JP2003512038A - 肥満に関連した遺伝子および肥満に関連した遺伝子を使用するための方法 - Google Patents

肥満に関連した遺伝子および肥満に関連した遺伝子を使用するための方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は肥満に関連した遺伝子に関する。さらに、本発明は、肥満を診断および処置するために、ならびに肥満の処置に有用な化合物についてスクリーニングするために、肥満に関連したこれらの遺伝子の差次的な発現を使用する方法を提供する。本発明の方法は、ＯＢ１〜６からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現可能な細胞を含む試験細胞集団を、被験体から提供する工程、試験細胞集団における核酸配列の１つ以上の発現を検出する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的に、肥満に関連した遺伝子およびこのような遺伝子を使用す
る肥満を検出および調節するための方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 肥満は、高度に可変性の原因および複雑性を有する複雑な表現型である。レプ
チン機能の喪失から生じる肥満が、別のアプローチに対して屈折しているが、１
つの治療学的アプローチの影響を受けやすい異なった質を有し得ることが可能で
ある。肥満は、米国において最も流行した代謝性障害であり、直接的および間接
的費用において、３００，０００の生命および７００億ドルの推定費用で、３５
％の成人の健康状態に影響を与えている。過体重または肥満であると考えられ得
る子供の数の増加に起因して、これは流行病として増加している。肥満は、過度
の体脂肪として定義され、そして、しばしば、健康の有意な機能障害を生じる。
ヒトの体重における脂肪細胞サイズまたは数が、１つ以上の数の物理的および生
理学的障害を生じ得るレベルまで増加する場合、肥満が生じる。通常のサイズの
ヒトは、３００億と３５億の間の脂肪細胞を有する。ヒトの体重が増える場合、
これらの脂肪細胞は、まずサイズが増加し、次いで、数が増加する。肥満は、遺
伝子的、代謝的、生化学的、生理学的および行動性因子によって影響される。こ
のように、永続するポジティブ臨床結果を達成するためにいくつかの領域につい
て伝えられなければならないのは、複合障害である［１〜３］。
【０００３】 肥満の個体は、二型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、高血圧、冠状心疾患、高コレステ
ロール血、変形性関節症、胆石、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸を含む病気
になりがちである。睡眠時無呼吸は、発作および心発作のより高い発生率と相関
する睡眠の間の無呼吸のエピソードを含み、臨床的な肥満なかで肥満関連の罹患
率および死亡率に貢献する２つの他の因子を含む［１、２］。
【０００４】 非薬学的な処置から薬学的な処置までのいくつかの十分に確立された肥満処置
形態が公知である。非薬学的な処置としては、食物消費を減少するかまたはリポ
サクションのような脂肪を除去するための食事、運動、精神的処置、および外科
的処置が挙げられる。食欲抑制剤およびエネルギー消費または栄養分改変薬剤が
、薬理学的処置の主な焦点である。デキスフェニフルアミン（Ｒｅｄｕｘ）およ
びサブトラミン（Ｍｅｒｄｉａ）およびβ３−アドレナリン作用性アゴニストお
よびオリスタット（Ｘｅｎｉｃａｌ）は、このような薬理学的処置の例である［
４］。
【０００５】 （発明の要旨） １つの局面において、本発明は、被験体における肥満処置の効率を評価する方
法を含み、ここで、この方法は、１つ以上のＯＢ１〜６核酸配列を発現可能な試
験細胞集団を提供する工程；１つ以上のこれらの核酸配列の発現を検出する工程
；肥満段階が公知である参照細胞集団における核酸配列の発現とこの発現を比較
する工程；および存在する場合、試験細胞集団と参照細胞集団との間の発現レベ
ルにおける差異を同定する工程を包含する。種々の実施形態において、被験体は
、哺乳動物であり得るかまたは好ましくはヒトであり得る。なお別の実施形態に
おいて、この方法は、ＯＢ：１〜６核酸配列の２つ、４つ、６つ、またはそれ以
上の比較を含む。他の実施形態において、インビトロで、哺乳動物被験体からエ
キソビボで、または哺乳動物被験体中のインビボで、試験細胞集団は、提供され
得る。
【０００６】 別の局面において、本発明は、被験体における肥満を処置するための試験治療
剤を同定する方法を含み、１つ以上のＯＢ１〜６核酸配列を発現可能な試験細胞
集団を提供するための工程；試験治療剤と試験細胞集団とを接触させる工程；こ
れらの核酸配列の１つ以上の発現を検出する工程；肥満段階が公知である参照細
胞集団における核酸配列の発現とこの発現とを比較する工程；ならびに存在する
場合、試験細胞集団と参照細胞集団との間の発現レベルにおける差異を同定する
工程を包含する。異なった実施形態において、この被験体は哺乳動物、またはよ
り好ましくは、ヒトであり得る。さらに、試験治療剤は、公知の抗肥満剤または
未知の抗肥満剤のいずれかであり得る。試験治療剤が公知の抗肥満薬剤である場
合、例えば、デキスフェニフルアミン、シブトラミン、β３−アドレナリン作用
性アゴニスト、およびオリスタット（ｏｌｉｓｔａｔ）であり得る。
【０００７】 別の局面において、本発明は、レプチン誘導性核酸配列を同定する方法を包含
し、ここで、この方法は、肥満段階が公知である被験体から試験集団を提供する
工程；試験細胞集団によって発現される１つ以上の核酸配列の発現を測定する工
程；試験細胞集団における核酸配列の発現を、試験細胞集団として、逆の肥満段
階を有する参照細胞集団における発現と比較する工程；存在する場合、試験およ
び参照細胞集団において差次的に発現される核酸を決定する工程；レプチンを両
方の集団に添加する工程；レプチン処置後に核酸配列の発現を比較する工程；な
らびに存在する場合、２つの集団間の発現レベルでの差異を同定する工程を包含
する。
【０００８】 さらなる局面において、本発明は、被験体における肥満に対する罹患性を同定
または決定する方法を包含する。この局面において、本発明は、１つ以上のＯＢ
１〜６核酸配列を発現可能な試験細胞集団を提供する工程；これらの核酸配列の
１つ以上の発現を検出する工程；肥満段階が公知である参照細胞集団中の核酸配
列の発現とこの発現とを比較する工程；ならびに存在する場合、試験細胞集団と
参照細胞集団との間の発現レベルにおける差異を同定する工程を包含する。被験
体は、哺乳動物であり得、またはより好ましくは、ヒトであり得る。
【０００９】 代替的な局面において、本発明は、１つ以上のＯＢ：１〜６核酸配列の発現ま
たは活性を調節する薬剤を、肥満に罹患するかまたは肥満を発症する危険性があ
る患者に投与することによって肥満を処置する方法を包含する。この薬剤は、Ｏ
Ｂ；１、２、および４〜６の１つ以上の発現を減少させる薬剤であり得る。ある
いは、この薬剤は、ＯＢ：３の発現を増加させる薬剤であり得る。さらに、この
薬剤は、ＯＢ核酸配列、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、または別の薬物に
よってコードされるポリペプチドに対する抗体であり得る。
【００１０】 本発明はまた、ＯＢ：１〜６核酸配列の２つ以上を検出するための１つ以上の
試薬を含むキットを含む。さらに、本発明は、２つ以上のＯＢ：１〜６核酸を検
出可能なプローブ核酸のアレイを含む。
【００１１】 配列番号１に少なくとも７５％同一である単離された核酸分子、または、核酸
配列の相補体、ならびにベクターおよびこの核酸配列を含む宿主細胞がまた、本
発明に含まれる。
【００１２】 別の局面において、本発明は配列番号１の核酸配列にコードされるポリペプチ
ドに少なくとも８０％同一である単離されたポリペプチド、またはそのフラグメ
ント、誘導体、アナログ、もしくはホモログを含む。さらに、本発明はまた、こ
のポリペプチド、フラグメント、誘導体、アナログ、および／またはホモログに
対する抗体を含む。
【００１３】 なおさらなる局面において、本発明は、単離された核酸または単離されたポリ
ペプチドのいずれかを含む薬学的組成物を含む。別の局面は、核酸およびポリペ
プチドの存在を検出する方法を含む。
【００１４】 さらに、本発明のポリペプチドおよび核酸を使用して、被験体における肥満を
処置し得る。肥満を処置するために使用される場合、ポリペプチドおよび核酸の
発現状態が調節される（すなわち、レプチンによって、上流制御されるかまたは
下流制御される）。肥満の処置は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて存在し得
る。
【００１５】 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は
、本発明が所属する当業者によって一般的に理解されるような同一の意味を有す
る。本明細書中に記載される方法および材料と類似しているかまたは等価である
方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方
法および材料を以下に記載する。本明細書中で述べられた全ての刊行物、特許出
願、特許、および他の参考文献は、それら全体が参考文献として援用され得る。
コンフリクトの場合には、本発明の明細書（定義を含む）が制御する。さらに、
物質、方法、および実施例は、例示の目的のみであって、制限されることは意図
しない。
【００１６】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかである。
【００１７】 （発明の詳細な説明） 遺伝的性質が肥満の性質および程度を決定する際に影響力があるという、強力
な証拠を提供してきた。動物において真実であることが、ヒトについて真実でな
いかもしれないが、肥満度指数（ＢＭＩ、重量および身長に相関する肥満の測定
）における４０〜８０％の変化は、遺伝的因子に起因する［２、５］。ヒト肥満
は、一般的にメンデルの遺伝パターンに従わないが［６］、それに従ういくつか
のげっ歯類モデルが存在する［６、７］。ヒト肥満は、複雑な形質であるので、
げっ歯類における単一変異が、大多数の肥満ヒトにおける原因を例示し得ないと
いうことは驚くべきことではないが、げっ歯類において見出される肥満と類似し
て遺伝的破壊を有するヒトの例が存在する［８、９］。さらに、複雑な表現型に
ついての動物モデル（高血圧および発作など）は、また肥満である。従って、こ
れらの動物は、ヒト肥満の複雑性を理解するためのより有力なモデルであり得る
［１０〜１２］。
【００１８】 肥満のいくつかのげっ歯モデルは、単一の遺伝子破壊の遺伝を生じる。マウス
において十分に特徴付けられているが、あるにしても、ヒトにおいてかろうじて
観察される、一遺伝子の肥満症候群は以下を含む：肥満（ｏｂ）および満腹因子
レプチンの翻訳の異常な終了。レプチンレセプターの変異は、肥満糖尿病マウス
（ｄｂ）を生じ、そして、Ａｇｏｕｔｉ（Ａｙ）は、肥満である被覆カラー変異
体である。皮膚において正常にのみ発現されるが、変異動物において、この遺伝
子は、遍在的に発現され、そして、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の結合
と拮抗し得る。ＭＳＨは、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）に由来し、プロホ
ルモンプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）のタンパク質分解性のプロセシン
グより生じる主要なホルモンである。脂肪表現型は、視床下部のプロホルモン変
換酵素カルボキシペプチダーゼＥにおける変異の結果である。この最も十分に特
徴付けされていない肥満マウス変異体が、ｔｕｂである。ｔｕｂは、神経ペプチ
ドＹ（ＮＰＹ、食欲刺激ホルモン）およびＰＯＭＣのような視床下部の神経ペプ
チドホルモンのプロセシングに影響し得る細胞質タンパク質をコードする［６、
７、１３、１４］。
【００１９】 最近、肥満についてのいくつかのマウスモデル、特にＡ∧ｙのモデルについて
類似した表現型を有するＰＯＭＣノックアウト変異体が報告された。このＰＯＭ
Ｃノックアウトは、それらの副腎腺のあきらかな形態学的な非存在に起因する、
初期での肥満の開始を有し、そして、黄色の毛、ならびに、副腎不全を有する。
これらの動物において検出可能なコルチコステロンは存在せず、そして、コルチ
コステロンは、食料摂取量を増加するので、これらのノックアウトマウスが肥満
であることは驚くべきことである。これらのマウスにおける肥満表現型は、α−
ＭＳＨ（ＰＯＭＸに由来するペプチドホルモン）で処理され得る［１５］。
【００２０】 この肥満（ｏｂ）マウスモデルは、一遺伝子であるが、肥満の原因であるかま
たは肥満の結果のいずれかである代謝性障害に罹患するヒトにおいて観察され得
る表現型に類似した複雑な表現型を示す。ｏｂマウス（ｏｂ／ｏｂ）は、レプチ
ンを使用する処置に対して応答性である、大いに肥満の表現型を有するレクチン
が欠失した動物である。ｏｂ／ｏｂマウスの効率が良いやせ（ｏｂ／＋または＋
／＋）同胞は、レプチン処置に対して、応答性ではない。このマウスモデルにお
いて観察される肥満はまた、ヒトにおいて観察され得る肥満に生理学的な結果を
明らかにする。レプチン欠失に起因する肥満は、ヒトにおいて非常にまれであり
、そして、ｏｂマウスについて記録された罹患性に類似していることが観察され
ている。ｏｂマウスにおけるこのレプチン欠失は、極端な初期開始肥満を生じる
。肥満のこのモデルは、内分泌、シグナル伝達、および肥満に関与する代謝経路
を研究するための手法を提供し得る。レプチンによって調節されるシグナル伝達
分子の同定は、レプチン発現、ことによると、肥満および肥満誘導性障害を処置
するための治療学的処置のための新規の手段を同定することを調節するための手
がかりを付与し得る。
【００２１】 他の動物モデル（ｆａ／ｆａ（脂肪性の）ラットを含む）は、ｏｂ／ｏｂおよ
びｄｂ／ｄｂマウスの両方に対して多数の類似性を有する。しかし、１つの差異
は、ｆａ／ｆａラットは、寒さに対して非常に感受性であるが、震えない熱産生
のそれらの能力は正常である。熱産生および代謝が、内分泌学的に密接に連結さ
れていることが十分に証明されている。鈍磨（冬眠および嗜眠に類似した状態）
は、マウス変異体におけるよりもｆａ／ｆａラットにおける肥満の維持において
大きな役割を果たすようである。さらに、いくつかの砂漠げっ歯類（例えば、ト
ゲネズミ）は、それらの天然の生息地において肥満とはならないが、標準的な実
験室給餌で食料を与えられる場合、肥満となる［１６］。
【００２２】 肥満マウス、ｏｂ／ｏｂ、およびそのヘテロ接合体（ｏｂ／＋）、非肥満、同
胞の下垂体における遺伝子発現に関するレプチン処置の効果を研究した。満腹因
子レプチンは、血清におけるレベルが一般的に脂肪組織の量に比例する、分泌さ
れたホルモンである。しかし、このことは、このタンパク質の排他的な供給源で
はない。なぜなら、それはまた、特定の生理学的条件下で、筋肉および胃によっ
て分泌され得る。レプチンは、給餌後の血中に存在するグルコサミンのレベルの
上昇に応答して、筋肉および脂肪によって分泌される［１７］。胃は、ホルモン
コレシストキニンに対して応答性のレプチンを分泌し、これは、腸管におけるタ
ンパク質および脂肪の存在に膵臓に応答して分泌される［１８、１９］。
【００２３】 ホルモンレプチンの非存在は、食欲、食料摂取量および肥満の劇的な増加をも
たらす。レプチンは、そのレセプターに結合し、そのレセプターは、視床下部お
よび脳の他の領域において見出されない。この結合は、食料摂取量、エネルギー
消費、グルコース代謝、および脂肪代謝の調節を生じる。レプチンはまた、動物
の免疫競合に影響を与えることが公知であって、そして、ｏｂ／ｏｂマウスは、
比較的繁殖が困難であり、免疫系［２０］および生殖行動［２１］の両方に対す
る影響を示唆する。レプチンはまた、血管形成活性を有することが観察され、脳
におけるこれら以外の他の細胞型が、レプチンレセプターのシグナル伝達を介し
て間接的にレプチンに応答し得、このレセプターは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル
経路を利用するレセプターのサイトカインファミリーのメンバーである［２２、
２３］。
【００２４】 体組成物を維持することに関与している末梢器官の機能に対してレプチンが与
える影響のいくらかは、レプチンと標的組織上のそのレセプターとの直接相互作
用を介して媒介され、そして、いくつかの効果が、第２のホルモンおよび神経経
路を介して間接的に媒介される。レプチンの急性心室投与は、視床下部の関連領
域内で、ＳＴＡＴシグナル経路を活性化し、食欲不振を起こすホルモンの発現を
誘導し、そして、食料摂取量を抑制する（レプチンの中心的な効果に関する総説
については、Ｅｌｍｑｕｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
１（６）：４４５−５０（１９９８）およびＫａｌｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ
Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０（１）：６８−１００（１９９９）を参照のこと）。中
心的な効果を指向することに加えて、レプチンは、食料摂取量における減少に独
立しているように見える末梢効果を有する。この第１の徴候の１つは、肥満のげ
っ歯類の体重の喪失が、レプチンを処理した群に与えられたマウスのつがいにみ
られる喪失を過度に超えるものであったという観察に由来する。Ｌｅｖｉｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（４）：１７２６−３０
（１９９６）を参照のこと。レプチンの末梢性効果は、視床下部変化および標的
組織に対する直接作用を介して媒介される両方の間接効果を含むようである。広
範に理解されるレプチンの代謝性効果に加えて、このホルモンはまた、稔性、血
管形成、および免疫応答に影響を与えるようである。レプチンの末梢効果に関す
る最近の総説については、参考文献を参照のこと。Ｃａｗｔｈｏｒｅｎｅら、Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
５７（３）：４４９−５３（１９９８）およびＨｏｕｓｅｋｎｅｃｈｔら、Ｊ．
Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ．７６（５）：１４０５−２０（１９９８）を参照のこと
。
【００２５】 さらに、代謝産物の調節において、下垂体の役割について多数の証拠（視床下
部および副腎腺（視床下部−下垂体−副腎軸、ＨＰＡ）のような他の内分泌性器
官と組み合わせて）が存在する。下垂体機能不全は、１つ以上の下垂体ホルモン
の減少したかまたは消失した分泌によって明らかとなる。この結果は、広範にわ
たり、そして、下垂体機能不全の性質に依存する。減少したかまたは消失したＡ
ＣＴＨ（プロオピロメラノコルチン（ＰＯＭＣ）由来のペプチドホルモン）の分
泌が存在する場合では、患者は、体重の喪失および節食障害を含む症状を示す。
下垂体ホルモンの分泌過多（例えば、クッシング病におけるＡＣＴＨ分泌下垂体
腺）で観察されるように、多数の他の欠失と同様に、肥満、高血圧および糖尿病
の徴候を含む［２４］。
【００２６】 最近まで、肥満を生じるプロセスにおいて原因となるヒトにおける遺伝子は見
出されていなかった。同定されてきたのは、肥満についてのいくつかの動物モデ
ルにおける遺伝子に類似している遺伝子であり、そして、ヒト集団において観察
される肥満に対する有意な貢献を示さない。しかし、体重および体組成物に影響
する障害（肥満を含む）の重症度および罹患率を考えると、このような体重障害
−原因遺伝子の全身的同定についての大きな必要性が存在する。この必要性を伝
えることが特に困難である。なぜなら、ヒトにおける肥満は、複雑、多因子性、
慢性疾患であり、生理学的、代謝的、細胞性、分子性、社会性、および行動的影
響によって影響される表現型に発展し得るためである［２］。
【００２７】 体内組成物の調製を担ういくつかの遺伝子およびレプチンの末梢効果は公知で
ある。新規遺伝子のプロファイリング技術を使用して、肥満および外因性レプチ
ンを用いた処置の両方に応答した下垂体、視床下部、脂肪、筋肉および肝臓で生
じる遺伝子発現変化が特徴付けられた。次いで、これらの差異が、その発現が肥
満およびレプチン処理による少なくとも部分的な標準化によって変更される遺伝
子の同定を可能にするために、重ねられた。このプロセスを用いて、下垂体で発
現される６個の肥満およびレプチン応答配列が同定された。この配列は、分泌分
子（分泌ホルモンのプロセシングに関与する）であるか、またはおそらくタンパ
ク質分泌に関与するかのいずれかであるポリペプチドをコードする。この結果は
また、ＡＣＴＨが、レプチンを含む調節ループに関与され得ることを示す。
【００２８】 遺伝子発現変化は、さる１０年間に、生理学的プロセスに関与し得る遺伝子を
同定するために広範に使用されてきた。これらには、デファレンシャルディスプ
レイ（Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７（５０７２）：９６７−７１（１
９９２）を参照のこと）、ＲＤＡ（代表差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏ
ｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ））（Ｌｉｓｉｔｓｙｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９（５０９７）：９４６−５１（１９９３）を参照のこと
）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７０（５２３５）：４４８４−８７（１９９５）を参照のこと）、およ
びより近年のアレイベースの技術（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０（
５２３５）：４６７−７０（１９９５）を参照のこと）が挙げられる。これらの
手段の近年の総説に関しては、（Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．−−補遺３０−３１：２８６−９６（１９９８））を参照のこと。これら
の技術の全ては、有用であることが証明されているが、サンプル間の小さな差異
を再現可能に検出する能力、サンプルにされ得る異なるｍＲＮＡ種の数、および
複数を独立で比較する能力に関して制限を有する。
【００２９】 細胞株間でその転写レベルが変動する遺伝子は、米国特許第５，８７１，６９
７号およびＳｈｉｍｋｅｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１７：７９８−８０３（１９９９）に記載されるように、ＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮ
ＧＴＭデファレンシャル発現分析を用いて同定された。これらの特許および刊行
物の内容は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００３０】 Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１
９８−８０３に記載されるような、未標識オリゴヌクレオチドヌクレオチド競合
アッセイが使用されて、差次的に発現された配列の同一性が確認された。
【００３１】 本発明は、ｏｂマウス対そのやせの同胞におけるレプチン処理で、反対の方向
に調節される遺伝子の同定に基づく。例えば、遺伝子がやせの個体に比べて、肥
満個体においてアップレギュレートされた場合、この遺伝子は、目的の遺伝子で
ある（ただし、レプチン処理は、この遺伝子のダウンレギュレーションを引き起
した）。しかし、なお目的のものであるこの遺伝子に関して、レプチンを用いた
処理後のやせのマウスでは、やはり調節はない。
【００３２】 差次的に発現される遺伝子を同定するために、以下の比較がなされた： Ａ）肥満／レプチン 対 肥満／ビヒクル Ｂ）やせ／レプチン 対 やせ／ビヒクル Ｃ）肥満／ビヒクル 対 やせ／ビヒクル 使用されたビヒクルは、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）であった。
【００３３】 目的の発現パターンは、以下であった： Ａ：Ｂ：Ｃが、アップレギュレート：変化なし：ダウンレギュレートのパ
ターンに調節された Ａ：Ｂ：Ｃが、ダウンレギュレート：変化なし：アップレギュレートのパ
ターンに調節された。
【００３４】 このディファレンシャル発現分析の結果は、表１に示される。同定されたバン
ドのうち、その発現レベルが異なった６個の核酸配列を、さらなる特徴付けのた
めに選択した。これらの配列は、本明細書中にＯＢ：１〜６と称される。分析さ
れたＯＢ配列の要約は、表２に示される。
【００３５】 １つの配列（ＯＢ６）は、新規遺伝子を表す。同定された他の配列は、以前に
記載されている。
【００３６】 提供されたＯＢ配列に関して、その発現は、本明細書中に記載される方法にお
いて、関連する核酸配列のいずれかを用いて測定された。以前記載された配列（
ＯＢ：１〜５）に関して、データベース登録番号が提供される。この情報は、当
業者がＯＢ核酸配列の発現を検出および測定するのに必要である情報を推定する
ことを可能にする。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】 以下は、レプチン処置に応答してその発現が差次的に発現される核酸配列の更
なる論議である。
【００３９】 （ＯＢ１） ＯＢ１は、肥満マウスでレプチン処置後ダウンレギュレートされた。Ｋｅｘ２
／ＰＣ２は、レプチンに応答して調節されることが見出され、結果は、ＴａｑＭ
ａｎ分析により確認された。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉｅａ中のＫｅｘ２は、対になった塩基性アミノ酸の後を切断する特異性を有す
るズブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ（ＳＰＣ）ファミリーの膜貫通Ｃ
ａ２＋依存性セリンプロテアーゼである。定常状態で、Ｋｅｘ２は、後期ゴルジ
区画中に優先的に局在化し、そして遠位の分泌経路を通過するプロタンパク質前
駆体のタンパク質分解による成熟を開始する。しかし、Ｋｅｘ２局在化は、静的
ではなく、そしてその道程は、その生涯の間に、見かけ上、後期ゴルジからの運
搬およびゴルジ後エンドソーム区画からの周期的バックを含む［２８］。これが
、Ｋｅｘ２／ＰＣ２の哺乳動物相同体についても真実である場合、そのときは、
これは、この分子が小分子治療の標的であるのみならず、抗体治療法の標的でも
あることを示唆する。抗体は、細胞内区画に到達し得、そしてＰＯＭＣプロセッ
シングの部位においてこのプロテアーゼを中和し得る。
【００４０】 従って、ＰＯＭＣのその派生するペプチドホルモンへのプロセッシングの原因
であるＫｅｘ２／ＰＣ２プロテアーゼ、特にＡＣＴＨは、最も少なく見ても、適
格な薬物標的である。この遺伝子は、小分子治療法が同定され得るクラスに入る
。ＰＯＭＣノックアウトマウス中で観察されるのとは反対の様式で、その基質と
ともに肥満症に応答して調節されることが新たに発見された。
【００４１】 多くのペプチドホルモンおよび神経ペプチドは、より大きな不活性前駆体から
、通常、対になった塩基性残基（主にＬｙｓ−ＡｒｇおよびＡｒｇ−Ａｒｇ）に
より、場合によっては、１つの塩基性残基（主にＡｒｇ）によりマークされる部
位におけるエンドタンパク質分解により産生される。１つのアルギニン部位およ
び二塩基性部位における前駆体切断は、Ｋｅｘ２様プロセッシングエンドプロテ
アーゼにより触媒され得る。Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６７（２３）：１６３３５−４０（１９９２）。２つの哺乳動物遺伝子産物ＰＣ
２およびＰＣ３が、酵母前駆体プロセッシングエンドプロテアーゼＫｅｘ２の触
媒ドメインに対するそれらの触媒ドメインの構造的類似性を基に、候補の神経内
分泌前駆体プロセッシング酵素として提案されている。これら２つのプロテアー
ゼは、哺乳動物細胞の分泌経路中のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）を切
断し得る。Ｔｈｏｍａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ
８８（１２）：５２９７−３０１（１９９１）。Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２３）：１６３３５−４０（１９９２）、Ｔｈｏｍａ
ｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８（１２）：５２９
７−３０１（１９９１）を参照のこと。
【００４２】 （ＯＢ２） ＯＢ２は、肥満マウスでレプチン処置後ダウンレギュレートされた。ＰＯＭＣ
は、Ｋｅｘ２／ＰＣ２によってタンパク質分解的にプロセッシングされ、とりわ
けペプチドホルモンＡＣＴＨを生成する。ＰＯＭＣおよびＫｅｘ２／ＰＣ２の両
方は、レプチンに応答して同時調節され、結果は、ＴａｑＭａｎ分析により確認
された。ＰＯＭＣは切断されて、アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）および
βリポトロピン（ＬＰＨ）を生じ得る。ヒトβＬＰＨは切断されて、βエンドル
フィン（１−３１）およびβエンドルフィン（１−２９）、βエンドルフィン（
１−２８）、γＬＰＨ、およびβメラノサイト刺激ホルモンを生じ得る。ウシＮ
−ＰＯＭＣ１−７７は切断されて、γ３メラノサイト刺激ホルモンを生じ得る。
Ａｚａｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１６）：１１９６８−７
５（１９９３）。ＰＯＭＣノックアウトは、黄色の毛色を含む、Ａｇｏｕｔｉ＾
ｙ様表現型をもつ肥満マウスを生じる。さらに、これらのマウスは、副腎をもた
ず、そしてコルチコステロンを産生しない。副腎がないことを除いて、この表現
型は、ＰＯＭＣプロセッシングの産物であるＭＳＨの投与で逆にできる。Ａｚａ
ｒｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１６）：１１９６８−７５（１
９９３）、Ｙａｓｗｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（９）：１０６６−７０（１９
９９）を参照のこと。
【００４３】 雄および雌両方のｏｂ／ｏｂマウスの、レプチンを用いた処置は、視床下部Ｐ
ＯＭＣ ｍＲＮＡを約３倍に刺激した。これらの結果は、ＰＯＭＣ切断の別の産
物であるαＭＳＨに対する生産、プロセッシング、または応答性が損なわれてい
ないことが肥満症の共通特徴であることを示唆した。これはまた、レプチンによ
り刺激された視床下部ＰＯＭＣニューロンが、レプチンとメラノコルチン系との
間のリンクを構成し得ることを示唆した。Ｍｉｚｕｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
４７（２）：２９４−９７（１９９８）。
【００４４】 ＰＯＭＣプロホルモンコンバターゼは、小分子薬物標的として重要であり得る
。ＰＯＭＣおよびＫｅｘ２／ＰＣ２が同時調節される様式は、レプチンに対する
これら２つの分子のダウンレギュレーションが、肥満表現型の一部または全体の
損失を生じることを示唆する。
【００４５】 （ＯＢ３） ＯＢ３（プロラクチン）の発現レベルは、レプチン処置に応答してアップレギ
ュレートされることが見出された。この結果はＴａｑＭａｎ分析により確認され
た。プロラクチン（ＰＲＬ）は、脳下垂体前葉により分泌される１９８アミノ酸
のペプチドホルモンである。このＵＴＲの５２アミノ酸フラグメントはレプチン
の添加により調整されると同定された。完全長のクローニングは、このフラグメ
ントがＰＲＬと結合していることを決定した。ＰＲＬは、妊娠の間に存在するが
、その影響は、他のホルモンの作用により鈍くなる。ＰＲＬは、出産後のエスト
ロゲンおよびプロゲステロンの減少に応答して授乳を刺激する。ヒトにおける高
プロラクチン血症は、性機能亢進に至る。女性では、高プロラクチン血症は、排
卵に影響し、そして最終的には赴任を生じる。同様に、男性における高プロラク
チン血症は、低下した精子形成能の結果として、低下したテストステロンレベル
によりもたらされる生殖不能に至る。Ａｒｏｎ、Ｄ．、Ｊ．Ｆｉｎｄｌｉｎｇお
よびＪ．Ｔｙｒｅｌｌ、視床下部＆脳下垂体、Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｇｙ、Ｆ．ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＧ．Ｓｔｒｅｗｌｅ
ｒ、編者、１９９７、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ：Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ
．１０８−９頁。
【００４６】 血清レプチンレベルは、授乳女性の１つの研究では、プロラクチンとは負に相
関した。ＵＩ：９７１７６７２０。マウスを用いた別の研究では、プロラクチン
分泌が、用量関連様式で大いに増加したことが見出されたが、１０−７〜１０− ５ のレプチン濃度でのみであった。Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９４（３）：１０２３−２８（１９９７）。
【００４７】 プロラクチンは生殖に重要である。最近の刊行物は「プロラクチンおよび生殖
