JP2003507031A - 水生生物種由来の増殖分化因子−８の核酸およびポリペプチド、ならびにトランスジェニック水生生物種 - Google Patents

水生生物種由来の増殖分化因子−８の核酸およびポリペプチド、ならびにトランスジェニック水生生物種

Info

Publication number
JP2003507031A
JP2003507031A JP2001517662A JP2001517662A JP2003507031A JP 2003507031 A JP2003507031 A JP 2003507031A JP 2001517662 A JP2001517662 A JP 2001517662A JP 2001517662 A JP2001517662 A JP 2001517662A JP 2003507031 A JP2003507031 A JP 2003507031A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gdf
seq
polypeptide
aquatic organism
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001517662A
Other languages
English (en)
Inventor
リー，セ−ジン
マックフェロン，アレキサンドラ，シー．
Original Assignee
ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン filed Critical ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン
Publication of JP2003507031A publication Critical patent/JP2003507031A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/40—Fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 増殖/分化因子-8（GDF-8）の産生および/または活性の阻害をもたらす、水生生物の生殖細胞の染色体に組込まれたトランスジーンを有する、魚類、甲殻動物、軟体動物などのトランスジェニック非ヒト水生生物を開示する。このような水生生物を作成する方法、およびかかる水生生物に由来するGDF-8ポリペプチドをコードする核酸配列も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 発明の分野 本発明は、一般に増殖分化因子-8(GDF-8；GDF-8)に関し、特に様々な水生生物
に由来するGDF-8ポリペプチドをコードする核酸配列、ならびにGDF-8遺伝子の破
壊されたトランスジェニック水生生物およびその同等物を作製する方法に関する
。
【０００２】発明の背景の知見 トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)スーパーファミリーは、胚の発達の際
の広範に渡る分化過程に作用する構造的に関連のあるタンパク質群を包含する。
該ファミリーには、正常な雄性発達に必要なミューラー阻害物質(MIS)(Behringe
rら、Nature, 345: 167, 1990)、ショウジョウバエの背腹軸形成および成虫原基
の形態形成に必要なショウジョウバエのデカペンタプレージック(DPP)遺伝子産
物(Padgettら、Nature, 325: 81-84, 1987)、卵の植物極に局在するアフリカツ
メガエルVg-1遺伝子産物(Weeksら、Cell, 51: 861-867, 1987)、アフリカツメガ
エル胚における中胚葉および前部構造(anterior structure)の形成を誘導し得る
(Thomsenら、Cell,63：485, 1990)アクチビン(Masonら、Biochem. Biophys. Res
. Commun., 135: 957-964, 1986)、ならびに軟骨新生および骨形成を誘導し得る
(Sampathら、J. Biol. Chem., 265: 13198, 1990)骨形成タンパク質(BMP、 オス
テオゲニン、OP-1)が含まれる。TGF-βは、様々な分化過程(脂肪形成、筋形成、
軟骨形成、造血および上皮細胞の分化などを含む)に作用し得る(概説として、Ma
ssague, Cell 49: 437, 1987参照のこと)。
【０００３】 TGF-βファミリーのタンパク質は、まず大きな前駆タンパク質として合成され
、その後C末端から約110〜140アミノ酸のあたりにある塩基性残基のクラスター
でタンパク質分解酵素による切断が起こる。該タンパク質のC末端領域または成
熟領域は全て、構造的に関連しており、ファミリー内の異なるメンバーはこれら
の相同性の程度に基づいて個々のサブグループに分類することができる。特定の
サブグループ内での相同性はアミノ酸配列同一性が70〜90％の範囲であるが、サ
ブグループ間の相同性は、顕著にもっと低く、一般的にはわずか20％〜50％の範
囲内である。各場合において、活性な種は、C末端断片がジスルフィド結合で結
合した二量体であると考えられている。TGF-βファミリーのメンバーのプロ領域
をTGF-βファミリーの他のメンバーの成熟領域とともに共発現させた場合、細胞
内二量体形成および生物学的に活性なホモ二量体の分泌が起こる（Grayら、Scie
nce, 247: 1328, 1990）。Hammondsらによるさらなる研究では、BMP-2のプロ領
域をBMP-4の成熟領域と組み合わせて使用することにより、成熟BMP-4の発現が顕
著に向上することが示されている（Molec. Endocrinol. 5: 149, 1991）。研究
されたファミリーのメンバーのほとんどのものにおいて、ホモ二量体種が生物学
的に活性であることが判っているが、インヒビン（Lingら、Nature, 321: 779,
1986）およびTGF-β（Cheifetzら、Cell, 48:409, 1987）などのファミリーの他
のメンバーについては、ヘテロ二量体も検出されているものもあり、これらはそ
れぞれのホモ二量体とは異なる生物学的特性を有していると考えらている。
【０００４】 さらに、筋肉組織およびタンパク質の含量が相対的に高く、脂肪含量が低い、
家畜および狩猟動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびシチメンチョウ、魚
など）を産生することが望ましい。筋肉およびタンパク質含量の増加を助長し、
望ましくない高脂肪および/または高コレステロールレベルを低下させる多くの
薬剤および食餌療法があるが、このような処置は、一般に事後処置であり、脈管
構造に顕著な障害が起こった後にのみ始められる。したがって、遺伝学的に、よ
り高筋肉含量で、かつ高脂肪レベルが関連して増加することのないように前もっ
て遺伝学的に処理した動物を産生することが望ましい。
【０００５】 食品産業は、食品材料中の筋肉量およびタンパク質量を向上させることに多く
の労力を費やしてきた。この試みは、合成食品材料の製造では比較的簡単である
が、動物性食品材料の製造においては成功には限界がある。例えば、牛肉および
家禽製品のコレステロールレベルを下げる試みは、動物飼料の中にコレステロー
ル低下剤を含ませることにより行われてきた（ElkinおよびRogler, Agric. Food
Chem. 38: 1635-1641, 1990等参照のこと）。しかし、動物性食品中で筋肉を増
加させ、脂肪とコレステロールレベルを低減するためのより効果的な方法が求め
られている。
【０００６】 米国の海産食品の市場は大きく、一人当たり（per capita）の海産食品の消費
量は、この10年間で23％増大している。この10年間、海産食品の消費者価格指数
は、244％跳ね上ったが、赤身の肉の値段はその半分しか上がっていない。野生
の魚および貝類および甲殻類の数は捕獲量のレベルを維持して管理するという努
力にも関わらず、米国では、漁業者が産生する量よりますます大量に消費されて
おり、資源が枯渇してきている。全世界の漁師は、2000年において1億1400万メ
ートルトンの需要の見積もりに対して、9000万メートルトンしかかなわないと思
われる（Harvey, 1990）。
【０００７】 遺伝子転移技術は、動物および植物の両方において、遺伝形質および表現形質
を操作するための新しい有力な手法となってきた。トランスジェニック魚および
他の水生生物の産出に関する多くの報告がなされている。魚のトランスジェニッ
クに関する最初の研究は、Vielkindら（1982）によって報告された。この研究者
達は、プラティフィッシュ(Platyfish)にスウォードテール腫瘍（swordtail tum
or）遺伝子を注入して、注入されたスウォードテールTu遺伝子がTuの無いプラテ
ィフィッシュでT-メラニン保有細胞誘導を誘発し得ることを見出した。1985およ
び1986年には、Zhuらが、成長ホルモン遺伝子の転移によりトランスジェニック
魚の産生を報告した。ヒトGH構造遺伝子に連結した水生生物のメタロチオネイン
プロモーターを用いて、トランスジェニックのドジョウ、キンギョおよびシルバ
ーカープ（silver carp）を産生することができた。平均して、トランスジェニ
ック魚は、対照より1倍から3倍大きかった。その後、同様の遺伝子構築物を用い
た研究報告が幾つか公開された（Rokkonesら、1989, Guyomardら、1989、Chenら
、1990）。
【０００８】発明の概要 本発明は、水生生物細胞の増殖分化因子GDF-8ポリペプチドおよびその機能的
ペプチド部分、かかるGDF-8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
およびGDF-8ポリペプチドまたはそのエピトープに対する特異的な免疫応答性を
有する抗体を提供する。GDF-8の発現は、種々の細胞増殖障害、特に、筋肉、神
経または脂肪組織などにおける細胞増殖障害に関与し得る。
【０００９】 他の実施形態では、本発明は、食品の原料として有用な、高い筋肉およびタン
パク質含量を有するか、脂肪およびコレステロール含量が低減されているか、ま
たはこれらの両方を備えた、非ヒトトランスジェニック動物、特に水生生物を提
供する。このようなトランスジェニック動物は、生殖細胞および体細胞において
染色体が改変されていることにより、GDF-8の産生が低下しているか、または完
全に阻害されている。このような動物は、その系統においてGDF-8レベルの低減
および正常なレベルより高レベルの筋肉組織を示し得、好ましくは、脂肪および
/またはコレステロールレベルは増加しない。したがって、本発明は、このよう
な遺伝子改変水生生物から得られる食品も提供する。このような食品は、筋肉組
織量が相対的に高いために、栄養価が増大している。本発明のトランスジェニッ
ク動物には、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジおよびトリなどの動物が含まれ、特に
トランスジェニック水生生物には、例えば、鰭魚(finfish)、カエル、エビ、ロ
ブスター、カニ、イカ、カキおよびアワビなどが含まれる。
【００１０】 他の実施形態では、GDF-8のセンス配列もしくはアンチセンス配列、またはこ
の両方をコードするポリヌクレオチドの導入は、目的とするトランスジーンをコ
ードする核酸配列の水生生物の受精卵（例えば、アワビまたは魚の受精卵）内へ
のエレクトロポレーションにより達成される。典型的には、核酸配列は制御配列
に隣接しており、該制御配列によりトランスジェニック生物内での該DNA配列の
発現が可能となる。
【００１１】 本発明は、筋肉含量の増加した動物性食品を製造する方法もまた提供する。該
方法は、動物、特に水生生物の前核胚の生殖細胞の遺伝子構造を改変し、該胚を
偽妊娠雌性体の卵管に移植することにより、該胚を満期産の子孫にまで成熟させ
、該子孫をトランスジーンの存在について試験して、トランスジーン陽性の子孫
を特定し、トランスジーン陽性の子孫を交配して、トランスジーン陽性のさらな
る子孫を得、そして、その子孫を処理して食品を得ることを含む。生殖細胞の改
変は、遺伝子組成を改変して、GDF-8タンパク質を産生するためのGDF-8タンパク
質をコードする天然に存在する遺伝子の発現を阻害または低減させることを含む
。ある実施形態では、トランスジーンは、GDF-8タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドのアンチセンスヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、トラン
スジーンは、天然型GDF-8遺伝子を置換するかその中に介入する非機能的配列を
含むか、または、またはドミナントネガティブ型GDF-8タンパク質をコードする
ものである。
【００１２】 本発明はまた、筋肉量の増加した水生生物食品を生産する方法を提供する。該
方法は、水生生物の前核胚の生殖細胞の遺伝子構造を改変して、該胚を適切な偽
妊娠雌性体の卵管に移植し、子孫が誕生する条件下で該胚を培養し、該子孫をト
ランスジーンの存在について試験して、遺伝子改変の子孫を特定し、トランスジ
ーン陽性の子孫を交配し、そして、その子孫を処理して食品を得ること、を含む
。
【００１３】 本発明はまた、水生生物由来のGDF-8またはその一部分のペプチドをコードす
る単離されたポリヌクレオチド、およびかかる配列によりコードされるポリペプ
チドを提供する。また、かかるポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主
細胞もまた本発明に包含される。実施例により、ゼブラフィッシュ、サケ、タラ
、ハタ、タイおよびベラ（tautog）などの鰭魚のGDF-8（それぞれ、配列番号28
、30、32、42、44、46および48）ならびにカエルGDF-8（配列番号50）をコード
するポリヌクレオチドが提供される。
【００１４】 本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、後述の本発明の詳細な説明を
、添付の図面を参照しながら読むと、より十分に理解されるであろう。
【００１５】詳細な説明 本発明は、水生生物由来の増殖分化因子-8ポリペプチド(GDF-8；ミオスタチン
)、その一部分のペプチド、および係るGDF-8ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。GDF-8は、筋肉内では高レベルで発現し、脂肪組織内で低
レベルで発現している。
【００１６】 本明細書に開示するとおり、GDF-8ポリペプチドおよびコードポリヌクレオチ
ドの同定ならびに単離は、特に、筋肉重量の増加、脂肪量の減少、またはこれら
の両方により、非ヒト動物の成長特性を制御するための手段を提供する。本発明
の実施において使用するために考えられる動物は、例えば、肉用種および産卵種
のニワトリならびにシチメンチョウを含む鳥類、食肉用子羊を含むヒツジ、食肉
用牛および乳牛などの牛類、および豚等を含む、食用品の加工に有用であると一
般に見なされている動物である。特に、水生生物（例えば、魚類（piscine））
は、本発明の方法への使用が考えられる。本発明の目的には、動物の生殖細胞の
染色体に組み込まれた異種DNA配列、または動物にとって通常内在性である１種
以上の他のDNA配列（本明細書中「トランスジーン」と総称して呼ぶ）を動物が
有している場合、このような動物を「トランスジェニック」と呼ぶ。トランスジ
ェニック動物（その子孫を含む）はまた、体細胞の染色体に偶発的に組み込まれ
たトランスジーンを有する。
【００１７】 TGF-βスーパーファミリーは、多くの型の細胞において、増殖、分化およびそ
の他の機能を制御する多機能なポリペプチドで構成されている。このペプチドの
多くは、他のペプチド性増殖因子に対する正または負のどちらかの制御作用を有
する。本発明のGDF-8ポリペプチドとTGF-βファミリーのメンバーとの間にある
構造相同性は、GDF-8が増殖および分化因子のTGF-βファミリーのメンバーであ
ることを示唆している。他のメンバーの多くの公知の活性に基づくと、GDF-8は
診断薬および治療薬として有用な生物学的活性を有していると考えることができ
る。
【００１８】 特に、TGF-βスーパーファミリーのあるメンバーは、神経組織の機能に関連す
る発現パターンを有するか、または神経組織の機能に関連する活性を有している
。例えば、インヒビンおよびアクチビンは、脳で発現されており（Meunierら、P
roc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 247, 1988; Sawchenkoら、Nature, 334: 615
, 1988)、アクチビンは神経細胞生存分子として機能し得る（Schubertら、Natur
e, 344: 868, 1990)。ファミリーの他のメンバーであるGDF-1は、その発現パタ
ーンは神経組織特異的であり（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 4250
, 1991)、かつVgr-1(Lyonsら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 4554, 1989;
Jonesら、Development, 111: 531, 1991)、OP-1（Ozkayanakら、J. Biol. Chem
., 267: 25220, 1992)、およびBMP-4（Jonesら、Development, 111: 531, 1991)
などの、ファミリーの他のメンバーも、神経組織に発現されている。骨格筋が運
動ニューロンの生存を促進する因子を産生することがわかっているので（Brown,
Trends Neurosci., 7: 10; 1984)、筋肉におけるGDF-8の発現は、GDF-8が神経
に対する栄養因子として作用し得ることを示唆している。このように、GDF-8は
、筋萎縮性側索硬化症または筋ジストロフィーなどの神経変性疾患の治療、およ
び移植前の培養中の細胞または組織の維持に有用であり得る。
【００１９】 GDF-8はまた、筋変性疾患または外傷に起因する組織の修復などの筋肉に関す
る疾患プロセスの治療に有用である。この点で、TGF-βファミリーの他のメンバ
ーの多くは、組織の修復の重要なメディエーターでもある。TGF-8は、コラーゲ
ンの形成において顕著な作用を有し、新生マウスで顕著な血管形成応答をもたら
す（Robertsら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 4167, 1986)。TGF-βはまた
、培養筋芽細胞の分化を阻害することも可能である（Massagueら、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 83: 8206, 1986)。さらに、遺伝子治療用の遺伝子を筋肉に送
達するためのビヒクルとして筋芽細胞が利用可能であることから、GDF-8の特性
は、移植前の細胞を維持するため、または融合の効率を増大させるために利用す
ることができる。
【００２０】 脂肪組織におけるGDF-8の発現は、GDF-8がさらに、脂肪細胞の異常増殖に関連
する肥満または障害の治療に有用であり得ることを示唆する。このように、TGF-
βは、in vitroでの脂肪細胞の分化に対する強力なインヒビターであることが示
されている（IgnotzおよびMassague、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:8530, 1
985)。
【００２１】 本発明は、実質的に純粋なGDF-8ポリペプチドおよびその一部分の機能的ペプ
チド、ならびにGDF-8をコードする実質的に純粋なポリヌクレオチドを提供する
。本明細書において、「実質的に純粋な」または「単離された」という用語は、
天然に会合する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質から比較的遊離
されている、ポリペプチド、特にGDF-8、またはコードポリヌクレオチドに対し
て用いられる。当業者であれば、タンパク質精製の標準的な技法を用いてGDF-8
ポリペプチドを実質的に精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは
、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一かつ主要なバンドとして特定すること
ができる。GDF-8ポリペプチドの純度は、アミノ末端（N末端）アミノ酸配列分析
により測定することもできる。同様に、GDF-8をコードする単離されたポリヌク
レオチドは、例えば、本明細書に開示する方法を用いてポリヌクレオチドをクロ
ーニングすることにより得ることができることは、当業者には公知である。
【００２２】 全長のGDF-8ポリペプチドは、GDF-8の活性の制御に関与するアミノ末端のプロ
領域、およびC末端領域を含んでいる。該C末端領域は、プロ領域から遊離すると
、GDF-8活性を示す（米国特許出願第09/628,112号、2000年7月27日出願、該特許
出願は参照により本明細書に組み込むものとする）。実質的に精製された水生動
物のGDF-8ポリペプチドおよびその一部分のペプチドが本発明により提供される
。本明細書中に用いる、「プロGDF-8」という用語は、全長のポリペプチドを指
す場合に用いられ、これには、アミノ末端（プレ）プロ領域およびカルボキシ末
端（C末端）の生物学的に活性なGDF-8領域が含まれる。この（プレ）プロ領域は
、以後「プロ領域」と呼ぶが、プロ領域のアミノ末端の最初のほぼ15〜30アミノ
酸を含むシグナルペプチド（リーダー配列）を含んでいる。シグナルペプチドは
、全長プロGDFポリペプチドから切断され得る。これは、さらにタンパク質分解
酵素切断部位Arg-Xaa-Xaa-Argで切断されてC末端GDF-8が産生され得る。「GDF-8
」という用語は、一般に、他に指示がない限り、「プロGDF-8」という用語と同
義であり、例えばC末端GDF-8ポリペプチドを指す。
【００２３】 他の指示がない限り、アミノ酸残基についての本明細書中の指示は、例えば、
マウスプロGDF-8（図5aおよび5b；配列番号12）およびヒトプロGDF-8（図5cおよ
び5d；配列番号14）において示されているような全長プロGDF-8ポリペプチドに
関して用いられる。該指示は、本明細書中で、「ほぼ」特定のアミノ酸残基で始
まるかまたは終わる特定のポリペプチドについて用いられることも理解されるで
あろう。「ほぼ」という用語は、かかる文脈において用いられる。なぜなら、プ
ロGDF-8ポリペプチドをタンパク質分解酵素切断認識部位もしくはそのすぐ近く
で、または認識部位から１アミノ酸もしくは数アミノ酸の所で、特定のプロテア
ーゼが切断し得ることがわかっているからである。同様に、シグナルペプチドは
、プロGDF-8ポリペプチドのほぼ15〜30アミノ酸残基（例えば、15、20、25また
は30残基など）からのいずれかの部位で、例えば残りのプロ領域の機能に影響す
ることなく、切断され得る。
【００２４】 「ペプチド」または「ペプチド部分」という用語は、本明細書中では、広義に
、ペプチド結合により連結した２つ以上のアミノ酸を意味するのに用いられる。
一般に、本発明のペプチドは、少なくとも約6アミノ酸を含有しており、通常は
、約10アミノ酸を含有し、かつ15以上のアミノ酸を含有してもよく、特に、12以
上のアミノ酸を含有してもよい。用語「ペプチド」は、本明細書中では、特定の
サイズまたは特定の数のアミノ酸を含有する分子を示すのではないということ、
および本発明のペプチドは数個以下のアミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸残
基を含む場合もあることを理解されたい。
【００２５】 プロGDF-8ポリペプチドの機能的ペプチド部分は、GDF-8活性を有することにお
いて、部分的に特徴づけられる。したがって、GDF-8の生物学的活性を示すペプ
チドは、GDF-8に実質的に固有なエピトープを提供するエピトープ性のペプチド
と同様、本発明に含まれる。本明細書で用いる「機能的ペプチド部分」という用
語は、プロGDF-8ポリペプチドに関して用いられる場合、生物体の筋肉の成長も
しくは脂肪含量に影響を与えるか、またはGDF-8と特異的に相互作用することが
知られている物質と特異的に相互作用しうるC末端GDF-8ポリペプチド、あるいは
C末端GDF-8ポリペプチドの活性を阻害し得るGDF-8プロ領域の連続的アミノ酸配
列を意味する。Act RIIAまたはAct RIIBなどのアクチビンII型受容体（Act RII)
（例えば、米国特許第5,885,794号参照のこと、該特許は本明細書中に参照によ
り組み込む）、または、GDF-8に特異的に結合するがTGF-βファミリーの他のメ
ンバーには結合しない抗GDF-8抗体は、GDF-8ペプチドと特異的に相互作用する物
質の例として挙げられる。
【００２６】 GDF-ポリペプチドの機能的ペプチド部分は、特異的なタンパク質-タンパク質
相互作用を同定するために有用なことが判っている様々なアッセイのいずれかを
用いて同定することができる。該アッセイには、例えば、ゲル電気泳動法、アフ
ィニティクロマトグラフィー、FieldsおよびSongによるツーハイブリッド系（Na
ture 340: 245-246, 1989; ならびに米国特許第5,283,173号；Fearonら、Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 89: 7958-7962, 1992; Chienら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 88: 9578-9582, 1991; Young, Biol. Repord. 58: 302-311 (1998)を参
照のこと、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込むこととする）、
逆ツーハイブリッドアッセイ（LeannaおよびHannink, Nucl. Acids. Res. 24: 3
341-3347, 1996,これは参照により本明細書に組み込む）、抑制的トランスアク
チベーター系（米国特許第5,885,779号、これは参照により本明細書に組み込む
）、ディスプレイ展示システム（Lowman、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Structu
. 26:401-424, 1997, これは参照により本明細書に組み込む)、GST/HIS沈降アッ
セイ、変異型オペレーター（WO98/01879、これは参照により本明細書に組み込む
)、タンパク質会合系（米国特許第5,776,589号、これは参照により本明細書に組
み込む）他（例えば、Mathins, Clin. Chem. 41: 139-147, 1995 Lam, Anticanc
er Drug Res. 12:145-167, 1997; Phizickyら、Microbiol. Rev. 59: 94-123, 1
995; これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込むこととする)が挙げら
れる。
【００２７】 GDFポリペプチドの機能的ペプチド部分はまた、分子モデリング法を用いても
同定することができる。例えば、成熟GDF-8ペプチドまたはその一部分のペプチ
ドのアミノ酸配列を、適切なモデリングソフトウェアを備えたコンピュータシス
テムに入力可能であり、GDF-8（「仮想のGDF-8」)の三次元的な描写を作製する
ことができる。GDF-8アミノ酸配列はまた、コンピュータシステムに入力して、
モデリングソフトウェアによりGDF-8配列の一部（例えば、成熟C末端領域の部分
）をシミュレーションすることが可能であり、仮想のActRIIまたは選択された抗
GDF-8抗体と特異的に相互作用し得るGDF-8の一部分のペプチドを特定することが
できる。特異的な相互作用におけるベースラインは、仮想のGDF-8および受容体
または抗体をモデリングし、該物質が「接触」する仮想のGDF-8内のアミノ酸残
基を特定することにより、予め決定しておくことができる。
【００２８】 ツーハイブリッドアッセイおよび分子モデリング法を含むこのような方法はま
た、GDF-8と特異的に相互作用する他の分子を特定するのに用いることもできる
ことが理解されよう。したがって、ツーハイブリッドアッセイなどの方法を用い
ることにより、例えば、GDF-8ポリペプチドまたはAct RIIAまたはAct RIIB受容
体と特異的相互作用するGDF-8ポリペプチドの一部分のペプチドをアッセイの１
つの結合要素として用いて、GDF-8ペプチドと特異的に相互作用するGDF受容体を
特定することにより、新規GDF-8受容体を特定することができる。同様に、分子
モデリング法を用いて、成熟GDFポリペプチドまたはGDF受容体と特異的に相互作
用し、したがってGDFシグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストとして有
用であり得る物質を同定することができる。このような物質は、例えば、GDF-8
、GDF-11などの機能的ペプチド部分、またはGDFもしくはその機能的ペプチド部
分の作用を模倣する化学物質であってよい。
【００２９】 本明細書中に開示される目的に有用なモデリングシステムは、例えば、結晶構
造解析もしくは核磁気共鳴分析などにより得られる構造的情報、または一次配列
情報に基づくことができる（例えば、Dunbrackら、"Meeting review: the Secon
d meeting on the Critical Assessment of Techniques for Protein Structure
Prediction (CASP2)(Asilomar, Califormia 1996年12月13〜16日）Fold Des. 2
(2): R27-42, (1997); FischerおよびEisenberg、Protein Sci. 5:947-55, 1996
; (米国特許第5,436,850号も参照のこと）；Havel, Prog. Biophys. Mol. Biol.
56:43-78, 1991; Lichtargeら、J. Mol. Biol. 274: 325-37, 1997; Matsumoto
ら、Ｊ. Biol. Chem. 270:19524-31, 1995; Saliら、J. Biol. Chem.268: 9023-
34, 1993; Sali, Molec. MEd. Today 1: 270-7, 1995a; Sali, Curr. Opin. Bio
technol. 6: 437-51, 1995b; Saliら、Proteins 23: 318-26, 1995c; Sali, Nat
ure Sturct. Biol. 5: 1029-1032, 1998; 米国特許第5,933,819号；米国特許第5
,265,030号参照のこと；これらのそれぞれは参照として本明細書中に組み込む）
。
【００３０】 GDF-8ポリペプチドまたはGDF受容体の結晶構造の座標を用いて、タンパク質に
結合しその物理的もしくは生理学的特性を様々な様式で変化させる化合物を設計
することができる。また、該タンパク質の構造の座標を用いて、該ポリペプチド
に結合する物質について小分子のデータベースをコンピュータによりスクリーニ
ングして、GDF-8活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る制御
物質または結合物質を開発することができる。このような物質は、標準的な式を
用いたコンピュータフィッティング動力学的データによって同定することができ
る（例えば、Segel, "Enzyme Kinetics" (J. Wiley & Sons 1975)参照のこと、
これは参照により本明細書中に組み込む）。
【００３１】 インヒビターまたは結合物質を設計するための結晶構造データを用いる方法は
当技術分野で公知である。例えば、GDF-8ポリペプチド座標を、TGF-βファミリ
ーメンバーなどの類似のポリペプチドの利用可能な他の座標（結合したインヒビ
ターを有するポリペプチドを含む）の上に重ねて、インヒビターがポリペプチド
と相互作用する方法の概略を提供することができる。また、合理的薬剤設計の実
施に利用するコンピュータプログラムを用いて、見出したものに類似の相互作用
（例えば、GDF-8ポリペプチドと特異的にそれに結合する物質との間の）の特性
を再現する化合物を同定することができる。特異的な相互作用の性質の詳細な知
見は、溶解性、薬物動力学などを、結合活性に影響することなく、変化または向
上させる化合物の改変を可能とする。
【００３２】 結晶構造情報を用いて物質を設計するために必要な働きを行うコンピュータプ
ログラムは、公知である。このようなプログラムの例としては、Catalyst Datab
ases(商標)（BioByte Master File, Derwent WDIおよびACDなどの化学データベ
ースにアクセスするための情報検索プログラム）; Catalyst/HYPO（商標）（化
合物のモデルおよび薬物の候補物質の構造を用いて様々な活性を解釈するための
仮説を作製するプログラム）;Ludi（商標）（相補的な極性のある基および疎水
基を特定しマッチングさせることにより、タンパク質の活性部位に分子をフィッ
トさせるプログラム）；およびLeapfrog（商標）（ユーザの調節下でパラメータ
により遺伝子アルゴリズムを用いて新しいリガンドを「成長」させるプログラム
）などがある。
【００３３】 様々な汎用の機械をかかるプログラムを用いて使用することができ、又は、該
操作を実行するためにより特化した装置を構築することがより便利であるかもし
れない。概して、上記実施形態は、プログラム可能なシステム上で実行される１
以上のコンピュータープログラム中に提供される。また各システムは、少なくと
も１個のプロセッサー、少なくとも1個のデータ記憶システム（揮発性若しくは
非揮発性メモリ及び／又は記憶素子を含む）、少なくとも1個の入力装置、及び
少なくとも１個の出力装置を含む。該プログラムは、本明細書中に記載の機能を
実行するためにプロセッサーで実行される。
【００３４】 かかるプログラムはそれぞれ、コンピューターシステムと情報をやりとりする
ために、任意の所望のコンピューター言語（例えば、マシン語、アセンブリ語、
高水準手続き型言語、又はオブジェクト指向プログラム言語を含む）でインプリ
メントすることができる。あらゆる場合において、この言語は、コンパイル型、
又は、インタープリター型言語であってもよい。該コンピュータープログラムは
、通常、記憶媒体又は記憶装置（例えば、ROM、CD-ROM、磁気メディア若しくは
光学メディアなど、汎用若しくは特定用途にプログラム化可能なコンピューター
により読み取ることができるもの）に、該記憶媒体又は記憶装置をコンピュータ
ーで読み取り本明細書中に記載の工程を実行する時に、コンピューターを設定及
び制御するために記録される。このシステムは、コンピュータープログラムによ
り設定された、コンピューターで読み取り可能な記憶媒体として提供されてもよ
い。この場合、そのように設定された該記憶媒体は、本明細書中に記載の機能を
実行するため、特定的にかつ予め定義された様式でコンピューターを作動させる
。
【００３５】 本発明の実施形態には、例えば、本明細書中に記載の、インターネットに基づ
くシステム、特に結晶構造解析若しくはNMR分析により得られた座標情報、又は
アミノ酸若しくはヌクレオチド配列情報を記憶し操作する特別なコンピューター
システムを含む。本明細書中で使用するコンピューターシステムとは、ハードウ
エア要素、ソフトウェア要素、及び前述の座標又は配列の解析に使用されるデー
タ記憶要素を指す。該コンピューターシステムは典型的に、配列データの処理、
アクセス及び操作のためのプロセッサーを含む。該プロセッサーとしてはよく知
られた型の中央演算素子のいずれか、例えばIntel社製のPentium II若しくはPen
tium III、又はSun、Motorola、Compaq、Advanced Micro Devices又はInternati
onal Business Machines社製の類似のプロセッサーが挙げられる。
【００３６】 典型的には、該コンピューターシステムは汎用的システムであり、プロセッサ
ーと、データ記憶のための１以上の内部データ記憶要素、及びデータ記憶要素に
記憶されたデータを取得するための１以上のデータ取得装置からなる。現在入手
可能な任意のコンピューターシステムが適当であるということを、当業者は容易
に確認できる。
