JP2003509058A - Ｔ−ｄｎａ組込みに関与する宿主遺伝子の付加による、向上した植物細胞形質転換 - Google Patents
Ｔ−ｄｎａ組込みに関与する宿主遺伝子の付加による、向上した植物細胞形質転換Info
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Abstract
(57)【要約】
植物の宿主細胞Ｔ−ＤＮＡ組込みに関与する少なくとも１つの遺伝子を付加することは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる形質転換を増強する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＡＴ５遺伝子によってコードされるヒストンＨ２Ａ遺伝子は、植物の形質転換頻度を増大させる。これは、ほぼ恐らく、Ｔ−ＤＮＡ組込みに必要な産物の過剰発現によって引き起こされる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、細菌性Ｔｉプラスミドの一部（Ｔ−ＤＮＡと命名される）を植物に移入し、そしてＴ−ＤＮＡを植物ゲノムに組み込むことによって、植物細胞を遺伝的に形質転換する。しかし、全ての植物がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換可能であるわけではなく、そして形質転換頻度は、有用であるためには低すぎるかもしれない。Ｔ−ＤＮＡ組込みプロセスについてはほとんど知られておらず、本発明の以前には、組込みに関与する植物遺伝子は同定されていない。
Description
【０００１】
（背景）
本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＡＴ５遺伝子によってコードされるヒ
ストンＨ２Ａの過剰発現に起因する、植物の向上したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ形質転換頻度に関する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓは、植物へ外来ＤＮＡを導入するために、植物生物学者によって利用されてい
る、グラム陰性の土壌細菌である。しかし、この形質転換ベクターの使用にはい
くつかの制限（例えば、単子葉植物を形質転換することの困難性および有用であ
るためには形質転換頻度が低すぎるかもしれないこと）がある。この実際の適用
については公知であるが、細菌から植物へのＤＮＡ移入の実際の機構は完全には
理解されていない。
ストンＨ２Ａの過剰発現に起因する、植物の向上したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ形質転換頻度に関する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓは、植物へ外来ＤＮＡを導入するために、植物生物学者によって利用されてい
る、グラム陰性の土壌細菌である。しかし、この形質転換ベクターの使用にはい
くつかの制限（例えば、単子葉植物を形質転換することの困難性および有用であ
るためには形質転換頻度が低すぎるかもしれないこと）がある。この実際の適用
については公知であるが、細菌から植物へのＤＮＡ移入の実際の機構は完全には
理解されていない。
【０００２】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、細菌性Ｔｉプラス
ミドの一部（Ｔ−ＤＮＡと称される）を植物に移入し、そしてこのＴ−ＤＮＡを
植物ゲノムに組込むことによって、植物細胞を遺伝的に形質転換する。Ｔ−ＤＮ
Ａ組込みプロセスについてはほとんど知られておらず、そして組込みに関与する
植物遺伝子はこれまで同定されていない。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物
細胞へと移入されるＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡ（移入されるＤＮＡ）と呼ばれる、Ｔ
ｉ（すなわち、腫瘍誘導性）プラスミドのセグメントである。Ｔ−ＤＮＡのプロ
セシングおよび移入を担うビルレンス（ｖｉｒ）遺伝子は、Ｔｉプラスミド上の
どこかに存在することが報告されている。Ｔ−ＤＮＡのプロセシング、Ｔ−ＤＮ
Ａの搬出のための細菌チャネルの形成、および植物細胞への細菌の付着における
ｖｉｒ遺伝子の役割が報告されている（ＳｈｅｎｇおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ，１
９９６；ＺｕｐａｎおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ，１９９７）。対照的に、Ｔ−Ｄ
ＮＡの移入および組込みにおける植物因子の役割についてはほとんど知られてい
ない。推定の植物因子の単離は近年報告されている。ＢａｌｌａｓおよびＣｉｔ
ｏｖｓｋｙは、植物のカリオフェリンα（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ α（ＡｔＫ
ＡＰ α））が、酵母ツーハイブリッド相互作用系においてＶｉｒＤ２核局在配
列と相互作用し得、そしておそらく、Ｔ複合体の核トランスロケーションに関与
することを示した。同様のアプローチを用いて、ＶｉｒＤ２ ＮＬＳと相互作用
し得る、トマトの２Ｃ型プロテインホスファターゼであるＤＩＧ３が同定された
。ＡｔＫＡＰ αとは異なり、ＤＩＧ３は、核への移入において負の役割を果た
す。Ｔ−ＤＮＡ／Ｔ複合体が核に入った後、これらは、植物の染色体に組込まれ
なければならない。植物の染色体ＤＮＡは、主にヒストンタンパク質からなるヌ
クレオソームになるようにパッケージングされている。入ってくるＴ−ＤＮＡは
、組込みプロセスの間にこのヌクレオソーム構造と相互作用しなければならない
かもしれない。しかし、Ｔ−ＤＮＡは、ゲノムのうちの転写される領域に優先的
に組込まれ得る。これらの領域は、ヒストンを一時的に含まないと考えられる。
正確には、Ｔ−ＤＮＡ組込みがどのようにして生じるかは不明である。近年の報
告は、Ｔ−ＤＮＡ組込みプロセスにおけるＶｉｒＤ２タンパク質の関与を示した
。植物のタンパク質もまた、このプロセスに関与するようである（Ｄｅｎｇら，
１９９８；ＢａｌｌａｓおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ，１９９７；Ｔａｏら）。Ｔ−
ＤＮＡの移入および組込みにおける植物因子の関与についての他の証拠は、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に抵抗性である、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのい
くつかの生態型の同定からもたらされている。
ミドの一部（Ｔ−ＤＮＡと称される）を植物に移入し、そしてこのＴ−ＤＮＡを
植物ゲノムに組込むことによって、植物細胞を遺伝的に形質転換する。Ｔ−ＤＮ
Ａ組込みプロセスについてはほとんど知られておらず、そして組込みに関与する
植物遺伝子はこれまで同定されていない。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物
細胞へと移入されるＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡ（移入されるＤＮＡ）と呼ばれる、Ｔ
ｉ（すなわち、腫瘍誘導性）プラスミドのセグメントである。Ｔ−ＤＮＡのプロ
セシングおよび移入を担うビルレンス（ｖｉｒ）遺伝子は、Ｔｉプラスミド上の
どこかに存在することが報告されている。Ｔ−ＤＮＡのプロセシング、Ｔ−ＤＮ
Ａの搬出のための細菌チャネルの形成、および植物細胞への細菌の付着における
ｖｉｒ遺伝子の役割が報告されている（ＳｈｅｎｇおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ，１
９９６；ＺｕｐａｎおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ，１９９７）。対照的に、Ｔ−Ｄ
ＮＡの移入および組込みにおける植物因子の役割についてはほとんど知られてい
ない。推定の植物因子の単離は近年報告されている。ＢａｌｌａｓおよびＣｉｔ
ｏｖｓｋｙは、植物のカリオフェリンα（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ α（ＡｔＫ
ＡＰ α））が、酵母ツーハイブリッド相互作用系においてＶｉｒＤ２核局在配
列と相互作用し得、そしておそらく、Ｔ複合体の核トランスロケーションに関与
することを示した。同様のアプローチを用いて、ＶｉｒＤ２ ＮＬＳと相互作用
し得る、トマトの２Ｃ型プロテインホスファターゼであるＤＩＧ３が同定された
。ＡｔＫＡＰ αとは異なり、ＤＩＧ３は、核への移入において負の役割を果た
す。Ｔ−ＤＮＡ／Ｔ複合体が核に入った後、これらは、植物の染色体に組込まれ
なければならない。植物の染色体ＤＮＡは、主にヒストンタンパク質からなるヌ
クレオソームになるようにパッケージングされている。入ってくるＴ−ＤＮＡは
、組込みプロセスの間にこのヌクレオソーム構造と相互作用しなければならない
かもしれない。しかし、Ｔ−ＤＮＡは、ゲノムのうちの転写される領域に優先的
に組込まれ得る。これらの領域は、ヒストンを一時的に含まないと考えられる。
正確には、Ｔ−ＤＮＡ組込みがどのようにして生じるかは不明である。近年の報
告は、Ｔ−ＤＮＡ組込みプロセスにおけるＶｉｒＤ２タンパク質の関与を示した
。植物のタンパク質もまた、このプロセスに関与するようである（Ｄｅｎｇら，
１９９８；ＢａｌｌａｓおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ，１９９７；Ｔａｏら）。Ｔ−
ＤＮＡの移入および組込みにおける植物因子の関与についての他の証拠は、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に抵抗性である、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのい
くつかの生態型の同定からもたらされている。
【０００３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換に関与する植物遺伝子を同定するた
めに、Ｔ−ＤＮＡタグ化Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓライブラリーを、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に抵抗性である変異体（ｒａｔ変異体）についてスクリ
ーニングした。植物遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロセ
スに関与するようであるいくつかの段階が存在する。第１に、植物によってコー
ドされる因子は、植物細胞表面への細菌付着の最初の段階に関与し得る。細菌付
着が欠損した変異体および生態型が同定されており、そして細菌付着に関与した
遺伝子が現在特徴付けられている。植物因子が関与し得る次の段階は、細菌から
植物細胞への、植物の細胞壁および細胞膜を横切ったＴ鎖の移入である。Ｔ−Ｄ
ＮＡ／Ｔ複合体が植物細胞の細胞質に侵入した後、植物因子は、Ｔ複合体を核へ
と輸送するために必要とされる。
めに、Ｔ−ＤＮＡタグ化Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓライブラリーを、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に抵抗性である変異体（ｒａｔ変異体）についてスクリ
ーニングした。植物遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロセ
スに関与するようであるいくつかの段階が存在する。第１に、植物によってコー
ドされる因子は、植物細胞表面への細菌付着の最初の段階に関与し得る。細菌付
着が欠損した変異体および生態型が同定されており、そして細菌付着に関与した
遺伝子が現在特徴付けられている。植物因子が関与し得る次の段階は、細菌から
植物細胞への、植物の細胞壁および細胞膜を横切ったＴ鎖の移入である。Ｔ−Ｄ
ＮＡ／Ｔ複合体が植物細胞の細胞質に侵入した後、植物因子は、Ｔ複合体を核へ
と輸送するために必要とされる。
【０００４】
Ｔ−ＤＮＡ組込みが欠損しており、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介根
形質転換に抵抗性である、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔ−ＤＮＡタグ化変異体ｒ
ａｔ５が特徴付けられた。遺伝的分析およびＤＮＡブロット分析の両方は、ｒａ
ｔ５中の単一遺伝子座で縦列反復配列として組込まれた２コピーのＴ−ＤＮＡが
存在することを示した。Ｔ−ＤＮＡ挿入部位を直接取り囲むｒａｔ５植物ＤＮＡ
には主な再配列は存在しない。これらのデータは、ｒａｔ５において、Ｔ−ＤＮ
Ａが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換に必要な遺伝子に挿入されたこ
とを強く示唆する。Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー−植物連結部の配列は、Ｔ−ＤＮ
ＡがヒストンＨ２Ａ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入されたことを示した。この挿
入は、コンセンサスなポリアデニル化シグナルの上流である。Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ生態型ＷｓのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして２０個の
異なるヒストンＨ２ＡのｃＤＮＡクローンを配列決定し、そしてコンピュータデ
ータベース検索を行うことによって、少なくとも６個の異なるヒストンＨ２Ａ遺