およびレプチン」にある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄ
ｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１１０１４１９３＆Ａｂｓｔｒａｃｔ
．を参照のこと）。ｏｂマウスは、一般に、非常に繁殖性ではない。従って、プ
ロラクチンに対するレプチンの影響は、レプチン処理ｏｂマウスで観察された繁
殖力の回復の部分的原因であり得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉ
ｅｖｅ＆ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝９０４８２６＆ｄｏｐｔ＝
Ａｂｓｔｒａｃｔ；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄ
ｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１０７５４４８４＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓ
ｔｒａｃｔｓを参照のこと）。従って、プロラクチンは、生殖の領域および代謝
疾患適用において有用性を有し得る。
【００４８】 （ＯＢ４） ＯＢ４は、レプチン処置に応答してダウンレギュレートされた。αグロビンは
、ヘモグロビン中の２つのタイプのポリペプチドの１つである。αグロビンおよ
びβグロビンの両方は、グルココルチコイドにより負に調節される。α鎖は、初
期胎児ヘモグロビンガウアー（ｇｏｗｅｒ）２（ε鎖をもつ）、胎児ヘモグロビ
ンＦ（γ鎖をもつ）、および成体ヘモグロビンＡ（β鎖をもつ）。
【００４９】 （ＯＢ５） ＯＢ５は、レプチン処置に応答してダウンレギュレートされた。Ｍｍ＿ＨＳＧ
Ｐ２５ＬＧ２Ｇ＿１は、ｇｐ２５Ｌ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｘ９０８７２
号）ついてのＸ９０８７２ Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡに対し７５％同一で
ある、１６００塩基対以上のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）である。このコンティ
グは、ｇｐ２５Ｌ２に７８％同一および８５％類似である２２７アミノ酸のオー
プンリーディングフレーム（「ＯＦＲ」）を有する。ＯＲＦはＳＳを有し、そし
てまたｃｉｓゴルジ保持シグナルを有し得る。しかし、その細胞表面上の発現の
証拠もある。さらに、この分子が、小胞体に常在し、おそらくトランスロコン（
ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）の成分であることのいくつかの証拠がある。Ｈｏｌｔｈ
ｉｕｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８（Ｐｔ．１０）：３２９５−３０５（
１９９５）、Ｋｅｕｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１（６６６３）：１８７−９０
（１９９８）。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４０（４）
：７５１−６５（１９９８）。また（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉ
ｅｖｅ＆ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ＿ｕｄｉｓ＝７４９２３１４＆ｄｏｐｔ
＝Ａｂｓｔｒａｃｔ）を参照のこと。
【００５０】 （ＯＢ６） ＯＢ６発現は、レプチン処置の後肥満マウスでダウンレギュレートされた。Ｏ
Ｂ６として同定されたこの非コード化発現ｍＲＮＡは、別の遺伝子の発現のレギ
ュレーターとしてのその潜在的な役割に起因して追跡された。１つのＯＲＦは、
ＣＸＣケモカインと弱い保存を含む。非翻訳、ポリアデニル化ＲＮＡは、発現に
おいて調節的役割を演じ得る。これの例は、Ｈ１９／ＩＧＦＩＩ相互作用であり
、ここでＨ１９は、ＩＧＦＩＩの発現（母性インプリンティング）を調節する。
Ｈ１９およびＩＧＦＩＩは、ゲノムＤＮＡ中で１ｋｂは離れていない。ＯＢ６は
、ＳｅｑＥｘｔｅｎｄにより伸長し得ず、そしてＢＬＡＳＴＸでヒットはなかっ
た。さらに、有意なＢＬＡＳＴＮ結果はなく、そしてこの遺伝子のＧＮＥ ＦＬ
Ｃは、有意なＯＲＦを与えなかった。
【００５１】 ＯＢ６はマップされ（図１）、それが、代謝において役割を演じ得る遺伝子に
緊密に近接しているか否かを決定した。ＯＢ６は、メラノコルチンレセプターの
クラスターの近傍［２６］およびガストリン放出ペプチド／ボムベシンに最も近
接して（１００ｋｂ程度）位置していることが見出された。ＧＲＰ／ボムベシン
は、細胞増殖に関与している［２７］。ＧＲＰ／ボムベシンがＯＢ６によって調
節されていのであれば、ＯＢ６が脂肪細胞の増殖と関係するなにかを有する可能
性がある。
【００５２】 脳下垂体で調整されることが見出される小数の遺伝子が与えられれば、ＯＢ６
が、別の遺伝子の発現を、おそらくは転写のレベルでよりもむしろ翻訳のレベル
で調節している場合、どの遺伝子が、ＯＢ６によって影響されるその発現を有し
ているかの決定は、その発現が代謝状態の脳下垂体媒介調節において役割を演じ
得る目的遺伝子の同定を導き得る。
【００５３】 ＯＢ６の核酸配列を以下に示す：
【００５４】
【化１】 （配列番号１） レプチンは、視床下部遺伝子発現を改変することが知られ、そして脳下垂体内
の遺伝子発現は、視床下部により合成されるタンパク質により強く影響され、そ
して視床下部−脳下垂体門脈循環を経由して脳下垂体に送達される。従って、レ
プチンのＰＯＭＣの脳下垂体発現に対する影響は、間接的であり得る。これを目
指して、脳下垂体細胞の一次培養を確立し、そしてレプチンで処理した。ＲＮＡ
を、レプチンの添加後２４時間のこれらの培養から作製し、そしてＰＯＭＣ発現
を、リアルタイム定量的ＰＣＲによりモニターした。２４時間までの間のレプチ
ンを用いた脳下垂体マウス脳下垂体細胞の処置は、プロラクチンまたはＰＯＭＣ
のいずれのｍＲＮＡレベルを変えなかった。試験した２つの遺伝子について、レ
プチンが、脳下垂体遺伝子発現を直接かつ実際に変えたことの証拠はなかった。
関係する細胞の正体は未知であるが、レプチンレセプターをコードするｍＲＮＡ
は脳下垂体細胞上に存在する。レプチンが、同定された遺伝子の発現を直接改変
する可能性があるが、これらの変化は、用いた培養およびレプチン曝露下では検
出されなかった。レプチンが視床下部遺伝子発現を改変することが示され、そし
て視床下部由来のペプチドが脳下垂体遺伝子発現を改変することが示されている
ので、この研究で見られるこれらの差異はまた、視床下部変化にとっては二次的
である可能性がある。
【００５５】 ＰＯＭＣ／ＰＣ２発現がレプチンの発現を調整、それ故内分泌ループを規定す
るか否かを試験するため、脂肪細胞を、ＰＣ２によるプロセッシングの後のＰＯ
ＭＣ由来のペプチドであるＡＣＴＨで処置した。脂肪細胞によるレプチン発現は
、ＡＣＴＨに応答してメッセージおよびタンパク質レベルの両方で減少した。（
図２を参照のこと）。しかし、この影響は、その他のＰＯＭＣ由来ペプチドにつ
いては観察されず、そしてこの結果は、インビボのＡＣＴＨとレプチンとの間で
見出された負の相関と一致する。このデータは、レプチンおよびＡＣＴＨを含む
調節ループの概念を支持する。詳細には、ＡＣＴＨの増加は、レプチンの減少に
至り、そして次に、レプチンの減少は、ＡＣＴＨの増加した発現を可能にする。
プロラクチンによるこの調節ループへの可能な寄与が考慮されたが、このペプチ
ドホルモンは、グルコース摂取，グリセロール放出、またはレプチン分泌によっ
てアッセイしたとき、脂肪細胞の代謝状態に対する影響を有さなかったことが見
出された。肥満症／レプチン／プロラクチンの１つの影響は、生殖の領域中に存
在し得る。インビボで観察されたすべての影響は、雌性動物に限られていた。
【００５６】 特定組織内で発現される遺伝子の２％までは、肥満症に応答して改変される。
しかし、これら遺伝子のほんのほぼ１０％が、レプチンを用いた処置の１週間後
、正常に向かってもとに戻る。４つの脳下垂体発現遺伝子（ＰＣ２、ＰＯＭＣ、
プロラクチン、およびＨＳＧＰ２５Ｌ２Ｇ＿１）は、肥満症により改変され、お
よび少なくとも部分的にレプチンにより正常化されることの両方が示された。さ
らに、１つの新規遺伝子（ＯＢ６）もまた、肥満症により改変され、そして少な
くとも部分的にレプチンにより正常化された。
【００５７】 目的のその他の発現パターンは、ｏｂ／ｏｂマウスとレプチン処置で矯正され
ない痩身マウスとの間の差異を代表するような発現パターンを含む。このような
バンドは、レプチン欠陥の二次的な結果として調整される遺伝子に属し得る可能
性がある。これらは、レプチンに応答性ではないけれども、それらは、肥満表現
型により課されるストレスに対する単なる応答ではない限り、これらは肥満表現
型の維持に重要であり得る。さらに、これらのバンドは、レプチン以外のその他
の化合物に応答して調整され得る。これが真実であれば、それらは、抗肥満症薬
物、小分子または抗体標的、および患者または予後／診断のスクリーニングのマ
ーカーの開発に新たな路となり得る。
【００５８】 例えば、マウスにおけるＰＯＭＣノックアウトは、アグーチ様表現型をもつ太
ったマウスを生じる［１５］。しかし、ｏｂ／ｏｂマウスでは真実ではない。な
ぜなら、これらマウスは、レプチン処理に応答してよりスリムになるからである
。レプチンに応答して、ＰＯＭＣは効果的にダウンレギュレートされ、これは最
終的にはスマートなマウスを生じる。このタイプの肥満症は、その他の種類の肥
満症とは根本的に相違し得る。従って、ｏｂ／ｏｂマウス対痩身マウスで調整さ
れる遺伝子の調査もまた有益であることが立証され得る。
【００５９】 （ＯＢ配列を用いる一般的スクリーニングおよび診断方法） 本明細書に開示された方法のいくつかは、試験および参照細胞集団において１
つ以上のＯＢ核酸の発現のレベルを比較することに関する。本明細書に開示され
る配列情報は、当該分野で公知の核酸検出方法と組合せ、種々のＯＢ転写物の検
出および比較を可能にする。いくつかの実施形態では、これらのＯＢ核酸および
ポリペプチドは、各ＯＢ核酸配列について開示された種々の配列（配列番号によ
って参照される）を含む核酸またはポリペプチドに相当する。
【００６０】 その種々の局面および実施形態において、本発明は、１つ以上のＯＢ１−６、
またはそのＯＢ配列の任意の組合せを発現し得る少なくとも１つの細胞を含む試
験細胞集団を提供することを含む。「発現し得る」により、この遺伝子が細胞内
でインタクトな形態で存在し、そして発現され得ることを意味する。次いで、存
在するのであれば、１つ、いくつか、またはすべてのＯＢ配列の発現が検出され
、そして好適には測定される。公知配列に対するデータベース実体により提供さ
れる配列情報、または新規に記載された配列の配列情報を用い、当業者に周知の
技法を用いて、ＯＢ配列の発現が検出され（発現される場合）そして測定され得
る。例えば、ＯＢ配列に相当する配列データベース実体内の配列、または本明細
書に開示の配列内の配列を用い、例えば、ノザンブロットハイブリダイゼーショ
ン分析、または特定核酸配列を特異的に、そして好適には定量的に増幅する方法
において、ＯＢ ＲＮＡ配列を検出するためのプローブを構築し得る。別の例と
して、これら配列を用い、これらＯＢ配列を、例えば、逆転写を基礎にしたポリ
メラーゼ連鎖反応のような僧服を基礎にした検出方法において特異的に増幅する
ためのプライマーを構築し得る。遺伝子発現における改変が、遺伝子増幅または
欠失に関連するとき、試験および参照集団における配列比較は、試験および参照
細胞集団中の調べられたＤＮＡ配列の相対量を比較することによりなされ得る。
【００６１】 ポリペプチド産物が公知であるＯＢ配列については、発現はまた、タンパク質
レベルで測定され得る。すなわち、本明細書に記載の遺伝子産物によりコードさ
れるポリペプチドのレベルを測定することによる。このような方法は当該分野で
周知であり、そして例えば、これら遺伝子によりコードされるタンパク質に対す
る抗体を基礎にする免疫アッセイを含む。
【００６２】 次いで、試験細胞集団中の１つ以上のＯＢ配列の発現レベルを、参照細胞集団
からの１つ以上の細胞中のこれら配列の発現レベルと比較する。細胞の試験集団
およびコントロール集団中の配列の発現は、核酸配列の発現を比較するための任
意の当該分野で認識された方法を用いて比較され得る。例えば、発現は、その両
方が本明細書に参考として援用される米国特許第５，８７１，６９７号およびＳ
ｈｉｍｋｅｔｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７９８−８０３に記
載のようなＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮＧ（登録商標）法を用いて比較され得る。
【００６３】 種々の実施形態において、ＯＢ１−６により表される１、２、３、４、５また
はすべての配列の発現が測定され得る。所望であれば、これら配列の発現は、そ
れらの発現が本明細書に記載のパラメータまたは条件の１つに従って改変される
ことが知られるその他の配列とともに測定され得る。
【００６４】 参照細胞集団は、測定されたＯＢ配列であって、そしてそれらに対して比較さ
れたパラメーター（例えば、肥満症ステージ）が既知である配列を発現し得る１
つ以上の細胞を含む。「肥満症ステージ」は、参照細胞が肥満被験体または痩身
被験体由来である否かが既知であることを意味する。例えば、正の肥満症ステー
ジをもつ被験体は肥満であり、その一方、負の肥満ステージをもつ被験体は痩身
である。
【００６５】 参照細胞集団に対する試験細胞集団中の遺伝子発現プロフィールの比較が、測
定されたパラメーターの存在または程度を示すか否かは、参照細胞集団の組成に
依存する。例えば、参照細胞集団が、肥満被験体（すなわち、正の肥満症ステー
ジをもつ被験体）からの細胞を含む場合、試験細胞集団および参照細胞集団中の
同様の遺伝子発現レベルは、試験細胞集団が同じ正の肥満症ステージを有するこ
とを示す。同様に、異なる遺伝子発現レベルは、試験細胞集団が負の肥満症ステ
ージを有することを示す。
【００６６】 種々の実施形態において、試験細胞集団中のＯＢ配列は、その発現レベルが、
参照細胞集団中のＯＢ転写物のレベルから２．０倍より少ないかまたはそれに等
しい係数内で変動する場合、発現レベルにおいて、参照細胞集団中のＯＢ配列の
発現レベルに匹敵し得ると考えられる。種々の実施形態において、試験細胞集団
中のＯＢ配列は、その発現レベルが、参照細胞集団中の対応するＯＢ配列の発現
レベルから２．０倍以上この参照細胞集団から変動する場合、発現レベルにおい
て改変されたと考えられ得る。
【００６７】 所望であれば、試験細胞集団と参照細胞集団との間で差次的に発現された配列
の比較は、その発現が測定されているパラメーターまたは条件と独立であるコン
トロール核酸に関してなされ得る。試験および参照核酸におけるこのコントロー
ル核酸の発現レベルは、比較された集団におけるシグナルレベルを規格化するた
めに用いられ得る。適切なコントロール核酸は、当業者によって容易に決定され
得る。
【００６８】 いくつかの実施形態では、試験細胞集団は、複数の参照細胞集団と比較される
。この複数の参照集団の各々は、既知のパラメーターにおいて異なり得る。従っ
て、試験細胞集団は、正の肥満症ステージを有する第１の参照細胞集団、および
負の肥満症ステージを有する第２の参照集団と比較され得る。
【００６９】 試験細胞集団は、任意の数の細胞（すなわち、１つ以上の細胞）であり得、そ
してインビトロ、インビボまたはエクスビボで提供され得る。
【００７０】 その他の実施形態において、試験細胞集団は、２つ以上のサブ集団に分割され
得る。このサブ集団は、細胞の第１の集団を分割して、サブ集団を可能な限り同
一に作製することにより作製され得る。これは、例えば、インビトロまたはエク
スビボスクリーニング方法において適切である。いくつかの実施形態では、種々
のサブ集団は、コントロール薬剤、および／または試験薬剤、複数の試験薬剤、
または、例えば、１つまたは一緒にかまたは種々の組合せで投与される複数試験
薬剤ま変化する投与量に晒され得る。
【００７１】 好適には、参照細胞集団中の細胞は、試験細胞と可能な限り同様の組織型由来
である。いくつかの実施形態では、コントロール細胞は、試験細胞と同じ被験体
由来、例えば、試験細胞の起源の領域に近接する領域由来である。その他の実施
形態では、参照細胞集団は、複数の細胞由来である。例えば、参照細胞集団は、
それについて本明細書に記載のパラメーターまたは条件の１つ（例えば、肥満症
ステージ、診断、または治療要求）が既知である先に試験された細胞からの発現
パターンのデータベースであり得る。
【００７２】 好ましくは、被験体は哺乳動物である。この哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒ
ト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得る。
【００７３】 （レプチン誘導核酸配列の同定） 本明細書中に記載されるＯＢ配列のいくつかの発現は、レプチンでの処理によ
って誘導される。従って、１つの局面において、本発明は、レプチン誘導核酸配
列の同定の方法を提供する。「レプチン誘導」とは、特定の核酸配列の発現がレ
プチンでの処理に続いて調節されることを意味する。
【００７４】 この方法は、肥満状態が既知である被験体由来の試験細胞集団を提供する工程
、およびこの試験細胞集団によって発現される１つ以上の核酸配列の発現を測定
する工程を包含する。次に、この試験細胞集団における核酸配列の発現を、逆の
肥満段階を有する被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団におけ
る、この核酸配列の発現と比較し、そしてこれら２つの集団においてどの配列（
存在する場合）が差示的に発現されるかを決定する。次いで、両方の集団をレプ
チンで処理する。このようなレプチン処理の後に、両方の集団における核酸配列
の発現を再度比較する。最後に、これら２つの集団間での発現レベルの差異を、
存在する場合には同定する。この様式で、レプチン誘導核酸配列が同定され得る
。
【００７５】 （肥満に対する感受性を診断または決定する方法） 本発明は、さらに、肥満に対する感受性を診断または決定する方法を提供する
。肥満は、この障害を有すると疑われる被験体由来の細胞の試験集団からの、１
つ以上のＯＢ核酸配列の発現を試験することによって診断される。
【００７６】 １つ以上のＯＢ核酸配列（例えば、ＯＢ：１〜６）の発現は、試験細胞集団に
おいて測定され、そして参照細胞集団におけるこの配列の発現と比較される。こ
の参照細胞集団は、肥満を罹患しない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む
。参照細胞集団が障害を有する細胞を含む場合には、試験集団と参照細胞集団と
におけるＯＢ配列の発現の間の類似性は、その被験体が肥満であることを示す。
試験集団と参照細胞集団とにおけるＯＢ配列の発現の間の差異は、その被験体が
肥満ではないことを示す。
【００７７】 被験体は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト
霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得る。
【００７８】 （肥満を処置する方法） 本発明にはまた、被験体における肥満を処置する、すなわち、肥満を予防する
かまたは肥満の開始を遅延させる方法が含まれ、この方法は、この被験体に、Ｏ
Ｂからなる群より選択される１つ以上の核酸の発現または活性を調節する薬剤を
投与することによる。「調節（する）」とは、ＯＢ核酸の発現または活性の増加
または減少を含むことを意味する。好ましくは、調節は、被験体におけるＯＢ遺
伝子または遺伝子産物の発現または活性の、肥満を罹患しない被験体と類似かま
たは同じレベルまでの変化を生じさせる。
【００７９】 被験体は、例えば、ヒト、マウスもしくはラットのようなげっ歯類、あるいは
イヌまたはネコであり得る。
【００８０】 １つの局面において、処置の方法は、ＯＢ：１、２および４〜６からなる群よ
り選択される１つ以上の核酸配列の発現を減少させる薬剤の投与を含む。あるい
は、この方法は、ＯＢ３核酸配列の発現を増加させる薬剤の投与を含み得る。
【００８１】 適切な薬剤は、特定のＯＢ核酸配列によってコードされるペプチドに対する抗
体、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、または他の薬剤を含み得る。
【００８２】 本明細書中に記載されるＯＢ核酸、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、および
アンタゴニストは、治療的に使用される場合には、本明細書中において「治療剤
」と呼ばれる。治療剤を投与する方法としては、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内
、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口の経路が挙げられるが、これらに限定されな
い。本発明の治療剤は、任意の好都合な経路によって（例えば、注入またはボー
ラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸および
腸管の粘膜など）を介する吸収によって）投与され得、そして他の生物学的に活
性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身性または局所性であり得る。さら
に、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を含む）によって、中枢神
経系に治療剤を投与することが有利であり得る。
【００８３】 脳室内注射は、レザバー（例えば、オマヤレザバー）に取付けられた脳室内カ
テーテルによって容易にされ得る。肺投与もまた、吸入器または噴霧器、および
エアロゾル化剤を有する処方物の使用によって利用され得る。処置の必要な領域
に局所的に治療剤を投与することもまた所望され得；これは、例えば、限定の目
的ではないが、手術の間の局所注入、局所適用、注射によって、カテーテル手段
によって、坐薬手段によって、または移植手段によって達成され得る。特定の実
施形態において、投与は、悪性腫瘍あるいは新形成組織または新形成前組織の部
位（または前の部位）での直接注射によるものであり得る。
【００８４】 種々の送達系が公知であり、そして、例えば（ｉ）リポソーム、微粒子、マイ
クロカプセルへのカプセル化；（ｉｉ）治療剤を発現し得る組換え細胞；（ｉｉ
ｉ）レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）；（ｉ
ｖ）レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部として、治療剤核酸の構
築などを含む本発明の治療剤を投与するために使用され得る。本発明の１つの実
施形態において、治療剤は、小胞内（特に、リポソーム）内で送達され得る。リ
ポソームにおいて、本発明のタンパク質が、他の薬学的に受容可能なキャリアに
加えて、両親媒性剤（例えば、ミセル、不溶性単層、液晶、または水溶液中の層
状の層として凝集形態にて存在する脂質）とともに組み合わされている。リポソ
ーム性処方物のために適切な脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、ス
ルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるがこ
れらに限定されない。このようなリポソーム性処方物の調製は、例えば、米国特
許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号（これらの
全ては、本明細書中に参考として援用される）に開示されるように、当該分野の
技術のレベル内である。なお別の実施形態において、治療剤は、例えば送達ポン
プ（例えば、Ｓａｕｄｅｋら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４
（１９８９）を参照のこと）および半浸透性重合体物質（例えば、Ｈｏｗａｒｄ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）を参照のこと）を含む
制御放出系において送達され得る。さらに、この制御放出系は、治療標的（例え
ば、脳）に近接して配置され得、従って、全身性用量の画分のみを必要とする。
例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９８４（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏ
ｃｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を参照のこと。
【００８５】 治療剤がタンパク質をコードする核酸である、本発明の特定の実施形態におい
て、適切な核酸発現ベクターの部分としてその核酸を構築し、そしてその核酸が
細胞内となるように投与する（例えば、レトロウイルスベクターの使用、直接注
射、微粒子ボンバードメントの使用、脂質もしくは細胞表面レセプターでのコー
ティング、またはトランスフェクト剤による）か、あるいはその核酸を、核に進
入することが公知のホメオボックス様ペプチドに連結させて投与することなどに
よって、その治療剤核酸をインビボで投与して、そのコードされたタンパク質の
発現を促進し得る（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８などを参照のこと）。あ
るいは、核酸治療剤は、細胞内に導入され得、そして発現のための宿主細胞ＤＮ
Ａに組み込まれ得る（相同組換えによる）。
【００８６】 本明細書中において使用される場合に、用語「治療有効量」とは、意味深い患
者の利益（すなわち、関連する医学的状態の処置、治癒、予防または改善、ある
いはこのような状態の処置、治癒、予防または改善の速度の増加）を示すに十分
な薬学的組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。単独で投与される個
々の活性成分に対して適用される場合には、この用語は、その成分単独を言及す
る。組み合わせで適用される場合には、この用語は、組み合わせで投与されても
、連続的に投与されても、同時に投与されても、治療効果を生じる活性成分の組
み合わせられた量を言及する。
【００８７】 特定の障害もしくは状態の処置において有効である、本発明の治療剤の量は、
その障害または状態の性質に依存し、そして標準的な臨床的技術によって、当業
者によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイが必要に応じて使用され
て、最適な投薬量範囲を同定するのに役立て得る。処方物において使用される正
確な用量はまた、投与経路およびその疾患もしくは障害の全体の重篤度に依存し
、そして実施者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。最終
的に、主治医は、各個々の患者を処置するために用いる本発明のタンパク質の量
を決定する。最初に、主治医は、低用量の本発明のタンパク質を投与し、そして
その患者の応答を観察する。より大きな用量の本発明のタンパク質を、最適な治
療効果がその患者に対して得られるまで投与され得、そしてこの時点で、投薬量
はそれ以上増加されない。しかし、本明細書における治療剤の静脈投与について
適切な投薬量の範囲は、一般に、１キログラム（ｋｇ）の体重あたり、約２０〜
５００マイクログラム（μｇ）の活性化合物である。経鼻投与についての適切な
投薬量範囲は、一般に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
有効用量は、インビトロもしくは動物モデルの試験系から誘導された用量応答曲
線から外挿され得る。坐剤は、一般に、０．５重量％から１０重量％の範囲内の
活性成分を含む：経口処方物は、好ましくは、１０％〜９５％の活性成分を含む
。
【００８８】 本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の持続時間は、処置される疾患の
重篤度ならびに各個々の患者の状態および潜在的な特異体質性の応答に依存して
、変動する。本発明のタンパク質の各適用の持続時間は、１２〜２４時間の範囲
の連続的な静脈内投与であることが、意図される。最終的に、主治医は、本発明
の薬学的組成物を使用する静脈内治療の適切な持続時間を決定する。
【００８９】 本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療のために使用され得る。遺伝子
治療とは、特定の核酸を被験体に投与することによって実施される治療をいう。
治療剤核酸の、哺乳動物被験体への送達は、直接的（すなわち、患者が直接、核
酸または核酸含有ベクターに曝露される）であっても間接的（すなわち、最初に
細胞が核酸でインビトロで形質転換され、次いで患者に移植される）であっても
いずれでもよい。これら２つのアプローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療ま
たはエキソビボ遺伝子治療として、公知である。本発明のポリヌクレオチドはま
た、（ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形態が挙げられるが、これらに限定
されない、）核酸を細胞または生物に導入するための、他の公知の方法によって
投与され得る。当該分野において利用可能な遺伝子治療に関する方法論のいずれ
かを、本発明の実施において使用し得る。例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９
９３．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ １２：４８８−５０５を参照のこと。
【００９０】 細胞はまた、このような細胞を増殖するため、またはこのような細胞における
所望の効果もしくは活性を発生させるために、本発明の治療剤またはタンパク質
の存在下で、エキソビボで培養され得る。次いで、処理された細胞は、治療の目
的で、インビボに導入され得る。
【００９１】 （被験体における肥満処置の効力の評価） 本明細書中において同定される、差示的に発現されるＯＢ配列はまた、精神生
理学的処置の経過をモニタリングすることを可能にする。この方法において、試
験細胞集団は、肥満のための処置を受けている被験体から提供される。所望であ
れば、試験細胞集団は、処置の前、途中または後の種々の時点において、被験体
から採取され得る。次いで、この細胞集団における１つ以上のＯＢ配列（例えば
、ＯＢ１〜６）の発現が測定され、そして精神生理学的状態が既知である細胞を
含む参照細胞集団と比較される。好ましくは、参照細胞は、処置に曝されていな
い。
【００９２】 参照細胞集団が処置に曝されておらず、そして疾患に罹患していない細胞を含
む場合には、試験集団とこの参照細胞集団とにおけるＯＢ配列の発現間の差異は
、この処置に効力がないことを示す。しかし、試験細胞集団と上記参照細胞集団
とにおけるＯＢ配列の発現間の類似性は、この処置に効力があることを示す。
【００９３】 「効力がある」とは、処置が、被験体における精神生理学の減少を導くことを
意味する。処置が予防的に適用される場合には、「効力がある」とは、処置が精
神生理学を遅延または予防することを意味する。例えば、肥満の処置が「効力が
ある」場合には、被験体における肥満の程度を減少させる。
【００９４】 効力は、特定の精神生理学を処置するための任意の公知の方法に関連して、決
定され得る。
【００９５】 （肥満を調節する薬剤の同定） 本発明にはまた、肥満を調節する薬剤を同定する方法が含まれる。１つの方法
は、１つ以上のＯＢポリペプチドを試験薬剤と接触させる工程、および試験薬剤
とポリペプチドとの間の複合体を検出する工程を包含する。複合体の存在は、そ
の試験薬剤が肥満を調節することを示す。複合体の非存在は、その試験薬剤が肥
満を調節しないことを示す。
【００９６】 「肥満を調節する」とは、試験薬剤が、ＯＢ核酸配列の１つ以上の発現を、増
加させるかまたは減少させるかのいずれかであることを意味する。
【００９７】 試験薬剤は、例えば、ＯＢ：１〜６によってコードされるポリペプチドに対す
る抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬剤であり得る。
【００９８】 試験薬剤は、公知または未知の治療剤であり得る。公知の治療剤の例としては
、デキスフェンフルラミン、シブトラミン、β３−アドレナリン作用性アゴニス
ト、およびオリスタット（ｏｌｉｓｔａｔ）が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００９９】 （ＯＢタンパク質の活性を調節する方法） 本発明は、ＯＢタンパク質に結合するか、または例えばＯＢ発現もしくはＯＢ
活性に対して刺激効果もしくは阻害効果を有する、モジュレーター（すなわち、
候補化合部もしくは試験化合物または候補薬剤もしくは試験薬剤）（例えば、Ｏ
Ｂ：１〜６によってコードされるポリペプチドに対する抗体、ペプチド、ペプチ
ド模倣物、低分子または他の薬剤）を同定するための方法を提供する。
【０１００】 １実施形態において、本発明は、ＯＢタンパク質またはポリペプチド、あるい
はその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、または膜結合形態の活
性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッ
セイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリ
アルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得
、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能
な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；
「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィ
ー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプ
チドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプ
チドオリゴマーもしくは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ
（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２：１４５）。
【０１０１】 分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下
に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ
Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９
９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；およ
びＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
【０１０２】 化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌ
ａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ
米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ’４０９）、
プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍ
ｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（
１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９
０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６
３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１〜３
１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。
【０１０３】 １実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、ＯＢ
タンパク質、またはその生物学的に活性な部分の膜結合形態を細胞表面上に発現
する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＯＢタンパク質
に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞
であり得る。この試験化合物がＯＢタンパク質に結合する能力の決定は、例えば
、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、こ
の試験化合物のＯＢタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が
複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによっ
て、達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または ３ Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が
、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出さ
れ得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの
酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得
る。１実施形態において、このアッセイは、ＯＢタンパク質、またはその生物学
的に活性な部分の膜結合形態をその細胞表面上に発現する細胞を、ＯＢと結合す
る公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混
合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＯＢタンパク質
と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここでこの試験化合物がＯＢタン
パク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物がＯＢ、またはそ
の生物学的に活性な部分と、公知の化合物と比較して優先的に結合する能力を決
定する工程を包含する。
【０１０４】 別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ＯＢタン
パク質またはその生物学的に活性な部分の膜結合形態を細胞表面上で発現する細
胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＯＢタンパク
質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）す
る能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＯＢ、またはその生物学的
に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＯＢタンパク質が、ＯＢ
標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによっ
て、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、
ＯＢタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＯＢ相互
作用タンパク質を発現する細胞の表面の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞
外の環境の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。
ＯＢ標的分子は、本発明の非ＯＢ分子またはＯＢタンパク質またはポリペプチド
であり得る。１実施形態において、ＯＢ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要
素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物
が膜結合ＯＢ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。
その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質または下流シグ
ナル分子のＯＢとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０１０５】 ＯＢタンパク質がＯＢ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用す
る能力の決定は、直接の結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され
得る。１実施形態において、ＯＢタンパク質がＯＢ標的分子に結合するかまたは
その標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定すること
により、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞第二メ
ッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など
）の誘導を検出すること、適切な基質の標的の触媒活性／酵素活性を検出するこ
と、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコー
ドする核酸に作動的に連結されたＯＢ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検
出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖
）を検出することにより、決定され得る。
【０１０６】 なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、Ｏ
Ｂタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、
ならびにその試験化合物がＯＢタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結
合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＯＢタンパク質への
結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１実
施形態において、このアッセイは、ＯＢタンパク質またはその生物学的に活性な
部分を、ＯＢに結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する
工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化
合物がＯＢタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、こ
の試験化合物がＯＢタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験
化合物が、公知の化合物と比較して、ＯＢ、またはその生物学的に活性な部分に
優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０１０７】 別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＯＢタンパク質
またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその
試験化合物がＯＢタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例
えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が
ＯＢの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＯＢタンパク質が、ＯＢ標的分子
に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定する
ことにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＯＢの
活性を調節する能力の決定は、ＯＢタンパク質が、ＯＢ標的分子をさらに調節す
る能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基
質に対する触媒活性／酵素活性は、上に記載のように決定され得る。
【０１０８】 なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＯＢタンパク質またはその生
物学的に活性な部分を、ＯＢに結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合
物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならび
にこの試験化合物がＯＢタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し
、ここで、この試験化合物がＯＢタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＯＢ
タンパク質が、ＯＢ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性
を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０１０９】 本発明の無細胞アッセイは、ＯＢの、可溶性の形態または膜結合形態の両方の
使用に受け入れられる。膜結合形態のＯＢを含む無細胞アッセイの場合には、Ｏ
Ｂの膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望まし
くあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、
例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマル
トシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカ
ミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１
１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエ
ーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ
ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プ
ロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−
プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨ
ＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒド
ロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙ
ｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａ
ｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０１１０】 本発明の上記のアッセイ方法の１より多くの実施形態において、ＯＢまたはそ
の標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体
化形態からの複合体化形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用
させることが、望ましくあり得る。試験化合物のＯＢへの結合、または候補化合
物の存在下および非存在下でのＯＢの標的分子との相互作用は、これらの反応物
を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例に
は、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つ
の実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合す
ることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例え
ば、ＧＳＴ−ＯＢ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチ
オンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、
次いで、これらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および非
吸着の標的タンパク質またはＯＢタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこ
の混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理
学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまた
はマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を
除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合
体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリック
スから解離され得、そしてＯＢの結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術
を使用して決定し得る。
【０１１１】 タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術もまた、本発明のスク
リーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＯＢまたはその標的分子の
いずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して固定され得
る。ビオチン化されたＯＢまたは標的分子は、当該分野において周知の技術を使
用して、ビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例
えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルのプレート（Ｐ
ｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＯＢまた
は標的分子と反応性であるが、ＯＢタンパク質のその標的分子への結合を妨害し
ない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標
的またはＯＢが、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このよ
うな複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のもの
に加えて、ＯＢまたは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、な
らびにＯＢまたは標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイ
が挙げられる。
【０１１２】 別の実施形態において、ＯＢの発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と
接触され、そして細胞中におけるＯＢのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定
される方法で同定される。候補化合物の存在下での、ＯＢのｍＲＮＡまたはタン
パク質の発現のレベルは、候補化合物不在下でのＯＢのｍＲＮＡまたはタンパク
質の発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、
ＯＢの発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＯＢのｍＲＮＡまた
はタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、その候補化合物が不在下よりも
大きい（統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＯＢのｍＲＮＡまた
はタンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、ＯＢのｍＲＮＡま
たはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下でその候補化合物の不在下よりも
小さい（統計的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、ＯＢのｍＲＮＡまた
はタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中におけるＯＢのｍ
ＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、ＯＢのｍＲＮＡまたはタンパク質を
検出するための本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０１１３】 本発明のなお別の局面において、ＯＢタンパク質は、ツーハイブリッドアッセ
イまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質
」として使用され得（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ
ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、
（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕ
ｃｈｉら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢ
ｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＯＢと結合するかまたは相互
作用する他のタンパク質（「ＯＢ結合タンパク質」または「ＯＢ−ｂｐ」）、な
らびにＯＢの活性を調節する他のタンパク質を同定する。このようなＯＢ結合タ
ンパク質はまた、例えば、ＯＢ経路の上流または下流のエレメントとして、ＯＢ
タンパク質によるシグナルの伝播に関与するようである。
【０１１４】 ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ド
メインからなる、大部分の転写因子の調節（ｍｏｄｕｌａｒ）性質に基づく。手
短には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を使用する。１つの構築物
において、ＯＢをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）
のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物において
、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）
」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ド
メインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク
質がインビボで相互作用し得る場合、ＯＢ依存複合体を形成して、転写因子のＤ
ＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが、密接に近接される。この近接は、転
写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されるレポーター遺伝子（例え
ば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そ
してこの機能性転写因子を含む細胞コロニーを単離および使用して、ＯＢと相互
作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を獲得し得る。
【０１１５】 本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤、お
よび本明細書中に記載される処置のためのその使用に関する。
【０１１６】 （ＯＢタンパク質を検出する方法） 本発明は、生物学的サンプルにおけるＯＢの存在または非存在を検出するため
の方法を提供する。この方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、
およびその生物学的サンプルをＯＢタンパク質またはＯＢタンパク質をコードす
る核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤と
を接触させ、その結果、ＯＢの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出され
る、工程を包含する。ＯＢのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬
剤は、ＯＢのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識され
た核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＯＢ核酸（例えば
、配列番号１もしくはその部分の核酸（例えば、少なくとも、１５、３０、５０
、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、
ストリンジェントな条件下でＯＢのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイ
ブリダイズするに十分である核酸））であり得る。本発明の診断アッセイにおけ
る使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０１１７】 ＯＢタンパク質を検出するための薬剤は、ＯＢタンパク質に結合し得る抗体で
あり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナ
ルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタ
クトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が
使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検
出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物
理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗体を直接標識すること、
ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって、そのプローブもしくは
抗体の間接的に標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例
としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識さ
れたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチン
を用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単
離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞
および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、Ｏ
ＢのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、イン
ビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＯＢ ｍＲＮＡの検出のためのイ
ンビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハ
イブリダイゼーションが挙げられる。ＯＢタンパク質の検出のためのインビトロ
技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット
、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＯＢゲノムＤＮＡを検出するためのイ
ンビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、
ＯＢタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＯＢ抗体を
被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用
いて標識され得る。この被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標
準的な画像化技術によって検出され得る。
【０１１８】 １つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタ
ンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体から
のｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ま
しい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血
球サンプルである。
【０１１９】 別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコン
トロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＯＢのタ
ンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤と接
触させ、その結果、ＯＢのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在が
その生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサン
プルにおけるＯＢのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その
試験サンプルにおけるＯＢのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在
とを比較する工程を包含する。
【０１２０】 （ＯＢ核酸） ＯＢ６、またはその相補体からなる群から選択される核酸配列を含む新規な核
酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターおよび細胞もまた、本発明において提
供される。ＯＢ核酸またはその生物学的に活性な部分によってコードされるポリ
ペプチドもまた、提供される。
【０１２１】 ＯＢをコードする核酸（例えば、ＯＢ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリ
ダイゼーションプローブとしての使用について十分な核酸フラグメント、および
ＯＢ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライ
マーとしての使用のためのフラグメントもまた本発明に含まれる。本明細書中で
使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲ
ノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用
して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラ
グメントおよびホモログを含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖
であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１２２】 「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、用途に依存し
て、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、または例えば、約６，０００ｎｔ
ほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検
出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供
給源から入手され、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅く
ハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ
、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技
術において特異性を有するように設計される。
【０１２３】 「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核
酸分子とは異なるものである。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に
含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部
分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が
挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、こ
の核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すな
わち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば
、種々の実施形態で、単離されたＯＢ核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲ
ノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４
ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオ
チド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子
は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質
的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその
他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１２４】 本発明の核酸分子、例えば、ＯＢ６のヌクレオチド配列を有する核酸分子、ま
たはこれらのヌクレオチド配列の相補体は、標準的な分子生物学的技法および本
明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプ
ローブとして、これらの核酸配列の全部または一部を使用して、ＯＢ核酸配列は
、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴ
ＯＲＹＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ
、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣ
ＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を用いて単
離され得る。
【０１２５】 本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤ
ＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中に
クローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＯＢ
ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば
、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０１２６】 本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結され
たヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ
るに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲ
ノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そ
して特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたは
ＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌ
クレオチドは、少なくとも約１０ｎｔおよび５０ｎｔほどの長さ、好ましくは約
１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。これらは、化学的に
合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【０１２７】 別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、ＯＢ６のヌクレオチド配
列の相補体である核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離された核酸
分子は、これらの配列のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはこれらの
ヌクレオチド配列の任意の部分の相補体である核酸分子を含む。ＯＢ６のヌクレ
オチド配列に相補的である核酸分子は、示されるヌクレオチド配列に十分相補的
である核酸分子であり、示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんど
または全くなく水素結合し得、これによって安定な二本鎖を形成する。
【０１２８】 本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間の
Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして
用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまた
は化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は
、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。
物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、
別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接
的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因し
て生じない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０１２９】 さらに、本発明の核酸分子は、ＯＢ６の核酸配列の一部のみ（例えば、プロー
ブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＯＢ６の生物学
的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中に提供され
るフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４
個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的ハイブリダ
イゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認
識を可能にするに十分な長さ）の配列として規定され、そして全長配列未満のせ
いぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミ
ノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変
もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される
核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似す
る構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分または側鎖に関してそ
れとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得
るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の
代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。
【０１３０】 誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修
飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得
る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実
施形態において、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整
列した配列に比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター
相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約４５％、５０％、７０％
、８０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの同一性（好ましい同一性は、８
０〜９９％）で、本発明の核酸もしくはタンパク質に実質的に相同であるか、あ
るいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの
、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の
相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子が挙げられるが、これらに限定
されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ
ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示的な
プログラムは、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登
録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設
定を使用、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ
．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体
が参考として本明細書中に援用される）を使用する）である。
【０１３１】 「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは
、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相
同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＯＢポリ
ペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、
例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織
において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコ
ードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（哺
乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラット、
ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＯＢポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、
天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の
変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配
列は、ヒトＯＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同核酸
配列は、ＯＢポリペプチドにおける保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、
およびＯＢ活性を有するポリペプチドをコードするこれらの核酸配列を含む。相
同アミノ酸配列は、ヒトＯＢポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１３２】 ヒトＯＢ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞
型（例えば、他の組織由来）におけるＯＢホモログ、ならびに他の哺乳動物由来
のＯＢホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計さ
れるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマー
は、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌ
クレオチドは、代表的には、ＯＢ配列を含む核酸のセンス鎖ヌクレオチド配列、
またはＯＢ配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、あるいはこれら
の配列の天然に存在する変異体の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約
１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個また
は約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１３３】 ヒトＯＢヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタンパク質
をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実
施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例
えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり
得る。このようなプローブは、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＯＢを
コードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＯＢ ｍＲＮＡレベルを検出
すること、またはゲノムＯＢ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否か
を決定すること）によって、ＯＢタンパク質を誤って発現する細胞または組織を
同定するための診断試験キットの一部として使用され得る。
【０１３４】 「ＯＢの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、本発明のポリペプ
チドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいい、
用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるよう
な成熟形態を含む。「ＯＢの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメ
ントは、ＯＢの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ＯＢ６の一部
を単離し、ＯＢタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロ
での組換え発現によって）、そしてＯＢのコードされた部分の活性を評価するこ
とによって調製され得る。例えば、ＯＢポリペプチドの生物学的に活性な部分を
コードする核酸フラグメントは、必要に応じて、ＡＴＰ結合ドメインを含み得る
。別の実施形態において、ＯＢの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグ
メントは、１つ以上の領域を含む。
【０１３５】 本発明に従うＯＢ核酸配列は、被験体における肥満を処置するために使用され
得る。この被験体は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
１つの局面において、被験体において肥満を処置するために使用されるこのよう
な核酸配列の発現状態は、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）によって調節される。「発
現状態」によって、核酸配列が発現される程度が意味される。特定の実施形態に
おいて、被験体において肥満を処置するために使用される核酸の発現状態は、ア
ップレギュレートされるか（すなわち、ＯＢ：３）、またはダウンレギュレート
されるか（すなわち、ＯＢ：１，２，および４〜６）のいずれかであり得る。さ
らに、別の局面において、被験体において肥満を処置するために使用される核酸
配列は、下垂体において発現される。
【０１３６】 （ＯＢ改変体） 本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、開示または参照されるＯＢヌ
クレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は、例え
ば、ＯＢ６に示されるようなＯＢ核酸を含むヌクレオチド配列によりコードされ
るのと同じＯＢタンパク質をコードする。
【０１３７】 ＯＢ６に示されるＯＢヌクレオチド配列に加えて、ＯＢのアミノ酸配列におけ
る変化に至るＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ること
が、当業者によって理解される。ＯＢ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然
の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明
細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＯＢタン
パク質、好ましくは哺乳動物のＯＢタンパク質をコードするオープンリーディン
グフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーショ
ンは、代表的には、ＯＢ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動性を
生じる。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＯＢの機能的活
性を変化させない、ＯＢ内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエ
ーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図さ
れる。
【０１３８】 さらに、他の種由来のＯＢタンパク質をコードし、従って、ＯＢ６のヒト配列
とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが
意図される。本発明のＯＢのＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに
対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＯＢ核酸に対するその相同性
に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイ
ブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＤＮ
Ａまたはその一部を用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＯＢ ＤＮＡは、
ヒトの膜結合ＯＢに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜結合
ヒトＯＢ ｃＤＮＡは、可溶性ヒトＯＢに対するその相同性に基づいて単離され
得る。
【０１３９】 従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌ
クレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下でＯＢ６のヌクレオチド配
列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少な
くとも１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチド長であ
る。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリ
ダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハ
イブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少
なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズした
ままである条件を記載することを意図する。
【０１４０】 ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＯＢタンパク質をコードする核酸）
または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト
配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクロ
ーニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高
いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０１４１】 本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、
その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない
条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で
異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズ
する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで
、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは
、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイ
ズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列
は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有さ
れている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩
濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０
Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度は、短いプローブ、プラ
イマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少な
くとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチ
ドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条
件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０１４２】 ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出
され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約
７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が
、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、
０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであ
る。このハイブリダイゼーションに、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ ＢＳＡ中で
の５０℃での１回以上の洗浄が続く。ストリンジェント条件下でＯＢ６の配列に
ハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子
に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、
天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を
有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０１４３】 第２の実施形態では、ＯＢ６またはそれらのフラグメント、アナログもしくは
誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハ
イブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デン
ハルト溶液、０．５％ ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で
のハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での３７℃
での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条
件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，Ｃ
ＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧ
Ｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９
９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照
のこと。
【０１４４】 第３の実施形態では、ＯＢ６、またはそれらのフラグメント、アナログもしく
は誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下で
ハイブリダイズする核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼー
ション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０
．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子
ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイ
ゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄であ
る。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（
例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ｉ
Ｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ
ｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ
ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓ
ｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９
８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：６７８９−６７
９２を参照のこと。
【０１４５】 （保存的変異） 集団中に存在し得る、ＯＢ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、
当業者は、ＯＢタンパク質の機能的能力を変更することなく、ＯＢ核酸にまたは
ＯＢポリペプチド配列に直接変化が導入されることをさらに理解する。いくつか
の実施形態において、ＯＢ６のヌクレオチド配列は変更され、それによってコー
ドされるＯＢタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらす。例えば、種々の「非
必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、ＯＢ６の
配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更する
ことなく、ＯＢの野生型配列から、変更され得る残基であり、一方、「必須」ア
ミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＯＢタンパク質
の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。
【０１４６】 さらに、本発明のＯＢタンパク質ファミリーメンバー間で保存されるアミノ酸
残基はまた、特に変更を受け入れ難いと予測される。このように、これらの保存
されたドメインは、変異を受け入れないようである。しかし、他のアミノ酸残基
（例えば、ＯＢタンパク質のメンバー間で保存されないかまたは半保存的のみで
あるアミノ酸残基）は、活性に必須でなくてもよく、従って変更を受け入れやす
いようである。
【０１４７】 本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、
ＯＢタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＯＢタンパク質は、
アミノ酸配列が、ＯＢ６を含む核酸によりコードされるポリペプチドとは異なる
が、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は
、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は
、ＯＢ６を含む核酸によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に少なくと
も約４５％の相同性、より好ましくは約６０％相同性、なおより好ましくは少な
くともおよそ７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、そして最も好ましくは
少なくとも約９９％の相同性であるアミノ酸配列を含む。
【０１４８】 相同なＯＢタンパク質をコードする単離された核酸分子は、ＯＢを含む核酸の
のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入する
ことにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が
、コードされるタンパク質に導入される。
【０１４９】 変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）
によってＯＢを含む核酸に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、
１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、
アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換で
ある。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されて
いる。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するア
ミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ
酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ
酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロ
シン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプ
トファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソ
ロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＯＢ中の推定された非必須ア
ミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あ
るいは、別の実施形態では、変異は、ＯＢコード配列の全てまたは一部に沿って
（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に
よって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＯＢの生物学的活性
についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。この核酸
の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換
え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１５０】 １つの実施形態では、変異ＯＢタンパク質は、以下についてアッセイされ得る
：（１）他のＯＢタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性
なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）変
異ＯＢタンパク質と、ＯＢリガンドとの間の複合体形成；（３）変異ＯＢタンパ
