JP2003508354A - チアミントリホスフェートを用いての真核細胞での燐酸化を行う方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 チアミントリホスフェートを含有する組成物、およびチアミントリホスフェート（ＴＰＰ）を原核細胞または真核細胞と接触させ、それにより、ＴＴＰからのホスフェート基を細胞のホスフェートアクセプタ基に移動させることを伴う燐酸化欠乏病態ならびに燐酸化方法におけるその適用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 この発明は、燐酸化不足（under-phosphorylated）である真核細胞を処理する
に適する組成物、ならびにチアミントリホスフェート（ＴＴＰ）を用いての真核
細胞での燐酸化を行う方法に関する。

【０００２】 神経筋接合部（ＮＭＪ）は、神経シグナルを運動神経から筋細胞または単純化
された筋細胞としてみることができるエレクトロサイトへの伝達に特殊化された
複雑な構造である。４３Ｋラプシン（rapsyn）（１,２参照）は、デンキナマズ(
Torpedo)の電気器官のシナプス後膜の内面（５,６）およびげっ歯動物のＮＭＪ
（７）で、ｎＡＣｈＲｓと同一に拡がって分布された膜関連周辺蛋白である（３
,４）。それは、機能性運動終板のｎＡＣｈＲのクラスター化と形成に必要であ
る。４３Ｋラプシン遺伝子の欠損した変異マウスは出産後死亡し、ｎＡＣｈＲの
欠損を示し、かつ機能不全のシナプス後膜を有する（８）。４３Ｋラプシンをイ
ンビトロで除去するとｎＡＣｈＲｓは膜面内でより移動性になり、酵素分解と熱
変性により感受性となり（１,２参照）かつ抗ｎＡＣｈＲ抗体により接触性にな
る（９）。 燐酸化は細胞シグナル化に重要である（１０〜１４参照）。４３Ｋラプシンは
いくつか推定上の燐酸化部位を含有し（１５）、インビボではセリン残基で部分
的に燐酸化され、インビトロでは内因性蛋白キナーゼＡ（ＰＫＡ）で燐酸化され
る（１６）。しかし、この燐酸化は４３Ｋラプシンに特異的でなく、シナプス後
膜の他の蛋白でも起こりうる（１６）。細胞シグナル化での燐酸化（１０〜１４
参照）およびシナプス後部の分化での４３Ｋラプシン（１、２、１７参照）の本
質的な役割からみて、このシナプス蛋白の特異的燐酸化を行う手段が望まれるで
あろう。

【０００３】 チアミンは細胞生命に必須であり、中枢神経系とシナプス伝達での役割を奏す
ることができる（１８〜２０）。チアミン経路には、チアミンとそのモノホスフ
ェート（ＴＭＰ）、ジホスフェート（ＴＤＰ）およびトリホスフェート（ＴＴＰ
）誘導体が含まれる。ＴＴＰ、チアミンの非補助因子は、恐らく燐酸化を介して
マキシ−クロリドチャンネルの透過性を活性化する（２１）。低濃度のＴＴＰは
、神経細胞（２３）と興奮細胞（２４〜２６）を除く殆どの細胞に見出されてい
る（２２）。しかし、現在のところ、ＴＴＰが４３Ｋラプシンの特異的燐酸化を
行うかどうかは不明である。 従って、〔γ³²Ｐ〕標識化チアミントリホスフェート（〔γ³²Ｐ〕−ＴＴＰ）
が、デンキナマズの電気器官から精製したシナプス後膜が豊富なアセチルコリン
リセプター（ｎＡＣｈＲ）中に存在する蛋白のホスフェートのドナーとして機能
することが、ここに意外にも発見された。単純化された筋細胞と考えられるエレ
クトロサイトが、神経筋接合部（ＮＭＪ）のモデル系として使用された。このよ
うな精製ＡＣｈＲの豊富なシナプス後膜とインキュベートすると、燐ドナーとし
て使用した〔γ−³²Ｐ〕−ＡＴＰ（アデノシントリホスフェート）が多くの蛋白
の燐酸化をもたらす。反対に、〔γ−³²Ｐ〕−ＴＴＰは、シナプス後膜に存在し
、ＡＣｈＲのクラスター化と凝集ならびにＮＭＪでの機能性終板の形成に必須な
シナプス細胞骨格蛋白の４３Ｋラプシンの特異的燐酸化をもたらす。かくして、
この発明は、ＴＴＰを燐ドナーとして最初に利用し、標的蛋白に対するＴＴＰ依
存燐酸化の強い特異性を提供するものである。

【０００４】 この燐酸化は、主としてヒスチジン残基で生じ、新しい内因性蛋白キナーゼ（
類）で触媒化される。ヒスチジン残基での燐酸化は、原核細胞と単純な真核細胞
で主として観察されている。これらは、通常、ヒスチジン蛋白キナーゼを介して
細胞機能の制御に関与している。しかし、これらは、より高度な真核細胞でも起
こり、生育と転移制御で主要な役割を果たす酵素ヌクレオシドジホスフェートキ
ナーゼ（ＮＤＰＫ）の存在から、ヒスチジンでの燐酸化の重要性が推定される。
ヒスチジン残基での燐酸化についてのほんの少数の事例が、より高度な真核細胞
で報告されており、これは、おそらく燐ドナーとしてのＡＴＰの大量使用と、Ｎ
−燐酸化よりＯ−燐酸化により適する分析法が入手できることによる（ホスホヒ
スチジンはＮ−燐酸化残基である）結果である。このことは、Ｎ−燐酸化アミド
結合により適合した技術を明確にし、かつ多分シナプスおよび／または真核性蛋
白に重要な燐酸化経路を明確にしうる新しい燐酸化反応の研究が必要なことを示
すものである。

【０００５】 この発明によれば、燐ドナーとしてのＴＴＰの使用は、ＴＴＰ依存性燐酸化
の効果を分析するため、明らかに他の細胞系蛋白にも拡張される。特に、ＴＴＰ
の使用を神経、免疫および内分泌系へ拡張することが明らかに企てられる。ラッ
トまたはマウスの粗脳膜製剤中の蛋白に対しＴＴＰを燐ドナーとして用いて、発
明者は、ある蛋白が製剤中に存在する内因性キナーゼで燐酸化されることを認め
た。脳膜および細胞骨格蛋白についてＴＴＰ−依存性燐酸化の分析を研究した。
また、発明者は、鳥および哺乳動物類、特にラット、マウス、サルとヒトからの
筋および脊髄蛋白への分析にこの分析を拡大した。発明者は、免疫および内分泌
系にもこの分析を拡大した。従って、この発明は広い応用性を有している。 ＴＴＰの燐ドナーとしての使用は、燐酸化の分野での新しい領域を開き、生理
学的細胞過程でのＴＴＰ依存燐酸化の役割をより理解させることになろう。今こ
こで事例にみられるように、これらの燐酸化が細胞機能に重要であるとすると、
その評価は、ＴＴＰ依存燐酸化に関与する分子の機能障害に由来する疾患をより
理解させ、かつ治療に最も重要である。

【０００６】 公知の方法論を用いて蛋白のＴＴＰ−依存燐酸化に関与するヒスチジンキナー
ゼを精製、配列決定かつクローニングすることにより、公知の方法論のキナーゼ
ファミリーを用いるかまたは公知のキナーゼファミリーのメンバーとして新しい
蛋白を分類することができるであろう。これにより、細胞過程、特に神経と筋細
胞の制御における新しいキナーゼの役割が洞察されるであろう。 この発明は、ＴＴＰ依存燐酸化の欠乏または細胞の重要な機能の制御に本質的
な蛋白のＴＴＰ依存過剰燐酸化に関連する疾患のさらなる治療上の分析を可能と
する。 加えて、チアミンは神経系の認識機能障害に関与することが知られている（米
国特許第５,８８５,６０８号及び同５,８４３,４６９号）が、得られた結果はチ
アミントリホスフェートの使用に関連していなかった。 しかし、この発明は、放射性標識したＴＴＰの存在下で、デンキナマズの４３
Ｋラプシンが、ｎＡＣｈＲリッチのシナプス後膜製剤中に存在する内因性キナー
ゼ（類）で燐酸化された有力な蛋白であることを例証するものである。

【０００７】 燐酸化は、ヒスチジン（類）と多少のセリン（類）で殆ど起こる。４３Ｋラプ
シンのＴＴＰおよびＡＴＰ依存燐酸化は、いずれもＴＴＰとＡＴＰで阻害される
。従ってＴＴＰ依存キナーゼ（類）は、幾つかの燐酸化部位をＰＫＡと共有する
であろう。４３Ｋラプシン燐酸化を内因性Ｚｎ²⁺により制御できそうなこと、お
よび４３Ｋラプシン機能の燐酸化を介したモジュレーションを以下に述べる。燐
酸化のげっ歯動物脳膜への拡大は、シナプス蛋白のホスフェートドナーとしての
ＴＴＰのより一般的な使用ならびに新しい燐酸化経路を示唆するものである。こ
の発明は、この広いかつ一般的発見に基づいている。 従って、この発明は、一部で、真核細胞の燐酸化レベルを増すのにチアミント
リホスフェートの有効量を含有する、燐酸化不足である真核細胞を処理するのに
適した組成物を提供する。この組成物は、慣習上、細胞処理組成物に添加される
他の成分、例えば緩衝液、電解質、細胞栄養源、抗酸化剤などを含有してもよく
、かつインビボ投与、例えば筋肉内または静脈内投与に適した何れの形態であっ
てもよい。

【０００８】 この発明は、また、シナプス後蛋白の燐酸化不足に関連した病状を有するか、
機能性運動終板の形成を欠く患者を処置しうる組成物の製造へのチアミントリホ
スフェートの使用に関する。 好ましい具体例で、チアミントリホスフェートは、チアミントリホスフェート
と医薬的に受容な担体もしくは希釈剤を含有する医薬的に受容な組成物の形態で
投与される。 この発明の他の観点は、燐酸化ヒスチジン残基の欠乏している細胞膜または細
胞の細胞骨格を処置しうる組成物の製造へのチアミントリホスフェートの使用を
含む。 例えば、細胞膜を、細胞の細胞膜または細胞骨格に含まれた蛋白、例えばラプ
シンの燐酸化ヒスチジン残基の量を増加するのに有効な量のチアミントリホスフ
ェートと接触させる。 そのため、チアミントリホスフェートは神経または筋機能の改善のため細胞を
処置するのに有効であろう。

【０００９】 この発明は、また、ラプシンを燐酸化するためにラプシンをチアミントリホス
フェートと接触することからなるラプシンのインビトロでの燐酸化方法を含む。 この方法は、チアミントリホスフェートの有効量を被検者、例えば患者に投与
することによりインビボで行うこともできる。被検者は、ヒトまたは動物であっ
てもよい。ヒトの被検者もしくは患者が特に好ましい。事実、この発明の方法の
全てに、被検者または患者はヒトまたは動物であってもよく、ヒトの被検者また
は患者が特に好ましい。 従って、この発明は、ラプシンを燐酸化しうる組成物の製造へのチアミントリ
ホスフェートの使用を含むものである。