伝子が示された。これらの遺伝子は、アミノ酸配列レベルで９０％より高い同一
性のタンパク質をコードする。従って、ヒストンＨ２Ａ遺伝子は、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓにおける小さな多重遺伝子ファミリーを含む。
形質転換に抵抗性である、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔ−ＤＮＡタグ化変異体ｒ
ａｔ５が特徴付けられた。遺伝的分析およびＤＮＡブロット分析の両方は、ｒａ
ｔ５中の単一遺伝子座で縦列反復配列として組込まれた２コピーのＴ−ＤＮＡが
存在することを示した。Ｔ−ＤＮＡ挿入部位を直接取り囲むｒａｔ５植物ＤＮＡ
には主な再配列は存在しない。これらのデータは、ｒａｔ５において、Ｔ−ＤＮ
Ａが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換に必要な遺伝子に挿入されたこ
とを強く示唆する。Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー−植物連結部の配列は、Ｔ−ＤＮ
ＡがヒストンＨ２Ａ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入されたことを示した。この挿
入は、コンセンサスなポリアデニル化シグナルの上流である。Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ生態型ＷｓのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして２０個の
異なるヒストンＨ２ＡのｃＤＮＡクローンを配列決定し、そしてコンピュータデ
ータベース検索を行うことによって、少なくとも６個の異なるヒストンＨ２Ａ遺
伝子が示された。これらの遺伝子は、アミノ酸配列レベルで９０％より高い同一
性のタンパク質をコードする。従って、ヒストンＨ２Ａ遺伝子は、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓにおける小さな多重遺伝子ファミリーを含む。
【０００５】
Ｔ−ＤＮＡ組込みは、相同組換えによって起こらないようである（相同組換え
は、原核生物および下等真核生物における最も一般的な外来ＤＮＡ組込み方法で
あると考えられる）。なぜなら、Ｔ−ＤＮＡと標的配列との間に大きな相同性が
見出されないからである。Ｔ−ＤＮＡは、非正統的組換えによって組込まれると
報告されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｇｈｅｙｓｅｎら，１９９
１；Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒら，１９９１；Ｏｈｂａら，１９９５）。非正統的組
換えは、高等植物のゲノムへのＤＮＡ組込みの主な機構である（Ｂｒｉｔｔ，１
９９６；Ｏｆｆｒｉｎｇａら，１９９０；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら，１９８８）
。
は、原核生物および下等真核生物における最も一般的な外来ＤＮＡ組込み方法で
あると考えられる）。なぜなら、Ｔ−ＤＮＡと標的配列との間に大きな相同性が
見出されないからである。Ｔ−ＤＮＡは、非正統的組換えによって組込まれると
報告されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，１９９０；Ｇｈｅｙｓｅｎら，１９９
１；Ｍａｙｅｒｈｏｆｅｒら，１９９１；Ｏｈｂａら，１９９５）。非正統的組
換えは、高等植物のゲノムへのＤＮＡ組込みの主な機構である（Ｂｒｉｔｔ，１
９９６；Ｏｆｆｒｉｎｇａら，１９９０；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら，１９８８）
。
【０００６】
植物におけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換頻度に影響を与える因子に
ついての情報は、この方法の性能を改善するために必要である。
ついての情報は、この方法の性能を改善するために必要である。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、宿主Ｔ−ＤＮＡ組込みに関与する少なくとも１つの遺伝子の、宿主
植物への付加に起因した、植物における増大したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形
質転換頻度に関する。１つの実施形態では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＡＴ５
遺伝子によってコードされる少なくとも１つのヒストンＨ２Ａ遺伝子の付加は、
ほぼ恐らく、宿主の天然の発現レベルと比較したヒストンの過剰発現に起因して
、形質転換頻度を向上させる。この遺伝子は、トランスジェニック植物中に存在
するか、または本発明の実施のための形質転換因子であるＴ−ＤＮＡによって運
搬されるかのいずれかであり得る。
植物への付加に起因した、植物における増大したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形
質転換頻度に関する。１つの実施形態では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＡＴ５
遺伝子によってコードされる少なくとも１つのヒストンＨ２Ａ遺伝子の付加は、
ほぼ恐らく、宿主の天然の発現レベルと比較したヒストンの過剰発現に起因して
、形質転換頻度を向上させる。この遺伝子は、トランスジェニック植物中に存在
するか、または本発明の実施のための形質転換因子であるＴ−ＤＮＡによって運
搬されるかのいずれかであり得る。
【０００８】
本発明のヒストン遺伝子の過剰発現は、形質転換ベクターとしてのＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍの使用を制限する乏しい性能を克服する。多くの植物は、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって一過性に形質転換され得、その結果、形質転換
遺伝子を一定の期間発現するが、Ｔ−ＤＮＡ組込みの問題のために安定には形質
転換されない。それゆえ、トランスジェニック植物が産生されない。遺伝子Ｈ２
Ａ（ＲＡＴ５）は、植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの非正統的組換えにおいて重要な
役割を果たし、そして遺伝子の過剰発現は、形質転換を増強する。
ａｃｔｅｒｉｕｍの使用を制限する乏しい性能を克服する。多くの植物は、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって一過性に形質転換され得、その結果、形質転換
遺伝子を一定の期間発現するが、Ｔ−ＤＮＡ組込みの問題のために安定には形質
転換されない。それゆえ、トランスジェニック植物が産生されない。遺伝子Ｈ２
Ａ（ＲＡＴ５）は、植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの非正統的組換えにおいて重要な
役割を果たし、そして遺伝子の過剰発現は、形質転換を増強する。
【０００９】
一過性および安定なＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）の発現データ、ならびに
野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物およびｒａｔ５のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植
物のゲノムへと組込まれたＴ−ＤＮＡ量の評価は、ｒａｔ５変異体が、形質転換
に必要とされるＴ−ＤＮＡ組込みを欠損していることを示した。ｒａｔ５変異の
補完は、野生型ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子をこの変異体植物において発現さ
せることによって達成された。驚くべきことに、野生型植物におけるＲＡＴ５の
過剰発現は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換効率を増大させた。さらに
、入ってくるＴ−ＤＮＡからのＲＡＴ５遺伝子の一過性の発現は、ｒａｔ５変異
体を補完し、そして野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の形質転換効率を増大さ
せるのに十分であった。本発明は、Ｔ−ＤＮＡ組込みにおける植物のヒストン遺
伝子の直接的な関与を用いて植物における安定な形質転換頻度を増大させる方法
および組成物を提供する。
野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物およびｒａｔ５のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植
物のゲノムへと組込まれたＴ−ＤＮＡ量の評価は、ｒａｔ５変異体が、形質転換
に必要とされるＴ−ＤＮＡ組込みを欠損していることを示した。ｒａｔ５変異の
補完は、野生型ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子をこの変異体植物において発現さ
せることによって達成された。驚くべきことに、野生型植物におけるＲＡＴ５の
過剰発現は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換効率を増大させた。さらに
、入ってくるＴ−ＤＮＡからのＲＡＴ５遺伝子の一過性の発現は、ｒａｔ５変異
体を補完し、そして野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の形質転換効率を増大さ
せるのに十分であった。本発明は、Ｔ−ＤＮＡ組込みにおける植物のヒストン遺
伝子の直接的な関与を用いて植物における安定な形質転換頻度を増大させる方法
および組成物を提供する。
【００１０】
（発明の説明）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ根形質転換を受けない、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
のいくつかのＴ−ＤＮＡタグ化［Ｔ−ＤＮＡの組込みによって遺伝子がランダム
に破壊されている植物］変異体が、同定された。これらは、ｒａｔ変異体（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に抵抗性）と呼ばれる。これらの変異体の大部
分では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は、植物細胞への細菌付着の間ま
たはＴ−ＤＮＡ核移入の前のいずれかの、初期段階でブロックされる。しかし、
変異体のうちのいくつかでは、Ｔ−ＤＮＡ組込み段階がブロックされている可能
性が最も高い。植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの非正統的組換えに関与する植物因子
はこれまで同定されていないので、Ｔ−ＤＮＡ組込みが欠損しているＴ−ＤＮＡ
タグ化Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体ｒａｔ５の特徴付けは、本発明の１つの局
面である。
のいくつかのＴ−ＤＮＡタグ化［Ｔ−ＤＮＡの組込みによって遺伝子がランダム
に破壊されている植物］変異体が、同定された。これらは、ｒａｔ変異体（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に抵抗性）と呼ばれる。これらの変異体の大部
分では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は、植物細胞への細菌付着の間ま
たはＴ−ＤＮＡ核移入の前のいずれかの、初期段階でブロックされる。しかし、
変異体のうちのいくつかでは、Ｔ−ＤＮＡ組込み段階がブロックされている可能
性が最も高い。植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの非正統的組換えに関与する植物因子
はこれまで同定されていないので、Ｔ−ＤＮＡ組込みが欠損しているＴ−ＤＮＡ
タグ化Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体ｒａｔ５の特徴付けは、本発明の１つの局
面である。
【００１１】
（ｒａｔ５変異体の特徴付け）
ｒａｔ５（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔ−ＤＮＡタグ化変異体）は、Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍの根の形質転換に対して抵抗性であるとして以前に同定され
た。インビトロでの根接種アッセイを、野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株Ａ
２０８（Ａｔ１０）を用いて行った。１ヵ月後、腫瘍を形成した根の束の百分率
を算出した。野生型植物（生態型Ｗｓ）の９０％を超える根の束が、大きな緑色
の奇形腫を形成した。対照的に、ｒａｔ５植物由来の１０％よりも少ない根の束
が、感染に応答して、小さな黄色のカルスを形成した（図１Ａ）。ホモ接合性の
ｒａｔ５植物（花粉ドナー）を野生型植物（卵ドナー）に交配し、そして得られ
たＦ１後代を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に対する感受性について試
験した。この分析は、ｒａｔ５が優性変異であることを示した（７；図１Ａ）。
Ｆ２後代のさらなる分析は、カナマイシン耐性が３：１に分離することを示した
。このことは、単一の遺伝子座がＴ−ＤＮＡ変異誘発によって破壊されたことを
