部組織もしくはこれらの組織に流れる血流の中に、付近に、ま
たは、他の場合これらと連絡を取り合うように配置された徐放性処方を用いる形
態形成デバイス（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）と組み合せて投与さ
れ得る（以下の形態形成デバイスを参照のこと）。

【００９２】 本発明の形態形成タンパク質アナログを含むリポソームは、周知の方法によっ
て調製され得る（例えば、ＤＥ ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，３６８８−９２頁（
１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７７：４０３０−４０３４頁（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５
号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは、小さ
な（約２００〜８００Å）単層型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル
％のコレステロールよりも多い。コレステロールの割合は、形態形成タンパク質
アナログの放出の最適な速度を制御するよう選択される。

【００９３】 本発明の形態形成タンパク質アナログはまた、組織誘導の速度および特徴を調
節するように、他の生物学的に活性な分子（例えば、免疫抑制剤、サイトカイン
など）を含むリポソームに結合され得る。形態形成タンパク質アナログのリポソ
ームへの結合は、任意の公知の架橋試薬（例えば、標的化送達のための抗体に対
して毒素または化学療法剤が結合するように広く用いられている異種二官能性の
（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）の架橋試薬）によって達成され得る
。リポソームへの結合はまた、炭水化物指向性架橋試薬４−（４−マレイミドフ
ェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）を用いて達成され得る（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ
ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．補遺１６Ｅ７７（１９９２））
。

【００９４】 （形態形成デバイス） 本発明の形態形成タンパク質アナログは、形態形成デバイスに含まれ得る。本
発明の形態形成デバイスは、組成物のための適切な送達またはサポートシステム
として機能する、移植可能な生体適合キャリア材料中に分散した形態形成タンパ
ク質アナログを含む。徐放性キャリアの適切な例としては、造形物（例えば、座
薬またはカプセル）の形態中の半透性のポリマーマトリクスが挙げられる。移植
可能な徐放性マトリクスまたはマイクロカプセルの徐放性マトリクスとしては、
以下が挙げられる：ポリアクチド（ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅ）（米国特許第３，７
７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グ
ルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５
４７−５６頁（１９８５）；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）また
は酢酸エチレンビニル（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅ
ｓ．，１５，１６７−２７７頁（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃ
ｈ．，１２，９８−１０５頁（１９８２））。

【００９５】 本発明の１つの実施形態において、形成形態デバイスのキャリアは、粒子また
は多孔性材料から構成される生体適合性マトリクスを含む。これらの細孔は、前
駆細胞の遊走、次いで、分化および増殖を許容するために好ましい大きさである
。当該分野で公知の種々のマトリクスが、利用され得る（例えば、米国特許第４
，９７５，５２６号；同第５，１６２，１１４号；同第５，１７１，５７４号お
よびＷＯ９１／１８５５８を参照のこと、これらは、本明細書において、参考と
して援用される）。

【００９６】 粒子サイズは、７０μｍ〜８５０μｍ、好ましくは７０μｍ〜４２０μｍ、最
も好ましくは、１５０μｍ〜４２０μｍの範囲内であるべきである。マトリクス
は、処置されるべき特定の組織欠損に橋渡しする形状中に粒子材料を緊密にパッ
キングすることによって作製され得る。あるいは、生体適合性、およびインビボ
での好ましい生体適合性のある材料は、遊走性前駆体細胞の補充のための一時的
な足場および基体として、ならびに、これらの次の固着および増殖のための基剤
としての役割を担うように構造化され得る。

【００９７】 有用なマトリクス材料としては、例えば、コラーゲン；グリコール酸、乳酸、
および酪酸（これらの誘導体を含む）のホモポリマーまたはコポリマー；ならび
に、セラミック（例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、および
他のリン酸カルシウム）が挙げられる。これらの種々の組み合せおよび他の適切
なマトリクス材料はまた、本明細書において示されたアッセイによって決定され
る場合、有用であり得る。

【００９８】 現在好ましいキャリアとしては、粒子状の骨、鉱質除去された骨、グアニジン
抽出された骨、種特異的な（同種の）骨、および特に処理された粒子状の骨、タ
ンパク質抽出された骨、鉱質除去された異種の骨が挙げられる。必要に応じて、
このような異種間の骨粉末マトリクスはまた、プロテアーゼ（例えば、トリプシ
ン）を用いて処理され得る。好ましくは、異種間のマトリクスは、粒子内侵入容
積（多孔性）および表面積を増加するように薬剤を改変する１つ以上の原線維を
用いて処理される。有用な改変薬剤としては、溶媒（例えば、ジクロロメタン、
トリクロロ酢酸、アセトニトリル、および酸（例えば、トリフルオロ酢酸および
フッ化水素））が挙げられる。本発明の材料を処方するのに有用な現在好ましい
原線維改変薬剤は、加熱された水溶性媒体、好ましくは、約ｐＨ４．５より低い
ｐＨを有する、最も好ましくは、約ｐＨ２〜ｐＨ４の範囲内のｐＨを有する酸性
の水溶性媒体である。現在好ましい加熱された酸性の水溶性媒体は、約３のｐＨ
を有する０．１％の酢酸である。鉱物除去され、脱脂され、グアニジン抽出され
た骨のコラーゲンを水溶性媒体中で、高い温度（例えば、約３７℃〜５℃の範囲
内、好ましくは、４５℃〜６０℃の範囲内）にて約１時間、加熱することは、通
常、所望の表面形態に達成するのに十分である。この機構は明らかではないが、
熱処理は、コラーゲンの原線維を改変し、その結果、粒子表面積が増加すること
が仮定される。

【００９９】 鉱物除去したグアニジン抽出された異種のウシの骨は、標準的な生体分子の精
製技術を用いてさらに分画され得るさらなる材料の混合物を含む。例えば、抽出
組成物のクロマトグラフ的分離、その後のクロマトグラムのピークに対応する種
々の抽出画分を活性マトリクスに戻して添加することを用いて、骨のインヒビタ
ーまたは組織誘導活性を分画して分けることでマトリクスの性質を向上させ得る
。

【０１００】 マトリクスはまた、実質的に残留重金属中で消耗され得る。本明細書に開示さ
れるような処理された、マトリクス中の個々の重金属濃度は、約１ｐｐｍより少
なく減少され得る。