【００１０】 また、この発明は、 ａ）放射性標識したチアミントリホスフェート、 ｂ）非放射性標識したチアミントリホスフェート、 ｃ）チアミントリホスフェートの移行用試薬、 ｄ）ＴＴＰ依存燐酸化性ヒスチジン残基を含有する精製蛋白、 ｅ）非ＴＴＰ従属燐酸化性ヒスチジン残基を含有する蛋白、および ｆ）任意の抗ホスホアミノ酸抗体 からなる、蛋白中のヒスチジン残基の特異的燐酸化を検出するキットを含む。 キット中、（ｄ）はポジのコントロールとして使用し、（ｅ）はネガのコント
ロールとして使用する。 この発明の他の観点は、 （ａ）患者から得た真核細胞サンプルから膜を精製し、 （ｂ）その膜をチアミントリホスフェートとインキュベートし、 （ｃ）外因性ホスフェートの導入をコントロールと比較し、かつ （ｄ）サンプル中の蛋白の燐酸化ヒスチジン残基の存在または非存在を測定す
る ことからなる真核細胞膜の燐酸化レベルを定量する方法である。

【００１１】 このような方法は、例えば異なる症状の評価に使用できる。 また、この発明には、原核細胞または真核細胞とチアミントリホスフェートを
接触させ、チアミントリホスフェートからのホスフェート基を、前記細胞のホス
フェートアクセプタ基に移行させることが含まれる。 好ましい具体例では、細胞のホスフェートアクセプタ基は、細胞蛋白のヒスチ
ジン残基である。 かくして、チアミントリホスフェートを含有する組成物は、 − ヒトの細胞または細胞膜の燐酸化不足に関連した疾患または症状、 − シナプス後蛋白の燐酸化不足に関連した疾患または症状、 − 機能性運動終板の形成の欠乏に関連した疾患または症状、 − 神経疾患または症状、 − 筋疾患又は症状、 − アレルギー関連の予防疾患または症状 を処置しうる。

【００１２】 この発明は、新しいタイプのキナーゼの精製法とＴＴＰ依存キナーゼ活性を担
持するその精製蛋白抽出物も含む。 ＴＴＰ依存キナーゼ活性を担持する蛋白抽出物の精製法は、 ａ）抽出物を真核生物組織から得、 ｂ）膜からサイトゾルを分別し、かつ ｃ）キナーゼ活性を奏する抽出物の１以上の成分を同定する ことからなる。 より詳しくは、精製法は、次の工程を含む： − プロテアーゼ阻害剤（例えばアンチパイン(登録商標)、アプロチニン(登
録商標)、ロイペプチン(登録商標)、ペプスタチンＡ(登録商標)、ＥＤＴＡ、Ｅ
ＧＴＡ）のカクテルを含有する緩衝液中の真核生物組織の均質化による抽出、 − 上澄液中の細胞抽出物を集めるための、低速で（Beckman JA 10ロータ；5
Krpm、10分）４℃での遠心分離、 − 膜区分としてペレットを採集するため細胞抽出物の遠心分離（Beckman JA
14ロータ；12.5Krpm、50分、４℃）、 − 膜ペレットは均質化バッファーに再懸濁し、ショ糖を添加して３５％ショ
糖（ｗ／ｗ）に調整する、 − 膜懸濁液の不連続ショ糖密度勾配（３５％〜４３％ショ糖）で高速超遠心
分離（Backman 45 Tiロータ；40Krpm、3時間、４℃）、 − 精製膜を３５％／４３％ショ糖界面で回収し、４０Ｋｒｐｍでの遠心分離
で採取する、 − 任意に、膜区分をさらに連続（３５％〜４３％）ショ糖密度勾配（で精製
するBackman SW 27ロータ；18Krpm、12時間、４℃）、 − 採取したバンドは新しいＴＴＰ依存蛋白キナーゼ活性を含有する。

【００１３】 精製蛋白抽出物は、５μｍＴＴＰと２５μｍＴＴＰからなるＫ_Dを有する。精
製蛋白抽出物のキナーゼ活性は、ｐＨ７.５周辺が好ましい。 この発明は、次の工程： ａ）アレルギー性分子と、チアミントリホスフェートからなる組成物を、チア
ミントリホスフェートでその分子の燐酸化をさせるのに受容な条件下で接触させ
、 ｂ）任意に、燐酸化されたアレルギー性分子を精製し、かつ ｃ）燐酸化分子のアレルギー性を同じ非燐酸化分子と平行して試験する ことからなる分子のアレルギー性の評価方法をも含むものである。 アレルギー性質は、通常の既知のアレルギー試験でテストされる。 アレルギー分子中、ダクリス・グロメラタ（Dacrylis glomerata）花粉のよう
なアレルギー性植物に存在する蛋白が挙げられる。

【００１４】 この発明をより詳細にかつ下記の図を参照して記載する。 図１：ｎＡＣｈＲリッチのシナプス後膜に存在する内因性キナーゼ(類)による
ホスフェートドナーとしてＴＴＰを用いる４３ｋＤａ蛋白の燐酸化。１Ａ：各種
のエフェクター存在下で８μＭ〔γ³²Ｐ〕−ＴＴＰを用いて燐酸化したエレクト
ロサイトのシナプス後膜のＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラムによれば、〜４
３ｋＤａ（矢印）に１つの主要な放射性バンドが示される。燐酸化は、用量−依
存で冷ＴＴＰ〔２４μＭ（レーン８／コントロールレーン４,９）および２４０
μＭ（レーン７／コントロールレーン４、９およびレーン５／コントロールレー
ン３，６）〕で阻害される。分子量マーカー：かなり右。１Ｂ：図１Ａのシスタ
ーゲルをブロットし、２つの部分に分離した。レーン１〜３は¹²⁵Ｉ−Ｂｇｔｘ
を、レーン４〜９は緩衝液とインキュベートした。両部分を再アラインし、オー
トラジオグラフィーした。レーン２では、燐酸化が防止され、¹²⁵Ｉ−Ｂｇｔｘ
で観察した放射性バンドはα−ｎＡＣｈＲである（矢印ヘッド）。レーン４〜９
では、放射性バンドは４３ｋＤａの³²Ｐ標識化蛋白である（矢印）。レーン３で
は、³²Ｐ−膜をさらに¹²⁵Ｉ−Ｂｇｔｘとインキュベートし、２つの放射性バン
ドを認めた。これから、ＴＴＰ依存燐酸化４３ｋＤａ蛋白はα−ｎＡＣｈＲでな
いことが示された。ＩＣ：図１Ａのオートラジオグラムのクマシーブルー。

【００１５】 図２：ＴＴＰ依存³²Ｐ−燐酸化４３ｋＤａ蛋白は、４３Ｋラプシンである。２
Ａ：³²Ｐ−ＴＴＰの存在下で燐酸化したシナプス後膜を可溶化し、３つの特異性
抗４３Ｋラプシン抗ペプチド抗体で免疫沈殿した（レーン１〜３）。プレ免疫血
清で放射性は沈殿しなかった（レーン４）。２Ｂ：抗４３Ｋラプシンの用量を増
加させる免疫沈降は、免疫沈殿した放射性は使用した抗体量に比例することを示
している（レーン３〜５）。免疫沈降の特異性は、プレ免疫血清と予吸収した抗
４３Ｋラプシン抗体で例証される（レーン１、２）。２Ｃ：免疫沈降の上澄液に
残存する³²Ｐ放射性は加えた抗体量に比例して減少し、全部ではないが殆どの放
射性ホスフェートが４３Ｋラプシン上であることを示す。

【００１６】 図３：４３Ｋラプシンの燐酸化を触媒する内因性ＴＴＰ依存キナーゼの特性。
３Ａ：ＴＴＰ、ＡＴＰおよびＧＴＰトリホスフェートによる４３ＫラプシンのＴ
ＴＰ依存燐酸化の阻害。３Ｂ：ＴＴＰキナーゼ活性はわずかなアルカリｐＨで最
適である。３Ｃ：４３Ｋ-ラプシン燐酸化は用量依存性で飽和できる（Ｋ_D−５〜
１０μＭＴＴＰ）。３Ｄ：４３ＫラプシンのＴＴＰ依存燐酸化の動態。 図４：４３Ｋラプシンを特異的に燐酸化するＴＴＰ依存キナーゼは、ＡＴＰ依
存キナーゼと異なる。³²Ｐ−ＴＴＰまたは³²Ｐ−ＡＴＰで燐酸化したシナプス後
膜のオートラジオグラフは、³²Ｐ−ＴＴＰで４３Ｋラプシン（矢印）のみが燐酸
化され（レーン１〜２）、一方³²Ｐ−ＡＴＰ（レーン３〜６）では、ｎＡＣｈＲ
サブユニットと４３Ｋラプシンを含む多くの蛋白が燐酸化されることを示してい
る。これは、燐ドナーの性質により異なるキナーゼが関与することを示唆してい
る。

【００１７】 図５：抗ホスホアミノ酸抗体での分析。類似の量のコントロール（Ｍｂ）と³² Ｐ−ＴＴＰ依存標識化（³²Ｐ−Ｍｂ）シナプス後膜をエレクトロブロットした。
４３Ｋラプシン（矢印）とα−ｎＡＣｈＲ（矢印頭部）を同定のためマークした
（ドット）。ブロットを業者提案の希釈で抗体を用いてプローブした：抗ホスホ
チロシン（ＰＹ１：２０００）、抗ホスホスレオニン（ＰＴ１：５０）および抗
ホスホセリン（ＰＳ１：５００）。５Ａ：抗ＰＹは、双方の膜中の４３Ｋラプシ
ンではなく、各種の蛋白を染色した（レーン１、５）。抗ＰＴは、４３Ｋラプシ
ンではなく幾つかの蛋白バンドをかなり染色した（レーン２、６）。抗ＰＳは、
両膜の４３Ｋラプシンを僅かに染色した（レーン３、７）。³²Ｐ−４３Ｋラプシ
ンのより高いシグナルに注目のこと（レーン７）。これは、４３Ｋラプシンの原
位置燐酸化セリンと³²Ｐ燐酸化セリンの存在がＴＴＰ依存キナーゼ(類)で生じた
ことを示唆している。レーン４、８に正常血清。５Ｂ：コントロール（レーン９
）と³²Ｐ−標識化膜（³²Ｐ−Ｍｂ、レーン１０）のポンソーレッド染色が、³²Ｐ
−Ｍｂでごく少ない蛋白を示している。５Ｃ：抗ＰＳ抗体での³²Ｐ標識化膜の免
疫染色を繰り返し、抗ＰＳ抗体による³²Ｐ−４３Ｋラプシン染色を確認した（レ
ーン１１、２２）。レーン１３はコントロール。

