JP2003512828A - Beta-defensin - Google Patents
Beta-defensinInfo
- Publication number
- JP2003512828A JP2003512828A JP2001533843A JP2001533843A JP2003512828A JP 2003512828 A JP2003512828 A JP 2003512828A JP 2001533843 A JP2001533843 A JP 2001533843A JP 2001533843 A JP2001533843 A JP 2001533843A JP 2003512828 A JP2003512828 A JP 2003512828A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- amino acid
- acid residues
- zamp3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 本発明は、β−デフェンシンファミリーの新規なメンバーであるzamp3およびzamp4のポリヌクレオチド分子およびポリペプチド分子に関する。ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、微生物感染の研究および治療において有効である。本発明は、また、zamp3またはzamp4ポリペプチドを包含する。 (57) [Summary] The present invention relates to polynucleotide and polypeptide molecules of zamp3 and zamp4, which are novel members of the β-defensin family. Polypeptides, and the polynucleotides that encode them, are useful in the study and treatment of microbial infections. The invention also encompasses zamp3 or zamp4 polypeptides.
Description
【0001】
発明の背景
生物を他の種による侵襲から保護するために、生物学的防御戦略が進化して来
ている。微生物感染応答系は、細胞中で酵素的に合成される化合物および単一遺
伝子産物であるペプチドを利用する、酸化的および非酸化的メカニズムを包含す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Biological defense strategies have evolved to protect organisms from invasion by other species. The microbial infection response system involves oxidative and non-oxidative mechanisms that utilize compounds that are enzymatically synthesized in cells and peptides that are single gene products.
【0002】
抗微生物性ペプチドは、多数の分類学的ファミリーを包含する生物において見
出される、酸素依存的宿主防御を構成する。抗微生物性ペプチドの1つの主要な
クラスは保存されたシステイン残基パターンにより配列規定され、デフェンシン
と命名される。哺乳動物デフェンシンは、皮膚、肺および腸から誘導され、広範
な種類の病原体、例えば、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌、菌類(例えば
、カンジダ(Candida)種)およびウイルスに対する抗生活性を示す。例えば、
:Poter他、Infect. Immunol. 65(6):2396−401、1997参照。[0002] Antimicrobial peptides constitute the oxygen-dependent host defense found in organisms containing a large number of taxonomic families. One major class of antimicrobial peptides is sequenced by the conserved cysteine residue pattern and is designated defensin. Mammalian defensins are derived from the skin, lungs and intestines and exhibit antibiotic activity against a wide variety of pathogens, including Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi (eg, Candida species) and viruses. For example,
: Poter et al., Infect. Immunol. 65 (6): 2396-401, 1997.
【0003】
デフェンシンペプチドの両親媒性特性は、微生物攻撃、すなわち、細胞壁を通
して孔をつくる、または「穴空け」による攻撃、の一般的メカニズムに対する手
掛かりであるように思われる。さらに、Daher他、J. Virol. 60(3):1068−
74、1986は、なかでも、単純ヘルペス1および2型、サイトメガロウイルスおよび
インフルエンザウイルス(A/WSN)を包含する、エンベロープウイルスがヒト好
中性ペプチド(HNP−1)とのインキュベーションにより不活性化されることを報
告し、ウイルスに対するデフェンシン分子の結合が細胞を感染するウイルスの能
力を損なうことを推測した。The amphipathic properties of defensin peptides appear to be a clue to the general mechanism of microbial attack, ie, attack by creating a hole or “punching” through the cell wall. In addition, Daher et al., J. Virol. 60 (3): 1068-
74, 1986, among others, enveloped viruses, including herpes simplex 1 and 2, cytomegalovirus and influenza virus (A / WSN), were inactivated by incubation with human neutrophil peptide (HNP-1). , And speculated that binding of the defensin molecule to the virus impairs the ability of the virus to infect cells.
【0004】
抗微生物性ペプチドのデフェンシンファミリーは、2つの明確なコンセンサス
配列に基づいて2つの主要なサブクラスに分割可能である。例えば、下記の文献
を参照のこと:Martin他、J. Leuko. Bio. 58:128−36、1995。第1デフェン
シンサブクラス、古典的デフェンシンは、HNPにより代表され、好中球およびマ
クロファージのいわゆる大きいアズロフィル粒子の中に貯蔵され、これらの細胞
により食作用を受けた微生物を攻撃する。HNPのアミノ酸配列は、β−デフェン
シンサブクラスのそれと区別される予測されたジサルファイド架橋と一致する。
また、上皮細胞はデフェンシン源であることができ、そしてこれらの細胞は外部
の、細胞外環境の中にこれらのペプチドを分泌する。The defensin family of antimicrobial peptides is divisible into two major subclasses based on two distinct consensus sequences. See, for example: Martin et al., J. Leuko. Bio. 58: 128-36, 1995. The first defensin subclass, classical defensins, represented by HNPs, is stored within the so-called large azurofil particles of neutrophils and macrophages and attacks microbes phagocytosed by these cells. The amino acid sequence of HNP is consistent with the predicted disulfide bridge that distinguishes it from that of the β-defensin subclass.
Also, epithelial cells can be the source of defensins, and these cells secrete these peptides into the external, extracellular environment.
【0005】
マウスにおいて、例えば、小腸および近接結腸のパネート細胞は、クリプチジ
ンと呼ぶ、デフェンシン様細胞を管腔の中に分泌する。例えば、下記の文献を参
照のこと:OuelletteおよびSelsted、The FASEB Journal 10:1280−9、1996
。デフェンシンの内因的病原体の防御機能についての支持は、マトリライシンホ
モ接合性ノックアウトマウスを使用して見出された。マトリライシン、すなわち
、α−デフェンシン活性を調節するために必要なメタロプロテイナーゼ、を欠如
するマウスは抗微生物活性を減少していることが見出され、病原体に対していっ
そう感受性であった(Wilson他、Science 286:133−7、1999)。In mice, for example, Paneth cells in the small intestine and the proximal colon secrete defensin-like cells called cryptidine into the lumen. See, for example: Ouellette and Selsted, The FASEB Journal 10: 1280-9, 1996.
. Support for defensin's defense function of the endogenous pathogen was found using matrilysin homozygous knockout mice. Mice lacking matrilysin, a metalloproteinase required to regulate α-defensin activity, were found to have reduced antimicrobial activity and were more susceptible to pathogens (Wilson et al., Science 286: 133-7, 1999).
【0006】
β−デフェンシン、すなわち、第2の主要なデフェンシンサブクラスは、ウシ
肺の中に見出されるペプチド(例えば、BNBDウシ好中性β−デフェンシン)なら
びに分泌された形態(TAP−気管性抗微生物性ペプチド)を包含する。例えば、
下記の文献を参照のこと:Selsted他、J. Biol. Chem. 268:6641−8、1993
。2つのヒトβ−デフェンシンが報告された。SAP−1(HBD1)はヒト乾癬性皮膚
から単離され、そしてhBD−1はヒト血液濾液の中に低濃度で見出された。例えば
、下記の文献を参照のこと:Bensch他、FEBS Lett. 368:331−5、1995)。HB
D2、Hardner他、Nature 387:861、1997。これらのヒトβ−デフェンシンのア
ミノ酸配列はウシBNDPおよびTAPに最も類似する。Β-Defensins, the second major defensin subclass, are peptides found in bovine lung (eg, BNBD bovine neutrophilic β-defensins) as well as secreted forms (TAP-tracheal antimicrobials). Sex peptides). For example,
See, Selsted et al., J. Biol. Chem. 268: 6641-8, 1993.
. Two human β-defensins have been reported. SAP-1 (HBD1) was isolated from human psoriatic skin and hBD-1 was found at low concentrations in human blood filtrate. See, for example: Bensch et al., FEBS Lett. 368: 331-5, 1995). HB
D2, Hardner et al., Nature 387: 861, 1997. The amino acid sequences of these human β-defensins are most similar to bovine BNDP and TAP.
【0007】
例えば、下記の文献を参照のこと:Harder他、Nature 387:861、1997、ここ
でSAP−1はhBD−2と表示される。ネズミβ−デフェンシンは下記のものを包含す
る:MBD1、Huttner他、FEBS Lett. 413:45−9、1997、Bals他、Infect. Imm
unol. 67:42−7、1997;MBD2、Morrison他、FEBS Lett. 422:112−6、1999
;MBD3、Bals他、Infect. Immunol. 67:3542−7、1999;およびMBD4、Jia他
、J. Biol. Chem. 1[equb ahead of print]、2000。For example, see the following references: Harder et al., Nature 387: 861, 1997, where SAP-1 is designated as hBD-2. Murine β-defensins include: MBD1, Huttner et al., FEBS Lett. 413: 45-9, 1997, Bals et al., Infect. Imm.
unol. 67: 42-7, 1997; MBD2, Morrison et al., FEBS Lett. 422: 112-6, 1999.
MBD3, Bals et al., Infect. Immunol. 67: 3542-7, 1999; and MBD4, Jia et al., J. Biol. Chem. 1 [equb ahead of print], 2000.
【0008】
保存されたシステイン残基以外で、デフェンシンファミリーは非常に配列分岐
している。活性の部位または状態に、または特定のデフェンシンにより攻撃され
る病原体のスペクトルに関係することがある。
抗微生物活性に加えて、特定デフェンシンは代謝的に感受性の細胞障害活性を
示し(Lichtenstein他、Blood 68:1407−10、1986およびSheu他、Antimicrob.
Agents Chemother. 28:626−9、1993)、ACTHに対する副腎皮質細胞の応答
を変更し(Zhu他、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)85:592−6、1988)そし
てヒト単球に対して特異的な走化活性を有する(Territo他、J. Clin. Invest
.)。Except for conserved cysteine residues, the defensin family is highly sequenced. It may be related to the site or state of activity or to the spectrum of pathogens attacked by a particular defensin. In addition to antimicrobial activity, certain defensins exhibit metabolically sensitive cytotoxic activity (Lichtenstein et al., Blood 68: 1407-10, 1986 and Sheu et al., Antimicrob.
Agents Chemother. 28: 626-9, 1993) and modified the response of adrenal cortical cells to ACTH (Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 592-6, 1988) and to human monocytes. Has specific chemotactic activity (Territo et al., J. Clin. Invest
.).
【0009】
好中球による単球のレクルートメントは、一部分、好中性デフェンシンにより
仲介されることがあり、それらの抗微生物性作用に加えてこれらのペプチドに対
する前炎症性活性を示唆する。また、デフェンシンmRNAレベルの減少はSPG(特
異的顆粒性疾患)において証明された。例えば、下記の文献を参照のこと:Tamu
ra他、Japan. Int. Hematol. 59:137−42、1994。Higazi他、J. Biol. Ch
em. 271:17650−5、1996は、デフェンシンの存在下にフィブリンに結合したプ
ラスミノゲンがtPAにより活性化に対する感受性が低いことがあることを示唆し
た。The recruitment of monocytes by neutrophils may be mediated in part by neutrophil defensins, suggesting proinflammatory activity against these peptides in addition to their antimicrobial effects. Also, a decrease in defensin mRNA levels was demonstrated in SPG (specific granular disease). For example, see the following reference: Tamu
ra et al., Japan. Int. Hematol. 59: 137-42, 1994. Higazi et al., J. Biol. Ch
Em. 271: 17650-5, 1996 suggested that fibrin-bound plasminogen in the presence of defensins may be less sensitive to activation by tPA.
【0010】
デフェンシンの抗微生物性、免疫刺激性、前炎症性および他の性を有する部分
が探求された。本発明は、これらの用途および本明細書における教示から当業者
にとって明らかな他の用途のためのポリペプチドを提供する。Parts of defensins with antimicrobial, immunostimulatory, proinflammatory and other properties have been sought. The present invention provides polypeptides for these uses and other uses that will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.
【0011】
発明の簡単な要約
本発明は、「zamp2」、「zamp3」および「zamp4」と表示する、新規なデフェ
ンシンタンパク質を提供する。また、本発明は、zamp3およびzamp4変異型ポリペ
プチドおよびzamp3およびzamp4融合タンパク質、ならびにこのようなポリペプチ
ドおよびタンパク質をコードする核酸分子、およびこれらの核酸分子およびアミ
ノ酸配列を使用する方法を提供する。Brief Summary of the Invention The present invention provides novel defensin proteins, designated "zamp2", "zamp3" and "zamp4". The invention also provides zamp3 and zamp4 variant polypeptides and zamp3 and zamp4 fusion proteins, as well as nucleic acid molecules encoding such polypeptides and proteins, and methods of using these nucleic acid molecules and amino acid sequences.
【0012】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することは本発明の理解の助
けとなるであろう:
用語「親和標識」は、本明細書において、ポリペプチドの精製または検出を提
供するか、あるいは基質へのポリペプチドの結合部位を提供するために、ペプチ
ドに結合させることができるポリペプチドのセグメントを表すために使用される
。原理的には、抗体または他の特異的な結合因子が利用可能な任意のペプチドま
たはタンパク質を親和標識として使用することができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Before describing the present invention in detail, it will be helpful to the understanding of the present invention to define the following terms: The term "affinity label" is used herein. Used to represent a segment of a polypeptide that can bind to a peptide, either to provide purification or detection of the polypeptide, or to provide a binding site for the polypeptide to a substrate. In principle, any peptide or protein for which an antibody or other specific binding agent is available can be used as an affinity label.
【0013】
親和標識は下記のものを包含する:ポリヒスチジントラクト、プロテインA(N
ilsson他、EMBO J. 4:1075、1985;Nilsson他、Methods Enzymol. 198:3
、1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(SmithおよびJohnson、Gene 67
:31、1988)、サブスタンスP、FlagTMペプチド(Hopp他、Biotechnology 6:1
204−10、1988、Eastman Kodak Co.、コネチカット州ニューヘブン、から入手
可能である)、ストレプトアビジン結合性ペプチド、または他の抗原エピトープ
または結合ドメイン。一般に、Ford他、Protein Expression and Purificati
on 2:95−107、1991、参照。親和標識をコードするDNAは、商業的供給会社か
ら入手可能である(例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージイ州ピスカタ
ウェイ)。Affinity labels include: polyhistidine tract, protein A (N
ilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3.
, 1991), glutathione S transferase (Smith and Johnson, Gene 67).
: 31, 1988), substance P, Flag TM peptide (Hopp et al., Biotechnology 6: 1).
204-10, 1988, Eastman Kodak Co., New Haven, CT), streptavidin binding peptides, or other antigenic epitopes or binding domains. In general, Ford et al., Protein Expression and Purificati
on 2: 95-107, 1991. DNA encoding the affinity tag is available from commercial suppliers (eg, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
【0014】
用語「対立遺伝子変異型」は、本明細書において、同一染色体遺伝子座を占有
する遺伝子の2またはそれ以上のオールタネイト形態の任意のものを表すために
使用される。対立遺伝子の変動は突然変異により天然に起こり、そして集団内に
表現型の多形性を生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサイレント(コー
ドされたポリペプチドの非変化)であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードすることができる。対立遺伝子変異型という用語は
、また、本明細書において遺伝子の対立遺伝子変異型によりコードされるタンパ
ク質を表すために使用される。The term “allelic variant” is used herein to describe any of two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic variation occurs naturally due to mutations and can result in phenotypic polymorphism within a population. The mutation in the gene may be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode a polypeptide having an altered amino acid sequence. The term allelic variant is also used herein to denote a protein encoded by an allelic variant of a gene.
【0015】
用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリ
ペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語
は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を
参照して使用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端
に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置
するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。
用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配
列に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列5'
ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。The terms “amino terminal” or “carboxyl terminal” are used herein to describe a position within a polypeptide. Where this relationship allows, these terms are used with reference to a particular sequence or portion of a polypeptide to describe proximity or relative position. For example, certain sequences located carboxy-terminal to a reference sequence within a peptide are located close to the carboxy terminus of the reference sequence but are not necessarily at the carboxy terminus of the complete polypeptide. The term "complement of a polynucleotide molecule" is a polynucleotide molecule that has a complementary base sequence and has an opposite orientation compared to a reference sequence. For example, array 5 '
ATGCACGGG 3'is complementary to 5'CCCGTGCAT 3 '.
【0016】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1またはそれ以上の縮重コドンを含むヌク
レオチド配列(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して
)を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一
アミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACのトリプレットの各々はAs
pをコードする)。The term “degenerate nucleotide sequence” refers to a nucleotide sequence that includes one or more degenerate codons (as compared to a reference polynucleotide molecule that encodes a polypeptide). Degenerate codons contain triplets of different nucleotides, but encode the same amino acid residue (ie, each of the GAU and GAC triplets is As.
code p).
【0017】
用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または
円形のDNA分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、プロ
モーターおよびターミネーターの配列を包含し、そして必要に応じて1またはそ
れ以上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポ
リアデニル化シグナル、およびその他を含むことができる。発現ベクターは、一
般に、プラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは双方の因子を
含有することができる。The term “expression vector” is used to describe a linear or circular DNA molecule consisting of a segment encoding the polypeptide in question operably linked to an additional segment that provides its transcription. It Such additional segments include promoter and terminator sequences and optionally include one or more origins of replication, one or more selectable markers, enhancers, polyadenylation signals, and the like. be able to. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or may contain elements of both.
【0018】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして他の余分のまたは望ましくな
いコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で
使用するために適当な形態であることを表す。このような単離された分子はそれ
らの自然環境から分離されたものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクローンを
包含する。The term “isolated”, when applied to a polynucleotide, removes the polynucleotide from its natural genetic environment, thus free of other extra or unwanted coding sequences, and genetically engineered. It represents a suitable form for use in the production system of the obtained protein. Such isolated molecules are those that have been separated from their natural environment and include cDNA and genomic clones.
【0019】
本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常アソシエートされる他の遺伝子
を含まないが、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域、例えば、プロモーター
およびターミネーターを包むことができる。アソシエートされた領域の同定は当
業者にとって明らかであろう(例えば、DynanおよびTijan、Nature 316:774−
78、1985、参照)。単離された核酸分子の他の例は、生物のゲノムの中に組込ま
れない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種の染色体から単離された
単離核酸分子は、その染色体の完全なDNA分子より小さい。The isolated DNA molecules of the present invention are free of other genes with which they are normally associated, but include naturally occurring 5'and 3'untranslated regions, such as promoters and terminators. You can Identification of associated regions will be apparent to those of skill in the art (eg, Dynan and Tijan, Nature 316: 774-.
78, 1985). Another example of an isolated nucleic acid molecule is a chemically synthesized nucleic acid molecule that does not integrate into the organism's genome. An isolated nucleic acid molecule isolated from a chromosome of a particular species is smaller than the complete DNA molecule of that chromosome.
【0020】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境、例えば、血
液および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパ
ク質である。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチ
ド、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形
態、すなわち、95%より大きい純度、より好ましくは99%より大きい純度のポリ
ペプチドを提供することが好ましい。この関係において使用するとき、用語「単
離された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または誘
導化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。An “isolated” polypeptide or protein is a polypeptide or protein found in conditions other than its natural environment, such as blood and animal tissues. In a preferred form, the isolated polypeptide is substantially free of other polypeptides, particularly other polypeptides of animal origin. It is preferred to provide the polypeptide in a highly purified form, ie greater than 95% pure, more preferably greater than 99% pure. As used in this context, the term "isolated" does not exclude the presence of another physical form of the same polypeptide, such as a dimer, or a glycosylated or derivatized form.
【0021】
用語「作用可能に連鎖された」は、DNAセグメントについて言及するとき、セ
グメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転
写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネー
ターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。
用語「オーソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能
的対応物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。
オーソログ間の配列の差は種形成の結果である。
用語「パラログ」は、生物により作られた、明確な、構造的に関係するタンパ
ク質である。パラログは遺伝子の重複を通して生ずると考えられる。例えば、α
−グロビン、β−グロビン、およびミオグロビンは互いにパラログである。The term “operably linked” when referring to DNA segments is such that the transcription is initiated at the promoter and the coding segment is such that the segments function in concert for their intended purpose. Indicates that the segment is arranged to progress through to the terminator. The term "ortholog" refers to a polypeptide or protein obtained from one species that is the functional counterpart of the polypeptide or protein from a different species.
Sequence differences between orthologs are the result of speciation. The term "paralog" is a distinct, structurally related protein made by an organism. Paralogs are thought to occur through gene duplication. For example, α
-Globin, β-globin, and myoglobin are paralogs of each other.
【0022】
用語「ポリヌクレオチド」は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。
ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離し、in vitroで合
成されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造することが
できる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(略号「bp」)、ヌクレオチド(
「nt」)、またはキロ塩基(「kb」)として表される。The term “polynucleotide” is a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleotide or ribonucleotide bases read in the 5 ′ → 3 ′ end direction.
Polynucleotides, including RNA and DNA, can be isolated from natural sources, synthesized in vitro, or produced from a combination of naturally occurring and synthetic molecules. The size of a polynucleotide depends on the base pair (abbreviation “bp”), nucleotide (
“Nt”) or kilobases (“kb”).
【0023】
この関係が許す場合、後者の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌク
レオチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、そ
れは全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解さ
れるであろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は
わずかに長さが異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違う
ことがある;こうして、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチド
は対合していなことがある。このような不対末端は一般に20ヌクレオチド長さを
越えない。When allowed by this relationship, the latter two terms can describe polynucleotides that are single-stranded or double-stranded. When this term is applied to a double-stranded molecule, it will be used to describe overall length and will be understood to be equivalent to the term "base pairs". As one of skill in the art will recognize, the two strands of a double-stranded polynucleotide may differ slightly in length, and their ends may be staggered as a result of enzymatic cleavage; thus, a double-stranded polynucleotide molecule All nucleotides in may be unpaired. Such unpaired ends generally do not exceed 20 nucleotides in length.
【0024】
「ポリペプチド」は、天然にまたは合成的に生産されたかどうかにかかわらず
、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸
残基より小さいポリペプチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。
用語「プロモーター」は、本明細書において、RNAポリメラーゼの結合を提供
しかつ転写を開始させるDNA配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野にお
いて認識されている意味において使用される。プロモーター配列は普通に、しか
し常にではないが、遺伝子の5'非コード領域の中に見出される。A “polypeptide” is a polymer of amino acid residues joined by peptide bonds, whether produced naturally or synthetically. Polypeptides smaller than about 10 amino acid residues are commonly referred to as "peptides". The term "promoter" is used herein in its art-recognized meaning to refer to the portion of a gene that contains a DNA sequence that provides for the binding of RNA polymerase and initiates transcription. Promoter sequences are commonly, but not always, found in the 5'non-coding region of genes.
【0025】
用語「レセプター」は、生物活性分子(すなわち、リガンド)に結合し、細胞
上のリガンドの作用を仲介する、細胞関連タンパク質を表す。膜結合レセプター
は、細胞外リガンド結合性ドメインと、典型的にはシグナルトランスダクション
に関係する細胞内エフェクタードメインとからなる、多ペプチド構造により特徴
づけられる。レセプターへのリガンドの結合は、エフェクタードメインと、細胞
中の1またはそれ以上の他の分子との間の相互作用を引き起こす、レセプターに
おけるコンフォメーションの変化を生ずる。この相互作用は、引き続いて、細胞
代謝の変更に導く。The term “receptor” refers to a cell associated protein that binds a bioactive molecule (ie, a ligand) and mediates the action of the ligand on the cell. Membrane bound receptors are characterized by a multi-peptide structure consisting of an extracellular ligand binding domain and an intracellular effector domain that is typically involved in signal transduction. Binding of the ligand to the receptor results in a conformational change in the receptor that causes an interaction between the effector domain and one or more other molecules in the cell. This interaction subsequently leads to alterations in cellular metabolism.
【0026】
レセプター−リガンドの相互作用に関係する代謝の事象は、遺伝子の転写、リ
ン酸化、脱リン酸化、サイクル的AMP産生の増加、細胞カルシウムの移動化、膜
脂質の移動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水
分解を包含する。大部分の核レセプターは、また、アミノ末端のトランス作用性
ドメイン、DNA結合性ドメインおよびリガンド結合性ドメインを包含する、多ド
メイン構造を示す。一般に、レセプターは、膜結合、細胞質ゾルまたは核レセプ
ター;モノマーのレセプター(例えば、甲状腺刺激ホルモンのレセプター、ベー
タ−アドレナリン作動性レセプター)またはマルチマーのレセプター(例えば、
PDGFレセプター、成長ホルモンレセプター、IL−3レセプター、GM−CSFレセプタ
ー、G−CSFレセプター、エリトロポイエチンレセプターおよびIL−6レセプター
)であることができる。Metabolic events involved in receptor-ligand interactions include gene transcription, phosphorylation, dephosphorylation, increased cyclic AMP production, cellular calcium mobilization, membrane lipid mobilization, cell adhesion, It includes the hydrolysis of inositol lipids and the hydrolysis of phospholipids. Most nuclear receptors also exhibit a multi-domain structure, including an amino-terminal trans-acting domain, a DNA binding domain and a ligand binding domain. Generally, receptors are membrane-bound, cytosolic or nuclear receptors; monomeric receptors (eg thyroid stimulating hormone receptors, beta-adrenergic receptors) or multimeric receptors (eg
PDGF receptor, growth hormone receptor, IL-3 receptor, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, erythropoietin receptor and IL-6 receptor).
【0027】
用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードす
るDNA配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大きい
ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。
通常、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌
ペプチドを除去する。The term “secretory signal sequence” refers to a DNA sequence that encodes a polypeptide (“secretory peptide”), which is a component of the larger polypeptide and is the secretory pathway of the cell in which the larger polypeptide is synthesized. Direct the polypeptide through.
Usually, the larger polypeptide is cleaved during transit through the secretory pathway to remove the secretory peptide.
【0028】
「可溶性レセプター」は、細胞膜に結合しないレセプターポリペプチドである
。最も普通には、可溶性のレセプターはトランスメンブランおよび細胞質ドメイ
ンを欠如するリガンド結合性レセプターのポリペプチドである。可溶性レセプタ
ーは、追加のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するまたは基質
へのポリペプチドの結合部位を提供する親和標識を含んでなることができる。多
数の細胞表面のレセプターは、タンパク質分解により産生されるか、あるいは選
択的にスプライスされたmRNAから翻訳される、天然に存在する、可溶性対応物を
有する。レセプターのポリペプチドは、それぞれ、膜の定着またはシグナルトラ
ンスダクションを提供する、これらのセグメントの十分な部分を欠如するとき、
トランスメンブランおよび細胞内ポリペプチドのセグメントを実質的に含まない
と言われる。“Soluble receptor” is a receptor polypeptide that does not bind to cell membranes. Most commonly, the soluble receptor is a ligand-binding receptor polypeptide lacking the transmembrane and cytoplasmic domains. Soluble receptors can comprise additional amino acid residues, for example, an affinity label that provides for purification of the polypeptide or provides a binding site for the polypeptide to a substrate. Many cell surface receptors have naturally occurring, soluble counterparts that are either proteolytically produced or translated from alternatively spliced mRNAs. Receptor polypeptides, when lacking sufficient portions of these segments to provide membrane anchorage or signal transduction, respectively,
It is said to be substantially free of transmembrane and intracellular polypeptide segments.
【0029】
不正確な分析法(例えば、ゲル電気泳動)により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xま
たは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10%の正確さであると理解さ
れるであろう。
本発明は、一部分、β−デフェンシンファミリーのタンパク質に対して相同性
を有するポリペプチドをコードする、新規なDNA配列の発見に基づく。すなわち
、本発明のzamp2、zamp3、およびzamp4ポリペプチドは配列番号4およびここにお
いて:C(X)6C(X)3-4C(X)7GXC(X)6CCに示す保存されたモチーフを示す、
ここで「(X)」は特異的アミノ酸間の好ましくは非システインアミノ酸残基の
数である。システインの位置および間隔はβ−デフェンシンファミリーの特徴を
示す。第1図は保存されたβ−デフェンシンモチーフの3つのジサルファイド結合
を提供する。It will be understood that the molecular weights and lengths of polymers determined by inaccurate analytical methods (eg gel electrophoresis) are approximations. When expressing such a value as "about" X or "approximately" X, the stated value of X will be understood to be accurate to ± 10%. The present invention is based, in part, on the discovery of a novel DNA sequence that encodes a polypeptide having homology to the β-defensin family of proteins. That is, the zamp2, zamp3, and zamp4 polypeptides of the invention exhibit the conserved motif shown in SEQ ID NO: 4 and here: C (X) 6C (X) 3-4C (X) 7GXC (X) 6CC,
Here, “(X)” is the number of preferably non-cysteine amino acid residues between specific amino acids. The position and spacing of cysteines are characteristic of the β-defensin family. Figure 1 provides the three disulfide bonds of the conserved β-defensin motif.
【0030】
zamp3ポリペプチド(Defb5)はウシ腸β−デフェンシンEPAのマウス相同体で
ある(Gallager他、Mamm. Genome 6:554−6、1995およびTraver他、Infect.
Immunol. 66:1045−56、1998)。zamp3ポリペプチドのヌクレオチド配列は
配列番号1に記載されており、その推定されたアミノ酸配列は配列番号2に記載さ
れており、そしてネズミzamp3をコードする偽遺伝子の天然に存在するゲノム配
列の中に見出される突然変異を解決することによって本来得られた(配列番号3
)。ゲノム配列(配列番号19)をさらに解析すると、zamp3のフレームシフトを
生じない第2イントロン/エクソンのスプライス部位が存在し、そして前述の修
復なしにzamp3の翻訳が起こることができることが示される。The zamp3 polypeptide (Defb5) is a mouse homolog of calf intestinal β-defensin EPA (Gallager et al., Mamm. Genome 6: 554-6, 1995 and Traver et al., Infect.
Immunol. 66: 1045-56, 1998). The nucleotide sequence of the zamp3 polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 1, its deduced amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 2, and within the naturally occurring genomic sequence of the pseudogene encoding murine zamp3. Originally obtained by solving the mutation found (SEQ ID NO: 3
). Further analysis of the genomic sequence (SEQ ID NO: 19) shows that there is a second intron / exon splice site that does not result in a frameshift of zamp3 and that translation of zamp3 can occur without the aforementioned repairs.
【0031】
zamp3ポリペプチドはシグナル配列、配列番号2のアミノ酸残基1〜22、配列番
号1のヌクレオチド10〜198を包含する。したがって、成熟ポリペプチドは配列番
号2のアミノ酸残基23〜アミノ酸残基63、配列番号1のヌクレオチド76〜198の範
囲である。成熟ポリペプチド内にデフェンシンシステインモチーフC(X)6C(X
)3-4C(X)7GXC(X)6CC(配列番号2のアミノ酸残基31〜60)が存在し、ここで
「(X)」は特異的アミノ酸間の好ましくは非システインアミノ酸残基の数であ
る。第2図は、ネズミデフェンシン3および4を有するzamp3の整列を提供する(配
列番号11および12)。The zamp3 polypeptide includes a signal sequence, amino acid residues 1-22 of SEQ ID NO: 2, nucleotides 10-198 of SEQ ID NO: 1. Thus, the mature polypeptide ranges from amino acid residue 23 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2, nucleotides 76 to 198 of SEQ ID NO: 1. The defensin cysteine motif C (X) 6C (X
) 3-4C (X) 7GXC (X) 6CC (amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2), where "(X)" is the number of preferably non-cysteine amino acid residues between specific amino acids. Is. Figure 2 provides an alignment of zamp3 with murine defensins 3 and 4 (SEQ ID NOs: 11 and 12).
【0032】
本発明は、配列番号2のアミノ酸残基31〜60を含んでなる単離されたポリペプ
チド、配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基63を含んでなる単離されたポリ
ペプチド、および配列番号2のアミノ酸残基31〜60、配列番号2のアミノ酸残基31
〜63、配列番号2のアミノ酸残基23〜60、配列番号2のアミノ酸残基23〜63、配列
番号2のアミノ酸残基1〜60、および配列番号2のアミノ酸残基1〜63から成るなる
ポリペプチドを提供する。本発明は、また、配列番号1のアミノ酸残基1〜324、
配列番号1のアミノ酸残基10〜198、配列番号1のアミノ酸残基10〜189、配列番号
1のアミノ酸残基76〜198、配列番号1のアミノ酸残基76〜189、配列番号1のアミ
ノ酸残基100〜198、および配列番号1のアミノ酸残基100〜189から成るなる単離
されたポリヌクレオチドを提供する。The present invention provides an isolated polypeptide comprising amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, an isolated polypeptide comprising amino acid residue 1-amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2. Peptide, and amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, amino acid residue 31 of SEQ ID NO: 2
~ 63, amino acid residues 23-60 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues 23-63 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues 1-60 of SEQ ID NO: 2, and amino acid residues 1-63 of SEQ ID NO: 2. Provide a polypeptide. The present invention also provides amino acid residues 1-324 of SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 1 amino acid residues 10-198, SEQ ID NO: 1 amino acid residues 10-189, SEQ ID NO:
An isolated poly-comprising amino acid residues 76-198 of 1; amino acid residues 76-189 of SEQ ID NO: 1; amino acid residues 100-198 of SEQ ID NO: 1; and amino acid residues 100-189 of SEQ ID NO: 1. Provide nucleotides.
【0033】
zamp4ポリペプチドのヌクレオチド配列は配列番号5に記載されており、そして
その推定されたアミノ酸配列は配列番号6に記載されている。zamp4ポリペプチド
は、配列番号6のアミノ酸残基1〜44、配列番号5のヌクレオチド1〜132を含む。
追加の5'配列は、追加のエクソンの一部分であると考えられ、この分野において
知られている方法を使用して見出すことができる。zamp4ポリペプチド内にデフ
ェンシンシステインモチーフC(X)6C(X)3-4C(X)7GXC(X)6CC(配列番号6
のアミノ酸残基12〜41)が存在し、ここで「(X)」は特異的アミノ酸間の好まし
くは非システインアミノ酸残基の数である。The nucleotide sequence of the zamp4 polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 5, and its deduced amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 6. The zamp4 polypeptide comprises amino acid residues 1-44 of SEQ ID NO: 6, nucleotides 1-132 of SEQ ID NO: 5.
The additional 5'sequences are considered to be part of the additional exons and can be found using methods known in the art. Defensin cysteine motif C (X) 6C (X) 3-4C (X) 7GXC (X) 6CC (SEQ ID NO: 6 in the zamp4 polypeptide
Amino acid residues 12-41) are present, where "(X)" is the number of preferably non-cysteine amino acid residues between specific amino acids.
【0034】
本発明は、単離されたポリペプチドおよび配列番号6のアミノ酸残基12〜41、
配列番号6のアミノ酸残基12〜44、配列番号6のアミノ酸残基1〜41、および配列
番号6のアミノ酸残基1〜44から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。また、本発明は、配列番号5のヌクレオチド1〜296、配列番号5のヌ
クレオチド1〜132、配列番号5のヌクレオチド1〜123、配列番号5のヌクレオチド
34〜123、および配列番号5のヌクレオチド34〜132から成るポリヌクレオチドを
提供する。The present invention provides isolated polypeptides and amino acid residues 12-41 of SEQ ID NO: 6,
Provided is a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of amino acid residues 12-44 of SEQ ID NO: 6, amino acid residues 1-41 of SEQ ID NO: 6, and amino acid residues 1-44 of SEQ ID NO: 6. Further, the present invention, nucleotides 1-296 of SEQ ID NO: 5, nucleotides 1-132 of SEQ ID NO: 5, nucleotides 1-123 of SEQ ID NO: 5, nucleotides of SEQ ID NO: 5
34-123, and nucleotides 34-132 of SEQ ID NO: 5 are provided.
【0035】
zamp2ポリペプチドはネズミβデフェンシン1のヒト相同体である(Huttner他
、FEBS Lett. 413:45−9、1997)。アミノ酸レベルにおいてマウスとヒトと
の間に100%の配列同一性が存在し、そしてヌクレオチドレベルにおいて1塩基対
の差が存在する。zamp2ポリペプチドのヌクレオチド配列は配列番号7に記載され
ており、そしてその推定されたアミノ酸配列は配列番号8に記載されている。成
熟ポリペプチド内にデフェンシンシステインモチーフC(X)6C(X)3-4C(X)7G
XC(X)6CC(配列番号8のアミノ酸残基37〜67)が存在し、ここで「(X)」は特
異的アミノ酸間の好ましくは非システインアミノ酸残基の数である。骨髄、胎盤
、骨格筋、小腸および子宮におけるzamp2の発現は逆転写PCR(RT−PCR)を使用
して見出された。The zamp2 polypeptide is the human homologue of murine β-defensin 1 (Huttner et al., FEBS Lett. 413: 45-9, 1997). There is 100% sequence identity between mouse and human at the amino acid level and a single base pair difference at the nucleotide level. The nucleotide sequence of zamp2 polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 7, and its deduced amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 8. Defensin cysteine motif C (X) 6C (X) 3-4C (X) 7G in the mature polypeptide
There is XC (X) 6CC (amino acid residues 37-67 of SEQ ID NO: 8), where "(X)" is the number of preferably non-cysteine amino acid residues between the specific amino acids. Expression of zamp2 in bone marrow, placenta, skeletal muscle, small intestine and uterus was found using reverse transcription PCR (RT-PCR).
【0036】
zamp3の新規なDNAに対応するmRNAの標準的ネズミノザンブロット組織分布は発
現を明らかにしなかった。ネズミ胚ブロットも同様であった。マウスRNAマスタ
ーブロットは、甲状腺、卵巣および精巣上体に対応する、淡い陽性シグナルを明
らかにした。zamp3ポリペプチドのmRNAの正常組織レベルは、ちょうどノザンブ
ロットの検出感度であるか、あるいはそれより低いように思われる。このような
観測は、デフェンシンに関すること分野における知識、すなわち、デフェンシン
が低いレベルで構成的に発現されるが、感染時に高度に誘導可能であること、に
一致する。Standard Nezminozan blot tissue distribution of mRNA corresponding to the novel DNA of zamp3 revealed no expression. The murine embryo blot was similar. Mouse RNA master blot revealed faint positive signals corresponding to thyroid, ovary and epididymis. Normal tissue levels of zamp3 polypeptide mRNA appear to be just below or below the sensitivity of Northern blot detection. Such observations are in line with knowledge in the field of defensins: that defensins are constitutively expressed at low levels but highly inducible upon infection.
