JP2003506487A - タンパク質チロシンホスファターゼインヒビター（ｐｔｐ）としてのペルオキソバナジウム化合物、血管形成、再狭窄およびエンドセリン産生に対するそれらの阻害作用、並びに免疫応答に対するそれらの刺激作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、血管形成、再狭窄の予防およびエンドセリンの産生における、および免疫モジュレーターとしてのペルオキソバナジウム化合物の使用に関する。ペルオキソバナジウム化合物は、それらの「オキソ」対応物よりも、いっそう効力があり、毒性が低いので、好ましい。in vitroにおいてヒト臍血管内皮細胞（HUVEC）ならびにex ovoにおいてニワトリ漿尿アッセイ膜を使用しておよびラット大動脈リングモデルにおいておよびin vivo Matrigelアッセイにより、抗血管形成活性を検証した。また、ペルオキソバナジウム化合物は基底レベルを減少させ、ラットにおけるインスリン誘導後に起こる血漿エンドセリンの増加を阻害する。ペルオキソバナジウム化合物は、なかでも、細胞の増殖、分化および移動またはペプチド（例えば、エンドセリンおよび免疫モジュレーター）の分泌、または両方に関係する1つまたはいくつかのタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）を阻害することによって、治療的に活性な抗血管形成因子でありかつ血管再狭窄の予防において有効であることが提案される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、血管形成、再狭窄およびエンドセリン産生の防止するため、および
ワクチン接種用アジュバントとしての、ペルオキソバナジウム化合物、例えば、
ビスペルオキソ（1，10−フェナントリン）オキソバナジン酸カリウム［bpV（ph
en）］、ビスペルオキソ（ピリジン−2−カルボキシラト）オキソバナジン酸カ
リウム［bpV（pic）］およびビスペルオキソ（2，2'−ビピリジル）オキソバナ
ジン酸カリウム［bpV（bipy）］の使用に関する。

【０００２】 発明の背景 A） ペルオキソバナジウム化合物 合成ペルオキソバナジウム（pV）化合物は、タンパク質チロシンホスファター
ゼ（PTP）の効力のあるインヒビターである、構造的に融通性の塩化メチレンで
ある（1）。これらの化合物は1つのオキソ配位子、バナジウムに対して配位する
1または2つのペルオキソ基、および1つの補助的配位子を含有し、光を遮断した
とき生理的pHにおいて水溶液中で安定である。これらのペルオキシアニオン化合
物のPTP阻害潜在能力および特異性の根元的メカニズムは特性決定されている。

【０００３】 PTPの既知インヒビター、例えば、オルトバナデート、モリブデート、タング
ステートおよび亜鉛に比較して、それらは触媒ドメイン中に位置する必須の、保
存されたシステイン残基を不可逆的に酸化する能力を有する（2）。補助的配位
子を操作する可能性は、潜在能力および特異性を調節するとき重要であることが
ある（1、3）。2つのpV化合物、bpV（phen）およびbpV（pic）による形質転換細
胞の増殖の可逆的停止が報告された（4）。マウスに対するpV化合物の投与は、
原生動物寄生生物（Leishmaniasis）により誘導された侵略的感染を治癒させた(
5）。

【０００４】 B） 血管形成 ほとんどすべての組織および器官は血管網状組織を発生させ、これらの組織は
細胞に栄養分および酸素を供給し、代謝廃棄物の排除を可能とする。血管網状組
織は、いったん形成すると、細胞のターンオーバー速度が遅い安定な系であり（
6）、しかも、刺激されると、内皮は最も急速に増殖する細胞のタイプの1つとな
ることができる（7）。事実、新しい血管の形成は重大な生理学的合併症を引き
起こすことがある。例えば、角膜および軟骨は健康な状況において無血管性であ
るが、これらの組織を含むいくつかの疾患は血管の多量の到着により複雑化する
。眼の血管形成疾患は、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、黄斑変性および角
膜移植片の血管新生化を包含する。