示す。カナマイシン耐性は、ｒａｔ５の表現型と共分離した。このことは、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に関与する遺伝子がＴ−ＤＮＡ挿入によって変
異した可能性が最も高いことを示す。
ｂａｃｔｅｒｉｕｍの根の形質転換に対して抵抗性であるとして以前に同定され
た。インビトロでの根接種アッセイを、野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株Ａ
２０８（Ａｔ１０）を用いて行った。１ヵ月後、腫瘍を形成した根の束の百分率
を算出した。野生型植物（生態型Ｗｓ）の９０％を超える根の束が、大きな緑色
の奇形腫を形成した。対照的に、ｒａｔ５植物由来の１０％よりも少ない根の束
が、感染に応答して、小さな黄色のカルスを形成した（図１Ａ）。ホモ接合性の
ｒａｔ５植物（花粉ドナー）を野生型植物（卵ドナー）に交配し、そして得られ
たＦ１後代を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に対する感受性について試
験した。この分析は、ｒａｔ５が優性変異であることを示した（７；図１Ａ）。
Ｆ２後代のさらなる分析は、カナマイシン耐性が３：１に分離することを示した
。このことは、単一の遺伝子座がＴ−ＤＮＡ変異誘発によって破壊されたことを
示す。カナマイシン耐性は、ｒａｔ５の表現型と共分離した。このことは、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に関与する遺伝子がＴ−ＤＮＡ挿入によって変
異した可能性が最も高いことを示す。
【００１２】
（ｒａｔ５からのＴ−ＤＮＡ−植物連結部の回収）
ｒａｔ５変異体におけるＴ−ＤＮＡ組込みパターンを、ＤＮＡブロット分析に
よって決定した。この結果は、ｒａｔ５変異体のゲノムには２コピーの変異誘発
性Ｔ−ＤＮＡしか組み込まれていないことを示した。さらなる分析は、図１Ｃに
示すように、これらの２コピーのＴ−ＤＮＡが直列の縦列反復配列として存在す
ることを示した。
よって決定した。この結果は、ｒａｔ５変異体のゲノムには２コピーの変異誘発
性Ｔ−ＤＮＡしか組み込まれていないことを示した。さらなる分析は、図１Ｃに
示すように、これらの２コピーのＴ−ＤＮＡが直列の縦列反復配列として存在す
ることを示した。
【００１３】
レフトボーダー（ＬＢ）Ｔ−ＤＮＡ−植物連結部を、プラスミドレスキュー技
術（材料および方法を参照のこと）を用いてｒａｔ５から回収し、そしてこのＴ
−ＤＮＡ−植物連結部の制限エンドヌクレアーゼマップを構築した。植物のＤＮ
ＡおよびＬＢ ＤＮＡの両方を含む約１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローン化し、続いて、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ配列決定センターで配列決定した。このフラグメントの配列を図１
Ｂに示す。この連結領域のＤＮＡ配列分析は、ヒストンＨ２Ａ遺伝子の３’非翻
訳領域（ＵＴＲ）にＴ−ＤＮＡが挿入されたことを示した（図１Ｂ）。多数のｃ
ＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離し、そして配列決定することによっ
て、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのヒストンＨ２Ａ遺伝子をさらに特徴付けた。ヒス
トンＨ２Ａの６つの異なる遺伝子改変体が同定された。このことは、Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓのヒストンＨ２Ａ遺伝子が、小さな多重遺伝子ファミリーを構成す
ることを示す。λゲノムＤＮＡライブラリーでは、ＲＡＴ５に対応する野生型ヒ
ストンＨ２Ａ遺伝子を含むクローンが同定された。このゲノムクローンのＤＮＡ
配列分析は、ｒａｔ５では、Ｔ−ＤＮＡがコンセンサスなポリアデニル化シグナ
ル（ＡＡＴＡＡ）の上流に挿入されたことを示した。ＷｓのＤＮＡおよびｒａｔ
５のＤＮＡのＤＮＡブロット分析は、ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ挿入が挿入部
位のすぐ周囲の植物ＤＮＡに何の主な再配列も引き起こさないことを示した。Ｒ
ＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子の３’ＵＴＲの破壊は、ｒａｔ５変異体における
ｒａｔ表現型の唯一の原因であるようである。
術（材料および方法を参照のこと）を用いてｒａｔ５から回収し、そしてこのＴ
−ＤＮＡ−植物連結部の制限エンドヌクレアーゼマップを構築した。植物のＤＮ
ＡおよびＬＢ ＤＮＡの両方を含む約１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローン化し、続いて、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ配列決定センターで配列決定した。このフラグメントの配列を図１
Ｂに示す。この連結領域のＤＮＡ配列分析は、ヒストンＨ２Ａ遺伝子の３’非翻
訳領域（ＵＴＲ）にＴ−ＤＮＡが挿入されたことを示した（図１Ｂ）。多数のｃ
ＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離し、そして配列決定することによっ
て、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのヒストンＨ２Ａ遺伝子をさらに特徴付けた。ヒス
トンＨ２Ａの６つの異なる遺伝子改変体が同定された。このことは、Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓのヒストンＨ２Ａ遺伝子が、小さな多重遺伝子ファミリーを構成す
ることを示す。λゲノムＤＮＡライブラリーでは、ＲＡＴ５に対応する野生型ヒ
ストンＨ２Ａ遺伝子を含むクローンが同定された。このゲノムクローンのＤＮＡ
配列分析は、ｒａｔ５では、Ｔ−ＤＮＡがコンセンサスなポリアデニル化シグナ
ル（ＡＡＴＡＡ）の上流に挿入されたことを示した。ＷｓのＤＮＡおよびｒａｔ
５のＤＮＡのＤＮＡブロット分析は、ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ挿入が挿入部
位のすぐ周囲の植物ＤＮＡに何の主な再配列も引き起こさないことを示した。Ｒ
ＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子の３’ＵＴＲの破壊は、ｒａｔ５変異体における
ｒａｔ表現型の唯一の原因であるようである。
【００１４】
図１は、ｒａｔ５変異体の特徴付けを示す。（Ａ）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換。無菌の根セ
グメントを、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８に感染させた。共存培養２
日後、この根を、植物ホルモンを含まず、かつ抗生物質としてチメンチン（ｔｉ
ｍｅｎｔｉｎ）を含むＭＳ培地に移植した。４週間後に腫瘍を数えた。（Ｂ）ｒ
ａｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列。（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込み
のパターン。ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダ
ー；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐ
ＢＲ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝
子；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。ｒａｔ５変異体由来の
５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩまたはＳａｌＩのいずれかで消化し、そし
てナイロンメンブレンにブロッティングした。ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩフラグメントを、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。Ｔ−ＤＮ
Ａを超えることが示された制限フラグメントの大きさをＥｃｏＲＩ消化によって
検出し、そしてＴ−ＤＮＡよりも小さいと示された大きさをＳａｌＩ消化によっ
て検出した。
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換。無菌の根セ
グメントを、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８に感染させた。共存培養２
日後、この根を、植物ホルモンを含まず、かつ抗生物質としてチメンチン（ｔｉ
ｍｅｎｔｉｎ）を含むＭＳ培地に移植した。４週間後に腫瘍を数えた。（Ｂ）ｒ
ａｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列。（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込み
のパターン。ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダ
ー；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐ
ＢＲ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝
子；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。ｒａｔ５変異体由来の
５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩまたはＳａｌＩのいずれかで消化し、そし
てナイロンメンブレンにブロッティングした。ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩフラグメントを、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。Ｔ−ＤＮ
Ａを超えることが示された制限フラグメントの大きさをＥｃｏＲＩ消化によって
検出し、そしてＴ−ＤＮＡよりも小さいと示された大きさをＳａｌＩ消化によっ
て検出した。
【００１５】
（野生型ヒストンＨ２Ａ遺伝子（ＲＡＴ５）によるｒａｔ５変異体の補完）
２つの異なる構築を行って、ｒａｔ５変異体の補完分析を行った。最初に、ノ
パリンシンターゼターミネーター（３’ＮＯＳ）を、１．７ｋｂｐの連結部フラ
グメントの３’領域に融合した（この１．７ｋｂｐのフラグメントの配列を図１
Ｂに示す）。この構築物は、それ自体のプロモーターを有するＲＡＴ５ヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子および３’ＮＯＳを含む。このフラグメント（ＲＡＴ５＋３’ＮＯ
Ｓ）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子をＴ−ＤＮＡのレフトボーダーとライトボ
ーダーとの間に含むビーカーのバイナリーベクターｐＧＴＶ−ＨＰＴ中にクロー
ン化して、バイナリーベクターｐＫＭ４を得た（図２Ａ）。第２の構築のために
、野生型ＷｓＤＮＡの、ヒストンＨ２Ａ遺伝子（ＲＡＴ５）＋ＲＡＴ５の上流お
よび下流の少なくとも２．０ｋｂｐの配列を含む、９．０ｋｂｐのＳａｃＩゲノ
ムフラグメントを、バイナリーベクターｐＧＴＶ−ＨＰＴにクローン化して、バ
イナリーベクターｐＫＭ５を得た（図２Ｂ）。ｐＫＭ４およびｐＫＭ５を、別々
に非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に移入して、それぞ
れ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ａｔ１０１２および株Ａｔ１０６２を得た。
パリンシンターゼターミネーター（３’ＮＯＳ）を、１．７ｋｂｐの連結部フラ
グメントの３’領域に融合した（この１．７ｋｂｐのフラグメントの配列を図１
Ｂに示す）。この構築物は、それ自体のプロモーターを有するＲＡＴ５ヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子および３’ＮＯＳを含む。このフラグメント（ＲＡＴ５＋３’ＮＯ
Ｓ）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子をＴ−ＤＮＡのレフトボーダーとライトボ
ーダーとの間に含むビーカーのバイナリーベクターｐＧＴＶ−ＨＰＴ中にクロー
ン化して、バイナリーベクターｐＫＭ４を得た（図２Ａ）。第２の構築のために
、野生型ＷｓＤＮＡの、ヒストンＨ２Ａ遺伝子（ＲＡＴ５）＋ＲＡＴ５の上流お
よび下流の少なくとも２．０ｋｂｐの配列を含む、９．０ｋｂｐのＳａｃＩゲノ
ムフラグメントを、バイナリーベクターｐＧＴＶ−ＨＰＴにクローン化して、バ
イナリーベクターｐＫＭ５を得た（図２Ｂ）。ｐＫＭ４およびｐＫＭ５を、別々
に非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に移入して、それぞ
れ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ａｔ１０１２および株Ａｔ１０６２を得た。
【００１６】
株Ａｔ１０１２および株Ａｔ１０６２の両方を別々に用い、生殖系列形質転換
方法（Ｂｅｎｔら，１９９８）を用いてｒａｔ５植物を形質転換し、そしてトラ
ンスジェニックｒａｔ５植物を、ハイグロマイシン（２０μｇ／ｍｌ）に対する
耐性について選択した。いくつかのトランスジェニック植物（Ｔ１）が得られた
。これらのトランスジェニック植物を自家受粉させ、そしてＴ１種子を収集した
。Ａｔ１０１２（３’ＮＯＳを有する野生型ヒストンＨ２Ａ）での形質転換によ
って得られた６つのトランスジェニック系統をランダムに選択し、そしてそれら