【0037】
本発明の他の面は、zamp3およびzamp4ポリペプチドのフラグメントを包含する
。好ましいフラグメントは、配列番号2のアミノ酸残基1〜22の範囲の、リーダー
配列を包含する。このようなリーダー配列を使用して、他のポリペプチドの分泌
を指令することができる。本発明のこのようなフラグメントは次のように使用す
ることができる:選択的分泌リーダーフラグメントは分泌のために選択された選
択的タンパク質との融合タンパク質として形成される;融合タンパク質の発現を
指令することができる調節領域を担持するプラスミドを試験細胞の中に導入する
;そしてタンパク質の分泌をモニターする。Another aspect of the invention includes fragments of zamp3 and zamp4 polypeptides. Preferred fragments include a leader sequence ranging from amino acid residues 1-22 of SEQ ID NO: 2. Such leader sequences can be used to direct the secretion of other polypeptides. Such fragments of the invention can be used as follows: a selective secretory leader fragment is formed as a fusion protein with a selective protein selected for secretion; directs expression of the fusion protein. A plasmid carrying a possible regulatory region is introduced into the test cells; and protein secretion is monitored.
【0038】
追加の好ましいフラグメントは、システインドメイン、配列番号2のアミノ酸
残基31〜60、配列番号4のアミノ酸残基12〜41を含む。本発明により提供される
フラグメントは、zamp3およびzamp4の投与が有益である、本明細書に記載する用
途、例えば、抗微生物剤として有効である(ThennarasuおよびNagaraj、Biochem
. Biophys. Res. Commun. 254:281−3、1999)。Additional preferred fragments include the cysteine domain, amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues 12-41 of SEQ ID NO: 4. The fragments provided by the invention are useful as described herein, where administration of zamp3 and zamp4 is beneficial, for example as an antimicrobial agent (Thennarasu and Nagaraj, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 254: 281-3, 1999).
【0039】
本発明は、また、下記の配列から成る群から選択されるzamp3またはzamp4ポリ
ペプチド組込んだ融合構築物を提供する:
(a) 配列番号2のアミノ酸残基31〜60;
(b) 配列番号6のアミノ酸残基12〜41;
(c) 配列番号2;
(d) 配列番号6;The present invention also provides a fusion construct incorporating a zamp3 or zamp4 polypeptide selected from the group consisting of the following sequences: (a) amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2; (b) Amino acid residues 12 to 41 of SEQ ID NO: 6; (c) SEQ ID NO: 2; (d) SEQ ID NO: 6;
【0040】
(a)または(b)の哺乳動物種相同体またはヒトパラログ;他のデフェンシン
分子の成熟ポリペプチド領域;および、必要に応じて、それらの間のポリペプチ
ドリンカー。デフェンシン分子が病原体の全く共通点のないスペクトルを有する
とき、デフェンシン分子を含有する融合構築物はより広い範囲の抗微生物有効性
を示すことが期待される。融合物の構成成分ポリペプチドを分離するか、あるい
は融合タンパク質の柔軟性を可能とし、これにより融合タンパク質の各デフェン
シン構成成分の抗微生物活性を保存することが必要である場合、ポリペプチドリ
ンカーを使用することが好ましい。当業者はこのようなリンカーを設計すること
ができる。A mammalian species homologue or human paralog of (a) or (b); a mature polypeptide region of another defensin molecule; and, optionally, a polypeptide linker therebetween. It is expected that fusion constructs containing a defensin molecule will exhibit a broader range of antimicrobial efficacy when the defensin molecule has a completely dissimilar spectrum of pathogens. A polypeptide linker is used when it is necessary to separate the component polypeptides of the fusion or to allow the flexibility of the fusion protein, thereby preserving the antimicrobial activity of each defensin component of the fusion protein. It is preferable. A person skilled in the art can design such a linker.
【0041】
zamp3およびzamp4ポリペプチドのコンセンサスドメイン中の高度に保存された
アミノ酸は、新しいファミリーメンバーを同定するツールとして使用することが
できる。例えば、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用して、種々
の組織源から得られたRNAから保存されたモチーフをコードする配列を増幅する
ことができる。さらに詳しくは、下記のプローブを使用して、zamp3様またはzam
p4様β−デフェンシンを同定することができる。本発明のこの面の好ましい態様
は、下記のものを包含する:The highly conserved amino acids in the consensus domain of zamp3 and zamp4 polypeptides can be used as a tool to identify new family members. For example, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) can be used to amplify conserved motif-encoding sequences from RNA obtained from various tissue sources. For more details, use the probe below to zamp3 like or zam
A p4-like β-defensin can be identified. Preferred embodiments of this aspect of the invention include the following:
【0042】
(a) 配列番号2、
(b) 配列番号6、
(c) 配列番号2のアミノ酸残基23〜63、
(d) 配列番号2のアミノ酸残基31〜60、および
(e) 配列番号6のアミノ酸残基12〜41。特に、上記配列から設計された高度
に縮重のプライマーはこの目的に有効である。(A) SEQ ID NO: 2, (b) SEQ ID NO: 6, (c) amino acid residues 23-63 of SEQ ID NO: 2, (d) amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, and (e) sequence Amino acid residues 12-41 of number 6. In particular, highly degenerate primers designed from the above sequences are effective for this purpose.
【0043】
本発明は、また、本明細書に開示するzamp3およびzamp4ポリペプチドをコード
する、DNAおよびRNA分子を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者
は容易に認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーにかんがみて、かなりの配
列変動はこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能である。配列番号9は、配列
番号2のzamp3ポリペプチドをコードするすべてのポリヌクレオチドを包含する縮
重ポリヌクレオチド配列である。配列番号10は、配列番号4のzamp4ポリペプチド
をコードするすべてのポリヌクレオチドを包含する縮重ポリヌクレオチド配列で
ある。The invention also provides polynucleotide molecules, including DNA and RNA molecules, that encode the zamp3 and zamp4 polypeptides disclosed herein. As those skilled in the art will readily appreciate, considerable sequence variation is possible between these polynucleotide molecules, given the degeneracy of the genetic code. SEQ ID NO: 9 is a degenerate polynucleotide sequence that includes all polynucleotides encoding the zamp3 polypeptide of SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 10 is a degenerate polynucleotide sequence that includes all polynucleotides encoding the zamp4 polypeptide of SEQ ID NO: 4.
【0044】
こうして、zamp3およびzamp4ポリペプチドをコードする配列番号9および配列
番号10のポリヌクレオチドは本発明に包含される。当業者は認識するように、配
列番号9および配列番号10の縮重配列は、また、UをTで置換することによって配
列番号2および配列番号6をコードするすべてのRNA配列を提供する。縮重ヌクレ
オチド位置を表すために配列番号9および10内で使用した1文字コードを表1に記
載する。「解」はコード文字により表されるヌクレオチドである。「相補体」は
1またはそれ以上の相補的ヌクレオチドのコードである。例えば、コードYはCま
たはTを表し、そしてその補体RはAまたはGを表し、AはTに対して相補的であり、
そしてGはCに対して相補的である。Thus, the polynucleotides of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 that encode zamp3 and zamp4 polypeptides are included in the present invention. As will be appreciated by those in the art, the degenerate sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 also provide all RNA sequences encoding SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6 by replacing U with T. The one-letter codes used within SEQ ID NOs: 9 and 10 to represent degenerate nucleotide positions are listed in Table 1. The "solution" is the nucleotide represented by the code letter. "Complement"
A code for one or more complementary nucleotides. For example, the code Y represents C or T, and its complement R represents A or G, where A is complementary to T,
And G is complementary to C.
【0045】[0045]
【表1】 [Table 1]
【0046】
所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号9および
配列番号10において使用する縮重コドンを表2に記載する。The degenerate codons used in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, including all possible codons for a given amino acid, are listed in Table 2.
【0047】[0047]
【表2】 [Table 2]
【0048】
当業者は認識するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代
表する縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セリ
ンの縮重コドン(WSN)は、ある環境において、アルギニン(AGR)をコードする
ことができ、そしてアルギニンの縮重コドン(MGN)は、ある環境において、セ
リン(AGY)をコードすることができる。同様な関係はフェニルアラニンおよび
ロイシンをコードするコドンの間に存在する。したがって、縮重配列に包含され
る、いくつかのポリヌクレオチドは変異型アミノ酸配列をコードすることができ
るが、当業者は、配列番号2または配列番号6のアミノ酸配列を参照することによ
って、このような変異型配列を容易に同定することができる。変異型配列は、本
明細書において記載するように、機能性について容易に試験することができる。As will be appreciated by those in the art, some ambiguity is introduced when determining degenerate codons representative of all possible codons encoding each amino acid. For example, a degenerate codon for serine (WSN) can encode arginine (AGR) in some circumstances, and a degenerate codon for arginine (MGN) can encode serine (AGY) in some circumstances. You can A similar relationship exists between codons encoding phenylalanine and leucine. Thus, some polynucleotides encompassed by a degenerate sequence can encode a variant amino acid sequence, but those of skill in the art can refer to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 as such. Different mutant sequences can be easily identified. Variant sequences can be easily tested for functionality as described herein.
【0049】
また、当業者は認識するように、異なる種は「優先的コドンの使用」を示すこ
とができる。一般に、下記の文献を参照のこと:Grantham他、Nucl. Acids Re
s. 8:1893−912、1980;Haas他、Curr. Biol. 6:315−24、1996;Wain−Ho
bson他、Gene 13:355−64、1981;GrosjeanおよびFiers、Gene 18:199−209
、1982;Holm、Nucl. Acids Res. 14:3075−87、1986;Ikemura、J. Mol.
Biol. 158:573−97、1982。本発明において使用するとき、用語「優先的コ
ドンの使用」または「優先的コドン」は、ある種の細胞において最も頻繁に使用
され、こうして各アミノ酸をコードする可能なコドンの1つまたはわずかの代表
的なものに好んで使用される、タンパク質翻訳コドンを言及する、この分野の用
語である(表2参照)。Also, as one of ordinary skill in the art will appreciate, different species can exhibit “preferred codon usage”. See generally the following references: Grantham et al., Nucl. Acids Re.
s. 8: 1893-912, 1980; Haas et al., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Ho.
bson et al., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209.
, 1982; Holm, Nucl. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol.
Biol. 158: 573-97, 1982. As used in the present invention, the term "preferred codon usage" or "preferred codon" is most often used in certain cells, thus representing one or only a few of the possible codons that encode each amino acid. Is a term in the art that refers to protein translation codons that are commonly used (see Table 2).
【0050】
例えば、アミノ酸のスレオニン(Thr)はACA、ACC、ACG、またはACTによりコ
ードされることができるが、哺乳動物細胞において、ACCは最も普通に使用され
るコドンである;他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌におい
て、異なるThrコドンは優先的であることができる。特定の種の優先的コドンを
、この分野において知られている種々の技術により、本発明のポリヌクレオチド
の中に導入することができる。組換えDNAの中への優先的コドンの導入は、例え
ば、特定の細胞の型または種内のタンパク質の翻訳を効率よくすることによって
、タンパク質の産生を増強することができる。For example, the amino acid threonine (Thr) can be encoded by ACA, ACC, ACG, or ACT, but in mammalian cells, ACC is the most commonly used codon; other species, For example, in insect cells, yeast, viruses or bacteria, different Thr codons can be predominant. Preferential codons of a particular species can be introduced into the polynucleotides of the invention by various techniques known in the art. Introduction of preferential codons into recombinant DNA can enhance protein production by, for example, streamlining translation of the protein within a particular cell type or species.
【0051】
したがって、配列番号9または配列番号10に開示されている縮重コドンの配列
は、この分野において普通に使用されかつ本明細書において開示する、種々の細
胞の型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として
働く。優先的コドンを含有する配列を、本明細書において開示するように、種々
の種における発現について試験し、発現のために最適化し、そして機能性につい
て試験することができる。Accordingly, the degenerate codon sequences disclosed in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 are of the polynucleotides commonly used in the art and disclosed herein in various cell types and species. Serves as a template for optimizing expression. Sequences containing preferential codons can be tested for expression in various species, optimized for expression, and tested for functionality, as disclosed herein.
【0052】
前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを包含
する。DNAおよびRNAを製造する方法はこの分野においてよく知られている。一般
に、大量のRNAを産生する細胞または組織からRNAを単離する。このような組織お
よび細胞はノザンブロッティングにより同定される(Thomas、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 77:5201、1980)。全RNAはグアジニウムイソチオシアネート
抽出および引き続くCsCl勾配の遠心により製造することができる(Chirgwin他、
Biochemistry 18:52−94、1979)。As mentioned above, the isolated polynucleotides of the present invention include DNA and RNA. Methods of making DNA and RNA are well known in the art. Generally, RNA is isolated from cells or tissues that produce large amounts of RNA. Such tissues and cells are identified by Northern blotting (Thomas, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 77: 5201, 1980). Total RNA can be produced by guanidinium isothiocyanate extraction and subsequent centrifugation of a CsCl gradient (Chirgwin et al.,
Biochemistry 18: 52-94, 1979).
【0053】
ポリ(A)+RNAは全RNAからAvivおよびLederの方法(Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 69:1408−12、1972)により製造される。相補的DNA(cDNA)はポリ(
A)+RNAから既知の方法により製造される。別法において、ゲノムDNAを単離する
ことができる。次いでzamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRにより、同定し、単離する
。Poly (A) + RNA was prepared from total RNA by the method of Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 69: 1408-12, 1972). Complementary DNA (cDNA) is poly (
A) + RNA is produced by a known method. Alternatively, genomic DNA can be isolated. The polynucleotide encoding the zamp3 or zamp4 polypeptide is then identified and isolated, eg, by hybridization or PCR.
【0054】
本明細書に開示するzamp3またはzamp4のポリヌクレオチド配列は、また、zamp
3またはzamp4遺伝子の5'非コード領域をクローニングするためのプローブまたは
プライマーとして使用することができる。zamp3またはzamp4遺伝子からのプロモ
ーター因子を使用して、例えば、トランスジェニック動物または遺伝子治療で治
療された患者において、異種遺伝子の組織特異的発現を指令することができる。
また、5'フランキング配列のクローニングは、米国特許第5,641,670号に開示さ
れているように「遺伝子活性化」によりzamp3またはzamp4タンパク質の産生を促
進する。The polynucleotide sequences of zamp3 or zamp4 disclosed herein also include zamp3
It can be used as a probe or primer for cloning the 5'non-coding region of the 3 or zamp4 gene. Promoter elements from the zamp3 or zamp4 genes can be used to direct tissue-specific expression of heterologous genes, eg, in transgenic animals or in patients treated with gene therapy.
Also, cloning of the 5'flanking sequence facilitates production of the zamp3 or zamp4 protein by "gene activation" as disclosed in US Pat. No. 5,641,670.
【0055】
簡単に述べると、少なくともターゲッティング配列、調節配列、エクソン、お
よび不対スプライスドナー部位を含んでなるDNA構築物をzamp3またはzamp4遺伝
子座の中に導入することによって、細胞における内因的zamp3またはzamp4遺伝子
の発現を変更する。ターゲッティング配列はzamp3またはzamp4の5'非コーディン
グ配列であり、内因的zamp3またはzamp4遺伝子座を有する構築物の相同的組換え
を可能とし、これにより構築物内の配列は内因的zamp3またはzamp4コーディング
配列と作用可能に連鎖するようになる。このようにして、内因的zamp3またはzam
p4プロモーターを他の調節配列で置換または補充して、増強された、組織特異的
、またはそうでなければ調節された発現を得ることができる。Briefly, an endogenous zamp3 or zamp4 in a cell is introduced by introducing into the zamp3 or zamp4 locus a DNA construct comprising at least targeting sequences, regulatory sequences, exons and unpaired splice donor sites. Change gene expression. The targeting sequence is the 5'non-coding sequence of zamp3 or zamp4, allowing homologous recombination of the construct with the endogenous zamp3 or zamp4 locus, which allows the sequence within the construct to interact with the endogenous zamp3 or zamp4 coding sequence. It becomes possible to chain. In this way, endogenous zamp3 or zam
The p4 promoter can be replaced or supplemented with other regulatory sequences to provide enhanced, tissue-specific, or otherwise regulated expression.
【0056】
zamp3およびzamp4ポリヌクレオチドプローブはRNAまたはDNAであることができ
る。DNAはcDNAまたはゲノムDNAであることができる。ポリヌクレオチドプローブ
は一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAであり、特に合成オリゴヌクレオチドであ
るが、クローニングされたcDNAまたはゲノム種から発生させることができ、一般
に少なくとも16ヌクレオチド、より頻繁に17ヌクレオチド〜25またはそれより多
いヌクレオチド、時には40〜60ヌクレオチドを含んでなり、ある場合においてza
mp3またはzamp4遺伝子またはcDNAの実質的な部分、ドメインまたはさらには全体
を含んでなるであろう。典型的なプローブおよびプライマーは、配列番号5のヌ
クレオチド1〜324、10〜198、10〜189、76〜198、76〜189、100〜198、100〜189
、1〜296、1〜132、1〜123、34〜123、および配列番号5の34〜132を含む。The zamp3 and zamp4 polynucleotide probes can be RNA or DNA. The DNA can be cDNA or genomic DNA. Polynucleotide probes are single- or double-stranded DNA or RNA, especially synthetic oligonucleotides, but which can be generated from cloned cDNA or genomic species, generally at least 16 nucleotides, and more often 17 nucleotides. -25 or more nucleotides, sometimes 40-60 nucleotides, and in some cases za
It may comprise a substantial portion, domain or even the entire mp3 or zamp4 gene or cDNA. Typical probes and primers are nucleotides 1-324, 10-198, 10-189, 76-198, 76-189, 100-198, 100-189 of SEQ ID NO: 5.
, 1-296, 1-132, 1-123, 34-123, and 34-132 of SEQ ID NO: 5.
【0057】
プローブおよびプライマーは一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クロー
ニングされたcDNAまたはゲノム配列またはその補体から発生させることができる
。分析用プローブは一般に少なくとも20ヌクレオチド長さであるが、多少短いプ
ローブ(14〜17ヌクレオチド)を使用することができる。PCRプライマーは少な
くとも5ヌクレオチド長さ、好ましくは15またはそれ以上のヌクレオチド長さ、
より好ましくは20〜30ヌクレオチドである。遺伝子の小さい領域を分析のターゲ
ットとするとき、短いポリヌクレオチドを使用することができる。遺伝子全体を
分析するためには、ポリヌクレオチドプローブは全エクソンまたはそれ以上を含
んでなることができる。Probes and primers are generally synthetic oligonucleotides, but can be generated from cloned cDNA or genomic sequences or their complements. Analytical probes are generally at least 20 nucleotides in length, although somewhat shorter probes (14-17 nucleotides) can be used. PCR primers are at least 5 nucleotides in length, preferably 15 or more nucleotides in length,
More preferably, it is 20 to 30 nucleotides. Short polynucleotides can be used when targeting small regions of a gene for analysis. To analyze the entire gene, the polynucleotide probe can comprise all exons or more.
【0058】
プローブは標識化して検出可能なシグナルを得ることができ、ここで標識化に
、この分野においてよく知られている技術に従い、例えば、酵素、ビオチン、放
射性核種、発蛍光団、化学発光体、有望な粒子およびその他を使用することがで
き、これらは多数の源(例えば、Molecular Probes,Inc.、Eugene、OR、およ
びAmersham Corp.、Arlington Heights、IL)から商業的に入手可能である。The probe may be labeled to give a detectable signal, wherein labeling is according to techniques well known in the art, eg enzymes, biotin, radionuclides, fluorophores, chemiluminescence. The body, promising particles and others can be used and they are commercially available from a number of sources (eg Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, and Amersham Corp., Arlington Heights, IL). .
【0059】
プローブを構築するために使用する好ましい領域は、本明細書に記載するよう
に他のチモポイエチンおよびエメリンと相同性を有する領域、アンキリン様領域
、カルシム結合性タンパク質様領域、シグナル配列、およびその他を包含する。
ポリヌクレオチドプローブを開発する技術およびハイブリダイゼーション技術は
この分野において知られており、例えば、下記の文献を参照のこと:Ausubel他
(編者)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and
Sons,Inc.、NY、1991。The preferred regions used to construct the probe are regions having homology to other thymopoietins and emerins, as described herein, ankyrin-like regions, calcime binding protein-like regions, signal sequences, and Including others.
Techniques for developing polynucleotide probes and hybridization techniques are known in the art, see for example: Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and
Sons, Inc., NY, 1991.
【0060】
zamp3およびzamp4ポリペプチドは、診断システムにおいて、それぞれzamp3ま
たはzamp4の存在を検出するために使用することができる。このような検出法か
ら誘導された情報は種々の疾患におけるzamp3およびzamp4ポリペプチドの意味に
対する洞察を提供し、zamp3またはzamp4のレベルの変更が有意である疾患につい
ての診断ツールとして働くであろう。zamp3またはzamp4ポリペプチドのレベルの
変更は、微生物感染および炎症を示すことがある。
基本的アッセイにおいて、一本鎖プローブ分子を生物学的試料から単離したRN
Aと、プローブとターゲットzamp3またはzamp4 RNA種との間の塩基対合を促進す
る温度およびイオン強度の条件下にインキュベートする。ハイブリダイゼーショ
ンした分子から非結合プローブを分離した後、ハイブリッドの量を検出する。The zamp3 and zamp4 polypeptides can be used in a diagnostic system to detect the presence of zamp3 or zamp4, respectively. The information derived from such detection methods will provide insights into the implications of zamp3 and zamp4 polypeptides in various diseases and will serve as a diagnostic tool for diseases in which alterations in zamp3 or zamp4 levels are significant. Altered levels of zamp3 or zamp4 polypeptides may indicate microbial infection and inflammation. In a basic assay, single-stranded probe molecules were isolated from biological samples by RN
Incubate A with conditions of temperature and ionic strength that promote base pairing between the probe and the target zamp3 or zamp4 RNA species. After separating the unbound probe from the hybridized molecules, the amount of hybrid is detected.
【0061】
RNA検出のよく確立されたハイブリダイゼーション法は、ノザン分析およびド
ット/スロットブロットハイブリダイゼーションを包含する(例えば、下記の文
献を参照のこと:Ausubel前掲、およびWu他(編者)、″Analysis of Gene E
xpression at the RNA Level″、Methods in Gene Biotechnology、pp.
225−239(CRC Press,Inc.、1997)。核酸プローブは放射性同位体、例えば
、32Pまたは35Sで検出可能に標識化することができる。Well-established hybridization methods for RNA detection include Northern analysis and dot / slot blot hybridization (see, eg: Ausubel, supra, and Wu et al. (Eds.), “Analysis”). of Gene E
xpression at the RNA Level ″, Methods in Gene Biotechnology, pp.
225-239 (CRC Press, Inc., 1997). The nucleic acid probe can be detectably labeled with a radioisotope, eg, 32 P or 35 S.
【0062】
選択的に、zamp3またはzamp4 RNAを非放射線ハイブリダイゼーション法で検
出することができる(例えば、下記の文献を参照のこと:Isaac(編者)、Proto
cols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes、Humana
Press,Inc.、1993)。典型的には、非放射線検出は色素形成または化学発光基
質の酵素的変換により達成される。例示的非放射性分子は、ビオチン、フルオレ
セイン、およびジゴキシゲニンを包含する。Alternatively, zamp3 or zamp4 RNA can be detected by non-radiative hybridization methods (see, eg, the following references: Isaac (editor), Proto).
cols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana
Press, Inc., 1993). Non-radioactive detection is typically accomplished by chromogenic or enzymatic conversion of chemiluminescent substrates. Exemplary non-radioactive molecules include biotin, fluorescein, and digoxigenin.
【0063】
zamp3またはzamp4オリゴヌクレオチドのプローブはin vivo診断においても有
効である。例示として、18F標識化オリゴヌクレオチドを被検体に投与し、陽電
子放射断層放射線写真により可視化することができる(Tavitian他、Nature Me
dicine 4:467、1998)。The zamp3 or zamp4 oligonucleotide probe is also effective in in vivo diagnosis. As an example, an 18 F-labeled oligonucleotide can be administered to a subject and visualized by positron emission tomography (Tavitian et al., Nature Me.
dicine 4: 467, 1998).
【0064】
多数の診断手順は検出法の感度を増加するためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)を利用する。PCRを実施する標準技術はよく知られている(一般に、下記の文
献を参照のこと:Mathew(編者)、Protocols in Human Molecular Genetic
s(Humana Press,Inc.、1991)、White(編者)、PCR Protocols:Current
Methods and Applications(Humana Press,Inc.、1993)、Cotter(編者)
、Molecular Diagnosis of Cancer(Humana Press,Inc.、1996)、Hanause
kおよびWalaszek(編者)、Tumor Maker Protocols(Humana Press,Inc.、1
998)、Lo(編者)、Clinical Applications of PCR(Humana Press,Inc.
、1998)、およびMeltzer(編者)、PCR in Bioanalysis(Humana Press,In
c.、1998)。本明細書に記載するように、相同性、例えば、システインモチーフ
を有する特定のzamp3またはzamp4ドメインまたは領域をコードする配列を増幅す
るように、PCRプライマーを設計することができる。Many diagnostic procedures use the polymerase chain reaction (PCR) to increase the sensitivity of detection methods.
) Is used. Standard techniques for performing PCR are well known (in general, see: Mathew (editor), Protocols in Human Molecular Genetic.
s (Humana Press, Inc., 1991), White (editor), PCR Protocols: Current
Methods and Applications (Humana Press, Inc., 1993), Cotter (editor)
, Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc., 1996), Hanause
k and Walaszek (editor), Tumor Maker Protocols (Humana Press, Inc., 1
998), Lo (editor), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc.
, 1998), and Meltzer (editor), PCR in Bioanalysis (Humana Press, In
c., 1998). As described herein, PCR primers can be designed to amplify sequences that encode homology, eg, specific zamp3 or zamp4 domains or regions that have a cysteine motif.
【0065】
診断アッセイの1つの変法は逆転写酵素−PCR(RT−PCR)である。RT−PCR技術
において、RNAを生物学的試料から単離し、cDNAに逆転写し、cDNAをzamp3または
zamp4プライマーとインキュベートする(例えば、下記の文献を参照のこと:Wu
他(編者)、″Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR
″、Methods in Gene Biotechnology、CRC Press,Inc.、pp. 15−28、199
7)。次いでPCRを実行し、産物を標準技術により分析する。One variant of the diagnostic assay is reverse transcriptase-PCR (RT-PCR). In the RT-PCR technique, RNA is isolated from a biological sample, reverse transcribed into cDNA, and the cDNA zamp3 or
Incubate with zamp4 primer (see for example: Wu
Others (editor), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR
″, Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pp. 15-28, 199
7). PCR is then performed and the products analyzed by standard techniques.
【0066】
例示として、RNAを生物学的試料から、例えば、前述のグアニジニウム−チオ
シアネート細胞溶解法により単離する。選択的に、固相技術を使用して細胞ライ
ゼイトからmRNAを単離する。ランダムオリゴヌクレオチド、dTの短いホモポリマ
ー、またはzamp3またはzamp4アンチセンスオリゴマーを使用して、単離されたRN
Aで逆転写反応をプライミングすることができる。オリゴ−dTプライマーを使用
すると、種々のmRNAヌクレオチド配列が増幅され、コントロールターゲット配列
を提供できるという利点が得られる。典型的には少なくとも5塩基長さである、2
つのフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反
応により、zamp3またはzamp4配列を増幅する。By way of illustration, RNA is isolated from a biological sample, for example, by the guanidinium-thiocyanate cell lysis method described above. Alternatively, solid phase techniques are used to isolate mRNA from cell lysates. Isolated RNs using random oligonucleotides, short homopolymers of dT, or zamp3 or zamp4 antisense oligomers
A can prime the reverse transcription reaction. The use of oligo-dT primers has the advantage that various mRNA nucleotide sequences can be amplified and provide control target sequences. Typically at least 5 bases long, 2
The zamp3 or zamp4 sequences are amplified by polymerase chain reaction using two flanking oligonucleotide primers.
【0067】
種々のアプローチを使用して、PCR増幅生成物を検出することができる。例え
ば、PCR生成物をゲル電気泳動により分画し、臭化エチジウム染色により可視化
することができる。選択的に、分画したPCR生成物を膜に移し、検出可能に標識
化したzamp3またはzamp4プローブとハイブリダイゼーションし、オートラジオグ
ラフィーにより検査することができる。追加の選択的アプローチは、化学発光検
出を得るためのジゴキシゲニン標識化デオキシリボ核酸トリホスファターゼの使
用、およびC−TRAK比色アッセイを包含する。A variety of approaches can be used to detect PCR amplification products. For example, PCR products can be fractionated by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. Alternatively, the fractionated PCR product can be transferred to a membrane, hybridized with a detectably labeled zamp3 or zamp4 probe, and examined by autoradiography. Additional selective approaches include the use of digoxigenin labeled deoxyribonucleic acid triphosphatase to obtain chemiluminescent detection, and the C-TRAK colorimetric assay.
【0068】
他のアプローチは実時間定量的PCRである(Perkin−Elmer Cetus、コネチカ
ット州ノーウォーク)。蛍光発生プローブは、結合したリポーターおよびクエン
チャー色素の両方を有するオリゴヌクレオチドから成り、前方向プライマーと逆
方向プライマーとの間に特異的にアニールする。Taq DNAポリメラーゼの5'エン
ドヌクレアーゼ活性を使用して、リポーター色素はクエンチャー色素から分離さ
せ、配列特異的シグナルを発生され、これは増幅が増加するにつれて増加する。
PCR反応間に、蛍光強度を連続的にモニターし、定量する。Another approach is real-time quantitative PCR (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). The fluorogenic probe consists of an oligonucleotide with both a reporter and a quencher dye attached, which anneals specifically between the forward and reverse primers. Using the 5'endonuclease activity of Taq DNA polymerase, the reporter dye is separated from the quencher dye, generating a sequence-specific signal, which increases as amplification increases.
Fluorescence intensity is continuously monitored and quantified during the PCR reaction.
【0069】
zamp3またはzamp4の発現を検出する他のアプローチはサイクリングプローブ技
術(CPT)であり、ここで一本鎖DNAターゲットは過剰のDNA−RNA DNAキメラプ
ローブと結合して複合体を形成し、RNAプローブをRNアーゼHで切断し、切断し
たキメラプローブの存在を検出する(例えば、下記の文献を参照のこと:Begg他
、J. Clin. Microbiol. 34:2985、1996およびBekkaoui他、Biotechniques
20:240、1996)。zamp3またはzamp4配列を検出する他の方法は下記のようなア
プローチを利用することができる:核酸配列に基づく増幅(NASBA)、交差ハイ
ブリダイゼーションの共同増幅(CATCH)、およびリガーゼ連鎖反応(LCR)(例
えば、下記の文献を参照のこと:Marshall他、米国特許第5,686,272号(1997)
、Dyer他、J. Virol. Methods 60:161、1996;Ehricht他、Eur. J. Bioch
em. 243:358、1997およびChadwick他、J. Virol. Methods 70:59、1998)
。他の標準法はこの分野において知られている。Another approach to detecting zamp3 or zamp4 expression is the cycling probe technology (CPT), in which a single-stranded DNA target binds to excess DNA-RNA DNA chimeric probe to form a complex, RNA probes are cleaved with RNase H to detect the presence of cleaved chimeric probes (see, eg, Begg et al., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996 and Bekkaoui et al., Biotechniques.
20: 240, 1996). Other methods of detecting zamp3 or zamp4 sequences can utilize approaches such as: Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), cross-hybridization co-amplification (CATCH), and ligase chain reaction (LCR) ( See, for example: Marshall et al., US Pat. No. 5,686,272 (1997).
, Dyer et al., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Ehricht et al., Eur. J. Bioch.
em. 243: 358, 1997 and Chadwick et al., J. Virol. Methods 70:59, 1998).
. Other standard methods are known in the art.
【0070】
zamp3またはzamp4プローブおよびプライマーは、また、組織試料中のzamp3ま
たはzamp4遺伝子の発現を検出し、位置決定するために使用することができる。
このようなin situハイブリダイゼーション法はこの分野においてよく知られて
いる(例えば、下記の文献を参照のこと:Choo(編者)、In Situ Hybridizat
ion Products、Humana Press,Inc.、1994;Wu他(編者)、″Analysis of
Cellular DNA or Abundance of mRNA Radioactive In Situ Hybridiza
tion(RISH)″、Methods in Gene Biotechnology、CRC Press,Inc.、pp.
259−278、1997およびWu他(編者)、″Localization of DNA or Abundan
ce of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization(RISH)″、Metho
ds in Gene Biotechnology、CRC Press,Inc.、pp. 279−289、1997)。The zamp3 or zamp4 probes and primers can also be used to detect and localize the expression of the zamp3 or zamp4 genes in tissue samples.
Such in situ hybridization methods are well known in the art (see, for example: Choo (editor), In Situ Hybridizat.
ion Products, Humana Press, Inc., 1994; Wu et al. (Editor), "Analysis of
Cellular DNA or Abundance of mRNA Radioactive In Situ Hybridiza
(RISH) ″, Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pp.
259-278, 1997 and Wu et al. (Editor), "Localization of DNA or Abundan.
ce of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH) ″, Metho
ds in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pp. 279-289, 1997).
【0071】
種々の追加の診断アプローチはこの分野においてよく知られている(例えば、
下記の文献を参照のこと:Mathew(編者)、Protocols in Human Molecular
Genetics、Humana Press,Inc.、1991;ColemanおよびTsongalis、Molecular
Diagnostics、Humana Press,Inc.、1996およびElles、Molecular Diagnosi
s of Genetic Disease、Humana Press,Inc.、1996)。Various additional diagnostic approaches are well known in the art (eg,
See references: Mathew (editor), Protocols in Human Molecular.
Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular
Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 and Elles, Molecular Diagnosi
s of Genetic Disease, Humana Press, Inc., 1996).
【0072】
本発明は、さらに、他の種からの対応物のポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド(オーソログ)を提供する。これらの種は下記のものを包含するが、これらに
限定されない:哺乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊椎動
物および無脊椎動物。特に興味あるものは、他の哺乳動物種、例えば、ヒト、ラ
ット、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類のポリペプチ
ドからのzamp3およびzaポリペプチドである。ヒトタンパク質の種相同体は、本
発明により提供される情報および組成物を慣用のクローニング技術と組合わせて
使用して、クローニングすることができる。例えば、そのタンパク質を発現する
組織および細胞のタイプから得られるmRNAを使用して、cDNAをクローニングする
ことができる。The invention further provides counterpart polypeptides and polynucleotides (orthologs) from other species. These species include, but are not limited to, mammals, birds, amphibians, reptiles, fish, insects and other vertebrates and invertebrates. Of particular interest are zamp3 and za polypeptides from other mammalian species, such as human, rat, pig, sheep, cow, dog, cat, horse, and other primate polypeptides. Species homologues of human proteins can be cloned using the information and compositions provided by the invention in combination with conventional cloning techniques. For example, mRNA can be cloned using mRNA from tissue and cell types that express the protein.
【0073】
本明細書において開示する配列から設計されたプローブでノザンブロットをプ
ロービングすることによって、mRNAの適当な源を同定することができる。次いで
、陽性の組織または細胞系統のmRNAからライブラリーを調製することができる。
次いで、種々の方法、例えば、完全なまたは部分的ヒトcDNAで、または開示した
配列をベースとする1またはそれ以上の組の縮重プローブでプロービングするこ
とによって、zamp3およびzamp4をコードするcDNAを単離することができる。Suitable sources of mRNA can be identified by probing Northern blots with probes designed from the sequences disclosed herein. The library can then be prepared from positive tissue or cell line mRNA.
The cDNAs encoding zamp3 and zamp4 are then isolated by various methods, such as by probing with full or partial human cDNAs or with one or more sets of degenerate probes based on the disclosed sequences. Can be separated.
【0074】
また、本明細書に開示する配列から設計したプライマーを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応、またはPCR(Mullis、米国特許第4,683,202号)により、cDNAをクロ
ーニングすることができる。追加の方法において、cDNAライブラリーを使用して
宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができ、そしてzamp3およ
びzamp4ポリペプチドに対する抗体で問題のcDNAの発現を検出することができる
。また、ゲノムのクローンの単離に同様な技術を適用することができる。The cDNA can also be cloned by the polymerase chain reaction using primers designed from the sequences disclosed herein or by PCR (Mullis, US Pat. No. 4,683,202). In an additional method, the cDNA library can be used to transform or transfect host cells, and the expression of the cDNA of interest can be detected with antibodies to the zamp3 and zamp4 polypeptides. Similar techniques can also be applied to the isolation of genomic clones.
【0075】
zamp3およびzamp4の別の種のポリペプチドは療法上重要性を有することがある
。ある場合において非天然タンパク質、すなわち、異なる種からのタンパク質は
天然タンパク質よりも効力がすることがあることが証明された。例えば、サケの
カルシトニンはヒト型のカルシトニンよりも骨再吸収の停止においてかなり有効
であることが示された。骨粗鬆症の治療においてヒトカルシトニンよりもサケカ
ルシトニンが効力のある理由として、いくつかの仮説が存在する。Polypeptides of another species of zamp3 and zamp4 may have therapeutic importance. It has been demonstrated that in some cases non-natural proteins, ie proteins from different species, may be more potent than native proteins. For example, salmon calcitonin has been shown to be significantly more effective in arresting bone resorption than human forms of calcitonin. Several hypotheses exist as to why salmon calcitonin is more effective than human calcitonin in treating osteoporosis.