ク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；
（例えば、アビジンタンパク質）；（４）ＡＴＰに結合する能力；または（５）
ＯＢタンパク質抗体に特異的に結合する能力。
【０１５１】 他の実施形態にでは、ＯＢ６の相補的ポリヌクレオチド配列のフラグメントで
あって、ここで相補的ポリヌクレオチド配列のフラグメントは、第１の配列にハ
イブリダイズする。
【０１５２】 他の特定の実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。ＯＢ６の
フラグメントまたはＯＢ６の相補的ポリヌクレオチド配列のフラグメントであっ
て、ここでこのフラグメントは、約１０ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド
長との間、約１０ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、例えば、約
１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、または約１０ヌクレオチド
長と約７５ヌクレオチド長との間、約１０塩基長と約５０塩基長との間、約１０
塩基長と約４０塩基長との間、約１０塩基長と約３０塩基長との間である。
【０１５３】 （アンチセンス） 本発明の別の局面は、ＯＢ６配列またはそのフラグメント、アナログもしくは
誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補
的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は
、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤ
ＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌク
レオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約
１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体のＯＢコード鎖、ま
たはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供され
る。ＯＢタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコード
する核酸分子、またはＯＢ核酸配列を含む核酸に相補的なアンチセンス核酸がさ
らに提供される。
【０１５４】 １つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＯＢをコードするヌクレオチ
ド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード
領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域
をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＯＢをコードするヌ
クレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用
語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５
’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域
ともいわれる）。
【０１５５】 本明細書中に開示されるＯＢをコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明
のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅ
ｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＯＢ ｍ
ＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＯＢ ｍＲＮ
Ａのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌク
レオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＯＢ ｍＲＮＡ
の翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約
３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセ
ンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を
用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安
定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成
される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々の改変ヌクレオ
チドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体および
アクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１５６】 アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセ
チルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキ
シメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル
ウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔ
ｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−
メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチル
アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ
６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メ
トキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａ
ｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、
５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラ
シル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシ
ン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、
２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オ
キシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−
チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル
、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセン
ス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用
いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡ
は、以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向
である）。
【０１５７】 本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、または
インサイチュで生成され、その結果それらは、ＯＢタンパク質をコードする細胞
性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに
結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば転写および／または翻訳
を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を
形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結
合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ（ｍａ
ｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明の
アンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げ
られる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するよう
に改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセ
ンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原
に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセンス核
酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結す
ることによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベク
ターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成
するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐ
ｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい
。
【０１５８】 なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイ
ブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに
平行に延びる（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ １５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’
−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ
アナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１５：３２７〜３
３０）を含み得る。
【０１５９】 （リボザイムおよびＰＮＡ部分） なお別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボ
ザイムは、それらに対してリボザイムが相補的領域を有する一本鎖核酸、例えば
ｍＲＮＡを切断し得るリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。従
って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆお
よびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１に記載
されている））は、ＯＢｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＯＢｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害するために用いられ得る。ＯＢをコードする核酸に特異性を
有するリボザイムは、本明細書に開示のＯＢ ＤＮＡのヌクレオチド配列に基づ
いて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮ
Ａの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が、ＯＢをコードするｍＲＮＡにお
いて切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築され得る。例えば、
Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第
５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＯＢｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子の
プールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するために
用いられ得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：
１４１１−１４１８を参照のこと。
【０１６０】 あるいは、ＯＢ遺伝子発現は、ＯＢ核酸の調節領域（例えば、ＯＢプロモータ
ーおよび／またはエンハンサー）に相補的であるヌクレオチド配列を標的化し、
標的細胞中のＯＢ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって
阻害され得る。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒ
ｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉ
ｏａｓｓａｙｓ １４：８０７−１５を参照のこと。
【０１６１】 種々の実施形態では、ＯＢの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改
変され、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善
し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変してペプチド核酸を
生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ４：５
−２３を参照のこと）。本明細書で用いられる場合、用語「ペプチド核酸」また
は「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格がシュードペプチド（ｐｓｅｕｄ
ｏｐｅｐｔｉｄｅ）骨格で置換され、かつ４つの天然のヌクレオ塩基のみが保持
されている、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物をいう。ＰＮＡの中性の骨格は
、低イオン強度条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーショ
ンを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら
（１９９６）上述；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ ９３
：１４６７０−６７５に記載のような、標準的な固相ペプチド合成プロトコール
を用いて実施され得る。
【０１６２】 ＯＢのＰＮＡは、治療適用および診断適用で用いられ得る。例えば、ＰＮＡは
、例えば、転写または翻訳抑止（ａｒｒｅｓｔ）を誘導すること、または複製を
阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス剤また
はアンチ遺伝子剤として用いられ得る。ＯＢのＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指
向ＰＣＲクランピングによる、例えば、遺伝子中の１塩基対変異の分析に；他の
酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼと組み合わせて用いる場合、人工の制限酵素と
して（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．（１９６６）上述）；またはＤＮＡ配列およびハイブリ
ダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９６６）
上述；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）上述）用いられ得る。
【０１６３】 別の実施形態では、ＯＢのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性の
取り込みを増大するために、ＰＮＡに親油性基またはその他の補助基を結合する
ことによるか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によるか、またはリポソームの使用
もしくは当該分野で公知の薬物送達のその他の技法によって改変され得る。例え
ば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な性質を組み合わせ得る、ＯＢのＰＮＡ−ＤＮＡキメ
ラが生成され得る。このようなキメラは、ＰＮＡ部分の高い結合親和性および特
異性を提供しながら、ＤＮＡ部分と相互作用するために、ＤＮＡ認識酵素、例え
ば、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメ
ラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合の数、および配向の点から選択
された適切な長さのリンカーを用いて連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上
述）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９６６）上述およびＦｉ
ｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３３５７−６３に記
載のように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準的なホルホルアミダイトカ
ップリング化学を用いて固体支持体上で合成し得、そして改変ヌクレオシドアナ
ログ、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミ
ジンホスホルアミダイトを、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に用い得る（Ｍａ
ｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７：５９７３−８８）。次い
で、ＰＮＡモノマーを段階的様式でカップリングし、５’ＰＮＡセグメントと３
’ＤＮＡセグメントをもつキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上述
）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントと３’ＰＮＡセグメントを
有して合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５：１１１９−１１１２４を参照のこと。
【０１６４】 その他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、イン
ビボで宿主細胞レセプターを標的にするため）、または細胞膜を横切る輸送を容
易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒ
ｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５
２；ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関
門を横切る輸送を容易にする薬剤（例えば、ＰＣＴ公開公報番号ＷＯ８９／１０
１３４を参照のこと）のような他の付属基を含み得る。さらに、オリゴヌクレオ
チドは、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８
８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）またはイ
ンターカーレーティング剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．
５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、
このオリゴヌクレオドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー
架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤などの他の分子に連結
され得る。
【０１６５】 （ＯＢポリペプチド） 本発明の１つの局面は、単離されたＯＢタンパク質、およびその生物学的に活
性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関す
る。抗ＯＢ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプチドフラ
グメントもまた提供される。１つの実施形態では、ネイティブＯＢタンパク質が
、標準的なタンパク質精製技法を用いる適切な精製スキームにより、細胞供給源
または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＯＢタンパク質は、組
換えＤＮＡ技法により産生される。組換え発現の代替として、ＯＢタンパク質ま
たはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技法を用いて化学的に合成され得る
。
【０１６６】 「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なその
部分は、ＯＢタンパク質が由来する細胞供給源または組織供給源からの細胞性物
質またはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、化学的に合成された場
合、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性
物質を実質的に含まない」は、ＯＢタンパク質が、単離されるかまたは組換えに
より産生された細胞の細胞成分から分離されているＯＢタンパク質の調製物を含
む。１つの実施形態では、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＯＢタ
ンパク質（本明細書ではまた「夾雑タンパク質」と呼ばれる）が約３０％（乾燥
重量による）より少ない、より好ましくは約２０％より少ない非ＯＢタンパク質
、なおより好ましくは約１０％より少ない非ＯＢタンパク質、そして最も好まし
くは約５％より少ない非ＯＢタンパク質を有する、ＯＢタンパク質の調製物を含
む。このＯＢタンパク質または生物学的に活性なその部分が組換えにより産生さ
れる場合、培養培地を実質的に含まないこともまた好ましい。すなわち、培養培
地は、タンパク質調製物の容量の約２０％より少ないか、より好ましくは約１０
％より少ないか、そして最も好ましくは約５％より少ない。
【０１６７】 用語「化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパ
ク質の合成に関与する化学的前駆体またはその他の化学物質からこのタンパク質
が分離されているＯＢタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「
化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」は、化学的前駆体ま
たは非ＯＢ化学物質を約３０％（乾燥重量による）より少く、より好ましくは化
学的前駆体または非ＯＢ化学物質を約２０％より少なく、なおより好ましくは化
学的前駆体または非ＯＢ化学物質を約１０％より少なく、そして最も好ましくは
化学的前駆体または非ＯＢ化学物質を約５％より少なく有するＯＢタンパク質の
調製物を含む。
【０１６８】 ＯＢタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＯＢタンパク質のアミノ酸配列（
例えば、全長ＯＢタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＯＢタンパク質
の少なくとも１つの活性を示すＯＢ６を含む核酸によってコードされるアミノ酸
配列）に十分に相同的であるか、またはこのアミノ酸配列から誘導されるアミノ
酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＯＢタン
パク質の少なくとも１つの活性をともなうドメインまたはモチーフを含む。ＯＢ
タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００また
はそれ以上のアミノ酸の長さのポリペプチドであり得る。
【０１６９】 本発明のＯＢタンパク質の生物学的に活性な部分は、これらのＯＢタンパク質
の間で保存された上記のドメインのうちの少なくとも１つを含み得る。ＯＢタン
パク質の代替の生物学的に活性な部分は、上記のドメインのうちの少なくとも２
つを含み得る。ＯＢタンパク質の別の生物学的に活性な部分は、上記のドメイン
のうちの少なくとも３つを含み得る。本発明のＯＢタンパク質のなお別の生物学
的に活性な部分は、上記のドメインのうちの少なくとも４つを含み得る。
【０１７０】 さらに、このタンパク質の他の領域が欠失した、他の生物学的に活性な部分が
、組換え技法により調製され得、ネイティブなＯＢタンパク質の１つ以上の機能
的活性について評価され得る。
【０１７１】 いくつかの実施形態において、ＯＢタンパク質は、これらのＯＢタンパク質の
うちの１つに実質的に相同的であり、そしてその機能的活性を保持し、以下に詳
細に記載されるように、なおも天然の対立遺伝子改変または変異誘発に起因する
アミノ酸配列において異なる。
【０１７２】 特定の実施形態において、本発明は、その発現が哺乳動物において調節される
ポリペプチドの配列に８０％以上同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリ
ペプチドを含む。
【０１７３】 本発明に従うＯＢタンパク質を使用して、被験体において肥満症を処置し得る
。この被験体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。１つの局面
において、被験体における肥満症を処置するために使用されるこのようなポリペ
プチドの発現状態は、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）によって調節される。「発現状
態」は、このポリペプチドが発現される程度を意味する。特定の実施形態におい
て、被験体における肥満症を処置するために使用されるポリペプチドの発現状態
は、アップレギュレートされ得る（すなわち、ＯＢ：３）か、またはダウンレギ
ュレートされ得る（すなわち、ＯＢ：１、２および４〜６）。さらに別の局面に
おいて、被験体における肥満症を処置するために使用されるポリペプチドは、下
垂体から分泌される。
【０１７４】 （２つ以上の配列間の相同性の決定） ２つのアミノ酸配列の相同性または２つの核酸の相同性のパーセントを決定す
るために、これらの配列を、最適な比較の目的にアラインする（例えば、第２の
アミノ酸配列または核酸配列との最適アラインメントのために第１のアミノ酸配
列または核酸配列の配列中にギャップを導入し得る）。次いで、対応するアミノ
酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。
第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌ
クレオチドで占められる場合、この分子はその位置で相同である（すなわち、本
明細書で用いられる場合、アミノ酸「相同性」または核酸「相同性」は、アミノ
酸「相同性」または核酸「同一性」と等価である）。
【０１７５】 核酸配列相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。この相
同性は、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰソフトウェアのような
当該分野で公知のコンピュータープログラムを用いて決定され得る。Ｎｅｅｄｌ
ｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３
−４５３を参照のこと。ＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用して核酸配列比較の
ために以下の設定を用い：５．０のＧＡＰ作成ペナルティーおよび０．３のＧＡ
Ｐ伸長ペナルティー、上記で言及した類似の核酸配列のコード領域は、好ましく
は、ＯＢ６を含むＤＮＡ配列のＣＤＳ（すなわちコードする）部分と、少なくと
も７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の
同一性の程度を示す。
【０１７６】 用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、比較の特定の領域にわたって残基対残基の基本に基づいて同一である程度を
いう。用語「配列同一性のパーセント」は、その比較の領域にわたり最適にアラ
インされた配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、
核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が生じる位置の数を決定し、一致
した位置の数を得ること、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウンンドウサイ
ズ）によって一致した位置の数を除すること、およびこの結果に１００を乗じ配
列同一性のパーセントを得ることにより算出される。本明細書で用いられる場合
、用語「実質的に同一」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、この
ポリヌクレオチドは、比較領域にわたって参照配列と比較した場合、少なくとも
８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性そしてしばしば
９０〜９５％の配列同一性、より通常は少なくとも９９％の配列同一性を有する
配列を含む。
【０１７７】 （ＯＢキメラおよび融合タンパク質） 本発明はまた、ＯＢキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用
される場合、ＯＢ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＯＢポ
リペプチドと作動可能に連結されたＯＢポリペプチドを含む。「ＯＢポリペプチ
ド」は、ＯＢに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、一方、「非
ＯＢポリペプチド」は、このＯＢタンパク質に実質的に相同ではないタンパク質
に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう（例えば、ＯＢタンパク質
とは異なり、しかも同一かまたは異なる生物に由来するタンパク質）。ＯＢ融合
タンパク質の中で、ＯＢポリペプチドは、ＯＢタンパク質のすべてか、またはそ
の一部分に対応する。１つの実施形態では、ＯＢ融合タンパク質は、ＯＢタンパ
ク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態において、
ＯＢ融合タンパク質は、ＯＢタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部
分を含む。なお別の実施形態では、ＯＢ融合タンパク質は、ＯＢタンパク質の少
なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「
作動可能に連結される」は、ＯＢポリペプチドおよび非ＯＢポリペプチドが互い
にインフレームで融合していることを示すことを意図する。非ＯＢポリペプチド
は、ＯＢポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１７８】 例えば、１つの実施形態では、ＯＢ融合タンパク質は、第二のタンパク質の細
胞外ドメインに、作動可能に連結されたＯＢドメインを含む。このような融合タ
ンパク質は、ＯＢ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイ（こ
のようなアッセイは、以下に詳細に記載される）においてさらに利用され得る。
【０１７９】 なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＯＢ融合タンパ
ク質であり、ここでＯＢ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換え
ＯＢの精製を容易にし得る。
【０１８０】 別の実施形態では、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異質シグナル配列を
含むＯＢタンパク質である。例えば、ネイティブなＯＢシグナル配列を除去し得
、そして別のタンパク質からのシグナル配列で置き換え得る。特定の宿主細胞で
は（例えば、哺乳動物宿主細胞）、ＯＢの発現および／または分泌は、異質シグ