【０１０１】 当業者は、骨または他の組織誘導を促進するように、形態形成デバイスの産生
において有用な所望の多孔性または表面微構造を有する選り抜きの生体適合性マ
トリクスを（すなわち、生分解性徐放性インプラントとして、）生成し得る。さ
らに、合成的に処方された基質（本明細書において開示されるように調製された
）が、使用され得る。

【０１０２】 （マトリクスの性質の一般考慮） 現在好ましいキャリア材料は、本明細書において記載されるように処理された
異種間の骨誘導粒子状マトリクスである。このキャリアは、生分解性合成的マト
リクスまたは合成的無機マトリクス（例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）
、コラーゲン、カルボキシメチルセルロース、リン酸三カルシウムまたはポリア
クチック酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、
および、これらの種々のコポリマー）のいずれかによって置換され得る。

【０１０３】 マトリクスジオメトリ、粒子サイズ、表面荷電の存在、ならびに、粒子内およ
び粒子間の両方の多孔性の程度は、首尾良いマトリクスの実施のために全て重要
である。研究は、表面荷電、粒子サイズ、鉱物の存在、およびマトリクスと形態
形成タンパク質アナログの結合のための方法論が全て、首尾良い組織誘導を達成
する役割を担うことを示した。

【０１０４】 骨マトリクス／骨形成タンパク質インプラントの界面における連続的な細胞の
反応は、複雑である。多数の工程カスケードは、以下を含む：移植されたマトリ
クスへのフィブリンおよびフィブロネクチンの結合、間葉細胞の遊走および増殖
、軟骨芽細胞への前駆体細胞の分化、軟骨形成、軟骨石灰化、脈管侵襲、骨形成
、再構築、ならびに骨髄分化。

【０１０５】 形態形成タンパク質アナログの首尾良いキャリアは、いくつかの重要な機能を
実施すべきである。キャリアは、形成形態タンパク質アナログの徐放性送達系と
して作用し、非特異的タンパク質分解から形態形成タンパク質アナログを防御し
、そして組織発達の間、前駆体細胞の誘導に関与する細胞の応答の各工程に順応
すべきである。

【０１０６】 さらに、選択された材料は、インビボでの生体適合性および好ましくは生分解
性がなければならない：キャリアは好ましくは、新しい骨または組織によって完
全に置換されるまで、一時的な足場として作用する。ポリアクチック酸（ＰＬＡ
）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および種々の組み合せは、インビボでの種々
の分解速度を有する。骨において、分解速度は、インプラントが皮質骨または海
綿質に配置されるか否かによって変化し得る。

【０１０７】 好ましい骨形成デバイスマトリクス材料（異種の骨から調製され、そして本明
細書において開示されるように処理された）は、種々の臨床場面において有用な
移植可能な材料を産生する。種々の整形外科的手順、歯周手順、および再構築手
順における骨形成のためのマトリクスとしての使用に加えて、マトリクスはまた
、徐放性キャリアとして使用され得るか、または整形外科的インプラントもしく
は一般的な補綴インプラントのためのコラーゲンコーティングとして使用され得
る。

【０１０８】 マトリクスは、手術の予測おいて所望されるように成形され得、手術中に医師
または技術者によって成形され得る。組織欠損を橋渡しするように、そして新し
い組織の所望される形成に到達するようにマトリクスを成形することが好ましい
。偽関節性欠損の骨の修復の場合、例えば、偽関節を橋渡しする寸法を使用する
ことが好ましい。ラット研究は、新しい骨が、移植されたデバイスの寸法を本質
的に有するよう形成されることを示す。従って、この材料は、局所インプラント
、皮下インプラント、腹腔内インプラント、または筋内インプラントに使用され
得る。骨形成手順において、この材料は、骨によってゆっくりと吸収され、そし
てインプラントの形状中またはインプラントの形状の非常に近くの骨によって置
換される。

【０１０９】 マトリクスは、疎接着粒子状材料（ｌｏｏｓｅｌｙ−ａｄｈｅｒｅｄ ｐａｒ
ｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）（例えば、コラーゲン）からなる形状維
持固体を含み得る。このマトリクスはまた、成形された多孔性固体、または、単
に、周囲の組織に保持された緊密にパッケージングされた粒子の凝集物を含み得
る。咀嚼筋または他の組織がまた、使用され得る。骨髄窩がきれいにされ、そし
て分散された形態形成タンパク質アナログを含む粒子とともに充填される場合、
広い同種の骨インプラントは、マトリクスのためのキャリアとして作用し得る。
このマトリクスはまた、ペーストまたはヒドロゲルの形態をとり得る。

【０１１０】 キャリア材料が、ヒドロゲルマトリックスを含む場合、それは、実質的に水か
ら構成されるゲル（好ましくは、水が９０％より多いゲルであるがこれに限定さ
れない）の形態における架橋親水性重合体の３次元ネットワークを指す。ヒドロ
ゲルマトリックスは、実効正電荷または実効負電荷を有し得、または、中性であ
り得る。典型的な実効負荷電マトリックスは、アルギネートである。実効正電荷
を有するヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニンのような細胞外マトリックス
成分によって、類型化され得る。市販の細胞外マトリックス成分の例としては、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭおよびＶｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭが挙げられる。実効中性ヒド
ロゲルの例は、高度に架橋されたポリエチレンオキシドまたはポリビニルアルコ
ール（ｐｏｌｙｖｉｎｙａｌｃｏｈｏｌ）である。

【０１１１】 抗生物質および化学療法剤、酵素、酵素インヒビターおよび他の生理活性物質
を含む種々の増殖因子、サイトカイン、ホルモン、栄養因子および治療組成物は
また、形態形成タンパク質アナログを含むキャリア材料中に吸着または分散され
得、そして、マトリックス材料は、ゆっくり吸収されるので、これらはまた、移
植部位において時間が経つにつれて遊離される。

【０１１２】 （他の組織特異的マトリックス） 上述の天然由来の骨マトリックスに加えて、有用なマトリックスはまた、適切
に改変された試薬を一緒に加えることによって、合成的に処方され得る。このよ
うなマトリックスの１例は、ＷＯ９１／１８５５８（この開示は、本明細書中で
参考として援用される）に開示される多孔性で、生体適合性の、インビボで生分
解性の合成マトリックスである。