【0076】
これらの仮説は下記のものを包含する:1)サケカルシトニンは分解に対する
いっそう抵抗性である;2)サケカルシトニンはより低い代謝的クリアランス速
度(MCR)を有する;そして3)サケカルシトニンはわずかに異なるコンフォメー
ションを有し、骨レセプター部位に対してより高いアフィニティーを生ずる。他
の例はβ−エンドルフィンファミリーの中に見出される(Ho他、Int. J. Pept
ide Protein Res. 29:521−24、1987)。研究において、単離されたモルモ
ットの回腸を電気刺激し、収縮を測定したとき、ラクダ、ウマ、シチメンチョウ
およびダチョウのβ−エンドルフィンの末梢オピオイド活性はヒトβ−エンドル
フィンのそれよりも大きいことが証明された。These hypotheses include: 1) salmon calcitonin is more resistant to degradation; 2) salmon calcitonin has a lower metabolic clearance rate (MCR); and 3) salmon calcitonin It has a slightly different conformation resulting in higher affinity for bone receptor sites. Other examples are found in the β-endorphin family (Ho et al., Int. J. Pept.
ide Protein Res. 29: 521-24, 1987). Studies have demonstrated that the peripheral opioid activity of camel, horse, turkey and ostrich β-endorphins is greater than that of human β-endorphin when the ileum of isolated guinea pigs is electrically stimulated and contractions are measured. It was
【0077】
ラット、マウスおよびウサギからの輸精管をその上アッセイした。ラットの輸
精管モデルにおいて、ラクダ、およびウマのβ−エンドルフィンは最高の相対潜
在能力を示した。ラットの合成されたリラキシンは、マウス恥骨結合アッセイに
おいて、ヒトおよびブタのリラキシンと同様に活性であった(Bullesbachおよび
Schwabe、Eur. J. Biochem. 241:533−7、1996)。こうして、本発明のネズ
ミzcys4分子はヒトの細胞、組織およびレシピエントにおけるヒト内因的分子よ
りも高い効力を有することがある。Vas deferens from rats, mice and rabbits were also assayed. Camel and horse β-endorphins showed the highest relative potency in the rat vas deferens model. Rat synthesized relaxin was as active as human and porcine relaxin in the mouse pubic bone binding assay (Bullesbach and
Schwabe, Eur. J. Biochem. 241: 533-7, 1996). Thus, the murine zcys4 molecule of the invention may have greater potency than human endogenous molecules in human cells, tissues and recipients.
【0078】
当業者は認識するように、配列番号1、配列番号2、および配列番号19に開示す
る配列はヒトzamp3遺伝子の単一の対立遺伝子を表し、配列番号5および配列番号
6の配列はヒトzamp4遺伝子の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変異型
およびオールタネイトスプライシングが起こることが期待される。対立遺伝子変
異型は、標準的手順に従い、異なる個体からのcDNAまたはゲノムのライブラリー
をプロービングすることによって、クローニングすることができる。配列番号1
、配列番号19、および配列番号5に示すDNA配列の対立遺伝子変異型は、サイレン
ト突然変異体を含有するものおよび突然変異がアミノ酸配列を変化させるものを
包含し、本発明の範囲内に入る。As will be appreciated by one of skill in the art, the sequences disclosed in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 19 represent single alleles of the human zamp3 gene, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 5.
The sequence of 6 represents a single allele of the human zamp4 gene, and allelic variants and alternate splicing are expected to occur. Allelic variants can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals according to standard procedures. Sequence number 1
, SEQ ID NO: 19, and allelic variants of the DNA sequences shown in SEQ ID NO: 5, including those containing silent mutants and those in which the mutation alters the amino acid sequence, are within the scope of the invention.
【0079】
本発明の好ましい態様において、単離された核酸分子は、ストリンジェント条
件下に、配列番号1または5のヌクレオチド配列の一部分を有する核酸分子または
それらの配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子に対してハイ
ブリダイゼーションすることができる。一般に、ストリンジェント条件は、規定
されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱的融点(Tm)よりも約5℃
低いように選択される。Tmはターゲット配列の50%が完全に合致するプローブに
ハイブリダイゼーションする温度(規定されたイオン強度およびpHにおいて)で
ある。In a preferred embodiment of the invention, the isolated nucleic acid molecule is, under stringent conditions, a nucleic acid molecule having a portion of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 5 or a nucleotide sequence complementary to those sequences. Can be hybridized to a nucleic acid molecule having Generally, stringent conditions are about 5 ° C above the thermal melting point (Tm) of a particular sequence at a defined ionic strength and pH.
Selected to be low. The Tm is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe.
【0080】
1対の核酸分子、例えば、DNA−DNA、RNA−RNAおよびDNA−RNAは、ヌクレオチ
ド配列がある程度の相補性を有する場合、ハイブリダイゼーションすることがで
きる。ハイブリッドは二重らせん中のミスマッチ塩基対を許容できるが、ハイブ
リッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチのハイブリッ
ドのTmは1〜1. 5%の塩基対ミスマッチ毎に1℃だけ低下する。ハイブリダイゼー
ション条件のストリンジェンシイを変化させると、ハイブリッドの中に存在する
ミスマッチの程度をコントロールすることができる。ハイブリダイゼーション温
度が増加しかつハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が減少するにつれて
、ストリンジェンシイの程度は増加する。A pair of nucleic acid molecules, such as DNA-DNA, RNA-RNA and DNA-RNA, can hybridize if the nucleotide sequences have some degree of complementarity. The hybrid can tolerate mismatched base pairs in the double helix, but the stability of the hybrid is affected by the degree of mismatch. The Tm of mismatched hybrids is reduced by 1 ° C for every 1-1.5% base pair mismatch. Varying the stringency of the hybridization conditions can control the degree of mismatch present in the hybrid. The degree of stringency increases as the hybridization temperature increases and the ionic strength of the hybridization buffer decreases.
【0081】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドのTmよりも約
5〜25℃低い温度および1MまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包
含する。より低い温度におけるより高い程度のストリンジェンシイはホルムアミ
ドの添加により達成することができる。ホルムアミドは、緩衝液中の1%のホル
ムアミドにつきハイブリッドのTmを約1℃だけ低下させる。一般に、このような
ストリンジェント条件は20〜70℃の温度および6×までのSSCおよび0〜50%のホ
ルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より高い程度
のストリンジェンシイは、40〜70℃の温度において、4×までのSSCおよび0〜50
%のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液を使用して達成可能
である。Stringent hybridization conditions are approximately above the Tm of the hybrid.
Includes hybridization buffer with 5-25 ° C lower temperature and Na + up to 1M. A higher degree of stringency at lower temperatures can be achieved by the addition of formamide. Formamide lowers the hybrid's Tm by about 1 ° C. for 1% formamide in buffer. Generally, such stringent conditions include temperatures of 20-70 ° C. and hybridization buffer containing SSC up to 6 × and 0-50% formamide. The higher degree of stringency is that SSCs up to 4x and 0-50 at temperatures of 40-70 ° C.
It can be achieved using a hybridization buffer containing% formamide.
【0082】
高度にストリンジェントの条件は、典型的には、42〜70℃の温度、および1×
までのSSCおよび0〜50%のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝
液を包含する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間に異なる程度のストリン
ジェンシイを使用して、ターゲット配列に対する最大の特異的結合を達成するこ
とができる。典型的には、増加する程度のストリンジェンシイにおいてハイブリ
ダイゼーション後の洗浄を実施して、ハイブリダイゼーションした複合体からハ
イブリダイゼーションしなかったポリヌクレオチドプローブを除去する。Highly stringent conditions are typically at temperatures of 42-70 ° C. and 1 ×
Up to SSC and 0-50% formamide in the hybridization buffer. Different degrees of stringency can be used during hybridization and washing to achieve maximal specific binding to the target sequence. Post-hybridization washes are typically performed at increasing degrees of stringency to remove unhybridized polynucleotide probes from the hybridized complex.
【0083】
上記条件は指針として働くこと意味し、そして当業者は特定のポリペプチドの
ハイブリッドとともに使用するためにこれらの条件を適合させることができる。
特定のターゲット配列のTmは、ターゲット配列の50%が完全に合致したプローブ
配列にハイブリダイゼーションする温度(規定された条件下に)である。Tmに影
響を及ぼす条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズおよび塩基対含量、ハイ
ブリダイゼーション溶液のイオン強度、およびハイブリダイゼーション溶液中の
脱安定化因子の存在を包含する。The above conditions are meant to serve as a guide, and one of skill in the art can adapt these conditions for use with a particular polypeptide hybrid.
The Tm of a particular target sequence is the temperature (under defined conditions) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe sequence. Conditions that affect the Tm include the size and base pair content of the polynucleotide probe, the ionic strength of the hybridization solution, and the presence of destabilizing factors in the hybridization solution.
【0084】
Tmを計算する多数の方程式はこの分野において知られており、そして変化する
長さのDNA、RNAおよびDNA−RNAハイブリッドおよびポリヌクレオチドプローブ配
列について特異的である(例えば、下記の文献を参照のこと:Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Press 1989);A
usubel他(編者)、Current Protocols in Molecular Biology(John Wile
y & Sons,Inc. 1987);BergerおよびKimmel(編者)、Guide to Molecula
r Cloning Techniques(Academic Press,Inc. 1987);およびWetmur、Cri
t. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227(1990))。A number of equations for calculating Tm are known in the art and are specific for varying lengths of DNA, RNA and DNA-RNA hybrid and polynucleotide probe sequences (see, eg, See also: Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); A
usubel et al. (Editor), Current Protocols in Molecular Biology (John Wile
y & Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (editor), Guide to Molecula
r Cloning Techniques (Academic Press, Inc. 1987); and Wetmur, Cri.
t. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)).
【0085】
配列解析ソフトウェア、例えば、OLIGO 6.0(LSR;ミネソタ州ロングレイク
)およびPrimer Premier 4.0(Premier Biosoft International;カリフォ
ルニア州パロアルト)、ならびにインターネット上のサイトは、所定の配列を解
析しかつユーザー規定基準に基づいてTmを計算するための入手可能な道具である
。また、このようなプログラムにより、規定された条件下に所定の配列を解析し
、適当なプローブ配列を同定することができる。典型的には、>50塩基対の、よ
り長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを計算したTmよりも約20
〜25℃だけ低い温度において実施する。<50塩基対の、より小さいプローブにつ
いて、ハイブリダイゼーションは典型的にはTmまたは5〜10℃だけ低い温度にお
いて実施される。これにより、DNA−DNAおよびDNA−RNAハイブリッドについてハ
イブリダイゼーション速度を最大にすることができる。Sequence analysis software, such as OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, Minnesota) and Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, Calif.), As well as sites on the Internet, analyze predetermined sequences and provide user-defined criteria. Is an available tool for calculating Tm based on. Further, such a program can analyze a predetermined sequence under defined conditions to identify an appropriate probe sequence. Typically, hybridization of longer polynucleotide sequences of> 50 base pairs is about 20 less than the calculated Tm.
Perform at temperatures as low as -25 ° C. For smaller probes <50 base pairs, hybridization is typically carried out at a temperature lower by Tm or 5-10 ° C. This can maximize the hybridization rate for DNA-DNA and DNA-RNA hybrids.
【0086】
ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度および安定性に影響
を及ぼす。<50塩基対の、より小さいプローブ配列は、相補的配列との平衡化に
急速に到達するが、低い安定性のハイブリッドを形成することがある。数分から
数時間のいずれかのインキュベート時間を使用して、ハイブリッドを形成するこ
とができる。より長いプローブ配列はいっそうゆっくり平衡化するようになるが
、より低い温度においてさえいっそう安定な複合体を形成する。インキュベーシ
ョンは一夜またはそれより長い時間進行させることができる。一般に、インキュ
ベーションは計算したCot時間の3倍に等しい期間の間実施される。Cot時間は、
ポリヌクレオチド配列が再アソシエーションするために要する時間であり、この
分野において知られている方法により特定の配列について計算することができる
。The length of the polynucleotide sequence affects the rate and stability of hybridization. Smaller probe sequences <50 base pairs rapidly reach equilibrium with complementary sequences but may form less stable hybrids. Incubation times anywhere from minutes to hours can be used to form hybrids. Longer probe sequences equilibrate more slowly, but form more stable complexes even at lower temperatures. The incubation can be allowed to proceed overnight or longer. In general, the incubation is carried out for a period equal to 3 times the calculated Cot time. Cot time is
The time it takes for a polynucleotide sequence to reassociate and can be calculated for a particular sequence by methods known in the art.
【0087】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成はハイブリッド複合体の熱安定性に影響を
与え、これによりハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩
衝液のイオン強度に影響を及ぼすであろう。A−T対は塩化ナトリウムを含有する
水溶液中でG−C対よりも安定性が低い。したがって、G−C含量が高くなるほど、
ハイブリッドはより安定になる。配列内のGおよびC残基の均一な分布もまたハイ
ブリッドの安定性に積極的に寄与する。さらに、塩基対組成を操作して所定の配
列のTmを変更することができる。例えば、5−メチルデオキシシチジンをデオキ
シシチジンと置換し、5−ブロモデオキシウリジンをチミジンと置換してTmを増
加することができ、これに対して7−デアズ−2'−デオキシグアノシンをグアノ
シンと置換してTmに対する依存性を減少することができる。The base pair composition of the polynucleotide sequence will affect the thermal stability of the hybrid complex and thereby the hybridization temperature and ionic strength of the hybridization buffer. The AT pair is less stable than the GC pair in aqueous solutions containing sodium chloride. Therefore, the higher the G-C content,
The hybrid will be more stable. The even distribution of G and C residues within the sequence also positively contributes to hybrid stability. In addition, the base pair composition can be manipulated to change the Tm of a given sequence. For example, 5-methyldeoxycytidine can be replaced with deoxycytidine, 5-bromodeoxyuridine with thymidine to increase Tm, whereas 7-deaz-2'-deoxyguanosine can be replaced with guanosine. And the dependence on Tm can be reduced.
【0088】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度は、また、ハイブリッドの安定性
に影響を与える。ハイブリダイゼーション緩衝液は、一般に、ブロッキング剤、
例えば、デンハルト溶液(Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス)、
変性サケ精子DNA、tRNA、ミルク粉末(BLOTTO)、ヘパリンまたはSDS、およびNa +
源、例えば、SSC(1×SSC:0.15Mの塩化ナトリウム、15mMのクエン酸ナトリウ
ム)またはSSPE(1×SSPE:1. 8MのNaCl、10mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7. 7)
を含有する。[0088]
The ionic concentration of the hybridization buffer also determines the stability of the hybrid.
Affect. Hybridization buffers generally include blocking agents,
For example, Denhardt's solution (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri),
Denatured salmon sperm DNA, tRNA, milk powder (BLOTTO), heparin or SDS, and Na +
Source, eg, SSC (1 x SSC: 0.15M sodium chloride, 15 mM sodium citrate)
Or SSPE (1 x SSPE: 1.8M NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7.7).
Contains.
【0089】
緩衝液のイオン濃度を減少させることによって、ハイブリッドの安定性を増加
させる。典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は10mM〜1MのNa+を含有す
る。脱安定化剤または変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニ
ウム塩、グアニジニウムカチオンまたはチオシアネートカチオンをハイブリダイ
ゼーション溶液に添加して、ハイブリッドのTmを変更させる。典型的には、ホル
ムアミドを50%までの濃度において使用して、より好都合な、より低い温度にお
いてインキュベーションを実施することができる。また、RNAプローブ使用する
とき、ホルムアミドは非特異的バックグラウンドを減少する作用をする。The stability of the hybrid is increased by reducing the ionic concentration of the buffer. Hybridization buffers typically contain 10 mM to 1 M Na + . A destabilizing or denaturing agent such as formamide, a tetraalkylammonium salt, a guanidinium cation or a thiocyanate cation is added to the hybridization solution to alter the Tm of the hybrid. Typically, formamide can be used at a concentration of up to 50% to carry out the incubation at a more convenient, lower temperature. Formamide also acts to reduce non-specific background when using RNA probes.
【0090】
例示として、42℃において50%のホルムアミド、5×SSC(1×SSC:0.15Mの塩
化ナトリウムおよび15mMのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH
7. 6)、5×デンハルト溶液(100×デンハルト溶液:2%(w/v)のフィコール40
0、2%(w/v)のポリビニルピロリドン、および2%(w/v)のウシ血清アルブミ
ン)、10%のデキストラン硫酸、および20μg/mlの変性、剪断サケ精子DNAを含
んでなる溶液中で、変異型zamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを、配列番号1または5のヌクレオチド配列(またはそれらの相補体)を
有するポリヌクレオチドと一夜ハイブリダイゼーションさせることができる。By way of illustration, 50% formamide at 42 ° C., 5 × SSC (1 × SSC: 0.15 M sodium chloride and 15 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH
7.6), 5 x Denhardt's solution (100 x Denhardt's solution: 2% (w / v) Ficoll 40
In a solution containing 0, 2% (w / v) polyvinylpyrrolidone, and 2% (w / v) bovine serum albumin), 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denaturing, sheared salmon sperm DNA. And a polynucleotide encoding a mutant zamp3 or zamp4 polypeptide can be hybridized overnight with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 5 (or their complements).
【0091】
当業者はこれらのハイブリダイゼーション条件の変更を案出することができる
。例えば、より高いまたはより低い温度、例えば、約65℃において、ホルムアミ
ドを含有しない溶液中で、ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートする
ことができる。そのうえ、プレミックスハイブリダイゼーション溶液は入手可能
であり(例えば、EXPRESSHYBハイブリダイゼーション溶液、CLONTECH Laborato
ries,Inc.)そしてハイブリダイゼーションを製造業者の使用説明書に従い実施
することができる。Those skilled in the art can devise modifications of these hybridization conditions. For example, the hybridization mixture can be incubated in a formamide-free solution at higher or lower temperatures, eg, about 65 ° C. Moreover, premix hybridization solutions are available (eg, EXPRESSHYB hybridization solutions, CLONTECH Laborato
ries, Inc.) and hybridization can be performed according to the manufacturer's instructions.
【0092】
ハイブリダイゼーション後、核酸分子をストリンジェント条件下に、または高
度にストリンジェントな条件下に洗浄して非ハイブリダイゼーション核酸分子を
除去する。典型的なストリンジェント洗浄条件は、0.5×〜2×SSCおよび0.1%の
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液中の55〜65℃における洗浄を包含する。
すなわち、変異型zamp3またはzamp4ポリペプチドをコードする核酸分子は配列番
号1または5のヌクレオチド配列(またはそれらの相補体)を有する核酸分子とス
トリンジェント洗浄条件下にハイブリダイゼーションし、ここで洗浄ストリンジ
ェントは50〜65℃における0.5×〜2×SSCおよび0.1%のSDSに等しく、55℃にお
ける0.5×SSCおよび0.1%のSDS、または65℃における2×SSCおよび0.1%のSDSを
包含する。当業者は、例えば、洗浄溶液中のSSCをSSPEと置換することによって
、同等条件を容易に案出することができる。After hybridization, the nucleic acid molecules are washed under stringent conditions or under highly stringent conditions to remove non-hybridized nucleic acid molecules. Typical stringent wash conditions include washing at 55-65 ° C in a solution of 0.5x-2x SSC and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS).
That is, a nucleic acid molecule encoding a variant zamp3 or zamp4 polypeptide hybridizes under stringent wash conditions with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 5 (or their complement), where wash stringent Equals 0.5 × -2 × SSC and 0.1% SDS at 50-65 ° C. and includes 0.5 × SSC and 0.1% SDS at 55 ° C. or 2 × SSC and 0.1% SDS at 65 ° C. One skilled in the art can easily devise equivalent conditions, for example by replacing SSC in the wash solution with SSPE.
【0093】
典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件は、50〜65℃における0.1×〜0.2
×SSCおよび0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液中の洗浄を包含する
。換言すると、変異型zamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドは配列番号1または5のヌクレオチド配列(またはそれらの相補体)を有する
核酸分子と高度にストリンジェントな洗浄条件下にハイブリダイゼーションし、
ここで洗浄ストリンジェントは50〜65℃における0.1×〜0.2×SSCおよび0.1%の
SDSに等しく、50℃における0.1×SSCおよび0.1%のSDS、または65℃における0.2
×SSCおよび0.1%のSDSを包含する。Typical highly stringent wash conditions are 0.1 × to 0.2 at 50-65 ° C.
X Washing in a solution of SSC and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). In other words, the polynucleotide encoding the mutant zamp3 or zamp4 polypeptide hybridizes with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 5 (or their complement) under highly stringent wash conditions,
The wash stringent here is 0.1 x ~ 0.2 x SSC and 0.1% at 50 ~ 65 ° C.
Equivalent to SDS, 0.1 x SSC and 0.1% SDS at 50 ° C, or 0.2 at 65 ° C
Includes SSC and 0.1% SDS.
【0094】
本発明は、また、2つの基準を使用して同定できる、zamp3またはzamp4変異型
核酸分子を包含する:前述したような、配列番号2または6のアミノ酸配列をもつ
コードされたポリペプチドの間の類似性の決定、およびハイブリダイゼーション
アッセイ。このようなzamp3またはzamp4変異型は下記の核酸分子を包含する:(
1)ストリンジェント洗浄条件下に配列番号1または5のヌクレオチド配列(また
はそれらの相補体)を有する核酸分子とハイブリダイゼーションする核酸分子、
ここで洗浄ストリンジェンシイは50〜65℃における0.5×〜2×SSC、0.1%のSDS
に等しい、および(2)配列番号2または6のアミノ酸配列に対して少なくとも80
%、少なくとも90%、少なくとも95%のまたは95%より大きい配列の同一性を有
するポリペプチドをコードする核酸分子。The present invention also includes zamp3 or zamp4 variant nucleic acid molecules that can be identified using two criteria: an encoded polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 6, as described above. Of similarity between, and hybridization assay. Such zamp3 or zamp4 variants include the following nucleic acid molecules: (
1) a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent wash conditions with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 5 (or their complements),
Here, wash stringency is 0.5 × to 2 × SSC, 0.1% SDS at 50 to 65 ° C.
And (2) at least 80 for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 6
%, At least 90%, at least 95%, or a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having greater than 95% sequence identity.
【0095】
選択的に、zamp3またはzamp4変異型は、(1)高度にストリンジェントの洗浄
条件下に配列番号1または5のヌクレオチド配列(またはそれらの補体)を有する
核酸分子とハイブリダイゼーションする核酸分子、ここで洗浄ストリンジェンシ
イは50〜65℃における0.1×〜0.2×SSC、0.1%のSDSに等しい、および(2)配列
番号2または6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なく
とも95%のまたは95%より大きい配列の同一性を有するポリペプチドをコードす
る核酸分子、として特徴づけることができる。Alternatively, a zamp3 or zamp4 variant is (1) a nucleic acid that hybridizes under highly stringent wash conditions with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 5 (or their complement). Molecules, where wash stringency is 0.1 × to 0.2 × SSC at 50-65 ° C., equal to 0.1% SDS, and (2) at least 80%, at least 90% relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 6. , A nucleic acid molecule encoding a polypeptide having at least 95% or greater than 95% sequence identity.
【0096】
本発明は、また、配列番号2または配列番号6のポリペプチドおよびそれらの種
相同体/オーソログに対して実質的に類似する、単離されたzamp3またはzamp4ポ
リペプチドを提供する。用語「実質的に同様な」は、本明細書において、配列番
号2または6に示す配列またはそれらのオーソログまたはパラログに対して50%、
好ましくは60%、より好ましくは少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプ
チドを表すために使用される。このようなポリペプチドは配列番号2または6に示
す配列またはそれらのオーソログまたはパラログに対して最も好ましくは少なく
とも90%、最も好ましくは少なくとも95%またはそれより大きい配列の同一性を
有する。The present invention also provides an isolated zamp3 or zamp4 polypeptide that is substantially similar to the polypeptides of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 and their species homologs / orthologs. The term "substantially similar" is used herein to mean 50% relative to the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 6 or their orthologs or paralogs,
Preferably used to represent polypeptides having 60%, more preferably at least 80% sequence identity. Such polypeptides have most preferably at least 90%, most preferably at least 95% or greater sequence identity to the sequences shown in SEQ ID NO: 2 or 6 or their orthologs or paralogs.
【0097】
配列同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参照の
こと:Altschul他、Bull. Math. Bio. 48:603−616、1986およびHenikoffお
よびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915−10919、1992。簡
単に述べると、表3(アミノ酸は標準的1文字コードにより示されている)に示す
ように10のギャップオープニングペナルティー、1のギャップエクステンション
ペナルティー、およびHenikoffおよびHenikoff(前掲)の「ブロサム(blosum)
62」スコアリングマトリックスを使用して、2つのアミノ酸配列を整列させて整
列スコアを最適化する。次いで同一性百分率を次のように計算する:The percentage sequence identity is determined by conventional methods. See, for example, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992. Briefly, 10 gap opening penalties, 1 gap extension penalties, and Henikoff and Henikoff (supra) “blosum” as shown in Table 3 (amino acids are indicated by the standard one-letter code).
A 62 "scoring matrix is used to align the two amino acid sequences to optimize the alignment score. Percentage identity is then calculated as follows:
【0098】[0098]
【数1】 [Equation 1]
【0099】[0099]
【表3】 [Table 3]
【0100】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上に開示した比を使用して同様な方法
により決定される。
当業者は認識するように、2つのアミノ酸配列を整列するために有効な多数の
アルゴリズムが存在する。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリ
ズムは、本明細書に開示するアミノ酸配列および推定上の変異型zamp3またはzam
p4のアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを検査する、適当なタンパク質整列
法である。FASTAアルゴリズムは下記の文献に記載されている:PearsonおよびLi
pman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444、1988、およびPearson、Met
h. Enzymol. 183:63、1990。Sequence identity of polynucleotide molecules is determined in a similar manner using the ratios disclosed above. As one of ordinary skill in the art will recognize, there are numerous algorithms that are effective for aligning two amino acid sequences. Pearson and Lipman's “FASTA” similarity search algorithm uses the amino acid sequence disclosed herein and the putative variant zamp3 or zam.
A suitable protein alignment method that tests the level of identity shared by the amino acid sequences of p4. The FASTA algorithm is described in: Pearson and Li.
pman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, and Pearson, Met.
h. Enzymol. 183: 63, 1990.
【0101】
簡単に述べると、まず、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を考慮しな
いで、問題の配列(例えば、配列番号2または6)、および同一性の最高密度(kt
up変数が1である場合)または同一性の対(ktup=2である場合)を有する試験配
列が共有する領域を同定することによって、FASTAは配列の類似性を特性決定す
る。次いで、アミノ酸置換マトリックスを使用してすべての対合アミノ酸の類似
性を比較することによって、同一性の最高密度をもつ10領域を再スコアリングし
、そして最高スコアに寄与する残基のみを含むように、領域の末端を「トリミン
グ」する。Briefly, first, without considering conservative amino acid substitutions, insertions, or deletions, the sequence in question (eg, SEQ ID NO: 2 or 6) and the highest density of identities (kt
FASTA characterizes sequence similarity by identifying regions shared by test sequences with up variables (if 1) or pairs of identities (if ktup = 2). The 10 regions with the highest densities of identity were then rescored by comparing the similarities of all paired amino acids using an amino acid substitution matrix, and included only those residues that contributed to the highest score. First, "trim" the ends of the region.
【0102】
「カットオフ」値(配列の長さおよびktup値に基づいて前もって決定した式に
より計算される)より大きいスコアをもつ、いくつかの領域が存在する場合、ト
リミングした最初の領域を検査して、領域を結合してギャップをもつ近似整列を
形成できるかどうかを決定する。最後に、アミノ酸配列の挿入または欠失を可能
とする、Needleman−Wunsch−Sellersアルゴリズムの変法(NeedlemanおよびWun
sch、J. Mol. Biol. 48:444、1970;Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26
:787、1974)を使用して、2つのアミノ酸配列の最高のスコアリング領域を整列
させる。If some regions have a score greater than the “cutoff” value (calculated by a previously determined formula based on the length of the sequence and the ktup value), then the first region trimmed is examined. , To determine if the regions can be joined to form an approximate alignment with gaps. Finally, a modification of the Needleman-Wunsch-Sellers algorithm that allows the insertion or deletion of amino acid sequences (Needleman and Wun
sch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26.
: 787, 1974) to align the highest scoring regions of two amino acid sequences.
【0103】
FASTA解析のためのパラメーターの例は次の通りである:ktup=1,ギャップオ
ープニングペナルティー=10、ギャップエクステンションペナルティー=1、お
よび置換マトリックス=BLOSUM62。Pearson、Meth. Enzymol. 183:63、1990
の付録2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル(「SMATR
IX」)を変更することによって、これらのパラメーターをFASTAプログラムの中
に導入することができる。
また、上に開示した比を使用して核酸分子の配列の同一性を決定するために、
FASTAを使用することができる。ヌクレオチド配列を比較するために、ktup値は1
〜6、好ましくは4〜6の範囲であることができる。Examples of parameters for FASTA analysis are as follows: ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1, and substitution matrix = BLOSUM62. Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63, 1990.
Scoring matrix file ("SMATR
IX ") can be modified to introduce these parameters into the FASTA program. Also, to determine the sequence identity of nucleic acid molecules using the ratios disclosed above,
FASTA can be used. Ktup value of 1 for comparing nucleotide sequences
It can range from ~ 6, preferably 4-6.
【0104】
本発明は、配列番号2または6のアミノ酸配列と比較して、1またはそれ以上の
「保存的アミノ酸置換」を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する
。保存的アミノ酸置換はアミノ酸の化学的特性に基づくことができる。すなわち
、配列番号2または6の1またはそれ以上のアミノ酸置換を含有する変異型を得る
ことができ、ここでアルキルアミノ酸はzamp3またはzamp4アミノ酸配列中のアル
キルアミノ酸で置換されており、芳香族アミノ酸はzamp3またはzamp4アミノ酸配
列中の芳香族アミノ酸で置換されており、硫黄含有アミノ酸はzamp3またはzamp4
アミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸で置換されており、ヒドロキシ含有アミノ酸
はzamp3またはzamp4アミノ酸配列中のヒドロキシ含有アミノ酸で置換されており
、酸性アミノ酸はzamp3またはzamp4アミノ酸配列中の酸性アミノ酸で置換されて
おり、塩基性アミノ酸はzamp3またはzamp4アミノ酸配列中の塩基性アミノ酸で置
換されているか、あるいは二塩基性モノカルボン酸アミノ酸はzamp3またはzamp4
アミノ酸配列中の二塩基性モノカルボン酸アミノ酸で置換されている。The present invention includes nucleic acid molecules that encode a polypeptide having one or more "conservative amino acid substitutions" as compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 6. Conservative amino acid substitutions can be based on the chemical properties of amino acids. That is, a variant containing one or more amino acid substitutions of SEQ ID NO: 2 or 6 can be obtained, wherein the alkyl amino acid is replaced with an alkyl amino acid in the zamp3 or zamp4 amino acid sequence and the aromatic amino acid is Substituted for aromatic amino acids in the zamp3 or zamp4 amino acid sequence, sulfur containing amino acids are zamp3 or zamp4
The amino acid sequence is replaced by a sulfur-containing amino acid, the hydroxy-containing amino acid is replaced by a hydroxy-containing amino acid in the zamp3 or zamp4 amino acid sequence, and the acidic amino acid is replaced by an acidic amino acid in the zamp3 or zamp4 amino acid sequence. , Basic amino acids are substituted with basic amino acids in the zamp3 or zamp4 amino acid sequence, or dibasic monocarboxylic acid amino acids are zamp3 or zamp4
Substituted with a dibasic monocarboxylic acid amino acid in the amino acid sequence.
【0105】
例えば、普通のアミノ酸の間で、「保存的アミノ酸置換」は、下記の基の各々
内のアミノ酸間の置換により例示される:(1)グリシン、アラニン、バリン、
ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびト
リプトファン、(3)セリンおよびトレオニン、(4)アスパラギン酸塩およびグ
ルタミン酸塩、(5)グルタミンおよびアスパラギン、および(6)リシン、アル
ギニンおよびヒスチジン。For example, between common amino acids, “conservative amino acid substitutions” are exemplified by substitutions between amino acids within each of the following groups: (1) glycine, alanine, valine,
Leucine and isoleucine, (2) phenylalanine, tyrosine, and tryptophan, (3) serine and threonine, (4) aspartate and glutamate, (5) glutamine and asparagine, and (6) lysine, arginine and histidine.
【0106】
BLOSUM62表は、関係するタンパク質の500より多いグループの高度に保存され
た領域を表す、タンパク質配列のセグメントの約2,000の局所的多重整列から誘
導されたアミノ酸置換マトリックスである(HenikoffおよびHenikoff、Proc. N
atl'l. Acad. Sci. USA、89:10915、1992)。したがって、本発明のアミノ
酸配列の中に導入することができる保存的アミノ酸置換を定めるために、BLOSUM
62置換頻度を使用することができる。The BLOSUM62 table is an amino acid substitution matrix derived from approximately 2,000 local multiple alignments of segments of protein sequences, representing highly conserved regions of more than 500 groups of proteins of interest (Henikoff and Henikoff. , Proc. N
atl'l. Acad. Sci. USA, 89: 10915, 1992). Therefore, in order to define conservative amino acid substitutions that can be introduced into the amino acid sequences of the present invention, BLOSUM
62 replacement frequencies can be used.
【0107】
化学的特性にのみ基づくアミノ酸置換を設計することができる(前述したよう
に)が、「保存的アミノ酸置換」という用語は好ましくは−1より大きいBLOSUM6
2値により表される置換を意味する。例えば、置換が0、1、2、または3により特
徴づけられる場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムに従うと、好ま
しい保存的アミノ酸置換は少なくとも1(例えば、1、2または3)のBLOSUM62値に
より特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも2(例え
ば、2または3)のBLOSUM62値により特徴づけられる。Although amino acid substitutions can be designed based on their chemical properties only (as described above), the term "conservative amino acid substitutions" is preferably BLOSUM6 greater than -1.
Means the substitution represented by a binary value. For example, an amino acid substitution is conservative if the substitution is characterized by 0, 1, 2, or 3. According to this system, preferred conservative amino acid substitutions are characterized by a BLOSUM62 value of at least 1 (eg, 1, 2 or 3), while more preferred conservative amino acid substitutions are BLOSUM62 values of at least 2 (eg, 2 or 3). Characterized by:
【0108】
配列番号1または5に記載するヌクレオチドをヌクレオチドで置換することによ
って、zamp3またはzamp4遺伝子における保存的アミノ酸変化を導入することがで
きる。このような「保存的アミノ酸」の変異型は、例えば、オリゴヌクレオチド
特異的突然変異誘発、リンカー−走査突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を使
用する突然変異誘発、およびその他により得ることができる(下記の文献を参照
のこと:Ausubel(1995)pp. 8−10〜8−22;およびMcPherson(編者)、Direc
ted Mutagenesis:A Practical Approach(IRL Press 1991))。エネルギ
ー収支を促進するこのような変異型の能力ならびに野生型タンパク質の他の性質
は、標準的方法、例えば、本明細書に記載するアッセイを使用して決定すること
ができる。選択的に、抗zamp3またはzamp4抗体に特異的に結合する能力により、
変異型zamp3またはzamp4ポリペプチドを同定することができる。Conservative amino acid changes in the zamp3 or zamp4 genes can be introduced by substituting the nucleotides set forth in SEQ ID NO: 1 or 5 with nucleotides. Such "conservative amino acid" variants can be obtained, for example, by oligonucleotide-directed mutagenesis, linker-scan mutagenesis, mutagenesis using the polymerase chain reaction, and others (see below). References: Ausubel (1995) pp. 8-10-8-22; and McPherson (editor), Direc.
ted Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). The ability of such variants to promote energy balance, as well as other properties of wild-type proteins, can be determined using standard methods, eg, the assays described herein. Alternatively, due to its ability to specifically bind to anti-zamp3 or zamp4 antibodies,
Mutant zamp3 or zamp4 polypeptides can be identified.
【0109】
実質的に相同性のタンパク質およびポリペプチドは、1またはそれ以上のアミ
ノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化は好
ましくは小さい特質を有する、すなわち、下記の天然を有する:保存的アミノ酸
置換およびタンパク質またはポリペプチドのフォルディングまたは活性に影響を
実質的に与えない他の置換;小さい欠失、典型的には1〜約30アミノ酸の欠失;
およびアミノ末端およびカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ
末端のメチオニン残基、約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド、または精
製を促進する小さいエクステンション(親和標識)、Substantially homologous proteins and polypeptides are characterized as having one or more amino acid substitutions, deletions or additions. These changes preferably have minor attributes, ie have the following naturalities: conservative amino acid substitutions and other substitutions that do not substantially affect the folding or activity of the protein or polypeptide; minor deletions, typical Typically from 1 to about 30 amino acids deleted;
And amino- and carboxyl-terminal extensions, such as amino-terminal methionine residues, small linker peptides of up to about 20-25 residues, or small extensions that facilitate purification (affinity labeling),
【0110】
例えば、ポリ−ヒスチジントラクト、プロテインA(Nilsson他、EMBO J. 4
:1075、1985;Nilsson他、Methods Enzymol. 198:3、1991)、グルタチオン
Sトランスフェラーゼ(SmithおよびJohnson、Gene 67:31、1988)、マルトー
ス結合性タンパク質(KellermanおよびFerenci、Methods Enzymol. 90:459−
463、1982;Guan他、Gene 67:21−30、1987)、チオレドキシン、ウビクイチ
ン、セルロース結合性タンパク質、T7ポリメラーゼ、または他の抗原エピトープ
または結合性ドメイン。一般に、下記の文献を参照のこと:Ford他、Protein E
xpression and Purification 2:95−107、1991。For example, poly-histidine tract, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4
: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), glutathione.
S-transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), maltose binding protein (Kellerman and Ferenci, Methods Enzymol. 90: 459-
463, 1982; Guan et al., Gene 67: 21-30, 1987), thioredoxin, ubiquitin, cellulose binding protein, T7 polymerase, or other antigenic epitopes or binding domains. See generally the following references: Ford et al., Protein E.
xpression and Purification 2: 95-107, 1991.
【0111】
親和標識をコードするDNA商業的供給会社から入手可能である(例えば、Pharm
acia Biotech.、ニュージャージイ州ピスカタウェイ;New England Biolabs
、マサチュセッツ州ベバーリイ)。親和標識を含んでなるポリペプチドは、zamp
3またはzamp4ポリペプチドと親和標識との間のタンパク質分解的切断部位をさら
に含んでなることができる。好ましいこのような部位はトロンビン切断部位およ
び因子Xa切断部位を包含する。本発明のタンパク質は、また、天然に存在しない
アミノ酸残基を含むことができる。DNAs encoding affinity tags are available from commercial suppliers (eg Pharm.
acia Biotech., Piscataway, NJ; New England Biolabs
, Beverly, Massachusetts). A polypeptide comprising an affinity tag is zamp
It may further comprise a proteolytic cleavage site between the 3 or zamp4 polypeptide and the affinity label. Preferred such sites include thrombin cleavage sites and factor Xa cleavage sites. The proteins of the invention can also include non-naturally occurring amino acid residues.