【０００５】 関節血管形成疾患は、慢性関節リウマチおよび関節症を包含する。皮膚の慢性
症状である乾癬は、また、皮膚表面における高血管化を示す。最後に、充実性腫
瘍成長は、局所的に進行し、身体全体にわたって広がる新しい血管の形成に決定
的に依存する（8、9）。また、現存する血管の維持は、細胞の複製および／また
は分化の調節を必要とする。例えば、急性および慢性の病理学的進行、例えば、
アテローム性動脈硬化症、血管形成後の再狭窄および高血圧症は、成熟血管の異
なる細胞成分（内皮細胞、平滑筋細胞、筋細胞および繊維芽細胞）の増殖を包含
する。

【０００６】 ある種のペプチドおよびタンパク質を包含する、いくつかの因子は、in vivo
血管応答を包含することができる。このような因子は、内因性物質、例えば、EG
F／TGF−α表皮増殖因子／形質転換増殖因子−アルファ）、TGF−β（形質転換
増殖因子−β）、TNF−α（腫瘍壊死因子−アルファ）、アンギオゲニン、プロ
スタグランジンE₂、およびモノブチリンである（10〜15）。しかしながら、これ
らの因子は培養において内皮細胞に対してマイトジェン作用をほとんどもたず（
TGF−α、EGF、アンギオゲニン、プロスタグランジンE₂、モノブチリン）そして
、パラドックス的に、それらは成長を阻害する（TGF−β、TNF−α）（10〜17）
。

【０００７】 こうして、それらの血管形成作用は大部分炎症応答に依存して間接的である。
炎症細胞はいくつかの因子、例えば、aFGF（酸性繊維芽細胞増殖因子）、bFGF（
塩基性繊維芽細胞増殖因子）、PDGF（血小板由来増殖因子）、および血管表皮増
殖因子（VEGF）を産生し、これらは内皮細胞のin vitro増殖およびin vivo血
管形成を刺激することができる（19〜28）。

【０００８】 血管形成プロセスは、普通に理解されているように、次のように要約すること
ができる：突然変異、酸素の欠如、およびその他により活性化された細胞は血管
形成分子を放出し（29〜34）、これらの分子は炎症細胞および内皮細胞を誘引し
、それらの増殖を促進する。白血球が血管内皮細胞に結合した後、血管内皮細胞
はそれらの膜上のタンパク質結合を認識して血管形成プロセスを活性化する（35
、36）。ターゲット組織への移動の間に、炎症細胞は血管形成作用を強化する物
質を放出する（37、38）。

【０００９】 活性化された血管内皮細胞は、血管壁を消化してターゲット組織に向かう移動
を可能とするプロテアーゼを分泌することによって、血管形成シグナルに対して
応答する（39〜41）。血管壁の消化により産生された、いくつかのタンパク質フ
ラグメントは内皮細胞の増殖および移動活性を強化する（42〜44）。最後に、内
皮細胞はそれらの接着性膜タンパク質を再配置して、毛細管を形成させる。

【００１０】 こうして、血管形成はいくつかの決定的な細胞事象から成る複雑なプロセスで
あり（45〜47）、それらのうちで下記のプロセスを容易に同定できる： ・ 内皮細胞への白血球の結合および誘導； ・ ターゲット組織への炎症細胞の移動； ・ 現存する血管系の周囲細胞の退行； ・ プロテアーゼによる血管壁の溶解； ・ 内皮細胞の移動； ・ 内皮細胞の増殖； ・ 内皮細胞の分化および管状形態への配置； ・ 毛細血管網状組織の形成； ・ 吻口；および ・ 血流の開始。

【００１１】 内皮細胞の増殖を誘導することが知られている因子は、オルトバナジン酸ナト
リウムを包含する（48）。この因子が毛細血管内皮細胞における侵入表現型を誘
導するメカニズムは明瞭に理解されてない。しかしながら、培養細胞に対するバ
ナジン酸塩の作用は、多数の面において、PMA（49）、bFGF（50）およびある種
のレトロウイルス形質転換タンパク質により誘発される作用に類似し、これらは
チロシン特異性タンパク質リン酸化を同定することによって作用する（51〜54）
。ホルボールエステルおよび種々の増殖因子、例えば、bFGF、VEGFおよびPDGFは
チロシン残基に対する細胞タンパク質のリン酸化を刺激するという発見とこれら
の観測は一致するが、バナジン酸塩は、多分1またはそれ以上のチロシンホスフ
ァターゼを阻害することによって、チロシンリン酸化を顕著に増加させる。