【０１１３】 簡潔には、このマトリックスは、生体適合性の生分解性コラーゲン、最も好ま
しくは、組織特異的コラーゲンの多孔性架橋構造重合体、および適切な組織特異
的グリコサミノグルカンを組織特異的細胞付着因子として含む。可溶性コラーゲ
ン、酸可溶性コラーゲン、中性水溶液または塩基性水溶液に可溶なコラーゲン、
ならびに市販のコラーゲンを含めて、多数の供給源から誘導された骨組織特異的
コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン）は、これら合成マトリックスにおける使
用に適切であり得る。さらに、軟骨に見られるような、ＩＩ型コラーゲンもまた
、Ｉ型コラーゲンと組み合わせて使用され得る。

【０１１４】 グリコサミノグルカン（ＧＡＧ）すなわちムコ多糖は、ヘキソウロン酸部分ま
たはヘキソース部分のいずれかとグリコシド結合し、そしてこれらのいずれかと
多少とも規則的な様式で交互に現れるヘキソサミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）の残
基から構成される多糖である。ＧＡＧは、動物起源のものであり、そして組織特
異的な分布を有する（例えば、Ｄｏｄｇｓｏｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｉｔｓ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｄｉｃｋｅｎｓ
ら編、１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９６８）を参照のこと）。ＧＡ
Ｇとの反応はまた、別の有用な性質（すなわち、宿主動物から免疫反応（異物反
応）を誘発しない能力）をコラーゲンに提供する。

【０１１５】 有用なＧＡＧとしては、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイ
チン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、デルマタン硫酸およびケラチン硫酸の
ような硫酸基を有するＧＡＧが挙げられる。骨形成デバイスに関して、現在は、
コンドロイチン６−硫酸が好ましい。他のＧＡＧはまた、本明細書中に記載のマ
トリックスを形成するのに適切であり得、そして当業者は、他の適切なＧＡＧを
知っているか、または慣用実験にすぎないものを用いて確認できるかのいずれか
である。ムコ多糖のより詳細な説明に関しては、Ａｓｐｉｎａｌｌ、Ｐｏｌｙｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９７
０）を参照のこと。

【０１１６】 コラーゲンは、酸性水溶液中で（好ましくは希酢酸溶液中で）ＧＡＧと反応し
得る。水性コラーゲン分散体へとＧＡＧを滴下することによって、ＧＡＧでコー
トされたもつれたコラーゲン原繊維の共沈物が生じる。次いで、この線維のもつ
れた塊は、ホモジナイズされて、微細な線維の同質な分散体を形成し得、次いで
、濾過され得、乾燥され得る。

【０１１７】 コラーゲン−ＧＡＧ産物の不溶性を、これら材料を共有結合的に架橋させるこ
とによって、所望の程度に上昇させ得る。これはまた、これら材料の再吸収に対
する抵抗性を上げるのに役立つ。一般に、脱水素熱（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍ
ａｌ）プロセスによって架橋することが好ましいが、コラーゲンを架橋するのに
適した任意の共有結合性Ｇ６０架橋方法もまた、これら複合材料を架橋するのに
適切である。

【０１１８】 乾燥する場合、架橋粒子は、本質的に、約５００μｍの直径を有する球形であ
る。走査型電子顕微鏡法は、表面に約２０μｍの細孔および内部に４０μｍの細
孔を示す。内部は、繊維状構造およびシート様構造の両方から構成され、細胞付
着のための表面を提供する。この空隙は、相互接続し、粒子の内部を通した細胞
への接近を提供する。この材料は、およそ９９．５％の空隙容積があると思われ
、マイクロキャリア１グラムあたりに増殖され得る潜在的な細胞量に関して、こ
の材料を非常に効率的にする。

【０１１９】 別の有用な合成マトリックスは、グリコール酸、乳酸および／または酪酸（そ
れらの共重合体および誘導体を含む）から構成される合成重合体のような、生体
適合性のインビボで生分解性の合成重合体から処方された合成マトリックスであ
る。これら重合体は、当該分野においてよく記載されており、そして市販されて
いる。例えば、ポリラクチド（例えば、分子量１００ｋａ）から、８０％ ポリ
乳酸／２０％ グリコシドから、またはポリ３−ヒドロキシ酪酸（例えば、分子
量３０ｋａ）から構成される重合体の全ては、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎ
ｃ．から購入され得る。重合体組成物は、一般に、粒子状の形態で得られ、そし
て形態形成デバイスは、重合体の加水分解を避けるために、好ましくは、非水性
条件下（例えば、エタノール−トリフルオロ酢酸溶液、ＥｔＯＨ／ＴＦＡ中で）
で作製される。さらに、空隙率を増加させるために、例えば、当該分野で公知で
ある多数の特定の溶媒処理のいずれかを使用し、粒状の重合体組成物の形態を変
え得る。

【０１２０】 （人工補綴デバイス） 本発明の別の実施形態において、形態形成タンパク質アナログを含む移植可能
な人工補綴デバイスが、提供される。当業者によって特定の処置のために選択さ
れる任意の人工補綴移植物は、本発明に従う少なくとも１つの形態形成タンパク
質アナログを含む組成物と組み合わせて使用され得る。この人工補綴物は、金属
またはセラミックを含む材料から作製され得る。好ましい人工補綴デバイスは、
股関節デバイス、ネジ、ロッドおよび脊椎固定のためのチタンケージからなる群
から選択される。

【０１２１】 形態形成組成物は、哺乳動物において標的組織に隣接して移植可能な表面領域
上の人工補綴インプラント上に配置される。好ましくは、哺乳動物は、ヒト患者
である。この組成物は、表面への強化された組織増殖を促進するのに十分な量お
いてインプラントの表面上に配置される。強化された組織増殖を促進するのに十
分な組成物量は、本明細書中およびＲｕｅｇｅｒら、米国特許第５，３４４，６
５４号に記載される（これは、本明細書中に参考として援用される）バイオアッ
セイのようなバイオアッセイを使用して、当業者によって経験的に決定され得る
。好ましくは、同様の人工補綴デバイスをヒト患者に使用する前に、動物研究を
行って、組成物成分の濃度を最適化する。このような人工補綴デバイスは、処置
される哺乳動物における、整形外科的欠損、損傷または異常を修復するのに有用
である。

【０１２２】 従って、本発明はまた、移植可能な人工補綴デバイスの、哺乳動物の標的組織
へのインビボでの統合を促進するための方法を提供する。この方法は、少なくと
も１つの骨形成タンパク質アナログを含む組成物を、人工補綴デバイスの表面上
に提供する工程、ならびに、標的組織および人工補綴デバイスの表面が、標的組
織とデバイスとの間での強化された組織増殖を可能にするのに十分な時間にわた
って少なくとも部分的に接触したまま維持される位置で、哺乳動物に、デバイス
を移植する工程を含む。