【００３７】 1実施形態において、該コンピューターシステムは、メインメモリ（好ましく
はRAM）、及びハードディスク又はデータを記憶したその他のコンピューターで
読み込める媒体等の１以上の内部データ記憶装置に接続されたバスに接続したプ
ロセッサーを含む。いくつかの実施形態において、かかるコンピューターシステ
ムはさらに、内部データ記憶装置に記憶されたデータを取得するために、１以上
のデータ取得装置を含んでいてもよい。
【００３８】 かかるデータ取得装置は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ 、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ又は遠隔的なデータ記憶シ ステム（インターネット経由等）に接続可能なモデム等であってもよい。いくつ かの実施形態において、かかる内部データ記憶装置は、フロッピーディスク、コ ンパクトディスク、磁気テープ等、コンピューターで読むことのできるれリムー バブル媒体であってもよく、コントロール論理及び/又はデータがそこに記憶さ れている。かかるコンピューターシステムは、データ取得装置に一旦挿入された データ記憶要素からコントロール論理及び/又はデータを読み込むための適当な ソフトウェアを含むか、又は適当なソフトウェアによってプログラムされている と好都合である。
【００３９】 該コンピューターシステムは、一般的には、コンピューター使用者に出力表示
する表示装置を含む。かかるコンピューターシステムがネットワークや広域ネッ
トワークにおいて他のコンピューターと連結し、該コンピューターシステムへの
集中的アクセスを提供し得ることも注目すべきである。
【００４０】 GDF-8又はGDF受容体と特異的に相互作用する化学物質を同定することを所望す
る場合、分子と特異的に相互作用する能力について化学物質又は断片をスクリー
ニングするための複数の方法のいずれかを使用することができる。この工程は、
視覚的検査（例えば、コンピューター画面上のGDF-8及びその受容体についての
検査）で開始してもよい。次いで、GDF-8ポリペプチド中の選択されたペプチド
の一部、又は擬似体として機能することができる化学物質を、受容体の個々の結
合部位内において様々な配向に位置させるか、又は、ドッキングさせることがで
きる。ドッキングはQuanta及びSybyl等のソフトウェアを使用して達成すること
ができ、続いて、CHARMM及びAMBER等の標準分子力学力場を用いたエネルギー最
小化及び分子動力学を実施した。
【００４１】 GDF-8のペプチドの一部、又は、例えばGDF受容体アゴニスト又はアンタゴニス
トとして有用な化学物質を選択するために専門化したコンピュータープログラム
が特に有用である。かかるプログラムには、例えば、GRID(Goodford, J. Med. C
hem., 28:849-857, 1985; Oxford University, Oxford, UKから入手可能）；MCS
S(Miranker及びKarplus, Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-
34, 1991; Molecular Simulations, Burlington, MAから入手可能）；AUTODOCK(
Goodsell及びOlsen, Proteins: Structure, Function and Genetics 8:195-202,
1990; Scripps Research Institute, La Jolla, CAから入手可能）；DOCK(Kunt
zら, J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; University of California, San Fran
cisco, CAから入手可能）が挙げられる。これらのそれぞれを参照により本明細
書に組み入れる。
【００４２】 選択された適切なペプチド又は物質を単一の化合物又は結合物質にアセンブリ
することができる。アセンブリはコンピューター画面上に表示される三次元画像
における断片同士の関係を視覚的に検査することによって実行することができ、
続いて、Quanta又はSybyl等のソフトウェアを使用してマニュアルモデル構築を
実施する。個々の化学物質又は断片に関し当業者の助けとなる有用なプログラム
には、例えば、CAVEAT(Bartlettら, Special Pub., Royal Chem. Soc. 78:182-1
96, 1989; University of California, Berkeley, CAから入手可能）；MACCS-3D
等の3Dデータベースシステム(MDL Information Systems, San Leandro CA; 総説
として、Martin, J. Med. Chem. 35:2145-2154, 1992を参照されたい）；HOOK(M
olecular Simulations, Burlington, Massから入手可能）が挙げられる。これら
のそれぞれを参照により本明細書に組み入れる。
【００４３】 かかる特異的に相互作用する物質を順々に上記のように一時にひとつの断片又
は化学物質を構築又は同定する方法に加えて、空の活性部位、あるいは付加的に
はGDF-8ポリペプチドと特異的相互作用する既知物質、例えば、抗GDF-8抗体の一
部を含むものを用いて、物質を全体的に又は新しく（de novo）として設計する
こともできる。かかる方法には、例えば、LUDI(Bohm, J. Comp. Aid. Molec. De
sign 6:61-78, 1992; Biosym Technologies, San Diego CAから入手可能）；LEG
END(Nishibata及びItai, Tetrahedron 47:8985, 1991; Molecular Simulations,
Burlington MAから入手可能）；LeapFrog(Tripos Associates, St. Louis MOか
ら入手可能）；Cohenら(J. Med. Chem. 33:883-894, 1990)により記載された方
法；及びNavia及びMurcko(Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210, 1992)により
記載された方法が挙げられる。これら方法のいずれも参照により本明細書に組み
入れる。
【００４４】 化合物の変形エネルギー及び静電相互作用を評価するために、当技術分野にお
いて特定のコンピューターソフトウェアを利用することができる。かかる用途の
ために設計されたプログラムの例としては、Gaussian 92, revision C(Frisch,
Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 1992); AMBER, version 4.0(Kollman, Univer
sity of California at San Francisco, 1994); QUANTA/CHARMM(Molecular Simu
lations, Inc., Burlington MA, 1994);及びInsight II/Discover(Biosysm Tech
nologies Inc., San Diego CA, 1994)が挙げられる。これらのプログラムは、例
えば、Silicon Graphics workstation、IRIS 4D/35又はIBM RISC/6000 workstat
ion model 550を使用してインプリメントすることができる。速度及び容量が継
続的に改変されているその他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケー
ジは当業者には公知であろう。
【００４５】 目的の分子、例えば、成熟GDF-8ポリペプチドと特異的に相互作用する物質を
同定するための分子モデリング方法は、本明細書中に記載の通りに実行すること
ができる。第１段階としては、標的分子、例えば、GDF-8の仮想表示(virtual re
presentation)を行なう。従って、標的分子がGDF-8ポリペプチド又はその機能性
ペプチド部分である場合に、1実施形態において、本発明は標的分子の仮想表示
を提供する。標的分子の仮想表示は、表示するか又はコンピューターシステムメ
モリ中に保持することができる。該工程は仮想標的分子を含む開始状態より始め
、次にコンピューターシステムのメモリへ保存されている1以上の仮想試験分子
をデータベースに含む状態へ移行する。上記の通り、メモリは任意のタイプのメ
モリ（RAM又は内部記憶装置を含む）であってもよい。
【００４６】 次に、該工程は、仮想の第１の試験分子（例えば、受容体又は化学物質）が仮
想の標的分子（例えば、GDF-8)と特異的に相互作用する能力を測定する状態へと
移行する。この場合、試験分子集団のうちの１つでありうる仮想試験分子を含有
するデータベースが、仮想標的分子と仮想試験分子との相互作用についての分析
のために開かれ、そして分析が実行される。特定の相互作用の測定は、コンピュ
ーターシステム中に保持されるソフトウェアにより、又は、予め測定された特定
の相互作用との比較により実行される計算に基づいて行なうことができる。これ
らのデータはコンピューターシステムのメモリ中に保存され適宜アクセスするこ
とができる。
【００４７】 次に、該工程は、特定の相互作用が検出される場合に、仮想試験分子が表示さ
れるか、又は、コンピューターの第２のデータベース中に保存される状態に移行
する。適切な場合には、該工程は、所望により仮想標的分子と第２の仮想試験分
子、第３の仮想試験分子等に対して繰り返される。
【００４８】 仮想試験分子が仮想標的分子と特異的に相互作用する測定が行なわれる場合、
同定された仮想試験分子をデータベースから移し、利用者に対して表示すること
ができる。この状態から利用者は、表示された名称又は構造を有する分子が、考
慮される制約条件内において標的分子と特異的に相互作用することを知ることが
できる。一旦、同定された試験分子の名称が利用者に表示されたならば、工程は
決定段階に移行する。この場合、より多くの仮想試験分子がデータベース中に存
在するか、又は、試験されているかどうか、測定が行なわれる。データベース中
にこれ以上分子が存在しない場合は、続いて、工程は終了段階で終了する。しか
しながら、データベース中により多くの試験分子が存在する場合、該工程は、特
定の結合活性を調べ得るようにデータベース中の次の試験分子へポインタを移動
させる状態に移行する。このように、新しい分子を、仮想標的分子と特異的に相
互作用する能力について試験する。
【００４９】 さらに本発明は、水生生物のGDF-8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供する。かかるポリヌクレオチドは、プロ-GDF-8ポリペプチドの一部又は
全体をコードするDNA、cDNA又はRNA配列であり得る。したがって、プロGDF-8ポ
リペプチドの全体又は一部をコードするポリヌクレオチド、特にGDF-8活性を有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に含まれる
。かかるポリヌクレオチドには、実質的に精製された天然のポリヌクレオチド、
並びに、合成及び意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、本
明細書中で開示するGDF-8ポリヌクレオチドは部位特異的変異に供することがで
きる。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子コードの結果として、縮重である配
列を含む。20の天然のアミノ酸が存在するが、これらの多くは1以上のコドンに
よって特定される。それゆえ、ヌクレオチド配列によりコードされるGDF-8ポリ
ペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない場合、本明細書中で開示する
ポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列の全てが本発明に含まれる。特
に有用な本発明のポリヌクレオチドには、アンチセンスGDF-8ポリヌクレオチド
配列が含まれる。
【００５０】 「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中において、ホスホジエステル
結合によって一緒に連結している２以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌ
クレオチドの配列を意味するように広く用いられる。このように、「ポリヌクレ
オチド」という用語には、RNA及びDNA（これらは遺伝子又はその一部、cDNA、合
成ポリデオキシリボ核酸等であってもよく、また、一本鎖又は二本鎖であっても
よい）、並びにDNA／RNAハイブリッドが含まれる。さらに、本明細書中で使用す
る「ポリヌクレオチド」という用語には、細胞から単離し得る天然の核酸分子、
並びに、例えば、化学合成法により又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などによる
酵素法により調製し得る合成分子が含まれる。様々な実施形態において、本発明
のポリヌクレオチドはヌクレオシド類似体若しくはヌクレオチド類似体、又はホ
スホジエステル結合以外の主鎖結合を含むことができる(上記参照)。
【００５１】 一般的に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド類とは天然のデオキシリボヌ
クレオチド（例えば、アデニン、シトシン、グアニン若しくはチミンと2’-デオ
キシリボースとが連結している）、又はリボヌクレオチド（例えば、アデニン、
シトシン、グアニン又はウラシルとリボースとが連結している）のことである。
しかしながら、ポリヌクレオチドにはヌクレオチド類似体（天然ではない合成ヌ
クレオチド又は改変した天然のヌクレオチドを含む）も含み得る。かかるヌクレ
オチド類似体は当技術分野で公知であり、かかるヌクレオチド類似体を含むポリ
ヌクレオチドとして市販されている(Linら, Nucl. Acids. Res. 22:5220-5234(1
994); Jellinekら, Biochemistry 34:11363-11372(1995); Pagratisら, Nature
Biotechnol.15：68-73(1997))。これら文献のいずれも参照により本明細書に組
み入れる。
【００５２】 ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド同士を連結している共有結合は一般的
にホスホジエステル結合である。しかしながら、該共有結合は、無数の他の結合
のいずれかであってもよい。かかる結合としては、例えば、チオジエステル結合
、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合、又は合成ポリヌクレオチドを作製
するためにヌクレオチドを連結するのに有用な当業者に公知の他の結合のいずれ
か（例えば、Tamら, Nucl. Acids Res. 22:977-986(1994); Ecker及びCrooke, B
io Technology 13:351360 (1995)、これら文献のいずれも参照により本明細書に
組み入れる。）が挙げられる。非天然のヌクレオチド類似体の取り込み、又は、
ヌクレオチド同士若しくは類似体同士を連結させる結合は、ヌクレオチド分解活
性を含み得る環境（例えば、組織培養培地を含む）にポリヌクレオチドが曝され
る場合、又は、生物体への投与の際に特に有用である。なぜならば、改変ポリヌ
クレオチドは分解をより受けにくいからである。
【００５３】 天然のヌクレオチド及びホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化
学的に合成し得るか、又は、鋳型として適切なポリヌクレオチドを使用する組換
えＤＮＡ方法を利用して作製し得る。比較的、ヌクレオチド類似体又はホスホジ
エステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは通常化学的に合成される
が、T7ポリメラーゼ等の酵素は特定のタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレ
オチド中へ組み込むことができ、故に、該酵素を使用して適切な鋳型から遺伝子
組換え的にこのようなポリヌクレオチドを製造することができる(Jellinekら,
前掲, 1995)。
【００５４】 ポリヌクレオチドがペプチド（例えば、GDF-8のペプチド部分）又はペプチド
試薬をコードする場合、コード配列は通常ベクター中に含まれ、且つ、適切な調
節エレメント（所望の場合、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを含む）
と機能的に連結している。コードされるペプチドはさらに、例えば、His-6タグ
等のペプチドタグと機能的に連結し得る。ペプチドタグにより、標的細胞中にお
ける物質の発現の同定を容易にし得る。His-6等のポリヒスチジンタグペプチド
はニッケルイオン、コバルトイオン等の２価のカチオンを使用して検出し得る。
さらなるペプチドタグには、例えば、抗FLAG抗体を使用して検出し得るFLAGエピ
トープ（例えば、Hoppら, BioTechnology 6:1204 (1988)及び米国特許第5,011,9
12号を参照。これらの文献を参照により本明細書に組み入れる。）；エピトープ
に対して特異的な抗体を使用して検出し得るc-mycエピトープ；ストレプトアビ
ジン又はアビジンを使用して検出し得るビオチン；及びグルタチオンを使用して
検出し得るグルタチオンS-トランスフェラーゼ等が挙げられる。かかるタグはさ
らなる利点を提供し、例えば、実質的に精製されたペプチドを取得することが望
まれる場合に、機能的に連結したペプチド又はペプチド試薬の単離を容易にし得
る。
【００５５】 本明細書中で使用する場合、「機能的に連結した」又は「機能的に結合した」
という用語は、単一の単位として機能し、且つ、片方若しくは両方の分子又はそ
れらの組み合わせに帰属される機能に影響を及ぼすように２以上の分子が互いに
位置することを意味する。例えば、GDF-8又はその機能性ペプチド部分をコード
するポリヌクレオチド配列が調節エレメントと機能的に連結している場合には、
調節エレメントは、細胞中で通常関連するポリヌクレオチド配列に影響を及ぼし
得る調節エレメントと同様に、該ポリヌクレオチドに対して調節効果を及ぼす。
また、機能的に連結されたコード配列からキメラポリペプチドが発現されるよう
に、第１のポリヌクレオチドコード配列を第２の（又はそれ以上の）コード配列
と機能的に連結させることもできる。キメラポリペプチドは、２種類の（又はそ
れ以上の）コードされたペプチドが単一のポリペプチド（すなわち、ペプチド結
合により共有結合している）へ翻訳される融合ポリペプチドであってもよく；又
は、翻訳時に互いに機能的に結合し安定した複合体を形成し得る２種類の別々の
ペプチドとして翻訳されてもよい。
【００５６】 プロ-GDF-8及びGDF-8のペプチド部分をコードするポリヌクレオチド（ゲノム
ＤＮＡ配列を含む）を本明細書中で開示する。コードされるポリペプチドは２ヶ
所の潜在的なタンパク質分解プロセシング部位（KR及びRR）を含むことが予想さ
れる。下流部位における前駆体の切断により、マウス種とヒト種についてそれぞ
れ109アミノ酸と103アミノ酸である生物学的に活性な成熟C末端断片を生じ、予
想される分子量は約12,400ダルトンである。さらに、マウスとヒトの全長GDF-8
cDNA配列を開示する。マウスのプレ-プロ-GDF-8タンパク質は376アミノ酸長であ
り、これは2676塩基対のヌクレオチド配列によりコードされており、104位のヌ
クレオチドから開始し1232位のヌクレオチドのTGA終止コドンにまで至る。ヒト
のプロ-GDF-8タンパク質は375アミノ酸であり、2743塩基対の配列によりコード
されており、59位のヌクレオチドからオープンリーディングフレームが開始し11
84位のヌクレオチドまで至る。GDF-8はダイマーを、又は、ヘテロダイマーを形
成することができ、予想される分子量は約23〜30キロダルトン(kDa;実施例４参
照)である。例えば、GDF-8は他のファミリーメンバー（例えば、GDF-11）とヘテ
ロダイマーを形成することができる。
【００５７】 ヒト、マウス、ラット及びニワトリのプロ-GDF-8のアミノ酸配列のアライメン
ト(図3b)はC末端の生物学的活性断片において配列が100％同一であることを示す
。さらに、マウス、ゼブラフィッシュ、及び２種類のサケのGDF-8対立遺伝子配
列のアライメント(図3c及び3d)によって、GDF-8アミノ酸配列がかなりの多様な
種において高度に保存されていることが示され；また、図19はGDF-8ポリペプチ
ドのC末端が水性生物において高度に保存されていることを示す。この開示によ
り、任意の種から、特に魚類等の水性生物からGDF-8ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを通常の方法で取得し得る。
【００５８】 様々な魚類に対するプロGDF-8ポリペプチド又はそのペプチドの一部をコード
するポリヌクレオチド、例えば、ゼブラフィッシュ（図2e；配列番号28及び29）
、サケ対立遺伝子１（「サケ-１」；図2f；配列番号30及び31）、サケ対立遺伝
子２（「サケ-２」；図2g；配列番号32及び33）、タラ（図14；配列番号42及び4
3）、ハタ（図15；配列番号44及び45）、タイ（図16；配列番号46及び47）、ベ
ラ（図17；配列番号48及び49）、並びに、両生類であるX. laevis（カエル；図1
8；配列番号50及び51）を本明細書中で開示する（図3c及び3d、並びに図19も参
照されたい）。図3c及び3dは、マウス、ゼブラフィッシュ、サケ-1及びサケ-2 G
DF-8間のアミノ酸配列アライメントを示す。C末端配列が高度に保存されている
。下流のRXXR部位における前駆体の切断により、マウスGDF-8に対して生物学的
に活性な約109アミノ酸の成熟C末端断片を生じる。図3c及び3dの魚の配列とマウ
スの配列のC末端断片の比較から、差異はわずかに14アミノ酸であることが明ら
かとなる（約88％の同一性）。同様に高度な配列同一性がヒトと様々な水性生物
のGDF-8ポリペプチドとの間で共有されている（図19）。したがって、本発明は
水性生物のGDF-8ポリペプチドをコードするGDF-8ポリヌクレオチド配列を提供す
る。この場合、該GDF-8ポリペプチドは、マウスGDF-8ポリペプチドに対して少な
くとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％又は95％同一である生物学
的に活性なC末端断片を有する。本発明のポリヌクレオチドは、上記のアミノ酸
配列を有するGDF-8ポリペプチドをコードする魚類及び両生類のGDF-8ポリヌクレ
オチドにより例示される。
【００５９】 １実施形態において、本発明は次に示すアミノ酸配列を含むGDF-8ポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する：配列番号29（図2e）、
配列番号31（図2f）、配列番号33（図2g）、配列番号43（図14）、配列番号45（
図15）、配列番号47（図16）、配列番号49（図17）又は配列番号51（図18）。別
の実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドを配列番号28、配列
番号30、配列番号32、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48又は配
列番号50として示す（配列中TはUであってもよい）。本発明のポリヌクレオチド
は上記の通りであるか、又はそれに相補的なポリヌクレオチドであってもよい。
また、上記のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするが、配列番号
12、配列番号14、配列番号19又は配列番号21等の非水性生物のpro-GDF-8ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド、また配列番号11、配列番号13、配列番号
18又は配列番号20で示されるポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない、少な
くとも15ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり得る。
【００６０】 プロ-GDF-8の推定タンパク質分解プロセッシング部位に続く配列を含むC末端G
DF-8ポリペプチドは、TGF-βスーパーファミリーの既知のメンバーに対して実質
的な相同性を示す。GDF-8配列は、他のファミリーメンバーおよび他の種におい
て高度に保存されている残基の大部分を含む（図３aおよび図３bを参照されたい
）。TGF-βおよびインヒビン-βポリペプチドと同様に、GDF-8は事実上全ての他
のファミリーメンバーにおいて見られる7つのシステイン以外にもさらに一対の
システイン残基を含む。既知のファミリーメンバーの中でも、GDF-8はVgr-1に対
して最も相同である（45％の配列同一性：図４を参照されたい）。
【００６１】 組換えGDF-8一次アミノ酸配列に小さな改変を加えると、例示したGDF-8ポリペ
プチドと比べて実質的に同等な活性を有するタンパク質を作製することができる
。このような修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発等の方法により導入される
改変等の計画的なものであってもよいし、または自然発生的なものであってもよ
い。これらの改変により作製されたポリペプチドの全ては、本明細書に開示され
るようにGDF-8の機能を維持するポリペプチドである限り、本発明により包含さ
れる。また、１以上のアミノ酸を欠失させることによっても、その生物学的活性
を大きく変化させることなく得られた分子の構造の改変を行うことができる。こ
れは、より利用範囲の広い小さな活性分子の開発につながり得る。例えば、GDF-
8の生物学的活性または他の機能に必要でないアミノ末端またはカルボキシ末端
のアミノ酸を除去することができる。
【００６２】 本発明のGDF-8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、例示した
配列、ならびにこれらの例示したポリペプチド配列の保存的変異を含む。本明細
書中で使用される「保存的変異」という用語は、他の生物学的に類似したアミノ
酸残基によるアミノ酸残基の置換を指す。保存的変異の例としては、イソロイシ
ン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基による他の疎水性残基
の置換、または極性残基による他の極性残基の置換、例えばアルギニンによるリ
ジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはグルタミンによ
るアスパラギンの置換等が挙げられる。また「保存的変異」という用語は、置換
ポリペプチドに特異的に相互作用する抗体が、非置換ポリペプチドとも特異的に
免疫反応を起こすのであれば、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用
することも含む。
【００６３】 本発明のポリヌクレオチドは、幾つかの方法によって得ることができる。例え
ば、該ポリヌクレオチドを、当技術分野で周知であるハイブリダイゼーションま
たはコンピュータベースの技法を用いて単離することができる。これらの技法に
は、１）相同的ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノムもしくはcD
NAライブラリーとのハイブリダイゼーション；２）構造的特徴を共有するクロー
ニングされたDNA断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング
；３）目的のDNA配列にアニーリングすることができるプライマーを用いたゲノ
ムDNAもしくはcDNAに対するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；４）類似配列につい
ての配列データベースのコンピュータ検索；および５）サブトラクションされた
DNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが含まれるが、これらに
限定されない。
【００６４】 GDF-8ポリペプチド間（特にヒトと魚などの様々な種の間）で共有される開示
された広範囲の配列保存の点からみて、任意の種、特に水生生物からGDF-8をコ
ードするポリヌクレオチド（本明細書中に開示される部分的GDF-8配列の残りを
含む）を得ること、および任意の種におけるGDF-8発現を同定することは一般的
作業である。特に、成熟GDF-8 C末端配列は、TGF-βスーパーファミリーの他の
メンバーに対して有意な相同性を共有し、GDF-8は、他のファミリーメンバーの
間および他の種間で高度に保存されている残基の大部分を含む。さらに、TGF-β
およびインヒビンβと同様に、GDF-8は事実上全ての他のファミリーメンバー中
に存在する７つのシステイン残基以外にさらに１対のシステイン残基を含む。GD
F-8はVgr-1に対して最も相同である（45％の配列同一性）。TGF-βスーパーファ
ミリーの他のメンバーと同様に、GDF-8は、タンパク質分解によって切断されて
活性GDF-8ペプチドとなるより大きな前駆体プレ-プロ-GDF-8ポリペプチドとして
合成される。しかし、本明細書の開示に基づき、水生種に独特であり、従って非
水生動物のGDF-8ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドには見られないヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列は容易に同定することができる。このような水生生物
の保存配列の同定によって、オリゴヌクレオチドプローブや抗体などの試薬の調
製が可能となり、これらは、本発明の水生生物GDF-8ポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドを非水生生物GDF-8ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと区別する
ための手段を提供する。
【００６５】 様々な生物のGDF-8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、周知の手
法およびアルゴリズムを用い、開示された配列に対する同一性もしくは相同性に
基づいて同定することができる。相同性または同一性は多くの場合、Genetics C
omputer Group の配列分析ソフトウェアパッケージ（ウィスコンシン大学バイオ
テクノロジーセンター, 1710 University Avenue, Madison, WI53705）等の配列
分析ソフトウェアを用いて測定される。このようなソフトウェアは、様々な欠失
、置換および他の改変に相同性の度合いを割りあてることにより、類似配列をマ
ッチングさせる。「相同性」および「同一性」という用語は、本明細書中におい
て２以上の核酸もしくはポリペプチド配列に関して使用される場合、任意の数の
配列比較アルゴリズムを用いてまたはマニュアルによるアラインメントおよび目
視観察によって測定した場合に比較ウィンドウまたは指定された領域上で最大限
一致するようにアラインメントされ比較されたときに同一である、またはこのよ
うな同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドのうち指定されたパーセンテージ
を有する、２以上の配列もしくはサブ配列を指す。
【００６６】 配列比較の際は、典型的には１つの配列が基準配列（reference sequence）と
して機能し、試験配列をこの基準配列と比較する。配列比較アルゴリズムを用い
る場合は、試験配列および基準配列をコンピュータに入力し、必要な場合はサブ
配列の座標を指定し、および配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定
する。デフォルトプログラムパラメーターを用いたり、他のパラメーターを指定
したりしてもよい。次に配列比較アルゴリズムは、そのプログラムのパラメータ
ーに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性％を計算する。
【００６７】 「比較ウィンドウ」という用語は、任意の個数の連続的位置、例えば約20〜60
0位（例えばアミノ酸もしくはヌクレオチド位置）、通常は約50〜約200位、より
一般的には約100〜約150位のセグメントについての参照を含む意味で本明細書中
において広く用いられる。比較ウィンドウの中で、配列は、同じ数の連続的位置
の参照配列と、これらの２つの配列を最適にアラインメントした後に、比較され
うる。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野において周知であ
る。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばSmithおよびWaterman
の局所的相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482,1981）、Needlemanおよ
びWunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443,1970）
、PersonおよびLipmanの類似性検索法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:2444,
1988）（それぞれは本明細書中に参照として組み込まれる）；これらのアルゴリ
ズムのコンピュータ化インプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software
Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの、GAP, B
ESTFIT, FASTAおよびTFASTA）；またはマニュアルによるアラインメントおよび
目視観察によって行うことができる。相同性もしくは同一性を決定するための他
のアルゴリズムとしては、例えばBLASTプログラム（Basic Local Alignment Sea
rch Tool at the National Center for Biological Information）、ALIGN、AMA
S（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS (Protein Multiple Sequ
ence Alignment)、ASSET(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、BAN
DS、BESTSCOR、BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node)、B
LIMPS (BLocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points, BMB, CLUSTA
L V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Watermanアルゴ
リズム、DARWIN, Las Vegasアルゴリズム、FNAT (Forced Nucleotide Alignment
Tool)、Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Seque
nce Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, Gen
Quest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alig
nment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construct
ion & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLK
N, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Align
ment by Genetic Algorithm)およびWHAT-IFが挙げられる。このようなアライン
