JP2003507055A - ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから得られた配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから単離された新規なｃＤＮＡｓクローンおよびそれらの相当するポリペプチド配列を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】概論 本発明は、新規なヒトタンパク質をコードする新規なヒトポリヌクレオチドの
発見、同定および特性に関する。本発明は、本明細書に記載するポリヌクレオチ
ド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド
およびペプチド、および診断、薬物スクリーニング、臨床試験モニタリング、生
理的障害または行動異常の治療に使用することができる、コードされるタンパク
質またはペプチドに対する抗体を包含する。本出願は、１９９９年８月２４日に
出願された米国仮出願番号６０／１５０５１１に対して優先権を主張している。背景技術 タンパク質は、様々な生物システムにおいて必須の要素として働く。多くの場
合そのようなシステムは、情報伝達、および細胞生理、化学物質放出、細胞内伝
達、あるいは遺伝子発現を制御する他の経路を仲介するために、タンパク質受容
体とそれらのコグネイトリガンド（多くの場合、タンパク質）の相互作用による
生理プロセスを制御する。このように、タンパク質仲介リガンド／受容体相互作
用は、ドラッグインターベンション（ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）お
よび治療薬の設計における理想的なターゲットである。発明の概要 本発明は、新規なヒトタンパク質をコードするヌクレオチド、および開示した
ヌクレオチド配列によりコードされる相当するアミノ酸配列の発見、同定および
特性に関する。本明細書に初めて記載した新規なヒトタンパク質（ＮＨＰｓ）は
、アフリカツメガエルアミロリド感受性チャンネルに似たタンパク質である、ヒ
トＡＰＸＬタンパクの典型的な構造モチーフを共有している。本明細書に記載し
た新規なヒト核酸配列は、１９０、１０８および１３３アミノ酸配列長（それぞ
れ配列番号２、４および６参照）のタンパク質をコードする。発明の詳細な記述 本明細書に初めて記載したＮＨＰｓは、とりわけヒト細胞株、およびヒト乳腺
、唾液腺、肝臓、腎臓及び肺細胞において発現している新規なタンパクである。
記載した配列は、ジーントラップｃＤＮＡおよびヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリー
（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ,ＭＤ）より分
離したクローンから編集された。本発明は下記のものを包含する。配列表に示し
たヌクレオチド、それらのヌクレオチドを発現する宿主細胞、およびそれらのヌ
クレオチドの発現生成物、ならびに：（ａ）特に前記ＮＨＰｓを含む前記遺伝子
生成物の哺乳動物相同体をコードするヌクレオチドおよびＮＨＰ生産物；（ｂ）
機能性ドメインに相当するＮＨＰの１以上の部分をコードするヌクレオチド、お
よびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド生成物（いずれか
の活性ドメイン（１以上の）の新規領域が含まれるが、それらに限定されない）
；（ｃ）前記ＮＨＰの遺伝子工学的に形成した変異形または天然の変異形であっ
て、少なくとも１つのドメインの全部または一部が欠失または変化したものをコ
ードする単離ヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定される
ポリペプチド生成物（シグナル配列の全部または一部を欠失する可溶性タンパク
質およびペプチドが含まれるが、それらに限定されない）；（ｄ）ＮＨＰのコー
ド領域の全部または一部、または他のペプチドまたはポリペプチドに融合したそ
のドメインの一つ（たとえば受容体結合ドメイン、アクセサリータンパク質／自
己結合ドメインなど）を含むキメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド；
または（ｅ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム
、二本鎖ＲＮＡ、または配列表に開示した新規配列を含む遺伝子治療構成物のよ
うな、前記ポリヌクレオチドの治療上または診断上の派生物、を含む。