【０１２３】 以下は、本発明の形態形成タンパク質アナログ組成物および方法を例示する実
施例である。これら実施例は、限定として解釈されるべきではない：実施例は、
例示の目的のために含まれ、そして本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定
される。

【０１２４】 （実施例１；ラットＩＧＦＢＰ−５プロモーター−ルシフェラーゼ遺伝子の構
築） ラットＩＧＦＢＰ−５遺伝子の転写開始部位（＋１）の８８８ｂｐ上流から１
１４ｂｐ下流までのヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１〜１００２）を
含む、１ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ラット肝臓から単離されたゲノムＤＮＡ
を使用してＰＣＲによって作製した。センスは、５’ＡＧＧ ＡＴＣ ＴＧＣ
ＣＴＧ ＣＣＣ ＴＧＴ３’（配列番号２）であり、そしてアンチセンスプライ
マーは、５’ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＡＣ３’（配列番号
３）である。反応は、９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；６８℃で６０秒間
を２５サイクル；最後の伸長を６８℃で１０分間であった。ＰＣＲ産物を、ｐＣ
ＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
に直接的にクローニングした。センス（正）方向のＩＧＦＢＰ−５プロモーター
を含むクローンを、制限酵素マッピングおよび二本鎖ＤＮＡの配列決定によって
確認した。次いで、ＩＧＦＢＰ−５プロモーターフラグメントを、プロモーター
のない（ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ
）を含むｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａｃＩ部位およ
びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。ＩＧＦＢＰ−５プロモーターのアンチ
センスフラグメントを、ｐＧＬ２−ＢａｓｉｃベクターのＸｈｏＩ部位およびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。全てのプラスミドの純度を、１％アガロースゲル
において確認した。超高純度ＤＮＡ調製物のみを、トランスフェクション研究の
ために使用した。

【０１２５】 （実施例２：ラットＩＧＦＢＰ−５プロモーター変異体の作製） ラットＩＧＦＢＰ−５プロモーターの５’末端における欠失を、１ｋｂプロモ
ーターフラグメントを含むプラスミドの、独特の制限酵素での消化またはＰＣＲ
によって作製した（図３）。５’末端が−３９０位、−２９７位、−１５１位、
−１３１位、−７１位および＋３２位で始まる構築物を、それぞれ、ＡｃｃＩ、
ＡｌｗＮＩ、ＳｔｕＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＳａｃＩおよびＤｒａＩでの親プラスミ
ドの消化によって作製した。５’末端が−５０位および−３３位で始まる構築物
を、それぞれ、センスプライマー５’ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＴＣ３’（配列番号４）および５’ＣＴＡ ＴＴＴ ＡＡＡ ＡＧＣ ＧＣ
Ｃ ＴＧＣ３’（配列番号５）を使用してＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ条件
は、９４℃で６０秒間；５０℃で６０秒間；７２℃で６０秒間を３５サイクル；
そして最後の伸長を、７２℃で１０分間であった。この得られたＤＮＡフラグメ
ントを、ｐＧＬ−２−Ｂａｓｉｃベクターにサブクローニングした。プロモータ
ーの２１ｂｐ配列内の内部変異を、上記の通りの、配列特異的なオリゴヌクレオ
チドプライマー（図５Ｂ）および野生型ＤＮＡテンプレート（−７１／＋１１４
）を用いてＰＣＲによって作製した。あるいは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔ
ｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。このＤＮＡ産物を、全体として配列決
定して、予期しない変異がないことを確かめた。

【０１２６】 （実施例３：ＦＲＣ培養および一過性トランスフェクション） 初代胎児頭蓋冠（ＦＲＣ）細胞を、公開された手順（Ｌ−Ｃ．Ｃ．Ｙｅｈら，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３８，４１８１〜４１９０（１９９７）、Ｍ．
Ａ．Ａｒｏｎｏｗら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４３，２１３〜２２
１頁（１９９０）；Ｔ．Ｋ．ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．
Ｒｅｓ．，３，４０１〜４０８頁（１９８８））を使用して調製した。簡潔には
、細胞を頭蓋冠の連続したコラゲナーゼ消化によって収集して、消化ＩＩＩから
Ｖの細胞をプールした。胎仔ラット頭蓋冠（ＦＲＣ）細胞を、１０％ウシ胎仔血
清、ビタミンＣ（１００μｇ／ｍｌ）、ならびに抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ ペ
ニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を含む完全培地（Ｍ
ＥＭ、α；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）にプレート
した。培養物を、９５％空気／５％ＣＯ_２、３７℃でコンフルエンスに達するま
で数日間インキュベートした。次いで、細胞を実験のために継代培養した。

【０１２７】 継代３回目のコンフルエント細胞を実験に使用した。トランスフェクション研
究を、公開された手順（Ｌ−Ｃ．Ｃ．Ｙｅｈら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ
．，１７５，７８〜８８（１９９８））を使用して実行した。簡潔には、ＦＲＣ
細胞を、完全αＭＥＭ＋血清において約７０％のコンフルエンスまで６ウェルプ
レートにおいて増殖させ、そしてリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法（ｃｏｐｒｅ
ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｃ．Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，７，２７４５−２７５２）で、プロモーター構築物を一過的にトラ
ンスフェクトした。プラスミドＤＮＡ（１２μｇ）を、各６ウェルプレートに使
用した。培地を、トランスフェクションの３時間後に除去して、そして細胞を、
室温で、１５％グリセロール／１×ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で２分間処理し
た。トランスフェクトされたＦＲＣ細胞を、新鮮な完全αＭＥＭにおいて一晩イ
ンキュベートして、その後、無血清αＭＥＭ中のＯＰ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）
またはビヒクルで２４時間処理した。ＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性を、Ｌ−
Ｃ．Ｃ．Ｙｅｈら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７５，７８〜８８（１
９９８）に記載されるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の測定によって決定
した。細胞を溶解し、そしてアリコート（２０μｌ）を使用して、Ｐｒｏｍｅｇ
ａのルシフェラーゼアッセイキットおよびＯＰＴＯＣＯＭＰ Ｉルミノメーター
ＩＬＡ９１１（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。別の
アリコート（１０μｌ）を使用して、Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈ
ｔキットを使用したβ−ガラクトシダーゼ活性の測定によってトランスフェクシ
ョン効率を決定した。ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性に対し
て基準化した。いくつかの実験において、Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ Ｒｅｐｏｒｔ
ｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用した。このシステムは、それぞれ、基質として、ルシ
フェリンおよびＧａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓを使用する、結合されたルシフェラ
ーゼおよびβ−ガラクトシダーゼに対する化学発光レポーター遺伝子アッセイシ
ステムである。得られた値は、単酵素システム（ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｚｙｍｅ
ｓｙｓｔｅｍ）を使用して得られた値と同等であった。