【００１２】 バナジン酸塩の他の誘導体（bpV（phen）；bpV（pic））は合成され、効力の
あるPTPインヒビターであることが証明された（1）。これらの生成物は、バナジ
ン酸塩と同様に、内皮細胞増殖を促進することが期待された。反対に、これらの
因子はいくつかの細胞タイプの増殖を阻害する（4）。ある場合において、細胞
はG2／Mにおいて阻止される。この拘束を説明するための最も簡単な仮説は、PTP
制御細胞有糸分裂がbpV（phen）およびbpV（pic）インヒビターのターゲットで
あることである。cdc25タンパク質はpV化合物の候補のターゲットとして提案さ
れた（4）。

【００１３】 国際特許公開WO 95／19177において、増殖疾患、転移および薬剤耐性腫瘍の
治療のためのバナジン酸塩化合物の使用が教示されている。これらのバナジン酸
塩化合物は抗増殖性および抗コラーゲン溶解性であると記載されているが、抗血
管形成活性の重大な指示はそれらの帰属されてない。さらにこの刊行物が示すよ
うに、抗腫瘍作用は5mMより高い投与量のバナジン酸塩で観測される。1.3mMまた
はそれより低いバナジン酸塩化合物の濃度は明らかな抗腫瘍作用を示さないこと
が認められる。 Montesano他（48）は、反対に、バナジン酸塩化合物が内皮細胞を増殖させる
が教示されている。それゆえ、それらの発見はこれらの化合物が前血管形成性で
あり、抗血管形成性でないことを示すであろう。

【００１４】 米国特許第5,716,981（Hunter他）には、抗血管形成用途におけるバナジウム
化合物、すなわち、オキソバナジン酸塩、オルトバナジン酸塩およびバナジル化
合物の使用が記載されている。しかしながら、この参考文献はこれらの化合物の
抗血管形成性を支持する実験的証拠を提供していない。これらの化合物はパクリ
タクセル（Paclitaxel）（詳細に記載されている抗血管形成化合物）に多分等し
いと記載されている。先行技術の残部は、バナジウム化合物が前血管形成性であ
ることを示唆しているので、これらの化合物を抗血管形成剤として使用すること
を確認させる教示はこの特許の中に存在しない。

【００１５】 pV化合物はオキソ化合物、例えば、バナジン酸塩よりもいっそう強力な抗腫瘍
分子である。形質転換された細胞に対するpV化合物の直接的抗増殖活性は知られ
ている（4）。国際特許公開WO 95／19177中のバナジン酸塩化合物について有効
であることが見出された濃度において、pV化合物は有効な抗腫瘍化合物である。 バナジウム化合物の抗腫瘍活性は知られているが、それらの抗血管形成活性は
従来それらのオキソまたはペルオキソ誘導体に関して開示されてきていない。

【００１６】 C） エンドセリン エンドセリン（ET）は、成熟血管の生理学的状態の重要なレギュレーターとし
て作用する、3つのイソペプチドの1ファミリーである。それらは今日まで同定さ
れた最も効力のある血管収縮剤である。さらに、それらは内皮細胞、平滑筋、筋
細胞および繊維芽細胞の増殖、ならびに、VEGFを包含する、種々の増殖因子の合
成を刺激することが知られている（55、56）。

【００１７】 また、ETは腫瘍発生に関係する血管形成因子であると考えられる（57）。大部
分の腫瘍細胞はETを合成し、分泌する（58〜62）。異なる癌により影響を受けた
患者はETの血液濃度の増加を示す（63〜65）。ETレセプターB型（RET_B）の発現
の減少は、ETの存在下にインキュベートした腫瘍細胞の成長を減少させる（65）
。上に示したように、ETは内皮細胞の増殖および移動を促進する（66）。ETリガ
ンドおよびETレセプター（RET_AおよびRET_B）の発現は、複数の腫瘍の内皮細胞に
おいて観測された（67、68）。ETは自己分泌方式で作用し、局所的血管形成を促
進する（69）。さらに、ETは転移の発生を一緒に進行する血流力学的変化に関係
づけられる。例えば、動脈肝臓血流／門静脈血流の比は結腸直腸癌からの肝臓転
移を有する患者において異常に高い（70）。この高い血流比は、in vivoで証明
されるように、体液性メディエイターの存在のためである（71）。