【００１８】 図６：燐酸化４３Ｋラプシンのホスホアミノ酸分析。³²Ｐ−ＡＴＰまたは³²Ｐ
−ＴＴＰにより燐酸化した４３Ｋラプシンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分別し、ＰＶ
ＤＦでブロットし、５．７Ｎ ＨＣｌ（１時間１０５℃）で加水分解し、薄層セ
ルロース上、ｐＨ３．５溶剤で１Ｄ高電圧電気泳動によりホスホアミノ酸を分析
した。非放射性Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−ＴｈｒとＰ−Ｔｙｒ（レーン２）を基準として
用いた。ＡＴＰ−依存³²Ｐ−４３Ｋラプシン加水分解物（レーン１）は、ホスホ
ペプチド領域とＰ−Ｓｅｒレベルでニンヒドリンで染色された幾つかの重要な放
射性スポットを示す（点線）。これは、（１６）で報告されたセリン燐酸化と一
致している。ＴＴＰ依存³²Ｐ−４３Ｋラプシン加水分解物は、類似のニンヒドリ
ン染色パターン（レーン３、点線）となるが、ホスホペプチド領域で放射性が殆
どなく、Ｐ−Ｓｅｒレベルでかなり放射性が弱く、無機ホスフェート（Ｐｉ）領
域での放射性が大部分の、全く異なる放射性パターン（レーン３）となる。これ
らの結果は、ＡＴＰとＴＴＰが４３Ｋラプシンで異なった燐酸化を駆動すること
を示している。

【００１９】 図７：ＴＴＰ−³²Ｐ−４３ＫラプシンのＴＬＣ分析。ＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラ
プシンとＡＴＰ−³²Ｐ−ＮＤＰＫのアルカリ加水分解物（３Ｎ ＫＯＨ、1時間
、１０５℃）と、ＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシンのトリプシン／プロナーゼ消化
物を溶媒Ａ中でＴＬＣで分離し、ニンヒドリン染色し（点線）、オートラジオグ
ラフィーした。外部基準は、Ｐ−Ｓｅｒ（レーン１）とＰ−Ｈｉｓ（レーン５）
であった。７Ａ：トリプシン／プロナーゼ消化（レーン２）、ＴＴＰ−³²Ｐ−ラ
プシンのアルカリ加水分解物（レーン３）と³²Ｐ−ＮＤＰＫのアルカリ加水分解
物（レーン４）の全部が、Ｐ−Ｈｉｓレベルで放射性を示している。７Ｂ：ＴＴ
Ｐ−³²Ｐ−４３Ｋラプシンのアルカリ加水分解物（レーン２、３）またはＮＤＰ
Ｋのアルカリ加水分解物（レーン４）に添加したＰ−Ｈｉｓ（点線の円）は、放
射性スポットで同時移動(comigrate)する。これは４３Ｋラプシン中ＴＴＰによ
りなされたヒスチジン燐酸化を強く示唆している。

【００２０】 図８：ＴＴＰは、脳膜蛋白の燐ドナーである。³²Ｐ−ＡＴＰ（図８Ａ）と³²Ｐ
−ＴＴＰ（図８Ｂ）でインキュベートしたげっ歯動物の粗脳膜抽出物をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィーした（分子量マーカー：かなり左）
。デンキナマズのシナプス後膜をコントロールとして用いた。８Ａ：デンキナマ
ズのＡＴＰ−³²Ｐ膜（レーン１）。ＡＴＰは脳膜抽出物中の多くの蛋白を燐酸化
し（レーン２）、燐酸化は冷ＡＴＰで阻止される（レーン３）。８Ｂ：³²Ｐ−Ｔ
ＴＰとインキュベートした脳膜は、４６ｋＤａ付近で２つの重要な³²Ｐ−バンド
を有するかなり単純な放射性パターンを示す（レーン２）。燐酸化は、冷ＴＴＰ
で部分的に阻止される（レーン３）。レーン１：コントロールのデンキナマズＴ
ＴＰ−³²Ｐ膜を、弱い脳膜シグナルに合うように、低濃度の³²Ｐ−ＴＴＰの低濃
度とインキュベートした。

【００２１】 図９は、異なる組織からの膜についてのＴＴＰ依存燐酸化の後で得たオートラ
ジオグラムを示す。３０ｋＤａの領域は検査されていない。分子マーカは、最左
レーンに示した。 ヒト赤血球（ＨＲＢ）膜由来蛋白（ＴＭ）の燐酸化は、主に３０〜４０ｋＤａ
、７０ｋＤａおよび２００ｋＤａ付近のバンドで起こる。ＨＲＢ溶解物（Ｔｓ）
は、１つは６６ｋＤａ付近、２つの高度に燐酸化したバンドは７０と２００ｋＤ
ａ領域の少なくとも３つの燐酸化バンドを示す。フラクションＰｍ（寄生虫＋赤
血球膜）とＴｍ（ヒト血球膜）との燐酸化の比較は、Ｐｍフラクションのみで検
出される燐酸化蛋白バンド（レーンＰｍ、例えば、５０、５５〜６０、１００、
１００〜２０１ｋＤａ付近のバンド、図９Ａと９Ｂ）は、ピー・ファルシパルム
(P.falciparum)寄生体から由来していることを示す。溶解物ＰｓとＴｓの燐酸化
パターンは、明白なアンサーをさす２つの弱いものである（図９Ｂで、ＰｍとＴ
ｍの蛋白量は、図９Ａの同じフラクションに比較して倍にしている）。

【００２２】 成体のマウス脳膜（Ａ）は、主として４６〜５０と１００ｋＤａ領域に燐酸化
蛋白を示す。燐酸化は、１５日胚体マウス脳膜でも観察できる（Ｅ１５、図９Ａ
と９Ｂ）。ＡｄとＥ１５の２つの燐酸化パターンは同じではなく、脳フラクショ
ンの加令差によるとみられる。 マウス幹細胞神経球（ＳａとＳｆ）は、５０〜６０ｋＤａの領域に燐酸化を示
した（図９Ａ）。 マウスの上頸神経筋膜（Ｃ ＳＣＧ）は４０〜６０ｋＤａの領域間に燐酸化を
示し、上澄液（Ｓ ＳＣＧ）もＴＴＰで燐酸化された（３０〜９７ｋＤａの燐酸
化バンド）。 図９Ｂでは、ナツメヤシ（Dactyle）花粉膜蛋白は、主に３０と５５〜６０ｋ
Ｄａ領域で燐酸化される（花粉）。花粉溶解液フラクシン（Ｓ花粉）での主な燐
酸化バンドは、５５〜６０ｋＤａに観察された（Ｆｉｇ１０参照） コントロールの燐酸化は、エレクトロサイト膜（co mb）で行った。

【００２３】 図１０は、ナツメヤシ花粉蛋白の³²Ｐ−ＴＴＰでの燐酸化後に得たオートラジ
オグラムを示す。３０〜６６ｋＤａ領域(^*)の蛋白は、１５℃と３０℃で、水抽
出物（レーン２〜４；９〜１０）とペレットフラクション（レーン５〜７；１２
〜１４）中の内因性キナーゼにより³²Ｐ−ＴＴＰで燐酸化される。水抽出物（レ
ーンＥ１）とペレットフラクション（レーンＰ１）についてのＴＴＰ依存燐酸化
の特異性は、冷ＴＴＰでのプレインキュベーションによる燐酸化の減少で示され
る。

【００２４】 図１１は、マウス骨髄顆粒球のＴＴＰ依存燐酸化を示す。Ｆｉｇ１１ａで、右
レーン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％アクリルアミド）、ペレットフラクションの燐
酸化の殆ど（Ｃ２Ｋ、顆粒球サイトプラストの均質物を２００ｘｇでの遠心分離
で得る）は、非常に高分子量でバンド(^*)を示した。燐酸化バンドは、６６と９
７ｋＤａの領域付近にも検出された(^*)。このバンドを抽出し、１２％アクリル
アミド（図１１ｂと１１ｃ）および２０％アクリルアミド（図１１ｄ）ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルでのオートラジオグラフィーによりさらに特徴付けた。図１１ｂと
１１ｃは、２５ｋＤａ付近に主要な燐酸化バンドを示した(^*)。図１１ｄは、２
５ｋＤａ領域で(^*)、また３０〜４６ｋＤａ領域(^*)で燐酸化を示した。

【００２５】実施例１ ：４３Ｋラプシンおよびデンキナマズ（Torpedo marmorata）のシナプ
ス後膜でのその燐酸化：ＴＴＰの役割材料と方法 シナプス後膜 ｎＡＣｈＲリッチのシナプス後膜（ｎＡＣｈＲ膜）を、新たに殺したデンキナ
マズ（Ｔｍ）から切除した電気器官から調製した（Biologie Marine,Arcachon）
（３，１６）。

【００２６】ホスフェートドナー、燐酸化と定量 〔γ−³²Ｐ〕−ＡＴＰ（³²Ｐ−ＡＴＰ）は、ＩＣＮからのものであった。〔γ
−³²Ｐ〕−ＴＴＰ（³²Ｐ−ＴＴＰ）は合成した（２７）。ｎＡＣｈＲ膜は、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ７.５、５〜１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０.０８％ Ｃ
ＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤中の（７−８０００Ｃｉ／ｍｏｌ）³²Ｐ−ＴＴＰ
または³²Ｐ−ＡＴＰを用いて４〜２０℃で６０〜９０分燐酸化した。燐酸化は、
ＳＤＳサンプル緩衝液で中止した。³²Ｐ燐酸化膜は、アクチン、４３Ｋラプシン
とα−ｎＡＣｈＲを分離することを意図したＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、オートラ
ジオグラフィー（Kodak Biomax）及び/又は³²Ｐ−定量（Molecular Dynamics Ph
osphorimager）をした。クマシーブルー染色を必要なとき行った。特異化の際、
ｎＡＣｈＲ膜を、³²Ｐ−ＴＴＰでのインキュベーション前に、５０ｍＭ Ｎａホ
スフェート緩衝液ｐＨ６．０と７.４中５〜２０ｍＭのジエチルピロカーボネー
ト（ＤＥＰＣ）(２８)で処理した（２０分、１６℃）。４３ＫラプシンのＴＴＰ
依存燐酸化に対する作用について、普通のキナーゼエフェクター〔ｃＡＭＰ：ア
デノシン３'−５'−サイクリックモノホスフェート、８−（４−クロロフェニル
チオ）ナトリウム塩（８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）；アニソマイシン；ｃＧＭＰ；カ
ルミダゾリウム；カルホスチン：ｃｄｃ２ペプチド；ゲニステイン；ビスインド
リルマレイミドＩ（ＧＦＸ）；Ｈ７；Ｈ８９；ＫＮ６２；ＫＴ５７２０、ＭＬ７
；蛋白キナーゼＡ阻害剤（ＰＫＩ）；スタウロスポリン；腫瘍壊死因子−α（Ｔ
ＮＦ−α）；ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）〕
をテストした。

【００２７】ホスフェート結合の化学安定性と性質 酸処理用に、³²Ｐ−ＡＴＰまたは³²Ｐ−ＴＴＰ処理膜を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルを切り、Ｔｒｉｓ緩衝液または１６％ＴＣＡで９０℃でインキュベートし（
２９、３０）、洗浄して分析した。４３Ｋラプシンの当量は、クーマシーブルー
染色で確認した。ベース処理として、³²Ｐ−標識化膜をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
し、ポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ）上で電気ブロットした。ブロ
ットを５５℃で乾燥し、蛋白ロスを最小にし、メタノールで湿潤し、Ｈ₂Ｏで洗
い、切り、４６℃で水または１Ｎ ＫＯＨ中でインキュベートし、分析した。