【０１２８】 （実施例４：ゲル移動度シフトアッセイ） ゲル移動度シフトアッセイのためのタンパク質を、公開されている手順（Ｎ．
Ｃ．Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９，２４９９（１９
９１））を使用して、コントロールまたはＯＰ−１処理のコンフルエントＦＲＣ
細胞から抽出した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード法（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８〜２５４（１９７６））
を使用して決定した。タンパク質抽出物を、アリコートに分割し、そして使用す
るまで−８０℃に、即座に凍結した。ゲル移動度シフト実験を、ＢａｎｄＳｈｉ
ｆｔキットを使用して実行した。簡潔には、放射性標識２本鎖ＤＮＡを、相補オ
リゴヌクレオチド（−７１から−３３までの配列およびその相補配列から成る）
のアニーリング、その後の［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰの存在下においてＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いた処理によって産生した。種々の濃度のタンパク質抽出
物を、室温で一定量の放射性標識ＤＮＡプローブ（５５５０ｃｐｍ）と２０分間
、インキュベートした。サンプルを、１×ＴＢＥ中で、５％の非変性ポリアクリ
ルアミドゲルで分析した。ゲルを、乾燥させ、そして放射性のバンドを検出し、
そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，
Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用し
て定量した。競合実験に関して、過剰量（２０×〜５００×）の非標識ＤＮＡプ
ローブまたは無関係のＥＢＮＡ−１もしくはＯｃｔ−１ ＤＮＡを、反応中に含
めた。

【０１２９】 （実施例５：統計学的分析） 複数の平均値を、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）で比較し、その後コントロール
との一対比較のためのスチューデントのｔ検定によって比較した。パーソナルコ
ンピューターのためのＰＳＩ−Ｐｌｏｔ（Ｐｏｌｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）におけるＡＮＯ
ＶＡおよびスチューデントのｔ検定のプログラムを分析のために使用した。

【０１３０】 （実施例６：ＯＰ−１処理のＦＲＣ細胞におけるレポーター遺伝子活性） 図４Ａは、ＯＰ−１またはビヒクルで処理されたＦＲＣ細胞における種々のク
ローンのレポーター遺伝子活性を示す。溶媒で処理されたトランスフェクトＦＲ
Ｃ細胞におけるｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターのプロモーター活性は非常に低く
、そして、ＯＰ−１はプロモーター活性に影響を与えなかった。ｐＧＬ２−コン
トロールベクターの活性は高く、そしてＯＰ−１処理細胞において、わずかに上
昇した。−８８８から始まる５’末端配列の順次の除去は、基礎（ｂａｓａｌ）
プロモーター活性の並行した損失を生じ、その結果、５’隣接配列のほんの１５
１ｂｐおよびエキソン１の最初の１１４ｂｐを有するＤＮＡフラグメントは、約
３０％のプロモーター活性を保持した。５’隣接配列のほんの１５６ｂｐおよび
エキソン１の最初の１２０ｂｐを有するＤＮＡフラグメントは、ほとんど（６１
％）のプロモーター活性を与える。

【０１３１】 （実施例７：ＯＰ−１によるラットＩＧＦＢＰ−５のダウンレギュレーション
の原因となる推定調節エレメントの同定） 領域−７１ｂｐから−５１ｂｐは、いくつかの推定調節転写エレメント：ＣＡ
ＴＴ様配列、Ｃ／ＥＢＰα様エレメント、およびｃ−Ｍｙｂ様モチーフ（Ｔ／Ｃ
ＡＡＣＧ／ＴＧ）またはＥ−ｂｏｘ様（ＣＡＮＮＴＧ）モチーフを含む。これら
のエレメントはまた、ヒトＩＧＦＢＰ−５プロモーターおよびマウスＩＧＦＢＰ
−５プロモーターに存在する（図５Ａ）。１つ以上のこれら推定調節エレメント
のどれが、ＯＰ−１によるラットＩＧＦＢＰ−５のダウンレギュレーションの原
因となるかをさらに詳細に示すために、それぞれのエレメントを、変異させた（
配列について図５Ｂを参照のこと）。各変異体のプロモーター活性を、ＦＲＣ細
胞のトランスフェクション後に測定した。

【０１３２】 図６Ａは、ＯＰ−１またはビヒクルで処理されたＦＲＣ細胞における種々の変
異体クローンの相対的なルシフェラーゼ活性を示す。図４に示される結果一致し
て、ＯＰ−１は、ＦＲＣ細胞においてＩＧＦＢＰ−５プロモーター配列−７１か
ら＋１１４の活性を劇的に減少させた（コントロールと比較して〜４７％）。Ｃ
ＡＡＴ様配列における変異は、コントロールの細胞およびＯＰ−１処理細胞の両
方においてプロモーター活性を減少させた（図６Ａ）。しかし、ＯＰ−１によっ
て誘導されたプロモーター活性における減少の程度は、本質的には同じままであ
った（約４０％、図６Ｂ）。Ｃ／ＥＢＰα様エレメントについてのＴからＣへの
１変異または４塩基変異はまた、コントロールの細胞およびＯＰ−１処理細胞の
両方においてＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性を減少させ（図６Ａ）、そしてこ
れは、ＯＰ−１への応答性がより少ないプロモーターを生じた（図６Ｂ）。Ｅ−
ｂｏｘ様モチーフにおける変異は、コントロールの細胞およびＯＰ−１処理の細
胞の両方においてプロモーター活性を減少させ（図６Ａ）、そしてＯＰ−１の効
果を完全に無くした（図６Ｂ）。これらの知見は、Ｃ／ＥＢＰα様エレメントお
よび推定Ｅ−ｂｏｘ様モチーフ（または、推定Ｅ−ｂｏｘ様モチーフ内の少なく
ともＣＡＡＣ配列）が、ＯＰ−１によるＩＧＦＢＰ−５転写のダウンレギュレー
ションの原因になるシス作用性のエレメントを含むことを示唆する。