【0112】
天然に存在しないアミノ酸は、限定されずに、下記のものを包含する:トラン
ス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシプロリン
、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチル−グリシン、アロ−スレオニン
、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシ−ステイン、ヒドロキシエチルホモシ
ステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert−ロイシン
、ノルバリン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザ
フェニル−アラニン、4−フルオロフェニルアラニン、4−ヒドロキシプロリン、
6−N−メチルリシン、2−アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα−メチルセリン
。Non-naturally occurring amino acids include, without limitation, the following: trans-3-methylproline, 2,4-methanoproline, cis-4-hydroxyproline, trans-4-hydroxyproline, N-methyl-glycine, allo-threonine, methylthreonine, hydroxyethylcystein, hydroxyethylhomocysteine, nitroglutamine, homoglutamine, pipecolic acid, tert-leucine, norvaline, 2-azaphenylalanine, 3-azaphenylalanine, 4 -Azaphenyl-alanine, 4-fluorophenylalanine, 4-hydroxyproline,
6-N-methyllysine, 2-aminoisobutyric acid, isovaline and α-methylserine.
【0113】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に組込む、いくつかの方法は
この分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレ
ッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する、in vitro系を使用する
ことができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法はこの分野に
おいて知られている。大腸菌(E. coli)S30抽出物および商業的に入手可能な
酵素および他の試薬を含んでなる無細胞系において、ナンセンス突然変異を含有
するプラスミドの転写および翻訳は実施される。Several methods are known in the art for incorporating non-naturally occurring amino acid residues into proteins. For example, an in vitro system can be used that uses chemically aminoacylated suppressor tRNA to suppress nonsense mutations. Methods of synthesizing amino acids and aminoacylating tRNA are known in the art. Transcription and translation of the plasmid containing the nonsense mutation is performed in a cell-free system comprising E. coli S30 extract and commercially available enzymes and other reagents.
【0114】
タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、下記の文献を参照
のこと:Robertson他、J. Am. Chem. Soc. 113:2722、1991;Ellman他、Me
thods Enzymol. 202:301、1991;Chung他、Science 259:806−09、1993;
およびChung他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145−49、1993。第2
の方法において、突然変異されたmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプ
レッサーtRNAのマイクロインジェクションにより、キセノプス・オオサイト(Xe
nopus oocytes)中で翻訳を実施する(Turcatti他、J. Biol. Chem. 271:1
9991−98、1996)。The protein is purified by chromatography. See, for example: Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Me.
thods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-09, 1993;
And Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-49, 1993. No. 2
In the method described above, xenopse oocytes (Xe) were isolated by microinjection of mutated mRNA and chemically aminoacylated suppressor tRNA.
translation in nopus oocytes (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 1
9991-98, 1996).
【0115】
第3の方法において、置換すべき天然のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン
)の非存在においてかつ所望の天然に存在しない1またはそれ以上のアミノ酸(
例えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニ
ルアラニンまたは4−フルオロフェニルアラニン)の存在下に、大腸菌(E. col
i)細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸をその天然の対応物の代わりに
タンパク質の中に組込む。Koide他、Biochem. 33:7470−76、1994、参照。in
vitro化学的修飾により、天然に存在するアミノ酸残基を天然に存在しない種
に変換することができる。化学的修飾を部位特異的突然変異誘発と組合わせて、
置換の範囲をさらに拡張することができる(WynnおよびRichards、Protein Sci
. 2:395−403、1993)。In the third method, in the absence of the naturally occurring amino acid to be replaced (eg, phenylalanine) and the desired non-naturally occurring amino acid (s) (
For example, E. coli in the presence of 2-azaphenylalanine, 3-azaphenylalanine, 4-azaphenylalanine or 4-fluorophenylalanine.
i) Culture the cells. The non-naturally occurring amino acid is incorporated into the protein in place of its natural counterpart. See Koide et al., Biochem. 33: 7470-76, 1994. in
In vitro chemical modifications can convert naturally occurring amino acid residues to non-naturally occurring species. Combining chemical modification with site-directed mutagenesis,
The range of substitutions can be further extended (Wynn and Richards, Protein Sci
.2: 395-403, 1993).
【0116】
制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、
天然に存在しないアミノ酸、および非天然アミノ酸をzamp3またはzamp4ポリペプ
チドのアミノ酸残基と置換することができる。「非天然アミノ酸」はタンパク質
合成後に修飾されており、および/または標準的アミノ酸のそれと異なる1また
はそれ以上のそれらの側鎖の中に化学的構造を有する。非天然アミノ酸は化学的
に合成されるか、あるいは好ましくは商業的に入手可能であり、そしてピペコリ
ン酸、チアゾリンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−および4−メチルプロリン
、および3,3−ジメチルプロリンを包含する。A limited number of non-conservative amino acids, amino acids not encoded by the genetic code,
Non-naturally occurring amino acids and unnatural amino acids can be substituted for amino acid residues in the zamp3 or zamp4 polypeptide. "Unnatural amino acids" have been modified after protein synthesis and / or have a chemical structure in their one or more side chains that differs from that of standard amino acids. Unnatural amino acids are either chemically synthesized or are preferably commercially available and include pipecolic acid, thiazolinecarboxylic acid, dehydroproline, 3- and 4-methylproline, and 3,3-dimethylproline. Include.
【0117】
本発明のzamp3またはzamp4ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野に
おいて知られている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査
突然変異誘発に従い同定することができる(CunninghamおよびWells、Science
244:1081−5、1989)。後者の技術において、単一のアラニンの突然変異を分子
中のすべての残基において導入し、そして生ずる突然変異体分子を生物学的活性
(例えば、抗微生物活性)について試験して、分子の活性に対して決定的である
アミノ酸残基を同定する。また、下記の文献を参照のこと:Hilton他、J. Biol
. Chem. 271:4699−708、1996。Essential amino acids in the zamp3 or zamp4 polypeptides of the invention can be identified according to procedures known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Science
244: 1081-5, 1989). In the latter technique, a single alanine mutation is introduced at every residue in the molecule and the resulting mutant molecule is tested for biological activity (eg, antimicrobial activity) to determine the activity of the molecule. Identifies amino acid residues that are critical to. See also: Hilton et al., J. Biol.
Chem. 271: 4699-708, 1996.
【0118】
また、リガンド−レセプターまたは他の生物学的相互作用の部位は、構造の物
理的解析により決定することができ、例えば、核磁気共鳴、結晶学、電子回折ま
たはフォトアフィニティー標識化のような技術と、推定上の接触部位のアミノ酸
の突然変異との組合わせにより決定することができる。例えば、下記の文献を参
照のこと:de Vos他、Science 255:306−12、1992;Smith他、J. Mol. Bio
l. 224:899−904、1992;Wlodaver他、FEBS Lett. 309:59−64、1992。必
須アミノ酸の同定は、また、関係するβ−デフェンシンとの相同性から推定する
ことができる。The site of ligand-receptor or other biological interaction can also be determined by physical analysis of the structure, such as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction or photoaffinity labeling. Can be determined by a combination of various techniques and mutation of amino acids at putative contact sites. For example, see the following references: de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Bio.
224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Identification of essential amino acids can also be inferred from homology with related β-defensins.
【0119】
既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載
されている方法を使用して、多重アミノ酸置換を行い、試験することができる:
Reidhaar−OlsonおよびSauer、Science 241:53−7、1988またはBowieおよびSa
uer、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:2152−6、1989。簡単に述べると、
これらの著者らはポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にランダム化
し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異化ポリペプチドを配列
決定して、各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示し
ている。使用できる他の方法は下記の方法を包含する:ファージディスプレイ(
例えば、Lowman他、Biochem. 30:10832−7、1991;Ladner他、米国特許第5,22
3,409号;Huse、WIPO公開WO 92/06204)および領域特異的突然変異誘発(Derb
yshire他、Gene 46:145、1986;Ner他、DNA 7:127、1988)。Multiple amino acid substitutions can be made and tested using known mutagenesis and screening methods, such as those described in the following references:
Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-7, 1988 or Bowie and Sa.
Uer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989. In short,
These authors randomized two or more positions in the polypeptide simultaneously, selected for functional polypeptides, and then sequenced the mutated polypeptides to generate a spectrum of acceptable substitutions at each position. A method of determining is disclosed. Other methods that can be used include the following: Phage display (
For example, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., US Patent No. 5,22.
No. 3,409; Huse, WIPO publication WO 92/06204) and region-directed mutagenesis (Derb
Yshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
【0120】
また、開示したzamp3またはzamp4 DNAおよびポリペプチド配列の変異型を、
下記の文献に開示されているように、DNAシャフリングにより発生させることが
できる:Stemmer、Nature 370:389、1994、Stemmer、Proc. Nat. Acad. Sc
i. USA 91:10747、1994および国際公開WO 97/20078。簡単に述べると、親D
NAをランダムフラグメント化し、次いでPCRによりリアセンブリーして、ランダ
ムに導入された点突然変異を生じさせることによって、in vitro相同的組換え
により変異型DNA分子を発生させる。Also, variants of the disclosed zamp3 or zamp4 DNA and polypeptide sequences are
It can be generated by DNA shuffling as disclosed in: Stemmer, Nature 370: 389, 1994, Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sc.
i. USA 91: 10747, 1994 and International Publication WO 97/20078. Briefly, parent D
The NA is randomly fragmented and then reassembled by PCR to generate randomly introduced point mutations to generate mutant DNA molecules by in vitro homologous recombination.
【0121】
親DNA分子のファミリー、例えば、対立遺伝子変異型または異なる種からのDNA
分子を使用して、追加の可変性をプロセスの中に導入することによって、この技
術を修飾することができる。所望の活性について選択またはスクリーニングし、
次いで突然変異誘発およびアッセイをさらに反復して、所望の突然変異を選択す
ると同時に有害な変化に対して選択することによって、配列を急速に「進化」さ
せる。A family of parental DNA molecules, eg, allelic variants or DNA from different species
Molecules can be used to modify this technique by introducing additional variability into the process. Select or screen for the desired activity,
The mutagenesis and assay is then further repeated to rapidly "evolve" the sequence by selecting for the desired mutation while selecting for deleterious changes.
【0122】
前述の突然変異誘発法を大きい処理量の自動化スクリーニング法と組合わせて
、宿主細胞においてクローニングされ、突然変異化されたポリペプチドの活性を
検出することができる。活性ポリペプチド(例えば、抗微生物活性)をコードす
る突然変異化DNA分子を宿主細胞から回収し、現代的装置を使用して急速に配列
決定することができる。これらの方法は、問題のポリペプチドにおける個々のア
ミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能とし、未知構造のポリペプチドに適用す
ることができる。The above-described mutagenesis method can be combined with high throughput automated screening methods to detect the activity of cloned and mutated polypeptides in host cells. Mutated DNA molecules encoding active polypeptides (eg, antimicrobial activity) can be recovered from the host cells and rapidly sequenced using modern equipment. These methods allow the rapid determination of the importance of individual amino acid residues in the polypeptide in question and can be applied to polypeptides of unknown structure.
【0123】
前述の方法を使用して、当業者は配列番号2の残基1〜63または配列番号6の残
基1〜43またはそれらの対立遺伝子変異型に対して実質的に相同的でありかつ野
生型タンパク質の抗微生物活特性を保持する種々のポリペプチドを同定しおよび
/または調製することができる。このようなポリペプチドは親和標識およびその
他からの追加のアミノ酸を含むことができる。このようなポリペプチドは、また
、一般的に前述した追加のポリペプチドセグメントを含むことができる。Using the methods described above, one of skill in the art would be substantially homologous to residues 1-63 of SEQ ID NO: 2 or residues 1-43 of SEQ ID NO: 6 or allelic variants thereof. And various polypeptides can be identified and / or prepared that retain the antimicrobial properties of the wild-type protein. Such polypeptides may include affinity tags and additional amino acids from others. Such polypeptides can also include additional polypeptide segments, generally as described above.
【0124】
全長のタンパク質、それらの活性なフラグメントおよび融合タンパク質を包含
する、本発明のポリペプチドを、慣用の技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞
において産生することができる。しかしながら、多少の注意を払って、本発明の
分子の抗微生物活性の結果として、宿主細胞を選択しなくてはならない。例えば
、zamp3またはzamp4mp4ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、
アゴニストまたはアンタゴニストは抗微生物機能の一部分として宿主細胞を殺す
ことができるので、任意の細胞培養に基づく系を評価しなくてはならない。The polypeptides of the present invention, including full-length proteins, active fragments thereof and fusion proteins, can be produced in genetically engineered host cells according to conventional techniques. However, some care must be taken in selecting host cells as a result of the antimicrobial activity of the molecules of the invention. For example, a zamp3 or zamp4mp4 polypeptide, fragment, fusion protein, antibody,
Since agonists or antagonists can kill host cells as part of their antimicrobial function, any cell culture-based system must be evaluated.
【0125】
zamp3またはzamp4mp4ポリペプチドは、PCRによるか、または潜在的細胞障害性
の問題を回避する他のタンパク質化学技術による調製を可能とするために十分に
小さいサイズを有する。選択的に、天然または操作した前駆体タンパク質は、成
熟zamp3またはzamp4mp4ポリペプチドを生ずる翻訳後切断前に、不活性であり、
これによりリソソームパッケージ前の宿主細胞の細胞障害性を制限する。例えば
、下記の文献を参照のこと:Lehrer他、Cell 229−30、1991。こうして、zamp3
またはzamp4mp4ポリペプチドに対する前駆体タンパク質は微生物細胞培養におい
て産生することができる。The zamp3 or zamp4mp4 polypeptides have a size small enough to allow their preparation by PCR or by other protein chemistry techniques that avoid potential cytotoxicity problems. Alternatively, the native or engineered precursor protein is inactive prior to post-translational cleavage to give the mature zamp3 or zamp4mp4 polypeptide,
This limits the cytotoxicity of the host cell prior to lysosomal packaging. See, for example: Lehrer et al., Cell 229-30, 1991. Thus, zamp3
Alternatively, the precursor protein for the zamp4mp4 polypeptide can be produced in microbial cell culture.
【0126】
適当な宿主細胞は、外因的DNAで形質転換またはトランスフェクトすることが
でき、培養により増殖させることができる細胞のタイプであり、そして細菌、真
菌細胞、および培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞の微
生物の培養された細胞は好ましい。クローニングされたDNA分子を操作し、外因
的DNAを種々の宿主細胞の中に導入する技術は、下記の文献に記載されている:S
ambrook他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、およびAusu
bel他(編者)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley
and Sons,Inc.、NY、1987。Suitable host cells are types of cells that can be transformed or transfected with exogenous DNA and can be grown in culture, and include bacterial, fungal, and cultured higher eukaryotic cells. Includes. Eukaryotic cells, especially cultured cells of multicellular microorganisms, are preferred. Techniques for manipulating cloned DNA molecules and introducing exogenous DNA into various host cells are described in the following references: S
ambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausu
bel et al. (Editor), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, Inc., NY, 1987.
【0127】
一般に、zamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクタ
ー内に一般に転写プロモーターおよびターミネーターを包含する、その発現のた
めの必要な他の遺伝因子に、作用可能に連鎖される。ベクターは、また、1また
はそれ以上の選択可能なマーカーおよび1またはそれ以上の複製起点を普通に含
有するが、当業者は認識するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々
のベクター上に提供し、そして宿主細胞のゲノムの中への組込みにより外因的DN
Aの複製を得ることができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマー
カー、ベクターおよび他の因子の選択は、当業者のレベル内の日常的設計事項で
ある。多数のこのような因子は文献に記載されており、そして商業的供給会社か
ら入手可能である。Generally, a DNA sequence encoding a zamp3 or zamp4 polypeptide is operably linked to other necessary genetic elements for its expression, which generally include transcription promoters and terminators within the expression vector. Vectors also usually contain one or more selectable markers and one or more origins of replication, but one of skill in the art will appreciate that the selectable markers in certain systems will be distinct. Exogenous DN provided on the vector and integrated into the genome of the host cell.
You can get a copy of A. Selection of promoters, terminators, selectable markers, vectors and other factors is a matter of routine design within the level of ordinary skill in the art. Many such factors are described in the literature and are available from commercial suppliers.
【0128】
zamp3またはzamp4ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分
泌シグナル配列(また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列として知られ
ている)を発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はzamp3またはzamp4
ポリペプチドのそれであることができるか、あるいは他の分泌されたタンパク質
(例えば、t−PA)から誘導するか、あるいは新規に合成することができる。分
泌シグナル配列はzamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするDNA配列に正しい
リーディングフレームで結合する。分泌シグナル配列は普通に問題のポリペプチ
ドをコードするDNA配列に対して5'に配置されるが、ある種の分泌シグナル配列
は問題のDNA配列の中のどこかに位置決定することができる(例えば、Welch他、
米国特許第5,037,743号;Holland他、米国特許第5,143,830号、参照)。To direct the zamp3 or zamp4 polypeptide into the secretory pathway of a host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence, prepro sequence or pre sequence) is provided in the expression vector. Secretory signal sequence is zamp3 or zamp4
It can be that of a polypeptide, or can be derived from other secreted proteins (eg, t-PA), or can be de novo synthesized. The secretory signal sequence is joined in correct reading frame to the DNA sequence encoding the zamp3 or zamp4 polypeptide. Secretory signal sequences are commonly placed 5'to the DNA sequence encoding the polypeptide of interest, although some secretory signal sequences may be located anywhere within the DNA sequence of interest ( For example, Welch et al.
U.S. Patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830).
【0129】
本発明は、下記の作用可能に連鎖された因子を含んでなる発現ベクターを提供
する:転写プロモーター;本明細書に記載するzamp3またはzamp4タンパク質をコ
ードするDNAセグメント;および転写ターミネーター。また、本発明は、前記タ
ンパク質に作用可能に連鎖された分泌シグナル配列をさらにコードするDNAセグ
メントを提供し、このような分泌シグナル配列は配列番号2のアミノ酸残基1〜ア
ミノ酸残基22を有するポリペプチドである。The present invention provides an expression vector comprising the following operably linked factors: a transcription promoter; a DNA segment encoding a zamp3 or zamp4 protein described herein; and a transcription terminator. The present invention also provides a DNA segment further encoding a secretory signal sequence operably linked to the protein, wherein the secretory signal sequence has amino acid residue 1 to amino acid residue 22 of SEQ ID NO: 2. It is a polypeptide.
【0130】
選択的に、本発明のポリペプチドの中に含有される分泌シグナル配列を使用し
て、他のポリペプチドを分泌経路の中に向けることができる。本発明は、このよ
うな融合ポリペプチドを提供する。配列番号2のアミノ酸残基1〜22から誘導され
た分泌シグナル配列が他のポリペプチドをコードするDNA配列に作用可能に連鎖
された、シグナル融合ポリペプチドを、この分野において知られておりかつ本明
細書に開示されている方法により、作ることができる。[0130] Alternatively, secretory signal sequences contained within the polypeptides of the invention can be used to direct other polypeptides into the secretory pathway. The present invention provides such fusion polypeptides. Signal fusion polypeptides are known in the art and are present in It can be made by the method disclosed in the specification.
【0131】
好ましくは、本発明の融合ポリペプチドの中に含有される分泌シグナル配列を
追加のペプチドに対してアミノ末端的に融合させて、追加のペプチドを分泌経路
の中に向ける。このような構築物はこの分野において知られている多数の用途を
有する。例えば、これらの新規な分泌シグナル配列の融合構築物は、例えば、常
態で分泌されないタンパク質の活性成分、例えば、レセプターの分泌を指令する
ことができる。このような融合物をin vivoまたはin vitroにおいて使用して
、ペプチドを分泌経路を通して向けることができる。Preferably, the secretory signal sequence contained in the fusion polypeptide of the invention is amino terminally fused to the additional peptide to direct the additional peptide into the secretory pathway. Such constructs have numerous uses known in the art. For example, fusion constructs of these novel secretory signal sequences can direct the secretion of, for example, the active components of proteins that are not normally secreted, such as receptors. Such fusions can be used in vivo or in vitro to direct the peptide through the secretory pathway.
【0132】
また、培養された哺乳動物細胞は、本発明において適当な宿主である。外因的
DNAを哺乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する:リン酸
カルシウム仲介トランスフェクション(Wigler他、Cell 14:725、1978;Corsa
roおよびPearson、Somatic Cell Genetics 7:603、1981;GrahamおよびVan
der Eb、Virology 52:456、1973)、エレクトロポレーション(Neumann他
、EMBO J. 1:841−5、1982)、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクショ
ン(Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley
and Sons,Inc.、NY、1987)、リポソーム仲介トランスフェクション(Hawley
−Nelson他、Focus 15:73、1993;Ciccarone他、Focus 15:80、1993)、お
よびウイルスベクター(MillerおよびRosman、BioTechniques 7:980−90、198
9;WangおよびFiner、Nature Med. 2:714−16、1996)。Cultured mammalian cells are also suitable hosts in the present invention. Extrinsic
Methods for introducing DNA into mammalian host cells include the following methods: calcium phosphate mediated transfection (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsa
ro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van.
der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-5, 1982), DEAE-dextrin mediated transfection (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley).
and Sons, Inc., NY, 1987), liposome-mediated transfection (Hawley)
-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993), and viral vectors (Miller and Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 198).
9; Wang and Finer, Nature Med. 2: 714-16, 1996).
【0133】
培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記
の特許文献に記載されている:Levinson他、米国特許第4,713,339号;Hagen他、
米国特許第4,784,950号;Palmiter他、米国特許第4,579,821号;およびRingold
、米国特許第4,656,134号。適当な培養された哺乳動物細胞は下記のものを包含
する:COS−1(ATCC No. CRL 1650)、COS−7(ATCC No. CRL 1651)、BH
K570(ATCC No. CRL 10314)、293(ATCC No. CRL 1573;Graham他、J.
Gen. Virol. 36:59−72、1977)およびチャイニーズハムスター卵巣(例えば
、CHO−K1;ATCC No. CRL 61)細胞系統。The production of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells is described, for example, in the following patent documents: Levinson et al., US Pat. No. 4,713,339; Hagen et al.
US Pat. No. 4,784,950; Palmiter et al., US Pat. No. 4,579,821; and Ringold.
U.S. Pat. No. 4,656,134. Suitable cultured mammalian cells include: COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BH.
K570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J.
Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) and Chinese hamster ovary (eg, CHO-K1; ATCC No. CRL 61) cell lines.
【0134】
追加の適当な細胞系統はこの分野において知られており、そして公衆の寄託機
関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type
Culture Collection)(マリイランド州ロックビレ)から入手可能である。
一般に、強い転写プロモーター、例えば、SV−40またはサイトメガロウイルスか
らのプロモーターは好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号参照。他の適当
なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からプロモーター(米国特許第4,57
9,821号および米国特許第4,601,978号)およびアデノウイルスの主要な後期プロ
モーターを包含する。Additional suitable cell lines are known in the art, and are public depository institutions, such as the American Type Culture Collection.
Culture Collection) (Rockville, Maryland).
In general, strong transcription promoters, such as those from SV-40 or cytomegalovirus, are preferred. See, for example, U.S. Pat. No. 4,956,288. Another suitable promoter is the promoter from the metallothionein gene (US Pat.
9,821 and US Pat. No. 4,601,978) and the adenovirus major late promoter.
【0135】
薬剤選択を一般に使用して、外来DNAが挿入された、培養された哺乳動物細胞
について選択する。このような細胞は普通に「トランスフェクタント」と呼ばれ
る。選択因子の存在において培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に移行させ
ることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい
選択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝
子である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G−418またはその他の存在にお
いて実施される。Drug selection is generally used to select for cultured mammalian cells that have had foreign DNA inserted. Such cells are commonly referred to as "transfectants." Cells that have been cultured in the presence of the selection factor and are able to transfer the gene of interest to their progeny are termed "stable transfectants". A preferred selectable marker is the gene encoding resistance to the antibiotic neomycin. Selection is carried out in the presence of a neomycin-type drug, such as G-418 or other.
【0136】
また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベルを増加することができる
、「増幅」と呼ぶ方法。低いレベルの選択因子の存在においてトランスフェクタ
ントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入された遺伝子の産物を高い
レベルで産生する細胞について選択することによって、増幅は実施される。好ま
しい増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与す
る、ジヒドロフォレートリダクターゼである。[0136] A method called "amplification" in which a selection system can also be used to increase the expression level of the gene of interest. Amplification is performed by culturing the transfectants in the presence of low levels of the selection factor and then increasing the amount of the selection factor to select for cells that produce high levels of the product of the introduced gene. . A preferred amplifiable selectable marker is dihydrofolate reductase, which confers resistance to methotrexate.
【0137】
他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、多薬剤耐性、プロマイシ
ンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。FACSソーティングま
たは磁気ビーズ分離技術のような手段により、変更された表現型を導入するオー
ルタネイティブマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表面のタン
パク質、例えば、CD4、CD8、クラスIのMHC、胎盤アルカリ性ホスファターゼを使
用して、非トランスフェクト細胞からトランスフェクトされた細胞を選別するこ
とができる。Other drug resistance genes (eg hygromycin resistance, multidrug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used. Alternate markers that introduce an altered phenotype by such means as FACS sorting or magnetic bead separation techniques, such as green fluorescent protein, or cell surface proteins such as CD4, CD8, class I MHC, placenta. Alkaline phosphatase can be used to sort transfected cells from untransfected cells.
【0138】
植物細胞、昆虫細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細
胞として使用することもできる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクタ
ーとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を使
用することは、Sinkar他、J. Biosci.(Bangalore)11:47−58、1987、におい
て概観されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産生
は、Guarino他、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO 94/06463号に記載さ
れている。オートグラファト・カリフォルニカ(Autographa californica)核
多角体病ウイルス(AcNPV)から普通に誘導される、組換えバキュロウイルスで
、昆虫細胞を感染させることができる。Other higher eukaryotic cells can also be used as host cells, including plant cells, insect cells and avian cells. The use of Agrobacterium rhizogenes as a vector for expressing genes in plant cells is reviewed in Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. There is. Transformation of insect cells and production of foreign polypeptides therein is described by Guarino et al., US Pat. No. 5,162,222 and WIPO Publication WO 94/06463. Insect cells can be infected with recombinant baculovirus, commonly derived from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV).
【0139】
2つの方法の1つにより、zamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするDNAをAcN
PVポリヘドリン遺伝子のコーディング配列の代わりに。バキュロウイルスのゲノ
ムの中に挿入する。第1は、野生型AcNPVとAcNPV配列によりフランクされたzamp3
またはzamp4を含有する転移ベクターとの間の相同的DNA組換えの伝統的方法であ
る。適当な昆虫細胞、例えば、SF9細胞を野生型AcNPVで感染させ、そしてAcNPV
ポリヘドリン遺伝子プロモーター、ターミネーター、およびフランキング配列に
作用可能に連鎖されたzamp3またはzamp4ポリペプチドからなる転移ベクターでト
ランスフェクトする。DNA encoding a zamp3 or zamp4 polypeptide was AcN-transfected by one of two methods.
Instead of the PV polyhedrin gene coding sequence. Insert into the baculovirus genome. First, zamp3 flanked by wild-type AcNPV and AcNPV sequences.
Or the traditional method of homologous DNA recombination between transfer vectors containing zamp4. Infecting appropriate insect cells, such as SF9 cells, with wild-type AcNPV, and AcNPV
Transfection with a transfer vector consisting of a polyhedrin gene promoter, a terminator, and a zamp3 or zamp4 polypeptide operably linked to flanking sequences.
【0140】
下記の文献を参照のこと:King、L. A. およびPossee、R. D. The Bacul
ovirus Expression System:A Laboratory Guide、London、Chapman & Ha
ll、O'Reilly、D. R.他、Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory
Manual、New York、Oxford University Press、1994;およびRichardson、
C. D. 編、Baculovirus Expression Protocols、 Methods in Molecular
Biology、Totowa、NJ、Humana Press、1995。昆虫細胞内の自然の組換えは、
ポリヘドリンプロモーターにより推進されたzamp3またはzamp4を含有する組換え
バキュロウイルスを生ずるであろう。組換えウイルスの系統は、この分野におい
て普通に使用されている方法により作られる。See References: King, LA and Possee, RD The Bacul.
ovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Ha
ll, O'Reilly, DR and others, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory
Manual, New York, Oxford University Press, 1994; and Richardson,
CD, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular
Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Natural recombination in insect cells
It will result in a recombinant baculovirus containing zamp3 or zamp4 driven by the polyhedrin promoter. Recombinant virus strains are produced by methods commonly used in the art.
【0141】
組換えバキュロウイルスを作る第2の方法は、Luckowが記載するトランスポゾ
ンをベースとする系を利用する(Luckow、V. A.、他、J. Virol. 67:4566−
79、1993)。この系はBac−to−Bacキット(Life Technologies、マリイランド
州ロックビレ)で販売されている。この系は転移ベクター、pFastBac1TM(Life
Technologies)を利用し、ここでpFastBac1TMは「バクミド(bacmid)」と呼
ばれる大きいプラスミドとして大腸菌(E. coli)の中に維持されたバキュロウ
イルスのゲノムの中にzamp3またはzamp4ポリペプチドをコードするDNAを動かす
ために、Tn7トランスポゾンを含有する。A second method of making recombinant baculovirus utilizes the transposon-based system described by Luckow (Luckow, VA, et al., J. Virol. 67: 4566-.
79, 1993). This system is sold in the Bac-to-Bac kit (Life Technologies, Rockville, MD). This system is a transfer vector, pFastBac1 ™ (Life
Technologies, where pFastBac1 ™ is a DNA encoding a zamp3 or zamp4 polypeptide in the baculovirus genome maintained in E. coli as a large plasmid called the "bacmid". Contains a Tn7 transposon to drive
【0142】
pFastBac1TM転移ベクターは、AcNPVポリヘドリンプロモーターを利用して、問
題の遺伝子、この場合においてzamp3またはzamp4、の発現を推進する。しかしな
がら、pFastBac1TMはかなりな程度に修飾可能である。ポリヘドリンプロモータ
ーを除去し、バキュロウイルスをベースとするタンパク質プロモーター(また、
Pcor、p6.9またはMPプロモーターとして知られている)で置換し、ここでこのプ
ロモーターは以前にバキュロウイルスの感染において発現され、そして分泌され
たタンパク質の発現に好都合であることが示されている。The pFastBac1 ™ transfer vector utilizes the AcNPV polyhedrin promoter to drive expression of the gene of interest, in this case zamp3 or zamp4. However, pFastBac1 ™ can be modified to a large extent. The polyhedrin promoter is removed, and a baculovirus-based protein promoter (also
(Known as the Pcor, p6.9 or MP promoter), where this promoter was previously expressed in baculovirus infection and has been shown to favor expression of secreted proteins. .
【0143】
下記の文献を参照のこと:Hill−Perkins、M. S. およびPossee、R. D.、J
. Gen. Virol. 71:971−6、1990;Bonning、B. C.、他、J. Gen. Virol.
75:1551−6、1994;および、Chazenbalk、G. D.、およびRapoport、B.、J.
Biol. Chem. 270:1543−9、1995。このような転移ベクター構築物において
、基本的タンパク質プロモーターの短いまたは長いバージョンを使用することが
できる。その上、自然zamp3またはzamp4分泌シグナル配列を昆虫タンパク質から
誘導された分泌シグナル配列で置換する、転移ベクターを構築することができる
。See references: Hill-Perkins, MS and Possee, RD, J.
Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning, BC, et al., J. Gen. Virol.
75: 1551-6, 1994; and Chazenbalk, GD and Rapoport, B., J.
Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Short or long versions of the basic protein promoter can be used in such transfer vector constructs. Moreover, transfer vectors can be constructed that replace the native zamp3 or zamp4 secretion signal sequence with a secretion signal sequence derived from an insect protein.
【0144】
例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、蜜蜂のメ
リチン(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)、またはバキュロウイ
ルスgp67(PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)からの分泌シグナル配
列を構築物において使用して、天然zamp3またはzamp4分泌シグナル配列を置換す
ることができる。さらに、転移ベクターは、発現されたzamp3またはzamp4ポリペ
プチドのC末端またはN末端におけるエピトープ標識、例えば、Glu−Gluエピトー
プ標識をコードするDNAとのインフレーム融合物を含むことができる(Grussenme
yer、T.、他、Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952−4、1985)。For example, a secretory signal sequence from ecdysteroid glucosyltransferase (EGT), bee melittin (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), Or baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, Calif.) Was used in the construct to The zamp3 or zamp4 secretion signal sequence can be replaced. In addition, the transfer vector can include an in-frame fusion with an epitope tag at the C-terminus or N-terminus of the expressed zamp3 or zamp4 polypeptide, eg, DNA encoding the Glu-Glu epitope tag (Grussenme).
Yer, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985).
【0145】
この分野において知られている技術を使用して、zamp3またはzamp4を含有する
転移ベクターを大腸菌(E. coli)の中に形質転換し、そして組換えバキュロウ
イルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニング
する。組換えバキュロウイルスのゲノムを含有するバクミドDNAを普通の技術に
従い単離し、そしてスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細
胞、例えば、Sf9細胞をトランスフェクトする。zamp3またはzamp4を発現する組
換えウイルスを引き続いて生成させる。この分野において普通に使用されている
方法により、組換えウイルスの系統を作る。The transfer vector containing zamp3 or zamp4 was transformed into E. coli using techniques known in the art, and the interrupted lacZ gene displaying recombinant baculovirus was expressed. To screen for bacmids containing Bacmid DNA containing the recombinant baculovirus genome is isolated according to conventional techniques and transfected into Spodoptera frugiperda cells, eg Sf9 cells. Recombinant virus expressing zamp3 or zamp4 is subsequently produced. Recombinant virus strains are generated by methods commonly used in the art.
【0146】
宿主細胞、典型的にはヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
frugiperda)から誘導された細胞系統を感染させるために、組換えウイルスを使
用する。一般に、下記の文献を参照のこと:GlickおよびPasternak、Molecular
Biotechnology:Principle and Applications of Recombinant DNA、ASM
Press、Washington、D. C.、1994。他の適当な細胞系統は、トリコデルマ・
ニ(Trichoderma ni)から誘導されたHigh FiveOTM細胞系統(Invitrogen)で
ある(米国特許第5,300,435号)。商業的に入手可能な無血清培地を使用して、
細胞を増殖させかつ維持する。A host cell, typically Spodoptera frugiperda (Spodoptera)
recombinant virus is used to infect cell lines derived from frugiperda). In general, see: Glick and Pasternak, Molecular.
Biotechnology: Principle and Applications of Recombinant DNA, ASM
Press, Washington, DC, 1994. Other suitable cell lines are Trichoderma
High FiveO ™ cell line (Invitrogen) derived from Trichoderma ni (US Pat. No. 5,300,435). Using commercially available serum-free medium,
Grow and maintain cells.
【0147】
適当な培地はSf9細胞についてSf900 IITM(Life Technologies)またはESF
921TM(Expression System);およびトリコデルマ・ニ(T.ni)細胞につい
てEx−cellO450TM(JRH Bioscience、カンサス州レネクサ)またはExpress Fi
veOTM(Life Technologies)である。細胞をほぼ2〜5×105細胞の接種密度から
1〜2×106細胞の密度に増殖させ、この時組換えウイルスの系統を0.1〜10、より
典型的には約3の感染の多重度(MOI)で添加する。組換えウイルスが感染した細
胞は典型的には感染後12〜72時間で組換えzamp3またはzamp4ポリペプチドを産生
し、そしてそれを変化する効率で培地の中に分泌する。培養物を通常感染後48時
間に収集する。Suitable media are Sf900 II ™ (Life Technologies) or ESF for Sf9 cells.
921 ™ (Expression System); and for Trichoderma ni (T.ni) cells Ex-cellO450 ™ (JRH Bioscience, Lenexa, Kans.) Or Express Fi
veO TM (Life Technologies). Cells from a seeding density of approximately 2-5 x 10 5 cells
Grows to a density of 1-2 × 10 6 cells, at which time recombinant virus strains are added at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1-10, more typically about 3. Cells infected with the recombinant virus typically produce recombinant zamp3 or zamp4 polypeptide 12-72 hours after infection and secrete it into the medium with varying efficiency. Cultures are usually harvested 48 hours post infection.
【0148】
遠心を使用して培地(上清)から細胞を分離する。zamp3またはzamp4ポリペプ
チドを含有する上清を、微小孔フィルター、通常0.45μmの孔大きさのフィルタ
ーを通して濾過する。使用する手順は一般に入手可能な実験室のマニュアルに記
載されている(King、L. A. およびPossee、R. D.、前掲;O'Reilly、D. R.
、他、前掲;Richardson、C. D.、前掲)。本明細書に記載する方法に従い、上
清からのzamp3またはzamp4ポリペプチドの引き続く精製を実施することができる
。Cells are separated from the medium (supernatant) using centrifugation. Supernatants containing zamp3 or zamp4 polypeptides are filtered through a micropore filter, usually a 0.45 μm pore size filter. The procedure used is described in publicly available laboratory manuals (King, LA and Possee, RD, supra; O'Reilly, DR.
, Et al., Supra; Richardson, CD, supra). Subsequent purification of zamp3 or zamp4 polypeptide from the supernatant can be performed according to the methods described herein.
【0149】
酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに
関して特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・メタ
ノリカ(Pichia metanolica)を包含する。外因的DNAでサッカロミセス・セレ
ビシエ(S. cerevisiae)を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産す
る方法は、例えば、下記の特許文献に記載されている:Kawasaki、米国特許第4,
599,311号;Kawasaki他、米国特許第4,931,373号;Brake、米国特許第4,870,008
号;Welch他、米国特許第5,037,743号;およびMurry他、米国特許第4,845,075号
。Fungal cells, including yeast cells, can also be used in the present invention. Yeast species of particular interest in this regard are Saccharomyces c
erevisiae), Pichia pastoris, and Pichia metanolica. Methods for transforming S. cerevisiae with exogenous DNA and producing recombinant polypeptides therefrom are described, for example, in the following patent documents: Kawasaki, US Pat.