【０００２】 上述のように、本発明は、（ａ）配列表に示したヒトＤＮＡ配列（および、そ
れを含むベクター）、および配列表に示したＤＮＡ配列の相補配列に高緊縮条件
下で［たとえば０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーシ
ョン、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｙ
＆ Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズし、機能
的に均等な遺伝子生成物をコードする、連続したＮＨＰオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）をコードするいかなるヌクレオチド配列が考慮される。さらに
、配列表に示したアミノ酸配列をコードおよび発現するＤＮＡ配列の相補配列に
中等度緊縮条件下でハイブリダイズし［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ Ｓ
ＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，前掲）］、
なおかつ機能的に均等なＮＨＰ遺伝子生成物をコードする、いかなるヌクレオチ
ド配列も考慮される。ＮＨＰの機能均等物には、他の種に存在する天然ＮＨＰ、
および天然の、または遺伝子工学的に作成した変異ＮＨＰ（部位特異的変異誘発
、遺伝子シャフリング、たとえばＵＳＰ５，８３７，４５８に記載される特異的
進化による）が含まれる。本発明には、開示したＮＨＰポリヌクレオチド配列の
縮重核酸バリアントも含まれる。

【０００３】 本発明には、前記ＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、した
がって前記ＮＨＰ遺伝子の相補配列である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含
まれる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、前記のように高緊縮であっ
てもよく、または緊縮度がより低くてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレ
オチド（”ＤＮＡオリゴ体”）である場合、その分子は一般的に約１６〜約１０
０塩基、約２０〜約８０塩基、または約３４〜約４５塩基の長さ、または本発明
の配列表に初めて開示した配列の連続領域を含む、そこに示すサイズの任意の変
更または組合わせである。そのようなオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）に関連して用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの
単離、クローニングおよび配列決定の鋳型調製などができる。

【０００４】 あるいは、そのようなＮＨＰオリゴヌクレオチドを、ライブラリーのスクリー
ニングおよび遺伝子発現パターンの評価のためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いることができる（特にマイクロアレイまたはハイスループット”チ
ップ”フォーマットを用いて）。さらに、一連の前記ＮＨＰオリゴヌクレオチド
配列またはその相補配列を用いて、前記ＮＨＰ配列の全部または一部を発現させ
ることができる。一般に長さ約１６〜約４０（または前記範囲のうちの任意の自
然数）ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが互いに部分的にオーバーラップして
もよく、および／またはオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを用いてＮＨ
Ｐ配列を発現させることができる。したがって前記ＮＨＰポリヌクレオチド配列
は一般に、それぞれ本明細書の配列表に初めて開示した、少なくとも約１８、好
ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの長さの別個のオリゴヌクレオチドを少
なくとも約２つまたは３つ含むはずである。そのようなオリゴヌクレオチド配列
は、配列表中の配列内に存在するいずれかのヌクレオチドから始まり、前記配列
に対してセンス（５’−から−３’へ）配向またはアンチセンス配向のいずれで
進行してもよい。

【０００５】 オリゴヌクレオチドプローブに関して、高緊縮条件とは、たとえば６×ＳＳＣ
／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ体について）、
４８℃（１７塩基オリゴ体について）、５５℃（２０塩基オリゴ体について）、
および６０℃（２３塩基オリゴ体について）での洗浄を表す。これらの核酸分子
は、たとえばＮＨＰ遺伝子調節に有用なＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子をコード
し、またはそれらの分子として作用することができる（ＮＨＰ遺伝子核酸配列の
増幅反応におけるアンチセンスプライマーを得るために、および／またはアンチ
センスプライマーとして）。ＮＨＰ遺伝子調節に関しては、それらの方法を用い
て生物学的機能を調節することができる。さらに、そのような配列を、同様にＮ
ＨＰ遺伝子調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として
使用できる。

【０００６】 阻害的アンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記を含めた群（こ
れらに限定されない）から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分を含むこと
ができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、
５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５
−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチ
ル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロ
ウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペン
テニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル
グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５
−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメ
チルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マ
ンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキ
シウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−
オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−
チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウ
ラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラ
シル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミ
ノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，
６−ジアミノプリン。

【０００７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノー
ス、キシルロースおよびヘキソースを含めた（これらに限定されない）群から選
択される少なくとも１個の修飾糖部分を含むこともできる。

【０００８】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデー
ト、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル
およびホルムアセタール、またはその類似体よりなる群から選択される少なくと
も１個の修飾リン酸主鎖を含む。

【０００９】 さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオ
リゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−単位
と異なり、鎖が互いに平行に走行する特異的な二本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮ
Ａと形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは２’−
Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−
ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）である。あるいは、二本鎖ＲＮＡは標的ＮＨＰの発現お
よび作用を破壊するために使用しうる。