の種子をハイグロマイシンの存在下で発芽させた。腫瘍形成アッセイを、Ｎａｍ
ら（１９９９）に記載された通りに、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ１０お
よび無菌の根接種プロトコルを用いて、６つのトランスジェニック系統の各々由
来の少なくとも５つの異なる植物に対して行った。この結果は、試験した６つの
トランスジェニックｒａｔ５系統のうちの５つで、腫瘍形成感受性表現型が回復
（ｒｅｃｏｖｅｒ）されたことを示した（図２Ｃ；表１）。これらの植物の根で
刺激された奇形腫は、野生型植物で生じた腫瘍と類似しているようであった。試
験したトランスジェニック植物のうちの１つは、腫瘍形成感受性表現型を回復し
なかった。これはおそらく、導入遺伝子が不活性であることによる。Ａｔ１０６
２（野生型植物由来のＲＡＴ５をコードするゲノムを含む）での形質転換によっ
て得られたｒａｔ５のトランスジェニックＴ１植物をまた、腫瘍形成感受性表現
型の回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）について試験した。これらの植物のうちの
いくつかはまた、腫瘍感受性表現型を回復し得た。このことは、ｒａｔ５変異の
補完を示す。ｒａｔ５変異体をｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ単独で形質転換することによ
って生成されるハイグロマイシン耐性トランスジェニック植物は、Ａ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８での感染の際に腫瘍を形成しなかった。
方法（Ｂｅｎｔら，１９９８）を用いてｒａｔ５植物を形質転換し、そしてトラ
ンスジェニックｒａｔ５植物を、ハイグロマイシン（２０μｇ／ｍｌ）に対する
耐性について選択した。いくつかのトランスジェニック植物（Ｔ１）が得られた
。これらのトランスジェニック植物を自家受粉させ、そしてＴ１種子を収集した
。Ａｔ１０１２（３’ＮＯＳを有する野生型ヒストンＨ２Ａ）での形質転換によ
って得られた６つのトランスジェニック系統をランダムに選択し、そしてそれら
の種子をハイグロマイシンの存在下で発芽させた。腫瘍形成アッセイを、Ｎａｍ
ら（１９９９）に記載された通りに、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ１０お
よび無菌の根接種プロトコルを用いて、６つのトランスジェニック系統の各々由
来の少なくとも５つの異なる植物に対して行った。この結果は、試験した６つの
トランスジェニックｒａｔ５系統のうちの５つで、腫瘍形成感受性表現型が回復
（ｒｅｃｏｖｅｒ）されたことを示した（図２Ｃ；表１）。これらの植物の根で
刺激された奇形腫は、野生型植物で生じた腫瘍と類似しているようであった。試
験したトランスジェニック植物のうちの１つは、腫瘍形成感受性表現型を回復し
なかった。これはおそらく、導入遺伝子が不活性であることによる。Ａｔ１０６
２（野生型植物由来のＲＡＴ５をコードするゲノムを含む）での形質転換によっ
て得られたｒａｔ５のトランスジェニックＴ１植物をまた、腫瘍形成感受性表現
型の回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）について試験した。これらの植物のうちの
いくつかはまた、腫瘍感受性表現型を回復し得た。このことは、ｒａｔ５変異の
補完を示す。ｒａｔ５変異体をｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ単独で形質転換することによ
って生成されるハイグロマイシン耐性トランスジェニック植物は、Ａ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８での感染の際に腫瘍を形成しなかった。
【００１７】
補完実験の遺伝的基礎を確認するために、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ
１０１２でのｒａｔ５変異体の形質転換によって得られたｒａｔ５トランスジェ
ニック系統のうちの１つ（ｒａｔ５ Ａｔ１０１２−６）について共分離分析を
行った。腫瘍形成感受性表現型を有する野生型ＲＡＴ５遺伝子を含む補完するＴ
−ＤＮＡの共分離を調べるために、ｒａｔ５変異についてホモ接合性であるがハ
イグロマイシン耐性についてヘテロ接合性であるＴ２植物由来の種子を、選択せ
ずにＢ５培地上で発芽させ、そして増殖させた。続いて、これらの植物の根を、
ハイグロマイシン耐性およびクラウンゴール腫瘍形成に対する感受性について試
験した。ハイグロマイシンに対して感受性である全ての植物はまた、ｒａｔ５変
異体の耐性と同様の様式で腫瘍形成について耐性であった。２５のハイグロマイ
シン耐性植物のうち、少なくとも８つは、腫瘍形成に対して感受性であった。し
かし、１７のハイグロマイシン耐性植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形
質転換に対して抵抗性のままであった。これらの植物は、補完するＲＡＴ５遺伝
子に関してヘテロ接合性であるようであり、そして腫瘍形成に対する感受性を回
復させるに十分に高いレベルまではこの遺伝子を発現しなかった。この可能性は
、ｒａｔ５変異が優性であり、それゆえ、ＲＡＴ５の１つの活性なコピーはＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を可能にするに十分ではないという知見に
対応する。まとめて考えると、分子的データおよび遺伝子的データは、ｒａｔ５
変異体において、ヒストンＨ２Ａ遺伝子の破壊が、腫瘍形成欠損（ｒａｔ）表現
型の原因であることを強力に示す。
１０１２でのｒａｔ５変異体の形質転換によって得られたｒａｔ５トランスジェ
ニック系統のうちの１つ（ｒａｔ５ Ａｔ１０１２−６）について共分離分析を
行った。腫瘍形成感受性表現型を有する野生型ＲＡＴ５遺伝子を含む補完するＴ
−ＤＮＡの共分離を調べるために、ｒａｔ５変異についてホモ接合性であるがハ
イグロマイシン耐性についてヘテロ接合性であるＴ２植物由来の種子を、選択せ
ずにＢ５培地上で発芽させ、そして増殖させた。続いて、これらの植物の根を、
ハイグロマイシン耐性およびクラウンゴール腫瘍形成に対する感受性について試
験した。ハイグロマイシンに対して感受性である全ての植物はまた、ｒａｔ５変
異体の耐性と同様の様式で腫瘍形成について耐性であった。２５のハイグロマイ
シン耐性植物のうち、少なくとも８つは、腫瘍形成に対して感受性であった。し
かし、１７のハイグロマイシン耐性植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形
質転換に対して抵抗性のままであった。これらの植物は、補完するＲＡＴ５遺伝
子に関してヘテロ接合性であるようであり、そして腫瘍形成に対する感受性を回
復させるに十分に高いレベルまではこの遺伝子を発現しなかった。この可能性は
、ｒａｔ５変異が優性であり、それゆえ、ＲＡＴ５の１つの活性なコピーはＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を可能にするに十分ではないという知見に
対応する。まとめて考えると、分子的データおよび遺伝子的データは、ｒａｔ５
変異体において、ヒストンＨ２Ａ遺伝子の破壊が、腫瘍形成欠損（ｒａｔ）表現
型の原因であることを強力に示す。
【００１８】
野生型植物におけるヒストンＨ２Ａ（ＲＡＴ５）遺伝子の過剰発現は、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換の効率を改善する。ＲＡＴ５遺伝子がＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換において直接的な役割を果たすか否かをさらに決
定するために、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ１０１２を用いて、さらなる
コピーのＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子を含むいくつかのトランスジェニックＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（生態型Ｗｓ）を作製した。これらのトランスジェニ
ック植物を自家受粉させ、Ｔ１の種子を収集し、そしてＴ２植物をハイグロマイ
シンの存在下で発芽させた。腫瘍形成アッセイを、本明細書中に記載の通りに、
４つの異なるトランスジェニック系統の各々由来の少なくとも５つの植物につい
て行った。生態型Ｗｓは通常、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に対して非
常に感受性であるので、腫瘍形成アッセイを変更して、形質転換感受性野生型植
物とＲＡＴ５を過剰発現するトランスジェニック野生型植物との間でのいかなる
わずかな差をも検出した。これらの変更は、通常使用される（２×１０9ｃｆｕ
／ｍｌ）よりも１００倍低い濃度（２×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）の細菌での根のセ
グメントの接種、および根のセグメントの束とするのではなく、個々の根のセグ
メントをＭＳ培地上に広げて腫瘍の産生を観察したことを含んでいた。この結果
は、表１および図２Ｄに示すように、ＲＡＴ５を過剰発現するトランスジェニッ
ク植物が野生型Ｗｓ植物よりも約２倍、根形質転換に対して感受性が高いことを
示す。これらのデータは、ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡ形質転
換において直接的な役割を果たすこと、およびＲＡＴ５の過剰発現が形質転換に
対する感受性を増大させ得ることを示す。
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換の効率を改善する。ＲＡＴ５遺伝子がＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換において直接的な役割を果たすか否かをさらに決
定するために、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ１０１２を用いて、さらなる
コピーのＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子を含むいくつかのトランスジェニックＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（生態型Ｗｓ）を作製した。これらのトランスジェニ
ック植物を自家受粉させ、Ｔ１の種子を収集し、そしてＴ２植物をハイグロマイ
シンの存在下で発芽させた。腫瘍形成アッセイを、本明細書中に記載の通りに、
４つの異なるトランスジェニック系統の各々由来の少なくとも５つの植物につい
て行った。生態型Ｗｓは通常、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に対して非
常に感受性であるので、腫瘍形成アッセイを変更して、形質転換感受性野生型植
物とＲＡＴ５を過剰発現するトランスジェニック野生型植物との間でのいかなる
わずかな差をも検出した。これらの変更は、通常使用される（２×１０9ｃｆｕ
／ｍｌ）よりも１００倍低い濃度（２×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）の細菌での根のセ
グメントの接種、および根のセグメントの束とするのではなく、個々の根のセグ
メントをＭＳ培地上に広げて腫瘍の産生を観察したことを含んでいた。この結果
は、表１および図２Ｄに示すように、ＲＡＴ５を過剰発現するトランスジェニッ
ク植物が野生型Ｗｓ植物よりも約２倍、根形質転換に対して感受性が高いことを
示す。これらのデータは、ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡ形質転
換において直接的な役割を果たすこと、およびＲＡＴ５の過剰発現が形質転換に
対する感受性を増大させ得ることを示す。
【００１９】
ヒストンＨ２Ａの一過性の発現は、ｒａｔ５の形質転換を可能にし、そして野
生型Ｗｓ植物の形質転換効率を増大させるに十分である。入ってきたＴ−ＤＮＡ
由来のＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子の発現は、ｒａｔ５変異体を補完する。ｐ
ＧＰＴＶ−ＨＹＧ（ヒストンＨ２Ａ遺伝子を含まない）を保有するＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ株でのこの変異体の形質転換は、ハイグロマイシン選択培地上に
、ごくわずかの、ゆっくりと増殖するカルスをもたらし、ｐＫＭ４またはｐＫＭ
５を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、迅速に増殖するハイグロマイシ
ン耐性カルスをそれぞれ、ｒａｔ５の根のセグメントの束の６０±２１％および
５４±２２％について刺激した。さらに、ｐＫＭ４を保有する腫瘍形成性Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（Ａ２０８）で野生型植物を（低細菌密度で）感染させ
た場合、ｐＧＰＴＶ−ＨＹＧを保有する腫瘍形成性細菌株で感染させた３６±９
％の根のセグメントと比較して、７８±８％の根のセグメントが腫瘍を発生した
。これらの形質転換実験は、バイナリーベクターｐＫＭ４またはｐＫＭ５を含む
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が、ｒａｔ５変異体植物を比較的高い効率で形質
転換し得、野生型植物に対して腫瘍形成性が２倍高く、そして「空の」バイナリ
ーベクターｐＧＰＴＶ−ＨＹＧを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株よりもハイ
グロマイシン耐性カルスを良好に刺激し得ることを示す。一過性に産生されたヒ