メントプログラムは、実質的に同一な配列を有するポリヌクレオチド配列を同定
するためのゲノムデータベースのスクリーニングに使用することもできる。
【００６８】 多数のゲノムデータベースが比較のために利用可能であり、例えばヒトゲノム
のかなりの部分は、ヒトゲノム配列決定プロジェクトの一部として利用可能であ
る（J. Roach, http://weber.u.Washington.edu/〜roach/human_genome_progres
s2.html）。さらに、例えばマイクロプラズマ・ジェニタリウム(M.genitalium)
、メタン生成菌(M. jannaschii)、インフルエンザ菌(H. influenzae)、大腸菌、
酵母（S. cerevisiae）、およびキイロショウジョウバエ(D. melanogaster)を含
む少なくとも21のゲノムはその全てが配列決定されている。また、マウス、線虫
(C. elegans)およびシロイヌナズナ(Arabidopsis)種などのモデル生物のゲノム
の配列決定においても大きな進歩があった。ある機能的情報の注釈が付いたゲノ
ム情報を含む幾つかのデータベースは、様々な団体によって維持されており、イ
ンターネットを介してアクセスが可能である（例えばhttp://wwwtigr.org/tdb；
http://www.genetics.wisc.edu ；http://genome-www.stanford.edu/〜ball；ht
tp://hiv-web.lanl.gov; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk
；http://Pasteur.fr/other/biology；およびhttp://www.genome.wi.mit.edu.が
ある）。
【００６９】 有用なアルゴリズムの１つの例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり
、これらは、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977; J. Mol. B
iol., 215:403-410, 1990、それぞれは本明細書中に参照として組み込まれる）
により記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Cent
er for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)を介して一
般に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベースの配列の中の同
じ長さのワードとアラインメントした時に、ある正の閾値スコアTにマッチする
またはこれを満たすクエリー配列の中の長さWの短いワードを同定することによ
り高スコア配列対（HSP）を同定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値（
neighborhood word score threshold）（Altschulら（前掲）, 1977, 1990）と
呼ばれる。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むより長いHSPを見
つけ出すための検索を開始するためのシード（seed）として機能する。これらの
ワードヒットを、各配列に沿って両方向に、累積アラインメントスコアを増やせ
る限り伸張させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターM
（一対のマッチ残基のための報酬スコア（reward score）；常に＞０）を用いて
計算される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを用いて、累積スコアを
計算する。各方向へのワードヒットの伸張は、累積アラインメントスコアがその
最大達成値から量Xだけ落ちたとき；１以上の負のスコア残基アラインメント（n
egative-scoring residue alignment）の累積によって累積スコアがゼロ以下に
なったとき；またはいずれかの配列の末端に達したときに、停止する。BLASTア
ルゴリズムのパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を
決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワー
ド長（W）＝11、期待値（E）＝10、M＝5、N＝4および両鎖の比較を用いる。アミ
ノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォルトとして、ワード長＝3および期
待値（E）＝10を使用し、またBLOSUM62スコアマトリックス（HenikoffおよびHen
ikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 10915, 1989を参照されたい）は、ア
ラインメント（B）＝50、期待値（E）＝10、M＝5、N＝4および両鎖の比較を使用
する。
【００７０】 またBLASTアルゴリズムにより、２つの配列間の類似性の統計的分析も行われ
る（例えばKarlinおよびAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:5873,1993
を参照されたい。当該文献は、本明細書中に参照として組み込まれる）。BLAST
アルゴリズムにより提供される類似性の１つの基準は、最小和確率（the smalle
st sum probability）（P(N)）であり、これは、２つのヌクレオチドもしくはア
ミノ酸配列の間にマッチが生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参
照核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、
および最も好ましくは約0.001未満である場合に、その核酸は、その参照配列に
類似しているとみなされる。
【００７１】 １つの実施形態において、タンパク質および核酸配列の相同性は、Basic Loca
l Alignment Search Tool (「BLAST」)を用いて評価される。具体的には、以下
の作業を実行するために５つの特定のBLASTプログラムが用いられる： （１）BLASTPおよびBLAST3は、タンパク質配列データベースとアミノ酸のクエリ
ー配列とを比較する； （２）BLASTNは、ヌクレオチド配列データベースとヌクレオチドのクエリー配列
とを比較する； （３）BLASTXは、タンパク質配列データベースとクエリーヌクレオチド配列（両
鎖）の６フレーム概念的（conceptual）翻訳産物とを比較する； （４）TBLASTNは、全ての６つのリーディングフレーム（両鎖）内で翻訳される
ヌクレオチド配列データベースとクエリータンパク質配列とを比較する；および （５）TBLASTXは、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳とヌクレオ
チドクエリー配列の６フレーム翻訳とを比較する。
【００７２】 BLASTプログラムは、１つのクエリーアミノ酸もしくは核酸配列と試験配列（
タンパク質もしくは核酸配列データベースから得ることが好ましい）との間の類
似セグメント（本明細書中において「高スコアセグメント対（high-scoring seg
ment pair）」と呼ばれる）を同定することによって相同配列を同定する。高ス
コアセグメント対は、好ましくは、スコアマトリックス（当技術分野において多
くが知られている）によって同定（アラインメント）される。好ましくは、使用
されるスコアマトリックスは、BLOSUM62マトリックス（Gonnetら, Science 256:
1443-1445, 1992; HenikoffおよびHenikoff, Proteins 17:49-61, 1993, それぞ
れは本明細書中に参照として組み込まれる）である。その他に劣るが好適なもの
として、PAMもしくはPAM250マトリックスを用いてもよい（SchwartzおよびDayho
ff編、「Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein
Sequence and Structure」(Washington, National Biomedical Research Founda
tion 1978)）。BLASTプログラムは米国国立医学図書館（the U.S. National Lib
rary of Medicine）を介して、例えばwww.ncbi.nlm.nih.govからアクセス可能で
ある。
【００７３】 上記アルゴリズムとともに用いられるパラメーターは、調査した配列の長さお
よび相同性の度合いによって調整することができる。幾つかの実施形態において
、パラメーターは、ユーザからの指示が無い場合はそのアルゴリズムにより使用
されるデフォルトパラメーターであってもよい。
【００７４】 GDF-8ポリヌクレオチドは、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒト、ニワトリ、
シチメンチョウ、魚および他の水生生物、ならびに他の種を含む任意の生物から
得ることができる。本発明の目的のために、「水生生物」という用語は、一生の
全てまたは生涯の大部分を水中で過ごす非ヒト脊椎動物もしくは無脊椎動物を指
すために用いられる。「大部分」という用語は、水生生物の寿命に関して使用さ
れる場合、その期間が無ければその動物が増殖、発生または成長することができ
ないと思われる期間を指す。このような水生生物の寿命の大部分とは、例えば両
生類等の生物が恒常性を保つために水中に入るのに必要な時間であったり、また
はワニ等の動物が餌を食べるために必要な時間であったりしうる。
【００７５】 水生生物の例としては、上綱Pisces（魚類）に属するもの、例えばサメ、ガン
ギエイおよびエイなどの軟骨魚類綱、およびサケ、マス、チャー(char)、アユ、
コイ、フナ、金魚、ローチ 、シラス、ウナギ、アナゴ、サーディン(sardin)、
ゼブラフィッシュ、トビウオ、ハタ、タイ、ブダイ、ゴウシュウマダイ、サバ、
クロマグロ、マグロ、ハガツオ、ブリ、イワウオ、ヒラメ、シタビラメ、カレイ
、フグ、モンガラカワハギ等の硬骨魚類綱が挙げられる。水生生物の更なる例と
しては、以下の綱に属するものが挙げられる：ジンドウイカ、イカ、タコ等の頭
足類；ハマグリ等の斧足類（例えばhardshell、Manila, Quahog, Surf, Soft-sh
ell）；ザルガイ、カラスガイ、タマキビ；ホタテガイ（例えばsea、bay、callo
o）；ホラガイ、巻貝、ナマコ；フネガイ；牡蠣（例えばC. virginica, Gulf, N
ew Zealand, Pacific）；リュウテンサザエ科や（緑、ピンク、赤などの）アワ
ビなどの腹足類；ロブスター（Spiny、RockおよびAmerican等を含むがこれらに
限定されない）等の甲殻類；中型エビ；小型エビ（M. rosenbergii, P. styllro
lls, P. indicus, P. jeponious, P. monodon, P. vannemel, M. ensis, S. mel
anthoおよびN. norvegious, 冷水小型エビ等を含むがこれらに限定されない）；
カニ（Blue, rook, stone, king, queen, snow, brown, dungeness, Johah, Man
groveおよびsoft-shelledを含むがこれらに限定されない）およびシャコ、オキ
アミ、ヨーロッパアカザエビ（langostino）、イセエビ/ザリガニ（例えばBlue,
Marron, Red Claw, Red Swamp, Soft-shelledおよびホワイトを含むがこれらに
限定されない）；カエル等の両生類；および棘皮動物類（ウニを含むがこれに限
定されない）。また、環形動物門および脊索動物門に属する水生生物（ワニやカ
メなどの爬虫類を含むがこれらに限定されない）も含まれる。
【００７６】 本発明は、水生生物GDF-8をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号28
、30、32、42、44、46、48または50に特異的にハイブリダイズするが、非水生生
物GDF-8をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号11、13、18または20に
はハイブリダイズしない、ヌクレオチド配列を提供する。したがって、本明細書
中で使用される「特異的にハイブリダイズする」という用語は、そのヌクレオチ
ド配列が、かかるポリヌクレオチドを識別することができることを意味する。本
明細書の開示に基づいて、かかるヌクレオチド配列の同定および選択は、一般的
作業であり、これは、例えば開示された配列の目視観察により、または好ましく
は、開示された配列を、本明細書中に開示されたプログラムを用いたコンピュー
タ化分析にかけることによって、行うことができる。
【００７７】 核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング手法により、本明細書中に
提供されたポリヌクレオチド配列に由来するプローブを用いて任意の生物から任
意の遺伝子配列を単離することができる。例えば、本明細書中に提供されるよう
なゼブラフィッシュまたはサケ配列に由来するプローブを用いて、他の水生生物
に由来するGDF-8ポリヌクレオチドを同定することができる。特に、C末端断片中
に保存されているため、水生生物に独特なGDF-8のこの部分をコードするポリヌ
クレオチド配列に対する核酸プローブを用いることが有益でありうる。問題のタ
ンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化
学合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド範
囲(stretch)が分かっている必要がある。このタンパク質をコードするDNA配列は
その遺伝子コードから推定することができるが、コードの縮重を考慮しなければ
ならない。配列が縮重している場合、混合付加反応（mixed addition reaction
）（例えば変性二本鎖DNAの異種混合物を含む）を行うことができる。このよう
なスクリーニングのためには、一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAに対してハイブリ
ダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係
するmRNA配列が極端に少ない量で存在する起源に由来するcDNAクローンの検出に
おいて特に有用である。このように、非特異的結合を回避するために仕向けられ
たストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば
標的DNAを混合物中のその完全な相補体である単一プローブにハイブリダイズさ
せることによる特定のcDNAクローンのオートラジオグラフによる可視化が可能に
なる（Wallaceら, Nucl. Acid. Res. 9:879, 1981）。
【００７８】 またGDF-8-ポリペプチドをコードする特定のポリヌクレオチドの開発は、１）
ゲノムDNAからの二本鎖DNA配列の単離、２）目的のポリペプチドに必要なコドン
を提供するためのDNA配列の化学的製造、および３）真核生物ドナー細胞から単
離したmRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のin vitro合成により達成することも
できる。後者の場合、mRNAの二本鎖DNA相補体が結果的に形成される。これは、
一般にはcDNAと呼ばれる。これらの方法のうち、ゲノムDNA単離体の単離は最も
一般的ではない。これは特に、哺乳動物ポリペプチドの微生物による発現を得る
ことが望ましい場合に当てはまり、これは、ゲノム配列中にイントロンが存在す
ることによるものである。
【００７９】 核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定レベルのストリンジェンシー
を達成するために使用される条件は、ハイブリダイズされるポリヌクレオチドの
性質によって変わるだろう。例えば、ハイブリダイゼーション条件を選択する際
に、その核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の度合い、ヌクレオチド
配列組成（例えばGC対AT含量）、および核酸のタイプ（例えばRNA対DNA）を考慮
することができる。さらに、該核酸のうちの１つが例えばフィルターに固定化さ
れるか否かを考慮する。
【００８０】 累進的に高くなるストリンジェンシー条件の例は、以下の通りである：およそ
室温にて2×SSC/0.1％ SDS（ハイブリダイゼーション条件）；およそ室温にて0.
2×SSC/0.1％SDS（低ストリンジェンシー条件）；約42℃にて0.2×SSC/0.1％SDS
（中程度のストリンジェンシー条件）；および約68℃にて0.1×SSC（高ストリン
ジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件のうち１つのみ（例えば高ストリンジ
ェンシー条件）を用いて行うことができる。あるいは、各条件を使用することが
できる。例えば、上記ステップの全てまたは幾つかを各々10〜15分間ずつ上記の
順序で繰り返して行うことができる。しかし、上記に記載したように、最適な条
件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応によって様々であり、経験的
に決定することができる。そのGDF-8プローブが由来する種によって、当業者で
あれば、これらのハイブリダイゼーションガイドラインを用いて、積極的にハイ
ブリダイズした配列（positively-hybridized sequence）がGDF-8核酸配列であ
るか否かを決定することができる。例えば、より高いストリンジェンシーを用い
て、種間ではなく種内でGDF-8を同定することができる。さらに、該ポリペプチ
ドのC末端領域中に配列が保存されているため、このC末端領域をコードするヌク
レオチドに対するプローブをより高いストリンジェンシー条件で使用することが
できる。
【００８１】 所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合は、ポリヌ
クレオチド配列の合成が適切な方法である場合が多い。所望のポリペプチドのア
ミノ酸残基の全配列が分かっていない場合、ポリヌクレオチド配列を直接合成す
ることは不可能であり、選択される方法は、cDNA配列の合成である。目的のcDNA
配列を単離するための標準的な手法中には、プラスミド担持cDNAライブラリーも
しくはファージ担持cDNAライブラリーの形成があり、これらのライブラリーは、
遺伝子発現が高レベルで行われるドナー細胞に豊富にあるmRNAの逆転写により誘
導される。PCR技法と組み合わせて用いれば、希少な発現産物でもクローニング
することができる。そのポリペプチドのアミノ酸配列の大部分が分かっている場
合、標的cDNA中に存在すると推定される配列を複製する（duplicating）標識し
た一本鎖もしくは二本鎖のDNAまたはRNAプローブ配列の産生を、DNA/DNAハイブ
リダイゼーション手法において用いることができる。これらの手法は、一本鎖形
態へと変性したcDNAのクローニングされたコピーに対して行われる（Jayら, Nuc
l. Acid Res., 11:2325, 1983）。
【００８２】 λgt11等のcDNA発現ライブラリーを、GDF-8に対して特異的な抗体を用いて、
少なくとも１つのエピトープを有するGDF-8ペプチドについて間接的にスクリー
ニングすることができる。このような抗体は、ポリクローナルもしくはモノクロ
ーナルとして誘導されていてもよく、GDF-8 cDNAの存在を示す発現産物を検出す
るために用いることができる。
【００８３】 GDF-8をコードするポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを好適な宿主
細胞中に導入することによって、培養細胞中で発現させることができる。「宿主
細胞」とは、その中でベクターを増殖させることができる細胞であり、ベクター
が発現ベクターである場合は、そのベクターの中にクローニングされたポリヌク
レオチドを発現させることができる。「宿主細胞」という用語は、親宿主細胞の
あらゆる子孫を含む。複製中に突然変異が生じ得るため、全ての子孫が親細胞と
同一でない場合があることを理解されたい。しかし、「宿主細胞」という用語が
用いられる場合はこのような子孫は含まれる。導入されたポリヌクレオチドが宿
主細胞中に継続的に維持されるような細胞へのポリヌクレオチドの安定な導入方
法は、当技術分野において周知であり日常的である。
【００８４】 本発明において、GDF-8ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター中に挿入
することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、GDF-8遺伝子配列の
挿入または組込みにより操作されたプラスミド、ウイルスまたは当技術分野で公
知の他のビヒクル（vehicle）を指す。このような発現ベクターは、宿主の挿入
された遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモーター配列、複製起点を含
み、さらにそのベクターを含む細胞の表現型選択を可能とする特定の遺伝子配列
を含むことができる。本発明で使用するのに適したベクターとしては、細菌中で
の発現のためのT-7に基づく発現ベクター（Rosenbergら, Gene, 56:125, 1987）
、哺乳動物細胞中での発現のためのpMSXND発現ベクター（LeeおよびNathans, J.
Biol. Chem., 263: 3521, 1988）および昆虫細胞中における発現のためのバキ
ュロウイルス由来ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。DNAセグメン
トは、調節エレメント（例えばT7、メタロチオネインIまたはポリヘドリンプロ
モーターなどのプロモーター）に機能的に連結されたベクター中に存在すること
ができる。
【００８５】 GDF-8をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいず
れかの中で発現させることができる。宿主細胞としては、微生物、酵母、昆虫お
よび哺乳動物の生物が挙げられる。真核生物またはウイルスの配列を有するDNA
配列を原核生物中で発現させる方法は当技術分野において周知である。宿主中で
発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミド
DNAベクターは当技術分野において公知である。このようなベクターは、本発明
のDNA配列を組み込むために用いられる。好ましくは、GDF-8の成熟C末端領域は
、GDF-8の全コード配列を含むcDNAクローンから発現される。あるいは、GDF-8の
C末端部分を、TGF-βファミリーの他のメンバーのプロ-領域との融合タンパク質
として発現させたり、または他のプロ-領域と同時発現させたりすることができ
る（例えばHammondsら, Molec. Endocrinol., 5:149, 1991; GrayおよびMason,
Science, 247:1328, 1990）。
【００８６】 宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、当技術分野で周知の従来技法によ
って行うことができる。宿主細胞は、例えば、指数関数的増殖期後に回収した後
CaCl2法により（またはMgCl2もしくはRbClを用いて）処理した細胞から調製され
る、大腸菌コンピテント細胞等の原核細胞であってもよい。また、望ましい場合
は、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、形質転換を行うこともできる。
【００８７】 宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェク
ション、エレクトロポレーション、リポソームに入れたプラスミドの挿入などの
従来の機械的手法、またはウイルスベクター等の、このようなDNAのトランスフ
ェクション方法を用いることができる。また、真核細胞を、本発明のGDF-8をコ
ードするDNA配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来DNA分子（例え
ば単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子等）で同時形質転換することもできる。
他の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えばシミアンウイルス40（SV40）や
ウシパピローマウイルス等）を用いて真核細胞を一過性感染もしくは形質転換し
、タンパク質を発現させるものである（例えばEukaryotic Viral Vectors, Cold
Spring Harbor Laboratory, Gluzman編, 1982を参照されたい）。
【００８８】 発現ベクター（またはポリヌクレオチド）は一般に、コードポリヌクレオチド
の構成的な、もしくは望ましい場合は、誘導性の、または組織特異的なもしくは
発生段階特異的な発現を提供することができるプロモーター配列、ポリ-A-認識
配列、およびリボソーム認識部位もしくは内部リボソーム侵入部位、あるいは他
の調節エレメント（例えばエンハンサー（組織特異的であってもよい））を含む
もしくはコードする。また該ベクターは、原核生物もしくは真核生物宿主系、ま
たは望ましい場合はその両方における複製に必要なエレメントも含み得る。プラ
スミドベクターおよびウイルスベクター（例えばバクテリオファージ、バキュロ
ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイ
ルス、セムリキ森林熱ウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクター）を含むこ
のようなベクターは周知であり、一般購入したり（Promega, Madison WI; Strat
agene, La Jolla CA; GIBCO/BRL, Gaithersburg MD）、または当業者により構築
することができる（例えばMeth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel編（Academic Pr
ess, Inc., 1990）; Jolly, Canc. Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bio
energ. Biomemb. 25:37-42, 1993; Kirshenbaumら, J. Clin. Invest. 92: 381-
387, 1993(それぞれは、本明細書中に参照として組み込まれる)を参照されたい
）。
【００８９】 本発明のポリヌクレオチド、例えばアンチセンスGDF-8分子またはGDF-8ポリペ
プチドのドミナントネガティブ形態(これは、GDF受容体と天然GDF-8との相互作
用を減少もしくは阻害することができる）をコードするポリヌクレオチドの発現
を駆動するためには、テトラサイクリン（tet）誘導性プロモーターが特に有用
でありうる。tet誘導性プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを
含む被験者にテトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を投与すると、コ
ードされたアンチセンス分子もしくはドミナントネガティブGDF-8ペプチドの発
現が誘導され、これにより、該アンチセンス分子または該ペプチドはその活性を
発揮することができる。このような方法は、例えば成体生物において筋肉肥大を
誘導するために用いることができる。
【００９０】 また、コードされた分子の発現が個体の筋肉細胞または培養細胞の混合集団（
例えば器官培養物）中の筋肉細胞に限定されるように、該ポリヌクレオチドを、
例えば筋肉細胞特異的調節エレメントなどの組織特異的調節エレメントに機能的
に連結させることができる。例えば筋肉クレアチンキナーゼプロモーター（Ster
nbergら, Mol. Cell. Biol. 8: 2896-2909, 1988、これは、本明細書中に参照と
して組み込まれる）およびミオシン軽鎖エンハンサー/プロモーター（Donoghue
ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:5847-5851, 1991、これは、本明細書中に
参照として組み込まれる）を含めた筋細胞特異的調節エレメントは、当技術分野
で周知である。
【００９１】 ウイルス発現ベクターは、細胞内、特に被験者の細胞内にポリヌクレオチドを
導入するために特に有用でありうる。ウイルスベクターは、比較的高い効率で宿
主細胞に感染することができ、且つ特定の細胞型に感染することができる、とい
う利点を提供する。例えば、GDF-8ポリぺプチドもしくはその機能的ペプチド部
分をコードするポリヌクレオチドをバキュロウイルスベクター中にクローニング
して、次にこれを用いて昆虫宿主細胞に感染させることにより、大量のコード化
プロドメイン（prodomain）を産生する手段を提供することができる。また、ウ
イルスベクターは、目的の生物の細胞（例えば哺乳動物、鳥類または魚類宿主細
胞等の脊椎動物宿主細胞）に感染するウイルスから誘導することもできる。ウイ
ルスベクターは、本発明の方法を実施するのに有用なポリヌクレオチドを標的細
胞中に導入するのに特に有用でありうる。ウイルスベクターは、特定の宿主中で
使用するために開発されており、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）に基づく
ものなどのレトロウイルスベクター、他のレンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワク
シニアウイルスベクターなどが挙げられる（MillerおよびRosman, BioTechnique
s 7: 980-990, 1992; Andersonら, Nature 392:25-30 Suppl., 1998; Vermaおよ
びSomia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334:1185-11
87(1996)を参照されたい。これらはそれぞれ本明細書中に参照として組み込まれ
る）。
【００９２】 例えばレトロウイルスを遺伝子導入に用いる場合、複製能力のあるレトロウイ
ルスは、理論的には、そのレトロウイルスベクターを産生するために利用される
パッケージング細胞系中でのレトロウイルスベクターおよびウイルス遺伝子配列
の組換えによって発生することができる。組換えによる複製能力のあるウイルス
の産生がその内部で減少したまたは行われなくなったパッケージング細胞系を用
いることで、複製能力のあるレトロウイルスが産生される可能性を最小化するこ
とができる。細胞に感染するために用いられる全てのレトロウイルスベクターの
上清を、PCRや逆転写酵素アッセイ等の標準的なアッセイによって複製能力のあ
るウイルスについてスクリーニングする。レトロウイルスベクターにより、宿主
細胞ゲノム中への異種遺伝子の組込みが可能となり、これにより、該遺伝子が細
胞分割による娘細胞に譲り渡されることができるようになる。
【００９３】 ポリヌクレオチド（ベクター中に含まれていても良い）を、当技術分野で公知
の様々な方法によって細胞中に導入することができる（Sambrookら, Molecular
Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989);
Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John WileyおよびSons
, Baltimore, MD (1987, および1995までの増刊号)。これらはそれぞれ本明細書
中に参照として組み込まれる）。このような方法としては、例えばトランスフェ
クション、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーシ
ョン、およびウイルスベクターを用いた感染が挙げられ、さらにリポソーム、マ
イクロエマルション等の使用を含むことができる。リポソーム、マイクロエマル
ション等は、細胞へのポリヌクレオチドの導入を容易にし、該ポリヌクレオチド
が細胞中に導入される前に分解されるのを防ぐことができる。具体的方法は、例
えばそのポリヌクレオチドを導入する細胞、ならびに細胞が培養中で単離されて
いるか、または培養中もしくはin situの組織もしくは器官の中にあるか否かに
基づいて選択されるだろう。
【００９４】 ウイルスベクターを用いた感染による細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、
その核酸分子をex vivoまたはin vivoで細胞中に効率的に導入することができる
という点で特に有利である（例えば米国特許第5,399,346号を参照されたい。当
該文献は本明細書中に参照として組み込まれる）。さらに、ウイルスは非常に特
殊化されており、１種〜少数種の特定の細胞型に感染してこの中で増殖する能力
に基づいて、ベクターとして選択することができる。このように、これらの天然
の特異性を用いて、ベクター中に含まれる核酸分子を特定の細胞型にターゲッテ
ィングすることができる。例えば、HIVに基づくベクターはT細胞に感染させるた
めに用いることができ、アデノウイルスに基づくベクターは例えば呼吸上皮細胞
に感染させるために用いることができ、ヘルペスウイルスに基づくベクターは神
経細胞に感染させるために用いることができる等が挙げられる。アデノ随伴ウイ
ルス等の他のベクターは、より広い宿主細胞範囲を有し得るため、様々な細胞型
に感染させるために用いることができるが、ウイルスもしくは非ウイルスベクタ
ーを特定の受容体もしくはリガンドを用いて改変し、受容体を介した事象により
標的特異性を変更することもできる。トランスジーンを細胞内に導入する他の方
法について、以下に記載する。
【００９５】 本発明は、GDF-8ポリペプチドまたはその機能的ペプチド部分と免疫反応する
抗体を含む。本質的に異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクロー
ナル抗体からなる抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物が提供される
。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によりタンパク質の断片を含む抗
原から作製される（Kohlerら, Nature, 256:495, 1975）。本発明で使用される
「抗体」という用語は、完全な分子だけでなく、GDF-8上のエピトープ型決定基
（epitopic determinant）に結合することができるその抗原結合フラグメント（
例えばFabおよびF(ab')2、FvおよびSCAフラグメントなど）も含むことを意味す
る。
【００９６】 （１）Fabフラグメントは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントからなり、
パパイン酵素で抗体分子全体を消化して完全な軽鎖および重鎖の一部からなるフ
ラグメントを生成することにより作製することができる。
【００９７】 （２）抗体分子のFab'フラグメントは、ペプシンで抗体分子全体を処理した後に
還元を行い、完全な軽鎖および重鎖の一部からなる分子を生成することにより得
ることができる。このように処理した抗体分子１つにつき、２つのFab'フラグメ
ントが得られる。
【００９８】 （３）抗体の（Fab')2フラグメントは、ペプシン酵素で抗体分子全体を処理した
後に還元を行わずに得ることができる。（Fab')2フラグメントは、２つのジスル
フィド結合により保持された２つのFab'フラグメントからなる２量体である。
【００９９】 （４）Fvフラグメントは、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖
の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
【０１００】 （５）一本鎖抗体（「SCA」）は、好適で柔軟なポリペプチドリンカーにより結
合された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された一本鎖分
子である。
【０１０１】 本明細書中で使用される「エピトープ」という用語は、抗GDF-8抗体などの抗
体のパラトープが特異的に結合する、GDF-8ポリペプチドなどの抗原上の抗原決
定基を指す。抗原決定基は通常、化学的に活性な表面分子群（例えばアミノ酸ま
たは糖側鎖等）からなり、特定の３次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有し
得る。
【０１０２】 本明細書中で使用される「特異的に結合する」または「特異的結合活性」とい
う用語は、抗体に関して用いられる場合、その抗体と特定のエピトープとの相互
作用が、少なくとも約1×10-6、一般的には少なくとも約1×10-7、通常は少なく
とも約1×10-8、および特に少なくとも約1×10-9または約1×10-10以下の解離定
数を有することを意味する。例えば、水生生物GDF-8ポリペプチドのエピトープ
に対する特異的結合活性を保持する抗体のFab、F(ab')2、FdおよびFvフラグメン
トは、抗体の定義の範囲内に含まれる。本発明の目的のために、例えば水生生物
GDF-8ポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体は、その抗体がTGF-β
ファミリーメンバーに比べてミオスタチン受容体に対して少なくとも２倍大きな
結合親和性、一般的には少なくとも５倍大きな結合親和性、および特に少なくと
も１０倍大きな結合親和性を有する場合は、タンパク質のTGF-βファミリーの他
のメンバーまたは非水生生物GDF-8とは実質的には反応しないと考えられる。本
発明のこのような抗体は、例えば水生生物GDF-8ポリペプチドもしくはそのエピ
トープ部分に対して生じたポリクローナル抗体を、非水生生物GDF-8ポリペプチ
ドやTGF-βファミリーメンバー等を結合させたカラムに通過させて、そのカラム
に結合したタンパク質に結合しない抗体の画分を回収する等の一般的方法を用い
て得ることができる。
【０１０３】 本明細書中で使用される「抗体」という用語は、天然の抗体だけでなく、非天
然の抗体（例えば一本鎖抗体、キメラ、二機能性(bifunctional)およびヒト化抗
体等）、ならびにこれらの抗原結合フラグメントを含む。このような非天然の抗
体は、固相ペプチド合成を用いて構築したり、組換えにより産生したり、または
例えば可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリ
ーニングすることにより得ることができる（Huseら, Science 246: 1275-1281(1
989)を参照されたい。当該文献は本明細書中に参照として組み込まれる）。例え
ばキメラ抗体、ヒト化抗体、CDRグラフト(grafted)抗体、一本鎖抗体、および二
機能性抗体を作製するためのこれらの方法および他の方法は、当業者には周知で
ある（WinterおよびHarris, Immunol. Today 14:243-246, 1993; Wardら, Natur
e 341: 544-546, 1989; HarlowおよびLane, Antibodies: A laboratory manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyardら, Protein Engineer
ing: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineer
ing, 第２版(Oxford University Press 1995)。これらの文献はそれぞれ本明細
書中に参照として組み込まれる）。
【０１０４】 上記のように、GDF-8特異的抗体の産生に用いることができる抗原には、非水
生生物GDF-8ポリペプチドまたはGDF-8ポリペプチド断片が含まれる。動物を免疫
するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、標準的な組換え法、化学
的合成法、または精製法により得ることができる。当技術分野において周知であ
るように、免疫原性を高めるために、抗原を担体タンパク質にコンジュゲートさ
せることができる。一般的に用いられる担体としては、キーホールリンペットヘ
モシアニン（KLH）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）、および破
傷風トキソイドが挙げられる。次に結合したペプチドを用いて動物（例えばマウ
ス、ラットまたはウサギ）を免疫する。このような担体に加え、周知のアジュバ
ントを抗原と共に投与して強力な免疫応答の誘導を容易にすることができる。
【０１０５】 本発明は、筋肉または脂肪組織の細胞増殖性疾患を検出するための方法であっ
て、GDF-8関連疾患を有することが疑われる細胞に抗GDF-8抗体を接触させる工程
と、該抗体への結合を検出する工程とを含んでなる方法を提供する。「細胞増殖
性疾患」という用語は、本明細書中において、少なくとも部分的に、形態学的に
も遺伝子型的にも周囲の組織と異なるように見える場合が多い悪性細胞の存在ま
たは非悪性細胞集団の存在を特徴とする疾患を指すために用いられる。悪性細胞
（即ち癌）は、多段階プロセスの結果として発症する。アンチセンス分子である
GDF-8ポリヌクレオチドは、様々な器官系（特に筋肉もしくは脂肪組織における
細胞）の悪性病変の治療に有用である。本質的に、GDF-8の発現の変化と因果関
係がある疾患に対し、GDF-8薬剤（例えば抑制もしくは促進剤）を用いた治療が
有効であると考えることができる。このような疾患の１つとして、例えば悪性細
胞増殖疾患が挙げられる。
【０１０６】 GDF-8ポリペプチドに特異的に結合する抗体を、GDF-8への結合を検出できるよ
うにする化合物で標識することができる。このような抗体を用いて、生物学的液
体または組織の中のGDF-8レベルを検出することができる。検出可能な量の抗原
を含む試料を使用することができる。本発明の好適なサンプルは筋肉組織である
。疑わしい細胞サンプル中のGDF-8レベルを、正常細胞サンプル中の当該レベル
と比較して、その被験者がGDF-8関連細胞増殖性疾患を有するか否かを決定する
ことができる。あるいは、例えばノーザンブロット分析により、GDF-8核酸を検
出し、GDF-8ポリヌクレオチドから転写されたmRNAのレベルを決定することがで
きる。
【０１０７】 本発明の抗体は、in vitroまたはin vivoでの免疫診断または免疫治療を利用
することが望ましい任意の被験者において使用することができる。本発明の抗体
は、例えば、これらの抗体を液相中で利用するか、または固相担体に結合するこ
とができるイムノアッセイでの使用に適している。さらに、これらのイムノアッ
セイにおける抗体は種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗
体を利用することができるイムノアッセイのタイプの例としては、直接的もしく
は間接的な形式での競合および非競合イムノアッセイが挙げられる。このような
イムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（RIA）およびサンドイッ
チ（免疫測定（immunometric））アッセイが挙げられる。本発明の抗体を用いた
抗原の検出は、順方向、逆方向、または同時モードで実行されるイムノアッセイ
を用いて行うことができ、このようなイムノアッセイとしては、例えば生理学的
サンプルに対する免疫組織化学的アッセイが挙げられる。当業者であれば、過度
の実験を行わなくても、他のイムノアッセイ形式が分かるであろうし、またはこ
れを簡単に認識することができるであろう。
【０１０８】 本発明の抗体を多くの様々な担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含む
抗原の存在を検出するために用いることができる。周知の担体の例としては、ガ
ラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン
、アミラーゼ、天然もしくは改変したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロ
ースおよび磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためには、可溶
性であっても不溶性であってもよい。当業者であれば、抗体の結合に適した他の
担体を知っているであろうし、また一般的な実験によりこのようなものを確認す
ることができるであろう。
【０１０９】 当業者には、多くの様々な標識および標識方法が知られている。本発明で使用
することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コ
ロイド状金属、化学発光化合物、リン光化合物および生物発光化合物が含まれる
。当業者であれば、抗体の結合に適した他の標識を知っているであろうし、また
一般的実験によりこのような標識を確認することができるであろう。
【０１１０】 さらにより高い検出感度を提供することができる他の技法は、低分子量ハプテ
ンに抗体を結合させることからなる。次にこれらのハプテンを二次反応により特
異的に検出することができる。例えば、アビジンに反応するビオチンまたは特定
の抗ハプテン抗体に反応することができるジニトロフェニル、プリドキサール（
puridoxal）、およびフルオレセイン等のこのようなハプテンを使用することは
一般的である。
【０１１１】 抗原のin vivo検出のために本発明のモノクローナル抗体を用いる際、検出可
能に標識された抗体は、診断上有効な投与量で与えられる。「診断上有効な」と
いう用語は、検出可能に標識されたモノクローナル抗体の量が、そのモノクロー
ナル抗体が特異的に結合する本発明のポリペプチドを含む抗原を有する部位の検
出を可能とするのに十分な量で投与されることを意味する。
【０１１２】 投与される検出可能に標識されたモノクローナル抗体の濃度は、ポリペプチド
を有する細胞への結合がバックグラウンドと比較して検出可能である程度に十分
なのものでなければならない。さらに、バックグラウンドに対する標的の最良シ
グナル比を得るために、検出可能に標識されたモノクローナル抗体は循環系から
急速に排除されることが望ましい。一般的に、in vivo診断のための検出可能に
標識されたモノクローナル抗体の投与量は、その個体の年齢、性別および疾患の
程度等の要因によって様々であろう。このような投与量は、例えば注射を複数回
行うか否か、抗原負荷、および当業者に周知の他の要因によって様々であり得る
。
【０１１３】 in vivo診断画像の形成のために、利用可能な検出器具のタイプは、所定の放
射性同位体を選択する際の重要な要因である。選択された放射性同位体は、所定
の器具のタイプにとって検出可能な崩壊(decay)タイプを有するものでなければ
ならない。in vivo診断のための放射性同位体の選択におけるさらに他の重要な
要因は、宿主に対する有害な照射を最小にすることである。理想的には、in viv
o画像形成に使用される放射性同位体は、粒子放射は起きないが、140〜250keV範
囲（従来のγカメラにより簡単に検出することができる）の大量のフォトンを生
成する。
【０１１４】 in vivo診断のために、放射性同位体は、中間官能基（intermediate function
al group）を用いて直接的もしくは間接的にイムノグロブリンに結合させること
ができる。金属イオンとして存在する放射性同位体をイムノグロブリンに結合す
るために使用されることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン５酢酸（DT
PA）およびエチレンジアミン４酢酸（EDTA）等の二官能性キレート剤ならびに類
似分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合することができる金属イオン
の典型的な例としては、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zrおよび201Tlが挙
げられる。
【０１１５】 また、核磁気共鳴映像法（MRI）または電子スピン共鳴法（ESR）におけるよう
に、in vivo診断の目的のために、本発明のモノクローナル抗体を常磁性同位体
で標識することもできる。一般的に、診断画像を可視化するための任意の従来方
法を利用することができる。通常は、カメラによる画像形成ではγ線および陽電
子を放出する放射線同位体が用いられ、MRIでは常磁性同位体が用いられる。こ
のような技法において特に有用な元素としては、157Gd、55Mn、162Dy、52Crおよ
び56Feが挙げられる。
【０１１６】 本発明のモノクローナル抗体は、被験者のGDF-8関連疾患の改善の過程を観察
するために、in vitroおよびin vivoにおいて使用することができる。従って、
例えば本発明のポリペプチドを含む抗原を発現している細胞数の増加もしくは減
少を測定することによって、または種々の体液中に存在するこのような抗原の濃
度の変化を測定することによって、GDF-8関連疾患の改善を目的とした特定の治
療法が効果的であるかどうかを決定することができる。「改善する」という用語
は、治療を受けている被験者において、GDF-8関連疾患の有害な影響を減少させ
ることを意味する。
【０１１７】 本発明は、正常な細胞における発現と比べて改変された様式で発現することが
できるポリヌクレオチド配列を同定している。よって、このポリヌクレオチド配
列に従った適切な治療技術または診断技術を設計することができる。治療はGDF-
8レベルまたはその活性を調節する試薬の投与を含む。「調節する」という用語
は、過剰発現時のGDF-8の抑制もしくは発現、または過少発現時のGDF-8発現の増
加を含む。筋関連障害がGDF-8の過剰発現と関連している時、アンチセンスGDF-8
ポリヌクレオチド配列またはGDF-8結合抗体のような抑制試薬を細胞に導入する
ことができる。加えて、本発明のGDF-8に結合するモノクローナル抗体に結合す
る抗イディオタイプ抗体、またはそのエピトープも、本発明の治療法に使用する
ことができる。あるいは、細胞増殖障害が変異GDF-8ポリペプチドの過少発現も
しくは過剰発現と関連している時には、センスポリヌクレオチド配列（DNAコー
ディング鎖）またはGDF-8ポリペプチドを細胞に導入することができる。このよ
うな筋関連障害には、癌、筋ジストロフィー、脊髄損傷、外傷、鬱血性閉塞性肺
疾患（COPD）、エイズ、または悪液質が含まれる。
【０１１８】 このように、細胞増殖障害がGDF-8の発現と関連している場合、翻訳レベルでG
DF-8発現を妨げる核酸配列を使用することができる。このアプローチでは、例え
ば、アンチセンス核酸を用いたそのmRNAの遮蔽、またはリボザイムを用いたその
切断のいずれかによって、特異的なGDF-8 mRNAの翻訳を妨げるために、アンチセ
ンス核酸およびリボザイムを利用する。このような障害には、例えば神経変性疾
患が含まれる。加えて、ドミナントネガティブGDF-8変異は、細胞内の未変性GDF
-8の正常な機能を積極的に妨げるために使用できる。
【０１１９】 本明細書で開示したように、アンチセンス分子、リボザイム、または三重鎖形
成剤は、本発明の方法を実行するために有用である。例えば、ポリヌクレオチド
は、GDF-8タンパク質発現のアンタゴニストとして作用するアンチセンスGDF-8ヌ
クレオチド配列となる（もしくはそれをコードする）ことができ、その結果、筋
肉量を増加させる、または、生物の脂肪含有量を減少させる。このようなポリヌ
クレオチドは、標的細胞に直接接触することができ、細胞による取り込みの際に
、それらのアンチセンス、リボザイムもしくは三重鎖形成活性をもたらすことが
できる。または、このようなポリヌクレオチドは、細胞に導入されるポリヌクレ
オチドによってコードされ、そこでポリヌクレオチドが発現して、例えばアンチ
センスRNA分子或いはリボザイムを生産し、その活性をもたらす。
【０１２０】 アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または三重鎖形成剤は、標的配
列に相補的であり、DNA配列もしくは、例えばメッセンジャーRNAのようなRNA配
列であってよく、およびコード配列、イントロン-エキソン連結部、シャイン-ダ
ルガーノ配列のような調節配列、またはその他の配列を含むヌクレオチド配列が
標的配列であってよい。相補性の程度は、ポリヌクレオチド、例えばアンチセン
スポリヌクレオチドが、細胞内の標的配列と特異的に相互作用することができる
程度である。アンチセンスまたは他のポリヌクレオチド全体の長さに依存して、
標的配列との１つもしくは少数のミスマッチは、標的配列に対するポリヌクレオ
チドの特異性を失わない場合許容される。従って、例えば２０ヌクレオチドから
成るアンチセンス分子では、許容されるミスマッチはあるとしてもごくわずかだ
が、一方、例えば細胞のポリペプチドをコードする標的mRNAの全長に相補的な、
アンチセンス分子のハイブリダイゼーション効率には、数個のミスマッチは影響
しないと思われる。許容しうるミスマッチの数は、例えばハイブリダイゼーショ
ン速度論を決定する周知の公式によって概算でき（Sambrookら、上述, 1989参照
）、または、本明細書で開示されたようなもしくは当技術分野で知られている他
の方法を用いて、特に、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム
、或いは三重鎖形成剤の存在が、標的配列のレベル或いは細胞内の標的配列にコ
ードされるポリペプチドの発現レベルを減少させることの決定によって、経験的
に決定できる。
【０１２１】 アンチセンス分子、リボザイム、もしくは三重鎖形成剤として有用なポリヌク
レオチドは、標的核酸分子の翻訳を阻害、または標的核酸分子を切断でき、その
結果細胞内のGDF-8レベルが減少する。アンチセンス分子は、例えば、mRNAに結
合して、細胞内で翻訳できない２本鎖分子を形成しうる。容易に合成され、標的
配列に特異的にハイブリダイズできるため、少なくとも約１５から２５ヌクレオ
チドのアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましいが、標的細胞に導入したポリ
ヌクレオチドからより長いアンチセンス分子を発現させることができる。アンチ
センス分子として有用な特異的ヌクレオチド配列は、例えば遺伝子歩行のような
有名な方法（例えば、参照により本明細書に組み入れた、Seimiyaら、J. Biol.
Chem. 272;4631-4636(1997)参照）を用いて同定できる。標的細胞に直接接触す
る場合、アンチセンス分子は、ハイブリダイゼーション部位で標的RNAを切断す
る鉄結合EDTAのような化学反応基と、機能しうる形で結合することができる。こ
れと比較して、三重鎖形成剤は転写を止めることができる（Maherら、Antisense
Res. Devel. 1:227 (1991); Helene, Anticancer Drug Design 6:569 (1991)）
。従って、三重鎖形成剤はGDF-8遺伝子調節エレメントの配列を認識するように
設計することができ、その結果、細胞内のGDF-8ポリペプチドの発現を減少させ
る、または阻害する。
【０１２２】 アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的なDNAまたはR
NA分子である（Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990）。細胞内で、
アンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズし、２本鎖分子を形成する。
細胞は２本鎖mRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はそのmRNAの翻訳を妨げ
る。
【０１２３】 容易に合成され、GDF-8産生標的細胞に導入する際、より大きい分子より問題
が起こりにくいため、約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい
。in vitroでの遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当技術
分野でよく知られている（Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988）。
【０１２４】 リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと類似の方法で、他の１本鎖RNAを
特異的に切断する能力を持つRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオ
チド配列の改変によって、RNA分子内の特異的なヌクレオチド配列を認識し、そ
れを切断する分子を設計することが可能である（Cech, J. Amer. Med. Assn., 2 60 :3030, 1988）。このアプローチの主な利点は、配列特異的であるために、特
定の配列を持つmRNAsのみが不活性化されることである。
【０１２５】 リボザイムには２つの基本タイプがある。すなわち、テトラヒメナタイプ（Ha
sselhoff, Nature, 334:585, 1988）および「ハンマーヘッド」タイプである。
テトラヒメナタイプリボザイムは長さ４塩基の配列を認識し、一方ハンマーヘッ
ドタイプリボザイムは長さ１１から１８塩基の配列を認識する。認識配列が長い
ほど、標的mRNA分子種に限定的に現れる可能性が大きい。従って、特異的なmRNA
分子種を不活性化するために、ハンマーヘッドタイプリボザイムはテトラヒメナ
タイプリボザイムよりも望ましく、１８塩基認識配列はより短い認識配列よりも
望ましい。
【０１２６】 本発明はまた、GDF-8に媒介される細胞増殖障害または免疫疾患の治療のため
の遺伝子治療法を提供する。この治療法は、細胞増殖障害を示すまたはそれに関
連した細胞に、GDF-8アンチセンスポリヌクレオチドを導入することによって、
その治療効果を実現する。アンチセンスGDF-8ポリヌクレオチドの送達は、キメ
ラウイルスのような組換え発現ベクター、またはコロイド分散系を用いて行われ
る。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の治療送達のためには、標的リ
ポソームの使用が望ましい。対照的に、GDF-8産生を向上させたい時には、GDF-8
ポリヌクレオチドは適切な細胞または細胞群に導入される。
【０１２７】 本明細書で教示したように、遺伝子治療に利用しうる種々のウイルスベクター
は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくはレト
ロウイルスのようなRNAウイルスを含む。レトロウイルスベクターには、マウス
または鳥類のレトロウイルス誘導体が好まれる。単一の外来遺伝子を挿入できる
レトロウイルスの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウ
イルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含むが、それに限ら
ない。更に幾つかのレトロウイルスベクターには、複数の遺伝子を組み込むこと
ができる。これらのベクター全てに、形質導入された細胞を同定し、作成できる
ように選択マーカー用の遺伝子を導入または組み込むことができる。ウイルスベ
クターに、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別のポリヌ
クレオチドとともに、対象のGDF-8ポリヌクレオチド配列を挿入することによっ
て、ベクターは標的特異的にされる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、
糖脂質、またはタンパク質の付加によって、標的特異的にされうる。望ましいタ
ーゲッティングは、レトロウイルスベクターを標的にする抗体によって達成され
る。当業者は、GDF-8アンチセンスポリヌクレオチドを包含しているレトロウイ
ルスベクターの標的特異的な送達を可能にするための、レトロウイルスゲノムに
挿入されうる、またはウイルスエンベロープに付加されうる、特異的なポリヌク
レオチド配列を知っているか、または過度の実験なしに容易に確かめることがで
きる。
【０１２８】 組換えレトロウイルスは不完全であるため、感染性のベクター粒子を生産する
ためには助力を必要とする。この助力は、例えば、LTR内の調節配列の制御下で
レトロウイルスのすべての構造遺伝子をコードするプラスミドを含む、ヘルパー
細胞系によって供給されうる。これらのプラスミドは、カプセルに入れるために
RNA転写産物を認識するための、パッケージング機構を可能にするヌクレオチド
配列を欠損している。パッケージングシグナルに欠損を持つヘルパー細胞系は、
例えばψ2、PA317、およびPA12を含むが、それに限らない。これらの細胞系は、
ゲノムがパッケージングされないため、空のビリオンを生産する。パッケージン
グシグナルは完全であるが、構造遺伝子が他の対象の遺伝子に置換されているレ
トロウイルスベクターが、このような細胞に導入されると、ベクターはパッケー
ジングされ、ベクタービリオンが生産される。
【０１２９】 あるいは、NIH3T3または他の組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトラン
スフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子、gag、pol、およびenvを
コードするプラスミドで直接トランスフェクトされうる。これらの細胞はその後
、対象の遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。その結果
生じる細胞はレトロウイルスベクターを培養液中に放出する。
【０１３０】 GDF-8アンチセンスポリヌクレオチドのためのもう一つの標的送達系は、コロ
イド分散系である。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロス
フェア、ビーズ、あるいは、水中油滴型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、お
よびリポソームを含む脂質性の系を含む。この発明で好まれるコロイド系はリポ
ソームである。リポソームは、in vitroおよびin vivoにおける送達媒体として
有用な人工膜小胞である。サイズ0.2から4.0 μmの範囲の、大きな単層の小胞（
large unilamellar vesicles, LUV）は、大きな高分子を含む、十分な率の水性
バッファーを包み込めることが示されている。RNA、DNA、および完全なビリオン
は、生物学的に活性な形で、水性の内部に包み込まれ、送達されうる（Fraleyら
、Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981）。哺乳類の細胞に加えて、植物、酵母、
および細菌の細胞にポリヌクレオチドを送達するために、リポソームが用いられ
ている。リポソームにとって、効率のよい遺伝子輸送媒体であるために、以下の
性質が備わっているべきである：１）高い効率で対象の遺伝子を包み込み、生物
学的活性を損なわないこと、２）非標的細胞と比較して、標的細胞に選択的かつ
十分に結合すること、３）高い効率で標的細胞の細胞質に小胞の水性内容物を送
達すること、および４）遺伝情報の正確かつ効率的な発現である（Manningら、B
ioTechniques, 6:682, 1988）。
【０１３１】 リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組合わせた、
リン脂質、特に高相転移温度のリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質また
は他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的性質は、pH、イオン強
度、および２価の陽イオンの存在に依存する。
【０１３２】 リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファ
チジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンのよう
なホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシ
ドを含む。脂質部分が14から18の炭素原子、特に16から18の炭素原子を含み、飽
和している、ジアシルホスファチジルグリセロールは、特に有用である。リン脂
質の例は、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、
およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【０１３３】 リポソームのターゲッティングは、解剖学上および機構上の要因に基づいて分
類される。解剖学上の分類は、例えば器官特異的、細胞特異的、およびオルガネ
ラ特異的のような、選択性のレベルに基づく。機構上のターゲッティングは、受
動的または能動的であるかどうかに基づいて識別される。受動的ターゲッティン
グは、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系（RES）の細胞に分布する、リポ
ソームの自然な傾向を利用する。一方、能動的ターゲッティングは、天然の局在
部位以外の器官や細胞タイプへのターゲッティングを達成するために、リポソー
ムをモノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質のような特異的リガ
ンドと結合させることによる、またはリポソームの組成或いはサイズを変えるこ
とによる、リポソームの改変を伴う。
【０１３４】 標的送達システムの表面は様々な方法で修飾されうる。リポソーム標的送達シ
ステムの場合、安定なリポソーム二重層への会合で標的リガンドを維持するため
に、脂質基はリポソームの脂質二重層に組み込まれることができる。様々な結合
基が、標的リガンドに脂質鎖を結合させるために使用される。
【０１３５】 筋肉および脂肪組織でのGDF-8の発現の結果、これらの組織に関わる、発明の
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を使用する様々な応用がある。こ
のような応用は、これらの組織および神経組織のような他の組織に関わる細胞増
殖障害の治療を含む。加えて、GDF-8は種々の遺伝子治療法に有用である。GDF-8
ポリペプチドを被験者に投与する実施形態では、その投与量の範囲は約0.1μg/k
g〜100mg/kg、より好ましくは約1μg/kg〜75mg/kg、最も好ましくは約10mg/kg〜
50mg/kgである。
【０１３６】 ヒトGDF-8遺伝子は、染色体２に位置する（実施例６参照）。様々なヒトの障
害の遺伝地図上の位置とGDF-8の染色体上の位置との比較によって、ヒト疾患の
病因におけるGDF-8遺伝子変異の役割を決定できる。例えば、若年性筋萎縮性側
索硬化症の常染色体劣性型は染色体２に位置する（Hentatiら、Neurology, 42,
Suppl.3:201, 1992）。GDF-8の更に正確なマッピングとこれらの患者からのDNA
の解析は、GDF-8が、実際に、この疾患に影響を及ぼす遺伝子であると確かめる
ことができる。加えて、GDF-8は他の染色体と染色体２との識別に有用である。
【０１３７】 本発明はまた、対応する非トランスジェニック動物によって正常に発現される
レベルと比較してGDF-8の発現レベルが変化している、非ヒトトランスジェニッ
ク動物、特にトランスジェニック水生生物を提供する。本発明のトランスジェニ
ック動物を作成するために様々な方法が採用されうる。一般に、このような３つ
の方法が採用されうる。１つの方法では、前核期の胚（「１細胞胚」）をメスか
ら採収し、トランスジーンを胚にマイクロインジェクションする。この場合、ト
ランスジーンは、結果的に生じる動物成体の生殖細胞と体細胞の両方の染色体に
組み込まれる。別の方法では、胚性幹細胞を単離し、トランスジーンをその中に
、エレクトロポレーション、プラスミドトランスフェクション、またはマイクロ
インジェクションによって組み込む。続いて、胚にその幹細胞を再導入し、そこ
でそれらはコロニーを形成し、生殖細胞系に寄与する。哺乳動物種のマイクロイ
ンジェクション法は、米国特許第4,873,191号に記述され、本発明の目的に適合
させうる。もう１つの方法では、胚細胞をトランスジーンを含むレトロウイルス
に感染させ、それによって、胚の生殖細胞はその染色体に組み込まれたトランス
ジーンを持つ。トランスジェニックを作成される動物が鳥類の時、鳥類の受精し
た卵子は一般的に最初の２０時間のうちに卵管内で細胞分裂を起こすので、受精
卵の前核へのマイクロインジェクションは、前核に接近できないため問題がある
。そのため、一般的に上述したトランスジェニック動物作成方法のうち、例えば
米国特許第5,162,215号に記述されたような、レトロウイルス感染が鳥類の種で
は好まれる。しかし、鳥類の種でマイクロインジェクションを用いるならば、最
近Loveらによって発表された手順（Biotechnology, 12, Jan 1994）が利用でき
る。それによって、以前に生まれた卵の産卵のおよそ２時間半後に屠殺された雌
鶏から胚が得られ、その胚盤の細胞質にトランスジーンをマイクロインジェクシ
ョンして、胚が成熟するまで宿主の卵殻内で培養される。トランスジェニックを
作成される動物がウシまたはブタの時、卵子の不透明性によって、従来の微分干
渉コントラスト顕微鏡による核の識別が困難なため、マイクロインジェクション
は妨げられる。この問題を克服するため、まず卵子を遠心して、より明視化する
ために前核を分離する。
【０１３８】 本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、または鳥類
の動物であってよく、また、動物の生殖細胞系列へのトランスジーンの導入によ
って作成されうる、魚類のような水生生物が好ましい。トランスジーンを導入す
るために、様々な発生段階の胚の標的細胞が用いられる。胚の標的細胞の発生段
階に応じて、異なる方法が用いられる。接合子はマイクロインジェクションに最
良の標的である。遺伝子転移の標的としての接合子の使用は、多くの場合、注入
されたDNAが最初の分裂の前に宿主遺伝子に組み込まれるという、大きな利点を
持っている（Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985）
。その結果、非ヒトトランスジェニック動物のすべての細胞は、組み込まれたト
ランスジーンを持つ。その生殖細胞の50％はトランスジーンを持つので、一般に
、創始者の子孫へのトランスジーンの有効な伝達にも反映される。
【０１３９】 「トランスジェニック」という用語は、すべての細胞に外因性の遺伝物質を持
つ動物を記述するために使用される。トランスジェニック動物は、その生殖細胞
に外因性の遺伝物質を持つ２匹のキメラ動物を交雑することによって、作成する
ことができる。その結果生じる子の25パーセントは、トランスジェニック、すな
わち、すべての細胞の両方の対立遺伝子に外因性の遺伝物質を持つ動物となる。
その結果生じる動物の50パーセントは１つの対立遺伝子に外因性の遺伝物質を含
み、25％は外因性の遺伝物質を含まない。
【０１４０】 本発明の実施に有用なマイクロインジェクション法において、トランスジーン
は、あらゆるベクターDNAから消化され、例えば、ゲル電気泳動によって精製さ
れる。トランスジーンは、転写に関わる細胞タンパク質と相互作用し、その結果
構成的に発現するために、機能しうる形で連結されたプロモーターを含むことが
好ましい。この点について有用なプロモーターは、メタロチオネイン、骨格アク
チン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホグリセリン酸、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素、およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子のプロモーター
と同様に、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、またはヘルペスウ