【００１０】 本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば
自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。一例として、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎらの方法（１９８８，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：３２０９）により合成でき、メチルホスホ
ネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる
（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７４４８−７４５１）など。

【００１１】 低緊縮条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する個
々の生物に応じて異なるが、推定可能であろう。そのような条件に関する手引き
については、たとえば下記を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，
１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（およびその定期的改訂版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１
９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓおよ
びＷｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク。

【００１２】 あるいは、適切な緊縮条件を採用し、またはＰＣＲにより、ヒトゲノムライブ
ラリーをスクリーニングするために、適切に標識したＮＨＰヌクレオチドプロー
ブを用いることができる。ヒトゲノムクローンの同定および解明は、多型性の確
認（ヌクレオチドリピート、ミクロサテライト対立遺伝子、単一ヌクレオチド多
型性、またはコーディング単一ヌクレオチド多型性に限定されないが、これらを
含む。）、特定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造の決定、および診断試験の
設計に有用である。たとえばヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接する
領域に由来する配列を用いて、エクソン、イントロン、スプライス部位（たとえ
ばスプライスアクセプターおよび／またはドナー部位）内などの変異を検出する
ための増幅アッセイに用いるプライマーを設計し、これらを診断および薬理ゲノ
ミックに使用できる。

【００１３】 さらに、本明細書に記載するＮＨＰ産物内のアミノ酸配列に基づいて設計した
２つの縮重または“オブル（ｗｏｂｂｌｅ）”オリゴヌクレオチドプライマープ
ールを用いてＰＣＲを行うことにより、目的生物の核酸からＮＨＰ遺伝子相同配
列を単離できる。反応の鋳型は、ＮＨＰ遺伝子／対立遺伝子を発現することが分
かっているかまたは推測される、例えば前立腺あるいは乳腺のような、ヒトまた
は非ヒト細胞系または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写により得られる全ＲＮ
Ａ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡであってよい。増幅配列が目的ＮＨＰ遺伝
子の配列であることを確認するために、ＰＣＲ生成物をサブクローニングして配
列決定することができる。次いでそのＰＣＲフラグメントを用いて多様な方法で
全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。たとえば増幅フラグメントを標識し、ｃＤ
ＮＡライブラリー、たとえばバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングに使用できる。あるいは、標識フラグメントを用いて、ゲノムライブラ
リーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離することができる。

【００１４】 ＰＣＲ法を利用して、全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。たとえば標
準法により、適切な細胞源または組織源（すなわち、ＮＨＰ遺伝子を発現するこ
とが分かっているかまたは推測されるもの、たとえば脳組織）からＲＮＡを単離
できる。このＲＮＡについて、最も５’末端の増幅フラグメントに特異的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを第１鎖合成のプライミングに用いて、逆転写（ＲＴ
）反応を行うことができる。次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標準
的なターミナルトランスフェラーゼ反応により”テイル形成”し、このハイブリ
ッドをＲＮａｓｅ Ｈで消化し、次いで相補プライマーにより第２鎖合成をプラ
イミングすることができる。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配列
を単離できる。使用できるクローニング方式の概説については、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（前掲）を参照されたい。

【００１５】 変異ＮＨＰ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、たとえばＰＣＲを用いて単離でき
る。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有すると推定され
る個体において発現することが分かっているかまたは推測される組織から単離し
たｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、この新
たな鎖を逆転写酵素で延長することにより合成できる。次いで正常遺伝子の５’
末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、第２ｃＤＮＡ
鎖を合成する。次いでこれら２プライマーを用いて、生成物をＰＣＲにより増幅
させ、所望により適切なベクター中へクローニングし、当業者に周知の方法でＤ
ＮＡ配列分析を行う。変異ＮＨＰ対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なＮＨＰ対立遺
伝子のものと比較することにより、変異ＮＨＰ遺伝子生成物の機能の喪失または
変化に関与する変異（１以上）を確認できる。

【００１６】 あるいは、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかもしくは分か
っている個体（例えば、肥満、高血圧などのＮＨＰ関連表現形を呈示しているヒ
ト）から得たＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを構築することができ、または
変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分かっているかもしくは推測される組織
からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。次いで、
正常なＮＨＰ遺伝子、またはそのいずれか適切なフラグメントを標識してプロー
ブとして用い、そのようなライブラリー中の対応する変異ＮＨＰ対立遺伝子を同
定することができる。次いで、確立されている方法で変異ＮＨＰ遺伝子配列を含
むクローンを精製し、配列分析することができる。