ストンＨ２Ａは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる植物の安定な形質転換効率
を改善し得る。
生型Ｗｓ植物の形質転換効率を増大させるに十分である。入ってきたＴ−ＤＮＡ
由来のＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子の発現は、ｒａｔ５変異体を補完する。ｐ
ＧＰＴＶ−ＨＹＧ（ヒストンＨ２Ａ遺伝子を含まない）を保有するＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ株でのこの変異体の形質転換は、ハイグロマイシン選択培地上に
、ごくわずかの、ゆっくりと増殖するカルスをもたらし、ｐＫＭ４またはｐＫＭ
５を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、迅速に増殖するハイグロマイシ
ン耐性カルスをそれぞれ、ｒａｔ５の根のセグメントの束の６０±２１％および
５４±２２％について刺激した。さらに、ｐＫＭ４を保有する腫瘍形成性Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（Ａ２０８）で野生型植物を（低細菌密度で）感染させ
た場合、ｐＧＰＴＶ−ＨＹＧを保有する腫瘍形成性細菌株で感染させた３６±９
％の根のセグメントと比較して、７８±８％の根のセグメントが腫瘍を発生した
。これらの形質転換実験は、バイナリーベクターｐＫＭ４またはｐＫＭ５を含む
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が、ｒａｔ５変異体植物を比較的高い効率で形質
転換し得、野生型植物に対して腫瘍形成性が２倍高く、そして「空の」バイナリ
ーベクターｐＧＰＴＶ−ＨＹＧを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株よりもハイ
グロマイシン耐性カルスを良好に刺激し得ることを示す。一過性に産生されたヒ
ストンＨ２Ａは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる植物の安定な形質転換効率
を改善し得る。
【００２０】
ｒａｔ５変異体は、Ｔ−ＤＮＡ組込みが欠損している。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｒａｔ５変異体のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、一過性の形
質転換の高い効率をもたらしたが、しかし、Ｔ−ＤＮＡによってコードされるｇ
ｕｓＡ遺伝子の発現によって決定した場合、安定な形質転換の低い効率を生じた
。この結果は、ｒａｔ５がＴ−ＤＮＡ組込みを欠損している可能性が最も高いこ
とを示唆した。この仮説を直接試験するために、Ｗｓ植物およびｒａｔ５植物由
来の根のセグメントを、Ｔ−ＤＮＡバイナリーベクターｐＢＩＳＮ１を保有する
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１で接種した。ｐＢＩＳＮ１は、「ス
ーパープロモーター」の制御下にｇｕｓＡ−イントロン遺伝子を含む（Ｎｉら，
１９９５；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕら，１９９６）。共存培養２日後、根のセグ
メントを、チメンチン（１００μｇ／ｍｌ）を含むカルス誘導培地に移植して、
細菌を殺傷した。感染の３日後、いくつかのセグメントを、色素原性色素Ｘ−ｇ
ｌｕｃを用いてＧＵＳ活性について染色した。野生型およびｒａｔ５変異体の両
方が、高いレベルのＧＵＳ発現を示した（約９０％の根のセグメントが青く染色
された；図３Ａ）。残りの根のセグメントを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを殺
傷するためにチメンチンを含むが植物形質転換の選択のための抗生物質を何ら含
まないカルス誘導培地上でカルスを形成させた。４週間後、少なくとも５つの異
なるＷｓ植物およびｒａｔ５植物から誘導された多数のカルスをＸ−ｇｌｕｃで
染色した。サンプリングしたＷｓカルスのうち、９２±１２％は、大きな青色の
染色領域を示したが、一方、２６±１０％のｒａｔ５のカルスしかＧＵＳ活性を
示さず、そしてこれらの青色の染色領域の大部分は、小さかった（図３Ａ）。こ
れらのデータは、ｒａｔ５変異体がｇｕｓＡ遺伝子を高レベルで一過的に発現し
得るが、ｇｕｓＡ発現を安定化できなかったことを示す。
ｓ ｒａｔ５変異体のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、一過性の形
質転換の高い効率をもたらしたが、しかし、Ｔ−ＤＮＡによってコードされるｇ
ｕｓＡ遺伝子の発現によって決定した場合、安定な形質転換の低い効率を生じた
。この結果は、ｒａｔ５がＴ−ＤＮＡ組込みを欠損している可能性が最も高いこ
とを示唆した。この仮説を直接試験するために、Ｗｓ植物およびｒａｔ５植物由
来の根のセグメントを、Ｔ−ＤＮＡバイナリーベクターｐＢＩＳＮ１を保有する
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＧＶ３１０１で接種した。ｐＢＩＳＮ１は、「ス
ーパープロモーター」の制御下にｇｕｓＡ−イントロン遺伝子を含む（Ｎｉら，
１９９５；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕら，１９９６）。共存培養２日後、根のセグ
メントを、チメンチン（１００μｇ／ｍｌ）を含むカルス誘導培地に移植して、
細菌を殺傷した。感染の３日後、いくつかのセグメントを、色素原性色素Ｘ−ｇ
ｌｕｃを用いてＧＵＳ活性について染色した。野生型およびｒａｔ５変異体の両
方が、高いレベルのＧＵＳ発現を示した（約９０％の根のセグメントが青く染色
された；図３Ａ）。残りの根のセグメントを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを殺
傷するためにチメンチンを含むが植物形質転換の選択のための抗生物質を何ら含
まないカルス誘導培地上でカルスを形成させた。４週間後、少なくとも５つの異
なるＷｓ植物およびｒａｔ５植物から誘導された多数のカルスをＸ−ｇｌｕｃで
染色した。サンプリングしたＷｓカルスのうち、９２±１２％は、大きな青色の
染色領域を示したが、一方、２６±１０％のｒａｔ５のカルスしかＧＵＳ活性を
示さず、そしてこれらの青色の染色領域の大部分は、小さかった（図３Ａ）。こ
れらのデータは、ｒａｔ５変異体がｇｕｓＡ遺伝子を高レベルで一過的に発現し
得るが、ｇｕｓＡ発現を安定化できなかったことを示す。
【００２１】
懸濁細胞株を、これらのＷｓカルスおよびｒａｔ５カルスから生成し、そして
さらに１ヶ月後、Ｗｓカルスおよびｒａｔ５カルス由来の高分子量植物ＤＮＡに
組み込まれたＴ−ＤＮＡの量を（ｐＢＩＳＮ１のＴ−ＤＮＡ内に位置するｇｕｓ
Ａ−イントロン遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして用いて）アッセ
イした（Ｎａｍら，１９９７；Ｍｙｓｏｒｅら，１９９８）。図３Ｂは、野生型
Ｗｓ植物のゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡは容易に検出可能であるとはいえ、
ｒａｔ５ゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡはそうでないことを示す。これらのデ
ータは、ｒａｔ５がＴ−ＤＮＡ組込みを欠損していることを直接実証する。レー
ンの各々における植物ＤＮＡの等しいローディングを実証するために、ｇｕｓＡ
プローブをブロットからストリッピングし、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓフェ
ニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プローブを用いてブロットを
再度ハイブリダイズした。
さらに１ヶ月後、Ｗｓカルスおよびｒａｔ５カルス由来の高分子量植物ＤＮＡに
組み込まれたＴ−ＤＮＡの量を（ｐＢＩＳＮ１のＴ−ＤＮＡ内に位置するｇｕｓ
Ａ−イントロン遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして用いて）アッセ
イした（Ｎａｍら，１９９７；Ｍｙｓｏｒｅら，１９９８）。図３Ｂは、野生型
Ｗｓ植物のゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡは容易に検出可能であるとはいえ、
ｒａｔ５ゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡはそうでないことを示す。これらのデ
ータは、ｒａｔ５がＴ−ＤＮＡ組込みを欠損していることを直接実証する。レー
ンの各々における植物ＤＮＡの等しいローディングを実証するために、ｇｕｓＡ
プローブをブロットからストリッピングし、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓフェ
ニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プローブを用いてブロットを
再度ハイブリダイズした。
【００２２】
図２は、ｒａｔ５変異体の補完および野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物にお
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す。バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡＴ
５ヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンターゼプ
ロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピンシン
ターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ、プロモーターレスｇｕｓＡ遺伝
子。ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印は、
転写方向を示す。（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完。ｒａｔ５変異体植物を、バイナ
リーベクターｐＫＭ４（Ａｔ１０１２）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株で
形質転換した。ハイグロマイシン耐性トランスジェニック植物を得て、そして自
家受粉してＴ２植物を得た。ＲＡＴ５を発現するＴ２植物、野生型Ｗｓ植物およ
びｒａｔ５変異体植物の無菌の根のセグメントを、腫瘍形成性Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ株Ａ２０８に感染させた。共存培養２日後、この根を、植物ホルモン
を含まずチメンチンを含むＭＳ培地に移した。４週間後に腫瘍を数えた。（Ｄ）
ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫
瘍形成アッセイ。Ｗｓ植物を、バイナリーベクターｐＫＭ４を含むＡ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ１０１２で形質転換した。ハイグロマイシン耐性トランス
ジェニック植物を得て、これを自家受粉して、Ｔ２植物を得た。ＲＡＴ５を過剰
発現するＴ２植物および野生型Ｗｓ植物の無菌の根のセグメントを、Ａ．ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８を低い細菌密度で用いて感染させた。共存培養２日
後、この根を、植物ホルモンを含まずチメンチンを含むＭＳ培地に移した。４週
間後に腫瘍を数えた。
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す。バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡＴ
５ヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンターゼプ
ロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピンシン
ターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ、プロモーターレスｇｕｓＡ遺伝
子。ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印は、
転写方向を示す。（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完。ｒａｔ５変異体植物を、バイナ
リーベクターｐＫＭ４（Ａｔ１０１２）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株で
形質転換した。ハイグロマイシン耐性トランスジェニック植物を得て、そして自
家受粉してＴ２植物を得た。ＲＡＴ５を発現するＴ２植物、野生型Ｗｓ植物およ
びｒａｔ５変異体植物の無菌の根のセグメントを、腫瘍形成性Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ株Ａ２０８に感染させた。共存培養２日後、この根を、植物ホルモン
を含まずチメンチンを含むＭＳ培地に移した。４週間後に腫瘍を数えた。（Ｄ）
ＲＡＴ５ヒストンＨ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫
瘍形成アッセイ。Ｗｓ植物を、バイナリーベクターｐＫＭ４を含むＡ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ Ａｔ１０１２で形質転換した。ハイグロマイシン耐性トランス
ジェニック植物を得て、これを自家受粉して、Ｔ２植物を得た。ＲＡＴ５を過剰