イルスからのプロモーターを含む。ラウス肉腫ウイルスのような、ウイルスの長
末端反復配列のプロモーターもまた用いることができる。トランスジェニックを
作成される動物が鳥類の時、好ましいプロモーターは、トリβ-グロビン遺伝子
、トリリゾチーム遺伝子、およびトリ白血病ウイルスのプロモーターを含む。胚
性幹細胞のプラスミドトランスフェクションに有用な構築物は、転写を活発にす
るエンハンサーエレメント、スプライス受容体、終止およびポリアデニル化シグ
ナル、あるいは翻訳を可能にするリボゾーム結合部位のような、当技術分野でよ
く知られている付加的な調節エレメントを用いる。
【０１４１】 レトロウイルス感染もまた、上述のようなヒト以外の動物へのトランスジーン
の導入のために用いられる。発生している非ヒト胚は、in vitroで胚盤胞まで培
養できる。この間、卵割球はレトロウイルス感染の標的となりうる（Jaenich, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-1264, 1976）。効率のよい卵割球の感染は
、透明帯を除去するための酵素処理によって得られる（Hoganら、(1986) Manipu
lating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor NYより）。トランスジーンを導入するために用いられるウイルスベク
ター系は、一般的にはトランスジーンを持った、複製に欠陥のあるレトロウイル
スである（Jahnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931, 1985; Van d
er Puttenら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985）。トランス
フェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培養することによって、
容易且つ効率的に得られる（Van der Puttenら、上述、1985; Stewartら、EMBO
J. 6:383-388, 1987）。あるいは、感染はより遅い段階で行ってもよい。ウイル
スまたはウイルス産生細胞は、卵割腔に注入できる（Jahnerら、Nature 298:623
-628, 1982）。組み込みは非ヒトトランスジェニック動物を形成する細胞の部分
集団でのみ起こっているため、その創始者の大部分は、トランスジーンについて
モザイクである。更に、その創始者は、一般に子に分離するゲノム中の異なる位
置に、レトロウイルスによるトランスジーンの様々な挿入を持つ。加えて、効率
は低いが、妊娠中期の胚の子宮内でのレトロウイルス感染によっても、生殖細胞
系列にトランスジーンを導入することは可能である（Jahnerら、上述, 1982）。
【０１４２】 トランスジーン導入のための第三の標的細胞のタイプは、胚性幹細胞（ES）で
ある。ES細胞は、in vitroで培養された着床前の胚から得られ、胚に融合させら
れる（Evansら、Nature 292:154-156, 1981; Bradleyら、Nature 309:255-258,
1984; Gosslerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069, 1986; およびRo
bertsonら、Nature 322:445-448, 1986）。トランスジーンは、DNAトランスフェ
クションまたはレトロウイルスを介した形質導入によって、効率よくES細胞に導
入されうる。このように形質転換されたES細胞は、その後、ヒト以外の動物から
の胚盤胞と合併される。ES細胞は、その後、胚でコロニーを形成し、その結果生
じたキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する（総説として、Jaenisch, Science 24 0 :1468-1474, 1988参照）。トランスジェニック動物に関して使われる時、「形
質転換した」とは、組換え核酸技術によって、異種の核酸分子を導入された（ま
たは、該分子がその先祖に導入された）細胞を意味し、「異種の」という用語は
、別の種に由来するか、その最初の型もしくは本来細胞で発現されていた型から
改変されているか、いずれかのポリヌクレオチドを意味する。
【０１４３】 「トランスジーン」という用語は、細胞に技術を用いて挿入され、その細胞か
ら発生した生物のゲノムの一部となる（すなわち、恒常的に組み込まれる、また
は恒常的な染色体外エレメントとなる）、あらゆるポリヌクレオチドを言うため
に使用される。トランスジーンは、トランスジェニック生物にとって部分的もし
くは完全に異種の（すなわち外来の）遺伝子であってよく、またはその生物の内
在性の遺伝子と相同な遺伝子であってよい。DNAに転写されゲノムに組み込まれ
るRNA配列を提供することによって作られるトランスジーンは、この定義に含ま
れる。発明のトランスジーンは、非ヒトトランスジェニック動物で発現できる、
GDF-8をコードするポリヌクレオチド、センスまたはアンチセンスのポリヌクレ
オチドを含む。
【０１４４】 「トランスジェニック」という用語は、さらに本明細書で用いられる場合、in
vitroでの初期胚もしくは受精卵の操作によって、または特異的な遺伝子のノッ
クアウトを誘導するあらゆるトランスジェニック技術によってゲノムが改変され
た、ヒト以外（非ヒト）のあらゆる生物、特に、水性生物を含む。「遺伝子のノ
ックアウト」という用語は、当業者によく知られているあらゆるトランスジェニ
ック技術によって達成された、機能の完全な欠損を伴う、in vivoでの遺伝子の
標的破壊を言う。１つの実施形態では、遺伝子のノックアウトを持つトランスジ
ェニック動物は、無機能にすべき遺伝子を標的とした、相同組換えによる挿入に
よって、標的遺伝子が無機能にされているものである。本明細書で使われる時、
「トランスジェニック」という用語は、導入遺伝子を持つヒト以外の生物、また
は内在性遺伝子が無機能になっているか、もしくは「ノックアウト」されている
生物を作成することができる、当業者によく知られているあらゆるトランスジェ
ニック技術を含む。
【０１４５】 本発明の実施に用いられるトランスジーンは、修正されたGDF-8コード配列か
ら成るポリヌクレオチドである。好ましい実施例では、内在性のGDF-8遺伝子は
、胚性幹細胞において相同ターゲッティングによって破壊される。例えば、GDF-
8遺伝子の完全な成熟C末端領域は、下に述べたように欠失させうる（実施例８参
照）。GDF-8の破壊または欠失は、任意に、（例えば、ドミナントネガティブGDF
-8ポリペプチドをコードする）機能を持たないGDF-8配列のような、別のポリヌ
クレオチドの挿入または該ポリヌクレオチドによる置換を伴う。他の実施形態で
は、トランスジーンは、GDF-8遺伝子または転写産物の一部に対するアンチセン
ス分子から成る。別の実施形態では、トランスジーンは、GDF-8に特異的に結合
できる抗体または受容体のペプチド配列をコードするDNAから成る。GDF-8のポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それらの細胞内局在性および活性と同
様に、本明細書に開示されているか、または当技術分野で知られている（例えば
、参照により本明細書に組み入れられり国際公開WO94/21681参照）。適切な場合
には、GDF-8活性を持つタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重のため核
酸配列が異なるポリヌクレオチドも、末端切断型、対立遺伝子変異型、および種
間相同体のように、本明細書で用いることができる。
【０１４６】 特定の実施形態では、本発明のトランスジェニック生物は水生生物である。鰭
魚、軟体動物などのトランスジェニック水生生物を作成する方法は、当技術分野
で知られており、（例えば、米国特許第5,675,061号のトランスジェニックアワ
ビ、米国特許第5,545,808号のトランスジェニックサケ参照。また、Molecular B
iology of Fishers第２巻（HochachkaおよびMommsen編、1993）中のHackettの「
トランスジェニック魚類の分子生物学」参照。HahnのHandbook of Culture of A
balone and Other Marine Gastropods (Hahn編、CRC Press, Inc., Boca Raton
FL 1989) 71-98ページ参照。Transgenic Fish (Hew編、World Scientific Publi
shing Co., Singapore, 1992a) 120-141ページのMoavらの「トランスジェニック
魚類における異種遺伝子の発現」参照。"Transgenic Models in Medicine and A
griculture" (Wiley-Liss, Inc.) 127-139ページのChen(1990)らの「ニジマスの
、あるいはコイとドジョウにおけるヒト成長ホルモン遺伝子の遺伝子導入、発現
および遺伝」; ChenおよびEvans, BioTechniques, 8:32-33, 1990; Chongおよび
Vielkind, Theor. Appl. Genet. 78: 369-380 (1989); Daviesら、"Methods in
Molecular Biology" (Elsevier Science Publishing Co. 1986)より; "Oxford S
urveys on Eukaryotic Gene" 6:85-110 (編Norman Maclean, Oxford University
Press 1989) 中のDaviesらの「魚類の不凍タンパク質遺伝子、およびトランス
ジェニック研究におけるそれらの使用」）これらは参照により本明細書に組み込
まれる。
【０１４７】 発明のトランスジェニック生物はまた、GDF-8遺伝子にヘテロ接合変異を持つ
ものも含む。ヘテロ接合トランスジェニックは、ホモ接合による破壊を有する生
物（最大の増加）、または妨害されたGDF-8を持たない野生型の生物（正常な筋
肉）と比較して、中間的な筋肉量の増加を示す。
【０１４８】 マイクロインジェクションされた後、トランスフェクトされた胚性幹細胞でコ
ロニー形成された後、またはトランスジーンを含むレトロウイルス感染させられ
た後（本明細書の他の場所で説明した、鳥類の種における本発明の実施を除く）
、胚は偽妊娠したメスの卵管に移植される。その結果生じた子孫は、トランスジ
ーン特異的プローブを用いた血液サンプルのサザンブロット解析によって、トラ
ンスジーンの組み込みについて試験される。この点について、PCRは特に有用で
ある。陽性の子孫（G0）を交雑して子孫（G1）を作り、そのトランスジーンの発
現を組織サンプルのノザンブロット解析によって解析する。同種のトランスジー
ンの発現と、トランスジェニック動物の内在性GDF-8遺伝子の発現との識別を容
易にするために、マーカー遺伝子断片が構築物のトランスジーンの3'非翻訳領域
に含まれてもよく、ノザンブロットプローブをマーカー遺伝子断片を検出するよ
う設計してもよい。適切な発現を確立するため、トランスジェニック動物でのGD
F-8の血清レベルを測定することも可能である。GDF-8トランスジーンの発現と、
それによるトランスジェニック動物の組織および血清レベルでのGDF-8の減少と
、その結果生じる筋組織量の増加によって、著しく増加した筋肉含有量を持ち、
好ましくは脂肪とコレステロールのレベルが増加しない、より好ましくは脂肪と
コレステロールのレベルが減少した、これらの動物からの食料品（すなわち卵、
牛肉、豚肉、魚、鳥肉、ミルクなど）が得られる。本発明の実施により、統計的
に有意な筋肉量の増加が、好ましくは少なくとも2％の筋肉量の増加（例えば、
ニワトリにおいて）、より好ましくは体重の割合にして25％の筋肉量の増加、よ
り好ましくはこれらの食料品にして40％以上の筋肉量の増加が得られる。
【０１４９】 従って、本発明は、GDF-8をコードする遺伝子の不活性化または欠損によって
特徴づけられる、家畜や商品価値のある動物において筋肉量を増加させる方法を
含む。家畜や商品価値のある動物は、ヒツジ、ウシ、ブタまたは鳥類の種であっ
てよく、および好ましくは魚類のような水性生物である。動物は単離されたGDF-
8をコードするポリヌクレオチド配列で処理されることが可能で、そのポリヌク
レオチド配列もまた、ヒツジ、ウシ、ブタもしくは鳥類の種、魚類のような水性
生物、または他のあらゆる種由来のものである。
【０１５０】 本発明は更に、GDF-8ポリペプチドに特異的に結合する動物の抗体、好ましく
は水生生物のGDF-8に特異的に結合する抗体を投与することによって、このよう
な動物の筋肉量を増加させる方法を含む。抗体は、抗GDF-8抗体で、モノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかでありうる。発明はまた、筋細胞
において、GDF-8の成長調節作用を阻害する治療剤として抗GDF-8モノクローナル
抗体を用いる方法を含む。筋細胞は筋肉への分化能を持つ始原細胞と同様に、胎
児または成体の筋細胞を含むと定義される。上述のように、モノクローナル抗体
は、ヒト化された（例えば、完全に或いはキメラのいずれか）モノクローナル抗
体、またはマウス、ヒツジ、ウシ、ブタもしくは鳥類のようなあらゆる種起源の
モノクローナル抗体でありうる。「ヒト化された」抗体の様々な組み合わせによ
って抗体分子を作成する方法は、当技術分野でよく知られており、マウスの可変
領域とヒトの定常領域の組み合わせ（Cabilyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :3273, 1984）、またはヒトのフレームワークへのマウス抗体の相補性決定領
域（CDRs, complementary determining regions）の移植によるもの（Richmann
ら、Nature 332:323, 1988）を含む。ヒト化された抗体を作製する方法を教示す
る他の参考文献は、Morrisonら、Science, 229:1202, 1985; Jonesら、Nature,
321:522, 1986; Monroeら、Nature 312:779, 1985; Oiら、BioTechniques, 4:21
4, 1986; 欧州特許出願第302,620号; および米国特許第5,024,834号を含む。そ
の結果、in vivoでの使用のための本発明のモノクローナル抗体のヒト化によっ
て、抗体に対する免疫応答は著しく減少する。
【０１５１】 モノクローナル抗体、GDF-8ポリペプチド、またはGDF-8ポリヌクレオチド（す
べてのGDF-8剤）は、骨格筋の発達を増加させる効果を持ちうる。本発明の方法
の好ましい実施形態では、GDF-8モノクローナル抗体、ポリペプチド、またはポ
リヌクレオチドは、筋消耗性疾患、神経筋障害、もしくは筋萎縮のような障害、
または老化に悩む患者に投与される。GDF-8剤はまた、筋ジストロフィー、脊髄
損傷、外傷、鬱血性閉塞性肺疾患（COPD）、エイズ、または悪液質のような障害
を病む患者にも投与しうる。好ましい実施形態では、GDF-8剤は、筋消耗性疾患
または障害の患者に、静脈、筋内、もしくは皮下注射によって投与される。好ま
しくは、モノクローナル抗体は、約0.1mg/kg〜約100mg/kg、より好ましくは約1
μg/kg〜75mg/kg、最も好ましくは約10mg/kg〜50mg/kgの投与量の範囲で投与さ
れる。抗体は、例えば、ボーラス注入または緩慢な注入によって投与しうる。30
分〜2時間かけての緩慢な注入が望ましい。GDF-8剤は、患者に投与するために適
した製剤に製剤化されうる。このような製剤は当技術分野で知られている。
【０１５２】 投与量の管理は、GDF-8タンパク質の作用を改変する様々な要因、例えば、形
成が望まれる組織の量、組織損傷の部位、損傷を受けた組織の状態、創傷の大き
さ、損傷を受けた組織の種類、患者の年齢、性別、および食事、感染の重度、投
与時間、あるいは他の臨床上の要因を考慮して、主治医によって決定される。投
与量は、再構成に使用される基質の種類、およびその組成物に用いられる抗GDF-
8抗体のような薬剤の種類によって変わる。一般的に、静脈、筋内、または皮下
注射のような、全身性のもしくは注射投与である。投与は一般的に、最小限有効
である用量で開始し、明確な効果が観察されるまであらかじめ設定した時間にわ
たり用量を増加させる。続いて、段階的な投与量の増加は、対応する作用の増大
をもたらすようなレベルにそのような段階的増加を限定すると同時に、現れる有
害な影響を考慮に入れる。GDF-8剤の最終組成への、またはGDF-8剤の前もしくは
後での、筋肉量の増加を促進することができるインスリン様増殖因子-1、または
ヒト、ウシ、もしくはトリ成長ホルモンのような、他に知られている増殖因子の
追加もまた、投与量に影響を与えうる。抗GDF-8抗体を投与する実施形態では、
抗GDF-8抗体は一般的に、約0.1μg/kg〜約100mg/kg、より好ましくは約10mg/kg
〜50mg/kgの投与量の範囲で投与される。
【０１５３】 経過は、組織の成長および/または組織の修復の定期評価によって観察できる
。経過は、例えばX線、組織形態学的測定、およびテトラサイクリンラベリング
で観察できる。
【０１５４】 本明細書で引用されたすべての参考文献は、完全に参照により組み入れる。
【０１５５】 以下の実施例は、説明を意図するものであり、本発明を限定するものではない
。それらは使用されうる代表的なもので、代わりに当業者に知られている他の手
順も使用されうる。
【０１５６】実施例 実施例１ TGF-βファミリーの新規メンバーの同定および単離 TGF-βスーパーファミリーの新規メンバーを同定するために、既知のファミリ
ーメンバー間で保存された2つの領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計
した：1つの領域はMISを除くすべてのファミリーメンバーにおいて保存された2
つのトリプトファン残基にまたがり、もう1つの領域は、C末端付近の不変のシス
テイン残基にまたがっている。これらのプライマーをマウスゲノムDNAにおける
ポリメラーゼ連鎖反応に用い、次いでプライマーの5'末端に位置する制限部位を
用いてPCR産物をサブクローニングし、これらのサブクローニングされたインサ
ートを保持する個々の大腸菌コロニーをピックアップして、ランダム配列決定分
析とハイブリダイゼーション分析との組合せを用いてスーパーファミリーの既知
のメンバーを除いた。
【０１５７】 GDF-8は、以下のプライマー： を用いて得られたPCR産物の混合物から同定された。
【０１５８】 これらのプライマーを用いたPCRは、マウスゲノムDNA 2μgを用いて、94℃を1
分間、50℃を2分間、72℃を2分間の40サイクルで行われた。
【０１５９】 約280bpのPCR産物をゲルを用いて精製し、EcoRIで消化し、再びゲルを用いて
精製し、pBluescriptベクター(Stratagene, San Diego, CA)中にサブクローニン
グした。個々のサブクローンを保持する細菌コロニーを、96ウエルマイクロタイ
タープレート中にピックアップし、多数の複製物を、細胞をニトロセルロース上
にプレーティングすることによって調製した。複製物フィルターを既知のファミ
リーメンバーを呈示するプローブにハイブリダイズさせ、配列決定分析のために
DNAをハイブリダイズしないコロニーから調製した。
【０１６０】 それぞれ、アミノ酸配列：GW(H/Q/N/K/D/E)(D/N)W(V/I/M)(V/I/M)(A/S)P(配列
番号９)およびM(V/I/M/T/A)V(D/E)SC(G/A)C(配列番号１０)をコードするSJL141
とSJL147とのプライマーの組合せにより、分析された110個のサブクローン中、
以前に同定された4種の配列(BMP-4、インヒビン-β、GDF-3およびGDF-5)が得ら
れ、さらに1種の新規配列が得られ、これをGDF-8と呼ぶこととした。
【０１６１】 ヒトGDF-8は、以下のプライマー： を用いて単離された。
【０１６２】 これらのプライマーを用いるPCRは、ヒトゲノムDNA 1μgを用いて、94℃を1分
間、58℃を2分間、72℃を2分間の30サイクルで行われた。PCR産物をBam HIで消
化し、ゲルを用いて精製し、pBluescriptベクター(Stratagene, San Francisco,
CA)中にサブクローニングした。
【０１６３】実施例２ GDF-8の発現パターンおよび配列 GDF-8の発現パターンを決定するために、種々の成体組織から調製されたRNAサ
ンプルをノーザンブロット分析によりスクリーニングした。RNAの単離およびノ
ーザンブロット分析は、ハイブリダイゼーションが5x SSPE、10％硫酸デキスト
ラン、50％ホルムアミド、1％SDS、200μg/mlのサケDNA、ならびにウシ血清アル
ブミン、フィコールおよびポリビニルピロリドン各0.1％の中で行わった以外は
すでに記載されている(Lee, Mol. Endocrinol., 4: 1034, 1990)とおりに行った
。各々の組織から調製された、2回ポリA選択したRNA 5μg(筋肉を除く。筋肉に
ついては、RNA 2μgだけ用いた)を、ホルムアルデヒドゲルに電気泳動し、ブロ
ットし、GDF-8でプロービングした。図１に示されるように、GDF-8プローブによ
り、筋肉で最も高レベルで発現され、かつ脂肪組織で有意により低レベルで発現
される単一のmRNA種が検出された。
【０１６４】 GDF-8遺伝子のさらに大きなセグメントを得るために、マウスゲノムライブラ
リーをGDF-8 PCR産物に由来するプローブを用いてスクリーニングした。GDF-8ゲ
ノムクローン部分配列を図２aに示す。配列は、GDF-8前駆体タンパク質の推定さ
れるC-末端領域に対応するオープンリーディングフレームを含む。推定されるGD
F-8配列は、2つの潜在的なタンパク質分解プロセッシング部位(四角で囲む)を含
む。これらの部位の第2番目で前駆体を切断することにより、推定分子量12,400
ダルトンで109アミノ酸の長さの成熟C末端断片を生成されるであろう。ヒトGDF-
8の部分配列を図２bに示す。ヒトクローンの単離過程でのPCRに誘発された誤り
がないと仮定すると、この領域におけるヒトとマウスのアミノ酸配列は、100％
同一である。
【０１６５】 推定のタンパク質分解プロセッシング部位に続くGDF-8のC末端領域は、既知の
TGF-βスーパーファミリーのメンバーに対して有意な相同性を示す(図３)。図３
は、GDF-8のC末端配列と、ヒトGDF-1(Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4
250-4254, 1991)、ヒトBMP-2および4(Wozneyら, Science, 242: 1528-1534, 198
8)、ヒトVgr-1(Celesteら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9843-9847, 1990
)、ヒトOP-1(Ozkaynakら, EMBO J., 9: 2085-2093, 1990)、ヒトBMP-5(Celeste
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9843-9847, 1990)、ヒトBMP-3(Wozneyら
, 前掲, 1988)、ヒトMIS(Cateら, Cell, 45: 685-698, 1986)、ヒトインヒビン-
αおよびインヒビン-β(Masonら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 135: 957-96
4, 1986)、ヒトTGF-β1(Derynckら, Nature, 316: 701-705, 1985)、ヒトTGF-β
2(deMartinら, EMBO J., 6: 3673-3677, 1987)ならびにヒトTGF-β3(ten Dijke
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715-4719, 1988)の対応領域とのアライ
ンメントを示す。保存されているシステイン残基を四角で囲んだ。線部は、アラ
インメントを最大にするために導入したギャップを示す。
【０１６６】 GDF-8は、他のファミリーメンバーにおいて高度に保存されている多くの残基
を含む。これらの残基には、特徴的な間隔を有する7つのシステイン残基を含ま
れる。TGF-βおよびインヒビンと同様に、GDF-8はまた、2つの付加的なシステイ
ン残基を含む。TGF-β2の場合には、これらの2つの付加的なシステイン残基は分
子内ジスルフィド結合を形成することで知られている(Daopinら, Science, 257:
369, 1992; SchluneggerおよびGrutter, Nature, 358: 430, 1992)。
【０１６７】 図４は、様々なTGF-βスーパーファミリーメンバー間のアミノ酸相同性を示す
。数字は、保存された第1のシステインからC末端までで算出された各々のペア間
のアミノ酸同一性％を示す。囲んだ四角は、特定のサブグループ内での高度に関
連するメンバー間の相同性を示す。この領域においては、GDF-8はVgr-1に最も相
同である(45％の配列同一性)。
【０１６８】実施例３ マウスおよびヒトGDF-8をコードするcDNAクローンの単離 マウスおよびヒトGDF-8をコードする全長cDNAクローンを単離するために、骨
格筋から調製したRNAを用いてλZAPIIベクター(Stratagene)中にcDNAライブラリ
ーを調製した。マウスおよびヒト筋肉から調製した2回ポリA選択したRNA 5μgか
らそれぞれ440万個および190万個の組換えファージから成るcDNAライブラリーを
、Stratageneによって提供される説明書に従って構築した。これらのライブラリ
ーを増幅させることなくスクリーニングした。ライブラリースクリーニングおよ
びcDNAインサートの特性解析をすでに記載された(Lee, Mol. Endocrinol., 4: 1
034-1040)とおりに行った。
【０１６９】 マウス筋肉cDNAライブラリーよりスクリーニングした2.4x106個の組換えファ
ージから280個を上回る陽性ファージを、実施例１に記載のようにゲノムクロー
ンに由来するマウスGDF-8プローブを用いて同定した。分析された最も長いcDNA
インサートの全ヌクレオチド配列を、図５aおよび配列番号１１に示す。2676塩
基対の配列は、単一の長いオープンリーディングフレームを含む。このオープン
リーディングフレームは、ヌクレオチド104のメチオニンコドンから始まり、ヌ
クレオチド1232のTGA終結コドンまで及ぶ。推定の開始メチオニンコドンの上流
には、ヌクレオチド23にin-frame終結コドンがある。推定されるプレプロGDF-8
タンパク質は、長さが376アミノ酸である。該配列には、N末端に分泌用のシグナ
ルペプチドであることが示唆される疎水性アミノ酸のコア(図６a)、アスパラギ
ン72には1つの潜在的なN-グリコシル化部位、アミノ酸264-267には推定のRXXRタ
ンパク質分解酵素切断部位、および既知のTGF-βスーパーファミリーのメンバー
に対して有意な相同性を示すC末端領域が含まれる。推定のRXXR部位での前駆体
タンパク質の切断により、長さ109アミノ酸である推定分子量約12,400ダルトン
の成熟C末端GDF-8断片が生成されるだろう。
【０１７０】 ヒト筋肉cDNAライブラリーよりスクリーニングされた1.9x106個の組換えファ
ージから、4個の陽性ファージが、ヒトゲノムDNAにおけるポリメラーゼ連鎖反応
によって得られたヒトGDF-8プローブを用いて同定された。最も長いcDNAインサ
ートの全ヌクレオチド配列を、図５bおよび配列番号１３に示す。2743塩基対の
配列には、単一の長いオープンリーディングフレームを含む。このオープンリー
ディングフレームは、ヌクレオチド59のメチオニンコドンから始まり、ヌクレオ
チド1184のTGA終結コドンまで及ぶ。推定されるプレプロGDF-8タンパク質は、長
さが375アミノ酸である。該配列には、N末端に分泌用のシグナルペプチドである
ことが示唆される疎水性アミノ酸のコア(図６b)、アスパラギン71には1つの潜在
的なN-グリコシル化部位、およびアミノ酸263-266には推定のRXXRタンパク質分
解酵素切断部位が含まれる。図７は、推定されるマウスGDF-8アミノ酸配列(上部
)とヒトGDF-8アミノ酸配列(下部)との比較を示す。数字は、N末端からのアミノ
酸の位置を示し、2つの配列間の同一性を垂直線で示す。マウスおよびヒトGDF-8
は、推定されるプロ領域において約94％同一であり、推定されるRXXR切断部位以
降では100％同一である。
【０１７１】実施例４ GDF-8の二量体化 GDF-8配列中のプロセッシングシグナルは機能的であるか否か、およびGDF-8は
TGF-βスーパーファミリーの他のメンバーと同様に二量体を形成するか否かを決
定するために、GDF-8cDNAをCHO細胞において恒常的に発現させた。GDF-8コード
配列をpMSXND発現ベクター(LeeおよびNathans, J. Biol. Chem., 263: 3521, (1
998))内にクローニングし、CHO細胞にトランスフェクトした。G418選択7に続い
て、細胞を0.2μMメトトレキセート中で選択し、耐性細胞由来の馴らし培地を濃
縮し、SDSゲル上に電気泳動した。馴らし培地は、Cell Trends, Inc.(Middletow
n, MD)によって調製された。抗GDF-8血清の調製については、GDF-8のC末端領域(
アミノ酸268-376)を、RSETベクター(Invitrogen, San Diego, CA)を用いて細菌
中に発現させ、ニッケルキレートカラムを用いて精製し、ウサギに注射した。す
べての免疫感作は、Spring Valley Labs(Woodbine, MD)によって行われた。
【０１７２】 (125I)-プロテインAを用いたウエスタンブロット分析は、Burnette(Anal. Bio
chem., 112: 195, 1981)の記載にしたがって行った。細菌により発現されたGDF-
8のC末端断片に対して誘起した抗血清を用いて、これらの細胞から調製した馴ら
し培地のウエスタンブロット分析を行うことにより、還元条件下で約52kDおよび
15kDの見かけの分子量を有する2種のタンパク質が検出された。これらのタンパ
ク質は、それぞれGDF-8の非プロセッシング型およびプロセッシング型に一致す
る。免疫前の血清またはアンチセンス構築物でトランスフェクトされたCHO細胞
に由来する馴らし培地のいずれでもバンドは得られなかった。非還元条件下では
、GDF-8抗血清により、約101kDおよび25kDの見かけの分子量を有する2種の主要
なタンパク質が検出された。これらのタンパク質は、それぞれ非プロセッシング
型GDF-8およびプロセッシング型GDF-8の二量体型に一致する。従って、他のTGF-
βファミリーメンバーと同様に、GDF-8は分泌され、かつタンパク質分解酵素に
よりプロセッシングされると考えられる。さらにC末端領域は、ジスルフィド連
結二量体を形成することが可能であると考えられる。
【０１７３】実施例５ GDF-8に対する抗体の調製および哺乳動物細胞におけるGDF-8の発現 GDF-8に対する抗体を調製するために、GDF-8抗原を融合タンパク質として細菌
で発現させた。GDF-8コード配列がベクター中に存在する開始メチオニンコドン
とともにin frameに配置されるように、アミノ酸268-376(成熟領域)にわたるマ
ウスGDF-8 cDNAの一部分をpRSETベクター(Invitrogen)に挿入した。得られた構
築物は、分子量約16,600kDの融合タンパク質をコードするオープンリーディング
フレームを作製した。融合構築物をBL21(DE3)(pLysS)細胞に形質転換し、融合タ
ンパク質の発現を、Rosenbergら(Gene, 56: 125-135)に記載のようにイソプロピ
ルチオ-N-ガラクトシド処理によって誘導した。次いで、Invitrogenによって提
供される説明書に従って、融合タンパク質を金属キレートクロマトグラフィーに
よって精製した。未精製および精製融合タンパク質についてクマシーブルー染色
したゲルを図８に示す。
【０１７４】 精製融合タンパク質を用いて、ウサギおよびニワトリの双方を免疫感作した。
ウサギの免疫感作はSpring Valley Labs(Sykesville, MD)によって行われ、ニワ
トリの免疫感作はHRP, Inc.(Denver, PA)によって行われた。免疫感作したウサ
ギおよび免疫感作したニワトリの双方に由来する血清を用いたウエスタンブロッ
ト分析により、融合タンパク質に対して誘導された抗体の存在が示された。
【０１７５】 哺乳動物細胞においてGDF-8を発現させるために、ヌクレオチド48-1303に由来
するマウスGDF-8 cDNA配列を、pMSXND発現ベクター中にメタロチオネインIプロ
モーターの下流に両方向にクローニングした。このベクターには、SV40由来のプ
ロセッシングシグナル、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および抗生物質G418に対
する耐性を付与する遺伝子が含まれている(LeeおよびNathans, J. Biol. Chem.,
263: 3521-3527)。得られた構築物をチャイニーズハムスター卵巣細胞にトラン
スフェクトし、恒常的にトランスフェクタントをG418の存在下で選択した。G418
耐性細胞から調製した馴らし培地2mlを透析し、凍結乾燥し、変性のための還元
条件下で電気泳動し、ニトロセルロースに転写し、抗GDF-8抗体(上記の抗体）お
よび(125I)-プロテインAとインキュベートした。
【０１７６】 図９に示されるように、ウサギGDF-8抗体(1：500に希釈)により、GDF-8の成熟
C末端断片の推定される分子量に近い分子量を有するタンパク質が、GDF-8がメタ
ロチオネインプロモーターに対して正確な(センス)方向にクローニングされた構
築物でトランスフェクトされた細胞の馴らし培地中に検出された(レーン2)。こ
のバンドは、対照のアンチセンス構築物でトランスフェクトされた細胞から調製
した同様のサンプル中では検出されなかった(レーン1)。同様の結果が、ニワト
リにおいて調製した抗体を用いても得られた。従って、GDF-8は、これらのトラ
ンスフェクトされた哺乳動物細胞によって分泌され、かつタンパク質分解により
プロセッシングされる。
【０１７７】実施例６ GDF-8の発現パターン GDF-8のパターンを決定するために、種々のマウス組織を起源として調製され
た2回ポリA選択したRNA 5μgをノーザンブロット分析に課した。図１０a(および
実施例２において上記で示したように)に示されるように、GDF-8プローブにより
、調べた多数の成体組織中でほぼ骨格筋にのみ存在する単一のmRNA種が検出され
た。同じブロットをより長く露光させた場合、かなり低いが検出可能なレベルの
GDF-8 mRNAが、脂肪、脳、胸腺、心臓および肺において見られた。これらの結果
から、GDF-8発現の骨格筋における特異性の高さが確認される。またGDF-8 mRNA
は、試験した双方の胎齢(交尾後12.5日および18.5日)のマウス胚においても検出
されたが、種々の発生段階の胎盤においては検出されなかった(図１０b)。
【０１７８】 さらにGDF-8の発現パターンを分析するために、in situハイブリダイゼーショ
ンを種々の発生段階で単離したマウス胚において行った。全てのin situハイブ
リダイゼーション実験においては、スーパーファミリーの他のメンバーと交差反
応する可能性を避けるために、GDF-8のC末端領域に対応するプローブを除外した
。ホールマウント(whole mount) in situハイブリダイゼーション分析は、ブロ
ッキングおよび抗体のインキュベーション工程をKnechtら(Development, 121: 1
927, 1955)に記載にしたがって行う以外は、(Wilkinson, In Situ Hybridizatio
n, A Practical Approach, 75-83頁, IRL Press, Oxford, 1992)に記載のとおり
行った。アルカリホスファターゼ反応を、10.5日目の胚については3時間、9.5日
目の胚については一晩中行った。ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド8-81
1および1298-2676(それぞれプロ領域および3'非翻訳領域に対応する)にわたるジ
ゴキシゲニン標識プローブを用いて行った。切片に対するin situハイブリダイ
ゼーションは、(Wilkinsonら, Cell, 50: 79, 1987)に記載のように、長さが約1