【００１７】 さらにたとえば、変異対立遺伝子を保有することが推測されるかまたは分かっ
ている個体の、変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推
測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、発現ライブ
ラリーを構築できる。この方法で、推定変異組織が形成した遺伝子生成物を発現
させ、正常ＮＨＰ生成物に対して産生された抗体と組み合わせた標準抗体スクリ
ーニング法を用いてスクリーニングしうる（スクリーニング法については、たと
えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ編，１９８８，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプリング・ハーバー，参照）。

【００１８】 さらに、標識ＮＨＰ融合タンパク質、たとえばＡＰ−ＮＨＰまたはＮＨＰ−Ａ
Ｐ融合タンパク質を用いてスクリーニングを行うことができる。ＮＨＰ融合によ
り機能の変化した遺伝子生成物が発現する場合（たとえばミスセンス変異または
フレームシフト変異の結果）、ＮＨＰに対するポリクローナル抗体が対応する変
異ＮＨＰ遺伝子生成物と交差反応すると思われる。それらとそのような標識抗体
との反応により検出されるライブラリークローンを当業者に周知の方法で精製し
、配列分析することができる。

【００１９】 本発明は下記のものをも包含する：（ａ）前記ＮＨＰコード配列および／また
はそれらの相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター
；（ｂ）コード配列の発現を指令する調節要素に機能可能な状態で結合した前記
ＮＨＰコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター；（ｃ）宿主細胞におけ
るコード配列の発現を指令する調節要素に機能可能な状態で結合した前記ＮＨＰ
コード配列のいずれかを含む、遺伝子工学的に処理した宿主細胞；ならびに（ｄ
）内因性ＮＨＰ遺伝子を外から導入した調節要素による制御（すなわち遺伝子活
性化）下で発現する、遺伝子工学的に処理した宿主細胞。本明細書中で用いる調
節要素には、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレータ
ー、ならびに発現を駆動および調節することが当業者に知られている他の要素が
含まれるが、これらに限定されない。それらの調節要素には、下記のものが含ま
れるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルスｈＣＭＶ極初期遺伝子の
調節可能なウイルス（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター）、ＳＶ４０アデ
ノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、Ｔ
ＲＣ系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコート
タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモー
ター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子のプロモー
ター、並びに転写因子。

【００２０】 本発明は下記のものをも包含する：抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ
フラグメントが含まれる）、ＮＨＰのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならび
にＮＨＰ遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築体（転写因子
阻害薬、アンチセンス分子およびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配
列置換構築体）、またはＮＨＰの発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド（
たとえばＮＨＰのコード配列がプロモーター、プロモーター／エンハンサーなど
の発現制御要素と機能可能な状態で結合した発現構築体など）。

【００２１】 ＮＨＰｓもしくはＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、およびＮＨＰヌク
レオチド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾病の診断のために
変異ＮＨＰｓまたは不適正発現したＮＨＰｓを検出するのに有用となりうる。前
記ＮＨＰタンパク質またはペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチ
ド配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、および遺伝子工
学的に処理した細胞および動物は、体内における正常なＮＨＰ機能の撹乱の症候
性発現または表現型発現を処理するのに有効な候補を同定する薬物スクリーニン
グ（またはコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニング）
にも使用できる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞および／または動物の使用は
、それらの系によりＮＨＰに対する内在性受容体と結合できる化合物を同定でき
るだけでなく、ＮＨＰ仲介情報伝達の引金を引く（トリガーする）化合物をも同
定できるという点で、有利である。