発現するＴ２植物および野生型Ｗｓ植物の無菌の根のセグメントを、Ａ．ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８を低い細菌密度で用いて感染させた。共存培養２日
後、この根を、植物ホルモンを含まずチメンチンを含むＭＳ培地に移した。４週
間後に腫瘍を数えた。
【００２３】
これらの植物の根に刺激された奇形腫は、野生型植物上で生成された腫瘍と類
似するようであった。試験したトランスジェニック植物のうちの１つは、腫瘍形
成感受性表現型を回復させなかった。これはおそらく、導入遺伝子が不活性であ
ることによる。Ａｔ１０６２（野生型植物由来のＲＡＴ５をコードするゲノムを
含む）での形質転換によって得られたｒａｔ５のトランスジェニックＴ１植物を
また、腫瘍形成感受性表現型の回復について試験した。これらの植物のいくつか
はまた、腫瘍形成感受性表現型を回復し得た。このことは、ｒａｔ５変異の補完
を示す。ｒａｔ５変異体をｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ単独で形質転換することによって
生成されたハイグロマイシン耐性トランスジェニック植物は、Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ Ａ２０８での感染の際に腫瘍を形成しなかった。
似するようであった。試験したトランスジェニック植物のうちの１つは、腫瘍形
成感受性表現型を回復させなかった。これはおそらく、導入遺伝子が不活性であ
ることによる。Ａｔ１０６２（野生型植物由来のＲＡＴ５をコードするゲノムを
含む）での形質転換によって得られたｒａｔ５のトランスジェニックＴ１植物を
また、腫瘍形成感受性表現型の回復について試験した。これらの植物のいくつか
はまた、腫瘍形成感受性表現型を回復し得た。このことは、ｒａｔ５変異の補完
を示す。ｒａｔ５変異体をｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ単独で形質転換することによって
生成されたハイグロマイシン耐性トランスジェニック植物は、Ａ．ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ Ａ２０８での感染の際に腫瘍を形成しなかった。
【００２４】
図３は、ｒａｔ５植物およびＷｓ植物のＴ−ＤＮＡ組込みアッセイを示す；（
Ａ）Ｗｓおよびｒａｔ５における一過性および安定なＧＵＳ発現；Ｗｓ植物およ
びｒａｔ５植物の無菌の根のセグメントを、バイナリーベクターｐＢＩＳＮ１を
含む非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に感染させた。共
存培養２日後、この根を、チメンチンを含むカルス誘導培地（ＣＩＭ）に移した
。感染３日後、セグメントの半分をＸ−ｇｌｕｃで染色して、一過性のＧＵＳ発
現の効率を決定した。他の群のセグメントを、ＣＩＭ上でカルスを形成させた。
４週間後、これらのカルスをＸ−ｇｌｕｃで染色して、安定なＧＵＳ発現の効率
を決定した。（Ｂ）ｒａｔ５植物およびＷｓ植物におけるＴ−ＤＮＡ組込み。懸
濁細胞を、バイナリーベクターｐＢＩＳＮ１を含む非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に感染させたＷｓおよびｒａｔ５の根のセグメント
から生成されたカルスから誘導した。懸濁細胞株を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍを殺傷するためにチメンチンまたはセフォタキシムの存在下で３週間増殖させ
た（形質転換についての選択なし）。ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から単離し、
０．６％アガロースでの電気泳動に供し、ナイロンメンブレンにブロッティング
し、そしてｇｕｓＡ遺伝子プローブとハイブリダイズした。オートラジオグラフ
ィー後、このメンブレンをストリッピングし、そしてフェニルアラニンアンモニ
アリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プローブと再度ハイブリダイズさせて、各レーンに
おけるＤＮＡの等しいローディングを決定した。
Ａ）Ｗｓおよびｒａｔ５における一過性および安定なＧＵＳ発現；Ｗｓ植物およ
びｒａｔ５植物の無菌の根のセグメントを、バイナリーベクターｐＢＩＳＮ１を
含む非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に感染させた。共
存培養２日後、この根を、チメンチンを含むカルス誘導培地（ＣＩＭ）に移した
。感染３日後、セグメントの半分をＸ−ｇｌｕｃで染色して、一過性のＧＵＳ発
現の効率を決定した。他の群のセグメントを、ＣＩＭ上でカルスを形成させた。
４週間後、これらのカルスをＸ−ｇｌｕｃで染色して、安定なＧＵＳ発現の効率
を決定した。（Ｂ）ｒａｔ５植物およびＷｓ植物におけるＴ−ＤＮＡ組込み。懸
濁細胞を、バイナリーベクターｐＢＩＳＮ１を含む非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に感染させたＷｓおよびｒａｔ５の根のセグメント
から生成されたカルスから誘導した。懸濁細胞株を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍを殺傷するためにチメンチンまたはセフォタキシムの存在下で３週間増殖させ
た（形質転換についての選択なし）。ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から単離し、
０．６％アガロースでの電気泳動に供し、ナイロンメンブレンにブロッティング
し、そしてｇｕｓＡ遺伝子プローブとハイブリダイズした。オートラジオグラフ
ィー後、このメンブレンをストリッピングし、そしてフェニルアラニンアンモニ
アリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プローブと再度ハイブリダイズさせて、各レーンに
おけるＤＮＡの等しいローディングを決定した。
【００２５】
（材料および方法）
（核酸操作）
総植物ゲノムＤＮＡを、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら（１９８３）の方法に従って
単離した。制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動、プラスミド
単離およびＤＮＡブロット分析を、記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８２
）通りに行った。
単離した。制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動、プラスミド
単離およびＤＮＡブロット分析を、記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８２
）通りに行った。
【００２６】
（プラスミドレスキュー）
ｒａｔ５のゲノムＤＮＡ（５μｇ）を、ＳａｌＩで完全に消化した。消化した
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。
ＤＮＡを、５００μｌの最終容量で、１×連結緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で３
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間自己連結させた。連結混
合物をエタノールで沈澱させ、エレクトロポレーション（２５μＦ、２００Ωお
よび２．５ｋＶ）によって電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞（ｍｃｒＢＣ−；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に形質転換
し、そしてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地上にプレーティン
グした。アンピシリン耐性コロニーをナイロンメンブレンに載せ、この細菌を溶
解し、そしてＤＮＡをインサイチュで変性させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８
２）。放射性標識したレフトボーダー（ＬＢ）配列（ｐＥ１４６１の３．０ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩフラグメント）をハイブリダイゼーションプローブとして用いて
、ＬＢを含むプラスミドを同定した。陽性コロニーを拾い、そしてプラスミドＤ
ＮＡを単離した。制限断片分析によって、ＬＢおよび植物連結部ＤＮＡの両方を
含むプラスミドが同定された。連結部のフラグメントを野生型植物ＤＮＡにハイ
ブリダイズさせることによって、植物の連結部のフラグメントを確認した。この
プラスミド（ＬＢ−植物連結部ＤＮＡを含む）の制限マップを作成した。植物Ｄ
ＮＡ＋７５塩基対のＬＢ配列を含む１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化して、ｐＥ１５０９を得た。続いて、
このフラグメントを、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ配列決定センターで
配列決定した。
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。
ＤＮＡを、５００μｌの最終容量で、１×連結緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で３
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間自己連結させた。連結混
合物をエタノールで沈澱させ、エレクトロポレーション（２５μＦ、２００Ωお
よび２．５ｋＶ）によって電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞（ｍｃｒＢＣ−；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に形質転換
し、そしてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地上にプレーティン
グした。アンピシリン耐性コロニーをナイロンメンブレンに載せ、この細菌を溶
解し、そしてＤＮＡをインサイチュで変性させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８
２）。放射性標識したレフトボーダー（ＬＢ）配列（ｐＥ１４６１の３．０ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩフラグメント）をハイブリダイゼーションプローブとして用いて
、ＬＢを含むプラスミドを同定した。陽性コロニーを拾い、そしてプラスミドＤ
ＮＡを単離した。制限断片分析によって、ＬＢおよび植物連結部ＤＮＡの両方を
含むプラスミドが同定された。連結部のフラグメントを野生型植物ＤＮＡにハイ
ブリダイズさせることによって、植物の連結部のフラグメントを確認した。この
プラスミド（ＬＢ−植物連結部ＤＮＡを含む）の制限マップを作成した。植物Ｄ
ＮＡ＋７５塩基対のＬＢ配列を含む１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化して、ｐＥ１５０９を得た。続いて、
このフラグメントを、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ配列決定センターで
配列決定した。
【００２７】
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの増殖およびインビトロでのＡｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの根の接種） これらを、Ｎａｍら（１９９７）によって以前記載された通りに行った。
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの根の接種） これらを、Ｎａｍら（１９９７）によって以前記載された通りに行った。
【００２８】
（植物生長条件）
種々のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ生態型の種子を、Ｓ．Ｌｅ
ｉｓｎｅｒおよびＥ．Ａｓｈｗｏｒｔｈから得た（元々、それぞれ、Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫおよび
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔ
ｅｒ，Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ由来）
。種子を、５０％の市販の漂白剤および０．１％ ＳＤＳから構成される溶液を
１０分間用いて表面滅菌し、次いで無菌の蒸留水で５分間リンスした。種子を、
０．７５％バクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ）で凝固させたＧ
ａｍｂｏｒｇのＢ５培地（ＧＩＢＣＯ）を含むペトリ皿において発芽させた。こ
のプレートを最初に４℃で２日間インキュベートし、そして１６時間明／８時間
暗の光周期の下で２５℃で７日間インキュベートした。実生を個々に、ベビーフ
ードジャー（ｂａｂｙ ｆｏｏｄ ｊａｒ）を含む凝固させたＢ５培地に移し、
そして根の培養のために７〜１０日間生長させた。あるいは、実生を、抽だい（
ｂｏｌｔ）接種のために土壌に移した。
ｉｓｎｅｒおよびＥ．Ａｓｈｗｏｒｔｈから得た（元々、それぞれ、Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫおよび
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔ
ｅｒ，Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ由来）
。種子を、５０％の市販の漂白剤および０．１％ ＳＤＳから構成される溶液を
１０分間用いて表面滅菌し、次いで無菌の蒸留水で５分間リンスした。種子を、
０．７５％バクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ）で凝固させたＧ
ａｍｂｏｒｇのＢ５培地（ＧＩＢＣＯ）を含むペトリ皿において発芽させた。こ
のプレートを最初に４℃で２日間インキュベートし、そして１６時間明／８時間
暗の光周期の下で２５℃で７日間インキュベートした。実生を個々に、ベビーフ
ードジャー（ｂａｂｙ ｆｏｏｄ ｊａｒ）を含む凝固させたＢ５培地に移し、
そして根の培養のために７〜１０日間生長させた。あるいは、実生を、抽だい（
ｂｏｌｔ）接種のために土壌に移した。
【００２９】
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの増殖）
全てのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を、適切な抗生物質（リファンピシン、
１０μｇ／ｍＬ；カナマイシン、１００μｇ／ｍＬ）を補充したＹＥＰ培地（Ｌ
ｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＤｒａｐｅｒ，１９８６）中で３０℃で増殖させ
た。一晩の細菌培養物を０．９％ ＮａＣｌで洗浄し、そして０．９％ ＮａＣ
ｌ中に、インビトロでの根インキュベーションのためには１ｍＬあたり２×１０ 9 コロニー形成単位で、抽だい接種のためには１ｍＬあたり２×１０11コロニー
形成単位で再懸濁した。
１０μｇ／ｍＬ；カナマイシン、１００μｇ／ｍＬ）を補充したＹＥＰ培地（Ｌ
ｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＤｒａｐｅｒ，１９８６）中で３０℃で増殖させ
た。一晩の細菌培養物を０．９％ ＮａＣｌで洗浄し、そして０．９％ ＮａＣ
ｌ中に、インビトロでの根インキュベーションのためには１ｍＬあたり２×１０ 9 コロニー形成単位で、抽だい接種のためには１ｍＬあたり２×１０11コロニー
形成単位で再懸濁した。
【００３０】
（インビトロでの根の接種および形質転換アッセイ）
寒天表面で生長させた根を切り出し、少量の滅菌水中で小さなセグメントに切
断し（約０．５ｃｍ）、そして滅菌濾紙上で軽く拭って過剰の水を除去した。い
くつかの実験については、切り出した根を、カルス誘導培地（ＣＩＭ；４．３２
ｇ／ＬのＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ［ＭＳ］最少塩［ＧＩＢＣＯ］、
０．５ｇ／Ｌ Ｍｅｓ、ｐＨ５．７、１ｍＬ／Ｌ ビタミンストック溶液［０．
５ｍｇ／ｍＬ ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｍＬ ピリドキシンおよび０．５ｍｇ
／ｍＬ チアミン−ＨＣｌ］、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、２０ｇ／Ｌ
グルコース、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．３ｍｇ
／Ｌ カイネチン、５ｍｇ／Ｌ インドール酢酸および０．７５％バクトアガー
）上で１日間予めインキュベートし、その後、これらの根をセグメントに切断し
た。乾燥させた束の根のセグメントをＭＳ基本培地（４．３２ｇ／ＬのＭＳ最少
塩、０．５ｇ／Ｌ Ｍｅｓ、ｐＨ５．７、１ｍＬ／Ｌ ビタミンストック溶液、
１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、１０ｇ／Ｌ スクロースおよび０．７５％
バクトアガー）に移し、そして２滴または３滴の細菌懸濁物をこれらの上に置い
た。１０分後、大部分の細菌溶液を除去し、そして細菌および根のセグメントを
２５℃で２日間共存培養した。
断し（約０．５ｃｍ）、そして滅菌濾紙上で軽く拭って過剰の水を除去した。い
くつかの実験については、切り出した根を、カルス誘導培地（ＣＩＭ；４．３２
ｇ／ＬのＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ［ＭＳ］最少塩［ＧＩＢＣＯ］、
０．５ｇ／Ｌ Ｍｅｓ、ｐＨ５．７、１ｍＬ／Ｌ ビタミンストック溶液［０．
５ｍｇ／ｍＬ ニコチン酸、０．５ｍｇ／ｍＬ ピリドキシンおよび０．５ｍｇ
／ｍＬ チアミン−ＨＣｌ］、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、２０ｇ／Ｌ
グルコース、０．５ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．３ｍｇ
／Ｌ カイネチン、５ｍｇ／Ｌ インドール酢酸および０．７５％バクトアガー
）上で１日間予めインキュベートし、その後、これらの根をセグメントに切断し
た。乾燥させた束の根のセグメントをＭＳ基本培地（４．３２ｇ／ＬのＭＳ最少
塩、０．５ｇ／Ｌ Ｍｅｓ、ｐＨ５．７、１ｍＬ／Ｌ ビタミンストック溶液、
１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、１０ｇ／Ｌ スクロースおよび０．７５％
バクトアガー）に移し、そして２滴または３滴の細菌懸濁物をこれらの上に置い
た。１０分後、大部分の細菌溶液を除去し、そして細菌および根のセグメントを
２５℃で２日間共存培養した。
【００３１】
一過性の形質転換アッセイのために、バイナリーベクターｐＢＩＳＮ１（Ｎａ
ｒａｓｉｍｈｕｌｕら，１９９６）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３
１０１に感染させた根の束を用いた（ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌｌ，１９８６
）。種々の期間の後、根を水でリンスし、濾紙上で軽く拭い、そしてＸ−ｇｌｕ
ｃ染色溶液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ Ｎａ2・ＥＤＴＡ、３００
ｍＭ マンニトールおよび２ｍＭ Ｘ−ｇｌｕｃ、ｐＨ７．０）で１日間、３７
℃にて染色した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性の定量的測定のために、
根をＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎ
ａ2ＥＤＴＡ、０．１％ サルコシルおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、ｐＨ７．０）を含む微量遠心管中で粉砕し、そしてＧＵＳ比活性を、Ｊｅｆ
ｆｅｒｓｏｎら（１９８７）に従って測定した。
ｒａｓｉｍｈｕｌｕら，１９９６）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３
１０１に感染させた根の束を用いた（ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌｌ，１９８６
）。種々の期間の後、根を水でリンスし、濾紙上で軽く拭い、そしてＸ−ｇｌｕ
ｃ染色溶液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ Ｎａ2・ＥＤＴＡ、３００
ｍＭ マンニトールおよび２ｍＭ Ｘ−ｇｌｕｃ、ｐＨ７．０）で１日間、３７
℃にて染色した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性の定量的測定のために、
根をＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎ
ａ2ＥＤＴＡ、０．１％ サルコシルおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、ｐＨ７．０）を含む微量遠心管中で粉砕し、そしてＧＵＳ比活性を、Ｊｅｆ
ｆｅｒｓｏｎら（１９８７）に従って測定した。
【００３２】
腫瘍形成を定量するために、根の束を、野生型Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株
に感染させた。２日後、根の束を、寒天の表面にこすり付けて、過剰な細菌を除
去し、次いでチメンチン（１００μｇ／ｍＬ）を含む滅菌水で洗浄した。個々の
根のセグメント（最初のアッセイ）または小さな根の束（５〜１０個の根のセグ
メント；改変アッセイ）を、ホルモンを含まないがチメンチン（１００μｇ／ｍ
Ｌ）を含むＭＳ基本培地に移し、そして４週間インキュベートした。
に感染させた。２日後、根の束を、寒天の表面にこすり付けて、過剰な細菌を除
去し、次いでチメンチン（１００μｇ／ｍＬ）を含む滅菌水で洗浄した。個々の
根のセグメント（最初のアッセイ）または小さな根の束（５〜１０個の根のセグ
メント；改変アッセイ）を、ホルモンを含まないがチメンチン（１００μｇ／ｍ
Ｌ）を含むＭＳ基本培地に移し、そして４週間インキュベートした。
【００３３】
カナマイシン耐性への根のセグメントの形質転換のために、根の束を、ｐＢＩ
ＳＮ１を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１で接種した。２日後、
小さな根の束（または個々の根のセグメント）を、チメンチン（１００μｇ／ｍ
Ｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＣＩＭに移した。２５℃での
４週間のインキュベーション後にカナマイシン耐性カルスを数えた。
ＳＮ１を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１で接種した。２日後、
小さな根の束（または個々の根のセグメント）を、チメンチン（１００μｇ／ｍ
Ｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＣＩＭに移した。２５℃での
４週間のインキュベーション後にカナマイシン耐性カルスを数えた。
【００３４】
安定なＧＵＳ発現を決定するために、根を上記の通りに接種し、そして根のセ
グメントを２日後に、選択を何ら伴わずにチメンチン（１００μｇ／ｍＬ）を含
むＣＩＭに移した。４週間後、ＧＵＳ活性を、Ｘ−ｇｌｕｃを用いて染色するこ
とによって、または上記のように４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄガラクトシ
ド（ＭＵＧ）蛍光比色アッセイを用いてＧＵＳ比活性を測定することによっての
いずれかでアッセイした。
グメントを２日後に、選択を何ら伴わずにチメンチン（１００μｇ／ｍＬ）を含
むＣＩＭに移した。４週間後、ＧＵＳ活性を、Ｘ−ｇｌｕｃを用いて染色するこ
とによって、または上記のように４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄガラクトシ
ド（ＭＵＧ）蛍光比色アッセイを用いてＧＵＳ比活性を測定することによっての
いずれかでアッセイした。
【００３５】
ＧＵＳ発現の反応速度を決定するために、根の束を感染させ、根のセグメント
を、２日後に、チメンチン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＣＩＭに移し、そしてカ
ルスを、選択を伴わずにＣＩＭ上で増殖させた。根の束を、上記のようにＭＵＧ
蛍光比色アッセイを用いて種々の時点でアッセイして、ＧＵＳ比活性を測定した
。
を、２日後に、チメンチン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＣＩＭに移し、そしてカ
ルスを、選択を伴わずにＣＩＭ上で増殖させた。根の束を、上記のようにＭＵＧ
蛍光比色アッセイを用いて種々の時点でアッセイして、ＧＵＳ比活性を測定した
。
【００３６】
（バイナリーベクターｐＫＭ４およびｐＫＭ５の構築）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のクローニングした１．７ｋｂｐ連結部のフラグメ
ントを含むプラスミドｐＥ１５０９をＥｃｏＲＩで消化して、連結部のフラグメ
ントを放出させた。５’の突出部の末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントおよびデオキシヌクレオチド三リン酸を用いてフィルインした。Ｔ−
ＤＮＡバイナリーベクター（ｐＥ１０１１）ｐＧＴＶ−ＨＰＴ（Ｂｅｃｋｅｒら
，１９９２）を酵素ＳａｃＩおよびＳｍａＩで消化して、ｐＧＴＶ−ＨＰＴから
プロモーターレスｇｕｓＡ遺伝子を放出した。複製起点およびハイグロマイシン
耐性遺伝子（ｈｐｔ）を含むより大きなフラグメントの３’突出部の配列を、ク
レノウＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて除去し
、そして得られた１．７ｋｂｐの平滑末端フラグメントをバイナリーベクターの
平滑末端に連結した。正しい方向で１．７ｋｂｐのフラグメントを含むバイナリ
ーベクタープラスミド（ヒストンＨ２Ａ遺伝子の下流のｐＡｎｏｓ）を選択し、
そしてｐＫＭ４（株Ｅ１５４７）と名付けた。
ントを含むプラスミドｐＥ１５０９をＥｃｏＲＩで消化して、連結部のフラグメ
ントを放出させた。５’の突出部の末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントおよびデオキシヌクレオチド三リン酸を用いてフィルインした。Ｔ−
ＤＮＡバイナリーベクター（ｐＥ１０１１）ｐＧＴＶ−ＨＰＴ（Ｂｅｃｋｅｒら
，１９９２）を酵素ＳａｃＩおよびＳｍａＩで消化して、ｐＧＴＶ−ＨＰＴから
プロモーターレスｇｕｓＡ遺伝子を放出した。複製起点およびハイグロマイシン
耐性遺伝子（ｈｐｔ）を含むより大きなフラグメントの３’突出部の配列を、ク
レノウＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を用いて除去し
、そして得られた１．７ｋｂｐの平滑末端フラグメントをバイナリーベクターの