【０１３３】 ＯＰ−１によるＩＧＦＢＰ−５プロモーターのダウンレギュレーションにおけ
る核タンパク質の役割を調べるために、ゲル移動度シフトアッセイを、−７１／
−３３領域からなる放射性オリゴヌクレオチドプローブならびにコントロールの
ＦＲＣ細胞およびＯＰ−１処理ＦＲＣ細胞由来のタンパク質を使用して実行した
。図７は、代表的なゲルシフトアッセイの結果を示す。コントロールのサンプル
およびＯＰ−１処理サンプルの両方において２つの主要なバンドが観察された。
両バンドの強度は、タンパク質濃度に比例し、そして（特にタンパク質を制限し
た場合）コントロールのサンプルにおいてよりもＯＰ−１処理のサンプルにおい
て（３０〜４０％）低かった。この知見は、このプロモーター領域と相互作用す
る核タンパク質の濃度が、コントロールにおいてよりもＯＰ−１処理ＦＲＣ細胞
において低く、転写の減少をもたらしたことを示唆する。このような解釈は、Ｏ
Ｐ−１が、ＩＧＦＢＰ−５転写をダウンレギュレートするという前述の知見によ
って支持される。また、移動したバンドは、無関係なオリゴヌクレオチドＥＢＮ
Ａ−１またはＯｃｔ−１によってまったく競合されなかった（図８）。

【０１３４】 ＩＧＦＢＰ−５プロモータークローンもまた、ＴＧＦ−βを用いて試験した。
図９は、ＴＧＦ−βが、多くの場合において、ＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性
を有意に（コントロールと比較して４０〜５０％）減少させたことを示す。しか
し、−５０〜＋１１４の領域からなるＤＮＡ構築物を、ＴＧＦ−β処理のＦＲＣ
細胞において一過的にコントロールの細胞に比べて、発現させた場合、このＤＮ
Ａ構築物は、ＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性においてほんの約２５〜３０％の
減少を示した。これらの知見は、２１ｂｐ（−７１から−５１）のＯＰ−１応答
領域もまた、より低い程度までであるが、ＴＧＦ−βに応答し得ることを示唆す
る。

【０１３５】 １つ以上の推定調節エレメントのどれが、ＴＧＦ−βによるラットＩＧＦＢＰ
−５のダウンレギュレーションの原因となるかをさらに詳細に示すために、各変
異体のプロモーター活性を、ＦＲＣ細胞のトランスフェクション後に測定した。

【０１３６】 図１０は、ＴＧＦ−βまたはビヒクルで処理されたＦＲＣ細胞における種々の
変異体クローンの相対的なルシフェラーゼ活性を示す。図９において示される結
果と一致して、ＴＧＦ−βは、ＦＲＣ細胞における−７１〜＋１１４プロモータ
ー領域の活性を劇的に（コントロールと比較して約４３％）減少された。３つの
推定部位（ＣＡＡＴ様配列、Ｃ／ＥＢＰα様エレメント、またはＥ−ｂｏｘ様モ
チーフ）の中のいずれか１つにおける変異は、ＴＧＦ−βによる減少を無くさな
かった。

【０１３７】 （実施例８：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性アッセイ） ＡＰ活性の測定に関して、コンフルエントＦＲＣ細胞を、上述の通り４８ウェ
ルプレートにおいて処理する。溶解産物における全細胞ＡＰ活性を、公開された
手順（Ｙｅｈら、１９９６）を使用し、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ
ール緩衝液（ｐＨ１０．３、３７℃）中の、基質としてリン酸ｐ−ニトロフェニ
ルを用い、市販のアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を
使用して測定する。反応を０．５Ｎ ＮａＯＨの添加によって終らせる。反応混
合物の吸光度は、ＭＲＸマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒ
ｅａｄｅｒ）（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，
ＶＡ）を使用して４０５ｎｍで測定する。溶解産物におけるタンパク質を、ＢＳ
Ａを標準物質としたブラッドフォードの方法（１９７６）に従ってＭＲＸマイク
ロプレートリーダーを使用して５９０ｎｍで測定する。ＡＰ活性を、全細胞タン
パク質１μｇにつき遊離されたｐ−ニトロフェノールのナノモルとして表現する
。

【０１３８】 （実施例９：骨小節（Ｂｏｎｅ Ｎｏｄｕｌｅ）形成） １２ウェルプレートにおけるコンフルエントＦＲＣ細胞を、５％ ＦＢＳ、ア
スコルビン酸（１００μｇ／ｍｌ）、および５ｍＭ β−グリセロール、ホスフ
ェート（Ｂｅｌｌｏｗｓら、１９８６）を含むα−ＭＥＭにおいて、溶媒ビヒク
ルまたはＯＰ−１（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理する。培地を３日ごとに交換する
。１６日目、細胞を１×ＰＢＳでリンスし、１０％ 中性緩衝化ホルマリンで固
定し、そして最後にエタノールで連続して洗浄する。鉱化骨小節は、固定後に白
い小節として見え、そして改変したｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色（Ｄｒｕｒｙおよび
Ｗａｌｉｎｇｔｏｎ，１９８０）でさらに、確認される。骨小節の定量を、ＣＣ
Ｄカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫ２倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅ
ｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）を使用した画像の獲得、およびＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕ
ｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ
Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を使用したこの画像の分析によって達成する。

【０１３９】 上述の実施例は、本発明の範囲を限定するためでなく、本発明を例示するため
に提供される。本発明の他の改変物は、当業者に容易に理解され、そして添付の
特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特
許および特許出願は、全て目的のために本明細書中に参考として援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＯＰ−１応答転写調節エレメントにおけるＯＰ−１の作用を説明する
概略図である。ＯＰ−１を用いた処理は、ＯＰ−１転写調節因子における変化を
媒介し、ＯＰ−１応答転写調節エレメントに対するＯＰ−１転写調節因子の結合
を失敗の生じた。結合の欠如は、ＯＰ−１応答転写調節エレメントと作動可能に
連結する遺伝子の転写の阻害を生じる。