【００２２】 最後に、ＮＨＰ生成物は治療として用いることができる。例えば、ＮＨＰに対
応するＮＨＰペプチド／ドメインのような可溶性誘導体、ＮＨＰ融合タンパク質
生成物（特にＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰの融合
またはドメイン）、ＮＨＰ抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメン
トを含める）、アンタゴニストまたはアゴニスト（ＮＨＰ仲介情報伝達経路にお
ける下流ターゲットで作用する情報伝達を制御する化合物を含む）を用いて、疾
病または障害を直接に処置することができる。たとえば、有効量の可溶性ＮＨＰ
、またはＮＨＰを模倣するＮＨＰ−ＩｇＦｃ融合タンパク質もしくは抗イディオ
タイプ抗体（またはそのＦａｂフラグメント）の投与により、内因性ＮＨＰ受容
体を活性化または中和することができるであろう。そのようなＮＨＰ生成物をコ
ードするヌクレオチド構築体を用いて、そのような生成物をインビボで発現する
ように宿主細胞を遺伝子工学的に処理することができる；遺伝子工学的に処理し
たこれらの細胞は体内で”バイオリアクター”として作用し、ＮＨＰ、ＮＨＰペ
プチド、またはＮＨＰ融合タンパク質を身体に連続的に供給する。機能性ＮＨＰ
、変異ＮＨＰ、ならびにアンチセンス分子およびリボザイム分子をコードするヌ
クレオチド構築体は、ＮＨＰ発現を調節する”遺伝子療法”方式にも使用できる
。したがって本発明は、生物学的障害を処置するための医薬配合物および方法を
も包含する。

【００２３】 ノックアウトＥＳ細胞クローンが、記載したＮＨＰの類似体をコードするマウ
ス遺伝子を用いて調製された。 本発明の多様な態様について、以下の各サブセクションにさらに詳細に記載す
る。 ４．１ ＮＨＰ配列 前記ＮＨＰのｃＤＮＡ配列（配列番号１、３および５）および相当する推定ア
ミノ酸配列（配列表２，４、および６）を配列表に示す。ＮＨＰ遺伝子は、ヒト
遺伝子トラップした配列タグから得られたプローブおよび／またはプライマーを
使用して、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから得られた。発現解析により、前記
ＮＨＰは、ヒト肝臓、乳腺、唾液腺、肺がんおよび遺伝子トラップヒト細胞にお
いて発現可能であることが示された。ヒトＡＰＸＬ遺伝子（アピカル様タンパク
）に加えて前記ＮＨＰｓは、様々な種の分泌性タンパク質、チロシンホスファタ
ーゼ、様々なヒトＬＩＭタンパク質、並びに様々な癌（腸、腎臓および肺）関連
抗原とかなりの類似性を有する。

【００２４】 前記オープンリーディングフレームは、その５’末端でタンデムメチオニンを
コードする。そのタンパク質の最初の２つのメチオニンの２番目が翻訳開始に用
いられ、配列表に示したタンパク質のそれぞれは、アミノ末端の一アミノ酸分短
くなるであろう。

【００２５】 ４．２ ＮＨＰｓおよびＮＨＰポリペプチド ＮＨＰｓ、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、変異、トランケートもしく
は欠失形のＮＨＰｓ、および／またはＮＨＰ融合タンパク質を、多様な用途のた
めに調製することができる。これには、抗体産生、診断アッセイにおける試薬と
して、ＮＨＰに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定、精神的、生物学的または
医学的な障害および疾病の療法処置に有用な医薬として使用し得る化合物のスク
リーニングのためのアッセイにおける試薬としての用途が含まれるが、これらに
限定されない。

【００２６】 配列表に、前記ＮＨＰ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を開示する。Ｎ
ＨＰｓは、翻訳開始部位に一致するＤＮＡ配列コンテクストにイニシエーターメ
チオニンをもつ。本明細書に示した配列データは、存在するＮＨＰｓの可能なス
プライスされた形を示している（それは組織特異的であるか、もしくはそうでな
いこともある）。

【００２７】 本発明のＮＨＰアミノ酸配列には、配列表に示したヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体を含む。さらに、他の種に由来す
る対応するＮＨＰ相同配列も本発明に包含される。事実、上述のＮＨＰヌクレオ
チド配列によってコードされるいずれかのＮＨＰタンパクは、本発明の範囲に含
まれ、配列表に示したアミノ酸配列の全部またはいずれかの新規部分をコードす
る新規ポリヌクレオチド配列も同様に本発明に含まれる。遺伝子コードの縮重性
は周知であり、したがって配列表に示した各アミノ酸はそのアミノ酸をコードし
うる周知の核酸”トリプレット”コドン（または多くの場合コドン類）の一般的
代表例である。したがって、本明細書で意図するように、配列表に示したアミノ
酸配列は、遺伝子コード（たとえば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ”，１９８６，Ｊ．Ｄａｒｎｅｌｌら編，ｐ．１０９，表４−１参照，Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク州ニューヨ
ーク；本明細書に参考として援用）を合わせて考慮すると、そのようなアミノ酸
配列をコードしうる核酸配列の種々の変形および組合わせすべてのうちの一般的
代表例である。