平滑末端に連結した。正しい方向で１．７ｋｂｐのフラグメントを含むバイナリ
ーベクタープラスミド（ヒストンＨ２Ａ遺伝子の下流のｐＡｎｏｓ）を選択し、
そしてｐＫＭ４（株Ｅ１５４７）と名付けた。
【００３７】
λゲノムクローン由来のヒストンＨ２Ａ遺伝子（ＲＡＴ５）を含む約９．０ｋ
ｂｐの野生型ゲノムＳａｃＩフラグメントを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔのＳａｃＩ部位にクローニングした。続いて、この９．０ｋｂｐのＳａｃＩフ
ラグメントを、ＳａｃＩでの消化によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから放出し、
そしてバイナリーベクターｐＧＴＶ−ＨＰＴのＳａｃＩ部位にクローニングして
、プラスミドｐＫＭ５（株Ｅ１５９６）を得た。ｐＫＭ４およびｐＫＭ５の両方
を、三親交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）（Ｄｉｔｔａら，１９
８０）によって非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１中に別
々に移して、それぞれ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ａｕ１０１２および株Ａ
ｔ１０６２を得た。
ｂｐの野生型ゲノムＳａｃＩフラグメントを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔのＳａｃＩ部位にクローニングした。続いて、この９．０ｋｂｐのＳａｃＩフ
ラグメントを、ＳａｃＩでの消化によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから放出し、
そしてバイナリーベクターｐＧＴＶ−ＨＰＴのＳａｃＩ部位にクローニングして
、プラスミドｐＫＭ５（株Ｅ１５９６）を得た。ｐＫＭ４およびｐＫＭ５の両方
を、三親交配（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）（Ｄｉｔｔａら，１９
８０）によって非腫瘍形成性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１中に別
々に移して、それぞれ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ａｕ１０１２および株Ａ
ｔ１０６２を得た。
【００３８】
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの生殖系列の形質転換）
生殖系列形質転換を、（ＢｅｎｔおよびＣｌｏｕｇｈ，１９９８）中に記載し
た通りに行った。トランスジェニック植物を、ハイグロマイシン（２０μｇ／ｍ
ｌ）を含むＢ５培地上で選択した。
た通りに行った。トランスジェニック植物を、ハイグロマイシン（２０μｇ／ｍ
ｌ）を含むＢ５培地上で選択した。
【００３９】
（引用文献）
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表１】
【図１Ａ】
図１は、ｒａｔ５変異体の特徴付けを示す：（Ａ）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換；（Ｂ）ｒａ
ｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列；（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込みの
パターン：ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー
；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐＢ
Ｒ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換；（Ｂ）ｒａ
ｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列；（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込みの
パターン：ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー
；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐＢ
Ｒ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。
【図１Ｂ】
図１は、ｒａｔ５変異体の特徴付けを示す：（Ａ）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換；（Ｂ）ｒａ
ｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列；（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込みの
パターン：ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー
；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐＢ
Ｒ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換；（Ｂ）ｒａ
ｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列；（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込みの
パターン：ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー
；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐＢ
Ｒ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。
【図１Ｃ】
図１は、ｒａｔ５変異体の特徴付けを示す：（Ａ）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換；（Ｂ）ｒａ
ｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列；（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込みの
パターン：ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー
；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐＢ
Ｒ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。
ｉｓ生態型Ｗｓ、ｒａｔ５変異体およびＦ１後代の安定な形質転換；（Ｂ）ｒａ
ｔ５／Ｔ−ＤＮＡ連結領域の配列；（Ｃ）ｒａｔ５におけるＴ−ＤＮＡ組込みの
パターン：ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー；ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー
；ｐＢＲ３２２、β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含むｐＢ
Ｒ３２２配列；Ｔｎ９０３、Ｅ．ｃｏｌｉ選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
；Ｔｎ５、植物選択のためのカナマイシン耐性遺伝子。
【図２Ａ】
図２は、ｒａｔ５変異体の補完および野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物にお
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
【図２Ｂ】
図２は、ｒａｔ５変異体の補完および野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物にお
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
【図２Ｃ】
図２は、ｒａｔ５変異体の補完および野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物にお
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
【図２Ｄ】
図２は、ｒａｔ５変異体の補完および野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物にお
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
けるＲＡＴ５の過剰発現を示す；バイナリーベクターｐＫＭ４（Ａ）およびｐＫ
Ｍ５（Ｂ）のマップ。ＲＢ、Ｔ−ＤＮＡライトボーダー；ＬＢ、Ｔ−ＤＮＡレフ
トボーダー；ｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル配列；ヒ
ストンＨ２Ａ、ＲＡＴ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のコード配列；ｐＨ２Ａ、ＲＡ
Ｔ５のヒストンＨ２Ａ遺伝子のプロモーター配列；Ｐｎｏｓ、ノパリンシンター
ゼプロモーター；ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子；ｐＡｇ７、アグロピン
シンターゼポリアデニル化シグナル配列；ｕｉｄＡ，プロモーターレスｇｕｓＡ
遺伝子；ヒストンＨ２Ａ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子およびｈｐｔ遺伝子の上の矢印
は、転写方向を示す；（Ｃ）ｒａｔ５変異体の補完；（Ｄ）ＲＡＴ５のヒストン
Ｈ２Ａ遺伝子を過剰発現するＷｓトランスジェニック植物の腫瘍形成アッセイ。
【図３Ａ】
図３は、ｒａｔ５植物およびＷｓ植物のＴ−ＤＮＡ組込みアッセイを示す；（
Ａ）Ｗｓおよびｒａｔ５における一過性および安定なＧＵＳ発現；（Ｂ）ｒａｔ
５植物およびＷｓ植物におけるＴ−ＤＮＡ組込み。
Ａ）Ｗｓおよびｒａｔ５における一過性および安定なＧＵＳ発現；（Ｂ）ｒａｔ
５植物およびＷｓ植物におけるＴ−ＤＮＡ組込み。
【図３Ｂ】
図３は、ｒａｔ５植物およびＷｓ植物のＴ−ＤＮＡ組込みアッセイを示す；（
Ａ）Ｗｓおよびｒａｔ５における一過性および安定なＧＵＳ発現；（Ｂ）ｒａｔ
５植物およびＷｓ植物におけるＴ−ＤＮＡ組込み。
Ａ）Ｗｓおよびｒａｔ５における一過性および安定なＧＵＳ発現；（Ｂ）ｒａｔ
５植物およびＷｓ植物におけるＴ−ＤＮＡ組込み。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ゲルヴィン， スタントン ビー．
アメリカ合衆国 インディアナ 47906，
ウエスト ラファイエット， ムーアー
ズ ベイ ロード 5251
(72)発明者 マイソール， キランクマー エス．
インド国 カーナタカ， マイソール，
ゴクラム ３アールディー ステージ，
４ティーエイチ クロス ナンバー774
／Ｂ
Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17
CA19 CD03 CD07 CD09 CD10
CD13 CD17
4B024 AA08 AA20 CA02 DA01 EA04
4B065 AB01 BA01 CA23 CA53
【要約の続き】
Claims (11)
- 【請求項１】 宿主植物における形質転換頻度を増大させる方法であって、
該方法は、以下： ａ．少なくとも１コピーの植物ヒストン遺伝子を、該宿主植物に付加する工程
、および ｂ．該植物ヒストン遺伝子のコピーを発現させて、形質転換頻度を増大させる
工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記ヒストン遺伝子が、Ｈ２Ａ遺伝子である、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 少なくとも１コピーのさらなるヒストン遺伝子を含む、トラ
ンスジェニック植物。 - 【請求項４】 前記ヒストン遺伝子が、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＲＡＴ５
遺伝子である、請求項３に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項５】 外来植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡ組込みを妨害する、ＲＡＴ５
遺伝子変異体。 - 【請求項６】 ｒａｔ５と称される、請求項５に記載の変異体。
- 【請求項７】 遺伝子構築物であって、発現された場合に宿主植物における
形質転換頻度を増大させ得る少なくとも１コピーのヒストン遺伝子を含む、遺伝
子構築物。 - 【請求項８】 前記ヒストン遺伝子が、Ｈ２Ａである、請求項７に記載の遺
伝子構築物。 - 【請求項９】 前記ヒストン遺伝子が、ＲＡＴ５ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
遺伝子である、請求項８に記載の遺伝子構築物。 - 【請求項１０】 Ｔ−ＤＮＡ組込みに関与する少なくとも１コピーの遺伝子
によって形質転換された宿主細胞であって、該遺伝子が、ヒストンの過剰発現を
もたらして、植物形質転換頻度を向上させ得る、宿主細胞。 - 【請求項１１】 前記遺伝子が、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＲＡＴ５遺伝子
である、請求項１０に記載の宿主細胞。
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