【００１８】 腫瘍性血管層は関与を有さず、結局血管収縮薬剤に対する応答しない。しかし
ながら、これらの薬剤は正常の肝臓血流を減少させ、腫瘍中の血流を増加する。
ETは血管改造および腫瘍発生に関係する効力のある血管収縮および血管形成因子
であるので、それらはこれらの変更された血流力学に関係づけられる。したがっ
て、ETインヒビターは腫瘍内血流を制御しかつ腫瘍の成長および変性に影響を及
ぼす、価値のあるツールである。さらに、このようなインヒビターはバナジウム
化合物の抗腫瘍作用がETを含むかどうかを立証するとき有効であろう。

【００１９】 D） 血管形成 また、ETは内皮細胞により細胞外マトリックスの産生を刺激することが知られ
ている（72、73）。それは血管再構築または血管形成時にしばしば観測されてい
る（74、75）。この作用は血管外傷後に再狭窄のために特に有害である。患者の
30〜50％において、再狭窄はアテローム性動脈硬化症の病変の再拡張により特徴
づけられる。この血管疾患の原因は、細胞増殖、細胞移動および細胞外マトリッ
クス産生により引き起こされる、局所的血管遮断のためである。

【００２０】 最近、ETは血管改造、特に長期間のアテローム性動脈硬化症、心臓性栄養過度
（鬱血性心不全）、高血圧症（肺性およびその他）、腎臓の問題およびある種の
全身的機能障害のような症状において主要な役割を演ずることが示された（76〜
80）。また、ETは冠状動脈および脳血管痙攣に強く関係し、虚血および生存率の
低下に導く（81、82）。こうして、ETの効力のある血管収縮活性および窒素活性
のために、ETインヒビターの産生は一般に抗高血圧症剤および抗増殖剤として有
効であることが期待され、特に血管外科手術の前、間および後に有効である。

【００２１】 E） 免疫応答 有効な細胞仲介免疫応答を開発するために、感染したマクロファージ（Mφ）
は特異的方法でTリンパ球の活性化を誘導することができる。引き続いて、T細胞
は、いくつかのリンフォカインを分泌することによって、細胞破壊機能のために
Mφを活性化することができる（83、85）。幾人かの研究者らは、リーシュマニ
ア（Leishmania）感染のコントロールにおけるサイトカインの重要性を証明した
（86〜91）。こうして、Mφ−Tリンパ球の相互作用の完全性は免疫応答の発生の
ための原始的ステップであり、そしてMφの参加は免疫応答の開始および支持に
対する重大である。

【００２２】 チロシンリン酸化は細胞増殖の開始において普通の事象であり、そして非増殖
性造血細胞の細胞機能を調節するシグナルトランスダクションにおけるチロシン
リン酸化の役割はまた十分に記載されている（92〜98）。PTPはホスホチロシン
依存的事象の調節において重要な役割を演ずる（99、100）。我々は最近NO調節
におけるPTPの重要性を証明した（5）。事実、pV化合物によるMφ PTPの阻害は
IFNγ刺激に導く応答性の増加に導く、これはNO産生の悪化により反映される。M
φ PTPの阻害とNO産生の増強との間の相関は、Mφ PTP活性およびチロシル残
基の過リン酸化の増加によりさらに支持された（5）。

【００２３】 タンパク質チロシルリン酸化状態のモジュレーションは、多くの場合において
、細胞外刺激に対するいくつかの細胞からのよりよい応答を生ずるであろうこと
が証明された（101〜103）。Tリンパ球活性が絶頂に達するシグナルトランスダ
クションの陰性調節において、PTPはきわめて重要な役割を演ずることができる
。以前の研究において、過バナジン酸塩（バナジン酸塩と過酸化水素との混合物
）は、c−fos遺伝子の転写およびそのmRNAの蓄積、ならびにCD69抗原およびCD25
の発現を刺激することが示された（103）。