【００２８】 本発明は、多数の基準のいずれかにより判定して、本明細書に記載したヌクレ
オチド配列がコードするＮＨＰに機能的に均等なタンパク質をも包含する。これ
らの基準には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＮＨＰの受容体
またはリガンドと結合する能力；均等もしくは相補的な信号伝達系もしくは細胞
代謝の変化に影響を与える能力（たとえば、イオンフラックス、チロシンリン酸
化など）。そのような機能的に均等なＮＨＰタンパク質には、上述のＮＨＰヌク
レオチド配列がコードするアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加体または置換体
であって、ただしサイレント変化を生じ、したがって機能的に均等な遺伝子生成
物を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、関与
する残基の極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／または両親媒性の類似
性に基づいて行うことができる。たとえば非極性（疎水性）アミノ酸残基にはア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリ
プトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン
、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ
；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが
含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアルギニン酸およびグルタミン酸が
含まれる。

【００２９】 多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発
現させることができる。ＮＨＰペプチドまたはポリペプチドが、例えば膜タンパ
ク（例えば、ＮＨＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から得られたＮＨＰペプチド、
あるいは膜内外（ＴＭ）および／または細胞質ドメイン（ＣＤ）が除去させてい
る切形もしくは欠失ＮＨＰｓ等）の可溶性誘導体の場合は、ペプチドまたはポリ
ペプチドを培地から、採集することができる。すなわち、ＮＨＰペプチドもしく
はポリペプチドが細胞から分泌されない場合には宿主細胞から、もしくはＮＨＰ
ペプチドもしくはポリペプチドが細胞から分泌される場合に培養媒体から採集す
ることができる。しかしそのような発現系には、ＮＨＰまたはその機能均等物を
ｉｎ ｓｉｔｕすなわち細胞膜内で発現する、工学的に処理した宿主細胞も包含
される。そのような発現系からのＮＨＰの精製または富化は、適切な界面活性剤
および脂質ミセル、ならびに当業者に周知の方法を用いて行うことができる。し
かし、ＮＨＰの構造特性および機能特性を維持するだけでなく、たとえば薬物ス
クリーニングアッセイにおいて生物学的活性を評価することが重要である場合、
そのような工学的に処理した宿主細胞自体を使用できる。

【００３０】 本発明の目的に使用できる発現系には下記のものが含まれるが、それらに限定
されない：ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、た
とえば細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
））；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵
母（たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃ
ｈｉａ））；ＮＨＰ配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロ
ウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコ
モザイクウイルス，ＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベク
ター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細
胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）
または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後期
プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構
築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２３９、３Ｔ
３）。

【００３１】 細菌系では、発現するＮＨＰ生成物について意図する用途に応じて、多数の発
現ベクターを有利に選択できる。たとえばＮＨＰを含有する医薬組成物を調製す
るために、あるいはＮＨＰに対する抗体を産生させるために、そのようなタンパ
ク質を大量に製造したい場合、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベ
ル発現を指令するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには下記
のものが含まれるが、それらに限定されない：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８
（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ Ｊ．，２：１７９１）、
この場合、ＮＨＰコード配列を個々に、融合タンパク質が産生されるようにｌａ
ｃＺコード領域と読み枠を一致させて、ベクターにライゲートさせることができ
る；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３
−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させること
もできうる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からグ
ルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下での
溶離によって、容易に精製できる。ＰＧＥＸベクターがトロンビンまたはＸａ因
子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計し、これにより、クローン化したター
ゲット遺伝子生成物をＧＳＴ部分から放出させることができる。