【図２】 図２は、ラットＩＧＦＢＰ−５プロモーターおよび一部のコード配列の領域（
−８８８〜＋１１４）のＤＮＡ配列である。

【図３】 図３は、異なるラットＩＧＦＢＰ−５プロモーター領域を含むＤＮＡ構築物を
示す。転写開始部位は、＋１である。ＤＮＡフラグメントは、ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子（Ｌｕｃ）を含むｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターへサブクローン
化された。５’欠失フラグメントは、示されたような固有の制限酵素を用いた親
ＤＮＡの消化またはＰＣＲによって生成された。固有の制限部位を示す（垂直の
矢印）。ＰＣＲに使用したプライマーの位置は、水平の矢印として示した。

【図４Ａ】 図４Ａは、一過性トランスフェクションされたＦＲＣ細胞中のＩＧＦＢＰ−５
プロモーター活性に対するＯＰ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。培養物
を、図３中に示されるＩＧＦＢＰ−５プロモーターの異なる欠失を含むＤＮＡ構
築物を用いてトランスフェクションし、そして溶媒（白棒）またはＯＰ−１（黒
棒）を用いて２４時間処理した。（Ａ）ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシ
ダーゼ（β−Ｇａｌ）活性に対して標準化した。値は、３つの異なるＦＲＣ調製
物からの、６〜１０回の独立した測定の平均±ＳＥを表す。（＊）は、ｐ＜０．
０５でコントロールと有意に異なる値を示す。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、一過性トランスフェクションされたＦＲＣ細胞中のＩＧＦＢＰ−５
プロモーター活性に対するＯＰ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。培養物
を、図３中に示されるＩＧＦＢＰ−５プロモーターの異なる欠失を含むＤＮＡ構
築物を用いてトランスフェクションし、そして溶媒（白棒）またはＯＰ−１（黒
棒）を用いて２４時間処理した。（Ｂ）異なるプロモーター構築物の機能として
の、ＯＰ−１−処理培養物／コントロール培養物における標準化されたルシフェ
ラーゼ活性の比。

【図５】 図５は、（Ａ）ラット、ヒト、およびマウスのＩＧＦＢＰ−５プロモーター領
域の部分的なヌクレオチド配列。この領域内の保存されたエレメントを示す。ゲ
ル移動度シフト法に対して使用されたオリゴヌクレオチドプローブ内に含まれる
領域もまた示す。（Ｂ）ＯＰ−１応答エレメントをさらに定義するために用いら
れたラットＩＧＦＢＰ−５プロモーター領域中の変異体の配列。

【図６Ａ】 図６Ａは、一過性トランスフェクションされたＦＲＣ細胞中の異なる部位特異
的変異ＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性に対するＯＰ−１の効果。培養物を、図
５Ｂに示された異なる構築物を用いてトランスフェクションし、そして溶媒また
はＯＰ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）を用いて２４時間処理した。（Ａ）ルシフェラ
ーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性に対して標準化した。値
は、３つの異なるＦＲＣ調製物からの、５〜８回の独立した測定の平均±ＳＥを
表す。（＊）は、ｐ＜０．０１でコントロールと有意に異なる値を示す。

【図６Ｂ】 図６Ｂは、一過性トランスフェクションされたＦＲＣ細胞中の異なる部位特異
的変異ＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性に対するＯＰ−１の効果。培養物を、図
５Ｂに示された異なる構築物を用いてトランスフェクションし、そして溶媒また
はＯＰ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）を用いて２４時間処理した。（Ｂ）異なるプロ
モーター構築物の機能としての、ＯＰ−１−処理培養物／コントロール培養物に
おける標準化されたルシフェラーゼ活性の比。

【図７】 図７は、ゲル移動度シフトアッセイによって明らかにされた、ラットＩＧＦＢ
Ｐ−５プロモーター中のＤＮＡ−タンパク質相互作用。このオートラジオグラフ
ィーは、ラットＩＧＦＢＰ−５プロモーターのヌクレオチド−７１〜−３１にわ
たる^３２Ｐ標識された２本鎖オリゴヌクレオチド、および溶媒またはＯＰ−１（
３００ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理されたＦＲＣ細胞からの抽出物の異なる濃度を
用いた代表的なゲル移動度シフト実験の結果を示す。

【図８】 図８は、ラットＩＧＦＢＰ−５プロモーター中のＤＮＡ−タンパク質相互作用
の特異性を示す。ゲル移動度シフト実験は、異なる濃度（２０Ｘ、５０Ｘ、２０
０Ｘおよび５００Ｘ）の未標識のホモログ競争的ＤＮＡまたは未標識のＥＢＮＡ
−１（Ｅ）ＤＮＡまたはＯｃｔ−１（Ｏ）ＤＮＡが存在することを除いては、図
７に記載されるように行った。全てのゲルシフトしたバンドは、用量依存性様式
で相同な競合的ＤＮＡにより阻害された。バンド形成は、ＥＢＮＤ−１ ＤＮＡ
またはＯｃｔ−１ ＤＮＡによっては阻害されなかった。

【図９】 図９は、一過性トランスフェクションされたＦＲＣ細胞中のＩＧＦＢＰ−５プ
ロモーター活性に対するＴＧＦ−βの効果。培養物を、図３に示される異なる構
築物を用いてトランスフェクションし、そしてＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）を用
いて２４時間処理した。値は、相対的なレポーター遺伝子活性（ＴＧＦ−β／コ
ントロール）であり、そして３つの異なるＦＲＣ調製物を使用する３回の独立し
た測定の平均±ＳＥを表す。

【図１０】 図１０は、一過性トランスフェクションされたＦＲＣ細胞中の異なる部位特異
的変異ＩＧＦＢＰ−５プロモーター活性に対するＴＧＦ−βの効果。培養物を、
図５Ｂに示される異なる構築物を用いてトランスフェクションし、そして溶媒ま
たはＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）を用いて２４時間処理した。値は、相対的なレ
ポーター遺伝子活性（ＴＧＦ−β／コントロール）であり、そして２つの異なる
ＦＲＣ調製物を使用する５〜８回の独立した測定の平均±ＳＥを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｌ 27/00 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｚ ４Ｃ０９７ Ａ６１Ｐ 19/04 Ａ６１Ｐ 19/04 21/00 21/00 25/00 25/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 リー， ジョン シー． アメリカ合衆国 テキサス 78213， サ ン アントニオ， ハルタウン ドライブ 1119 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR32 QR55 QS32 4B065 AA91X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C081 AB18 BA02 BA12 CD28 CD29 DA05 DC03 4C084 AA01 DB59 DB60 MA67 NA14 ZA01 ZA94 ZA96 ZB21 4C097 AA01 AA20 AA21 DD15 ZZ00