【００２８】ＰＶＤＦ−エレクトロトランスファーした(３１) ³²Ｐ−４３Ｋラプシン上での
ホスホアミノ酸分析 酸安定性ホスホアミノ酸の測定のため、４３Ｋラプシンを４０μｌ ５.７Ｎ ＨＣｌで加水分解した（１時間、１０５℃）。上澄液を蒸発させ、１０μｌ
Ｈ₂Ｏを添加した。加水分解物を、１Ｄ−（ｐＨ３.５）または２Ｄ高圧電気泳動
の何れかで、薄層セルロースプレート上で分析した（第１電気泳動、ｐＨ１.９
；第２電気泳動、ｐＨ ３.５）(３２)。塩基安定性分析のため、４３Ｋラプシ
ンを３Ｎ ＫＯＨ中で加水分解し（３時間、１０５℃）、１０％ＨＣｌＯ₄でｐ
Ｈ７.５に中和した(３３)。上澄液を、溶媒Ａ（ｔ−ブタノール：メチルエチル
ケトン：アセトン：メタノール：水：濃ＮＨ₄ＯＨ＝１０：２０：２０：５：４
０：５、ｖ／ｖ）中のシリカゲル６０Åプレート（ＩＣＮ）上で薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）により分析し、ホスホセリン（Ｐ−Ｓｅｒ）とホスホリジン
（Ｐ−Ｌｙｓ）とからホスホヒスチジン（Ｐ−Ｈｉｓ）を分離する(３３)。ホス
ホヒスチジンとホスホリジンは、ポリヒスチジンとポリリジンからそれぞれ合成
した(３４)。４０μｌのトリプシン緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、１３５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０.１％ＳＤＳ、１ｍＭ Ｃａｃｌ₂、ｐＨ８.５）中２μｇのＴ
ＰＣＫトリプシン（Promega）を用い、酵素加水分解を行った(３７℃、９０分)
。２μｇＴＰＣＫ−トリプシンを加え（３７℃、２時間）、次いで４００μｇプ
ロナーゼ（Boehringer-Mannheim）(３７℃、１８時間)を添加した。上澄液を、
溶媒Ａ中ＴＬＣで分析した。ホスホアミノ酸とホスホペプチドは、ニンヒドリン
で目視した。

【００２９】ホスホペプチド ＰＶＤＦトランスファーした³²Ｐ−４３ＫラプシンをＴＰＣＫ−トリプシンで
トリプシン消化し、ホスホペプチドを生じた（ｏ.ｎ．；トリプシン緩衝液中３
７℃）。加水分解物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、³²Ｐ−ペプチドの同定
用にオートラジオグラフィーした。抗体またはα−ブンガロトキシン(Bgtx)での標識化 ³²Ｐ−膜をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気ブロットし(３５)、(３６)に従っ
て処理し、特異的な抗３４Ｋラプシン(３７)、特異的な抗ホスホアミノ酸抗体（
Sigma）または¹²⁵Ｉ−Ｂｇｔｘ（Amersham）でプローブし、分析した。免疫沈降 ³²Ｐ膜を、１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.８／０.１％ ＳＤ
Ｓ／１％ ＮＰ４０／０．５％デオキシコレート／プロテアーゼ阻害剤／０．１
５Ｍ ＮａＣｌに希釈し、５０μｌ蛋白Ａ−アガロースビーズ（Santa Cruz）で
安全性を保証し、４３Ｋラプシンを特異的に認識する抗４３Ｋラプシン抗ペプチ
ド抗体で免疫沈降させた(３７)。３０μｌの蛋白Ａビーズを添加した（ｏ.ｎ.、
４℃）。ビーズを遠心分離、洗浄し分析した。

【００３０】結 果 ＴＴＰ依存燐酸化蛋白は４３Ｋラプシンである。 ｎＡＣｈＲ膜を〔γ−³²Ｐ〕ＴＴＰとインキュベートして燐酸化した蛋白は、
〜４３ｋＤａに移行した（図１、矢印）。燐酸化は、キナーゼを外部的に添加せ
ずに生じ、Ｍｇ²⁺（５ｍＭ、図１Ａ、レーン３、６）で増強され、ＤＴＴ（図１
Ａ、レーン１）で部分的に阻害され、Ｚｎ²⁺（図１Ａ、レーン２）で阻害され、
ＴＴＰは用量依存性〔図１Ａ：２４μＭ（レーン８対レーン４、９）〕；２４０
μＭ（レーン５対３、６；レーン対４，９）。 ブロットした³²Ｐ−標識膜を¹²⁵Ｉ−Ｂｇｔｘ、α-ｎＡＣｈＲに特異的な毒素
とさらにインキュベーションすると、２つの放射性バンドが観察された（図１Ｂ
、レーン１、３）。レーン２では燐酸化が防止され、¹²⁵Ｉ−Ｂｇｔｘ標識化バ
ンド（矢の頭）に対応し、³²Ｐ標識化４３ｋＤａバンド（矢印）とは区別される
ただ１つの放射性バンドが観察された。これはα−ｎＡＣｈＲが³²Ｐ−ＴＴＰで
燐酸化されないことを示すものである。

【００３１】 ³²Ｐ標識化バンドは、抗４３Ｋラプシン抗体で認識された（免疫ブロット）。 ³² Ｐ−燐酸化蛋白が４３Ｋラプシンであることを確かめるため、³²Ｐ標識化膜の
免疫沈降を３つの特異性抗４３Ｋラプシン抗ペプチド抗体で行った(３７)。図２
Ａは、³²Ｐラベル化蛋白が、抗４３Ｋラプシン抗体で特異的に免疫沈降されたこ
とを示す。半定量分析（図２Ｂ）で用いた１つの抗４３Ｋラプシン抗体（図２Ａ
、レーン１）は、免疫沈降した放射性が使用した抗４３Ｋラプシンの量に直接的
に相関していることを示した（図２Ｂ、レーン３〜５）。免疫沈降の上澄液は、
反対の状況を示した（図２Ｃ）。免疫沈降の特異性を、プレ免疫血清と予吸収抗
体で証明した（図２Ｂ、レーン１、２）。これは、４３ＫにラプシンがＴＴＰ依
存燐酸化蛋白であることを示すものである。

【００３２】ＴＴＰ依存燐酸化は、ｎＡＣｈＲリッチの膜の存在下、内因性キナーゼ(類)で駆 動される。 キナーゼを外から添加せず４〜２２℃で生ずる４３Ｋラプシンの燐酸化は、Ｍ
ｇ²⁺（５ｍＭ、図１Ａ、レーン３、６）、ｐＨおよび時間に依存性である（図３
）。それにはＴＴＰを必要とし、用量依存で飽和でき（Ｋ_D〜５〜１０μＭＴＴ
Ｐ、図３Ｃ、しかし１つの膜製品Ｋ_D〜２５μＭ ＴＴＰ）、酵素反応の特徴を
示す。従って、４３ＫラプシンのＴＴＰ依存燐酸化を、シナプス後膜で共に精製
した内因性キナーゼ（類）で行った。ＴＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰのＩＣ₅₀は、それ
ぞれ４０μＭ、５００μＭと１０００μＭ付近である（図３Ａ）。ＣＴＰは阻害
が弱い。ＴＴＰ依存キナーゼまたはキナーゼ類（ＴＴＰキナーゼ、ＴＴＰ−４３
Ｋキナーゼ）活性は弱アルカリｐＨで好ましく（図３Ｂ）、ＤＴＴで部分的に阻
害される（３０〜４０％阻害／１０ｍＭ；図１Ａ、レーン１）。

【００３３】ＴＴＰ−４３キナーゼはＰＫＡではない ４３Ｋラプシンは、検出感度内で³²Ｐ−ＴＴＰの存在下で燐酸化される唯一の
蛋白（図１と４、レーン１，２）である一方、ｎＡＣｈＲサブユニットを含む付
加的な蛋白が、前の結果と一致して³²Ｐ−ＡＴＰで（図４、レーン３〜６）燐酸
化される(１６)。４３Ｋラプシンの燐酸化は２５〜５０μＭ ³²Ｐ−ＴＴＰで飽
和されるが（図３Ｃ）、２００μＭ³²Ｐ−ＡＴＰでは飽和されない。³²Ｐ−ＡＴ
Ｐと³²Ｐ−ＴＴＰ依存４３Ｋラプシンの燐酸化は特異的にＴＴＰとＡＴＰの両方
で阻害され、ＰＫＡとＴＴＰキナーゼに共通の燐酸化部位が存在することを示唆
している。しかし、ＰＫＡエフェクターで行った分析では、それらが異なること
が示された。ＰＫＩはＰＫＡを阻害したが（６０±１３％阻害）、ＴＴＰキナー
ゼはしない（６±１％阻害）。外因性ＰＫＡ触媒サブユニットは、ＡＴＰ依存燐
酸化（６０３±１４％ ³²Ｐ対１００±２３％コントロール）（１６、この研究
）を増したが、ＴＴＰで行ったとき阻害する（４１±６％対１００±２％コント
ロール）。

【００３４】ＴＴＰ−４３Ｋキナーゼ、新規なキナーゼ ＰＫＡ〔Ｓｅｒ−４０６(３８)〕とチロシンキノーゼ〔Ｔｙｒ−９８、Ｔｙｒ
−１８９、Ｔｙｒ−３２５(３９)〕の推定上の燐酸化部位は、デンキナマズの４
３Ｋラプシンに存在する。プロサイト(Prosite)(４０)とホスホベース（Phospho
Base）(４１)の研究で、ＣａＭII、ＣＫＩ、ＣＫII、ＰＫＡ、ＰＫＣ及びＰＫ
Ｇ蛋白キナーゼに対する推定上の部位が示された。１８の普通のキナーゼエフェ
クター中、スタウロスポリンのみが、僅かに阻害を引起こした（３３±３％阻害
／２００nＭ）。ＰＫＡ、ＰＫＣ（ＴＰＡ、カルホスチン、ＧＦＸ）、ＭＡＰキ
ナーゼ蛋白キナーゼＧ、ＣａＭキナーゼII、ＪＮＫ２キナーゼ、ｃｄｃ２キナー
ゼ、ＭＬＣＫ、ＳＡＰキナーゼ、ＴｙｒＰＫの多くの活性化因子又は阻害剤は、
新しいタイプとみられるＴＴＰキナーゼの活性を変更しなかった。