599,311; Kawasaki et al., U.S. Pat. No. 4,931,373; Brake, U.S. Pat. No. 4,870,008.
Welch et al., US Pat. No. 5,037,743; and Murry et al., US Pat. No. 4,845,075.
【0150】
選択可能なマーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄
養(例えば、ロイシン)の非存在において増殖する能力により、形質転換された
細胞を選択する。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
において使用するために好ましいベクター系は、Kawasaki他(米国特許第4,931,
373号)により開示されているPOT1ベクター系であり、これによりグルコースを
含有する培地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。Transformed cells are selected by phenotype determined by a selectable marker, normal drug resistance or the ability to grow in the absence of a particular nutrient (eg, leucine). Saccharomyces cerevisiae
A preferred vector system for use in Kawasaki et al. (US Pat. No. 4,931,
No. 373), which allows the selection of transformed cells by growth in medium containing glucose.
【0151】
酵母において使用するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解
糖酵素遺伝子(例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号;Ingsman他、米国特
許第4,615,974号;およびBitter、米国特許第4,977,092号、参照)およびアルコ
ールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、米国特許第4,990,44
6号;米国特許第5,063,154号;米国特許第5,139,936号および米国特許第4,661,4
54号、参照。Suitable promoters and terminators for use in yeast include glycolytic enzyme genes (see Kawasaki, US Pat. No. 4,599,311; Ingsman et al., US Pat. No. 4,615,974; and Bitter, US Pat. No. 4,977,092, see. ) And alcohol dehydrogenase genes. Also, U.S. Pat.
6; U.S. Pat. No. 5,063,154; U.S. Pat. No. 5,139,936 and U.S. Pat. No. 4,661,4
See No. 54.
【0152】
ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカラロミセ
ス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス・ラクチス(
Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces
frgilis)、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)、ピキア・パストリ
ス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia metanolica)、ピキア
・グイレルモンディイ(Pichia guillermondii)およびカンジダ・マルトサ(C
andida maltosa)を包含する、他の酵母のための形質転換系はこの分野におい
て知られている。Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis (
Kluyveromyces lactis), Kluyveromyces fragilis (Kluyveromyces)
frgilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia metanolica, Pichia guillermondii and Candida maltosa.
Transformation systems for other yeasts, including andida maltosa) are known in the art.
【0153】
例えば、Gleeson他、J. Gen. Microbiol. 132:3459−3465、1986およびCr
egg、米国特許第4,882,279号、参照。McKnight他、米国特許第4,935,349号の方
法に従い、アスペルギルス(Aspergillus)細胞を利用することができる。アク
レモニウム・クリソゲヌム(Acremonium chrysogenum)は、Sumino他、米国特
許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換
する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。For example, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 and Cr.
See egg, US Pat. No. 4,882,279. Aspergillus cells can be utilized according to the method of McKnight et al., US Pat. No. 4,935,349. Acremonium chrysogenum is disclosed in Sumino et al., US Pat. No. 5,162,228. Methods for transforming Neurospora are disclosed in Lambowitz, US Pat. No. 4,486,533.
【0154】
組換えタンパク質の生産のための宿主としてピキア・メタノリカ(Pichia me
tanolica)を使用することは、WIPO公開WO 97/17450号、WO 97/17451号、WO
98/02536号、およびWO98/02565号に開示されている。ピキア・メタノリカ(
P. metanolica)の形質転換において使用するDNA分子は二本鎖、円形のプラス
ミドとして普通に製造され、これらは好ましくは形質転換の前に線状化される。
ピキア・メタノリカ(P. metanolica)におけるタンパク質の生産のために、プ
ラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ(P. me
tanolica)の遺伝子、例えば、ピキア・メタノリカ(P. metanolica)のアルコ
ール利用遺伝子(AUG1またはAUG2)のそれであることが好ましい。As a host for the production of recombinant proteins, Pichia menorica
tanolica) can be used for WIPO publication WO 97/17450, WO 97/17451, WO
It is disclosed in 98/02536 and WO98 / 02565. Pichia methanolica (
The DNA molecules used in the transformation of P. metanolica are commonly produced as double-stranded, circular plasmids, which are preferably linearized prior to transformation.
For the production of the protein in P. methanolica, the promoter and terminator in the plasmid are Pichia methanolica (P. menolica).
tanolica), for example, that of the alcohol utilization gene (AUG1 or AUG2) of P. metanolica.
【0155】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ホル
メートデヒドロゲナーゼ(FMD)、およびカタラーゼ(CAT)遺伝子のプロモータ
ーを包含する。宿主染色体の中へのDNAの組込みを促進するために、宿主DNA配列
により双方の末端においてフランクされたプラスミドの全体の発現セグメントを
有することが好ましい。ピキア・メタノリカ(Pichia metanolica)において使
用するために好ましい選択可能なマーカーはピキア・メタノリカ(P. metanoli
ca)のADE2遺伝子であり、これはホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカル
ボキシラーゼ(AIRC;EC4.1.1.21)をコードし、これはアデニンの非存在におい
てade2宿主細胞を増殖させる。Other useful promoters include the promoters of the dihydroxyacetone synthase (DHAS), formate dehydrogenase (FMD), and catalase (CAT) genes. It is preferable to have the entire expression segment of the plasmid flanked at both ends by the host DNA sequence to facilitate integration of the DNA into the host chromosome. A preferred selectable marker for use in Pichia metanolica is P. metanoli.
Ca) ADE2 gene, which encodes phosphoribosyl-5-aminoimidazole carboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21), which propagates ade2 host cells in the absence of adenine.
【0156】
メタノールの使用を最小としようとする、大規模の工業的方法のために、双方
のメタノール利用遺伝子(AUG1およびAUG2)が欠失されている、宿主細胞を使用
することが好ましい。分泌されたタンパク質の生産のために、液胞プロテアーゼ
遺伝子(PEP4およびPRB1)を欠如する宿主細胞は好ましい。問題のポリペプチド
をコードするDNAを含有するプラスミドをピキア・メタノリカ(P. metanolica
)細胞の中に導入することを促進するために、エレクトロポレーションを使用す
る。2.5〜4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/cmの電界強度を有する、指数的に減
衰する、パルス電界、および1〜40ミリセカント、最も好ましくは約20ミリセカ
ントの時間定数(τ)を使用する、エレクトロポレーションにより、ピキア・メ
タノリカ(P. metanolica)細胞を形質転換することが好ましい。For large-scale industrial methods that seek to minimize the use of methanol, it is preferred to use host cells in which both methanol utilization genes (AUG1 and AUG2) have been deleted. Host cells lacking the vacuolar protease genes (PEP4 and PRB1) are preferred for the production of secreted proteins. A plasmid containing the DNA encoding the polypeptide in question was ligated to P. methanolica.
3.) Use electroporation to facilitate introduction into cells. Use an exponentially decaying, pulsed electric field with a field strength of 2.5-4.5 kV / cm, preferably about 3.75 kV / cm, and a time constant (τ) of 1-40 msec, most preferably about 20 msec. Preferably, P. metanolica cells are transformed by electroporation.
【0157】
細菌大腸菌(Escherichia coli)、バシラス(Bacillus)および他の属の株
を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有用である。これらの宿主
を形質転換し、その中にクローニングされた外来DNA配列を発現する技術はこの
分野においてよく知られている(例えば、Sambrook他、前掲、参照)。大腸菌(
E. coli)のような細菌においてzamp3またはzamp4ポリペプチドを発現させると
き、ポリペプチドを、典型的には不溶性粒子として、細胞質の中に保持させるこ
とができるか、あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスミック空間の中に向け
ることができる。Prokaryotic host cells, including strains of the bacteria Escherichia coli, Bacillus and other genera, are also useful in the present invention. Techniques for transforming these hosts and expressing foreign DNA sequences cloned therein are well known in the art (see, eg, Sambrook et al., Supra). E. coli (
When expressing a zamp3 or zamp4 polypeptide in a bacterium such as E. coli), the polypeptide can be retained in the cytoplasm, typically as an insoluble particle, or periplasmic by a bacterial secretory sequence. Can be turned into the Mick space.
【0158】
前者の場合において、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば、グアニジンイソ
チオシアネートまたは尿素を使用して、変性する。次いで変性されたポリペプチ
ドをリフォルディングさせ、変性物の希釈により、例えば、尿素の溶液および還
元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンとの組合わせに対する透析
、および引き続く緩衝化生理食塩水に対する透析により、二量体化させることが
できる。後者の場合において、細胞を崩壊させて(例えば、超音波処理または浸
透圧ショックにより)ペリプラスミック空間の内容物を解放し、これにより変性
およびリフォルディングの必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリ
プラスミック空間から可溶性の、機能的形態で回収することができる。In the former case, the cells are lysed, the particles are harvested and denatured using, for example, guanidine isothiocyanate or urea. The denatured polypeptide is then refolded and by dilution of the denatured product, for example, by dialysis against a solution of urea and a combination of reduced and oxidized glutathione and subsequent dialysis against buffered saline. It can be dimerized. In the latter case, the polypeptide is disrupted (eg, by sonication or osmotic shock) to release the contents of the periplasmic space, thereby eliminating the need for denaturation and refolding. Can be recovered from the periplasmic space in a soluble, functional form.
【0159】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素
および選択した宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培地中で培養する。
規定された培地および複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野にお
いて知られており、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよ
び無機質を含む。培地は、また、成長因子または血清のような成分を含有するこ
とができる。一般に、外因的に添加されたDNAを含有する細胞について成長培地
を選択する。Transformed or transfected host cells are cultured according to conventional procedures in a medium containing nutrients and other components necessary for the growth of the selected host cells.
A variety of suitable media, including defined media and complex media, are known in the art and generally include carbon sources, nitrogen sources, essential amino acids, vitamins and minerals. The medium can also contain components such as growth factors or serum. Generally, growth medium is selected for cells containing exogenously added DNA.
【0160】
この選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の欠如により実施され、必須
栄養素は発現ベクター上に担持されるか、あるいは宿主細胞の中に共トランスフ
ェクトされた選択可能なマーカーにより補足される。炭素、窒素および微量栄養
素の適切な源を含む培地中で約25℃〜35℃の温度において、ピキア・メタノリカ
(P. metanolica)細胞を培養する。慣用の手段、例えば、小さいフラスコの震
盪または発酵槽のスパージにより、液体培地を十分にエアレーションする。ピキ
ア・メタノリカ(P. metanolica)のために好ましい培地は、YEPD(2%のD−グ
ルコース、2%のBactoTMペプトン(Difco Laboratories、ミシガン州デトロイ
ト)、1%のBactoTM酵母エキス(Difco Laboratories)、0.004%のアデニンお
よび0.006%のL−ロイシン)である。This selection is carried out, for example, by drug selection or lack of essential nutrients, which are either carried on the expression vector or supplemented by a selectable marker cotransfected into the host cell. R. The P. metanolica cells are cultured at a temperature of about 25 ° C to 35 ° C in a medium containing appropriate sources of carbon, nitrogen and micronutrients. The liquid medium is well aerated by conventional means, such as shaking a small flask or sparging the fermentor. A preferred medium for P. methanolica is YEPD (2% D-Glucose, 2% Bacto ™ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto ™ Yeast Extract (Difco Laboratories). , 0.004% adenine and 0.006% L-leucine).
【0161】
分画および/または慣用の精製方法および培地を使用して、発現された組換え
zamp3またはzamp4ポリペプチド(またはキメラzamp3またはzamp4ポリペプチド)
を精製することができる。試料の分画のために、硫酸アンモニウム沈降および酸
またはカオトロープ抽出を使用することができる。典型的な精製工程は、ヒドロ
キシアパタイト、サイズ排除クロマトグラフィー、FPLCおよび逆相高性能液体ク
ロマトグラフィーを包含することができる。適当なクロマトグラフィーの媒質は
、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製の
シリカ、およびその他を包含する。PEI、DEAE、QAEおよびQ誘導体は好ましい。Expressed recombinants using fractionation and / or conventional purification methods and media
zamp3 or zamp4 polypeptide (or chimeric zamp3 or zamp4 polypeptide)
Can be purified. Ammonium sulfate precipitation and acid or chaotrope extraction can be used for fractionation of the sample. Typical purification steps can include hydroxyapatite, size exclusion chromatography, FPLC and reverse phase high performance liquid chromatography. Suitable chromatographic media include derivatized dextran, agarose, cellulose, polyacrylamide, specialty silicas, and others. PEI, DEAE, QAE and Q derivatives are preferred.
【0162】
典型的なクロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基で
誘導化された媒質、例えば、フェニル−セファローズFF(Pharmacia)、トヨパ
ールブチル650(Toso Haas、ペンシルベニア州モントゴメリヴィレ)、オクチ
ル−セファローズ(Pharmacia)およびその他;またはポリアクリル樹脂、例え
ば、Amberchrom CG 71(Toso Haas)およびその他を包含する。適当な固体支
持体は、ガラスビーズ、シリカをベースとする樹脂、セルロース樹脂、アガロー
スビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミ
ド樹脂、およびその他を包含し、これらはこれらを使用する条件下に不溶性であ
る。Typical chromatographic media are media derivatized with phenyl, butyl, or octyl groups, such as Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose and others; or polyacrylic resins such as Amberchrom CG 71 (Toso Haas) and others. Suitable solid supports include glass beads, silica-based resins, cellulose resins, agarose beads, cross-linked agarose beads, polystyrene beads, cross-linked polyacrylamide resins, and the like, under the conditions in which they are used. It is insoluble.
【0163】
これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキ
シル基および/または炭水化物部分によるタンパク質の結合を可能とする反応性
基で修飾することができる。化学的カップリングの例は、臭化シアンの活性化、
N−ヒドロキシスクシンイミドの活性化、エポキシドの活性化、スルフヒドリル
の活性化、ヒドラジドの活性化、およびカーボジイミドの化学的カップリングの
ためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を包含する。These supports can be modified with amino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups, hydroxyl groups and / or reactive groups that allow the attachment of proteins by carbohydrate moieties. An example of chemical coupling is the activation of cyanogen bromide,
It includes carboxyl and amino derivatives for N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, sulfhydryl activation, hydrazide activation, and carbodiimide chemical coupling.
【0164】
これらおよび他の固体の媒質はこの分野においてよく知られており、かつ広く
使用されており、そして商業的供給会社から入手可能である。レセプターのポリ
ペプチドを固体の媒質に結合する方法は、この分野においてよく知られている。
特定の方法の選択は日常的設計事項であり、そして一部分選択した支持体の性質
により決定される。例えば、Affinity Chromatography:Principle & Method
s、Pharmacia LKB Biotechnology、スイス国ウップサラ、1988、参照。These and other solid media are well known and widely used in the art and are available from commercial suppliers. Methods for coupling receptor polypeptides to solid media are well known in the art.
The choice of a particular method is a matter of routine design and will be determined in part by the nature of the support chosen. For example, Affinity Chromatography: Principle & Method
See Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Switzerland, 1988.
【0165】
本発明は、本明細書に記載する発現ベクターが導入されている培養された細胞
を提供する;ここで培養された細胞はDNAセグメントによりコードされるzamp3ま
たはzamp4を発現する。本発明は、また、タンパク質を製造する方法を提供する
;この方法は、本明細書に記載する発現ベクターが導入されている細胞を培養し
、これにより培養された細胞はDNAセグメントによりコードされるzamp3またはza
mp4を発現し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含む。The present invention provides a cultured cell into which the expression vector described herein has been introduced; the cultured cell expresses zamp3 or zamp4 encoded by the DNA segment. The invention also provides a method of producing a protein; the method comprises culturing cells into which an expression vector as described herein has been introduced, whereby the cultured cells are encoded by a DNA segment. zamp3 or za
expressing mp4 and recovering the expressed polypeptide.
【0166】
本発明のポリペプチドは、特定の性質を利用することによって、単離すること
ができる。例えば、固定化金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーを使用し
て、ポリヒスチジン標識からなるものを包含する、ヒスチジンに富んだタンパク
質を精製することができる。簡単に述べると、ゲルにまず2価の金属イオンを負
荷してキレート化剤を形成する(Sulkowsiki、Trends in Biochem. 3:1−7
、1985)。使用する金属イオンに依存して、異なるアフィニティーを有する、こ
のマトリックスにヒスチジンに富んだタンパク質を吸着させ、競合溶離、pHの低
下、または強いキレート化剤を使用して、吸着されたタンパク質を溶離する。The polypeptides of the present invention can be isolated by taking advantage of certain properties. For example, immobilized metal ion adsorption (IMAC) chromatography can be used to purify histidine-rich proteins, including those consisting of polyhistidine labels. Briefly, gels are first loaded with divalent metal ions to form chelating agents (Sulkowsiki, Trends in Biochem. 3: 1-7).
, 1985). Depending on the metal ion used, adsorb a histidine-rich protein onto this matrix with different affinities and elute the adsorbed protein using competitive elution, reduced pH, or strong chelating agents. .
【0167】
他の精製法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換
クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を包含する(Methods
in Enzymol.、Vol. 182、″Guide to Protein Purification″、M. Deu
tscher(編者)、Academic Press、サンディエゴ、1990、pp. 529−39)。本
発明の追加の態様の範囲内において、問題のポリペプチドと親和標識(例えば、
マルトース結合性タンパク質、免疫グロブリンドメイン)との融合物を構築して
、精製を促進することができる。Other purification methods include purification of glycosylated proteins by lectin affinity chromatography and ion exchange chromatography (Methods
in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deu
tscher (editor), Academic Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). Within the scope of additional aspects of the invention, a polypeptide of interest and an affinity tag (eg,
Fusions with maltose binding proteins, immunoglobulin domains) can be constructed to facilitate purification.
【0168】
タンパク質のリフォルディング(および、必要に応じて、再酸化)手順を好都
合に使用することができる。タンパク質を>80%の純度、より好ましくは>90%
の純度、なおより好ましくは>95%の純度に精製することが好ましく、そして特
に好ましくはタンパク質は薬学的に純粋な形態である、すなわち、汚染する高分
子、特に他のタンパク質および核酸に関して99.9%より高い純度であり、そして
感染因子または発熱因子を含有しない。好ましくは、精製されたタンパク質は他
のタンパク質、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。Protein refolding (and optionally reoxidation) procedures may be conveniently used. Protein> 80% pure, more preferably> 90%
Is preferred, even more preferably> 95% pure, and particularly preferably the protein is in pharmaceutically pure form, ie 99.9% with respect to contaminating macromolecules, especially other proteins and nucleic acids. It is of higher purity and contains no infectious or pyrogenic factors. Preferably, the purified protein is substantially free of other proteins, especially other proteins of animal origin.
【0169】
また、zamp3またはzamp4ポリペプチドまたはそれらのフラグメントは化学的合
成法により製造することができる。zamp3またはzamp4ポリペプチドは、モノマー
またはマルチマー;グリコシル化または非グリコシル化;ペグリル化または非ペ
グリル化;アミド化または非アミド化;硫酸化または非硫酸化であることができ
;そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むか、あるいは含まないことができる
。Also, zamp3 or zamp4 polypeptides or fragments thereof can be produced by chemical synthetic methods. The zamp3 or zamp4 polypeptide can be a monomer or a multimer; glycosylated or non-glycosylated; PEGylated or non-PEGylated, amidated or non-amidated; sulfated or non-sulfated; and an initial methionine amino acid residue. May or may not be included.
【0170】
例えば、zamp3またはzamp4ポリペプチドは、独占的固相合成、部分的固相法、
フラグメント縮合または古典的溶液合成により合成することができる。ポリペプ
チドは好ましくは、例えば、Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85:2149、19
63、に記載されているように、固相ペプチド合成により製造される。アルファ−
アミノ末端が保護されたアミノ酸を使用して、この合成は実施される。不安定性
側鎖を有する3官能価アミノ酸を、また、適当な基で保護して、ポリペプチド組
立て間に望ましくない化学的反応が起こるのを防止する。アルファ−アミノ保護
基を選択的に除去して、引き続く反応がアミノ末端において起こるようにする。
アルファ−アミノ保護基を除去する条件は側鎖保護基を除去しない。For example, zamp3 or zamp4 polypeptides may be synthesized by proprietary solid phase synthesis, partial solid phase methods,
It can be synthesized by fragment condensation or classical solution synthesis. The polypeptide is preferably, for example, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 19
63, by solid phase peptide synthesis. Alpha-
This synthesis is performed using amino-terminal protected amino acids. Trifunctional amino acids with labile side chains are also protected with suitable groups to prevent undesired chemical reactions during polypeptide assembly. The alpha-amino protecting group is selectively removed so that subsequent reactions occur at the amino terminus.
Conditions that remove the alpha-amino protecting group do not remove the side chain protecting group.
【0171】
アルファ−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成分野において有効である
ことが知られている基である。アシル型保護基(例えば、ホルミル、トリフルオ
ロアセチル、アセチル)、アリール型保護基(例えば、ビオチニル)、芳香族ウ
レタン型保護基[例えば、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)、置換ベンジルオ
キシカルボニルおよび9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル(Fmoc)]、
脂肪族ウレタン保護基[例えば、t−ブトキシカルボニル(tBco)、イソプロピ
ルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル]およびアルキル型保護
基(例えば、ベンジル、トリフェニルメチル)が包含される。好ましい保護基は
tBocおよびFmocである。Alpha-amino protecting groups are groups known to be effective in the field of stepwise polypeptide synthesis. Acyl-type protecting groups (eg, formyl, trifluoroacetyl, acetyl), aryl-type protecting groups (eg, biotinyl), aromatic urethane-type protecting groups [eg, benzyloxycarbonyl (Cbz), substituted benzyloxycarbonyl and 9-fur Orenylmethyloxy-carbonyl (Fmoc)],
Included are aliphatic urethane protecting groups [eg t-butoxycarbonyl (tBco), isopropyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl] and alkyl type protecting groups (eg benzyl, triphenylmethyl). Preferred protecting groups are
tBoc and Fmoc.
【0172】
選択される側鎖の保護基はカップリング間に無傷に止まらなくてはならず、そ
してアミノ末端保護基の脱保護間に、またはカップリング条件間に除去されては
ならない。また、側鎖保護基は、合成完結後に、仕上げられたポリペプチドを変
更しない反応条件を使用して除去されなくてはならない。tBoc化学において、3
官能価アミノ酸の側鎖保護基は大部分ベンジルに基づく。Fmoc化学において、側
鎖保護基は大部分ブチルまたはトリチルに基づく。The side chain protecting groups selected must remain intact during coupling and must not be removed during deprotection of the amino terminal protecting group or during coupling conditions. Also, side chain protecting groups must be removed after the synthesis is complete using reaction conditions that do not alter the finished polypeptide. 3 in tBoc chemistry
The side chain protecting groups of functional amino acids are largely benzyl based. In Fmoc chemistry, side chain protecting groups are mostly based on butyl or trityl.
【0173】
tBoc化学において、好ましい側鎖保護基はアルギニンについてトシル、アスパ
ラギン酸についてシクロヘキシル、システインについて4−メチルベンジル(お
よびアセトアミドメチル)、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンについてベ
ンジル、ヒスチジンについてベンジルオキシメチル(およびジニトロフェニル)
、リシンについて2−Cl−ベンジルオキシカルボニル、トリプトファンについて
ホルミルそしてチロシンについてホルミル2−ブロモベンジルである。Fmoc化学
において、好ましい側鎖の保護基はアルギニンについて2,2,5,7,8−ペンタメチ
ルクロマン−6−スルホニル(Pmc)または2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベ
ンゾフラン−5−スルホニル(Pbf)、アスパラギン、システイン、グルタミンお
よびヒスチジンについてトリチル、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ト
レオニンおよびチロシンについてt−ブチル、リシンおよびトリプトファンにつ
いてtBocである。In tBoc chemistry, preferred side chain protecting groups are tosyl for arginine, cyclohexyl for aspartic acid, 4-methylbenzyl (and acetamidomethyl) for cysteine, benzyl for glutamic acid, serine and threonine, and benzyloxymethyl for histidine (and dinitro). Phenyl)
, 2-Cl-benzyloxycarbonyl for lysine, formyl for tryptophan and formyl 2-bromobenzyl for tyrosine. In Fmoc chemistry, the preferred side chain protecting groups are 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) or 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5 for arginine. Trityl for sulfonyl (Pbf), asparagine, cysteine, glutamine and histidine, t-butyl for aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine and tyrosine, tBoc for lysine and tryptophan.
【0174】
ホスホペプチドの合成のために、ホスフェート基の直接的または組立て後の組
込みを使用する。直接的組込み法において、セリン、スレオニンまたはチロシン
上のホスフェート基は、Fmoc化学においてメチル、ベンジル、またはt−ブチル
により保護するか、あるいはtBoc化学においてメチル、ベンジルまたはフェニル
により保護することができる。ホスフェート保護なしのホスホチロシンの直接的
組込みをFmoc化学において使用することができる。組立て後の組込み法において
、セリン、トレオニンまたはチロシンの非保護のヒドロキシル基を固相上でジ−
t−ブチル−、ジベンジル−またはジメチル−N,N'−ジイソプロピル−ホスホア
ミダイトで誘導化し、次いでt−ブチルヒドロ−ペルオキシドで酸化する。For the synthesis of phosphopeptides, direct or post-assembly incorporation of phosphate groups is used. In the direct incorporation method, the phosphate group on serine, threonine or tyrosine can be protected with methyl, benzyl, or t-butyl in Fmoc chemistry or with methyl, benzyl or phenyl in tBoc chemistry. Direct incorporation of phosphotyrosine without phosphate protection can be used in Fmoc chemistry. In the post-assembly integration method, the unprotected hydroxyl group of serine, threonine or tyrosine is di-
Derivatization with t-butyl-, dibenzyl- or dimethyl-N, N'-diisopropyl-phosphoamidite followed by oxidation with t-butyl hydro-peroxide.
【0175】
固相合成は、通常、アルファ−アミノ保護(側鎖保護)アミノ酸を適当な固体
の支持体にカップリングさせることによってカルボキシル末端から実施される。
クロロメチル、クロロトリチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させるとき、
エステル結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはC末端に遊離のカルボキシ
ル基を有するであろう。選択的に、アミド樹脂、例えば、ベンズヒドリルアミン
またはp−メチルベンズヒドリルアミン樹脂(tBoc化学について)およびリンク
(Rink)アミドまたはPAL樹脂(Fmoc化学について)を使用するとき、アミド結
合が形成し、そして生ずるポリペプチドはC末端にカルボキシアミド基を有する
であろう。Solid phase synthesis is usually performed from the carboxyl terminus by coupling an alpha-amino protected (side chain protected) amino acid to a suitable solid support.
When attached to chloromethyl, chlorotrityl or hydroxymethyl resins,
The ester bond will form and the resulting polypeptide will have a free carboxyl group at the C-terminus. Alternatively, when using an amide resin, such as benzhydrylamine or p-methylbenzhydrylamine resin (for tBoc chemistry) and Rink amide or PAL resin (for Fmoc chemistry), an amide bond is formed, The resulting polypeptide will then have a carboxamide group at the C-terminus.
【0176】
これらの樹脂は、ハンドルまたはリンカーを含むか、あるいは含まない、結合
した第1アミノ酸を含むか、あるいは含まない、ポリスチレン−またはポリアミ
ド−をベースとするか、あるいはポリエチレングリコール−グラフト化されてい
るかどうかにかかわらず、商業的に入手可能であり、そしてそれらの製造は下記
の文献に記載されている:Stewart、他、″Solid Phase Peptide Synthesis
″(第2版)、(Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード、1984)お
よびBayerおよびRapp、Chem. Pept. Prot. 3:3、1986;およびAtherton、他
、Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach、IRL Press
、Oxford、1989。These resins are polystyrene- or polyamide-based, with or without a handle or linker, with or without a bound first amino acid, or polyethylene glycol-grafted. And commercially available, and their manufacture is described in: Stewart, et al., “Solid Phase Peptide Synthesis.
(2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) and Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986; and Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , IRL Press
, Oxford, 1989.
【0177】
必要に応じて側鎖において、およびアルファ−アミノ基において保護された、
C末端のアミノ酸を、種々の活性化剤、例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミ
ド(DCC)、N,N'−ジイソプロピルカーボジイミド(DIPCDI)およびカルボニル
ジイミダゾール(CDI)を使用して、ヒドロキシメチル樹脂に結合させる。それ
はクロロメチルまたはクロロトリチル樹脂に直接的にそのセシウムテトラメチル
アンモニウム塩の形態で、あるいはトリエチルアミン(TEA)またはジイソプロ
ピルエチルアミン(DIEA)の存在において結合させることができる。アミド樹脂
への第1アミノ酸の結合は、カップリング反応の間のアミド結合の形成と同一で
ある。Optionally protected at the side chain and at the alpha-amino group,
The C-terminal amino acid is attached to the hydroxymethyl resin using various activators such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) and carbonyldiimidazole (CDI). . It can be attached directly to the chloromethyl or chlorotrityl resin in the form of its cesium tetramethylammonium salt or in the presence of triethylamine (TEA) or diisopropylethylamine (DIEA). The attachment of the first amino acid to the amide resin is identical to the formation of the amide bond during the coupling reaction.
【0178】
樹脂の支持体への結合後、保護化学(例えば、tBoc、Fmoc)に依存して種々の
の試薬を使用して、アルファ−アミノ保護基を除去する。Fmoc除去の程度は、30
0〜320nmにおいて、あるいは導電性セルによりモニターすることができる。アル
ファ−アミノ保護基を除去した後、残りの保護されたアミノ酸を要求される順序
で段階的にカップリングして、所望の配列を得る。After attachment of the resin to the support, various reagents are used to remove the alpha-amino protecting group, depending on the protection chemistry (eg tBoc, Fmoc). The degree of Fmoc removal is 30
It can be monitored at 0-320 nm or by a conductive cell. After removal of the alpha-amino protecting group, the remaining protected amino acids are stepwise coupled in the required order to give the desired sequence.
【0179】
種々の活性化剤、例えば、下記のものをカップリング反応に使用することがで
きる:DCC、DIPCDI、2−クロロ−1,3−ジメチルイミジウムヘキサフルオロホス
フェート(CIP)、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−(ジメチル
アミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)およびそのピロリ
ジン類似体(PyBOP)、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフル
オロホスフェート(PyBrOP)、O−(ベンゾトリアゾル−1−イル)−1,1,3,3−
テトラメチル−ウロニムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびそのテトラ
フルオロボレート類似体(TBTU)またはそのピロリジン類似体(HBPyU)、O−(
7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニムヘ
キサフルオロホスフェート(HATU)およびそのテトラフルオロボレート類似体(
TATU)またはそのピロリジン類似体(HAPyU)。Various activators can be used in the coupling reaction, for example: DCC, DIPCDI, 2-chloro-1,3-dimethylimidium hexafluorophosphate (CIP), benzotriazole- 1-yl-oxy-tris- (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and its pyrrolidine analogues (PyBOP), bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBrOP), O- (benzotriazole- 1-yl) -1,1,3,3-
Tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and its tetrafluoroborate analogue (TBTU) or its pyrrolidine analogue (HBPyU), O- (
7-azabenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HATU) and its tetrafluoroborate analogue (
TATU) or its pyrrolidine analogue (HAPyU).
【0180】
カップリング反応において使用する最も普通の触媒添加剤は、4−ジメチルア
ミノピリジン(DMAP)、3−ヒドロキシ−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−1,2,3−ベ
ンゾトリアジン(HODhbt)、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(BOBt)および1
−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(HOAt)を包含する。各保護された
アミノ酸は過剰量(>2.0当量)で使用し、そしてカップリングは通常N−メチル
ピロリドン(NMP)中で、あるいはDMF、CH2Cl2またはそれらの混合物中で実施す
る。各段階において、例えば、Kaiser、他、Anal. Biochem. 34:595、1970、
に記載されているように、ニンヒドリン反応により、カップリング反応の完結の
程度をモニターすることができる。The most common catalyst additives used in coupling reactions are 4-dimethylaminopyridine (DMAP), 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HODhbtt). ), N-hydroxybenzotriazole (BOBt) and 1
-Hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt). Each protected amino acid is used in excess (> 2.0 equivalents) and the coupling is usually carried out in N-methylpyrrolidone (NMP) or in DMF, CH2Cl2 or mixtures thereof. At each stage, for example, Kaiser et al., Anal. Biochem. 34: 595, 1970,
The degree of completion of the coupling reaction can be monitored by the ninhydrin reaction, as described in.
【0181】
所望のペプチドが完全に組立てられた後、適切な掃去剤とともに試薬を使用し
てペプチド−樹脂を切り放す。掃去剤(例えば、H2O、エタンジチオール、フェ
ノールおよびチオアニソール)とともにTFAにより、Fmocペプチドは通常切り放
され、脱保護される。tBocペプチドは通常液状HFで1〜2時間−5〜0℃において切
り放され、脱保護され、これによりポリペプチドは樹脂から切り放され、側鎖保
護基の大部分は除去される。掃去剤、例えば、アニソール、ジメチルサルファイ
ドおよびp−チオクレゾールを通常液状HFとともに使用して、切り放し間にポリ
ペプチド中に存在するアミノ酸残基のアルキル化およびアシル化からカチオンが
形成するのを防止する。After the desired peptide has been fully assembled, the peptide-resin is cleaved off using a reagent with an appropriate scavenger. The Fmoc peptide is usually cleaved and deprotected by TFA with a scavenger (eg H 2 O, ethanedithiol, phenol and thioanisole). The tBoc peptide is usually cleaved with liquid HF for 1-2 hours at -5 to 0 ° C and deprotected, thereby cleaving the polypeptide from the resin and removing most of the side chain protecting groups. Scavengers such as anisole, dimethyl sulfide and p-thiocresol are usually used with liquid HF to prevent cation formation from alkylation and acylation of amino acid residues present in the polypeptide during cleavage. To do.
【0182】
トリプトファンのホルミル基およびヒスチジンのジニトロフェニル基を、HFの
切り放し前にDMF中で、それぞれ、ピペリジンおよびチオフェニルにより、除去
することが必要である。システインのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀(II)
により除去するか、あるいはヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム(III)または
テトラフルオロホウ酸銀(これは同時にシステインをシスチンに酸化する)によ
り除去することができる。tBocペプチドの切り放しおよび脱保護のために使用さ
れる他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)およびトリメチルシ
リルトリフルオロアセテート(TMSOTf)を包含する。It is necessary to remove the formyl group of tryptophan and the dinitrophenyl group of histidine in DMF prior to HF cleavage by piperidine and thiophenyl, respectively. The acetamidomethyl group of cysteine is mercury (II) acetate
Or by iodine, thallium (III) trifluoroacetate or silver tetrafluoroborate, which simultaneously oxidizes cysteine to cystine. Other strong acids used for cleaving and deprotecting the tBoc peptide include trifluoromethanesulfonic acid (TFMSA) and trimethylsilyltrifluoroacetate (TMSOTf).
【0183】
また、zamp3またzamp4結合性ポリペプチドをリガンドの精製に使用することが
できる。ポリペプチドを固体支持体、例えば、アガロース、架橋したアガロース
、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、架橋ポ
リアクリルアミド、または使用条件下に安定である同様な物質のビーズ上に固定
化する。固体支持体にポリペプチドを結合する方法はこの分野において知られて
おり、そしてアミン化学、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活
性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、およびヒドラジド活性化を包
含する。生ずる媒質は一般にカラムの形態に形造り、そしてリガンドを含有する
流体をカラムに1またはそれ以上の回数通過させて、リガンドをリガンド結合性
ポリペプチドに結合させる。次いで塩濃度、カオトロープ因子(グアニジンHCl
)、またはリガンド−レセプターの結合を崩壊するpHの変化により、リガンドを
溶離する。Zamp3 or zamp4 binding polypeptides can also be used to purify the ligand. Immobilizing a polypeptide on a solid support, such as agarose, cross-linked agarose, glass, cellulosic resin, silica-based resin, polystyrene, cross-linked polyacrylamide, or a bead of similar material that is stable under the conditions of use. To do. Methods of attaching polypeptides to solid supports are known in the art and include amine chemistry, cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, sulfhydryl activation, and hydrazide activation. To do. The resulting medium is generally shaped into a column and the fluid containing the ligand is passed through the column one or more times to bind the ligand to the ligand binding polypeptide. Then salt concentration, chaotropic factor (guanidine HCl
), Or a change in pH that disrupts the ligand-receptor binding elutes the ligand.
【0184】
リガンド結合性レセプター(または抗体、相補体/抗相補体の対の一方のメン
バー)またはそれらの結合性フラグメント、および商業的に入手可能なバイオセ
ンサー計器(BIAcoreTM、Pharmacia Biosensor、ニュージャージイ州ピスカタ
ウェイ)を用いるアッセイシステムを好都合に使用することができる。このよう
なレセプター、抗体、相補体/抗相補体の対のメンバーまたはフラグメントをレ
セプターチップの表面上に固定化する。この計器の使用は下記の文献に開示され
ている:Karlsson、J. Immunol. Methods 145:229−40、1991およびCunning
hamおよびWells、J. Mol. Biol. 234:554−63、1993。Ligand binding receptors (or antibodies, members of one of the complement / anti-complement pairs) or binding fragments thereof, and commercially available biosensor instruments (BIAcore ™ , Pharmacia Biosensor, NJ). An assay system using Piscataway, Ill. May be conveniently used. Such receptors, antibodies, complement / anti-complement pair members or fragments are immobilized on the surface of the receptor chip. The use of this instrument is disclosed in the following references: Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 and Cunning.
Ham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993.
【0185】
アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して、レセプター、抗体、メンバーま
たはフラグメントをフローセル内の金薄膜に結合したデキストラン繊維に共有結
合させる。被験試料をセルに通過させる。リガンド、エピトープ、または相補体
/抗相補体の対の反対メンバーが試料の中に存在する場合、それはそれぞれ固定
化されたレセプター、抗体またはメンバーに結合し、媒質の屈折率を変化させ、
これは金薄膜表面のプラスモン共鳴の変化として検出される。このシステムは、
結合アフィニティーをそれから計算することができるオンおよびオフの速度、お
よび結合の化学量論の評価を可能とする。Amine or sulfhydryl chemistry is used to covalently attach the receptor, antibody, member or fragment to a dextran fiber bound to a thin gold film in the flow cell. Pass the test sample through the cell. If an opposite member of the ligand, epitope, or complement / anti-complement pair is present in the sample, it binds respectively to the immobilized receptor, antibody or member, altering the refractive index of the medium,
This is detected as a change in plasmon resonance on the surface of the gold thin film. This system
It allows evaluation of on and off rates, and binding stoichiometry, from which binding affinity can be calculated.