ナル配列の使用を通じて増大され得る。
【０１８１】 なお別の実施形態では、この融合タンパク質は、ＯＢ−免疫グロブリン融合タ
ンパク質であり、ここで１つ以上のドメインを有するＯＢ配列が、免疫グロブリ
ンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこの
ＯＢ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に組み込まれ、そして
被験体に投与されて、細胞の表面上でＯＢリガントとＯＢタンパク質との間の相
互作用を阻害し、それによってインビボのＯＢ媒介信号伝達を抑制し得る。この
ＯＢ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＯＢ同族リガンドの生体利用性に
影響を与え得る。ＯＢリガンド／ＯＢ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障
害の両方の処置、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進または阻害）に、治療
的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＯＢ−免疫グロブリン融合タンパク
質は、被験体中で抗ＯＢ抗体を産生するため、ＯＢリガンドを精製するため、お
よびＯＢリガンドとのＯＢの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニング
アッセイにおいて、免疫原として用いられ得る。
【０１８２】 本発明のＯＢキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法によ
り産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメ
ントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端化末端または粘着
（ｓｔａｇｇｅｒ）末端化末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必
要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避け
るためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより
、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化Ｄ
ＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントの
ＰＣＲ増幅を、次いでアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグ
メント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて、キメラ遺
伝子配列を生成するために実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲ
ＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（
例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販さ
れている。ＯＢをコードする核酸は、この融合部分がＯＢタンパク質にインフレ
ーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１８３】 （ＯＢアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、ＯＢアゴニスト（模倣物）またはＯＢアンタゴニストのいずれ
かとして機能するＯＢタンパク質の改変体に関する。ＯＢタンパク質の改変体、
例えば、ＯＢタンパク質の離散した点変異または短縮型が、変異誘発により生成
され得る。ＯＢタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＯＢタンパク
質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し
得る。ＯＢタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＯＢタンパク
質の１つ以上の活性を、例えば、ＯＢタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケ
ードの下流メンバーまたは上流メンバーに競合的に結合することにより阻害され
得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理によ
り惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の
生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＯＢタンパク
質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用
を有する。
【０１８４】 ＯＢアゴニスト（模倣物）またはＯＢアンタゴニストのいずれかとして機能す
るＯＢタンパク質の改変体は、ＯＢタンパク質アゴニスト活性またはアンタゴニ
スト活性についてのＯＢタンパク質の変異体、例えば短縮型変異体のコンビナト
リアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施
形態では、ＯＢ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル
変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる
。ＯＢ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合
物を、潜在的なＯＢ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは
、その中にＯＢ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）
より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列中
に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から
潜在的なＯＢ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法が
ある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次
いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結され得る。遺伝子の縮重セ
ットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＯＢ配列の所望のセットをコー
ドする配列のすべての供給量を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する
方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １１：４
７７を参照のこと）。
【０１８５】 （ポリペプチドライブラリー） さらに、ＯＢタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、
ＯＢタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＯＢフラ
グメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメ
ントのライブラリーは、ＯＢコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子
あたり約１つのみのニックが生じる条件下において、ヌクレアーゼで処理するこ
と、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセ
ンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ
１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去す
ること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結する
ことにより生成し得る。この方法により、ＯＢタンパク質の種々のサイズのＮ末
端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０１８６】 点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物についてｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が当該分野で公知
である。このような技法を、ＯＢタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により
生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな
遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した
最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現
ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な
細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺
伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でこのコンビナトリアル遺
伝子を発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新
規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングア
ッセイと組み合わせて用い、ＯＢ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕ
ｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ
ら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１
）。
【０１８７】 （抗ＯＢ抗体） 単離されたＯＢタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポリク
ローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技法を用いて
、ＯＢに結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。完全長のＯ
Ｂタンパク質が用いられ得るが、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のた
めのＯＢの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＯＢの抗原性ペプチドは、
ＯＢ６に示される核酸配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列の少な
くとも８アミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体がＯ
Ｂと特異的な免疫複合体を形成するように、ＯＢのエピトープを含む。好ましく
は、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少な
くとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは２０酸残基、および最も好ましく
は３０アミノ酸残基を含む。抗原性ポリペプチドによって包含される好ましいエ
ピトープは、タンパク質の表面に配置されるＯＢの領域（例えば、親水性領域）
である。抗体産生を標的化するための手段として、親水性および疎水性の領域を
示すヒドロパシープロットを、フーリエ変換を伴うか伴わない、当該分野で周知
の任意の方法（例えば、Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ Ｗｏ
ｏｄｓ法を含む）によって生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考
として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参
照のこと。
【０１８８】 ＯＢポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモ
ログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成における免
疫原として利用し得る。本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、免疫グロ
ブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、Ｏ
Ｂのような抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子をいう
。このような抗体は、制限されずに、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ ’ ）２フラグメン
ト、およびＦａｂ発現ライブラリーを含む。当該分野で公知の種々の手順が、Ｏ
Ｂタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモロ
グに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得
る。これらのタンパク質のいくつかは、以下で議論される。
【０１８９】 ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）は、ネイティプタンパク質、またはそ
の合成改変体、または前述の誘導体での注射により免疫化され得る。適切な免疫
原調製物は、例えば、組換えにより発現されたＯＢタンパク質または化学的に合
成されたポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジュバントをさらに含み
得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のアジュバントは、制限さ
れずに、フロイント（完全および不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば
、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック
ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、
Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、または類似の免疫刺激剤
を含む。所望であれば、ＯＢに対して指向された抗体分子は、哺乳動物（例えば
、血液）から単離され得、そしてさらに、ＩｇＧフラクションを得るためのプロ
テインＡクロマトグラフィーのような、周知の技法により精製され得る。
【０１９０】 本明細書で用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクロー
ナル抗体組成物」は、ＯＢの特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の
１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル抗
体組成物は、それと免疫反応する特定のＯＢタンパク質に対し、単一の結合親和
性を示す。特定のＯＢタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナ
ログもしくはホモログに対して指向されたモノクローナル抗体の調製には、連続
的な細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技法が利用され得る。こ
のような技法は、制限されずに、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ、１９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；
トリオーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生
するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯ
ＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌ
ａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）を含む。ヒトモノク
ローナル抗体を、本発明の実施において利用し得、そしてヒトハイブリドーマを
用いることによるか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロ
でヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することにより（Ｃｏｔ
ｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡ
ＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７−９６頁を
参照のこと）産生され得る。
【０１９１】 本発明によれば、技法は、ＯＢタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために
適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さら
に、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合され得（例えば、Ｈｕ
ｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと
）、ＯＢタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモ
ログに対し、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速か
つ有効な同定を可能にする。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技法により「ヒト
化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＯＢタ
ンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当該分野で公知の
技法により産生し得、以下を含むがこれらに限定されない：（ｉ）抗体分子のペ
プシン消化により産生されるＦ（ａｂ ’ ）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ ’ ）２ フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフ
ラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により生成さ
れるＦａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０１９２】 さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクロ
ーナル抗体のような、組換え抗ＯＢ抗体（これらは、標準組換えＤＮＡ技術を用
いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒ
ト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により生成され
得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番号ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ８６／０２２６９；欧州特許出願番号第１８４，１８７号；欧州特許出願番号
第１７１，４９６号；欧州特許出願番号第１７３、４９４号；ＰＣＴ国際公開番
号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，
２２５，５３９号；欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１
９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）
ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１
４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：
９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４
４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８０：
１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９
：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：
２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ １４１：４０５３〜４０６０。
【０１９３】 １つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのた
めの方法は、当該分野内で公知の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これらに限定されない。特定の
実施形態において、ＯＢタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体
の選択は、このようなドメインを所有しているＯＢタンパク質のフラグメントに
結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＯＢタンパク質内の１つ以
上のドメイン（例えば、ＯＢファミリータンパク質、あるいはそれらの誘導体、
フラグメント、アナログまたはホモログの上記保存された領域にわたるドメイン
）に対して特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０１９４】 抗ＯＢ抗体は、ＯＢタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分
野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサンプル内の
ＯＢタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のた
めに、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態にお
いて、ＯＢタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたは
ホモログに対する抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な
化合物［本明細書中、以下において「治療剤」］として利用される。
【０１９５】 抗ＯＢ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＯＢを単離するために用いら
れ得る。抗ＯＢ抗体は、細胞からの天然のＯＢ、そして宿主細胞において発現さ
れる組換え的に産生されたＯＢの精製を容易にし得る。さらに、抗ＯＢ抗体が、
（例えば、細胞性溶解物または細胞上清における）ＯＢタンパク質を検出するた
めに用いられ、ＯＢタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＯＢ
抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手
順の一部として組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に用
いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に連結する（すなわち、物理的に連結
する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補
欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。
適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適
切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビ
ジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン
、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロ
トリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオ
レセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の
例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラ
ーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質
の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１９６】 （ＯＢ組換え発現ベクターおよび宿主細胞） 本発明の別の局面は、ＯＢタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、
発現ベクターに関する。本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は
、それに連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクター
は、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る直
線状または環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性
ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結さ
れ得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る
（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動
物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、
宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより
宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能
に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書にお
いて「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発
現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラス
ミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベク
ターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果
たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス
、およびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むことが意
図される。
【０１９７】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の
本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作
動可能に連結される、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される、１つ以
上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連
結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳
系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において
）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されるという意味
を意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現
制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。こ
のような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯ
Ｎ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １
８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１
９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオ
チド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌク
レオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発
現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発
現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の
発現ベクターは、宿主細胞中に導入され得、それにより、本明細書に記載される
核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合
ペプチドを含む）（例えば、ＯＢタンパク質、ＯＢの変異形態、融合タンパク質
など）を生成し得る。
【０１９８】 本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＯＢ発現のために設計され得る。例えば、ＯＢは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または
哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥ
ＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ
ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに議論される。あるいは、組換
え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼ
を用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１９９】 原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベ
クターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ
末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、
以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増大させる
こと；（２）組換えタンパク質の溶解度を増大させること；および（３）アフィ
ニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質
の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解
性切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そしてこの組換えタンパク質によ
り、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離すること
が可能になる。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、ト
ロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては
、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク
質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧ
ＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏ
ｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０２００】 適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍ
ｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１
ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が
挙げられる。
【０２０１】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラ
テジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿
主細菌中でタンパク質を発現することである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺ
ＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは
、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用さ
れるコドンであるように発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変更する
ことである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤ
ＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０２０２】 別の実施形態において、ＯＢ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母
Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐ
Ｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：２２９−２３４
）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌ
ｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）
Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（
ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙
げられる。
【０２０３】 あるいは、ＯＢは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で
発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現の
ために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉ
ｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６−２１６５）お
よびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２０４】 なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤ
Ｍ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２Ｐ
Ｃ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）が挙げ
られる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばし
ば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用される
プロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およ
びシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方の
ための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を
参照のこと。
【０２０５】 別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例え
ば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の
発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切
な組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター
（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８
−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９
８８）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプ
ターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭ
ＢＯ Ｊ ８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎ
ｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢ
ａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン
特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ
およびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓
特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９
１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター
；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が
挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウス
ホックス（ｍｕｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓ
ｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプ
ロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅ
ｎｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７−５４６）。
【０２０６】 本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分
子は、ＯＢ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（ＤＮＡ
分子の転写によって）可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々
の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセ
ンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、
ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、ある
いは、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞特異的発
現を指向する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換え
プラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここ
ではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベ
クターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用す
る遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅ
ｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２０７】 本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのよ
うな細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的
影響のいずれかに起因して、特定の改変が次の世代において生じ得るので、この
ような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中
で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０２０８】 宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ｏ
Ｂタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺
乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ
細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２０９】 ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を使用し
て原核生物細胞または真核生物細胞中に導入され得る。本明細書中で使用される
場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（
例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技術
をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈
、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、また
はエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェ
クションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出さ
れ得る。
【０２１０】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、用いられる発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技法に依存して、細胞の小フラクションのみが外
来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込み得ることが知られている。これらの組込み
体を同定および選択するために、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対
する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子とともに宿主細胞中に導入され
る。種々の選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセート
のような薬物に対する耐性を付与するものを含む。選択マーカーをコードする核
酸は、ＯＢをコードするのと同じベクター上に宿主細胞中に導入され得るか、ま
たは別のベクター上に導入され得る。この導入された核酸で安定にトランスフェ
クトされた細胞は、薬物選択により同定され得る（例えば、取り込まれた選択マ
ーカー遺伝子をもつ細胞は生存し、一方、その他の細胞は死滅する）。
【０２１１】 培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のような、本発明の宿主細
胞を用いて、ＯＢタンパク質を産生（すなわち、発現）し得る。従って、本発明
はさらに、本発明の宿主細胞を用いてＯＢタンパク質を産生する方法を提供する
。１つの実施形態では、この方法は、本発明の宿主細胞（その中にＯＢをコード
する組換え発現ベクターが導入されている）を、適切な培地中で、このＯＢタン
パク質が産生されるように培養する工程を包含する。別の実施形態では、この方
法は、この培地から、または宿主細胞からＯＢを単離する工程をさらに包含する
。
【０２１２】 （ＯＢ核酸を同定するためのキットおよび核酸収集物） 別の局面では、本発明は、肥満に関連する病理を試験するために有用なキット
を提供する。このキットは、２以上のＯＢ配列を検出する核酸を含み得る。好ま
しい実施形態では、キットは、３、４、５または全てのＯＢ核酸配列を検出する
試薬を含む。
【０２１３】 キットまたは複数の核酸配列は、例えば、１以上のＯＢ核酸配列を特異的に同
定し得るＯＢ核酸配列に相同な配列を含み得る。
【０２１４】 本発明は、ＯＢ１〜６からなる群より選択される２以上の核酸配列を検出する
ための１以上の試薬を含むキットを提供する。種々の実施形態では、ＯＢ１〜６
により表される、２、３、４、５またはそれ以上の配列の発現が測定される。こ
のキットは、例えば、列挙された核酸の部分に相補的な相同核酸配列（例えば、
オリゴヌクレオチド配列）または遺伝子によりコードされるタンパク質に対する
抗体を有することにより、列挙された核酸を同定し得る。
【０２１５】 本発明はまた、プローブ核酸のアレイを含む。これらのプローブ核酸配列は、
ＯＢ１〜６からなる群より選択される２以上の核酸配列を検出する。種々の実施
形態では、ＯＢ１〜６により表される、２、３、４、５またはそれ以上の配列の
発現が同定される。
【０２１６】 アレイにおけるプローブ核酸は、例えば、列挙された核酸の部分に相補的な相
同核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチド配列）を有することにより、列挙され
た核酸を検出し得る。この基板アレイは、米国特許第５，７４４，３０５号に記
載されるように、例えば、固体基板（例えば、「チップ」）上であり得る。
【０２１７】 本発明はまた、単離された複数の核酸配列を含む。この複数の核酸配列は、典
型的には、ＯＢ１〜６により表される、２以上の核酸配列を含む。種々の実施形
態において、この複数の核酸配列は、代表的には、ＯＢ１〜６により表される、
２、３、４、５またはそれ以上の配列を含む。
【０２１８】 「単離された」核酸分子は、他の核酸分子から分離された核酸分子であり、こ
れは、核酸に天然に供給源に存在する。単離された核酸分子の例としては、ベク
ターに含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分
子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子または合
成ＲＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、そして「単離
された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の天然に核酸に隣接する
配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
種々の実施形態では、単離された核酸分子は、約５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満、
５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未
満または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得、このヌクレオチド配列は
、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然に隣接する。さら
に、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、他の細胞性材料また
は培養培地を実質的に含まない（組換え技術によって産生された場合）か、また
は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない（化学的に合成された
場合）。
【０２１９】 （本発明に従う組成物） 別の局面では、本発明は、下垂体により分泌される組成物を含む。このような
組成物は、肥満と関連付けられ、そしてその発現状態は、レプチン（ｌｅｐｔｉ
ｎ）処置により調節され得る。「発現状態」は、組成物が発現される程度を意図
する。特定の実施形態では、この組成物は、ＯＢ１〜６からなる群より選択され
る。この組成物は、本発明に従う方法のいずれかにおいて使用され得る。
【０２２０】 本発明はさらに、以下の実施例に詳細に記載され、これは、特許請求の範囲に
記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２２１】 （実施例１：動物） ４つの群のマウス（これは、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇのためのサンプルを生じ
るように処理された）は以下であった： Ａ）リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（「ビヒクル」）で処置した肥満（ｏ
ｂ／ｏｂ）［「肥満／ＰＢＳ」］ Ｂ）レプチン−ＩｇＧ／ＰＢＳ（「レプチン」）で処置した肥満（ｏｂ／ｏｂ
）［「やせ／レプチン」］ Ｃ）ＰＢＳで処置したやせ（ｏｂ／＋または＋／＋）［「やせ／ＰＢＳ」］ Ｄ）レプチン−ＩｇＧ／ＰＢＳで処置したやせ（ｏｂ／＋または＋／＋）（「
やせ／レプチン」）。
【０２２２】 マウス（Ｃ５７Ｂ１／６肥満（ｏｂ／ｏｂ）およびやせ（ｏｂ／＋、＋／＋同
腹子；８週齢；雌））をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。これらを試験
を開始する前に１０日間馴化した。食料および水を随意に与え、そしてこれらを
１２時間（６：００ｐｍ〜６：００ａｍ）の暗闇：１２時間の照明のサイクルに
維持した。各マウスを秤量し、そしてレプチン−ＩｇＧタンパク質を１ｍｇ／ｋ
ｇで投与した。このマウスを、毎日注射し、そして秤量し、そして食料摂取量を
測定した。７日にわたって増えた重量は、肥満／ＰＢＳ，２．７＋／−０．３ｇ
ｍ；肥満／レプチン，−３．５＋／０．２ｇｍ；やせ／ＰＢＳ ０．６＋／−０
．１ｇｍ；やせ／レプチン，−０．４＋／−０．１ｇｍであった。食料摂取量（
７日を過ぎたマウスあたり）は、肥満／ＰＢＳ，３５＋／−０．８ｇｍ；肥満／
レプチン，２０＋／−０．５ｇｍ；やせ／ＰＢＳ ２３＋／−０．８ｇｍ；やせ
／レプチン，１８．５＋／−０．５ｇｍであった。
【０２２３】 ７日間の毎日の注入後、マウスを屠殺し、そして筋肉（腓腹筋）、肝臓、脂肪
（プールされた腎周囲および卵巣）、下垂体および視床下部（ｈｙｐｏｔｈａｌ
ａｍｉ）を取り出し、そしてドライアイス上でスナップ凍結した。ＲＮＡを以下
に記載するように組織から抽出した。４つの群中の、全部で２４０のマウス（１
２０の肥満および１２０のやせ）を使用した。各組織について、３つのプールを
調製し、各プールは、５（肝臓）と２０（下垂体および視床下部）との間のマウ
スを含んだ。ＲＮＡを、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）のために組織の各
プールから調製した。
【０２２４】 （実施例２：示差的遺伝子発現分析） ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（登録商標）反応を、本質的には記載される（Ｓｈｉ
ｍｋｅｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７９８〜８
０３（１９９９））ように行った。簡潔には、総細胞ＲＮＡを、相分離のために
１〜１０倍量のブロモクロロプロパンを使用して、Ｔｒｉｚｏｌ（ＢＲＬ，Ｇｒ
ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ）で単離した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ ＯＨ）。混入している
ＤＮＡを０．０１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ）およ
び１ユニット／μｌ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）
の存在下でＤＮＡａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で処理す
ることにより除去した。フェノール／クロロホルム抽出後、ＲＮＡ量を分光光度
法およびホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動により評価し、そしてＲＮＡ
収量を、ＯｌｉｎＧｒｅｎｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎ
ｅ ＯＲ）を用いて蛍光光度法により測定した。ポリ−Ａ＋ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）磁気ビーズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を使用し
て５０μｇの総ＲＮＡから調製し、そして蛍光光度法を用いて定量した。
【０２２５】 第１鎖ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬ，Ｇｒａｎ
ｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ）を使用して１．０μｇのポリ＋Ａから調製した。第２
鎖の合成を、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、およ
びＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（全てＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ
製）の添加後に行った。次いで、５ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加
し、そしてインキュベーションを１６℃にて５分間続けた。反応を北極のエビ（
ａｒｃｔｉｃ ｓｈｒｉｍｐ）アルカリホスファターゼ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌ
ａｎｄ ＯＨ）で処理し、そしてｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出によ
り精製した。ｃＤＮＡの収率をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）で蛍光光度法を使用して測定した。
【０２２６】 （実施例３：ｃＤＮＡフラグメント化、タグ化および増幅） フラグメント化を、９６の個々の制限酵素消化（それぞれ、９６の制限酵素対
のうちの１つを使用する）によって達成した。タグ化は、制限消化の間に産生す
るｃＤＮＡフラグメントの５’末端および３’末端に適合性の末端を有する増幅
カセットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応によって達成した。増幅カセットによって
、ＰＣＲ産物の１つの鎖が蛍光タグ（ＦＡＭ）を用いて標識され、他の鎖がビオ
チンで標識される。増幅は、Ｋｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｄｖａｎｔ
ａｇｅ）およびＰＦＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）熱安
定ポリメラーゼの組み合わせを使用して実行された。ＰＣＲ産物精製は、磁性ス
トレプトアビジンビーズ（ＣＰＧ Ｉｎｃ．、Ｌｉｎｃｏｌｏｎ Ｐａｒｋ Ｎ
Ｊ）および磁石を使用して行った。磁性ビーズに結合される、精製され、蛍光標
識され、そしてビオチニル化されたＰＣＲ産物を、ビオチン化された鎖が、スト
レプトアビジンコートＭＰＧＴＭ磁性ビーズとの会合を保持し得ながら、ＦＡＭ
標識ｃＤＮＡ鎖を溶解する条件下で、ＲＯＸタグ化分子サイズ標準（ＰＥ−Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を含む、
ゲル充填緩衝液中で変性した。変性に続いて、サンプルを５％ポリアクリルアミ
ド、６Ｍ尿素、０．５×ＴＢＥ超薄膜ゲル上に充填し、Ｎｉａｇａｒａ機器上で
電気泳動した。ＰＣＲ産物を、ビオチン化していないＰＣＲプライマーの１つの
５’末端において蛍光標識によって視覚化し、これによって、全ての検出された
フラグメントが両方の酵素によって消化されたことを確実にした。
【０２２７】 Ｎｉａｇａｒａゲル電気泳動システムの１次成分は、上記のように作製され、
精製され、蛍光標識された一本鎖ｃＤＮＡフラグメントの検出を可能にする、定
置型レーザー励起およびマルチカラーＣＣＤイメージングシステムを使用するプ
ラットフォームに載置された、水平超薄膜４８ウェルゲルカセットである。
【０２２８】 （実施例４：ゲル解釈） 電気泳動機器の出力は、Ｊａｖａ（登録商標）に基づく、インターネット準備
されたＯｐｅｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＯＧＩ）ソフトウェア
を使用して処理する。各レーンは、５０〜５００ｂｐの範囲に渡るサイジングラ
ダー（ｓｉｚｉｎｇ ｌａｄｄｅｒ）および単一のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ反応
の蛍光標識産物を含む。ＲＯＸラダーピークは、ＣＣＤカメラフレームと塩基対
におけるＤＮＡフラグメントサイズとの間の関係を提供する。ＯＧＩソフトウェ
アは、それぞれ、サイジングラダーおよびサンプルからのＲＯＸおよびＦＡＭピ
ークにより生成されるシグナルおよびレーンを追跡するために使用される。ラダ
ーピーク間の一次補間を使用して、フレームからの蛍光トレースを塩基対に変換
する。ここで、サイズ決めされ、かつｃＤＮＡを消化するために使用される制限
対によって規定される５’末端および３’末端を有するＦＡＭ標識ｓｓＤＮＡに
対応するデータは、Ｏｒａｃｌｅ ８データベースに、点−点長さ対増幅アドレ
スとして投入（ｓｕｂｍｉｔ）される。
【０２２９】 （実施例５：示差的発現分析および仮の遺伝子同定） ３つの組織サンプルからそれぞれ作製される各ｃＤＮＡプールについて、３つ
の独立したＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ反応を行った。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ反応
からのＯＧＩ作製トレースデータについての各サンプルを表す複合トレースを、
特定の閾値限界を越える差を検出するように設計されたソフトウェアを使用して
、ペアで（すなわち、ｏｂ／ｏｂ下垂体±レプチン（ｌｅｐｔｉｎ））比較した
。データベース問合せを、制限消化フラグメント化によって規定される末端を有
するサイズ決めされたフラグメントに固有の情報を使用して実行した。
【０２３０】 （実施例６：オリゴヌクレオチド位置決めによる遺伝子の確認） 公知のマウス遺伝に対する末端配列および長さにおいてマッピングする制限フ
ラグメントを、非標識オリゴヌクレオチドプライマーの設計のための鋳型として
使用した。制限フラグメントの一端に対して設計された非標識オリゴヌクレオチ
ドをもとの反応物に過剰に加え、そしてＰＣＲによって再増幅した。次いで、競
合するＰＣＲプライマーとのこの新たな反応物を電気泳動して、目的のピークの
選択的減少を評価するために非標識オリゴヌクレオチドなしで再増幅されるコン
トロール反応と比較した。Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、上記を参照のこと。
【０２３１】 （実施例７：リアルタイム定量的ＰＣＲ（「ＲＴＱ−ＰＣＲ」） ＲＴＱ−ＰＣＲを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅ
ｔｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ機器およびソフトウェア（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して
、表３に記載されるプライマーを使用して記載されるように実施した。Ｈｅｉｄ
ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９４（１９９６）およびＧｉｂｓｏｎ
ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９９５−１００１（１９９６）を参照のこと。
【０２３２】
【表３】 （実施例８：脂肪細胞培養物） 脂肪細胞を、８週齢の絶食した（二時間）雌性Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス（Ｊａ
ｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）の卵巣脂肪パッドから調
製した。Ｒｏｄｂｅｌｌら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９：３７５−８０（
１９６４）を参照のこと。脂肪パッドを、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｎＭアデノシン、５ｍＭグルコース、３％画分
Ｖ ＢＳＡ、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２５ｍＭＭ
ｇＳＯ４、０．４５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．１７ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、および
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）中で細かく切った。脂肪組織フラグメントを、同
じ緩衝液中で、Ｉ型コラーゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）の存在下で３７℃で穏やか
に３０分間振盪（１００ｒｐｍ）しながら消化した。単離された脂肪細胞を、２
５０μＭのポリプロピレンメッシュを通した濾過によって未消化の組織から分離
し、そして３回洗浄した。洗浄の間、細胞を３分間、５００ｒｐｍで遠心分離し
た。各時間において、下澄みを捨て、細胞をＫｒｅｂ−Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液中で再懸濁し、最終洗浄は５．５ｍＭグルコース ＤＭＥＭ中、５％Ｂ
ＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼおよび１０ｐ
Ｍ（−）−Ｎ６−（２−フェニルイソプロピルアデノシン）を用いてである。脂
肪細胞を４８ウェルプレート、１ウェル当たり５００μｌにつき５×１０５細胞
中で培養した。細胞を、ＡＣＴＨ（１００、１０、１および０．１ｎＭ；Ｓｉｇ
ｍａ）またはラットプロラクチン（１００、１０、１および０．１ｎＭ；Ａｃｃ
ｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で四つ組みで処理した。ｒｈＩｎｓｕｌｉｎ（
１、０．１および０．０１ｎＭ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）およびイソプロテレノー
ル（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）（３０、１０、３および１ｎＭ；Ｓｉｇｍａ
）を加えて、ポジティブコントロールとしてウェルを分離した。細胞を３７℃／
５％ＣＯ２で、インキュベートした。５０μｌを４時間およびまた１６時間でサ
ンプリングした。培地グルコースをヘキソキナーゼ比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ）
によって測定し、培地グリセロールを、グリセロールキナーゼ／オキシダーゼ比
色アッセイ（Ｓｉｇｍａ）によって測定し、そして培地レプチンをＥＬＩＳＡ（
Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）によって測定した。ＲＮＡを、市販の材料およびプ
ロトコル（ＲＮＡ ＳＴＡＴ）を使用する脂肪細胞から調製した。
【０２３３】 （実施例９：下垂体培養物） 下垂体細胞培養物を、８週齢の雌性Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの下垂体全体から
調製した。下垂体を細かく切って、次いで、４ｍｇ／ｍｌのコラーゲナーゼ（タ
イプ２、ＣＬＳ２、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および４００μｇ／ｍｌのＤＮａ
ｓｅを含むＨａｎｋの平衡塩溶液中で３７℃で３０分間、迅速に攪拌することに
よって消化した。消化された下垂体を、１０％ＦＢＳを有する低グルコースＤＭ