【００３５】 このＴＴＰ依存燐酸化は、少なくとも新しい内因性キナーゼで触媒される。こ
のキナーゼは、上で述べたように共精製され（copurified）、Ｋ_D（図３Ｃに示
した見掛解離定数）とＩＣ₅₀ （図３Ａに示すようなＴＴＰまたはＡＴＰまたは
ＧＴＰの存在下、サイオールキナーゼの酵素活性の５０％を阻害する製品濃度）
の測定で特徴付けられる。このキナーゼは、ｐＨ依存性でもある。最適ｐＨは７
.５付近である。ラプシンのヒスチジン残基のＴＴＰ依存燐酸化の原因とするキ
ナーゼ含有精製抽出物を、そのキナーゼの酵素活性を阻害する生成物の濃度を増
加させプレインキュベートする（図３Ａ）。プレインキュベーション後に、キナ
ーゼは、その燐酸化性質の一部を９０％まで損なう。４３ラプシンのＴＴＰ依存
燐酸化に対する作用について、化学的キナーゼエフェクター、例えば〔ｃＡＭＰ
；アデノシン３'−５'−サイクリックモノホスフェート、８−（４−クロロフェ
ニルチオ）ナトリウム塩（８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）；アニソマイシン；ｃＧＭＰ
；カルミダゾリウム；カルホスチン；ｃｄｃ２ペプチド、ゲニステリン；ビスイ
ンドリルマレイミドＩ（ＧＦＸ）；Ｈ７Ｈ８９；ＫＮ６２；ＫＴ５７２０、ＭＬ
７；蛋白キナーゼＡ阻害剤（ＰＫＩ）；スタウロスポリン；腫瘍壊死因子−α（
ＴＮＦ−α）；ホスボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）
〕を試験した。これらの分子は、ＴＴＰ依存キナーゼの活性を劇的に変更せず、
結果として新しいタイプであった。

【００３６】Ｚｎの効果 ４３Ｋラプシンは２つの隣近した亜鉛フィンガーモチーフを含有し(４２)、Ｚ
ｎ²⁺はＴＴＰ依存燐酸化をＭｇ²⁺非依存で阻止する〔〜７０％阻害／０.５〜３
ｍＭ Ｚｎ²⁺／８μＭ ³²Ｐ−ＴＴＰ（図１、レーン２）〕。

【００３７】ＴＴＰで燐酸化したアミノ酸の性質 ³²Ｐ−ＡＴＰ依存燐酸化４３Ｋラプシン（ＡＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシン）の
酸加水分解物の２Ｄ高電圧電気泳動で、ＰＫＡによる燐酸化が主にセリンで起こ
ることが分かっている(１６)。ＴＴＰ依存³²Ｐ燐酸化４３ラプシン（ＴＴＰ−³² Ｐ４３Ｋラプシン）での同様の分析では、セリンでわずかな放射性シグナルを、
無機ホスフェート（Ｐｉ）で強いシグナルを有する、異なる結果が示された。ホ
スホセリンの存在は、ホスホセリン（ＰＳｅｒ）、ホスホスレオニン（ＰＴｈｒ
）とホスホチロシン（ＰＴｙｒ）に特異な抗ホスホアミノ酸抗体で確認した（図
５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したコントロールとＴＴＰ³²Ｐ燐酸化膜の等量を
エレクトロブロットし、ポンソーレッドで染色（図５Ｂ、レーン９、１０）し、
特異性抗ホスホアミノ酸抗体でプローブした。抗ＰＴｙｒ（図５Ａ、レーン１、
５）は、４３Ｋラプシンではない、幾つかの非放射性バンドを強く染色した。こ
れは、原位置Ｔｙｒ燐酸化蛋白とｎＡＣｈＲ関連蛋白チロシンキナーゼの存在(
４３)を示し、Ｔｙｒは４３Ｋラプシンで燐酸化されないことを示唆している（
しかし４４を参照）。³²Ｐ−４３Ｋラプシンは、抗ＰＴｈｒで染色されなかった
（図５Ａ、レーン２、６）。抗ＰＳｅｒは、コントロール（図５Ａ、レーン３）
〔これは４３Ｋラプシン中の原位置ＰＳｅｒの存在と一致(１６)〕とＴＴＰ³²Ｐ
膜（図５Ａ、レーン７；図５Ｃ、レーン１１、１２）との両方で４３Ｋラプシン
をわずかに染色した。³²Ｐ−４３Ｋラプシンのより強い染色（レーン７対３）は
ＴＴＰに駆動されたセリンでのいくらかの燐酸化を示唆しており、ＴＴＰとＡＴ
Ｐによる４３ＫラプシンのＡＴＰとＴＩＰ依存燐酸化の相互阻害にそれぞれ一致
している。

【００３８】 ＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシン加水分解物中の予期に反した高い³²Ｐｉ含量を
洞察するため、ＡＴＰ−とＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシンを同時にＨＣｌで加水
分解し、ＩＤ−電気泳動で分析した。類似のニンヒドリン染色ホスホペプチドパ
ターンとしかし異なるオートラジオグラムが得られた（図６）。ＡＴＰ−³²Ｐ−
４３Ｋラプシン加水分解物（レーン１）はＰ−Ｓｅｒに高い放射活性（矢の頭）
を、Ｐｉに低い放射活性を示した。ＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシン加水分解物（
レーン３）は、Ｐ−Ｓｅｒにごくわずかな放射活性（矢の頭）とＰｉに高い放射
活性を示した。これは、ＡＴＰでのセリン燐酸化を確認し、ＴＴＰでの燐酸化が
セリン以外の残基で優先的に起こり、かつＴＴＰ駆動のリン結合が主に酸不安定
であることを示唆している。

【００３９】 さらに、ｐＨ安定性分析をＡＴＰ−とＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシンで行った
。両方の燐蛋白を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを９０℃でＴＣＡと処理し、³² Ｐ定量した（表１）。ＴＴＰ−依存燐酸化４３Ｋラプシンは酸に感受性で、³²Ｐ
ホスファート損失は、ＴＣＡでの時間の関数である（５および１０分後の５０±
４と１６±１％ ³²Ｐ 対コントロールの１００±１３％）。反対に、ＡＴＰ− ³² Ｐ−４３Ｋラプシンは感受性が少ない（５および１０分後の７９±５と４９±
９％ ³²Ｐ 対コントロールの１００±８％）。アルカリｐＨで行った同様のテ
スト（表Ｉ）では、ＡＴＰ駆動リン結合（１８±２対コントロール１００±６％ ³² Ｐ）に対比し、ＴＴＰ依存リン結合の顕しい安定性が示された（１Ｎ ＫＯＨ
中２時間後の７２±４％ ³²Ｐ 対コントロールの１００±５％）。かくして、
ＡＴＰで励起されたホスフェート結合は酸安定でアルカリ不安定で、Ｏ−結合の
ホスホアミノ酸、ホスホセリンとホスホスレオニンのサインである(４５)。セリ
ンは、実際にＡＴＰで燐酸化される（１４および図６）。逆に、ＴＴＰで導入さ
れたホスホリル結合は酸不安定でアルカリ安定で、ホスホヒスチジンまたはホス
ホリジンでのＮ−ホスフェート結合の特性である(４５)。

【００４０】ＴＴＰはヒスチジン残基で燐酸化を優先的に起こす ＴＴＰ燐酸化４３ＫラプシンのＮ−ホスホアミノ酸を同定するため、４３Ｋラ
プシン加水分解物のＴＬＣを溶媒Ａ中で行った。ヒスチジンを自己燐酸化する(
４７)ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（ＮＤＰＫ）(４６)をコントロール
として用いた（図７Ａ、Ｂ、レーン４）。全ての加水分解物（図７Ａ、Ｂ、レー
ン２〜４）がホスホヒスチジンに類似して移行する放射性物を示し、最も高い強
度がＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシンの酵素加水分解物に観察された（図７Ａ、レ
ーン２）。４３Ｋラプシン（図７Ａ、レーン３；図７Ｂ、レーン２、３）とＮＤ
ＰＫアルカリ加水分解物（図Ａ、Ｂ、レーン４）の双方におけるＰ−Ｈｉｓでの
低い放射性は、恐らく加水分解中のＰ−Ｈｉｓ部分分解に由来する。添加したホ
スホヒスチジン（内部基準）は、放射性スポットとともに移動した（図７Ｂ、レ
ーン２〜４）。この結果は、ＴＴＰでのヒスチジンの燐酸化に好ましい。

【００４１】 ヒスチジンの重要性を評価するため、ｎＡＣｈＲ膜をＤＥＰＣと前処理し、³² Ｐ−ＴＴＰとインキュベートした〔ＤＥＰＣはヒスチジン修飾し、続く燐酸化を
防止する(２８)〕。４３Ｋラプシン燐酸化は、ＤＥＰＣ膜で効果的に低下した（
偽膜中２０±２％対１００±１９％³²Ｐ）。 ＡＴＰ−とＴＴＰ−³²Ｐ−４３Ｋラプシンで行った部分トリプシン消化と１５
％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ＡＴＰ−燐酸化４３Ｋラプシンの〜６.
５〜１５ｋＤａでの１つの主要な放射性バンドおよびＴＴＰ燐酸化４３Ｋラプシ
ンの〜６.５〜３５ｋＤａの幾つかの放射性バンドが示された。これは、燐ドナ
ーの性質によって燐酸化部位が異なることを示す。ＡＴＰは多分１つのセリン残
基を主に燐酸化し、一方ＴＴＰでは、１つまたはいくつかのヒスチジン残基が主
に燐酸化される。

【００４２】ＴＴＰはＮＤＰＫの燐ドナーではない ＮＤＰＫは、生育と転移制御で主要な役割を果たす高度に保存された酵素であ
る（４７）。その酵素は、ヒスチジンを自己燐酸化し、幅広い特異性を示すので
、燐酸化をＴＴＰでアッセイした。ＮＤＰＫは、³²Ｐ−ＴＴＰではなく、³²Ｐ−
ＡＴＰで強く燐酸化された。ＴＴＰ、中枢神経系（ＣＮＳ）でのホスフェートドナー ³²Ｐ−ＴＴＰまたは³²Ｐ−ＡＴＰとインキュベートしたマウスとラットの脳膜
を燐酸化した。しかし、デンキナマズのシナプス後膜でのごとく（図８Ａ、Ｂ、
レーン１）、ＡＴＰはマウス脳膜で多くの蛋白を燐酸化し（図８Ａ、レーン２）
、一方ＴＴＰはほとんど燐酸化しなかった。２つの主要な³²Ｐ標識化バンドは、
〜４３〜４６ｋＤａで観察された（図８Ｂ、レーン２）。燐酸化はＡＴＰ（図８
Ｂ、レーン３）またはＴＴＰ（図８Ｂ、レーン３）で部分的に阻害された。従っ
て、インビトロで、ＴＴＰはＣＳＮ中の蛋白の燐ドナーである。

【００４３】論 考 ｎＡＣｈＲリッチの膜製剤に関連した内因性ＰＫＡは、４３Ｋラプシンと他の
蛋白を燐酸化する(１６)。ｎＡＣｈＲクラスター化とシナプス後構造形成での４
３Ｋラプシンの本質的な役割が、４３Ｋラプシンの特異的燐酸化研究を促進させ
た。免疫沈降とウエスタンブロット分析で、ＴＴＰを燐ドナーとして用いるよう
な燐酸化を同定した。ＴＴＰ依存キナーゼ（類）、（ａ）新規キナーゼ（類） 燐ドナーとしてＴＴＰを用いる４３Ｋラプシンの特異的燐酸化は、４〜３０℃
のデンキナマズの周囲の海水温度に合う温度で起こる。４３Ｋラプシンはシナプ
ス後膜内面に局在し（５、６）、このことから、局所解剖学的に、高いサイトゾ
ルＴＴＰ含量になり易い（〜４〜３０ｎｍｏｌ／ｇ湿組織：２４、２６）。従っ
て、４３Ｋラプシンの有効な内因性燐酸化に必要な条件は、燐ドナーとしてのＴ
ＴＰでの４３Ｋラプシンの燐酸化はインビボでデンキナマズのエレクトロサイト
で起こるという概念を支持するものに合致する。