【0186】
用語「相補体/抗相補体の対」は、本明細書において使用するとき、適当な条
件下に非共有結合的にアソシエートした安定な対を形成する、非同一部分を表す
。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補体/
抗相補体の対のプロトタイプのメンバーである。他の典型的な相補体/抗相補体
の対は、レセプター/リガンドの対、抗体/抗原(またはハプテンまたはエピト
ープ)の対、センス/アンチセンスポリヌクレオチドの対、およびその他を包含
する。相補体/抗相補体の対の引き続く解離を望む場合、相補体/抗相補体の対
は好ましくは<109/Mの結合アフィニティーを有する。The term “complement / anti-complement pair” as used herein refers to non-identical moieties that form a non-covalently associated stable pair under appropriate conditions. For example, biotin and avidin (or streptavidin) are complementary /
Members of the anti-complement pair prototype. Other exemplary complement / anti-complement pairs include receptor / ligand pairs, antibody / antigen (or hapten or epitope) pairs, sense / antisense polynucleotide pairs, and the like. If subsequent dissociation of the complement / anti-complement pair is desired, the complement / anti-complement pair preferably has a binding affinity of <10 9 / M.
【0187】
また、この分野において知られている他のアッセイシステムにおいて、リガン
ド結合性レセプターポリペプチドを使用することができる。このようなシステム
は結合アフィニティーを測定するスキャッチャード分析(Scatchard、Ann. NY
Acad. Sci. 51:660−72、1949参照)および比色アッセイ(Cunningham他、
Science 253:545−48、1991およびCunningham他、Science 245:821−25、19
91)。Ligand binding receptor polypeptides can also be used in other assay systems known in the art. Such systems use Scatchard analysis (Scatchard, Ann. NY) to measure binding affinity.
Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) and colorimetric assay (Cunningham et al.,
Science 253: 545-48, 1991 and Cunningham et al., Science 245: 821-25, 19
91).
【0188】
本発明は、また、抗zamp3または抗zamp4抗体を提供する。例えば、zamp3また
はzamp4発現ベクターの産物、または天然源から単離されたzamp3またはzamp4を
抗原として使用して、zamp3またはzamp4に対する抗体を得ることができる。zamp
3に「特異的に結合する」抗zamp3およびzamp4に「特異的に結合する」抗zamp4抗
体は特に有効である。抗体が106/Mまたはそれより大きい、好ましくは107/Mま
たはそれより大きい、より好ましくは108/Mまたはそれより大きい、最も好まし
くは109/Mまたはそれより大きい結合アフィニティー(Ka)でzamp3またはzamp4
のポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合する場合、抗体は特異的に結
合すると考える。抗体の結合アフィニティーは、例えば、スキャッチャード分析
(Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51:660、1949)により、容易に決定す
ることができる。適当な抗体は、特定のドメインにおいてzamp3に結合する抗体
および特定のドメインにおいてzamp4に結合する抗体を包含する。The present invention also provides anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies. For example, the product of a zamp3 or zamp4 expression vector, or zamp3 or zamp4 isolated from natural sources can be used as an antigen to obtain antibodies to zamp3 or zamp4. zamp
Anti-zamp3 antibodies that "bind specifically" to 3 and anti-zamp4 antibodies that "bind specifically" to zamp4 are particularly effective. The binding affinity (Ka) of the antibody is 10 6 / M or higher, preferably 10 7 / M or higher, more preferably 10 8 / M or higher, most preferably 10 9 / M or higher. At zamp3 or zamp4
An antibody is considered to specifically bind when it binds to a polypeptide, peptide or epitope of. The binding affinity of an antibody can be easily determined by, for example, Scatchard analysis (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949). Suitable antibodies include antibodies that bind zamp3 in a particular domain and antibodies that bind zamp4 in a particular domain.
【0189】
抗原zamp3エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドおよびzamp4エピトープ
担持ペプチドおよびポリペプチドを使用して、抗zamp3または抗zamp4抗体を製造
することができる。本発明の抗原エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは
、配列番号2または4内に含有される少なくとも9、好ましくは15〜約30アミノ酸
の配列を含有する。しかしながら、本発明のアミノ酸配列のより大きい部分を含
んでなり、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全体
までの任意の長さのアミノ酸を含有し、かつ本発明のポリペプチドのアミノ酸配
列の全体を包含する、ペプチドまたはポリペプチドは、また、zamp3またはzamp4
に結合する抗体を誘導するために有効である。Antigens zamp3 epitope-bearing peptides and polypeptides and zamp4 epitope-bearing peptides and polypeptides can be used to produce anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies. The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention contain a sequence of at least 9, preferably 15 to about 30 amino acids contained within SEQ ID NO: 2 or 4. However, the polypeptide of the invention comprises a larger portion of the amino acid sequence of the invention, contains amino acids of any length up to 30-50 amino acids, or the entire amino acid sequence of the polypeptide of the invention, and A peptide or polypeptide that includes the entire amino acid sequence of zamp3 or zamp4
Is effective to induce antibodies that bind to.
【0190】
水性溶媒中の実質的な溶解度を提供するようにエピトープ担持ペプチドのアミ
ノ酸配列を選択することが望ましい(すなわち、配列は比較的親水性の残基を含
むが、疎水性残基を回避することが好ましい)。親水性ペプチドは疎水性プロッ
トから予測することができる、例えば、下記の文献を参照のこと:HoppおよびWo
ods、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:3824−8、1981およびKyteおよびDoo
little、J. Mol. Biol. 157:105−142、1982。その上、プロリン残基を含有
するアミノ酸配列は、また、抗体産生に望ましいことがある。It is desirable to select the amino acid sequence of the epitope-bearing peptide so as to provide substantial solubility in an aqueous solvent (ie, the sequence contains relatively hydrophilic residues but avoids hydrophobic residues). Preferably). Hydrophilic peptides can be predicted from the hydrophobicity plots, see for example: Hopp and Wo.
ods, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-8, 1981 and Kyte and Doo.
little, J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982. Moreover, amino acid sequences containing proline residues may also be desirable for antibody production.
【0191】
組換えzamp3またはzamp4タンパク質または天然源から単離されたzamp3またはz
amp4に対するポリクローナル抗体は、この分野においてよく知られている方法を
使用して製造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと:Green他、
“Production of Polyclonal Antisera”、Immunochemical Protocols(Man
son、編者)、pp. 1−5(Humana Press 1992)、およびWilliams他、“Expre
ssion of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and
purification of specific polyclonal antibodies”、DNA Cloning 2
:Expression Systems、第2版、Glover他(編者)、p. 15(Oxford Universi
ty Press 1995)。Recombinant zamp3 or zamp4 protein or zamp3 or z isolated from natural sources
Polyclonal antibodies against amp4 can be produced using methods well known in the art. For example, see the following references: Green et al.,
“Production of Polyclonal Antisera”, Immunochemical Protocols (Man
Son, editor), pp. 1-5 (Humana Press 1992), and Williams et al., “Expre
ssion of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and
purification of specific polyclonal antibodies ”, DNA Cloning 2
: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (Editor), p. 15 (Oxford Universi
ty Press 1995).
【0192】
アジュバント、例えば、明礬(水酸化アルミニウム)またはフロインド完全ア
ジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用して、zamp3またはzamp4
ポリペプチドの免疫原性を増加させることができる。免疫化に有効なポリペプチ
ドは、また、融合ポリペプチド、例えば、zamp3またはzamp4またはそれらの一部
分と免疫グロブリンまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。
ポリペプチド免疫原は全長の分子またはその一部分であることができる。ポリペ
プチドの一部分が「ハプテン様」である場合、このような一部分は免疫化のため
に好都合には高分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)
、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイド)に結合または連鎖する
ことができる。Adjuvants such as alum (aluminum hydroxide) or Freund's complete or incomplete Freund's adjuvant are used to zamp3 or zamp4.
The immunogenicity of the polypeptide can be increased. Immunizing effective polypeptides also include fusion polypeptides, such as fusions of zamp3 or zamp4 or a portion thereof with an immunoglobulin or maltose binding protein.
The polypeptide immunogen can be a full length molecule or a portion thereof. When a portion of the polypeptide is "hapten-like", such portion is conveniently a polymeric carrier for immunization (eg, keyhole limpet hemocyanin (KLH)).
, Bovine serum albumin (BSA) or tetanus toxoid).
【0193】
ポリクローナル抗体は典型的には動物、例えば、ウマ、雌牛、イヌ、ニワトリ
、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、ヤギまたはヒツジにおい
て発生させるが、本発明の抗zamp3または抗zamp4抗体は類人猿の抗体に由来する
ことができる。ヒヒにおいて診断的、療法的に有効な抗体を発生させる一般的技
術は、例えば、下記の文献に記載されている:Goldenberg、国際特許公開No.WO
91/11465、およびLosman他、Int. J. Cancer 46:310、1990。また、抗体
はトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックヒツジ、雌牛、ヤギま
たはブタにおいて発生させることができ、そして酵母および真菌中で修飾された
形態でならびに哺乳動物細胞および昆虫細胞中で発現させることができる。Polyclonal antibodies are typically raised in animals such as horses, cows, dogs, chickens, rats, mice, rabbits, hamsters, guinea pigs, goats or sheep, although the anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies of the invention are It can be derived from an ape antibody. General techniques for generating diagnostically and therapeutically effective antibodies in baboons are described, for example, in the following references: Goldenberg, International Patent Publication No. WO.
91/11465, and Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Antibodies can also be raised in transgenic animals, such as transgenic sheep, cows, goats or pigs, and expressed in modified form in yeast and fungi and in mammalian and insect cells. it can.
【0194】
選択的に、モノクローナル抗zamp3または抗zamp4抗体を発生させることができ
る。特異的抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、この分野において知られ
ている方法により得ることができる(例えば、下記の文献を参照のこと:Kohler
他、Nature 256:495、1975;Coligan他(編者)、Current Protocols in I
munology、Vol. 1、pp. 2.5.1−2.6.7(John Wiley & Sons 1991);Pick
sley他、“Production of monoclonal antibodies against proteins exp
ressed in E. coli”、DNA Cloning:Expression Systems、第2版、Glover
他(編者)、p. 63(Oxford University Press 1995))。Alternatively, monoclonal anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies can be generated. Rodent monoclonal antibodies to specific antigens can be obtained by methods known in the art (see, for example, the following references: Kohler
Et al., Nature 256: 495, 1975; Coligan et al. (Editor), Current Protocols in I.
munology, Vol. 1, pp. 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Pick
sley et al., “Production of monoclonal antibodies against proteins exp.
ressed in E. coli ”, DNA Cloning: Expression Systems, Second Edition, Glover
Other (editor), p. 63 (Oxford University Press 1995)).
【0195】
簡単に述べると、モノクローナル抗体は次のようにして得ることができる。za
mp3またはzamp4遺伝子産物を含んでなる組成物をマウスに注射し、血清試料を取
出すことによって抗体産生を確認し、脾臓を取出してBリンパ球を獲得し、Bリン
パ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクロー
ニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗
体を産生するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離す
る。Briefly, monoclonal antibodies can be obtained as follows. za
The composition comprising the mp3 or zamp4 gene product was injected into mice and antibody production was confirmed by removing serum samples, removing the spleen to obtain B lymphocytes, and fusing the B lymphocytes with myeloma cells. To produce hybridomas, clone the hybridomas, select positive clones producing antibodies to the antigen, cultivate clones producing antibodies to the antigen, and isolate the antibodies from the hybridoma culture.
【0196】
さらに、本発明の抗zamp3または抗zamp4抗体はヒトモノクローナル抗体に由来
することができる。抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように
操作されたトランスジェニックマウスから、ヒトモノクローナル抗体は得られる
。この技術において、内因的重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲッテッド崩壊を含
有する胚幹細胞系統に由来したマウスの中に、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の因
子を導入する。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体
を合成することができ、そしてこのマウスを使用してヒト抗体分泌ハイブリドー
マを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法
は、例えば、下記の文献に記載されている:Green他、Nature Genet. 7:13、
1994;Lonberg他、Nature 368:856、1994;およびTaylor他、Int. Immun. 6
:579、1994。Furthermore, the anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies of the invention can be derived from human monoclonal antibodies. Human monoclonal antibodies are obtained from transgenic mice that have been engineered to produce specific human antibodies in response to antigen challenge. In this technique, human heavy and light chain locus factors are introduced into mice derived from an embryonic stem cell line containing targeted disruption of endogenous heavy and light chain loci. Transgenic mice can synthesize human antibodies specific for human antigens, and the mice can be used to produce human antibody-secreting hybridomas. Methods for obtaining human antibodies from transgenic mice are described, for example, in the following references: Green et al., Nature Genet. 7:13,
1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; and Taylor et al., Int. Immun. 6
: 579, 1994.
【0197】
種々のよく確立された技術により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養
物から単離し、精製することができる。このような単離技術は、プロテインAセ
ファローズを使用するアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマト
グラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを包含する(例えば、下記の
文献を参照のこと:Coligen、pp. 2.7.1−2.7.12およびpp. 2.9.1−2.9.3;Ba
ines他、“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”、Methods in Mol
ecular Biology、Vol. 10、pp. 79−104(The Humana Press,Inc. 1992
))。Monoclonal antibodies can be isolated and purified from hybridoma cultures by a variety of well-established techniques. Such isolation techniques include affinity chromatography using Protein A Sepharose, size exclusion chromatography, and ion exchange chromatography (see, for example, the following references: Coligen, pp. 2.7.1). -2.7.12 and pp. 2.9.1-2.9.3; Ba
ines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, Methods in Mol
ecular Biology, Vol. 10, pp. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992
)).
【0198】
特定の用途のために、抗zamp3または抗zamp4抗体のフラグメントを製造するこ
とが望ましい。このような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解
的加水分解により、得ることができる。抗体フラグメントは、慣用法に従い全抗
体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例示として、抗体を
ペプシンで酵素的に消化してF(ab)'2と表示する5Sフラグメントを形成するこ
とによって、抗体フラグメントを製造することができる。チオール還元剤を使用
して、このフラグメントをさらに切断して、3.5S Fab'1価フラグメントを産生
することができる。For particular applications, it may be desirable to produce fragments of anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies. Such antibody fragments can be obtained, for example, by proteolytic hydrolysis of the antibody. Antibody fragments can be obtained by pepsin or papain digestion of whole antibodies according to conventional methods. By way of illustration, an antibody fragment can be produced by enzymatically digesting the antibody with pepsin to form the 5S fragment designated F (ab) '2. This fragment can be further cleaved using a thiol reducing agent to produce a 3.5S Fab 'monovalent fragment.
【0199】
必要に応じて、ジサルファイド結合の切断から生ずるスルフヒドリル基のブロ
ッキング基を使用して、切断反応を実施することができる。別法として、ペプシ
ンを使用する酵素的切断は2つの1価FabフラグメントおよびFcフラグメントを直
接的に産生する。これらの方法は、例えば、下記の文献に記載されている:Gold
enberg、米国特許第4,331,647号;Nisonoff他、Arch. Biochem. Biophys. 89
:230、1960;Porter、Biochem. J. 73:119、1959;Edelman他、Methods in
Enzymology、Vol. 1、p. 422(Academic Press 1967);およびColigan、
前掲。If desired, the cleavage reaction can be carried out using a blocking group of sulfhydryl groups resulting from the cleavage of the disulfide bond. Alternatively, enzymatic cleavage using pepsin directly produces two monovalent Fab and Fc fragments. These methods are described, for example, in the following references: Gold
Nenberg, US Pat. No. 4,331,647; Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89.
: 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., Methods in
Enzymology, Vol. 1, p. 422 (Academic Press 1967); and Coligan,
Ibid.
【0200】
フラグメントが無傷抗体により認識される抗原に結合するかぎり、抗体を切断
する他の方法、例えば、重鎖を分離して1価の軽−重鎖フラグメントを形成する
方法、フラグメントをさらに切断する方法、または他の酵素的、化学的または遺
伝学的技術を使用することもできる。
例えば、FvフラグメントはVHおよびVL鎖のアソシエーションを含んでなる。下
記の文献に記載されているように、このアソシエーションは非共有結合であるこ
とができる:Inbar他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659、1972。選択
的に、可変鎖は細胞間ジサルファイド結合により結合するか、あるいは化学物質
、例えば、グルタルアルデヒドにより架橋することができる(例えば、下記の文
献を参照のこと:Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12:437、1992)。Other methods of cleaving the antibody so long as the fragment binds to the antigen recognized by the intact antibody, eg, separating the heavy chains to form a monovalent light-heavy chain fragment, further cleaving the fragment Methods, or other enzymatic, chemical or genetic techniques can also be used. For example, the Fv fragment comprises an association of VH and VL chains. This association can be non-covalent, as described in the following references: Inbar et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972. Alternatively, the variable chains can be linked by intercellular disulfide bonds or cross-linked by chemicals such as glutaraldehyde (see, for example, Sandhu, Crit. Rev. Biotch. 12: 437, 1992).
【0201】
Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより接続されたVHおよびVL鎖を含んで
なることができる。オリゴヌクレオチドにより接続されたVHおよびVLドメインを
コードするDNA配列を含んでなる構造的遺伝子を構築することによって、これら
の一本鎖抗原結合性タンパク質(scFv)は製造される。構造遺伝子を発現ベクタ
ーの中に挿入し、次いで発現ベクターを宿主細胞、例えば、大腸菌(E. coli)
の中に導入する。これらの組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカ
ーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを産生する方法は、
例えば、下記の文献に記載されている:Whitlow他、Methods:A Companion to
Methods in Enzymology 2:97、1991;また、Bird他、Science 242:423
、1988;Ladner他、米国特許第4,946,778号;Pack他、Bio/Technology 11:12
71、1993;およびSandhu、前掲。Fv fragments can comprise VH and VL chains connected by a peptide linker. These single chain antigen binding proteins (scFv) are produced by constructing structural genes that comprise DNA sequences encoding VH and VL domains connected by oligonucleotides. Insert the structural gene into an expression vector and then insert the expression vector into a host cell such as E. coli.
To introduce in. These recombinant host cells synthesize a single polypeptide chain with a linker peptide bridging the two V domains. The method of producing scFv is
See, for example, Whitlow et al., Methods: A Companion to.
Methods in Enzymology 2:97, 1991; also Bird et al., Science 242: 423.
1988; Ladner et al., U.S. Pat. No. 4,946,778; Pack et al., Bio / Technology 11:12.
71, 1993; and Sandhu, supra.
【0202】
例示として、リンパ球をin vitroにおいてzamp3またはzamp4ポリペプチドに
暴露し、ファージまたは同様なベクター中の抗体展示ライブラリーを選択するこ
とによって、scFvを得ることができる(例えば、固定化または標識化zamp3また
はzamp4タンパク質またはペプチドを使用する)。潜在的zamp3またはzamp4ポリ
ペプチド結合性ドメインを有するペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上で
(ファージ展示)または細菌、例えば、大腸菌(E. coli)上に展示されたラン
ダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる
。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダ
ム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成により得ることができる。By way of illustration, scFv can be obtained by exposing lymphocytes in vitro to zamp3 or zamp4 polypeptides and selecting antibody display libraries in phage or similar vectors (eg, immobilization or Use labeled zamp3 or zamp4 proteins or peptides). Genes encoding peptides with potential zamp3 or zamp4 polypeptide binding domains can be screened for random peptide libraries displayed on phage (phage display) or on bacteria such as E. coli. Can be obtained by Nucleotide sequences that encode a polypeptide can be obtained in a number of ways, including random mutagenesis and random polynucleotide synthesis.
【0203】
これらのランダムペプチド展示ライブラリーを使用して、既知のターゲットと
相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。このターゲッ
トはタンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物
学的または合成的高分子、または有機または無機の物質であることができる。こ
のようなランダムペプチド展示ライブラリーをつくりかつスクリーニングする技
術はこの分野において知られている(Ladner他、米国特許第5,223,409号、Ladne
r他、米国特許第4,946,778号、Ladner他、米国特許第5,403,484号、Ladner他、
米国特許第5,571,698号、およびKay他、Phage Display of Peptides and P
roteins(Academic Press,Inc. 1996)。These random peptide display libraries can be used to screen for peptides that interact with known targets. The target can be a protein or polypeptide, such as a ligand or receptor, a biological or synthetic macromolecule, or an organic or inorganic substance. Techniques for creating and screening such random peptide display libraries are known in the art (Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409, Ladne.
r et al., U.S. Pat.No. 4,946,778, Ladner et al., U.S. Pat.No. 5,403,484, Ladner et al.,
U.S. Pat.No. 5,571,698, and Kay et al., Phage Display of Peptides and P.
roteins (Academic Press, Inc. 1996).
【0204】
そしてランダムペプチド展示ライブラリーおよびこのようなライブラリーをス
クリーニングするキットは、例えば、Clontech(カリフォルニア州パロアルト)
、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)、New England Biolab
s,Inc.(マサチュセッツ州ベバーリイ)、およびPharmacia LKB Biotechnolo
gy Inc.(ニュージャージイ州ピスカタウェイ)から商業的に入手可能である。
本明細書に開示するzamp3またはzamp4配列を使用して、ランダムペプチド展示ラ
イブラリーをスクリーニングして、zamp3またはzamp4に結合するタンパク質を同
定することができる。And random peptide display libraries and kits for screening such libraries are described, for example, in Clontech (Palo Alto, Calif.).
, Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolab
s, Inc. (Beverly, Mass.), and Pharmacia LKB Biotechnolo.
Commercially available from gy Inc. (Piscataway, NJ).
The zamp3 or zamp4 sequences disclosed herein can be used to screen random peptide display libraries to identify proteins that bind to zamp3 or zamp4.
【0205】
抗体フラグメントの他の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードする
ペプチドである。問題の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって
、CDRペプチド(「最小認識単位」)を得ることができる。このような遺伝子は
、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するPCRにより製造される(例
えば、下記の文献を参照のこと:Larrick他、Methods:A Companion to Meth
ods in Enzymology 2:106、1991);Courtenay−Luck、“Genetic Manipul
ation of Monoclonal Antibodies”、Monoclonal Antibodies:Production
,Engineering and Clinical Application、Ritter他、(編者)、p. 166(
Cambridge University Press 1995);およびWard他、“Genetic Manipulat
ion and Expression of Antibodies”、Monoclonal Antibodies:Principl
es and Applications、Birch他、(編者)、p. 137(Wiley−Liss,Inc. 19
95))。Another form of antibody fragment is a peptide that encodes a single complementarity determining region (CDR). CDR peptides ("minimal recognition units") can be obtained by constructing the gene encoding the CDR of the antibody in question. Such a gene is produced, for example, by PCR for synthesizing a variable region from RNA of antibody-producing cells (see, for example, the following document: Larrick et al., Methods: A Companion to Meth.
ods in Enzymology 2: 106, 1991); Courtenay-Luck, “Genetic Manipul.
ation of Monoclonal Antibodies ”, Monoclonal Antibodies: Production
, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (Editor), p. 166 (
Cambridge University Press 1995); and Ward et al., “Genetic Manipulat
ion and Expression of Antibodies ”, Monoclonal Antibodies: Principl
es and Applications, Birch et al. (Editor), p. 137 (Wiley-Liss, Inc. 19
95)).
【0206】
選択的に、抗zamp3または抗zamp4抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体から誘
導することができる。マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重および
軽可変鎖からヒト可変ドメインの中に転移させることによって、ヒト化モノクロ
ーナル抗体を産生する。次いで、ヒト抗体の典型的な残基をネズミ対応物のフレ
ームワーク領域において置換する。ヒトモノクローナル抗体に由来する抗体成分
の使用は、ネズミ定常領域の免疫原性に関連する潜在的問題を排除する。ネズミ
免疫グロブリン可変領域をクローニングする一般的技術は、例えば、下記の文献
に記載されている:Orlandi他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:3833、19
89。Alternatively, anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies can be derived from "humanized" monoclonal antibodies. Humanized monoclonal antibodies are produced by transferring the mouse complementarity determining regions from the heavy and light variable chains of mouse immunoglobulin into the human variable domain. Typical residues from human antibodies are then replaced in the framework regions of the murine counterpart. The use of antibody components derived from human monoclonal antibodies eliminates the potential problems associated with the immunogenicity of murine constant regions. General techniques for cloning murine immunoglobulin variable regions are described, for example, in the following references: Orlandoi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 3833, 19
89.
【0207】
ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は、例えば、下記の文献に記載され
ている:Jones他、Nature 321:522、1986;Carter他、Proc. Nat. Acad. S
ci. USA 89:4285、1992;Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12:437、1992;S
inger他、J. Immun. 150:2844、1993;Sudhir(編者)、Antibody Engineeri
ng Protocols(Humana Press,Inc. 1995);Kelley、“Engineering Thera
peutic Antibodies”、Protein Engineering:Principles and Practice、C
leland他(編者)、pp. 399−434(John Wiley & Sons,Inc. 1996);お
よびQueen他、米国特許第5,693,762号(1997)。Techniques for producing humanized monoclonal antibodies are described, for example, in the following references: Jones et al., Nature 321, 522, 1986; Carter et al., Proc. Nat. Acad. S.
ci. USA 89: 4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotch. 12: 437, 1992; S.
inger et al., J. Immun. 150: 2844, 1993; Sudhir (editor), Antibody Engineeri
ng Protocols (Humana Press, Inc. 1995); Kelley, “Engineering Thera
peutic Antibodies ”, Protein Engineering: Principles and Practice, C
Leland et al. (editor), pp. 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996); and Queen et al., US Pat. No. 5,693,762 (1997).
【0208】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、動物を抗zamp3または抗zamp4抗体ま
たは抗体フラグメントで標準的技術に従い免疫化することによって製造すること
ができる。例えば、下記の文献を参照のこと:Green他、“Production of Pol
yclonal Antisera”、Methods In Molecular Biology:Immunochemical Pr
otocols、Manson(編者)、pp. 1−12(Humana Press 1992)。また、Coliga
n、前掲、pp. 2.4.1−2.4.7参照。[0208] Polyclonal anti-idiotype antibodies can be prepared by immunizing animals with anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies or antibody fragments according to standard techniques. See, for example: Green et al., “Production of Pol.
yclonal Antisera ”, Methods In Molecular Biology: Immunochemical Pr
otocols, Manson (editor), pp. 1-12 (Humana Press 1992). Also, Coliga
n, supra, see pp. 2.4.1-2.4.7.
【0209】
選択的に、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、前述の技術に従い、免疫
原として抗zamp3または抗zamp4抗体または抗体フラグメントを使用して製造する
ことができる。別法として、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人猿抗イディ
オタイプ抗体を前述の技術に従い製造することができる。抗イディオタイプ抗体
を製造する方法は、例えば、下記の文献に記載されている:Irie、米国特許第5,
208,146号、Greene他、米国特許第5,637,677号、およびVarthakaviおよびMinoch
a、J. Gen. Virol. 77:1875、1996。Alternatively, monoclonal anti-idiotypic antibodies can be produced according to the techniques described above using anti-zamp3 or anti-zamp4 antibodies or antibody fragments as immunogens. Alternatively, humanized anti-idiotype antibodies or apes anti-idiotype antibodies can be produced according to the techniques described above. Methods for producing anti-idiotypic antibodies are described, for example, in the following references: Irie, US Pat.
208,146, Greene et al., US Pat. No. 5,637,677, and Varthakavi and Minoch.
a, J. Gen. Virol. 77: 1875, 1996.
【0210】
ファージ(ファージディスプレイ)上にまたは細菌、例えば、大腸菌(E. co
li)上に展示されたランダムまたは方向づけられたライブラリーをスクリーニン
グすることによって、潜在的zamp3またはzamp4ポリペプチド結合性ドメインを有
するポリペプチド、「結合性タンパク質」をコードする遺伝子を得ることができ
る。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ラン
ダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成において得ることができ
る。選択的に、拘束ファージ展示ライブラリーを製造することもできる。これら
のペプチド展示ライブラリーを使用して、既知のターゲットと相互作用するペプ
チドについてスクリーニングすることができる。On a phage (phage display) or on a bacterium such as E. coli (E.
li) By screening the random or oriented libraries displayed above, one can obtain genes encoding polypeptides, "binding proteins" with potential zamp3 or zamp4 polypeptide binding domains. Nucleotide sequences that encode a polypeptide can be obtained in a number of ways, including random mutagenesis and random polynucleotide synthesis. Alternatively, a restricted phage display library can be produced. These peptide display libraries can be used to screen for peptides that interact with known targets.
【0211】
ここでターゲットはタンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたは
レセプター、生物学的または合成的高分子、または有機または無機の物質である
ことができる。このようなペプチド展示をつくりかつスクリーニングする技術は
この分野において知られており(Ladner他、米国特許第5,223,409号;Ladner他
、米国特許第4,946,778号;Ladner他、米国特許第5,403,484号およびLadner他、
米国特許第5,571,698号)そしてペプチド展示ライブラリーおよびこのようなラ
イブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、クロンテク(Clontech、カ
リフォルニア州パロアルト)、インビトロゲン(Invitrogen、カリフォルニア州
サンディエゴ)、ニュー・イングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド
(New England Biolabs,Inc.、マサチュセッツ州ベバーリイ)およびファー
マシアLKBバイオテクノロジー・インコーポレーテッド(Pharmacia LKB Biote
chnology,Inc.、ニュージャージイ州ピスカタウェイ)から商業的に入手可能で
ある。本明細書に開示するzamp3またはzamp4配列を使用してペプチド展示ライブ
ラリーをスクリーニングして、zamp3またはzamp4に結合するタンパク質を同定す
ることができる。zamp3またはzamp4ポリペプチドと相互作用する、これらの「結
合性タンパク質」を本質的に抗体と同様に使用することができる。The target here can be a protein or polypeptide, for example a ligand or receptor, a biological or synthetic macromolecule, or an organic or inorganic substance. Techniques for making and screening such peptide displays are known in the art (Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409; Ladner et al., US Pat. No. 4,946,778; Ladner et al., US Pat. No. 5,403,484 and Ladner et al.
US Pat. No. 5,571,698) and peptide display libraries and kits for screening such libraries are described, for example, in Clontech, Palo Alto, Calif., Invitrogen, San Diego, Calif., New England Biolabs. Incorporated (New England Biolabs, Inc., Beberley, Mass.) And Pharmacia LKB Biotechnology Incorporated.
chnology, Inc., Piscataway, NJ). The zamp3 or zamp4 sequences disclosed herein can be used to screen peptide display libraries to identify proteins that bind to zamp3 or zamp4. These "binding proteins" that interact with the zamp3 or zamp4 polypeptides can be used essentially like antibodies.
【0212】
本発明の他の面において、精製されたzamp3またはzamp4ポリペプチドと、薬学
上許容されるビヒクルとを含んでなる医薬組成物が提供される。このような医薬
組成物は病理学的微生物、例えば、細菌、真菌およびウイルスの感染に関連する
症状の治療において使用される。zamp3またはzamp4ポリペプチドの抗微生物用途
は、病原体が標準的治療に対して耐性となる状況を包含する。例えば、スタヒロ
コッカス(Staphylococcus)株が普通に使用される抗体に対して耐性となるので
、病院セプシスは増加する問題である。In another aspect of the invention there is provided a pharmaceutical composition comprising a purified zamp3 or zamp4 polypeptide and a pharmaceutically acceptable vehicle. Such pharmaceutical compositions are used in the treatment of conditions associated with the infection of pathological microorganisms such as bacteria, fungi and viruses. Antimicrobial applications of zamp3 or zamp4 polypeptides include situations where pathogens become resistant to standard treatments. For example, hospital sepsis is an increasing problem as Staphylococcus strains become resistant to commonly used antibodies.
【0213】
一般に、zamp3またはzamp4ポリペプチド、フラグメント、融合物、抗体、アゴ
ニストおよびアンタゴニストの抗微生物活性をこの分野において知られている技
術により評価することができる。さらに詳しくは、被験因子に対する微生物細胞
培養物の感受性を評価し、感染したマウスに対する被験因子の保護作用を評価す
ることによって、抗微生物活性をアッセイすることができる。例えば、Musiek他
、Antimicrob. Agents Chemother. 3:40、1973参照。また、哺乳動物細胞培
養物の保護により、抗ウイルス活性を評価することができる。In general, the antimicrobial activity of zamp3 or zamp4 polypeptides, fragments, fusions, antibodies, agonists and antagonists can be assessed by techniques known in the art. More specifically, antimicrobial activity can be assayed by assessing the sensitivity of the microbial cell culture to the test factor and assessing the protective effect of the test factor on infected mice. See, eg, Musiek et al., Antimicrob. Agents Chemother. 3:40, 1973. In addition, protection of mammalian cell cultures can be evaluated for antiviral activity.
【0214】
抗微生物活性を評価する既知技術は、例えば、下記を包含する:Barsum他、Eu
r. Respir. J. 8(5):709−14、1995;Sandovsky−Losica他、J. Med. V
et. Mycol.(England)28(4):279−87、1990;Mehentee他、J. Gen. Micr
obiol.(England)135(Pt.8):2181−8、1989;SegalおよびSavage、Journal
of Medical and Veterinary Mycology 24:477−479、1986およびその他
。抗ウイルス活性に対して特異的な既知アッセイは、例えば、Daher他、J. Vir
ol. 60(3):1068−74、1986に記載されているアッセイを包含する。Known techniques for assessing antimicrobial activity include, for example: Barsum et al., Eu.
r. Respir. J. 8 (5): 709-14, 1995; Sandovsky-Losica et al., J. Med. V.
et. Mycol. (England) 28 (4): 279-87, 1990; Mehentee et al., J. Gen. Micr.
obiol. (England) 135 (Pt.8): 2181-8, 1989; Segal and Savage, Journal.
of Medical and Veterinary Mycology 24: 477-479, 1986 and others. Known assays specific for antiviral activity are described, for example, by Daher et al., J. Vir.
ol. 60 (3): 1068-74, 1986.
【0215】
さらに、契約研究所は抗微生物性を評価するサービスを提供する。例えば、パ
ンラブス・インコーポレーテッド(Panlabs,Inc. of Bothell、Washington)
は、下記の微生物についてのin vitroまたはin vivo試験を提供する:細菌、
グラム陰性細菌(エンテロバクター・クロセ(Enterobactor cloacae)、大腸
菌(Escherichia coli)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumon
iae)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エル
ジノーサ[緑膿菌](Pseudomonas aeruginosa)、ネズミチフス菌(Salmonell
a typhimurium)およびセラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens))
、グラム陽性細菌(枯草菌(Bacillus subtilis)、ブレベバクテリウム・アン
モニアゲネス(Brevebacterium ammoniagenes)、Further, contract laboratories provide services for assessing antimicrobial properties. For example, Panlabs, Inc. of Bothell, Washington
Provides in vitro or in vivo tests for the following microorganisms: bacteria,
Gram-negative bacteria (Enterobactor cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumon)
iae), Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonell's Salmonell
a typhimurium) and Serratia marcescens)
, Gram-positive bacteria (Bacillus subtilis), Brevebacterium ammoniagenes,
【0216】
コリネバクテリウム・ミヌチッシムム(Corynebacterium minutissimum)、
ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、マイコバクテリウム・ラ
ネ(Mycobacterium ranae)、スタヒロコッカス(Staphylococcus)株およびス
トレプトコッカス(Streptococcus)株)および嫌気性生物(アクチノマイセス
・ビスコーサス(Actinomyces viscosus)、バクテロイデス・フラジリス(Bac
teroides fragilis)、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostidium sporog
enes)、コリネバクテリウム・アクネス(Corynebacterium acnes)、Corynebacterium minutissimum,
Micrococcus luteus, Mycobacterium ranae, Staphylococcus strains and Streptococcus strains and anaerobes (Actinomyces viscosus), Bacteroides Fragilis (Bac
teroides fragilis), Clostidium sporog
enes), Corynebacterium acnes,
【0217】
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびポルフィロモナス・
ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis))ならびに原生動物(トリコモナ
ズ・フェツス(Trichomonas foetus))および真菌(例えば、カンジダ・アル
ビカンス(Candida albicans)、エピデルモフィトン・フロッコスム(Epiderm
ophyton floccosum)、エキソフィアラ・ジェアンセルメイ(Exophiala jeans
elmei)、ミクロスポルム(Microsporum)株、トリコフィトン(Trchophyton)
株およびその他)。また、モレキュラー・プローブ(Molecular Probes of O
regon)は細菌学において使用するための商業的に入手可能な蛍光技術を有する
。Helicobacter pylori and Porphyromonas
Porphyromonas gingivalis) and protozoa (Trichomonas foetus) and fungi (eg, Candida albicans), Epidermophyton flocsum (Epiderm)
ophyton floccosum), Exophiala Jean Selmay (Exophiala jeans
elmei), Microsporum strain, Trchophyton
Shares and others). Also, Molecular Probes of O
regon) has commercially available fluorescent technology for use in bacteriology.
【0218】
所望ならば、これに関するzamp3またはzamp4ポリペプチド、フラグメント、融
合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体の性能を、これに関して
機能的であることが知られているタンパク質、例えば、プロリンに富んだタンパ
ク質、リゾチーム、ヒスタチン、ラクトペルオキシダーゼまたはその他と比較す
ることができる。さらに、zamp3またはzamp4ポリペプチド、フラグメント、融合
タンパク質、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストを1またはそれ以上の抗微
生物因子と組み合わせて評価して、相乗効果を同定することができる。If desired, the performance of zamp3 or zamp4 polypeptides, fragments, fusion proteins, agonists, antagonists or antibodies in this regard is known to be functional in this regard, eg proline-rich proteins. , Lysozyme, histatin, lactoperoxidase or others. In addition, zamp3 or zamp4 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists and antagonists can be evaluated in combination with one or more antimicrobial agents to identify synergistic effects.