【００３２】 昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドロー
シスウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（Ａ
ｃＮＰＶ）を外来遺伝子発現のためのベクターとして用いる。ウイルスはＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。ＮＨＰ遺伝子コード
配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内へクロー
ン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御
下におく。ＮＨＰ遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子が
不活性化され、ノンオクルーデッド（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイル
ス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性コートをもたない
ウイルス）が産生されるであろう。次いでこれらの組換えウイルスをＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の感染に用い、ここで挿入遺伝子を発現
させる（たとえばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６
：５８４；Ｓｍｉｔｈ，ＵＳＰ４，２１５，０５１参照）。

【００３３】 哺乳動物宿主細胞の場合、多数のウイルス性発現系を利用できる。アデノウイ
ルスを発現ベクターとして用いる場合、目的とするＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配
列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三
部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせることができる。
次いでこのキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイル
スゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ
３）に挿入すると、生存可能な、感染宿主においてＮＨＰ生成物を発現しうる組
換えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９）。
挿入したＮＨＰ遺伝子ヌクレオチド配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナル
が必要な可能性もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配
列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ＮＨＰ遺伝子また
はｃＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナルは必
要ないかもしれない。しかしＮＨＰコード配列の一部のみを挿入する場合、外因
性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）を供給しなければな
らない。さらに、挿入配列全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが目的コ
ード配列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル
および開始コドンは、天然および合成のいずれでも、多様な由来のものであって
よい。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを取り込ませるこ
とにより、発現効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４）
。

【００３４】 さらに、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子生成物を目的とする特定の様
式で修飾およびプロセシングする、宿主細胞系統を選ぶことができる。タンパク
質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たと
えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タン
パク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的
な機序をもつ。発現した外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実
にするために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。このために、一
次転写体の適正なプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化の
ための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞
にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３
、ＷＩ３８、特にヒト細胞系が含まれるが、これらに限定されない。

【００３５】 組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。たと
えば前記ＮＨＰ配列を安定に発現する細胞系を工学的に作成し得る。ウイルス起
源の複製を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御要素（たとえ
ばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位
など）により制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来Ｄ
ＮＡの導入後、工学的に作成した細胞を富化培地で１〜２日間増殖させ、次いで
選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択性マーカーが選択に対する耐
性を与え、細胞はそのプラスミドを細胞の染色体に安定に組み込むことができ、
増殖してフォーカスを形成する。次いでこれをクローン化し、細胞系に拡張する
ことができる。この方法は、目的ＮＨＰ生成物を発現する細胞系を工学的に作成
するのに有利に使用できる。このような工学的に作成した細胞系は、ＮＨＰ生成
物の内因活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であ
る。

【００３６】 多数の選択系を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定さ
れない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．
，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９
６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６）、お
よびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ ａｌ．，１
９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-また
はａｐｒｔ^-細胞に使用できる。代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎
として用いることもできる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を
与える（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミ
コフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９
８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；ｎ
ｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒ
ｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。

【００３７】 あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、い
かなる融合タンパク質も容易に精製し得る。たとえばＪａｎｋｎｅｃｈｔらが記
載した系は、ヒト細胞系において発現した非変性融合タンパク質を容易に精製で
きる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的遺伝
子をその遺伝子のオープンリーディングフレームが翻訳可能な状態で６ヒスチジ
ン残基からなるアミノ末端タグに融合するように、ワクシニア組換えプラスミド
内へサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの
抽出物をＮｉ²⁺・ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装填し、ヒスチジンタグ付
きタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。

【００３８】 ４．３ ＮＨＰ産物に対する抗体 １以上のＮＨＰのエピトープ、またはＮＨＰの保存バリアントのエピトープ、
またはＮＨＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明に包含
される。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’
）₂フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗
イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合性フ
ラグメントが含まれるが、それらに限定されない。

【００３９】 本発明の抗体は、たとえば生物学的試料中のＮＨＰの検出に使用でき、したが
って患者を異常な量のＮＨＰについて調べる診断法または予後法の一部として使
用できる。そのような抗体を、たとえばセクション５．５に示すような化合物ス
クリーニング法と組み合わせて、またはＮＨＰ遺伝子生成物の発現および／また
は活性に対する被験化合物の作用を評価するのにも利用できる。さらに、そのよ
うな抗体を遺伝子療法と組み合わせて用いて、たとえば正常な、および／または
工学的に処理したＮＨＰ発現細胞を患者に導入する前に評価することができる。
そのような抗体をさらに、異常なＮＨＰ活性の阻害方法として使用できる。した
がって、たとえばそのような抗体を治療法の一部として利用できる。