【００４４】 燐酸化は、ｎＡＣｈＲリッチのシナプス後膜中に存在し、ＴＴＰに特異的、但
しＡＴＰにいくらか親和性の内因性キナーゼ（類）で駆動される酵素反応の特徴
を有するＭｇ²⁺とＴＴＰ−依存性である。これらは、ＴＴＰ依存−４３Ｋラプシ
ンキナーゼ（類）またはＴＴＰ−キナーゼ（類）と命名された。 これらＴＴＰ−キナーゼ（類）は、新しいタイプとみられ、ＰＫＡ、ＰＫＣま
たは通常のキナーゼと異なる。その親和性は、ＰＫＡの阻害剤、ＰＫＣの活性化
因子（ＴＰＡ）あるいは阻害剤（カルホスチン、ＧＦＸ）または他の通常のキナ
ーゼのエフェクターによっては劇的に影響されない。新しい真核性蛋白キナーゼ
群または公知のキナーゼ群のメンバーとしての分類の問題は、それらの同定、精
製、特徴付けおよびシーケンシングで解決されるであろう。

【００４５】４３Ｋラプシンのヒスチジン燐酸化 ホスホアミノ酸と抗体分析は、セリン残基でのいくらかの少ない燐酸化の他に
、ヒスチジンが優勢に燐酸化されることを示唆している。ＴＴＰ依存４３Ｋ燐酸
化のＡＴＰとＴＴＰの両方による阻害は、ＴＴＰキナーゼがＰＫＡとのいくつか
の共通の燐酸化部位を共有し得ることを示唆している。しかし、ＴＴＰで導入さ
れた検出しうるホスホリル基の殆どはヒスチジンであり、ＡＴＰによるものはセ
リンであること(１６)から、共有されたセリン部位を介する阻害は、部分的に考
えるべきである。高濃度の異型トリホスフェートＡＴＰによる燐酸化の強い阻害
は、恐らく、異なった親和性ではあるが、ＡＴＰまたはＴＴＰの何れかを認識し
結合するＴＴＰキナーゼの能力にあるであろう。加えて、セリンの燐酸化でもた
らされたヒスチジンのミクロ環境の修飾が起こり、ＴＴＰキナーゼ(類)によるヒ
スチジン燐酸化が低下する（Ｓｅｒ−４０６、強いＰＫＡコンセンサス部位は、
Ｈｉｓ−３８４とＨ−３８７に密接である）。

【００４６】 Ｚｎ²⁺は多くの蛋白の活性を修飾し、シナプス伝達での役割を果たし得る(４
８)。我々は、ＴＴＰキナーゼ活性が５００μＭ Ｚｎ²⁺で防止されることを示
した。Ｓｅｒ−４０６の前のＣ−終末として、４３Ｋラプシンは２つの亜鉛フィ
ンガーモチーフを示し、これは多分ｎＡＣｈＲクラスター化に重要である可能性
がある（４２、４９、５０）。加えて２つの保存ヒスチジン、Ｈｉｓ−３８４と
Ｈｉｓ−３８７が亜鉛フィンガーモチーフに存在する。インビボで、４３Ｋラプ
シンがＺｎ²⁺を恐らく２つのヒスチジンを介して結合し(４２)、結果として、事
後に燐酸化しにくくするであろう。Ｚｎ²⁺の結合は、配置の変化を誘発し、ＴＴ
Ｐキナーゼによるヒスチジン燐酸化に対する４３Ｋラプシンの接触性の減少を誘
因する。Ｚｎ²⁺がインビボで４３Ｋラプシンに結合すると、亜鉛フィンガー領域
は蛋白燐酸化状態の調節に役割を果たすのである。ＴＴＰキナーゼのＺｎ²⁺に対
する固有の感受性は、Ｚｎ²⁺濃度で部分的にのみ考えるべきである。

【００４７】 トリプシン消化は、ＡＴＰが多分１つの主たるセリンの燐酸化をもたらす（多
分Ｓｅｒ４０６、強く保有されたＰＫＡコンセンサス部位）が、一方ＴＴＰは１
または数種のヒスチジンの燐酸化を行い得ることを示唆している。４３Ｋラプシ
ンは潜在候補である１３のヒスチジンを有する。これら残基中の１０個が、ひよ
こ(５１)、ヒト(５２)、マウス(５３)、デンキナマズ(５４)とツノガエル(Xenop
us)(５５)で保存されている。保存ヒスチジンのあるものは、タンデム亜鉛フィ
ンガーの保存された隣接シーケンス、例えばＨｉｓ−１５４；Ｈｉｓ−２３９；
Ｈｉｓ−２５６；Ｈｉｓ−３８４とＨｉｓ−３８７を有する。Ｈｉｓ−５３；Ｈ
ｉｓ−３２９；Ｈｉｓ−３４８とＨｉｓ−３５３について全体的に保存された隣
接シーケンスではないが、高度な相同性が、４３Ｋラプシン機能に重要とみられ
る領域に局在する。Ｈｉｓ−５３は、４３Ｋラプシン自己−会合に関与するドメ
インに存在する(５６)。Ｈｉｓ−３８４とＨｉｓ−３８７の変異は、４３Ｋラプ
シンのクラスター形成能を低下する(４２)。Ｈｉｓ−３４８とＨｉｓ−３５３は
、４３Ｋラプシンの２つの重要な部位に局在する。Ｈｉｓ−１５４の隣接シーケ
ンスＲＹＡＨはケイ.アエロゲネス(K.aerogenes)(５７)、エヌ.メニンギティデ
ス(N.meningitides)(５８)と大腸菌(５９)に保存され、原核生物のポリホスフェ
ートキナーゼ活性に必須の燐酸化部位として同定されている(５９)。ホスホヒス
チジンのホスフェートは、高エネルギー状態で、しばしばアクセプター残基（同
一又は他の分子上）に移送され、細胞調節の２成分シグナル化機構で重要な工程
である（６０、６１）。ＴＴＰで燐酸化されたヒスチジンを同定し、ヒスチジン
燐酸化の類似の役割がシナプス後ドメインでの４３Ｋラプシン燐酸化とクラスタ
ー化機能に関連しているかどうかを変異分析で測定することが興味あるであろう
。

【００４８】４３ＫラプシンのＴＴＰ依存燐酸化、ＴＴＰキナーゼ(類)とｎＡＣｈＲクラスタ ー化 ４３Ｋラプシンは、組織成熟に応じた比率で、サイトゾルおよび膜付着プール
として存在する(３７)。４３Ｋラプシン燐酸化とその細胞区画化の関係の問題が
、提起されている。 ｎＡＣｈＲ燐酸化は、多くの事例で報告されている（６２〜６５）。４３Ｋラ
プシンは、ｎＡＣｈＲβ−サブユニットを含む幾つかのシナプス後膜蛋白のチロ
シン燐酸化を制御する(４４)。ｎＡＣｈＲチロシン燐酸化は速い速度のレセプタ
ー非感受化を制御し、神経誘因ｎＡＣｈＲクラスター化で役割を果たし得る（６
５〜６７）。ｎＡＣｈＲと関連した２つの蛋白チロシンキナーゼは、デンキナマ
ズのエレクトロサイトでクローンされた(４３)。主にヒスチジン(類)での４３Ｋ
ラプシンの特異的燐酸化を駆動するＴＴＰ−キナーゼ(類)は、ｎＡＣｈＲリッチ
のシナプス後膜にも存在する。その精製（上記参照）により、ｎＡＣｈＲ燐酸化
とクラスター化を原因とするカスケードにそれらが関与している可能性がさらに
分析できるであろう。

【００４９】 １８の普通の蛋白キナーゼエフェクター中、有力であるが非特異的な蛋白キナ
ーゼ阻害剤(６８)であるスタウロスポリンのみが、いくらかの阻害を引起こす。
スタウロスポリンは、アグリン誘因ｎＡＣｈＲ燐酸化と凝集をも阻止する(６９)
。このことから、これらの事象とＴＴＰを介した４３Ｋラプシン燐酸化の起こり
うる関連性についての疑問が呈せられる。アグリンはＮＭＪ分化で重要な役割を
果たす（７０〜７２）。同時にトランスフェクトした４３Ｋラプシンは、ダイス
トロフィン糖蛋白複合体のアグリン結合成分のダイストログリカンをクラスター
化させる(７３)。これは、シナプス関連筋特異キナーゼ（７４〜７５）のＭｕＳ
Ｋと、ｎＡＣｈＲクラスター化とシナプス後分化を原因とするアグリン−ＭｕＳ
Ｋ−ＭＡＳＣシグナル化複合体の成分のクラスター化と活性化も誘発する。アグ
リン−ダイストログリカン−ＭｕＳＫ−ＭＡＳＣカスケードにおける４３Ｋラプ
シンの関与に対するＴＴＰ−依存燐酸化の影響を研究するのは興味があることで
あろう。

【００５０】 ＴＴＰを介した４３Ｋラプシンの燐酸化は、興奮性細胞での４３Ｋラプシンと
チアミン経路の相互作用の可能性をも示唆している。神経活性の増加は、ＴＴＰ
とＴＤＰからＴＭＰとチアミンへの脱燐酸化をもたらし（１８、７６）、小脳の
求心路遮断はチアミンホスフェート誘導体の代謝回転を減少する(７７)。

【００５１】実施例２ ：ＴＴＰ依存燐酸化の他の真核細胞系への拡張。ＴＴＰ、哺乳動物シナ
プス蛋白の燐ドナー 脊椎動物のＮＭＪでの４３ＫラプシンのＴＴＰ依存性燐酸化の発生、ならびに
蛋白質-蛋白質相互作用でのその潜在的な役割、ｎＡＣｈＲ凝集およびＮＭＪで
の安定化は、依然として明らかにされるべきである。 ＴＴＰはＮＤＰＫヒスチジンの燐ドナー〔ＮＤＰＫの広範な特異性にかかわら
ず(４７)〕ではないが、ＴＴＰは、げっ歯動物の中枢神経膜に存在する蛋白の燐
酸化を引起こすことができる。かくして、ＴＴＰは、シナプス蛋白に特異な、可
能性のある新しい燐酸化経路を明確にする価値ある手段である。

【００５２】 ４３Ｋラプシンは、同時にトランスフェクトしたＧＡＢＡ_Aレセプターをクラ
スター化させ(７８)、ひなの毛様神経節神経に存在している(５１)。脳レセプタ
ー、ひなの毛様神経節４３Ｋラプシンおよび推定されている脳４３Ｋラプシン同
族体の燐酸化での燐ドナーとしてのＴＴＰの関与の解析により、シナプス機能の
基底にある分子過程がより理解できるはずである。 ４３Ｋラプシンの新しくかつ特異なＴＴＰ依存燐酸化は、シナプス組成化のモ
ジュレーションでＴＴＰ依存燐酸化が重要である可能性のあることを強調してい
る。それはまた、より古典的なプリン三燐酸経路と異なるシナプス蛋白の新しい
燐酸化経路をも開くものである。