【0219】
システインモチーフを含んでなるデフェンシンポリペプチドは、抗生ペプチド
、単球および樹状走化性ペプチドとして商業的に入手可能である。商業的供給会
社は下記の会社を包含する:リサーチ・ダイアグノスチックス・インコーポレー
テッド(Research Diagnostics,Inc.、ニュージャージイ州フランダース)、
ペニンスラ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド(Peninsula Laboratorie
s,Inc.、カリフォルニア州ベルモント)、アメリカ・ペプチド・カンパニー(A
merica Peptide,Co.、カリフォルニア州スンベイル)。配列番号2のアミノ酸
残基31〜60を含んでなるzamp3ポリペプチド、および配列番号6のアミノ酸残基12
〜41を含んでなるzamp4ポリペプチドはこの目的のために有効であろう。Defensin polypeptides comprising a cysteine motif are commercially available as antibiotic peptides, monocytes and dendritic chemotactic peptides. Commercial suppliers include: Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ,
Peninsula Laboratorie (Peninsula Laboratorie
s, Inc., Belmont, CA), American Peptide Company (A
America Peptide, Co., Sumvale, CA). A zamp3 polypeptide comprising amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, and amino acid residue 12 of SEQ ID NO: 6
A zamp4 polypeptide comprising-41 would be effective for this purpose.
【0220】
デフェンシンはヒトの眼の組織および分泌に関連し、眼の微生物に関係する疾
患において有効である(Cullor他、Arch. Ophthalmol. 108:861−4、1990;M
uphy他、米国特許第5,242,902号;Hattenbach他、Antimicrob. Agents Chemot
her. 42:323、1998;Haynes他、Lancet 354:451−2、1998およびHaynes他、
Br. J. Ophthalmol. 83:737−41、199)。デフェンシンポリペプチドを添加
すると、角膜保存媒質の微生物汚染は減少した。このような因子はこのような移
植に関連する感染性術後合併症を減少するために有効である(Schwab他、Cornea
11:370−5、1992)。Defensins are associated with human ocular tissues and secretions and are effective in diseases involving ocular microbes (Cullor et al., Arch. Ophthalmol. 108: 861-4, 1990; M).
uphy et al., US Pat. No. 5,242,902; Hattenbach et al., Antimicrob. Agents Chemot
her. 42: 323, 1998; Haynes et al., Lancet 354: 451-2, 1998 and Haynes et al.,
Br. J. Ophthalmol. 83: 737-41, 199). Addition of the defensin polypeptide reduced microbial contamination of the corneal preservation medium. Such factors are effective in reducing infectious postoperative complications associated with such transplants (Schwab et al., Cornea
11: 370-5, 1992).
【0221】
こうして、zamp3またはzamp4ポリペプチド、それらのアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、眼に関連する感染および炎症の治療において療法的に有効である。
本発明のzamp3またはzamp4ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストにお
けるこの能力の存在を証明するために、このようなzamp3またはzamp4ポリペプチ
ド、アゴニストまたはアンタゴニストをこの分野において知られている手順に従
い、それらの抗微生物活性および化学走性活性に関して評価する。所望ならば、
これに関するzamp3またはzamp4ポリペプチドを、他のαおよびβデフェンシン、
ウサギ好中性デフェンシンおよびその他に対して比較することができる。さらに
、zamp3またはzamp4ポリペプチド、それらのアゴニストまたはアンタゴニストを
1またはそれ以上の抗微生物性分子と組合わせて評価して、相乗効果を同定する
ことができる。Thus, zamp3 or zamp4 polypeptides, their agonists or antagonists, are therapeutically effective in the treatment of eye-related infections and inflammation.
To demonstrate the existence of this ability in the zamp3 or zamp4 polypeptides, agonists or antagonists of the invention, such zamp3 or zamp4 polypeptides, agonists or antagonists, according to procedures known in the art, to their antimicrobials. Evaluate for activity and chemotaxis activity. If desired
The zamp3 or zamp4 polypeptide in this regard can be labeled with other α and β defensins,
It can be compared against rabbit neutrophil defensin and others. In addition, zamp3 or zamp4 polypeptides, their agonists or antagonists
It can be evaluated in combination with one or more antimicrobial molecules to identify synergistic effects.
【0222】
同様に、本発明のzamp3またはzamp4ポリペプチドは、また、耳に関連する感染
および炎症の治療において療法的に有効である。本発明は、微生物に関係する疾
患を治療する方法を提供する。この方法は治療的有効量のzamp3またはzamp4ポリ
ペプチドを哺乳動物に投与することを含み、これによりポリペプチドは疾患を改
善する。好ましくは、このようなポリペプチドは配列番号2のアミノ酸残基31〜6
0、アミノ酸残基23〜63、または配列番号6のアミノ酸残基12〜41を包含する。1
つのこのような用途は、眼に関連する微生物に関係する疾患、例えば、結膜炎の
用途である。Similarly, the zamp3 or zamp4 polypeptides of the invention are also therapeutically effective in treating ear-related infections and inflammation. The present invention provides methods of treating diseases associated with microorganisms. The method comprises administering to the mammal a therapeutically effective amount of a zamp3 or zamp4 polypeptide, whereby the polypeptide ameliorates the disease. Preferably, such a polypeptide comprises amino acid residues 31-6 of SEQ ID NO: 2.
0, amino acid residues 23-63, or amino acid residues 12-41 of SEQ ID NO: 6. 1
One such application is for diseases associated with eye related microorganisms, such as conjunctivitis.
【0223】
本発明は、また、治療的有効量の本発明のポリペプチドを哺乳動物に投与する
、避妊法を提供する。このような投与は、胚の着床および/または発育の防止に
おいて有効であろう。
また、デフェンシンは補体カスケードを活性化することが見出された(Prohas
zka他、Mol. Immunol. 34:809−16、1997およびProhaszkaおよびFust、Lance
t 352:1152、1998)。補体成分Clqは感染因子、例えば、細菌およびウイルス
に対する宿主の防御においてある役割を演ずる。Clqはいくつかの特殊化機能を
示すことが知られている。The present invention also provides a method of contraception, wherein a therapeutically effective amount of the polypeptide of the present invention is administered to a mammal. Such administration would be effective in preventing embryo implantation and / or development. Defensins were also found to activate the complement cascade (Prohas
zka et al., Mol. Immunol. 34: 809-16, 1997 and Prohaszka and Fust, Lance.
t 352: 1152, 1998). The complement component Clq plays a role in host defense against infectious agents such as bacteria and viruses. Clq is known to exhibit some specialized functions.
【0224】
例えば、Clqは結合した抗体またはC反応性タンパク質(CRP)との相互作用を
介して補体カスケードを誘発する。また、Clqはある種の細菌、RNAウイルス、マ
イコプラズマ、尿酸結晶、細菌エンドトキシンの脂肪A成分およびある種の細胞
内オルガネラの膜と直接的に相互作用する。Clqレセプターに結合するClqは食作
用を促進すると考えられる。また、Clqは宿主防御系の抗体形成面を増強するよ
うに思われる。例えば、Johnston、Pediatr. Infect. Dis. J. 12:933−41
、1993参照。こうして、補体活性化デフェンシンは増強された抗微生物因子とし
て作用して、感染因子の溶解または食作用を促進する。For example, Clq triggers the complement cascade through interaction with bound antibody or C-reactive protein (CRP). Clq also interacts directly with certain bacteria, RNA viruses, mycoplasmas, urate crystals, the fat A component of bacterial endotoxins and the membranes of certain intracellular organelles. Clq binding to Clq receptors is thought to promote phagocytosis. Clq also appears to enhance the antibody-forming surface of the host defense system. For example, Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12: 933-41.
, 1993. Thus, complement activated defensins act as enhanced antimicrobial agents, facilitating lysis or phagocytosis of infectious agents.
【0225】
また、デフェンシンの抗微生物活性は避妊の用途に有効である(Sawickiおよ
びMystkovska、Lancet 353:464−5、1999)。
また、炎症前活性を望むとき、本発明の医薬組成物を使用することができる。
このような炎症前活性の用途は、特に制限されたまたは損傷した脈管系、例えば
、糖尿病に関連する四肢における損傷を有する領域における、慢性組織損傷の治
療を包含する。対照的に、zamp3またはzamp4ポリペプチドに対するアンタゴニス
トは抗炎症剤として有効であることがある。The antimicrobial activity of defensins is also effective in contraceptive applications (Sawicki and Mystkovska, Lancet 353: 464-5, 1999). Also, when proinflammatory activity is desired, the pharmaceutical composition of the present invention can be used.
Applications of such pro-inflammatory activity include treatment of chronic tissue damage, particularly in areas with limited or damaged vascular systems, eg, damage in the extremities associated with diabetes. In contrast, antagonists to zamp3 or zamp4 polypeptides may be effective as anti-inflammatory agents.
【0226】
本発明のzamp3またはzamp4ポリペプチド医薬組成物は、また、免疫応答性の刺
激を望む症状の治療において使用することができる。このような症状の治療は、
機能不全免疫系を有する患者、例えば、エイズの患者または化学療法、放射線治
療またはその他を行う個体の治療を包含する。ヒトB−デフェンシン(HBD1およ
びHBD2)は未熟樹状突起細胞に対する化学走性活性を示す(Yang他、Science 2
86:525−8、1999)。化学走性活性は、デフェンシンがそれらの抗微生物活性に
加えて免疫刺激性であること示唆する。化学走性は、未熟樹状突起細胞ならびに
記憶T細胞の表面上に見出されるCCR6レセプターを通して仲介される。The zamp3 or zamp4 polypeptide pharmaceutical compositions of the present invention can also be used in the treatment of conditions in which stimulation of immune responsiveness is desired. Treatment of such symptoms
It includes treatment of patients with a dysfunctional immune system, eg, patients with AIDS or individuals undergoing chemotherapy, radiation therapy or otherwise. Human B-defensins (HBD1 and HBD2) show chemotactic activity on immature dendritic cells (Yang et al., Science 2
86: 525-8, 1999). Chemotactic activity suggests that defensins are immunostimulatory in addition to their antimicrobial activity. Chemotacticity is mediated through CCR6 receptors found on the surface of immature dendritic cells as well as memory T cells.
【0227】
zamp3およびzamp4は適合免疫応答の仲介において有効であろう。詳しくは、こ
のようなβ−デフェンシンペプチドは免疫無防備状態の個体における免疫応答を
促進するために使用することができる。ベータ−デフェンシンに由来する逆に修
飾されたペプチドを使用して、内因性免疫刺激分子とそれらのレセプターとの相
互作用をブロックし、これにより免疫抑制および抗炎症効果を達成するために使
用できるであろう。Zamp3 and zamp4 will be effective in mediating adaptive immune responses. In particular, such β-defensin peptides can be used to promote an immune response in immunocompromised individuals. Inversely modified peptides derived from beta-defensin can be used to block the interaction of endogenous immunostimulatory molecules with their receptors and thereby achieve immunosuppressive and anti-inflammatory effects. Ah
【0228】
βデフェンシンの他のメンバーは気管支上皮組織の中に見出され、嚢胞性繊維
症は頻繁な微生物感染により特徴づけられ、zamp3またはzamp4ポリペプチドを含
有する医薬組成物は、また、嚢胞性繊維症に関連する肺感染の治療において使用
するために考えられる。また、塩濃度に対する活性の減少により特徴づけられる
、操作されたzamp3またはzamp4ポリペプチドは本発明に包含される。高い塩濃度
に対する感受性の減少は、高い塩濃度の環境、例えば、嚢胞性繊維症を患う患者
の肺気道における操作されたzamp3またはzamp4ポリペプチドの抗微生物活性を保
存するであろう。この方法において、肺へのデリバリーのために処方された操作
されたzamp3またはzamp4ポリペプチドを含有する医薬組成物は、嚢胞性繊維症に
関連する肺感染を治療するために使用することができる。Other members of β-defensins are found in bronchial epithelial tissue, cystic fibrosis is characterized by frequent microbial infections, and pharmaceutical compositions containing zamp3 or zamp4 polypeptides also contain cysts. Considered for use in the treatment of lung infections associated with sexual fibrosis. Also included in the invention are engineered zamp3 or zamp4 polypeptides, which are characterized by a decrease in activity with respect to salt concentration. Reduced sensitivity to high salt concentrations will preserve the antimicrobial activity of engineered zamp3 or zamp4 polypeptides in the environment of high salt concentration, eg, the lung airways of patients with cystic fibrosis. In this way, pharmaceutical compositions containing engineered zamp3 or zamp4 polypeptides formulated for pulmonary delivery can be used to treat pulmonary infections associated with cystic fibrosis.
【0229】
放射性ハイブリッドマッピングは、哺乳動物の染色体の高い分解能の、隣接す
る地図を構築するために開発された、幹細胞の遺伝的技術である(Cox他、Scien
ce 250:245−50、1990)。遺伝子配列の部分的または完全な知識は、染色体の
放射性ハイブリッドマッピングパネルとともに使用するために適当なPCRプライ
マーの設計を可能とする。ヒトゲノム全体をカバーする、商業的に入手可能な放
射性ハイブリッドマッピングパネル、例えば、Stanford G3 RH PanelおよびG
eneBridge 4 RH Panel(Research Genetics,Inc.、アラバマ州ハンツヴィ
レ)は商業的に入手可能である。Radioactive hybrid mapping is a stem cell genetic technique developed to construct high-resolution, contiguous maps of mammalian chromosomes (Cox et al., Scien.
ce 250: 245-50, 1990). Partial or complete knowledge of the gene sequence allows the design of suitable PCR primers for use with chromosomal radioactive hybrid mapping panels. Commercially available radioactive hybrid mapping panels covering the entire human genome, eg Stanford G3 RH Panel and G
The eneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, Alab.) is commercially available.
【0230】
これらのパネルは、遺伝子、配列標識化部位(STS)、および問題の領域内の
他の非多形性および多形性マーカーの急速な、PCRをベースとする染色体の位置
決定および順序決定を可能とする。これは、問題の新しく発見された遺伝子と前
にマッピングされたマーカーとの間の、直接的に比例する物理的距離の確立を包
含する。遺伝子位置の正確な知識は、下記の目的を包含する、多数の目的に有効
である:1)配列が存在するcontigの一部分であるかどうかを決定し、そして追
加の取り囲む遺伝的配列を種々の形態、例えば、YAC、BACまたはcDNAクローンで
得ること;2)同一染色体領域に対する連鎖を示す、遺伝性疾患の可能な候補の
遺伝子を準備すること;および3)特定の遺伝子がどんな機能を有することがで
きるかの決定を促進することができる、交差参照モデルの生物、例えば、マウス
。These panels show rapid, PCR-based chromosomal localization and ordering of genes, sequence labeling sites (STS), and other non-polymorphic and polymorphic markers within the region of interest. Make decisions possible. This involves establishing a directly proportional physical distance between the newly discovered gene of interest and the previously mapped marker. Accurate knowledge of gene location is useful for a number of purposes, including the following: 1) determining if a sequence is part of an existing contig and adding additional surrounding genetic sequences to various Morphology, eg YAC, BAC or cDNA clone; 2) Preparing a candidate gene for a hereditary disease that exhibits linkage to the same chromosomal region; and 3) What function a particular gene has. Cross-reference model organisms, such as mice, that can facilitate the determination of
【0231】
T31全ゲノム放射線ハイブリッド(WGRH)パネル(Research Genetics,Inc.
、アラバマ州ハンツヴィレ)およびマップ・マネイジャー(Map Manager)QT連
鎖解析プログラムを使用して、ネズミzamp3遺伝子をマウスにおいて染色体8に対
してマッピングした。P=0.0001において、ネズミzamp3は5.6のLODスコアでマー
カーD8Mit141に結合した。D8Mit141はマウス染色体8上の6.0cMにマッピングされ
た。 商業的に入手可能なマウスT31全ゲノム放射線ハイブリッド(WGRH)を使
用して、ネズミzamp4をマウスにおいて染色体に対してマッピングした。T31 Whole Genome Radiation Hybrid (WGRH) Panel (Research Genetics, Inc.
, Huntsville, Alab.) And the Map Manager QT linkage analysis program was used to map the murine zamp3 gene to chromosome 8 in mice. At P = 0.0001, murine zamp3 bound to the marker D8Mit141 with an LOD score of 5.6. D8Mit141 mapped to 6.0 cM on mouse chromosome 8. Murine zamp4 was mapped to chromosomes in mice using the commercially available mouse T31 whole genome radiation hybrid (WGRH).
【0232】
この結果は、マウス染色体14WICGR放射線ハイブリッド地図上のフレームワー
クマーカーD14Mit156の25.88cR_3000端部に、ネズミzamp4はマップすることを
示す。近接および遠位のフレームワークマーカーは、それぞれ、D14Mit156およ
びD14Mit31であった。他のデフェンシンはマウス染色体8以外の位置にマッピン
グされなかった。この領域は、ヒトデフェンシンクラスターの位置とオーバーラ
ップする、ヒト染色体8p21−p23に対する既知の保存された相同領域である。The results show that the murine zamp4 maps to the 25.88cR_3000 end of the framework marker D14Mit156 on the mouse chromosome 14WICGR radiation hybrid map. The proximal and distal framework markers were D14Mit156 and D14Mit31, respectively. Other defensins did not map to positions other than mouse chromosome 8. This region is a known conserved region of homology to human chromosome 8p21-p23, which overlaps with the position of the human defensin cluster.
【0233】
本発明は、また、診断用途において使用される試薬を提供する。例えば、zamp
3遺伝子、zamp3DNAまたはRNAを含んでなるプローブまたはそれらのサブ配列を使
用して、zamp3遺伝子がマウス染色体8上に存在するかどうか、または突然変異が
起こったかどうかを決定することができる。zamp3遺伝子座における検出可能な
染色体異常は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化および
再配列を包含するが、これらに限定されない。分子遺伝学的技術、例えば、制限
フラグメント長さ多形性(RFLP)解析、PCR技術を使用する短い縦反復(STR)解
析、およびこの分野において知られている他の遺伝学的連鎖解析技術に従い、本
発明のポリヌクレオチドを使用して、このような染色体異常を検出することがで
きる(Sambrook他、前掲;Ausubel他、前掲;Marian、Chest 108:255−265、1
995)。The present invention also provides reagents for use in diagnostic applications. For example, zamp
A probe comprising 3 genes, zamp3 DNA or RNA or their subsequences can be used to determine if the zamp3 gene is present on mouse chromosome 8 or if a mutation has occurred. Detectable chromosomal abnormalities at the zamp3 locus include, but are not limited to, aneuploidy, gene copy number alterations, insertions, deletions, restriction site alterations and rearrangements. According to molecular genetic techniques, such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, short vertical repeat (STR) analysis using PCR techniques, and other genetic linkage analysis techniques known in the art. Polynucleotides of the invention can be used to detect such chromosomal abnormalities (Sambrook et al., Supra; Ausubel et al., Supra; Marian, Chest 108: 255-265, 1).
995).
【0234】
本発明の他の面は、SPG、チェディアック−東(Chediak−Higashi)症候群ま
たはデフェンシン濃度の変更により特徴づけられる他の症状について評価を行う
細胞培養物または患者の血清試料または組織バイオプシー中のzamp3またはzamp4
ポリペプチドの検出を包含する。イムノアッセイ技術およびzamp3またはzamp4ポ
リペプチドエピトープを認識できる抗体を使用して、zamp3またはzamp4ポリペプ
チドを検出することができる。さらに詳しくは、本発明は、下記の工程を含むza
mp3またはzamp4ポリペプチドを検出する方法を包含する:Another aspect of the invention is a cell culture or patient serum sample or tissue biopsy that is evaluated for SPG, Chediak-Higashi syndrome or other conditions characterized by altered defensin concentrations. Zamp3 or zamp4 inside
Includes detection of polypeptides. Immunoassay techniques and antibodies capable of recognizing zamp3 or zamp4 polypeptide epitopes can be used to detect zamp3 or zamp4 polypeptides. More specifically, the present invention includes the following steps:
Methods for detecting mp3 or zamp4 polypeptides include:
【0235】
zamp3またはzamp4ポリペプチドを含有する可能性がある溶液または試料または
細胞培養ライゼイトを、固体支持体に結合した抗体に対して暴露させ、ここで抗
体はzamp3またはzamp4ポリペプチドの第1エピトープに結合し、
固定化した抗体−ポリペプチドを洗浄して非結合汚染物質を除去し、
固定化した抗体−ポリペプチドを、zamp3またはzamp4ポリペプチドの第2エピ
トープに結合する第2抗体に対して暴露し、ここで第2抗体は検出可能な標識化と
アソシエートし、そして
検出可能な標識を検出する。A solution or sample or cell culture lysate that may contain a zamp3 or zamp4 polypeptide is exposed to an antibody bound to a solid support, where the antibody is the first epitope of the zamp3 or zamp4 polypeptide. To the second antibody that binds to the immobilized antibody-polypeptide to remove unbound contaminants and binds the immobilized antibody-polypeptide to the second epitope of the zamp3 or zamp4 polypeptide. Upon exposure, the second antibody associates with the detectable label and detects the detectable label.
【0236】
対照の濃度と異なるzamp3またはzamp4ポリペプチド濃度は、SPG、チェディア
ック−東(Chediak−Higashi)症候群またはデフェンシン濃度の変更により特徴
づけられる他の症状を示すことがある。さらに、zamp3またはzamp4の発現は感染
危機の開始の予測として嚢胞性繊維症の患者においてモニターすることができる
。また、デフェンシン、例えば、zamp3またはzamp4ポリペプチドの高いレベルは
肺における細胞障害作用に関連づけられ、このような細胞障害性を回避または処
理する直接的に治療するために、zamp3またはzamp4ポリペプチドのレベルを使用
できることを示す。例えば、zamp3またはzamp4ポリペプチドに対して向けられた
抗体を投与してzamp3またはzamp4ポリペプチドを不活性化することができる。A zamp3 or zamp4 polypeptide concentration that differs from the control concentration may indicate SPG, the Chediak-Higashi syndrome or other symptoms characterized by altered defensin concentrations. Furthermore, expression of zamp3 or zamp4 can be monitored in patients with cystic fibrosis as a predictor of the onset of infection crisis. Also, high levels of defensins, e.g., zamp3 or zamp4 polypeptides, have been associated with cytotoxic effects in the lung, and levels of zamp3 or zamp4 polypeptides can be directly treated to avoid or treat such cytotoxicity. Indicates that can be used. For example, an antibody directed against the zamp3 or zamp4 polypeptide can be administered to inactivate the zamp3 or zamp4 polypeptide.
【0237】
本発明の追加の面において、前述のzamp3またはzamp4ポリペプチドに特異的に
結合する抗体または合成された結合性タンパク質(例えば、ファージディスプレ
イ、大腸菌(E. coli)Fab、およびその他により発生されたもの)が提供され
る。このような抗体は、本明細書に記載する他の用途の中で、抗イディオタイプ
抗体の調製に有効である。商業的に入手可能なキット、例えば、Ph.DTMファージ
ディスプレイライブラリーキット(Phage Display Peptide Library Kits)
(New England Biolabs,Inc.、マサチュセッツ州ベバーリイ)を使用するフ
ァージディスプレイにより、合成された結合性タンパク質を産生することができ
る。ファージディスプレイ技術は、例えば、米国特許第5,223,409号、第5,403,4
84号および第5,571,698号に記載されている。In an additional aspect of the invention, antibodies or synthesized binding proteins that specifically bind to the aforementioned zamp3 or zamp4 polypeptides (eg, generated by phage display, E. coli Fab, and others). Provided). Such antibodies are useful in preparing anti-idiotype antibodies, among other uses described herein. Commercially available kits, eg Ph.D ™ Phage Display Peptide Library Kits
(New England Biolabs, Inc., Beverley, Mass.) Can be used to produce the synthesized binding protein by phage display. Phage display technology is described, for example, in US Pat. Nos. 5,223,409 and 5,403,4.
84 and 5,571,698.
【0238】
本発明の追加の面は、上に開示したzamp3またはzamp4ポリペプチドのアゴニス
トまたはアンタゴニストを同定する方法を提供し、前記アゴニストまたはアンタ
ゴニストはここにおいてさらに論ずる価値ある性質を有することができる。1つ
の態様において、zamp3またはzamp4ポリペプチドのアゴニストを同定する方法が
提供され、この方法はそれに対して応答性である細胞を準備し、被検化合物の存
在下に細胞を培養し、細胞の応答をzamp3またはzamp4ポリペプチドの存在下に培
養した細胞と比較し、そして細胞の応答が同一タイプである被検化合物を選択す
ることを含む。An additional aspect of the invention provides a method of identifying an agonist or antagonist of a zamp3 or zamp4 polypeptide disclosed above, which agonist or antagonist may have valuable properties as further discussed herein. In one embodiment, a method of identifying an agonist of a zamp3 or zamp4 polypeptide is provided, the method comprising preparing a cell responsive thereto, culturing the cell in the presence of a test compound, and responsiveness of the cell Compared to cells cultured in the presence of zamp3 or zamp4 polypeptide and selecting a test compound for which the cell response is of the same type.
【0239】
他の態様において、zamp3またはzamp4ポリペプチドのアンタゴニストを同定す
る方法が提供され、この方法はzamp3またはzamp4ポリペプチドに対して応答性で
ある細胞を準備し、zamp3またはzamp4ポリペプチドの存在下に細胞の第1部分を
培養し、zamp3またはzamp4ポリペプチドおよび被検化合物の存在下に細胞の第2
部分を培養し、そして細胞の第1部分に比較して細胞の第2部分の細胞の応答の減
少を検出することを含む。In another embodiment, a method of identifying an antagonist of a zamp3 or zamp4 polypeptide is provided, the method comprising preparing a cell that is responsive to a zamp3 or zamp4 polypeptide, the presence of the zamp3 or zamp4 polypeptide. Incubate a first portion of cells underneath and incubate a second portion of cells in the presence of zamp3 or zamp4 polypeptide and the test compound.
Culturing the portion and detecting a decreased cellular response of the second portion of the cell relative to the first portion of the cell.
【0240】
本発明のそれ以上の面は、細胞培養物中の単球の化学誘引性を研究する方法が
提供され、この方法はzamp3またはzamp4ポリペプチド、フラグメント、融合タン
パク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを含んでなる培地中で単球をイ
ンキュベートして、単球の化学誘引性を研究または評価することを含む。このよ
うな評価は、この分野において知られている方法、例えば、Territo他、前掲に
記載されている方法を使用して実施することができる。A further aspect of the invention there is provided a method of studying the chemoattractant properties of monocytes in cell culture, which method comprises a zamp3 or zamp4 polypeptide, fragment, fusion protein, antibody, agonist or antagonist. Incubating the monocytes in a medium comprising the to study or assess the chemoattractant properties of the monocytes. Such evaluations can be performed using methods known in the art, such as those described in Territo et al., Supra.
【0241】
メラノコルチンレセプターは、アデニレートシクラーゼを活性化し、カルシウ
ムフラックスを引き起こす、Gカップルドタンパク質レセプターである。アゴウ
チタンパク質(これはトキシン様である36アミノ酸ドメインを含有する)は、MC
lおよびMC4に対するMSH−アルファの結合を阻害すると考えられる。さらに、ア
ゴウチタンパク質はカルシウムチャンネルのアンタゴニストであると考えられ、
そしてある種のトキシンはイオンフラックスをモジュレートすると考えられる。
実験の証拠は発生し、これらはデフェンシンがカルシウムチャンネルをブロック
することができることを示唆する。The melanocortin receptor is a G-coupled protein receptor that activates adenylate cyclase and causes calcium flux. The agoroprotein, which contains a 36 amino acid domain that is toxin-like,
It is believed to inhibit the binding of MSH-alpha to l and MC4. Furthermore, agouchi protein is thought to be a calcium channel antagonist,
And some toxins are thought to modulate ion flux.
Experimental evidence arises, these suggest that defensins can block calcium channels.
【0242】
本発明のそれ以上の面は、細胞培養におけるレセプターのメラノコルチンファ
ミリーの活性を研究する方法を提供し、この方法はリガンドまたは推定上のリガ
ンドと、zamp3またはzamp4ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体
、アゴニストまたはアンタゴニストとを含んでなる培地中で、このようなレセプ
ター(例えば、ACTHレセプターまたはその他)を内因的に担持する細胞、または
このようなレセプターを担持するように操作された細胞をインキュベートして、
リガンドまたは推定上のリガンドの結合および/またはイオンフラックスの調節
またはモジュレーションを研究または評価することを含む。このような評価はこ
の分野において知られている方法、例えば、Zhu他、前掲に記載されている方法
を使用して実施することができる。A further aspect of the invention provides a method of studying the activity of the melanocortin family of receptors in cell culture, which method comprises a ligand or a putative ligand and a zamp3 or zamp4 polypeptide, fragment, fusion protein. Cells that endogenously carry such a receptor (eg, ACTH receptor or others), or cells engineered to carry such a receptor, in a medium comprising an antibody, an agonist or an antagonist. Incubate,
It involves studying or assessing the binding or / and the modulation or modulation of ion flux of a ligand or a putative ligand. Such an evaluation can be performed using methods known in the art, such as those described in Zhu et al., Supra.
【0243】
本発明のそれ以上の面は、細胞培養におけるイオンフラックスを研究する方法
を提供し、この方法はzamp3またはzamp4ポリペプチド、フラグメント、融合タン
パク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを含んでなる培地中で、イオン
フラックス、例えば、カルシウムフラックス、ナトリウムフラックス、カリウム
フラックスまたはその他を形成できる細胞をインキュベートして、イオンフラッ
クスの調節またはモジュレーションを研究または評価することを含む。A further aspect of the invention provides a method of studying ion flux in cell culture, which method comprises in a medium comprising a zamp3 or zamp4 polypeptide, fragment, fusion protein, antibody, agonist or antagonist. And incubating cells capable of forming an ion flux, such as calcium flux, sodium flux, potassium flux or otherwise, to study or evaluate the regulation or modulation of ion flux.
【0244】
本発明のそれ以上の面は、細胞培養における哺乳動物細胞、例えば、腫瘍細胞
に対する細胞致死活性を研究する方法を提供し、この方法はzamp3またはzamp4ポ
リペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴ
ニストを高い被験因子および低い細胞濃度で含んでなる培地中で、このような細
胞細胞をインキュベートして、細胞致死活性を研究または評価することを含む。
このような評価はこの分野において知られている方法、例えば、Lichtenstein他
、Blood 68:1407−10、1986およびSheu他、Antimicrob. Agents Chemother.
28:626−9、1993に記載されている方法を使用して実施することができる。A further aspect of the invention provides a method of studying cell-killing activity against mammalian cells, eg tumor cells, in cell culture, which method comprises zamp3 or zamp4 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies. , Incubating such cells in a medium comprising an agonist or antagonist at high test factors and low cell concentrations to study or assess cell killing activity.
Such evaluations are methods known in the art, such as Lichtenstein et al., Blood 68: 1407-10, 1986 and Sheu et al., Antimicrob. Agents Chemother.
28: 626-9, 1993.
【0245】
本発明のそれ以上の面は、外因的微生物感染、例えば、細菌、ウイルスまたは
菌類の感染のin vitro研究において、細胞培養試薬としてzamp3またはzamp4ポ
リペプチド、フラグメント、融合タンパク質またはアゴニストを使用することを
包含する。
本発明の追加の面は、細胞培養における上皮細胞のデフェンシン誘導を研究す
ることである。本発明のこの面において、上皮細胞を培養し、病原体刺激に暴露
する。次いで、上皮細胞によるzamp3またはzamp4ポリペプチド産生の誘導を測定
する。A further aspect of the invention is the use of zamp3 or zamp4 polypeptides, fragments, fusion proteins or agonists as cell culture reagents in the in vitro study of exogenous microbial infections, eg bacterial, viral or fungal infections. Include doing. An additional aspect of the invention is to study defensin induction of epithelial cells in cell culture. In this aspect of the invention, epithelial cells are cultured and exposed to pathogen stimuli. The induction of zamp3 or zamp4 polypeptide production by epithelial cells is then measured.
【0246】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝学および微生物学、タ
ンパク質化学、および抗体の産生および分析に関係する課程のための実験室実用
講座の教育ツールとして使用されるであろう。zamp3またはzamp4の分子は、ユニ
ークなポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を有するために、試験する目的
で標準または「未知のもの」として使用することができる。例えば、zamp3また
はzamp4ポリヌクレオチドは、例えば、下記の目的のための補助教材として使用
することができる:zamp3またはzamp4が発現すべき遺伝子である、細菌、ウイル
ス、または哺乳動物の発現のための発現構築物、例えば、融合構築物を調製する
方法を学生に教示するために;ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断
部位を決定するために;組織中のzamp3またはzamp4ポリヌクレオチドのmRNAおよ
びDNA局在化を決定するために(すなわち、ノザンおよびサザンブロッティング
ならびにポリメラーゼ連鎖反応により);および核酸ハイブリダイゼーションに
より関係するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定するために。The polynucleotides and polypeptides of the present invention will be used as educational tools in laboratory hands-on courses for courses related to genetics and microbiology, protein chemistry, and antibody production and analysis. Molecules of zamp3 or zamp4 can be used as standards or "unknown" for testing purposes because they have unique polynucleotide and polypeptide sequences. For example, zamp3 or zamp4 polynucleotides can be used, for example, as a teaching aid for the following purposes: expression for bacterial, viral, or mammalian expression, where zamp3 or zamp4 is the gene to be expressed. To teach students how to prepare constructs, eg, fusion constructs; to determine restriction endonuclease cleavage sites for polynucleotides; to determine mRNA and DNA localization of zamp3 or zamp4 polynucleotides in tissues To identify (ie, by Northern and Southern blotting and polymerase chain reaction); and to identify related polynucleotides and polypeptides by nucleic acid hybridization.
【0247】
例示として、学生は配列番号1のヌクレオチド配列から成る核酸分子のAlwI消
化が約13塩基対および187塩基対の2つのフラグメントを提供すること、およびCv
iRI消化が約58塩基対、54塩基対におけるダブレット、30塩基対、および12塩基
対のフラグメントを生ずること見出すであろう。By way of illustration, students found that AlwI digestion of a nucleic acid molecule consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 provided two fragments of approximately 13 and 187 base pairs, and Cv
You will find that the iRI digest yields fragments of approximately 58 base pairs, doublets at 54 base pairs, 30 base pairs, and 12 base pairs.
【0248】
zamp3またはzamp4ポリペプチドは下記を教示する補助教材として使用すること
ができる:抗体の調製;ウェスタンブロッティングによるタンパク質の同定;タ
ンパク質の精製;発現された全タンパク質に対する比として発現されたzamp3ま
たはzamp4ポリペプチドの重量の測定;ペプチド切断部位の同定;アミノおよび
カルボキシル末端のタグのカップリング;アミノ酸配列分析、ならびにin vitr
oおよびin vivoにおける天然およびタッグドタンパク質の両方の生物学的活性
(すなわち、プロテアーゼ阻害)のモニター、これらに限定されない。The zamp3 or zamp4 polypeptides can be used as an adjunct material to teach: antibody preparation; protein identification by Western blotting; protein purification; zamp3 or expressed as a ratio of total expressed protein. Measurement of weight of zamp4 polypeptide; identification of peptide cleavage site; coupling of amino and carboxyl terminal tags; amino acid sequence analysis and in vitr
Monitor biological activity (ie, protease inhibition) of both native and tagged proteins in o and in vivo, without limitation.
【0249】
zamp3またはzamp4ポリペプチドは下記を教示する補助教材として使用すること
ができる:抗体の調製;ウェスタンブロッティングによるタンパク質の同定;タ
ンパク質の精製;産生された全タンパク質に対する比として産生されたzamp3ま
たはzamp4ポリペプチドの重量の測定;ペプチド切断部位の同定;アミノおよび
カルボキシル末端のタグのカップリング;アミノ酸配列分析、ならびにin vitr
oおよびin vivoにおける天然およびタッグドタンパク質の両方の生物学的活性
のモニター、これらに限定されない。A zamp3 or zamp4 polypeptide can be used as an adjunct material to teach: antibody preparation; protein identification by Western blotting; protein purification; zamp3 or protein produced as a ratio to total protein produced. Measurement of weight of zamp4 polypeptide; identification of peptide cleavage site; coupling of amino and carboxyl terminal tags; amino acid sequence analysis and in vitr
Monitor biological activity of both native and tagged proteins in o and in vivo, without limitation.
【0250】
また、zamp3またはzamp4ポリペプチドは下記を教示するために使用することが
できる:分析技術、例えば、質量分析、特に4つのアルファヘリックスの、コン
フォメーションを決定する円偏光二色性、原子的詳述の三次元構造を決定するX
線結晶学、溶液中のタンパク質構造を明らかにするための核磁気共鳴分光学。例
えば、zamp3またはzamp4を含有するキットを分析のために学生に与えることがで
きる。教師はアミノ酸配列を知っているので、学生の技量を決定または進展させ
るための試験としてタンパク質を学生を与えることができ、次いで教師は学生が
ポリペプチドを正しく分析したかどうかを知るであろう。すべてのポリペプチド
はユニークであるので、zamp3またはzamp4の教育上の利用はそれら自体ユニーク
である。The zamp3 or zamp4 polypeptides can also be used to teach the following: analytical techniques, such as mass spectrometry, in particular the circular alpha dichroism, which determines the conformation of the four alpha helices, the atoms. To determine the three-dimensional structure of a detailed description X
Line crystallography, nuclear magnetic resonance spectroscopy to reveal protein structure in solution. For example, a kit containing zamp3 or zamp4 can be given to students for analysis. Since the teacher knows the amino acid sequence, he or she can give the student the protein as a test to determine or develop the student's skill, and then the teacher will know if the student has correctly analyzed the polypeptide. Since all polypeptides are unique, the educational use of zamp3 or zamp4 is unique in their own right.