00〜650塩基の範囲のヌクレオチド8-793および1566-2595にわたる35S標識プロー
ブを用いて行われた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続いて、スライド標
本をNTB-3写真用エマルジョンに浸し、16〜19日間露光させ、展開し、ヘマトキ
シリンとエオシンまたはトルイジンブルーのいずれかで染色した。RNA単離、ポ
リA選択およびノーザンブロット分析は、すでに記載された(McPherronおよびLee
, J. Biol. Chem., 268: 3444, 1993)とおり行った。
【０１７９】 試験した全ての段階において、GDF-8 mRNAの発現は、発生中の骨格筋に限定さ
れているようであった。初期段階では、GDF-8発現は発生中の体節に限定されて
いた。whole mount in situハイブリダイゼーション分析により、GDF-8 mRNAを
まず体節の約3分の1において交尾後9.5日と同じ初期段階で検出することができ
た。この発生段階では、ハイブリダイゼーションは最も成熟した(この実施例に
おいては、21個のうち9個)吻側体節に限定されているようであった。交尾後10.5
日までは、ほとんどすべての体節(この実施例においては33個のうち28個に示さ
れた)においてGDF-8発現が明らかに示された。交尾後10.5日の胚から調製した切
片のin situ ハイブリダイゼーション分析に基づくと、体節におけるGDF-8の発
現は、筋節部分に局在化しているようであった。発生の後期段階では、GDF-8発
現は、発生中の筋肉の広範囲において検出された。
【０１８０】 GDF-8は、同様に成体動物において継続して発現される。ノーザンブロット分
析によると、GDF-8 mRNA発現は、試験した様々な成体組織の中でほぼ骨格筋にお
いてのみ認められた。またかなり低いが明かに検出可能なシグナルが脂肪組織に
おいて見られた。多数の様々な成体骨格筋から調製したRNAのノーザンブロット
分析に基づくと、GDF-8発現は広範囲に及ぶと考えられるが、発現レベルは個々
の筋肉によって様々であった。
【０１８１】実施例７ GDF-8の染色体位置 GDF-8の染色体上の位置をマッピングするために、ヒト/げっ歯類体細胞ハイブ
リッド(Drwingaら, Genomics, 16: 311-413, 1993; DuboisおよびNaylor, Genom
ics, 16: 315-319. 1993)由来のDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応、次いでサザンブ
ロッティングを行うことによって解析した。ポリメラーゼ連鎖反応は、プライマ
ー#83, 5'-CGCGGATCCGTGGATCTAAATGAGAACAGTGAGC-3'(配列番号１５)およびプラ
イマー#84, 5'-CGCGAATTCTCAGGTAATGATTGTTTCCGTTGTAGCG-3'(配列番号１６)を用
いて、94℃を2分間、60℃を1分間、72℃を2分間の40サイクルで行われた。これ
らのプライマーは、ヒトGDF-8 cDNA配列中のそれぞれヌクレオチド119-143(Bam
HI認識配列が隣接する)およびヌクレオチド394-418(EcoRI認識配列が隣接する)
に対応する。PCR産物をアガロースゲルに電気泳動し、ブロットし、オリゴヌク
レオチド#100, 5'-ACACTAAATCTTCAAGAATA-3'(配列番号１７)（これはプライマー
#83と#84で挟まれた領域に対して内部に存在する配列に対応する）を用いてプロ
ーブした。フィルターを、6x SSC、1x Denhardt溶液、100μg/mlの酵母トランス
ファーRNAおよび0.05％ピロリン酸ナトリウム中で50℃にてハイブリダイズさせ
た。
【０１８２】 図１１に示すように、ヒト特異的プローブにより、陽性対照サンプル(全ヒト
ゲノムDNA)およびヒト/囓歯動物ハイブリッドのパネルからの単一のDNAサンプル
において推定されるサイズ(約320塩基対)のバンドが検出された。この陽性シグ
ナルは、ヒト第2染色体に対応する。各々のハイブリッド細胞系に含まれるヒト
染色体は、最初の24レーン(1-22、XおよびY)のそれぞれ上部において確認される
。M、CHOおよびHで示されるレーンにおいては、開始鋳型DNAがそれぞれマウス、
ハムスターおよびヒト起源の全ゲノムDNAであった。B1と記されたレーンには、
鋳型DNAを用いていなかった。左側の数字は、DNA標準物の移動度を示す。これら
のデータにより、GDF-8遺伝子が第2染色体に位置することが示される。
【０１８３】実施例８ GDF-8トランスジェニックノックアウトマウス GDF-8遺伝子を胚性幹細胞における相同性ターゲティングによって破壊した。
得られたマウスのGDF-8機能が存在しないことを確実にするために、成熟C末端領
域全体を欠失させ、neoカセットで置き換えた(図１２a)。Stratagene(La Jolla,
CA)によって提供される説明書に従って、マウス 129SV/Jのゲノムライブラリー
をλFLX II中に調製した。GDF-8遺伝子の構造は、制限酵素マッピングおよびこ
のライブラリーから単離したファージクローンの部分配列決定分析から推定され
た。R1 ES細胞をターゲティング構築物でトランスフェクトし、ガンシクロビル(
2μm)およびG418(250μg/ml)で選択し、サザンブロット分析によって分析した。
相同的なターゲティングクローンをC57BL/6胚盤胞中に注入し、偽妊娠の雌性体
に移植した。ターゲティングされた対立遺伝子の生殖細胞伝達は、5個の別別に
誘導されたESクローンから全部で9匹のオスのキメラにおいて達成された。ゲノ
ムサザンブロットを、上記のように42℃でハイブリダイズし、42℃にて0.2X SSC
、0.1％SDS中で洗浄した。
【０１８４】 脚全体の分析において、14週齢のマウスの脚の皮を剥ぎ、PBS中に溶解した0.2
M EDTAで、4℃にて4週間処理し、次いでPBS中に溶解した0.5M ショ糖で、4℃に
て処理した。繊維の数とサイズの分析においては、サンプルを、(Brumbackおよ
びLeech, Color Atlas of Muscle Histochemistry, 9-33頁, PSG Publishing Co
mpany, Littleton, MA, 1984)に記載のように、イソペンタン中に直接入れ、凍
結させた。10〜30μmの切片を、クリオスタットを用いて調製し、ヘマトキシリ
ンとエオシンで染色した。筋繊維の数は、前脛骨筋(tibialis cranialis muscle
)の最も広範囲な部分から切り取られた切片から決定された。筋繊維のサイズは
、前脛骨筋および腓腹筋の切片の写真より測定された。繊維型の分析を、(Cummi
ngら, Color Atlas of Muscle Pathology, 184-185頁, 1994)に記載のようにpH
4.35で前処理した後のミオシンATPアーゼアッセイ、およびI型ミオシンに対して
誘導された抗体(MY32, Sigma)およびVectastain法(Vector Labs)を用いた免疫組
織化学によって行った。免疫組織化学実験においては、一次抗体を省いた場合に
は、染色は見られなかった。胴体を、毛を剃り落としたマウスから全ての内臓、
結合脂肪および結合組織を取り除くことによって調製した。4ヶ月齢の雄由来の
内臓の脂肪含有量は、(Leshnerら, Physiol. Behavior, 9: 281, 1972)に記載の
ように決定された。
【０１８５】 タンパク質とDNAの分析においては、組織を150 mM NaCl、100 mM EDTA中でホ
モジナイズした。タンパク質濃度をBioradタンパク質アッセイを用いて決定した
。DNAを、SDSを1％まで添加し、1 mg/mlのプロテイナーゼKで55℃にて一晩中処
理し、フェノールで3回およびクロロホルムで2回抽出し、さらに酢酸アンモニウ
ムとEtOHとを用いて沈殿させることによって単離した。DNAを2 mg/mlのRNアーゼ
で37℃にて1時間消化し、プロテイナーゼK消化およびフェノールとクロロホルム
とを用いた抽出し、DNAを酢酸アンモニウムとEtOHとを用いて2回沈殿させた。
【０１８６】 GDF-8遺伝子の相同的ターゲティングは、ガンシクロビル/G418二重耐性ES細胞
クローンの131個中13個において見られた。これらのターゲティングクローンの
胚盤胞への注入に続いて、本発明者らは5個の別別に誘導されたESクローンから
キメラを得た。これらをC57BL/6の雌に交配させると、ヘテロ接合型の仔が生じ
た(図１２b)。F1ヘテロ接合体の交配から誘導される678匹の子孫の遺伝子型分析
により、170匹の+/+(25％)、380匹の+/-(56％)、128匹の-/-(19％)が示された。
遺伝子型の比は、期待される比1：2：1に近かったが、ホモ接合型突然変異体の
数が期待されるよりも少ない数であったことは、統計学的に有意であることがわ
かった(p<0.001)。
【０１８７】 ホモ接合型突然変異体は、C57BL/6マウスおよび互いに交配させた場合には、生
存可能であり、かつ繁殖可能である。しかしながら、ホモ接合型突然変異体の動
物は、ヘテロ接合型および野生型の腹仔よりも約30％大きかった(McPherronら,
Nature 387: 83-90, 1997,これは参照により本明細書に組込むものとする；表１
を参照されたい)。突然変異体と野生型の間の体重の差異は、成体動物の年齢お
よび性に関係なく比較的一定であるようであった。また成体の突然変異体は、非
常に目立つ肩と臀部を有する異常な体型を示した。殺した動物から皮膚を剥ぎ取
ると、突然変異体の筋肉は、野生型の動物のものよりも非常に大きいことが明か
であった。骨格筋の質量の増大は、身体中広範囲に及ぶようであった。ホモ接合
型突然変異体の動物から単離した個々の筋肉は、野生型腹仔より単離したものよ
りも約2〜3倍の重さがあった(McPherronら, 前掲, 1997;表２を参照されたい)。
しかしながら重量の増大の大きさは、調査した筋肉中のGDF-8の発現レベルとほ
ぼ相関しているようであった。筋肉量の増大が野生型と突然変異体の動物の間の
総体重における全体的な差異を説明することができるか否か、または突然変異体
の多くの組織が一般的により大きいか否かを決定するために、本発明者らは総体
重と胴体の重量とを比較した。野生型と突然変異体の動物間の胴体の重量におけ
る差異は、総体重における差異に匹敵した(McPherronら, 前掲, 1997;表３を参
照されたい)。さらに野生型および突然変異体の動物の脂肪含有量は類似してい
たので、これらのデータは、総体重の差異の全てが骨格筋量の増大に起因するこ
とと一致する。しかしながら、本発明者らは、骨量における差異がまた身体の総
質量における差異に寄与する可能性をはっきりと除外してはいなかった。ヘテロ
接合型ノックアウトのマウスは、筋肉量が野生型とホモ接合型ノックアウトの間
の中間的な質量である表現型を有していた。
【０１８８】 骨格筋量の増大が過形成症または肥大症に起因するものであるか否かを決定す
るために、いくつかの異なる筋肉群の組織学的分析を行った。突然変異体の筋肉
は、全く正常であるようであった。過剰な結合組織または脂肪は見られず、また
変性の明かな徴候(例えば、繊維サイズの大幅な変化(下記を参照されたい)、ま
たは中心配置核(centrally placed nuclei))も全く存在しなかった。筋繊維の数
を計量したことにより、前脛骨筋が最も広範囲な部分において、野生型腹仔に対
して突然変異体の動物の全繊維数は、86％多かった(突然変異体 = 5470+/-121(n
=3)、野生型 = 2936+/-288(n=3)；p<0.01)。
【０１８９】 この結果と、突然変異体の筋肉から抽出したDNA量が野生型の筋肉から抽出し
たDNA量よりもおおよそ50％多い(プールした腓腹筋、足底筋、上腕三頭筋および
胸筋から、突然変異体 = 350μg(n=4)、野生型 = 233μg(n=3)；p=0.05)という
知見は一致した。従って、骨格筋量の増大の大部分が、筋繊維過形成症に起因す
るものであった。しかしながら、また筋繊維肥大症は、筋肉質量の全体的な増大
に寄与すると考えられた。図１３に示すように、前脛骨筋および腓腹筋の繊維直
径の平均は、野生型腹仔に対し突然変異体の動物において、それぞれ7％および2
2％大きかった。このことは、繊維の断面積がそれぞれ約14％および49％増大し
ていることを示唆する。繊維直径の平均が突然変異体においてより大きいが、し
かしながら繊維サイズの標準偏差が突然変異体と野生型の筋肉で類似していたこ
とは、特筆すべきことであり、このことは突然変異体の動物において筋肉の変性
がないことと一致する。また繊維サイズの増大は、タンパク質とDNAとの比(w/w)
が野生型の筋肉と比較して突然変異体の筋肉においてわずかに増大していた(突
然変異体 = 871+/-111(n=4)、野生型 = 624+/-85(n=3)；p<0.05)という知見と一
致していた。
【０１９０】 最後に、種々の筋肉の繊維型分析を行い、I型(遅筋型)およびII型(速筋型)繊
維の双方の数が突然変異体の動物において増大しているか否かを決定した。前脛
骨筋を含めて試験した筋肉の大部分において、筋繊維の大多数が、突然変異体お
よび野生型の動物の双方でII型であった。従って、上記で考察した繊維計数に基
づくと、II型繊維の絶対数が前脛骨筋において増大したことになる。ヒラメ筋に
おけるI型繊維の数は、本発明者らが定量することを試みるには十分に多かった
ので、ヒラメ筋において繊維型の比を定量したところ、I型繊維のパーセントは
、野生型筋肉と比較して突然変異体において約33％低減していた(野生型 = 39.2
+/-8.1(n=3)、突然変異体 = 26.4+/-9.3(n=4))；しかしながら、野生型および突
然変異体の動物の双方についてのこの比における多様性があまりにも高く、繊維
型の相対数に関する確かな結論を支持するものではなかった。
【０１９１】実施例９ ラット、ニワトリおよび魚類GDF-8の単離 ラットおよびニワトリのGDF-8 cDNAクローンを単離するために、これらの種か
ら調製した骨格筋cDNAライブラリーをStratageneから入手し、マウスGDF-8プロ
ーブを用いてスクリーニングした。ライブラリースクリーニングは、最後の洗浄
を2x SSC中、65℃で行ったこと以外はすでに記載された(Lee, Mol. Endocrinol.
, 4: 1034-1040)ように行った。ハイブリダイズしたクローンの部分配列決定分
析により、マウスおよびヒトGDF-8に高度に関連するオープンリーディングフレ
ームの存在が明らかとなった。ラットおよびニワトリのGDF-8の部分配列を、そ
れぞれ図２cおよび２dに示し、さらにラットおよびニワトリGDF-8の推定される
アミノ酸配列と、マウスおよびヒトGDF-8のアミノ酸配列とのアラインメントを
図３bに示している。4種の配列の全ては、タンパク質分解プロセッシング部位を
示すと考えられるRSRR(配列番号５２)配列を含む。このRSRR(配列番号５３)配列
に続いて、配列は4種全ての間で100％保存されているC末端領域を含む。ヒトと
ニワトリのように進化上かなり離れているような種間のC末端領域の完全な保存
は、この領域は他の多くの種においても同様に高度に保存されているかもしれな
いことを示唆する。
【０１９２】 鰭魚のGDF-8に対する配列を、ゼブラフィッシュおよびサケのポリA RNAに由来
するライブラリーを調製することによって得た(McPherronおよびLee, Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, 94: 12457, 1997を参照されたい。これは参照により本明
細書に組み入れる)。ゼブラフィッシュGDF-8は、GenBankにおいて登録番号AF019
626として寄託されている。サケにおいては、対立遺伝子1の配列を有するクロー
ンと対立遺伝子2の配列を有するクローンが存在するので、サケのGDF-8は、少な
くとも2種の対立遺伝子を有すると考えられた。ゼブラフィッシュ、サケの対立
遺伝子1およびサケの対立遺伝子2に対する核酸配列および推定のアミノ酸配列を
、それぞれ図２e、２fおよび２gに示す。図３cおよび３dは、マウス、ゼブラフ
ィッシュおよびサケ(対立遺伝子1および2)のGDF-8間のアミノ酸配列アラインメ
ントを示す。C末端配列は、高度に保存されている。下流部位にある前駆体が切
断されて、マウスGDF-8において109アミノ酸からなる生物学的活性のある成熟C
末端断片が生成されるだろう。C末端断片において、魚類配列とマウスの配列と
を比較すると、14アミノ酸しか違わず、約88％の同一性がある。
【０１９３】実施例１０ 魚類における遺伝子導入および保持 現在まで用いられているトランスジェニック魚を産生するための最も一般的な
方法は、マイクロインジェクション法である。DNAをサケ科の生殖細胞系に導入
するために、トランスジーン構築物を初期発生段階の受精卵の細胞質にマイクロ
インジェクトする。直鎖状DNAは、初期発生において環状DNAよりも効果的に維持
される(Iyengarら, Mol. Mar. Biol. Biotech., 4: 248-254, 1995)。生殖細胞
系の形質転換の頻度は、通常、環状DNAにおいては非常に低い。従って、全ての
ベクター配列を除去した直鎖状DNAが好ましい。魚の卵の有用性に従って、確立
されたマイクロインジェクション法を用いて、ほんの一例として、カットスロー
ト(cutthrout trout)(またはギンザケ)の卵に遺伝子を導入する。
【０１９４】 簡潔に言えば、発生が停止され、かつ柔らかい卵殻を保持する受精卵のペリマ
イクロピラー(perimycropylar)領域（卵殻および卵黄膜を通過した卵の細胞質）
に、DNA溶液2nL(遺伝子構築物107コピーを含有する)をマイクロインジェクトす
る。この方法によって、DNAを雄および雌の双方の前核付近に導入することで、
宿主染色体中への組込みが、平均して第1から第3分割の過程で生じる。80個を上
回る数(1000個まで)の卵をマイクロインジェクトする。注入された卵は、約4〜6
ヶ月間で稚魚へ成長することができる。生存力に影響を及ぼさない構築物を用い
る場合には、生存率は、典型的にはこの段階で約70％であり、1〜2％がトランス
ジェニックのサケ科の魚となるであろう。
【０１９５】 トランスジェニックした個体を同定するための一つの方法は、構築物を導入し
た魚を採血し、血漿を得て、この血漿サンプルを、構築物に特異的なオリゴヌク
レオチドプライマーを用いたPCRによって分析することである。
【０１９６】 本発明は、現段階で好ましい実施形態を参照して説明してきたが、種々の改変
を本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができることが、理解されるはず
である。従って、本発明は以下の請求の範囲のみに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１aは、成体組織におけるGDF-8 mRNAの発現を示すノーザンブロットである
。プローブは、マウスGDF-8クローンの部分配列であった。 図１bは、マウス、ラット、ヒト、サル、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌおよびニ
ワトリにおいて同定されたGDF-8ゲノム配列を示すサザンブロットである。
【図２】 図２a〜２gは、マウスGDF-8(図２a；配列番号５および６)、ヒトGDF-8(図２b
；配列番号７および８)、ラットGDF-8(図２c；配列番号２０および２１)、ニワ
トリGDF-8(図２d；配列番号１８および１９)、ゼブラフィッシュ(図２e；配列番
号２８および２９)、サケ1(図２f；配列番号３０および３１)およびサケ2(図２g
；配列番号３２および３３)のヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列を示
す。マウス配列における推定の二塩基プロセッシング部位を四角で囲む。
【図３】 図３aは、マウスGDF-8のC末端配列(配列番号１２のアミノ酸残基265-276)と、
他のTGF-βスーパーファミリーメンバー(それぞれ、配列番号２２、２３、２４
、２５、２６、２７および３４〜４１)とのアラインメントを示す。保存されて
いるシステイン残基を四角で囲む。線部は、アラインメントを最大にするために
導入したギャップを示す。 図３bは、ヒト(配列番号１４)、マウス(配列番号１２)、ラット(配列番号２１
)およびニワトリ(配列番号１９)の配列に由来するGDF-8のC末端配列のアライン
メントを示す。 図３cおよび３dは、GDF-8に対するゼブラフィッシュアミノ酸配列(配列番号２
９)と、マウスGDF-8(配列番号１２)、ならびにサケ対立遺伝子1(サケ1；配列番
号３１)およびサケ対立遺伝子2(サケ2；配列番号３３)のC末端配列とのアライン
メントを示す。
【図４】 図４は、様々なTGFスーパーファミリーメンバー間のアミノ酸相同性を示す。
数字は、保存された第1のシステインからC末端までで算出された各々のペア間の
アミノ酸同一性％を示す。四角で囲んだ部分は、特定のサブグループ内での高度
に関連するメンバー間の相同性を示す。
【図５】 図５a〜５dは、GDF-8配列を示す。マウスGDF-8 cDNAクローン(図５aおよび５b
；配列番号１１および１２；GenBank登録番号U84005)とヒトGDF-8 cDNAクローン
(図５cおよび５d；配列番号１３および１４)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
を示す。数字は、5'末端からのヌクレオチド位置を示す。コンセンサスN-結合型
グリコシル化シグナルに影をつけている。推定のRXXRタンパク質分解酵素切断部
位を四角で囲む。
【図６】 図６aおよび６bは、GDF-8のハイドロパシー(hydropathicity)プロファイルを
示す。マウスGDF-8(図６a)およびヒトGDF-8(図６b)における平均的疎水性値を、
KyteおよびDoolittleの方法(J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982)を用いて計算
した。正の数字は、疎水性の増加を示す。
【図７】 図７は、マウスGDF-8アミノ酸配列(配列番号１２)とヒトGDF-8アミノ酸配列(
配列番号１４)との比較を示す。推定されるマウス配列を、上部の行において示
し、推定されるヒト配列を下部の行において示す。数字は、N末端からのアミノ
酸の位置を示す。2つの配列間の同一性を垂直線で示す。
【図８】 図８は、細菌におけるGDF-8の発現を示す。pRSET/GDF-8発現プラスミドを保持
するBL21(DE3)(pLysS)細胞を、イソプロピルチオ-N-ガラクトシドで誘導し、GDF
-8融合タンパク質を金属キレートクロマトグラフィーによって精製した。レーン
：全体 = 全細胞溶解物；可溶物 = 可溶性タンパク質画分；不溶物 = 不溶性タ
ンパク質画分(10mM Tris pH8.0、50mM リン酸ナトリウム、8M 尿素、および10mM
β-メルカプトエタノール(バッファーB)中に再懸濁した)（これらは、カラムに
ロードしたもの）；ペレット = カラムにロードする前に除かれた不溶性タンパ
ク質画分；フロースルー = カラムに結合しなかったタンパク質；洗浄物 = 示さ
れたpHにおいてバッファーB中で洗浄した洗浄物。分子量標準物の位置を右側に
示す。矢印は、GDF-8融合タンパク質の位置を示す。
【図９】 図９は、哺乳動物細胞におけるGDF-8の発現を示す。チャイニーズハムスター
卵巣細胞をpMSXND/GDF-8発現プラスミドでトランスフェクトし、G418中で選択し
た。G418耐性細胞からの馴らし培地(GDF-8がアンチセンスまたはセンス方向性の
いずれかでクローニングされた構築物でトランスフェクトされた細胞から調製し
た)を濃縮し、還元条件下で電気泳動し、ブロットし、抗GDF-8抗体および(125I)
-プロテインAを用いてプロービングした。矢印は、プロセッシングを受けたGDF-
8タンパク質の位置を示す。
【図１０】 図１０は、GDF-8 mRNAの発現を示す。成体組織（図１０a）または示された妊
娠期間における胎盤および胚(図１０b)から調製されたポリA選択したRNA(各5μg
)を、ホルムアルデヒドゲル上に電気泳動し、ブロットし、全長マウスGDF-8を用
いてプロービングした。
【図１１】 図１１は、ヒトGDF-8の染色体マッピングを示す。ヒト/げっ歯類ハイブリッド
体細胞系から調製したDNAサンプルをPCRに供し、アガロースゲル上に電気泳動し
、ブロットし、プロービングした。各々のハイブリッド細胞系に含まれるヒト染
色体は、最初の24レーン(1〜22、XおよびY)のそれぞれ上部において確認される
。M、CHOおよびHで示されるレーンにおいては、開始鋳型DNAがそれぞれマウス、
ハムスターおよびヒト起源の全ゲノムDNAであった。B1と記されたレーンには、
鋳型DNAを用いていなかった。左側の数字は、DNA標準の移動度を示す。
【図１２】 図１２は、GDF-8遺伝子座(上部の線)およびターゲティング構築物(第2の線)の
地図を示す。黒色の囲みおよび点彩の囲みは、それぞれプロ領域およびC末端領
域に対するコード配列を示す。白抜きの囲んだ四角は、5'非翻訳配列および3'非
翻訳配列を示す。3'相同性断片の下流にあり、かつ示されている最も末端にある
HindIII部位の上流にある領域に由来するプローブは、GDF-8遺伝子において11.2
キロベース(kb)のHindIII断片、および相同的にターゲティングされた遺伝子に
おいて10.4kbの断片にハイブリダイズする。略語：H, HindIII；X, XbaI。 図１２bは、ヘテロ接合型突然変異体のマウスの交配により得られた子孫のサ
ザンブロット分析を示す。レーンは、以下の通りである：野生型129 SV/Jマウス
から調製したDNA(レーン１)、ターゲティングされた胚性幹細胞(レーン2)、F1ヘ
テロ接合型マウス(レーン3および4)、およびこれらのマウスの交配から誘導され
た子孫(レーン5〜13)。
【図１３】 図１３は、突然変異体および野生型腹仔における筋繊維のサイズ分布を示す。
繊維の最も小さな断面の幅を、(a)野生型(n = 1761)と突然変異体(n = 1052)の
前脛骨筋、または(b)野生型(n = 900)と突然変異体(n = 900)の腓腹筋について
測定した。繊維サイズを全繊維数のパーセントとしてプロットした。標準偏差は
、野生型と突然変異体の前脛骨筋に関しては、それぞれ9μmおよび10μmであり
、野生型と突然変異体の腓腹筋に関しては、それぞれ11μmおよび9μmである。
説明：○-○,野生型；◇-◇,突然変異体。
【図１４】 図１４は、タラGDF-8のヌクレオチド(配列番号４２)およびアミノ酸(配列番号
４３)の部分配列を示す。
【図１５】 図１５は、ハタGDF-8のヌクレオチド(配列番号４４)およびアミノ酸(配列番号
４５)の部分配列を示す。
【図１６】 図１６は、タイGDF-8のヌクレオチド(配列番号４６)およびアミノ酸(配列番号
４７)の部分配列を示す。
【図１７】 図１７は、ベラGDF-8のヌクレオチド(配列番号４８)およびアミノ酸(配列番号
４９)の部分配列を示す。
【図１８】 図１８は、アフリカツメガエルT7 GDF-8のヌクレオチド(配列番号５０)および
アミノ酸(配列番号５１)の部分配列を示す。
【図１９】 図１９は、ヒトGDF-8(配列番号１４)のアミノ酸残基281-370と、ゼブラフィッ
シュ(配列番号２８)、サケ(配列番号３１/３３)、タラ(配列番号４３)、ハタ(配
列番号４５)、タイ(配列番号４７)、ベラ(配列番号４９)およびアフリカツメガ
エル(配列番号５１)のGDF-8の対応するアミノ酸とのアラインメントを提供する
。
【図２０】 図２０は、ヒト(1)、ゼブラフィッシュ(2)、サケ(3)、タラ(4)、ハタ(5)、タ
イ(6)、ベラ(7)およびアフリカツメガエル(8)のGDF-8アミノ酸配列の配列ペア距
離を示す。これは、PAM250残基重量表(residue weight table)を用いたクラスタ
ー法を用いて決定した。類似性％を、対角線の黒塗りの四角の右上に示し、相違
性％を左下に示す。
【図２１】 図２１は、示された生物からのGDF-8の系統樹を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月５日（２００２．４．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】 全長のGDF-8ポリペプチドは、GDF-8の活性の制御に関与するアミノ末端のプロ
領域、およびC末端領域を含んでいる。該C末端領域は、プロ領域から遊離すると
、GDF-8活性を示す（米国特許出願第09/628,112号、2000年7月27日出願、該特許
出願は参照により本明細書に組み込むものとする）。実質的に精製された水生動
物のGDF-8ポリペプチドおよびその一部分のペプチドが本発明により提供される
。本明細書中に用いる、「プロGDF-8」という用語は、全長のポリペプチドを指
す場合に用いられ、これには、アミノ末端（プレ）プロ領域およびカルボキシ末
端（C末端）の生物学的に活性なGDF-8領域が含まれる。この（プレ）プロ領域は
、以後「プロ領域」と呼ぶが、プロ領域のアミノ末端の最初のほぼ15〜30アミノ
酸を含むシグナルペプチド（リーダー配列）を含んでいる。シグナルペプチドは
、全長プロGDFポリペプチドから切断され得る。これは、さらにタンパク質分解
酵素切断部位Arg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号５３)で切断されてC末端GDF-8が産生さ
れ得る。「GDF-8」という用語は、一般に、他に指示がない限り、「プロGDF-8」
という用語と同義であり、例えばC末端GDF-8ポリペプチドを指す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】 様々な魚類に対するプロGDF-8ポリペプチド又はそのペプチドの一部をコード
するポリヌクレオチド、例えば、ゼブラフィッシュ（図2e；配列番号28及び29）
、サケ対立遺伝子１（「サケ-１」；図2f；配列番号30及び31）、サケ対立遺伝
子２（「サケ-２」；図2g；配列番号32及び33）、タラ（図14；配列番号42及び4
3）、ハタ（図15；配列番号44及び45）、タイ（図16；配列番号46及び47）、ベ
ラ（図17；配列番号48及び49）、並びに、両生類であるX. laevis（カエル；図1
8；配列番号50及び51）を本明細書中で開示する（図3c及び3d、並びに図19も参
照されたい）。図3c及び3dは、マウス、ゼブラフィッシュ、サケ-1及びサケ-2 G
DF-8間のアミノ酸配列アライメントを示す。C末端配列が高度に保存されている
。下流のRXXR(配列番号５３)部位における前駆体の切断により、マウスGDF-8に
対して生物学的に活性な約109アミノ酸の成熟C末端断片を生じる。図3c及び3dの
魚の配列とマウスの配列のC末端断片の比較から、差異はわずかに14アミノ酸で
あることが明らかとなる（約88％の同一性）。同様に高度な配列同一性がヒトと
様々な水性生物のGDF-8ポリペプチドとの間で共有されている（図19）。したが
って、本発明は水性生物のGDF-8ポリペプチドをコードするGDF-8ポリヌクレオチ
ド配列を提供する。この場合、該GDF-8ポリペプチドは、マウスGDF-8ポリペプチ
ドに対して少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％又は95％同
一である生物学的に活性なC末端断片を有する。本発明のポリヌクレオチドは、
上記のアミノ酸配列を有するGDF-8ポリペプチドをコードする魚類及び両生類のG
DF-8ポリヌクレオチドにより例示される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】 マウス筋肉cDNAライブラリーよりスクリーニングした2.4x106個の組換えファ
ージから280個を上回る陽性ファージを、実施例１に記載のようにゲノムクロー
ンに由来するマウスGDF-8プローブを用いて同定した。分析された最も長いcDNA
インサートの全ヌクレオチド配列を、図５aおよび配列番号１１に示す。2676塩
基対の配列は、単一の長いオープンリーディングフレームを含む。このオープン
リーディングフレームは、ヌクレオチド104のメチオニンコドンから始まり、ヌ
クレオチド1232のTGA終結コドンまで及ぶ。推定の開始メチオニンコドンの上流
には、ヌクレオチド23にin-frame終結コドンがある。推定されるプレプロGDF-8
タンパク質は、長さが376アミノ酸である。該配列には、N末端に分泌用のシグナ
ルペプチドであることが示唆される疎水性アミノ酸のコア(図６a)、アスパラギ
ン72には1つの潜在的なN-グリコシル化部位、アミノ酸264-267には推定のRXXR(
配列番号５３)タンパク質分解酵素切断部位、および既知のTGF-βスーパーファ
ミリーのメンバーに対して有意な相同性を示すC末端領域が含まれる。推定のRXX
R(配列番号５３)部位での前駆体タンパク質の切断により、長さ109アミノ酸であ
る推定分子量約12,400ダルトンの成熟C末端GDF-8断片が生成されるだろう。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】 ヒト筋肉cDNAライブラリーよりスクリーニングされた1.9x106個の組換えファ
ージから、4個の陽性ファージが、ヒトゲノムDNAにおけるポリメラーゼ連鎖反応
によって得られたヒトGDF-8プローブを用いて同定された。最も長いcDNAインサ
ートの全ヌクレオチド配列を、図５bおよび配列番号１３に示す。2743塩基対の
配列には、単一の長いオープンリーディングフレームを含む。このオープンリー
ディングフレームは、ヌクレオチド59のメチオニンコドンから始まり、ヌクレオ
チド1184のTGA終結コドンまで及ぶ。推定されるプレプロGDF-8タンパク質は、長
さが375アミノ酸である。該配列には、N末端に分泌用のシグナルペプチドである
ことが示唆される疎水性アミノ酸のコア(図６b)、アスパラギン71には1つの潜在
的なN-グリコシル化部位、およびアミノ酸263-266には推定のRXXR(配列番号５３ ) タンパク質分解酵素切断部位が含まれる。図７は、推定されるマウスGDF-8アミ
ノ酸配列(上部)とヒトGDF-8アミノ酸配列(下部)との比較を示す。数字は、N末端
からのアミノ酸の位置を示し、2つの配列間の同一性を垂直線で示す。マウスお
よびヒトGDF-8は、推定されるプロ領域において約94％同一であり、推定されるR
XXR(配列番号５３)切断部位以降では100％同一である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】実施例９ ラット、ニワトリおよび魚類GDF-8の単離 ラットおよびニワトリのGDF-8 cDNAクローンを単離するために、これらの種か
ら調製した骨格筋cDNAライブラリーをStratageneから入手し、マウスGDF-8プロ
ーブを用いてスクリーニングした。ライブラリースクリーニングは、最後の洗浄
を2x SSC中、65℃で行ったこと以外はすでに記載された(Lee, Mol. Endocrinol.
, 4: 1034-1040)ように行った。ハイブリダイズしたクローンの部分配列決定分
析により、マウスおよびヒトGDF-8に高度に関連するオープンリーディングフレ
ームの存在が明らかとなった。ラットおよびニワトリのGDF-8の部分配列を、そ
れぞれ図２cおよび２dに示し、さらにラットおよびニワトリGDF-8の推定される
アミノ酸配列と、マウスおよびヒトGDF-8のアミノ酸配列とのアラインメントを
図３bに示している。4種の配列の全ては、タンパク質分解プロセッシング部位を
示すと考えられるRSRR(配列番号５２)配列を含む。このRSRR(配列番号５２)配列
に続いて、配列は4種全ての間で100％保存されているC末端領域を含む。ヒトと
ニワトリのように進化上かなり離れているような種間のC末端領域の完全な保存
は、この領域は他の多くの種においても同様に高度に保存されているかもしれな
いことを示唆する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マックフェロン，アレキサンドラ，シー． アメリカ合州国 21201 メリーランド州 ボルチモア，218番，ダブリュ．プラッ ト ストリート 519 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA21 BA41 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA60 4H045 AA10 AA11 BA10 CA50 CA52 DA01 EA05 FA74