【００５３】使用された材料と方法 プロテアーゼ阻害剤 ：アプロチミン、ピファブロック、ロイペプチン、アンチパ
イン、ペプスタチンＡシナプス後膜 ：ｎＡＣｈＲリッチなシナプス後膜（ｎＡＣｈＲ膜）を、新しく殺
したデンキナマズ〔Torpedo marmorata(T.m.) から切除した電気器官から調製し
た (Biologie Marine, Arcachon) (Sobelら、1977, Hillら1991)。げっ歯動物の脳、ＳＣＧと神経球膜製剤 脳膜を４℃で調製した。マウスとラットを麻酔し、次に断頭して殺した。脳を
切開し、１０％ショ糖（ｗ／ｗ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴとプロテ
アーゼ阻害剤（アプロチニン、ピファブロック、ロイペプチン、アンチパイン、
ペプスタチンＡ、ＰＭＳＦ）を含有する５容量の氷冷Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７.５
中でテフロン（登録商標）ガラスホモゲナイザーで均質化した。ホモジネートを 、１,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。さらに、上澄液を３０,０００ｇで ４℃で１時間遠心分離した。粗脳膜に相当する得られるペレットを、ＤＴＴを欠 く氷冷均質化緩衝液中で均質化し、−８０℃で貯蔵した。

【００５４】マウスの骨髄顆粒細胞膜製剤（４℃） 骨髄顆粒細胞をマウスから単離し、核のないサイトプラストをWigler及び Wei
nstein 1975に従って調製し、顆粒のマーカーであるＬｙ−６Ｇの存在およびリ
ンパ球様細胞用マーカーＢ２２０の不在をテストした。サイトプラスト膜を、１
０ｍＭ ＥＧＴＡとプロテアーゼ阻害剤の存在下、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐ
Ｈ７.５緩衝液でのガラスポッター中での均質化および２０００×５分での遠心
分離によりWright ら、1977に従い調製してペレットＣ２Ｋを得、その上澄液を
さらに５７０００×１時間遠心分離し、ペレットＣ５７Ｋを得た。ペレットは−
８０℃で貯蔵した。ナツメヤシ花粉フラクション ナツメヤシ花粉５０ｍｇをプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン、ピファブロッ
ク、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチンＡ）の存在下３００μｌ冷水中
で１時間循環させ、１４Ｋで４℃、１５分間遠心分離し、上澄液（抽出物）とペ
レットのフラクションを得る。ペレットのフラクションをプロテアーゼ阻害剤（
アプロチニン、ピファブロック、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチンＡ
）の存在下で水に再懸濁する。両フラクションを−８０℃で貯蔵する。

【００５５】ヒト赤血球（ＨＲＢ） 赤血球は、凝固防止のクエン酸塩上に採取したヒト血液（Ａ＋）からのもので
ある。血液を４℃で２〜４週間、５０ｍｌ管中に保存し、ＲＰＭＩ １６４０(G
ibco)で洗浄し、プラズマと白血球を除いた。赤血球細胞を９００ｘｇで１０分
間室温で遠心分離し、ＲＰＭＩで２回希釈した。次に赤血球細胞を、Ｈｅｐｅｓ
（９ｇ／ｌ）とＮａＨＣＯ₃（２ｇ／ｌ）、ｐＨ７.２に緩衝化したＣＯ₂、ＲＰ
ＭＩ、＋１０％ヒト血清＋グルコース（２ｇ／ｌ）、ハイポキサンチン（２０ｍ
ｇ／ｌ＋ゲンタマイシン（２.５ｍｇ／ｌ）の存在下、加湿オーブン中で培養し
た。赤血球細胞培養物をＨ₂Ｏとプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン、ピファブ
ロック、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチンＡ）の存在下４℃で３０分
溶解し、１４Ｋで４℃３０分遠心分離し、上澄液または溶解液（Ｐｓ）とペレッ
ト（Ｐｍ）のフラクションを得た。ペレットをＨ₂Ｏ＋プロテアーゼ阻害剤で２
回洗浄した。両方のフラクション（溶解物と膜）を−８０℃で貯蔵した。

【００５６】ピー.ファルシパルム寄生体培養物 寄生体は、ヒト赤血球細胞上で生育した。赤血球細胞は、凝固防止のためクエ
ン酸塩上で採取したヒト血球（Ａ＋）由来物である。血液を４℃で２〜４週間、
５０ｍｌ管中で保有し、次いでＲＰＭＩ １６４０（Gibco）で洗浄し、血漿と
白血球を除去した。赤血球細胞を９００ｘｇで１０分間、室温で遠心分離、ＲＰ
ＭＩで２回希釈した。次に赤血球細胞を、Ｈｅｐｅｓ（９ｇ／ｌ）とＮａＨＣＯ ₃ （２ｇ／ｌ）、ｐＨ７.２で緩衝化したＣＯ₂、ＲＰＭＩ、＋１０％ヒト血清＋
グルコース（２ｇ／ｌ）、ハイポキサンチン（２０ｍｇ／ｌ）＋ゲンタマイシン
（２.５ｍｇ／ｌ）の存在下、３７℃で加湿オーブンで培養した。培養物を、ヒ
ト赤血球細胞を含有する媒体で規則的に希釈し、高度な寄生体の生育を維持した
。高い含量の寄生虫を含有する培養物を、室温で６００ｘｇで１０分間遠心分離
した。細胞ペレットを血漿ゲルとＲＰＭＩの混合物に再懸濁し、ホモジナイズし
、３７℃で３０分インキュベートし、次いで低速（１５０ｘｇ、１０分）で遠心
分離した。ペレットは寄生体(mamre parasite)に感染した赤血球細胞からなり、
Ｈ₂Ｏとプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン、ピファブロック、ロイペプチン、
アンチパイン、ペプスタチンＡ）の存在下、４℃で３０分溶解させ、１４Ｋで３
０分間遠心分離して上澄液または溶解物（Ｐｓ）とペレットのフラクションを得
た。ペレットはＨ₂Ｏ＋プロテアーゼ阻害剤で２回洗浄した。両フラクション（
溶解物と膜）を−８０℃で貯蔵した。

【００５７】神経球の調製 血経球を、わずかに変更したReynolds および Weiss 1992にしたがって調製す
る。胚線条体細胞を妊娠マウスから分離し、Ｂ２７栄養源（Gibco）とＥＧＦの
存在下、ＤＭＥＭ Ｆ１２中で培養した。媒地は部分的に１週間に２回取換えた
。媒地に浮遊する細胞を、付着細胞から分別して解離し、使用まで週ごとの継代
で培養媒地に維持した。ホスフェートドナー、燐酸化と定量 〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（³²Ｐ−ＡＴＰ）は、ＩＣＮからのものであった。〔γ− ³² Ｐ〕−ＴＴＰ（³²Ｐ−ＴＴＰ）は合成した（Ｇrandfilsら、1988）。ｎＡＣｈ
Ｒ膜は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ７.５、５〜１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
０.０８％ＣＨＡＰＳ、プロテアーゼ阻害剤中の（７〜８０００Ｃｉ／ｍｏｌ）^{3 2} Ｐ−ＴＴＰまたは³²Ｐ−ＡＴＰを用いて、４〜２０℃で６０〜９０分間燐酸化
した。 燐酸化はＳＤＳ−サンプル緩衝液で停止した。³²Ｐ−燐酸化膜を、アク
チン、４３Ｋラプシンおよびａ−ｎＡＣｈＲの分離を意図したＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付し、オートラジオグラフィー（Kodak Biomax）および／または³²Ｐ−定量し
た（Molecular Dynamics Phosphorimager）。クーマシーブルー染色は、必要時
に行った。

【００５８】結 果 ＴＴＰは、ＣＮＳと筋以外の多くの生理学系でのエンドキナーゼに対するホス
フェートのドナーである。 ＴＴＰは、内因性キナーゼを介する中枢神経系（ＣＮＳ）のホスホドナーであ
ってもよい。多くの異なるＣＮＳ組織に存在する蛋白（全ＣＮＳ、上頸神経筋（
ＳＣＧ）、神経球）は、内因性キナーゼを介してホスホドナーとしてＴＴＰで燐
酸化される（図９）。 ＴＴＰは、また多くの他の重要な生理学系（内因性キナーゼ）、例えばヒト赤
血球細胞（Ｔｍ、Ｔｓ）、マウス免疫系（脊髄顆粒球、図１１）、アレルギー性
植物（Dactylis glomerate pollen）、寄生虫（Ｐｍ、Ｐｓ；プラスモジウム・
ファルシパルム）に存在する蛋白に対する燐ドナーであってもよい（図９と１０
）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで、ＴＴＰ依存燐酸化蛋白は、系に重要な蛋白に類似
の領域に移行する。

【００５９】 全ての燐酸化は、エキソキナーゼを添加することなく³²Ｐ−ＴＴＰで行われた
。これはテストした組織におけるＴＴＰ依存エンドキナーゼの存在を示すもので
ある。 これらの結果によれば、ホスフェートのドナーとしてのＴＴＰの使用が、ＣＮ
Ｓと筋の他の多くの生理学系で一般化できる。 図９は、異なる組織由来膜のＴＴＰ依存燐酸化後に得られたオートラジオグラ
ムを示す。３０ｋＤａの領域は、試験しなかった。分子マーカーは、最左レーン
である。 上記のとおり、組織で検出された燐酸化は全て、ＴＴＰ-依存性のエンドキナ
ーゼに起因している。ＴＴＰは、神経筋接合部のモデルであるエレクトロサイト
の４３Ｋラプシン蛋白の燐ドナーであることが証明されている。ここに示した結
果は、ＴＴＰが動物に重要な種々の生理学的組織の燐ドナーでもあることを立証
した。

【００６０】 ＴＴＰが、ＣＮＳ以外の組織、例えばＳＣＧの燐ドナーであることが、発明者
らにより示された。さらに、燐酸化パターンは、加齢に依存し、かつ分化過程に
重要と思われる。 また、骨髄細胞は、細胞系の再生における可能性のために極めて興味深い。こ
のような細胞はＴＴＰにより燐酸化されることが興味深い。過度な燐酸化又は燐
酸化の欠失は、それらの再生特性に関連があることを証明している。 神経球は、再生の複数の可能性に対しても重要である。それらは、ゲルでのシ
グナルが弱くても、燐酸化される（これは、実験で使用した神経球のわずかな量
に起因している可能性がある）。