【００４０】 抗体産生のためには、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（たとえばＮＨＰの機能性ドメ
インに相当するもの）、トランケートＮＨＰポリペプチド（１以上のドメインが
欠失したＮＨＰ）、ＮＨＰの機能均等物、またはＮＨＰの変異配列を注射するこ
とにより、種々の宿主動物を免疫化することができる。数例を挙げると、そのよ
うな宿主動物にはブタ、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットが含まれるが、これ
らに限定されない。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために種々のアジュバ
ントを使用でき、これにはフロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物
ゲル、たとえば水酸化アルミニウム、界面活性剤、たとえばリゾレシチン、プル
ロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリ
ンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール
、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ
Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒｖｕｍが含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は免疫
化動物の血清から得られる不均一な抗体分子集団である。

【００４１】 特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、連続した培
養細胞系により抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができうる
。これらには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：Ｋｏｈｌｅｒお
よびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：
４９５−４９７；およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドー
マ法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄ
ａｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブ
リドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ社，ｐｐ．７７−９６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、
ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含めた、いかなる免疫グロブ
リンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビ
トロまたはインビボで培養することができる。インビボで高力価のｍＡｂを産生
できるので、これは現在好ましい産生方法である。

【００４２】 さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５
４）の産生のために開発された、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの
遺伝子を適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシ
ングすることによる方法を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物
種に由来する分子、たとえばネズミｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定
常部をもつものである。

【００４３】 あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（ＵＳＰ４，９４６，７
７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓ
ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，
Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４４−５４６）を、ＮＨＰ遺伝子生成物に対する一本
鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ
鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させ、一本鎖ポリペプチドにすることに
より形成される。

【００４４】 特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法で形成できる。
たとえばそのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により調製でき
るＦ（ａｂ’）₂フラグメント、およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィ
ド橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これら
に限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１２７５−１２８１）、目的
とする特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定す
ることができる。

【００４５】 次いでＮＨＰに対する抗体を利用し、当業者に周知の方法を用いて、そのＮＨ
Ｐを”模倣”した抗イディオタイプ抗体を産生させることができる（たとえばＧ
ｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ ａｎｄ Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５
）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１４７（８）：２４２９−２４３８参照）。たとえば、ＮＨＰドメインに
結合し、ＮＨＰがそのコグネイト受容体に結合するのを競合阻害する抗体を用い
て、ＮＨＰを”模倣”する、したがって受容体に結合して活性化または中和する
抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。そのような抗イディオタイプ
抗体またはそのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントは、ＮＨＰ調
節またはシグナリング経路を伴う療法に使用できる。

【００４６】 本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。これらの
態様は本発明の個々の態様を説明するために示したにすぎず、機能的に均等な方
法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に例示および記載し
たもののほか本発明の種々の変更が、以上の記載および添付の図面からから当業
者に明らかになるであろう。そのような変更も本発明の範囲に含まれる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ザンブロウィッチ，ブライアン アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ファイアースォーン・プレイ ス 18 (72)発明者 フリドリッチ，グレン アメリカ合衆国テキサス州77004，ヒュー ストン，ハーマン・ドライブ 2207，ブリ ランド・アンド・ブリランド (72)発明者 ネールス，ミヒャエル ドイツ国デ−82131 ストックドルフ，ポ ール−ケラー−シュトラーセ ６ (72)発明者 サンズ，アーサー・ティー アメリカ合衆国テキサス州77382，ザ・ウ ッドランズ，ブリストル・ベンド・サーク ル 163 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載の新規ＮＨＰ遺伝子中の少なくとも２４連
   続塩基のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイ
   ブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号３に記載の独特なＮＨＰ遺伝子中の少なくとも２４
   連続塩基のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
4. 【請求項４】 （ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号３のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイ
   ブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
5. 【請求項５】 配列番号５に記載の新規ＮＨＰ遺伝子中の少なくとも２４連
   続塩基のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
6. 【請求項６】 （ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列をコードし；かつ （ｂ）緊縮条件下で配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイ
   ブリダイズする ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。