【0251】
zamp3またはzamp4に特異的に結合する抗体は、教育補助教材として、zamp3ま
たはzamp4を精製するアフィニティークロマトグラフィーカラムを調製し、抗体
をコードするポリヌクレオチドを対抗し、配列決定する方法を学生に指導するた
めに、そして実用講座としてヒト化抗体を設計する方法を学生に教示するために
使用することができる。次いで試薬会社はzamp3またはzamp4遺伝子、ポリペプチ
ド、または抗体を包装し、学生が微生物学の分野における技量を獲得するように
教育施設に販売することができる。遺伝子およびタンパク質の各々はユニークで
あるので、遺伝子およびタンパク質の各々は実験室の実用講座において学生のた
めにユニークな課題および学習の経験をつくる。このようなzamp3またはzamp4遺
伝子、ポリペプチド、または抗体を含有する教育キットは本発明の範囲内に入る
と考えられる。Antibodies that specifically bind to zamp3 or zamp4 can be used as educational aids by preparing an affinity chromatography column for purifying zamp3 or zamp4, and competing with a polynucleotide encoding the antibody to determine the sequence. Can be used to teach, and as a hands-on course, teach students how to design humanized antibodies. The reagent company can then package the zamp3 or zamp4 gene, polypeptide, or antibody and sell it to an educational facility so that the student gains skills in the field of microbiology. Because each of the genes and proteins is unique, each of the genes and proteins creates a unique assignment and learning experience for the student in the lab hands-on course. Educational kits containing such zamp3 or zamp4 genes, polypeptides, or antibodies are considered to be within the scope of the invention.
【0252】
本発明は、1つの面において、a)配列番号2のアミノ酸残基31〜60;およびb)
配列番号2のアミノ酸残基12〜41;から成る群から選択されるポリペプチドを含
んでなる単離されたタンパク質を提供する。1つの態様において、タンパク質はa
)配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基63の配列から成るポリペプチド;お
よびb)配列番号2のアミノ酸残基23〜アミノ酸残基63の配列から成るポリペプチ
ド;から成る群から選択される配列を有するポリペプチドを含んでなる。他の態
様において、タンパク質は配列番号4のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基43の配列か
ら成るポリペプチドを含んでなる。The invention in one aspect is: a) amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2; and b)
There is provided an isolated protein comprising a polypeptide selected from the group consisting of amino acid residues 12-41 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the protein is a
B) a polypeptide consisting of the sequence of amino acid residue 1 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2; and b) a polypeptide consisting of the sequence of amino acid residue 23 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2; Comprising a polypeptide having the sequence: In another embodiment, the protein comprises a polypeptide consisting of the sequence of amino acid residue 1 to amino acid residue 43 of SEQ ID NO: 4.
【0253】
本発明は、また、a)配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基63の配列を有
するポリペプチド、ここでポリペプチドは配列番号2のアミノ酸残基31、32、38
、42、52、59および60に対応するシステイン残基を有する;b)配列番号2のアミ
ノ酸残基23〜アミノ酸残基60の配列を有するポリペプチド、ここでポリペプチド
は配列番号2のアミノ酸残基31、32、38、42、52、59および60に対応するシステ
イン残基を有する;およびc)配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基43の配
列を有するポリペプチド、ここでポリペプチドは配列番号6のアミノ酸残基12、1
9、24、34、40および41に対応するシステイン残基を有する;から成る群から選
択されるポリペプチドに対して少なくとも80%の同一性を有するペプチドを含ん
でなる単離されたタンパク質を提供する。1つの態様において、ktup=1、ギャッ
プオープニングペナルティー=10、ギャップエクステンションペナルティー=1
、および置換マトリックス=BLOSUM62、デフォルトとして設定された他のパラメ
ーターを有するFASTAを使用して、アミノ酸の同一性百分率を決定する。The present invention also includes a) a polypeptide having a sequence from amino acid residue 1 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide is amino acid residue 31, 32, 38 of SEQ ID NO: 2.
, 42, 52, 59 and 60; b) a polypeptide having a sequence from amino acid residue 23 to amino acid residue 60 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide is the amino acid residue of SEQ ID NO: 2. Having cysteine residues corresponding to groups 31, 32, 38, 42, 52, 59 and 60; and c) a polypeptide having a sequence from amino acid residue 1 to amino acid residue 43 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide Is amino acid residues 12, 1 of SEQ ID NO: 6
Having a cysteine residue corresponding to 9, 24, 34, 40 and 41; providing an isolated protein comprising a peptide having at least 80% identity to a polypeptide selected from the group consisting of: To do. In one embodiment, ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1.
, And the substitution matrix = BLOSUM62, FASTA with other parameters set as defaults to determine percent amino acid identity.
【0254】
また、a)配列番号2のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基60;およびb)配列番号6
のアミノ酸残基12〜アミノ酸残基41;から成る群から選択されるポリペプチドが
提供される。
本発明は、また、薬学上許容されるベヒクルと組み合わせた、前述したポリペ
プチドを提供する。
他の面において、本発明は、前述のポリペプチドを動物に接種し、ここでポリ
ペプチドは動物における免疫応答を誘発して抗体を産生し;そして抗体を動物か
ら単離する;ことを含むポリペプチドに対する抗体を産生する方法を提供する。
本発明は、また、前述のタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。[0254] Also, a) amino acid residue 31 to amino acid residue 60 of SEQ ID NO: 2; and b) SEQ ID NO: 6
A polypeptide selected from the group consisting of amino acid residue 12 to amino acid residue 41; The present invention also provides the above-mentioned polypeptide in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle. In another aspect, the invention comprises inoculating an animal with a polypeptide as described above, wherein the polypeptide induces an immune response in the animal to produce an antibody; and the antibody is isolated from the animal. Methods of producing antibodies to peptides are provided. The present invention also provides an antibody that specifically binds to the aforementioned protein.
【0255】
また、前述のタンパク質に特異的に結合する抗体の抗イディオタイプ抗体が提
供される。
他の面において、本発明は、配列番号2のアミノ酸残基31〜60;およびb)配列
番号6のアミノ酸残基12〜41;から成る群から選択されるポリペプチドを含んで
なるタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。1つの態
様において、タンパク質はa)配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基63の配
列から成るポリペプチド;およびb)配列番号2のアミノ酸残基23〜アミノ酸残基
63の配列から成るポリペプチド;から成る群から選択される配列を有するポリペ
プチドを含んでなる。他の態様において、タンパク質は配列番号4のアミノ酸残
基1〜アミノ酸残基43の配列から成るポリペプチドを含んでなる。他の態様にお
いて、ポリヌクレオチドは配列番号1または配列番号5のヌクレオチド配列または
それらの成分から成るポリヌクレオチドに対してストリンジェント洗浄条件後に
ハイブリダイゼーションしたままである。Also provided are anti-idiotypic antibodies of antibodies that specifically bind to the aforementioned proteins. In another aspect, the invention encodes a protein comprising a polypeptide selected from the group consisting of amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2; and b) amino acid residues 12-41 of SEQ ID NO: 6. An isolated polynucleotide is provided. In one embodiment, the protein is a) a polypeptide consisting of the sequence of amino acid residue 1 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2; and b) amino acid residue 23 to amino acid residue of SEQ ID NO: 2.
A polypeptide consisting of 63 sequences; a polypeptide having a sequence selected from the group consisting of: In another embodiment, the protein comprises a polypeptide consisting of the sequence of amino acid residue 1 to amino acid residue 43 of SEQ ID NO: 4. In other embodiments, the polynucleotide remains hybridized to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5 or components thereof after stringent wash conditions.
【0256】
本発明は、また、a)配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基63の配列を有
するポリペプチド、ここでポリペプチドは配列番号2のアミノ酸残基31、32、38
、42、52、59および60に対応するシステイン残基を有する;b)配列番号2のアミ
ノ酸残基23〜アミノ酸残基63の配列を有するポリペプチド、ここでポリペプチド
は配列番号2のアミノ酸残基31、32、38、42、52、59および60に対応するシステ
イン残基を有する;およびc)配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基43の配
列を有するポリペプチド、ここでポリペプチドは配列番号6のアミノ酸残基12、1
9、24、34、40および41に対応するシステイン残基を有する;から成る群から選
択されるポリペプチドに対して少なくとも80%の同一性を有するペプチドを含ん
でなる単離されたタンパク質を提供する。The invention also includes a) a polypeptide having a sequence from amino acid residue 1 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide is amino acid residue 31, 32, 38 of SEQ ID NO: 2.
, 42, 52, 59 and 60; b) a polypeptide having a sequence from amino acid residue 23 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide is the amino acid residue of SEQ ID NO: 2. Having cysteine residues corresponding to groups 31, 32, 38, 42, 52, 59 and 60; and c) a polypeptide having a sequence from amino acid residue 1 to amino acid residue 43 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide Is amino acid residues 12, 1 of SEQ ID NO: 6
Having a cysteine residue corresponding to 9, 24, 34, 40 and 41; providing an isolated protein comprising a peptide having at least 80% identity to a polypeptide selected from the group consisting of: To do.
【0257】
1つの態様において、ktup=1、ギャップオープニングペナルティー=10、ギャ
ップエクステンションペナルティー=1、および置換マトリックス=BLOSUM62、
デフォルトとして設定された他のパラメーターを有するFASTAを使用して、アミ
ノ酸の同一性百分率を決定する。他の態様において、ペプチドと配列番号2また
は6との間の差は保存的アミノ酸置換のためである。他の態様において、ポリヌ
クレオチドは配列番号1または配列番号5のヌクレオチド配列またはそれらの成分
から成るポリヌクレオチドに対してストリンジェント洗浄条件後にハイブリダイ
ゼーションしたままである。In one embodiment, ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1, and substitution matrix = BLOSUM62,
FASTA with other parameters set as defaults is used to determine percent amino acid identity. In other embodiments, the difference between the peptide and SEQ ID NO: 2 or 6 is due to a conservative amino acid substitution. In other embodiments, the polynucleotide remains hybridized to the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5 or components thereof after stringent wash conditions.
【0258】
本発明は、また、a)配列番号2のアミノ酸残基31〜アミノ酸残基60;およびb
)配列番号6のアミノ酸残基12〜アミノ酸残基41;から成る群から選択されるポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また、a)配列番号1のヌクレオチド1〜ヌクレオチド324;b)配列番号1のヌク
レオチド10〜ヌクレオチド198;c)配列番号1のヌクレオチド76〜ヌクレオチド1
98;d)配列番号1のヌクレオチド100〜189;e)配列番号5のヌクレオチド1〜296
;f)配列番号5のヌクレオチド1〜132;およびg)配列番号5のヌクレオチド34〜
123から成る;から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチドが提供さ
れる。The invention also includes: a) amino acid residue 31 to amino acid residue 60 of SEQ ID NO: 2; and b
3.) A polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of amino acid residue 12 to amino acid residue 41 of SEQ ID NO: 6; Also, a) nucleotide 1 to nucleotide 324 of SEQ ID NO: 1; b) nucleotide 10 to nucleotide 198 of SEQ ID NO: 1; c) nucleotide 76 to nucleotide 1 of SEQ ID NO: 1.
98; d) nucleotides 100-189 of SEQ ID NO: 1; e) nucleotides 1-296 of SEQ ID NO: 5
F) nucleotides 1-132 of SEQ ID NO: 5; and g) nucleotides 34-34 of SEQ ID NO: 5.
An isolated polynucleotide selected from the group consisting of: 123;
【0259】
他の面において、本発明は、また、下記の作用可能に連鎖された因子を含んで
なる発現ベクターを提供する:転写プロモーター;前述したタンパク質をコード
するDNAセグメント;および転写ターミネーター。1つの態様において、DNAセグ
メントはタンパク質に作用可能に連鎖された分泌シグナル配列をさらにコードす
る。他の態様において、分泌シグナル配列は配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ
酸残基22の配列を有するポリペプチドである。In another aspect, the invention also provides an expression vector comprising the following operably linked factors: a transcription promoter; a DNA segment encoding the aforementioned protein; and a transcription terminator. In one embodiment, the DNA segment further encodes a secretory signal sequence operably linked to the protein. In another embodiment, the secretory signal sequence is a polypeptide having the sequence from amino acid residue 1 to amino acid residue 22 of SEQ ID NO: 2.
【0260】
本発明は、また、前述した発現ベクターが導入されており、DNAセグメントに
よりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞を提供する。
本発明は、さらに、前述した発現ベクターが導入された細胞を培養し、これに
より細胞はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し;そして発
現されたポリペプチドを回収する;ことを含むタンパク質を製造する方法を提供
する。The present invention also provides a cultured cell into which the aforementioned expression vector has been introduced and which expresses the polypeptide encoded by the DNA segment. The present invention further comprises culturing cells into which the above-described expression vector has been introduced, whereby the cells express the polypeptide encoded by the DNA segment; and recover the expressed polypeptide; A method of manufacturing is provided.
【0261】
他の面において、本発明は、下記のポリペプチドから成る群から選択されるポ
リペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、微生物に関係する
疾患を治療する方法を提供する:a)配列番号2のポリペプチド;b)配列番号6の
ポリペプチド;c)配列番号2のアミノ酸残基23〜63から成るポリペプチド;d)
配列番号2のアミノ酸残基31〜60から成るポリペプチド;およびe)配列番号6の
アミノ酸残基12〜40から成るポリペプチド;これによりポリペプチドは疾患を軽
減する。1つの態様において、微生物に関係する疾患は眼に関連する。他の態様
において、微生物に関係する疾患は結膜炎である。他の態様において、微生物に
関係する疾患は耳に関連する。In another aspect, the present invention provides a method of treating a disease associated with a microorganism comprising administering to a mammal a therapeutically effective amount of a polypeptide selected from the group consisting of the following polypeptides: Provided: a) a polypeptide of SEQ ID NO: 2; b) a polypeptide of SEQ ID NO: 6; c) a polypeptide consisting of amino acid residues 23 to 63 of SEQ ID NO: 2; d)
A polypeptide consisting of amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2; and e) a polypeptide consisting of amino acid residues 12-40 of SEQ ID NO: 6; whereby the polypeptide reduces disease. In one embodiment, the microbial related disease is associated with the eye. In other embodiments, the microbial-related disease is conjunctivitis. In other embodiments, the microbially-related disease is associated with the ear.
【0262】
また、本発明によれば、下記のポリペプチドから成る群から選択されるポリペ
プチドの治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、避妊方法が提供される:
a)配列番号2のポリペプチド;b)配列番号6のポリペプチド;c)配列番号2のア
ミノ酸残基23〜63から成るポリペプチド;d)配列番号2のアミノ酸残基31〜60か
ら成るポリペプチド;およびe)配列番号6のアミノ酸残基12〜40から成るポリペ
プチド。
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに説明する。Also provided according to the invention is a method of contraception comprising administering to a mammal a therapeutically effective amount of a polypeptide selected from the group consisting of the following polypeptides:
a) a polypeptide of SEQ ID NO: 2; b) a polypeptide of SEQ ID NO: 6; c) a polypeptide of amino acid residues 23-63 of SEQ ID NO: 2; d) a polypeptide of amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2 A peptide; and e) a polypeptide consisting of amino acid residues 12-40 of SEQ ID NO: 6. The invention is further described by the following non-limiting examples.
【0263】実施例1
.組織分布
マウス多重組織ノザンブロット(MTNTM;Clontech、カリフォルニア州パロア
ルト)をプロービングして、ネズミzamp3発現の組織分布を決定した。ほぼ214bp
のPCR由来プローブ(配列番号18)をマウスゲノムDNAから増幅した。オリゴヌク
レオチドプライマーZC22848(配列番号13)およびZC22847(配列番号14)をプラ
イマーとして使用した。PCRにおいてプローブを次のようにして使用した:1サイ
クル、94℃において30秒間;30サイクル、94℃において15秒間および68℃におい
て1分間;次いで1サイクル、68℃において3分間。 Example 1 Tissue Distribution Mouse multiple tissue Northern blots (MTN ™ ; Clontech, Palo Alto, Calif.) Were probed to determine the tissue distribution of murine zamp3 expression. Almost 214bp
PCR-derived probe (SEQ ID NO: 18) was amplified from mouse genomic DNA. Oligonucleotide primers ZC22848 (SEQ ID NO: 13) and ZC22847 (SEQ ID NO: 14) were used as primers. The probe was used in PCR as follows: 1 cycle, 94 ° C for 30 seconds; 30 cycles, 94 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 1 minute; then 1 cycle, 68 ° C for 3 minutes.
【0264】
生ずるDNAフラグメントを1.5%アガロースゲル(OmniPure Agrose、EM Scie
nce、ニュージャージイ州ギッブスタウン)上で電気泳動させ、フラグメントをQ
IAquickTM法(Qiagen、カリフォルニア州チャツワース)に従い精製し、配列を
配列分析により確証した。製造業者の使用説明書に従いプライムIIランダム・プ
ライム標識化系(RediPrime II Random Prime Labeling System、Amersham
、イリノイ州アーリントンハイツ)を使用して、プローブを放射線標識化した。
NUCTRAPプッシュカラム(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)を使用して
、プローブを精製した。The resulting DNA fragment was loaded onto a 1.5% agarose gel (OmniPure Agrose, EM Scie
nce, Gibbstown, NJ), and Q
Purified according to the IAquick ™ method (Qiagen, Chatsworth, CA), the sequence was confirmed by sequence analysis. Primer II Random Prime Labeling System, Amersham according to the manufacturer's instructions.
, Arlington Heights, Ill.) Was used to radiolabel the probe.
The probe was purified using a NUCTRAP push column (Stratagene, La Jolla, CA).
【0265】
ExpressHybTM(Clontech)溶液をプレハイブリダイゼーションのために使用し
、そしてノザンブロットのためのハイブリダイゼーション溶液として使用した。
1×106cpm/mlの標識化プローブを使用して、ハイブリダイゼーションを65℃に
おいて実施した。次いでブロットを室温において2×SSC、0.1%SDS中で1時間洗
浄し、次いで50℃において0.1×SSC、0.1%SDS中で1時間洗浄した。発現は観測
されなかった。こうしてzamp3ポリペプチドのmRNAの正常組織レベルはノザンブ
ロットの検出感度より低いように思われる。このような観測はいくつかのデフェ
ンシンに関する分野における知識と一致する、すなわち、デフェンシンは低いレ
ベルで構成的に発現されるが、感染時に高度に誘導可能である。ExpressHyb ™ (Clontech) solution was used for prehybridization and as a hybridization solution for Northern blots.
Hybridization was performed at 65 ° C. using 1 × 10 6 cpm / ml labeled probe. Blots were then washed at room temperature in 2 × SSC, 0.1% SDS for 1 hour and then at 50 ° C. in 0.1 × SSC, 0.1% SDS for 1 hour. No expression was observed. Thus, normal tissue levels of zamp3 polypeptide mRNA appear to be less than the sensitivity of Northern blot detection. Such observations are consistent with knowledge in the field of several defensins: defensins are constitutively expressed at low levels but are highly inducible upon infection.
【0266】
マウス胚多重組織ノザンブロット(MTNTM;Clontech)を前述したようにプロ
ービングし、ハイブリダイゼーションさせた。発現は観測されなかった。
マウスRNAマスター・ブロット(Master BlotTM)を前述したようにプロービ
ングした。発現は甲状腺、卵巣および精巣上体において淡いシグナルとして検出
された。Mouse embryo multiple tissue Northern blots (MTN ™ ; Clontech) were probed and hybridized as previously described. No expression was observed. Mouse RNA Master Blot ™ was probed as described above. Expression was detected as a faint signal in thyroid, ovary and epididymis.
【0267】実施例2
.ネズミzamp3の染色体帰属および配置
商業的に入手可能なマウスT31全ゲノム放射線ハイブリッド(WGRH)パネル(R
esearch Genetics,Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ)およびマップ・マネイジ
ャー(Map Manager)QT連鎖解析プログラムを使用して、ネズミzamp3をマウス
において染色体8に対してマッピングした。P=0.0001において、ネズミzamp3は5
.6のLODスコアでマーカーD8Mit141に結合した。D8Mit141はマウス染色体8上の6.
0cMにマッピングされた。 Example 2 Chromosome Assignment and Placement of Murine zamp3 Commercially Available Mouse T31 Whole Genome Radiation Hybrid (WGRH) Panel (R
Mouse zamp3 was mapped to chromosome 8 in mice using the esearch Genetics, Inc., Huntsville, Ala. and Map Manager QT linkage analysis program. At P = 0.0001, the rat zamp3 is 5
It bound to the marker D8Mit141 with an LOD score of .6. D8Mit141 is on mouse chromosome 8.
Mapped to 0 cM.
【0268】
T31 WGRHパネルは、100の放射線ハイブリッドクローン、+2つの対照DNA(12
9aaドナーおよびA23レシピエント)の各々からのPCRable DNAを含有する。ネズ
ミzamp3をT31 WGRHパネルでマッピングするために、20μlの反応物を96ウェル
のマイクロタイタープレート(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)中で構
成し、RoboCycler Gradient 96サーマルサイクラー(Stratagene)において使
用した。The T31 WGRH panel consisted of 100 radiation hybrid clones, plus 2 control DNA (12
9aa donors and A23 recipients). For mapping murine zamp3 with a T31 WGRH panel, 20 μl of reaction was constructed in a 96-well microtiter plate (Stratagene, La Jolla, Calif.) And used in a RoboCycler Gradient 96 thermal cycler (Stratagene).
【0269】
102のPCR反応の各々は、2μlの10×KlenTaq PCR反応緩衝液(Clontech Labo
ratories,Inc.、カリフォルニア州パロアルト)、1.6μlのdNTP混合物(2.5mM
の各々、Perkin−Elmer、フォスターシティー、カリフォルニア州)、1μlのセ
ンスプライマー、ZC19960、(配列番号15)、1μlのアンチセンスプライマー、Z
C19961、(配列番号16)、2μlのRediLoad(Research Genetics,Inc.)、0.4
μlの50×Advantage KlenTaq ポリメラーゼ混合物(Clontech)、25ngの個々
のハイブリッドクローンまたは対照および全体積を20μlとするためのddH2Oから
成っていた。Each of the 102 PCR reactions contained 2 μl of 10 × KlenTaq PCR reaction buffer (Clontech Labo
ratories, Inc., Palo Alto, Calif., 1.6 μl dNTP mixture (2.5 mM
Each of Perkin-Elmer, Foster City, Calif.), 1 μl sense primer, ZC19960, (SEQ ID NO: 15), 1 μl antisense primer, Z
C19961, (SEQ ID NO: 16), 2 μl of RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0.4
It consisted of μl of 50 × Advantage KlenTaq polymerase mixture (Clontech), 25 ng of individual hybrid clones or controls and ddH 2 O for a total volume of 20 μl.
【0270】
反応物に等しい量の鉱油をオーバーレイし、密閉した。PCRサイクル条件は次
の通りであった:初期の1サイクルの94℃における5分の変性、35サイクルの94℃
における45秒の変性、60℃における45秒のアニーリングおよび72℃における1分
のエクステンション、次いで最後の1サイクルの72℃における7分のエクステンシ
ョン。反応物を2%アガロースゲル(Life Technologies、マリイランド州ガイ
サースバーグ)上の電気泳動により分離した。The reaction was overlaid with an equal amount of mineral oil and sealed. PCR cycle conditions were as follows: initial 1 cycle 5 min denaturation at 94 ° C, 35 cycles 94 ° C.
45 s denaturation at 60 ° C., 45 s annealing at 60 ° C. and 1 min extension at 72 ° C., followed by 7 min extension at 72 ° C. for the last cycle. Reactions were separated by electrophoresis on a 2% agarose gel (Life Technologies, Gaithersburg, Md.).
【0271】
前述したように商業的に入手可能なマウスT31全ゲノム放射線ハイブリッド(W
GRH)を使用して、ネズミzamp4をマウスにおいて染色体14に対してマッピングし
た。センスプライマーZC25,260(配列番号17)およびアンチセンスプライマーZC
25,261(配列番号18)を反応において使用した。この結果は、マウス染色体14
WICGR放射線ハイブリッド地図上のフレームワークマーカーD14Mit156の25.88cR
_3000端部に、ネズミzamp4はマップすることを示す。近接および遠位のフレー
ムワークマーカーは、それぞれ、D14Mit156およびD14Mit31であった。
以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で説明したが、
本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変化および変更が可能である。
したがって、本発明は添付された特許請求の範囲による以外限定されない。As described above, the commercially available mouse T31 whole genome radiation hybrid (W
GRH) was used to map murine zamp4 to chromosome 14 in mice. Sense primer ZC25,260 (SEQ ID NO: 17) and antisense primer ZC
25,261 (SEQ ID NO: 18) was used in the reaction. This result shows that mouse chromosome 14
25.88cR of framework marker D14Mit156 on WICGR radiation hybrid map
At the _3000 end, the mouse zamp4 indicates to map. The proximal and distal framework markers were D14Mit156 and D14Mit31, respectively. As will be appreciated, although particular aspects of the invention have been described for purposes of illustration,
Various changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention.
Therefore, the present invention is not limited except by the appended claims.
【配列表】 [Sequence list]
【図1】
第1図は、保存されたβ−デフェンシンモチーフの3つのジサルファイド結合の
構造を図解する。FIG. 1 illustrates the structure of the three disulfide bonds of the conserved β-defensin motif.
【図2】
第2図は、ネズミβデフェンシン3(Mbdef3)(Bals他、Infect. Immunol. 6
7:3542−7、1999)(配列番号11)およびネズミβデフェンシン4(Mbdef4)遺
伝子バンク受け入れNo. AAD38852(配列番号12)とのzamp3のアミノ酸配列の整
列を示す。システインドメイン内の保存されたシステイン残基の位置を星印「*
」で示す。FIG. 2 shows murine β-defensin 3 (Mbdef3) (Bals et al., Infect. Immunol. 6).
7: 3542-7, 1999) (SEQ ID NO: 11) and murine β-defensin 4 (Mbdef4) gene bank accession No. AAD38852 (SEQ ID NO: 12). The position of a conserved cysteine residue within the cysteine domain is indicated by an asterisk "*".
".
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/15 C12N 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 5/00 A C12P 21/02 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,C H,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM, HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,K G,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT ,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW, MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,S E,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT ,TZ,UA,UG,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ガオ,ゼレン アメリカ合衆国,ワシントン 98052,レ ッドモンド,ワンハンドレッドセブンティ ーナインス プレイス ノースイースト 9502 #3 (72)発明者 ホロウェイ,ジェイムズ エル. アメリカ合衆国,ワシントン 98115,シ アトル,ノースイースト エイティーナイ ンス ストリート 835 (72)発明者 プレスネル,スコット アール. アメリカ合衆国,ワシントン 98407,タ コマ,ノース ピュージェット サウンド アベニュ 2902 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA31 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90Y AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA19 BA20 BA23 CA25 DA42 NA14 ZB322 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA86 EA29 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (51) Int.Cl. 7 Identification Code FI Theme Coat (Reference) C12N 1/15 C12N 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 5/00 A C12P 21/02 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS) , MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU , AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW , MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Gao, Zeren, Washington, USA 98052, Redmond, One Hundred Seventeenth Place Northeast 9502 # 3 (72) Inventor Holloway, James El. Washington, USA 98115, Theatre, Northeast 8th Street 835 (72) Inventor Presnell, Scott Earl. North Puget Sound Avenue 2902 F term (Reference) 4B024 AA01 BA31 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90Y AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 A01 A02 BA20 BA23 CA25 DA42 NA14 ZB322 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA86 EA29 FA74
Claims (17)
リペプチド。1. An isolated polypeptide comprising amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2.
離されたポリペプチド。2. An isolated polypeptide comprising amino acid residue 1 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2.
: a) 配列番号2のアミノ酸残基31〜60から成るポリペプチド、 b) 配列番号2のアミノ酸残基31〜63から成るポリペプチド、 c) 配列番号2のアミノ酸残基23〜60から成るポリペプチド、 d) 配列番号2のアミノ酸残基23〜63から成るポリペプチド、 e) 配列番号2のアミノ酸残基1〜60から成るポリペプチド、 f) 配列番号2のアミノ酸残基1〜63から成るポリペプチド、 g) 配列番号6のアミノ酸残基12〜41から成るポリペプチド、 h) 配列番号6のアミノ酸残基12〜44から成るポリペプチド、 i) 配列番号6のアミノ酸残基1〜41から成るポリペプチド、および j) 配列番号6のアミノ酸残基1〜44から成るポリペプチド。3. A polypeptide selected from the group consisting of the following polypeptides: a) a polypeptide consisting of amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, b) consisting of amino acid residues 31-63 of SEQ ID NO: 2 A polypeptide consisting of amino acid residues 23 to 60 of SEQ ID NO: 2, a polypeptide consisting of amino acid residues 23 to 63 of SEQ ID NO: 2, e) consisting of amino acid residues 1 to 60 of SEQ ID NO: 2 A) consisting of amino acid residues 1 to 63 of SEQ ID NO: 2 g) a polypeptide consisting of amino acid residues 12 to 41 of SEQ ID NO: 6 h) amino acid residues 12 to 44 of SEQ ID NO: 6 I) a polypeptide consisting of amino acid residues 1-41 of SEQ ID NO: 6, and j) a polypeptide consisting of amino acid residues 1-44 of SEQ ID NO: 6.
のポリペプチド。4. The polypeptide of claim 1, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
して 抗体を動物から単離する、 工程を含む、ポリペプチドに対する抗体を産生する方法。5. Inoculating an animal with the polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide elicits an immune response in the animal to produce an antibody and the antibody is isolated from the animal. , A method for producing an antibody against a polypeptide.
ディオタイプ抗体。7. An anti-idiotype antibody that is an antibody that specifically binds to the protein of claim 1.
をコードする単離されたポリヌクレオチド。8. An isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2.
ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。9. An isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising amino acid residue 1 to amino acid residue 63 of SEQ ID NO: 2.
ドをコードする単離されたポリヌクレオチド: a) 配列番号2のアミノ酸残基31〜60から成るポリペプチド、 b) 配列番号2のアミノ酸残基31〜63から成るポリペプチド、 c) 配列番号2のアミノ酸残基23〜60から成るポリペプチド、 d) 配列番号2のアミノ酸残基23〜63から成るポリペプチド、 e) 配列番号2のアミノ酸残基1〜60から成るポリペプチド、 f) 配列番号2のアミノ酸残基1〜63から成るポリペプチド、 g) 配列番号6のアミノ酸残基12〜41から成るポリペプチド、 h) 配列番号6のアミノ酸残基12〜44から成るポリペプチド、 i) 配列番号6のアミノ酸残基1〜41から成るポリペプチド、および j) 配列番号6のアミノ酸残基1〜44から成るポリペプチド。10. An isolated polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of the following polypeptides: a) a polypeptide consisting of amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, b) SEQ ID NO: 2 A) a polypeptide consisting of amino acid residues 31-63 of c), c) a polypeptide consisting of amino acid residues 23-60 of SEQ ID NO: 2, d) a polypeptide consisting of amino acid residues 23-63 of SEQ ID NO: 2, e) a SEQ ID NO: 2) a polypeptide consisting of amino acid residues 1-60, f) a polypeptide consisting of amino acid residues 1-63 of SEQ ID NO: 2, g) a polypeptide consisting of amino acid residues 12-41 of SEQ ID NO: 6, h) a sequence A polypeptide consisting of amino acid residues 12-44 of number 6; i) a polypeptide consisting of amino acid residues 1-41 of SEQ ID NO: 6; and j) a polypeptide consisting of amino acid residues 1-44 of SEQ ID NO: 6.
クレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド: a) 配列番号1のヌクレオチド1〜324から成るポリヌクレオチド。 b) 配列番号1のヌクレオチド10〜198から成るポリヌクレオチド、 c) 配列番号1のヌクレオチド10〜189から成るポリヌクレオチド、 d) 配列番号1のヌクレオチド76〜198から成るポリヌクレオチド、 e) 配列番号1のヌクレオチド76〜189から成るポリヌクレオチド、 f) 配列番号1のヌクレオチド100〜198から成るポリヌクレオチド、 g) 配列番号1のヌクレオチド100〜189から成るポリヌクレオチド、 h) 配列番号5のヌクレオチド1〜296から成るポリヌクレオチド、 i) 配列番号5のヌクレオチド1〜132から成るポリヌクレオチド、 j) 配列番号5のヌクレオチド1〜123から成るポリヌクレオチド、 k) 配列番号5のヌクレオチド34〜123から成るポリヌクレオチド、および l) 配列番号5のヌクレオチド34〜132から成るポリヌクレオチド。11. An isolated polynucleotide encoding a polynucleotide selected from the group consisting of the following polynucleotides: a) A polynucleotide consisting of nucleotides 1-324 of SEQ ID NO: 1. b) a polynucleotide consisting of nucleotides 10 to 198 of SEQ ID NO: 1 c) a polynucleotide consisting of nucleotides 10 to 189 of SEQ ID NO: 1 d) a polynucleotide consisting of nucleotides 76 to 198 of SEQ ID NO: 1 e) SEQ ID NO: 1 F) a polynucleotide consisting of nucleotides 100 to 198 of SEQ ID NO: 1, g) a polynucleotide consisting of nucleotides 100 to 189 of SEQ ID NO: 1, h) a nucleotide of 1 to 296 of SEQ ID NO: 5 I) a polynucleotide consisting of nucleotides 1-132 of SEQ ID NO: 5, j) a polynucleotide consisting of nucleotides 1-123 of SEQ ID NO: 5, k) a polynucleotide consisting of nucleotides 34-123 of SEQ ID NO: 5, And l) a polynucleotide consisting of nucleotides 34 to 132 of SEQ ID NO: 5.
ー: 転写プロモーター、 請求項1に記載のタンパク質をコードするDNAセグメント、および 転写ターミネーター。12. An expression vector comprising the following operably linked factors: a transcription promoter, a DNA segment encoding the protein of claim 1, and a transcription terminator.
れた分泌シグナル配列をさらにコードする、請求項12に記載の発現ベクター。13. The expression vector of claim 12, wherein the DNA segment further encodes a secretory signal sequence operably linked to the protein.
ノ酸残基22の配列を有するポリペプチドである、請求項13に記載の発現ベクター
。14. The expression vector according to claim 13, wherein the secretory signal sequence is a polypeptide having a sequence of amino acid residues 1 to 22 of SEQ ID NO: 2.
Aセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現する培養された細胞。15. The DN vector into which the expression vector according to claim 12 has been introduced.
A cultured cell expressing the polypeptide encoded by the A segment.
、 これにより前記細胞は前記DNAセグメントによりコードされる前記ポリペプチ
ドを発現し、そして 前記発現されたポリペプチドを回収する、 工程を含む、タンパク質を製造する方法。16. Culturing cells into which the expression vector of claim 12 has been introduced, whereby the cells express the polypeptide encoded by the DNA segment and recover the expressed polypeptide. A method for producing a protein, comprising:
ドの治療的に有効な量を哺乳動物に投与することを含む、微生物に関係する疾患
を治療する方法: a) 配列番号2のポリペプチド、 b) 配列番号6のポリペプチド、 c) 配列番号2のアミノ酸残基23〜63から成るポリペプチド、 d) 配列番号2のアミノ酸残基31〜60から成るポリペプチド、および e) 配列番号6のアミノ酸残基12〜40から成るポリペプチド、 これにより、前記ポリペプチドは前記疾患を軽減する。17. A method of treating a microbial-related disease, comprising administering to a mammal a therapeutically effective amount of a polypeptide selected from the group consisting of the following polypeptides: a) SEQ ID NO: 2 B) the polypeptide of SEQ ID NO: 6, c) the polypeptide of amino acid residues 23-63 of SEQ ID NO: 2, d) the polypeptide of amino acid residues 31-60 of SEQ ID NO: 2, and e) A polypeptide consisting of amino acid residues 12-40 of SEQ ID NO: 6, whereby the polypeptide reduces the disease.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US42836199A | 1999-10-28 | 1999-10-28 | |
US09/428,361 | 1999-10-28 | ||
PCT/US2000/029397 WO2001030846A1 (en) | 1999-10-28 | 2000-10-25 | Beta-defensins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003512828A true JP2003512828A (en) | 2003-04-08 |
Family
ID=23698566
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001533843A Pending JP2003512828A (en) | 1999-10-28 | 2000-10-25 | Beta-defensin |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1224219A1 (en) |
JP (1) | JP2003512828A (en) |
AU (1) | AU1230501A (en) |
CA (1) | CA2389256A1 (en) |
WO (1) | WO2001030846A1 (en) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2303421C (en) * | 1997-09-10 | 2005-07-12 | Zymogenetics, Inc. | Beta-defensins |
-
2000
- 2000-10-25 WO PCT/US2000/029397 patent/WO2001030846A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-10-25 AU AU12305/01A patent/AU1230501A/en not_active Abandoned
- 2000-10-25 CA CA002389256A patent/CA2389256A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-25 EP EP00973839A patent/EP1224219A1/en not_active Withdrawn
- 2000-10-25 JP JP2001533843A patent/JP2003512828A/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU1230501A (en) | 2001-05-08 |
EP1224219A1 (en) | 2002-07-24 |
CA2389256A1 (en) | 2001-05-03 |
WO2001030846A1 (en) | 2001-05-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20060223987A1 (en) | Novel beta-defensins | |
WO2002020651A2 (en) | Human phermone polypeptide | |
CA2303421C (en) | Beta-defensins | |
JP2003512828A (en) | Beta-defensin | |
JP2003527099A (en) | Follistatin-related protein ZFSTA4 | |
WO2002018571A2 (en) | Human phermone polypeptides | |
US20020161203A1 (en) | Rattlesnake venom gland proteins | |
US20030157686A1 (en) | Rattlesnake venom gland proteins | |
JP2002541846A (en) | Adipocyte complement-related protein homolog ZACRP2 | |
US20040058354A1 (en) | Mammalian alpha-helical protein-53 | |
US20020160487A1 (en) | Testis specific transcription factor ZGCL-1 | |
JP2002525100A (en) | Secreted protein 48 | |
JP2001511345A (en) | Secreted protein encoded by human chromosome 13 | |
JP2003500054A (en) | Secreted alpha helix protein-32 | |
US20020197699A1 (en) | Secreted protein ZCMP2 | |
JP2004526446A (en) | Mammalian α-helix protein-53 | |
US20030032778A1 (en) | New member of the human syntaxin/epimorphin family | |
MXPA01007159A (en) | Zlrr3:a human leucine-rich repeat protein | |
EP1326979A2 (en) | Human cyclic nucleotide binding protein | |
JP2003504022A (en) | Secreted protein ZACRP4 | |
CA2432785A1 (en) | Seleno-cysteine containing protein zsel1 | |
WO2001042466A2 (en) | Zvwf1: a member of the von willebrand factor type a domain superfamily |