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 形態形成タンパク質媒介の生物学的効果を誘導し得る化合物
   を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程： ａ）検出可能な生成物をコードするレポーター遺伝子に作動可能に連結された
   形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントを含むＤＮＡ配列を含む標的細胞を
   提供する工程であって、ここで、該ＤＮＡ配列は、形態形成タンパク質に曝露さ
   れる形態形成タンパク質応答細胞中に存在する場合、該ＤＮＡ配列が制御する遺
   伝子の転写をダウンレギュレートする、工程； ｂ）該標的細胞を試験化合物に曝露する工程；および ｃ）該検出可能な生成物の生成レベルを、該試験化合物の非存在下で観察され
   たレベルと比較する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで、該形態形成タンパ
   ク質応答転写阻害エレメントが、ＯＰ−１応答転写阻害エレメントである、方法
   。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記ＯＰ−１応答
   転写阻害エレメントが、配列番号１のヌクレオチド８１７〜８３７を含む、方法
   。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、ここで、前記ＯＰ−１応答
   転写阻害エレメントが、配列番号１のヌクレオチド８０７〜８４７を含む、方法
   。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の方法であって、ここで、前記ＯＰ−１応答
   転写阻害エレメントが、配列番号１のヌクレオチド７９９〜８５７を含む、方法
   。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで
   、検出可能な生成物がＲＮＡである、方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで
   、検出可能な生成物がタンパク質である、方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記形態形成タン
   パク質応答転写阻害エレメントが、Ｃ／ＥＢＰα様エレメントを結合し得るタン
   パク質を結合し、該Ｃ／ＥＢＰα様エレメントは、配列番号６のヌクレオチド５
   〜１５を含む、方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記形態形成タン
   パク質応答転写阻害エレメントが、ｃ−ｍｙｂモチーフまたはＥ−ｂｏｘ様モチ
   ーフを結合し得るタンパク質を結合し、該モチーフは、配列番号６のヌクレオチ
   ド１４〜２０を含む、方法。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記形態形成タ
    ンパク質応答転写阻害エレメントを含む前記ＤＮＡ配列が、前記標的細胞にトラ
    ンスフェクトされる、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標的細胞が
    ＯＰ−１レセプターを発現する、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、以下の工程： ｄ）形態形成タンパク質によって媒介される生物学的効果の、前記試験化合物
    による誘導を検出する工程 をさらに包含する、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記生物学的
    効果は、前記形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントに対する細胞内分子の
    結合における変化、分化の表現型マーカーの誘導、軟骨性骨または膜性骨を形成
    するための前駆体細胞の誘導、軟骨を形成するための前駆体細胞の誘導、または
    組織／靭帯様組織もしくは神経様組織を形成するための前駆体細胞の誘導からな
    る群より選択される、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、以下の工程： ｅ）前記試験化合物の非存在下で観察される前記検出可能な生成物の生成レベ
    ルよりも低い該レベルを誘導する該試験化合物を、組織部位に曝露し、そして哺
    乳動物における組織形成を誘導する該形態形成タンパク質アナログの能力を検出
    する工程、 をさらに包含する、方法。
15. 【請求項１５】 検出可能な生成物をコードするレポーター遺伝子に作動可
    能に連結された形態形成タンパク質応答転写阻害エレメントを含む、単離された
    ＤＮＡ配列。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のＤＮＡ配列であって、ここで、前記形
    態形成タンパク質応答転写阻害エレメントが、配列番号１のヌクレオチド８１７
    〜８３７を含む、ＤＮＡ配列。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載のＤＮＡ配列であって、ここで、前記形
    態形成タンパク質応答転写阻害エレメントが、配列番号１のヌクレオチド８０７
    〜８４７を含む、ＤＮＡ配列。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のＤＮＡ配列であって、ここで、前記形
    態形成タンパク質応答転写阻害エレメントが、配列番号１のヌクレオチド７９９
    〜８５７を含む、ＤＮＡ配列。
19. 【請求項１９】 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列であ
    って、ここで、前記検出可能な生成物が、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニ
    コールアセチルトランスフェラーゼである、ＤＮＡ配列。
20. 【請求項２０】 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含
    む、ベクター。
21. 【請求項２１】 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列でト
    ランスフェトされた、細胞。
22. 【請求項２２】 請求項１、１２または１４のいずれか１項に記載の方法に
    従って同定される、形態形成タンパク質の生物学的効果を誘導し得る、化合物。
23. 【請求項２３】 以下： ａ）請求項２２に記載の化合物；および ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、 を含む、薬学的組成物。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の組成物であって、ここで、請求項２２
    に記載の化合物は、前駆体細胞を誘導して軟骨性骨もしくは膜性骨を形成し得る
    か；前駆体細胞を誘導して軟骨を形成し得るか；または前駆体細胞を誘導して組
    織／靭帯様組織もしくは神経様組織を形成し得る、組成物。
25. 【請求項２５】 哺乳動物における移植のための形態形成デバイスであって
    、該デバイスは、以下： ａ）移植可能な生体適合性キャリア；および ｂ）該キャリア中に配置される請求項２２に記載の化合物、 を備える、形態形成デバイス。
26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の形態形成デバイスであって、ここで、
    請求項２２に記載の化合物は、前駆体細胞を誘導して軟骨性骨もしくは膜性骨を
    形成を形成し得るか；前駆体細胞を誘導して軟骨を形成し得るか；または前駆体
    細胞を誘導して組織／靭帯様組織もしくは神経様組織を形成し得る、形態形成デ
    バイス。
27. 【請求項２７】 哺乳動物における整形外科的な欠損、損傷または異常を修
    復するための移植可能な人工補綴デバイスであって、以下： ａ）該哺乳動物において、標的組織に隣接した表面領域を有する移植可能な人
    工補綴インプラント；および ｂ）該表面領域への増強された組織増殖を促進するのに十分な量で、該表面領
    域上に配置される、請求項２２に記載の化合物を含む、組成物、 を備える、人工補綴デバイス。
28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の人工補綴デバイスであって、ここで、
    請求項２２に記載の化合物は、前駆体細胞を誘導して軟骨性骨もしくは膜性骨を
    形成を形成し得るか；前駆体細胞を誘導して軟骨を形成し得るか；または前駆体
    細胞を誘導して組織／靭帯様組織もしくは神経様組織を形成し得る、人工補綴デ
    バイス。