【００６１】 ピー.ファルシパルムは、ヒトにマラリアを引起こす最も毒性の寄生体であ
る。ピー.ファルシパルムに感染した赤血球は、血漿膜上でノブと呼ばれる電子
の密集した突出物を生じる。ノブは、感染した赤血球が上皮細胞に結合するのに
かならずしも十分ではないが、必要である。複雑な表現型は、大脳のマラリアに
寄与し得る（Pologeら、1987）。ピー.ロフラエ(P.Lophurae)に存在するものと
類似性を共有するピー.ファルシパルムの80〜90kDaのノブ-関連ヒスチジン-リッ
チな蛋白（ＫＡＨＲＰ）は、ノブの存在と隔離に相関している（Leechら、1984
、Pologeら、1987）。このＫＡＨＲＰは、４３Ｋラプシンに極めて類似した特性
を示す。４３Ｋラプシンは、エレクトロサイトのシナプス後膜の細胞質面に、神
経筋接合部のシナプス後密度で局在する(Nghiemら、2000)。ＫＡＨＲＰ蛋白は、
これらのノブの細胞質面に局在し（Pologeら、1987）、細胞付着誘導において役
割を果たし得る(Udeinyaら、1983)。マラリア寄生体に共通なように、ＫＡＨＲ
Ｐは、ポリスチジン反復構造およびコンセンサスモチーフを有するタンデムに反
復するアミノ酸を含む(ＫＡＲＨについてはＧｌｙＨｉｓＨｉｓＰｒｏＨｉｓ、K
oideら、1986)。パスツール研究所のMercereau-Pujalon博士のグループは、寄生
体抗原および特にＲ２３抗原でのワクチンの開発を目的とした宿主-寄生体の相
互作用の研究に関わっている。この保存された抗原は、アミノ酸モチーフの１つ
として、Ｈｉｓを有する６ ＡｓｎＨｉｓＬｙｓＳｅｒＡｓｐＳｅｒ/Ｈｉｓ/Ａ
ｓｎアミノ酸コンセンサスモチーフとともに１１の繰り返しを含む。この抗原は
、ピー.ファルシパルム感染した赤血球細胞に対する抗体をオプソニン作用によ
り認識し、組換えＲ２３は、リスザル(Saimiri sciureus)で良好な保護を誘発す
ることができる(Perrautら、1995、1997)。寄生体蛋白の燐酸化は、その感染又
はワクチンの特性を調節する上で重要である可能性がある。

【００６２】 赤血球細胞の本質的な特性は、ＴＴＰによる燐酸化の程度、および赤血球細胞
の疾患又は感染性が蛋白の過度な燐酸化又はその欠乏によって調節されるかどう
かに関連している。 アレルギー性植物（Dactylis glomerate pollen）は多く、世界中の全ての温
度域にわたって繁殖している。２つの主要なアレルゲンＤａｃ ｇ３およびＤａ
ｃ ｇ４は、アレルギー性植物（Dactylis glomerate pollen）に存在する。Ｄ
ａｃ ｇ３（３０ｋＤａ）はクローンされ、シークエンスされ、多くのヒトのア
レルギーパターンからの血清で認識される(Guerin-Marchandら)。多くの花粉種
に存在する主要で基本的な花粉アレルゲンであるＤａｃ ｇ４（６０ｋＤａ）は
、精製、特徴付けられており、Ｄａｃ ｇ４に対するモノクローナル抗体が生産
されている(Leduc-Brodardら)。花粉蛋白のアレルゲン性およびＴＴＰ依存燐酸
化の関連性が、このために指摘されている。

【００６３】 実施例３：真核細胞におけるヒスチジンの燐酸化 真核細胞で、燐酸化は、細胞調節での主要な役割にもかかわらず（３２）、セ
リン残基で優勢であり（〜９０％）、スレオニン残基で〜９．９％かつチロシン
残基でわずか〜０．１％で起こることが見積もられた。ヒスチジンでの燐酸化（
〜６％）は、大部分が原核細胞で証明されており、しばしば制御過程に関連して
いる（６１）。真核細胞では、ほとんど報告されていない（７９）。したがって
、この発明は、真核細胞中のシナプス蛋白上でヒスチジン燐酸化を行うことがで
き、このために真核細胞の燐酸化の重要性を拡大する、意外な新しい手段を提供
するものである。

【００６４】 結 論 発明者らは、ここに、チアミントリホスフェート（ＴＴＰ）、ＡＴＰ又はＧＴ
Ｐとは異なるトリホスフェート成分による蛋白の燐酸化をはじめて立証した。蛋
白キナーゼ（類）は、新規な種であると考えられる。燐酸化されたアミノ酸は、
アミノ酸が主としてヒスチジンであるために、真核細胞でも一般的である。また
、この燐酸化の蛋白標的は、シナプス後膜に特異的に存在し、適切に機能するよ
うにシナプスに必須の４３Ｋラプシンであることが立証された。ＴＴＰ依存燐酸
化のこの新しい型は、４３Ｋラプシンに限定されず、マウスおよびラットの脳膜
でも認められる。これにより、新規な燐酸化経路の燐ドナーとしてＴＴＰを広範
囲にかつより一般的に使用することができる。 明らかに、上記技術の下、この発明について多くの修飾及び変更が可能である
。したがって、多くの変更および修飾は、この発明の意図および範囲から逸脱し
ない限り、上記具体例に行うことができるものと理解される。

【００６５】

【表１】

【００６６】 値：³²Ｐ-ＡＴＰ(４３Ｋラプシン/ＡＴＰ)または³²Ｐ-ＴＴＰ（４３Ｋラプシン/
ＴＴＰ）で燐酸化し、ＴＣＡまたはＫＯＨでインキュベートした４３Ｋラプシン
中の³²Ｐ％の、コントロールの偽対応物に対する（標準平均±標準偏差） * ｐＨ-安定性分析で測定したＰａａは、酸及び塩基の安定性分析の双方に示す
推定上のＰａａである（下線）。

【００６７】 引用文献

【００６８】 引用文献（つづき）

【００６９】 引用文献（つづき）

【００７０】 引用文献（つづき）

【００７１】 引用文献（つづき）

【００７２】 引用文献（つづき）

【００７３】 引用文献（つづき）

【００７４】 引用文献（つづき）

【００７５】 引用文献（つづき）

【００７６】 引用文献（つづき）

【００７７】 上記の全ての引用文献を、ここに引用して導入する。 この発明を記載しているので、多くの変更及び修飾が、この発明の意図及び範
囲を逸脱しない限り、上記具体例に行い得ることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 9/12 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェ ルシュ・シアンティフィク−シーエヌアー ルエス ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴ ＩＦＩＱＵＥ−ＣＮＲＳ フランス国 75794 パリ・セデックス 16リュ・ミシェル・アンジュ ３ (72)発明者 ニアン，ホアン−オアン フランス、エフ−75013 パリ、スクワー ル ド ポール ロワイヤル、８ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA28 BA13 BB03 BB10 BB16 DA20 DA36 DA77 FB01 4B050 CC01 DD11 LL03 4B063 QA01 QQ08 QR41 QS02 4B065 AA93X BD50 CA44 4C086 AA01 AA02 DA38 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA66 NA14 ZA01 ZA94 ZB13 ZB21 ZC01 ZC41 ZC78

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 チアミントリホスフェートと担体とからなる組成物。
2. 【請求項２】 単位投与型である請求項１の組成物。
3. 【請求項３】 哺乳動物への筋肉内または静脈内投与に適する形態である請
   求項１の組成物。
4. 【請求項４】 真核細胞の燐酸化レベルを増加するのに有効な量のチアミン
   トリホスフェートからなる請求項１の組成物。
5. 【請求項５】 シナプス後蛋白の燐酸化不足に関連した病態または機能的運
   動終板の形成における欠損を有する患者を処置しうる組成物の製造へのチアミン
   トリホスフェートの使用。
6. 【請求項６】 チアミントリホスフェートが、チアミントリホスフェートと
   医薬的に受容な担体もしくは希釈剤を含む医薬的に受容な組成物の形態で投与さ
   れる請求項５の使用。
7. 【請求項７】 燐酸化ヒスチジン残基の欠乏である細胞膜または細胞の細胞
   骨格を処置しうる組成物の製造へのチアミントリホスフェートの使用。
8. 【請求項８】 欠乏燐酸化ヒスチジン残基がラプシン残基である請求項７の
   使用。
9. 【請求項９】 ラプシンとチアミントリホスフェートを接触させ、ラプシン
   を燐酸化することからなるラプシンのインビトロの燐酸化方法。
10. 【請求項１０】 ラプシンを燐酸化しうる組成物の製造へのチアミントリホ
    スフェートの使用。
11. 【請求項１１】 （ａ）放射性標識したチアミントリホスフェート、 （ｂ）非放射性標識したチアミントリホスフェート、 （ｃ）チアミントリホスフェートの移行用の試薬、 （ｄ）ＴＴＰ依存燐酸化性ヒスチジン残基含有の精製蛋白、 （ｅ）非ＴＴＰ依存燐酸化性ヒスチジン残基含有の蛋白、および （ｆ）任意の、抗ホスホアミノ酸抗体 からなる蛋白中のヒスチジン残基の特異的燐酸化を検出するキット。
12. 【請求項１２】 （ａ）患者から得た真核細胞サンプルから真核細胞の膜ま
    たは細胞骨格を精製し、 （ｂ）その膜または細胞骨格をチアミントリホスフェートとインキュベートし、 （ｃ）外因性ホスフェートの導入をコントロールと比較し、かつ （ｄ）サンプル中の蛋白の燐酸化されたヒスチジン残基の存在または不存在を測
    定する ことからなる真核細胞の細胞骨格または膜の燐酸化のレベルを定量する方法。
13. 【請求項１３】 原核または真核細胞とチアミントリホスフェートを接触さ
    せ、チアミントリホスフェートからのホスフェート基を細胞のホスフェートアク
    セプタ基に移行させることからなる燐酸化方法。
14. 【請求項１４】 細胞のホスフェートアクセプタ基が細胞蛋白のヒスチジン
    残基である請求項１３の方法。
15. 【請求項１５】 真核細胞がヒト細胞である請求項１３の方法。
16. 【請求項１６】 ａ）真核生物組織から抽出物を収得し、 ｂ）膜からサイトゾルを分別し、および ｃ）キナーゼ活性を奏する抽出物の１以上の成分を同定する ことからなるＴＴＰ依存キナーゼ活性を有する蛋白抽出物の精製方法。
17. 【請求項１７】 ホスフェート基を蛋白のヒスチジン残基に移行しうる新し
    いＴＴＰ依存キナーゼ活性を有する精製した蛋白抽出物。
18. 【請求項１８】 真核細胞での燐酸化を行いうる組成物の製造へのチアミン
    トリホスフェートの使用。
19. 【請求項１９】 組成物が、ヒトの細胞又は細胞膜の燐酸化不足に関連した
    疾患又は症状を処置し得る請求項１８の使用。
20. 【請求項２０】 組成物がシナプス後蛋白の燐酸化不足に関連した疾患また
    は症状を処置しうる請求項１８の使用。
21. 【請求項２１】 組成物が、機能性運動終板の形成の欠乏に関連した疾患ま
    たは症状を処置しうる請求項１８の使用。
22. 【請求項２２】 組成物が神経疾患または症状を処置しうる請求項１８の使
    用。
23. 【請求項２３】 組成物が筋疾患または症状を処置しうる請求項１８の使
    用。
24. 【請求項２４】 組成物がアレルギーに関連した疾患または症状を処置また
    は予防しうる請求項１８の使用。
25. 【請求項２５】 次の工程： ａ）アレルギー性分子と、チアミントリホスフェートからなる組成物を、チアミ
    ントリホスフェートでその分子の燐酸化をさせるのに受容な条件下で接触させ ｂ）任意に、燐酸化されたアレルギー性分子を精製し、および ｃ）燐酸化分子のアレルギー性質を同じ非燐酸化分子と平行してテストする ことからなる分子のアレルギー性質の評価方法。