【００２４】 また、pV化合物bpV（phen）はまた翻訳における核NF−kBの転位を誘導し、Mφ
iNOS mRNAの発現を増加できることが証明された（5）。血小板活性化因子お
よびNaオルトバナジン酸塩で刺激した培養におけるラットクッパー細胞は、いく
つかのタンパク質中のホスホチロシン、およびプロスタグランジンE₂発生、の時
間および濃度依存的増加を示した（101）。前述したように、bpV（phen）で前処
理したMφはIFNγ刺激に対していっそう耐性であり、これはバナジン酸塩処理細
胞および非処理細胞に比較して、NO産生量がより多いことにより反映されること
を我々は最近証明した（5）。

【００２５】 bpV（phen）はいくつかの免疫機能の強力なアクチベーターでありうるという
証拠が存在するが、炎症応答および特異的抗原に対する有効な免疫応答の発生に
おいて重要な役割を有し、こうしてアジュバントとして作用することについて認
識されている、サイトカイン（例えば、IFNγ、IL−12およびIL−1）およびして
ケモカイン（例えば、RANTES、MIP−1α、β、MIP−2、IP−10、MCP−1）を誘導
するオキソまたはペルオキソ誘導体の能力は従来開示されてきていない。

【００２６】 発明の要約 本発明は、血管形成、再狭窄およびエンドセリン産生に対して、かつ免疫モジ
ュレーターとして有効であるpV化合物を提供する。これらの分子は遷移金属（例
えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブまたはタンタル
）と、1つのオキソまたはペルオキソ基とを含んでなる。ペルオキソ基を含んで
なる分子は、いっそう効力のある抗血管形成分子である。好ましくは、分子は補
助的配位子をまた含有し、このような配位子は遷移金属原子に結合することがで
きる任意の分子を包含する（通常、酸素および窒素を含む結合を介する）。フェ
ナントリン、ピコリン酸、ビピリジン、シュウ酸、4，7−ジメチル−フェナント
リンおよびペプチドはこのような配位子の例である。

【００２７】 新しい血管の形成を阻害しそして／または現存する血管の回復におけるエンド
セリン（ET）の全身的および局所的レベルを制御するために、すべてのこれらの
分子を使用することができる。 ペルオキソアニオンを含有する分子は、それらのオキソ対応物よりも強力であ
る。したがって、前者は遷移金属への過度の暴露から生ずる毒性を減少するため
に非常に低い濃度において使用することができる（4）。

【００２８】 オキソ遷移金属錯体は、オキソ錯体、例えば、バナジン酸塩、タングス酸塩、
モリブデン酸塩、およびバナジル錯体、例えば、下記の錯体を包含する：メタバ
ナジン酸塩（VO₃ ^-）、オルトバナジン酸塩（VO₄ ^3-）、それらの塩、バナジル化
合物（VO²⁺）、例えば、バナジルアセチルアセトネートおよびバナジルサルフェ
ート。同様な錯体は他の遷移金属について存在する。

【００２９】 他の適当なタングステンおよびモリブデンの錯体は、例えば、グリセロール、
酒石酸および糖から誘導されるヒドロオキソ誘導体を包含する。ペルオキソ遷移
金属錯体は、遷移金属と組合わせることができる任意の酸化剤を包含する。それ
自体、好ましいペルオキシドは下記のものを含んでなる：t−ブチルヒドロペル
オキシド、ベンゾイルペルオキシド、m−クロロペルオキシ安息香酸、クメンヒ
ドロペルオキシド、過酢酸、ヒドロペルオキシロン酸、エチルペルオキシド、ピ
リジンペルオキシドおよび過酸化水素。

【００３０】 本発明の化合物の一般的構造は、次の通りである：

【化５】

【００３１】 式中、 Tはバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル
から成る群から選択される遷移金属であり、 Yは酸素またはヒドロキシルであり、 ZおよびZ'は酸素およびペルオキシドから独立して選択され、そして LまたはL'は1つの電子対を表すことができる任意の基である。