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ゲノム内に内在性増殖分化因子-８（GDF-8）遺伝子の破壊を
    有しており、この破壊がトランスジーンの挿入を含んでおり、この破壊により野
    生型動物に比べて筋肉量の増加を示す、トランスジェニック非ヒト水生生物。
  2. 【請求項２】 甲殻動物、軟体動物、脊索動物、腹足動物、斧足動物、頭足
    動物および棘皮動物からなる群より選択される水生生物である、請求項1記載の
    トランスジェニック水生生物。
  3. 【請求項３】 魚類および両生類からなる群より選択される水生生物である
    、請求項1記載のトランスジェニック水生生物。
  4. 【請求項４】 トランスジーンがGDF-8アンチセンスポリヌクレオチドを含
    む、請求項1記載のトランスジェニック水生生物。
  5. 【請求項５】 水生生物が、内在性GDF-8遺伝子の破壊においてホモ接合体
    またはヘテロ接合体である、請求項1記載のトランスジェニック水生生物。
  6. 【請求項６】 請求項３記載のトランスジェニック水生生物によって産生さ
    れた魚肉。
  7. 【請求項７】 筋肉量が増加している水生生物から食品を製造する方法であ
    って： a) 増殖分化因子-８（GDF-8）の発現を阻害または妨害するトランスジーンを
    、水生生物の受精胚、受精卵または前核胚の生殖細胞に導入し； b) 適切な偽妊娠雌性体の卵管に、ステップa)の胚を移植することにより、該
    胚を満期産の子孫にまで成熟させ； c) 該子孫をトランスジーンの存在について試験して、筋肉量の増加している
    トランスジーン陽性の子孫を特定し； d) トランスジーン陽性の子孫を交配して、筋肉量の増加しているトランスジ
    ーン陽性のさらなる子孫を得；そして、 e) その筋肉量の増加している子孫を処理して、食品を得ること； を含む、上記方法。
  8. 【請求項８】 筋肉量の増加を示すトランスジェニック水生生物を産生する
    方法であって： a) 選択マーカー配列を含むトランスジーンを、水生生物の胚性幹細胞に導入
    し； b) 水生生物胚に上記胚性幹細胞を導入し； c) 該胚を、適切な偽妊娠水生生物に移植し； d) 該胚を満期まで発達させ；そして、 e) ゲノム内に内在性GDF-8遺伝子の破壊を有しており、この破壊により野生
    型の水生生物に比べて筋肉量の増加を示すトランスジェニック水生生物を特定す
    ること； を含む、上記方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法により産生されるトランスジェニック
    水生生物であって、そのゲノム内に内在性GDF-8遺伝子の破壊を有しており、こ
    の破壊により野生型の水生生物に比べて筋肉量の増加を示す、上記トランスジェ
    ニック水生生物。
  10. 【請求項１０】 トランスジェニック水生生物が、内在性GDF-8遺伝子の破
    壊においてホモ接合体またはヘテロ接合体である、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 トランスジーンを胚性幹細胞に導入するステップが、トラ
    ンスジーンを含むウイルスを胚性幹細胞に感染させることによって実施される、
    請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ウイルスがレトロウイルスである、請求項１１記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 トランスジーンがGDF-8アンチセンスポリヌクレオチドを
    含むものである、請求項８記載の方法。
  14. 【請求項１４】 水生生物が、甲殻動物、軟体動物、脊索動物、腹足動物、
    斧足動物、頭足動物および棘皮動物からなる群より選択される、請求項８記載の
    トランスジェニック水生生物。
  15. 【請求項１５】 水生生物が、魚類および両生類からなる群より選択される
    、請求項８記載のトランスジェニック水生生物。
  16. 【請求項１６】 コレステロールレベルの低減された水生生物食品を製造す
    る方法であって： a) 増殖分化因子-８（GDF-8）の発現を阻害または妨害するトランスジーンを
    水生生物の胚に導入し； b) 子孫が孵化する条件下で該胚を培養し； c) その子孫をトランスジーンの存在について試験して、コレステロールレベ
    ルの低減されたトランスジーン陽性の子孫を特定し； d) コレステロールレベルの低減されたトランスジーン陽性の子孫を交配し；
    そして、 e) その子孫を処理して、コレステロールレベルの低減された水生生物食品を
    得ること； を含む、上記方法。
  17. 【請求項１７】 トランスジーンがGDF-8アンチセンスポリヌクレオチドを
    含むものである、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 GDF-8ポリペプチドに結合する抗体またはそのフラグメン
    トを水生生物に投与することを含む、水生生物の筋肉量を増加させる方法。
  19. 【請求項１９】 水生生物が魚類である、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であ
    る、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 水生生物のGDF-8ポリペプチドをコードする単離されたポ
    リヌクレオチドであって、該GDF-8ポリペプチドが配列番号12(図3cおよび3d)に
    示すマウスGDF-8ポリペプチドのアミノ酸残基280〜376付近に対して少なくとも
    約65％の同一性を有する、上記ポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 GDF-8ポリペプチドが、配列番号12に示すマウスGDF-8ポリ
    ペプチドのアミノ酸残基280〜376に対して少なくとも約70％の同一性を有する、
    請求項２１記載の単離されたポリヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 GDF-8ポリペプチドが、配列番号12に示すマウスGDF-8ポリ
    ペプチドのアミノ酸残基280〜376に対して少なくとも約75％の同一性を有する、
    請求項２１記載の単離されたポリヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】 GDF-8ポリペプチドが、配列番号12に示すマウスGDF-8ポリ
    ペプチドのアミノ酸残基280〜376に対して少なくとも約80％の同一性を有する、
    請求項２１記載の単離されたポリヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】 GDF-8ポリペプチドが、配列番号12に示すマウスGDF-8ポリ
    ペプチドのアミノ酸残基280〜376に対して少なくとも約85％の同一性を有する、
    請求項２１記載の単離されたポリヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】 水生生物が、脊椎動物および無脊椎動物からなる群より選
    択される、請求項２１記載のポリヌクレオチド。
  27. 【請求項２７】 水生生物が脊索動物である、請求項２６記載のポリヌクレ
    オチド。
  28. 【請求項２８】 水生生物が、甲殻動物、軟体動物、腹足動物、斧足動物、
    頭足動物および棘皮動物からなる群より選択される、請求項２６記載のポリヌク
    レオチド。
  29. 【請求項２９】 水生生物が両生類である、請求項２６記載のポリヌクレオ
    チド。
  30. 【請求項３０】 水生生物が魚類である、請求項２６記載のポリヌクレオチ
    ド。
  31. 【請求項３１】 魚類が鰭魚である、請求項３０記載のポリヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】 請求項２１記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  33. 【請求項３３】 ベクターが発現ベクターである、請求項３２記載のベクタ
    ー。
  34. 【請求項３４】 ベクターがプラスミドである、請求項３２記載のベクター
    。
  35. 【請求項３５】 ベクターがウイルスベクターである、請求項３２記載のベ
    クター。
  36. 【請求項３６】 請求項３２記載のベクターを含有する宿主細胞。
  37. 【請求項３７】 原核細胞である請求項３６記載の宿主細胞。
  38. 【請求項３８】 真核細胞である請求項３６記載の宿主細胞。
  39. 【請求項３９】 配列番号29(図2e)、配列番号31(図2f)、配列番号33(図2g)
    、配列番号43(図14)、配列番号45(図15)、配列番号47(図16)、配列番号49(図17)
    または配列番号51(図18)に示すアミノ酸配列を含むGDF-8ポリペプチドをコード
    する単離されたポリヌクレオチド。
  40. 【請求項４０】 配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号42、配列
    番号44、配列番号46、配列番号48および配列番号50からなる群より選択される、
    単離されたポリヌクレオチド。
  41. 【請求項４１】 TがUであってもよい、請求項40記載の単離されたポリヌク
    レオチド。
  42. 【請求項４２】 請求項40記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオ
    チド。
  43. 【請求項４３】 請求項39記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイ
    ズする少なくとも15ヌクレオチドを含んでおり、配列番号12をコードするポリヌ
    クレオチドにはハイブリダイズしないヌクレオチド配列。
  44. 【請求項４４】 請求項40記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする少
    なくとも15ヌクレオチドを含んでおり、配列番号11に示すポリヌクレオチドには
    ハイブリダイズしない、ヌクレオチド配列。
  45. 【請求項４５】 水生生物由来の実質的に精製されたGDF-8ポリペプチド。
  46. 【請求項４６】 C末端の生物学的に活性な断片において、マウスGDF-8ポリ
    ペプチドに対して約65％〜95％の同一性を有する、請求項４５記載のポリペプチ
    ド。
  47. 【請求項４７】 水生生物が脊椎動物および無脊椎動物からなる群より選択
    される、請求項４５記載のポリペプチド。
  48. 【請求項４８】 水生生物が、甲殻動物、軟体動物、腹足動物、斧足動物、
    頭足動物および棘皮動物からなる群より選択される、請求項４５記載のポリペプ
    チド。
  49. 【請求項４９】 水生生物が両生類である、請求項４５記載のポリペプチド
    。
  50. 【請求項５０】 配列番号51の配列を含む、請求項４９記載のポリペプチド
    。
  51. 【請求項５１】 水生生物が魚類である、請求項４５記載のポリペプチド。
  52. 【請求項５２】 魚類が鰭魚である、請求項５１記載のポリペプチド。
  53. 【請求項５３】 配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号43、配列
    番号45、配列番号47および配列番号49に示す配列からなる群より選択されるアミ
    ノ酸配列を含む、請求項５２記載のポリペプチド。
  54. 【請求項５４】 請求項５２記載のポリペプチドに特異的に結合し、配列番
    号12に示すポリペプチドに結合する抗体。
JP2001517662A 1999-08-19 2000-08-17 水生生物種由来の増殖分化因子−８の核酸およびポリペプチド、ならびにトランスジェニック水生生物種 Pending JP2003507031A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/378,238 US6465239B1 (en) 1993-03-19 1999-08-19 Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US09/378,238 1999-08-19
PCT/US2000/022884 WO2001012777A2 (en) 1999-08-19 2000-08-17 Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003507031A true JP2003507031A (ja) 2003-02-25