ＥＭ中で二回洗浄し、次いで、ラミニンコート６ウェルプレート中でウェル当た
り３００，０００細胞をプレートした。細胞を、３７℃ Ｃ／５％ＣＯ２で一晩
インキュベートし、その後レプチンで処理した。マウスレプチン（ＢＩＯＭＯＬ
）を、４つ組み（１００、１０および１ｎＭ）で加えた。ＲＮＡを市販の材料お
よびプロトコル（ＲＮＡ ＳＴＡＴ）を使用して下垂体から調製した。
【０２３４】 （実施例１０：定量的発現分析） 遺伝子発現の差に対する肥満およびレプチン投与の効果を、Ｑｕａｎｔｉｔａ
ｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＱＥＡＴＭ）を使用して
試験した。代謝コントロールに関係する主要な５つの組織（下垂体、視床下部、
筋肉、肝臓および脂肪）を、レプチンで処理された肥満（ｏｂ／ｏｂ）；ビヒク
ル（ＰＢＳ）で処理された肥満；レプチンで処理されたやせ（ｏｂ／＋または＋
／＋）；およびビヒクルで処理されたやせの４つのグループの雌性マウスのそれ
ぞれから分析した。各組織について、これらのプールを、５（肝臓）マウスと２
０（下垂体および視床下部）マウスとの間からの組織を含む各プールを用いて調
製した。ＲＮＡを各プールの組織から調製し、そしてＲＮＡから誘導されるｃＤ
ＮＡを、９６対の制限酵素を使用して分析した。以前の結果は、これが、１：１
００，０００よりも大きな検出感度を有する発現ゲノムの９０％より大きな分析
を可能にすることを示す（Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、上記）。３つの二成分の比較は
、最初に肥満対やせマウス（ともにビヒクル処理）、やせマウス、ビヒクル対レ
プチン処理、および肥満マウスレプチン対ビヒクル処理でなされた。二倍（ｐ＜
０．０５）より大きくピーク高さが異なる場合、差と考える。これらの比較の結
果は、表４に示される。各遺伝子フラグメントは、遺伝子の一部を表し、そして
任意の一つの遺伝子が、複数の独立した遺伝子フラグメントを作製する可能性を
有する−いくつかの遺伝子は、検出可能な１のみを生じるが、他のものは、５〜
１０を生じ得る。遺伝子フラグメントと表される遺伝子との間で約３対１の比が
存在する。ピーク高さにおける差が、もとにあるｍＲＮＡの発現における差を反
映することは、以前に確証されている（Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、上記）。
【０２３５】 ５つの組織のそれぞれからのＲＮＡを、ＱＥＡおよび決定される検出可能な遺
伝子フラグメントの数によって分析した（表４）。上に記載されるように、各遺
伝子フラグメントは、特定のｃＤＮＡの一部を表し、見出される遺伝子フラグメ
ントの数が、組織内で発現される遺伝子の数の尺度として使用され得る。他の組
織と比較して脂肪において検出される遺伝子フラグメントの数に大きな差があり
、脂肪が他の組織と比較して少ない遺伝子を発現することを示唆する。各遺伝子
フラグメントのピーク高さを比較することによって、異なる組織における肥満ま
たはレプチンのいずれかに応答する遺伝子の数における大きな差があることがま
た明かである。従って、肝臓は、肥満に対して非常に感受性であり、５８７遺伝
子フラグメント（総計の２．３％）がやせの肝臓における発現に対して２倍より
大きく変化する。対照的に、８２（０．３％）のみの差が、視床下部において検
出された。他の組織は、これら２つの間であり、１１７（０．５％）の遺伝子フ
ラグメントが下垂体において変化し、１５８（０．６％）が筋肉において変化し
、そして１９６（１．６％）が脂肪において変化する。これらの評価が、全ての
組織の発現から引き出されることが注記されるべきである。肝臓が細胞型の点に
おいて視床下部よりも均質であるので、視床下部における遺伝子発現の差の数は
、過小評価され得る。脂肪および肝臓は、レプチン処理に対して最も応答性の組
織であり、約０．６％および０．４％の遺伝子が、一週間の処理に応答して、２
倍より大きく変化する。以下に記載されるように、この分析は、これらが、例え
ば、下垂体により送達されるタンパク質における変化によって間接的に肝臓遺伝
子発現を変化させるレプチンと比較して、脂肪または肝臓に対するレプチンの直
接の効果であるか否かについては取り組まない。より大きな差が、やせのマウス
に比較して肥満のマウスにおけるレプチンの応答において検出される。これは、
同じセットのマウスにおける生理学的応答（食物取り込みおよび脂肪損失）に関
して見られるものに匹敵する。
【０２３６】 主要な目的は、肥満の発達に関する遺伝子の同定であった。上記の簡単な２通
りの比較は、これらのより関連する遺伝子を同定するだけでなく、肥満に対する
代償性応答として変化される遺伝子およびレプチンにより変化されるがレプチン
の再生（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）効果に関連し得る遺伝子もまた同定する（
Ｃｌａｒｋｅら、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ４（１）
：４８〜５５（１９９９）。従って、その遺伝子発現の変化を、肥満による発現
が変化された遺伝子について探索することによりさらに分析し、そして同時に発
現を、レプチンによる１週間の処置経過によるやせパターンの発現へと戻した。
レプチンによる処理した肥満マウスのみを、この比較に使用した。なぜなら、こ
れらがレプチンの効果に対してより感受性であるからである。
【０２３７】 肥満マウスとやせマウスとの間で異なる遺伝子フラグメントの６％〜１２％が
、レプチン処理により少なくとも部分的に正常化される（表４）。細胞の不均一
性に関連する不確実性および遺伝子フラグメント数と遺伝子数との間の関係が原
因で、組織間の差異が有意であるか否か不確かである。この分析の逆は、肥満に
関連する差異の約９０％が、レプチンでの１週間の処理経過により有意には正常
化されないことを示し、そしてレプチン応答性遺伝子の検出のための簡単な二成
分比較に固有な危険を指摘する。この差異の９０％を正常化できなかったあり得
る理由としては、処理の長さおよび８週間のレプチン欠如により確立された不可
逆的変化が挙げられる。
【０２３８】
【表４】 下垂体において検出された遺伝子発現の差異を、さらに分析した。遺伝子プロ
ファイリングにより、肥満マウスと比較してやせマウスの下垂体において差次的
に発現された１１７個の遺伝子フラグメントを同定することが可能になった。最
小の発現差異は２倍であり；最大の差異は、いくつかの遺伝子の発現の低レベル
さに起因して、正確には評価され得ない。示される遺伝子に対する同定された遺
伝子フラグメントの比の基づいて（表５）、この１１７個の遺伝子フラグメント
が、約４０個の種々の遺伝子を示すことが推定される。比較評価は、本発明者ら
が、（肥満マウスにおいて）レプチンにより調節される、下垂体で発現される約
７個の遺伝子の発現を検出し得たことを示す。肥満により変化したこの１１７個
の遺伝子フラグメントのうちの１４個が、レプチンにより少なくとも部分的に正
常化された。これら１４個の遺伝子フラグメントを、そのフラグメントのＤＮＡ
を断片化するために使用した制限酵素およびサイズ（塩基対）に由来する命名に
従って、表５に列挙する。
【０２３９】
【表５】 肥満およびレプチン処理の両方により変化したこの１４個の下垂体由来遺伝子
フラグメントの遺伝子の同定を、オリゴヌクレオチドポイズニング（ｐｏｉｓｏ
ｎｉｎｇ）および遺伝子フラグメントのクローニングおよび配列決定の組み合わ
せを使用して、実行した。これらのアプローチにより、この１４個の遺伝子フラ
グメントのうちの１０個について遺伝子の身元を決定した。これらの遺伝子フラ
グメントのうちの４つは、プロセシング酵素ＰＣ２をコードするｍＲＮＡに対応
し（ＯＢ１）；４つの遺伝子フラグメントが、プロラクチンをコードするｍＲＮ
Ａに対応し（ＯＢ３）、１つの遺伝子フラグメントは、プレプロオピオメラノコ
ルチン（ＰＯＭＣ）をコードするｍＲＮＡに対応し（ＯＢ２）、そして１つの遺
伝子フラグメントは、タンパク質ＨＳＧＰ２５Ｌ２Ｇ＿１のマウスホモログをコ
ードするｍＲＮＡに対応する（ＯＢ５）。このタンパク質は、小胞体内に存在す
るようであるタンパク質の密接に関連するファミリーのうちの１つであるが、未
知の機能を有する。興味深いことに、このファミリーの１つのメンバーをコード
するｍＲＮＡは、ＸｅｎｏｐｕｓにおいてＰＯＭＣと協調的に発現される（Ｓｅ
ｉｄａｈら、ＤＮＡ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９（６）：４１５〜２４（１
９９０）。３つの遺伝子フラグメントの身元は未決定のままであり、そして１つ
の遺伝子フラグメント（ｉ０ｍ０−３０７）（ＯＢ６）については、その遺伝子
フラグメントのＤＮＡ配列を得たが、これは、重要なオープンリーディングフレ
ームを全く含んでおらず、本発明者らは、なお全長ｃＤＮＡを同定しなければな
らない。
【０２４０】 （ＰＯＭＣ／ＰＣ２（ＯＢ２／ＯＢ１）） ＰＣ２およびＰＯＭＣの各々に対応する１つの遺伝子フラグメントに関するＱ
ＥＡ試験を、図３に示す。４つのパネルの各々は、レプチンもしくはＰＢＳを用
いて処理された肥満マウス間（上部パネル）、またはＰＢＳを用いて処理された
肥満マウスとやせマウスとの間（下部パネル）のいずれかの比較を示す。各デー
タのセットを、別々のウィンドウで示し、そして２または３個のトレースを含む
。いくつかのセットにおいて、全てのｃＤＮＡが各対の制限フラグメントに関し
て好首尾に分析されなかった場合、２個のトレースのみを示す（最小２個のトレ
ースが引続く分析に必要であった）。各トレースを、３つの独立した下垂体プー
ルのうちの１つから誘導する。各ｃＤＮＡサンプルを、３連で分析し、そして各
トレースは、この３連の平均を表す。図３において、このトレースの関連性のあ
る部分を示し（トレースの下に示される塩基対の遺伝子フラグメントサイズと共
に）、そして２サンプル間で異なる遺伝子フラグメントを、垂直線で示す。各ウ
ィンドウ内において、独立した下垂体プールから誘導したトレースが、大きく重
複し、この技術の再現性を実証することに注目する。指摘された標的遺伝子フラ
グメントを例外として、異なる群のマウスから得たトーレスが類似することはま
た、明らかである。定量に関して、遺伝子フラグメントの高さを算出し、そして
各遺伝子フラグメントに関する平均および標準偏差を、算出する。２つの遺伝子
（ＰＣ２およびプロラクチン）に関して、同じ方向かつ比較可能な程度で変更さ
れた、対応するｃＤＮＡの各々から誘導された複数の遺伝子フラグメントが存在
する。これは、この遺伝子フラグメントの基礎をなす遺伝子の同定および遺伝子
発現差異の大きさの両方における信頼を増加する。
【０２４１】 遺伝子発現の差異を検出するためのＱＥＡの確実性は、以前に文書化されてい
る（Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、前出）。データセットにおける信頼性をさらに増加す
るために、本発明者らは、実時間定量的ＰＣＲを使用して、代表的な遺伝子セッ
ト（ＰＣ２およびＰＯＭＣ）に対して転写レベルを特徴付けた。さらに、下垂体
の３個のプールを使用した（最初の実験と完全に独立し、そして５個の下垂体／
プールを含む）；抽出されたＲＮＡを、実時間定量的ＰＣＲを用いて分析した。
図４に示される結果によって、肥満がＰＣ２およびＰＯＭＣの両方の発現を減少
することを確認する。ΔＣＴ値を、Ａに与え、そしてこれらのΔを使用して、平
均相対発現を生成する（Ｂ）。
【０２４２】 ＰＣ２およびＰＯＭＣの両方のｍＲＮＡレベルは、肥満マウスにおいて増加し
、そしてレプチン処置により減少される。ＰＣ２（Ｂｅｒｔａｇｅｎａ，Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏ
ｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ２３（３）：４６７〜８５（１９９４））は、より小
さな生物活性ペプチドホルモンへのＰＯＭＣ前駆体のプロセシングに関与するよ
うである２つの主要なプロテアーゼのうちの１つである。ＰＣ２発現に対するレ
プチンの効果が、特定の細胞型に限定されるか否かは未だ公知ではない。ＡＣＴ
Ｈの発現に関して、他のＰＯＭＣ誘導ペプチドの生理学的機能は、未だ明確では
ない。ＰＯＭＣ前駆体のレプチン媒介性示差的プロセシングが、生物学的に関連
し得る可能性が、アドレスされるべく残っている。
【０２４３】 （プロラクチン（ＯＢ３）） プロラクチンｃＤＮＡに由来する４つの遺伝子フラグメントを、肥満症および
レプチン処置の両方により変更した。従って、肥満症は、３倍〜５倍、プロラク
チンｍＲＮＡレベルを抑制し、そしてレプチンは、肥満マウスにおいて２〜３倍
、レプチンｍＲＮＡレベルを増加させた（表５）。このプロラクチン発現は、本
明細書中で報告されるように肥満症により減少もされ、そしてレプチンによって
増加もされ、これは、肥満症の発症および維持における減少したプロアクチンの
原因となる役割と一致する。低いプロラクチンレベルが、肥満症の発症に寄与し
得る機構は、明らかではない。
【０２４４】 （ＨＳＧＰ２５Ｌ２Ｇ１（ＯＢ５）） 同定された第４の遺伝子は、ＨＳＧＰ２５Ｌ２Ｇ＿１のマウスホモログである
。個の遺伝子の発現は、肥満のマウスにおいて約６倍増加され、そしてレプチン
処置により５０％抑制される。コードされるタンパク質は、内質小網に属するが
未知の機能を有するようであるタンパク質のファミリーの１つのメンバーである
（Ｗａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２９）：１９５９９〜６１０
（１９９１）を参照のこと）。驚くべきことに、このファミリーの１つのメンバ
ーをコードするｍＲＮＡは、ＸｅｎｏｐｕｓにおいてＰＯＭＣと共に協調的に発
現される（Ｈｏｌｔｈｕｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２（第１部）：２０
５〜１３（１９９５）を参照のこと）。
【０２４５】 （他の実施形態） 本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、上記の記載は、例示を意図
し、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することを意図
しないことが理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、上記の特許
請求の範囲内である。
【０２４６】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＯＢ６遺伝子の遺伝子マッピングの結果を示す図である。
【図２】 図２は、ＡＣＴＨおよびレプチンを含む提案された調節ループを示す図である
。
【図３】 図３は、ＰＣ２およびＰＯＭＣの各々に対応する１つの遺伝子フラグメントに
ついてＱＥＡトレースを示す図である。
【図４】 図４は、遺伝子の代表的なセットのについて、転写レベルを特徴付けるために
行なわれたリアルタイムの定量的ＰＣＲの結果を示す図である。
【図５】 図５は、ＯＢ６の逆の相補鎖の翻訳分析を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｃ０８５ 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ 48/00 16/18 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 3/04 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/47 1/34 Ｚ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｍ 1/00 1/19 1/34 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/19 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ｆ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ジェネンテック・インコーポレーテッド ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ． アメリカ合衆国カリフオルニア・94080− 4990・サウス・サン・フランシスコ・ディ ーエヌエー・ウェイ・１ 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 スチュアート， ティモシー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94080 −4490， サウス サン フランシスコ， ディーエヌエイ ウェイ １ (72)発明者 レウィン， デイビッド アメリカ合衆国 コネチカット 06511， ニュー ヘイブン， ローレンス スト リート 298 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 GA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 GA08 4B063 QA11 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ52 QR55 QR59 QR62 QR80 QR82 QS14 QS25 QS34 QS39 4B065 AA91Y AA93Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA17 BA44 DB20 MA24 MA38 MA52 MA59 MA66 ZA702 4C085 AA13 AA14 BB11 BB41 BB43 CC02 CC23 DD63 DD88 GG02 GG03 GG05 GG08 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA70 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA27 EA50 FA72 FA74

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被験体における肥満処置の効力を評価する方法であって、該
    方法は、以下の工程： ａ）ＯＢ１〜６からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現可能な細胞
    を含む試験細胞集団を、該被験体から提供する工程； ｂ）該試験細胞集団における該核酸配列の１つ以上の発現を検出する工程； ｃ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、肥満段階が既知の少なくとも
    １つの細胞を含む参照細胞集団における該核酸配列の発現と比較する工程；およ
    び ｄ）存在する場合、該試験細胞集団および該参照細胞集団におけるＯＢ１〜６配
    列の発現レベルにおける差異を同定する工程、 を包含し、 それにより、該被験体における肥満処置の効力を評価する、方法。
  2. 【請求項２】 前記被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記被験体がヒトである、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記方法が、２つ以上の前記核酸配列の発現を比較する工程
    を包含する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記方法が、４つ以上の前記核酸配列の発現を比較する工程
    を包含する、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記方法が、６つ以上の前記核酸配列の発現を比較する工程
    を包含する、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記試験細胞集団における前記核酸配列の発現が、前記参照
    細胞集団と比較して増加している、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記試験細胞集団がインビトロで提供される、請求項１に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 前記試験細胞集団が、哺乳動物被験体からエキソビボで提供
    される、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記試験細胞が、哺乳動物被験体からインビボで提供され
    る、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 被験体における肥満を処置するための試験治療剤を同定す
    る方法であって、該方法は、以下の工程： ａ）ＯＢ１〜６からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現可能な細胞
    を含む試験細胞集団を、該被験体から提供する工程； ｂ）該試験細胞集団を該試験治療剤と接触させる工程； ｃ）該試験細胞集団における１つ以上の該核酸配列の発現を検出する工程； ｄ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、肥満段階が既知の少なくとも
    １つの細胞を含む参照細胞集団における該核酸配列の発現と比較する工程；およ
    び ｅ）存在する場合、該試験細胞集団および該参照細胞集団におけるＯＢ１〜６配
    列の発現レベルにおける差異を同定する工程、 を包含し、 それにより、被験体における肥満を処置するための試験治療剤を同定する、方法
    。
  12. 【請求項１２】 前記被験体が哺乳動物である、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記被験体がヒトである、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記試験治療剤が既知の抗肥満剤である、請求項１１に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記試験治療剤が、以下からなる群：デキスフェニフルア
    ミン、シブトラミン、β３−アドレナリン作用性アゴニスト、および オリスタット（ｏｌｉｓｔａｔ）から選択される、請求項１４に記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 前記試験治療剤が未知の抗肥満薬剤である、請求項１１に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 レプチン誘導核酸配列を同定する方法であって、該方法が
    、以下の工程： ａ）肥満段階が既知である被験体から試験細胞集団を提供する工程； ｂ）該試験細胞集団によって発現される１つ以上の核酸配列の発現を測定する工
    程； ｃ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、逆の肥満段階の被験体由来の
    少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における該核酸配列の発現と比較する
    工程； ｄ）核酸配列が、存在する場合、該試験細胞集団および該参照細胞集団において
    差次的に発現されるか否かを決定する工程； ｅ）該試験細胞集団および該参照細胞集団にレプチンを添加する工程； ｆ）レプチン処理後の該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、レプチン処
    理後の該参照細胞集団における該核酸配列の発現と比較する工程；ならびに ｇ）存在する場合、該試験細胞集団および該参照細胞集団における発現レベルに
    おける差異を同定する工程 を包含し、 それにより、レプチン誘導核酸配列を同定する方法。
  18. 【請求項１８】 被験体における肥満に対する罹病性を診断または決定する
    方法であって、該方法は、以下の工程： ａ）ＯＢ：１〜６からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現可能な細
    胞を含む試験細胞集団を、該被験体から提供する工程； ｂ）該試験細胞集団における１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程； ｃ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現を、肥満に罹患していない被験体
    由来の少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における該核酸配列の発現と比
    較する工程；および ｄ）存在する場合、該試験細胞集団および参照細胞集団における該核酸配列の発
    現レベルにおける差異を同定する工程、 を包含し、 それにより、該被験体おける肥満に対する罹患性を診断または決定する、方法。
  19. 【請求項１９】 前記被験体が哺乳動物である、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記被験体がヒトである、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 肥満を処置する方法であって、該方法が、肥満に罹患する
    かまたは肥満を発症する危険性のある患者に、ＯＢ：１〜６からなる群から選択
    される１つ以上の核酸配列の発現または活性を調節する薬剤を投与する工程を包
    含する、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、該方法が、肥満に罹患
    するかまたは肥満を発症する危険性のある患者に、ＯＢ：１、２、４、５、およ
    び６からなる群から選択される１つ以上の核酸配列の発現または活性を減少させ
    る薬剤を投与する工程を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２１に記載の方法であって、該方法が、肥満に罹患
    するかまたは肥満を発症する危険性のある患者に、ＯＢ：３からなる群から選択
    される１つ以上の核酸配列の発現または活性を増加させる薬剤を投与する工程を
    包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２１に記載の方法であって、前記薬剤が、ＯＢ核酸
    配列によってコードされるポリペプチドに対する抗体、ペプチド、ペプチド模倣
    物、低分子、または他の薬物である、方法。
  25. 【請求項２５】 ＯＢ：１〜６からなる群から選択される２つ以上の核酸配
    列を検出するための１つ以上の試薬を含む、キット。
  26. 【請求項２６】 プローブ核酸が、ＯＢ：１〜６からなる群から選択される
    ２つ以上の核酸配列を検出する、プローブ核酸のアレイ。
  27. 【請求項２７】 配列番号１に少なくとも７５％同一である核酸配列、また
    は該核酸配列の相補体を含む、単離された核酸分子。
  28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の核酸配列を含む、核酸ベクター。
  29. 【請求項２９】 請求項２７に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞
    。
  30. 【請求項３０】 単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以
    下： ａ）配列番号１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプ
    チド； ｂ）配列番号１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプ
    チドのフラグメントであって、該フラグメントが少なくとも６個連続したアミノ
    酸を含む、フラグメント。 ｃ）配列番号１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ドの誘導体； ｄ）配列番号１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ドのアナログ；および ｅ）配列番号１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ドのホモログ、 からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも８０％同一である、単離さ
    れたポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体
    、ならびに該抗体のフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体。
  32. 【請求項３２】 請求項２７に記載の核酸を含む、薬学的組成物。
  33. 【請求項３３】 請求項３０に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
  34. 【請求項３４】 サンプル中の請求項２７に記載の核酸の存在を決定する方
    法であって、該方法は、請求項２７に記載の核酸に選択的に結合する化合物と、
    該サンプルを接触させる工程、および請求項２７に記載の核酸に結合した該化合
    物が該サンプル中に存在するか否かを決定する工程を包含する、方法。
  35. 【請求項３５】 請求項２７に記載の核酸の活性を調節するための方法であ
    って、該方法が、請求項２７に記載の核酸を含む細胞サンプルを、該ポリペプチ
    ドの活性を調節するために十分な量で前記核酸に結合する化合物と接触させる工
    程を包含する、方法。
  36. 【請求項３６】 被験体中の肥満を処置するために使用される単離されたポ
    リペプチドであって、該ポリペプチドが、以下： ａ）ＯＢ：１〜６のアミノ酸配列を含むポリペプチド； ｂ）配列番号１〜６のアミノ酸を含むポリペプチドのフラグメントであって、該
    フラグメントがＯＢ：１〜６の少なくとも６個連続したアミノ酸を含む、フラグ
    メント； ｃ）ＯＢ：１〜６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドの誘導体； ｄ）ＯＢ：１〜６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドのアナログ； ｅ）ＯＢ：１〜６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドのホモログ からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも８０％同一である、単離さ
    れたポリペプチド。
  37. 【請求項３７】 前記ポリペプチドの発現状態がレプチンによって調節され
    る、請求項３６に記載のポリペプチド。
  38. 【請求項３８】 前記ポリペプチドの発現がレプチンによってダウンレギュ
    レートされ、そして、該ポリペプチドがＯＢ：１、２、および４〜６からなる群
    から選択される、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. 【請求項３９】 前記ポリペプチドの発現がレプチンによってアップレギュ
    レートされ、そして、該ポリペプチドがＯＢ：３からなる群から選択される、請
    求項３７に記載のポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 前記被験体が哺乳動物である、請求項３６に記載のポリペ
    プチド。
  41. 【請求項４１】 前記被験体がヒトである、請求項４０に記載のポリペプチ
    ド。
  42. 【請求項４２】 前記ポリペプチドが下垂体から分泌される、請求項３６に
    記載のポリペプチド。
  43. 【請求項４３】 被験体における肥満を処置するために使用される単離され
    た核酸分子であって、該核酸が、ＯＢ：１〜６のいずれかの１つ核酸配列かまた
    は該核酸配列の相補体に対して、少なくとも７５％同一である、単離された核酸
    分子。
  44. 【請求項４４】 前記核酸配列の発現状態がレプチンによって調節される、
    請求項４３に記載の核酸分子。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の核酸分子であって、前記核酸配列の発
    現状態が、レプチンによってダウンレギュレートされ、そして、該核酸がＯＢ：
    １、２、および４〜６からなる群から選択される、核酸分子。
  46. 【請求項４６】 請求項４４に記載の核酸分子であって、前記核酸配列の発
    現状態が、レプチンによってアップレギュレートされ、そして、該核酸がＯＢ３
    からなる群から選択される、核酸分子。
  47. 【請求項４７】 前記被験体が哺乳動物である、請求項４３に記載の核酸分
    子。
  48. 【請求項４８】 前記被験体がヒトである、請求項４７に記載の核酸分子。
  49. 【請求項４９】 前記核酸配列が下垂体において発現される、請求項４３に
    記載の核酸分子。
  50. 【請求項５０】 該下垂体によって分泌され、肥満に関連し、そして、発現
    状態がレプチンによって調節される、組成物。
  51. 【請求項５１】 前記組成物がＯＢ：１〜６からなる群から選択される、請
    求項５０に記載の組成物。
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