Family

ID=23492313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001517662A Pending JP2003507031A (ja) 1999-08-19 2000-08-17 水生生物種由来の増殖分化因子−８の核酸およびポリペプチド、ならびにトランスジェニック水生生物種

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6465239B1 (ja)
EP (1) EP1210408A4 (ja)
JP (1) JP2003507031A (ja)
AU (1) AU6921000A (ja)
CA (1) CA2382048A1 (ja)
WO (1) WO2001012777A2 (ja)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7566768B1 (en) 1995-10-26 2009-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
DE69941116D1 (de) * 1998-05-06 2009-08-27 Metamorphix Inc G von gdf-8
US6284882B1 (en) * 1999-06-10 2001-09-04 Abbott Laboratories Myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
EP1572934A4 (en) * 2002-02-21 2007-12-19 Wyeth Corp FOLLISTATIN DOMAIN CONTAINING PROTEINS
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
SI1581649T1 (sl) 2002-12-20 2011-09-30 Amgen Inc Vezna sredstva, ki zavirajo miostatin
CN1829532A (zh) * 2003-06-02 2006-09-06 惠氏公司 肌肉抑制素（gdf8）抑制剂和皮质类固醇联合用于治疗神经肌肉紊乱的用途
MX2007011400A (es) * 2005-03-23 2007-10-11 Wyeth Corp Deteccion de agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8).
ES2659114T3 (es) 2005-08-19 2018-03-13 Wyeth Llc Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y usos en el tratamiento de ALS y otros trastornos asociados con GDF-8
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US20070149458A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-28 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
US20070190056A1 (en) * 2006-02-07 2007-08-16 Ravi Kambadur Muscle regeneration compositions and uses therefor
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
TWI454479B (zh) 2007-03-06 2014-10-01 Amgen Inc 變異之活動素受體多肽及其用途
LT2370463T (lt) 2008-11-26 2016-12-12 Amgen Inc. Stabilizuotas aktivino iib receptoriaus variantas
AU2010301196A1 (en) * 2009-10-01 2012-05-17 Myostin Therapeutics Pty Ltd Synthetic myostatin peptide antagonists
AU2012364736A1 (en) 2011-12-19 2014-07-24 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
CA2876397C (en) 2012-06-15 2019-08-06 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
DK3835310T3 (da) 2012-09-13 2024-06-03 Bristol Myers Squibb Co Fibronektinbaserede skeletdomæneproteiner, der binder til myostatin
EP3985024A1 (en) 2013-02-01 2022-04-20 Atara Biotherapeutics, Inc. Anti-activin-a compounds for the treatment of ovarian cancer
PT2981822T (pt) 2013-05-06 2020-12-07 Scholar Rock Inc Composições e métodos para modulação do fator de crescimento

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999040181A1 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
WO1999042573A1 (en) * 1998-02-19 1999-08-26 Biostar Inc. Immunological methods to modulate myostatin in vertebrate subjects

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585479A (en) 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA
DE69432815T2 (de) 1993-03-19 2003-12-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine, Baltimore Wachstumsfaktor-8
KR100227406B1 (ko) * 1993-05-12 1999-12-01 브루스 엠. 에이센 Bmp-11 조성물
US6008434A (en) * 1994-07-08 1999-12-28 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-11 transgenic mice
DK0776337T3 (da) 1994-07-08 2005-12-12 Univ Johns Hopkins Med Vækstdifferentieringsfaktor-11
DE69617274T2 (de) 1995-06-06 2002-08-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston Verfahren und vorrichtung für diagnostischen dns-test
AU6274298A (en) 1997-02-05 1998-08-25 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Growth differentiation factor-8

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999040181A1 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
WO1999042573A1 (en) * 1998-02-19 1999-08-26 Biostar Inc. Immunological methods to modulate myostatin in vertebrate subjects

Also Published As

Publication number Publication date
CA2382048A1 (en) 2001-02-22
WO2001012777A9 (en) 2002-04-04
WO2001012777A3 (en) 2001-07-05
EP1210408A4 (en) 2003-09-24
WO2001012777A2 (en) 2001-02-22
US6465239B1 (en) 2002-10-15
AU6921000A (en) 2001-03-13
EP1210408A2 (en) 2002-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003507031A (ja) 水生生物種由来の増殖分化因子−８の核酸およびポリペプチド、ならびにトランスジェニック水生生物種
US20080178310A1 (en) Growth Differentiation Factor-8 Nucleic Acid and Polypeptide from Aquatic Species, and Transgenic Aquatic Species
JP5785525B2 (ja) 増殖分化因子受容体、そのアゴニスト、およびアンタゴニスト、ならびにそれらの使用方法
JP5004930B2 (ja) 筋重量を増加させるためのフォリスタチンの使用方法
US20110239317A1 (en) Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
AU2002307564A1 (en) Use of follistatin to increase muscle mass
AU2011244851A1 (en) Promyostatin peptides and methods of using same
AU2012204098B2 (en) Use of follistatin to increase muscle mass
AU2007200633B2 (en) Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
AU2006201079A1 (en) Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
AU2006209266A1 (en) Promyostatin peptides and methods of using same

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070813

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100420

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100714

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100722

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20101221