【００３２】 好ましい態様において、遷移金属Tはバナジウムであり、Yは酸素であり、Zお
よびZ'はペルオキシドであり、そしてLおよびL'は1，10−フェナントロリンの窒
素原子である。 他の好ましい態様において、遷移金属Tはバナジウムであり、Yは酸素であり、
ZおよびZ'はペルオキシドであり、そしてLおよびL'はピコリン酸の窒素原子また
は酸素原子である。 なお他の好ましい態様において、遷移金属Tはバナジウムであり、Yは酸素であ
り、ZおよびZ'はペルオキシドであり、そしてLおよびL'は2，2'− ビピリジンの
窒素原子である。

【００３３】 上記pV化合物は、内皮細胞増殖を阻害するので、効力のある抗血管形成剤であ
る。それらは血管新生およびエンドセリン産生をさらに阻害する。 そのうえ、ラットモデルにおけるpV化合物bpV（bipy）の投与は、頸動脈の血
管形成後血管改造度の有意な減少を明らかにした。さらに、pV化合物bpV（bipy
）は、サイトカインおよびケモカイン遺伝子の発現を誘導し、アゴニストに応答
して細胞リクルートメントを増強し、結局ワクチン接種の関係においてアジュバ
ントとして作用する能力に基づいて、効力のある免疫モジュレーターであること
が見出された。 添付図面を参照しながら、本発明の好ましい態様の下記の非限定的説明を読む
と、本発明の他の目的、利点および特徴は明らかとなるであろう。

【００３４】 本発明の好ましい態様の説明 特定の態様および添付図面を参照することによって、本発明を説明する。これ
らの態様および添付図面は本発明の範囲を限定するよりむしろ本発明を例示する
ことを目的とする。

【００３５】 A） ペルオキソバナジウム化合物および血管形成 1 − ペルオキソバナジウム化合物は内皮細胞の増殖および管状構造の形成
を阻害する 以前に記載されているように、ヒト臍血管内皮細胞（HUVEC）をコラゲナーゼ
制御消化により抽出する（105）。純粋なHUVECを第4継代培養前に使用した（各
継代培養においてトリプシン−EDTA）。ジアセチルLDLを組込みかつ因子VIII関
係抗原で標識化できる能力について、細胞を分析した。

【００３６】 ゼラチンで被覆した無菌プレートの中に、内皮細胞を2500細胞／cm²の密度で
プレートした。細胞を完全培地（M199：ヘパリン（90μg／ml）またはL−グルタ
ミン（2mM）、ビカーボネート、FBS（20％）およびECGS（100μg／ml））中で24
時間培養して、細胞接着を確実にした。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、培地を
実験条件に従い添加した。最後のPBS洗浄を時間t＝0と考えた。 ペトリ皿中のDNAの存在量で細胞増殖を測定した。各実験を三重反復実験にお
いて実施した。培地を毎日交換した。96時間培養した後、細胞をクエン酸ナトリ
ウム−SDS溶液で溶解し、Hoescht 33358とインキュベートした。試料を分光蛍
光計で365nmにおいて読んだ。

【００３７】 結果はpV化合物を使用する内皮細胞の増殖の投与量−応答阻害を示す（第1図
）。概算IC₅₀はbpV（phen）について2μMおよびbpV（pic）について3.5μMであ
る。 あるいは、フィブリンマトリックス中の培養したHUVECは血清の存在下に三次
元管状様構造を形成することができる。このアッセイをbpV（phen）、bpV（pic
）またはバナジン酸塩の存在下に実施して、HUVECの分化および体制化に対する
これらの化合物の各1つの影響を評価した（表I）。HUVECをゼラチン被覆ウェル
の底に高い密度で播種して、48時間にコンフルエント単層を形成した。

【００３８】 次いで、重合前に、50,000HUVEC／mlをフィブリノゲン溶液の中に埋め込んだ
。試験すべき分子を含有する測定でフィブリンマトリックスをカバーしたが、こ
れらの分子を含有しない培地を対照とした。細胞の挙動を位相差顕微鏡により周
期的に観測した。1μMのbpV（phen）の存在下に21日間培養した後、コード様構
造（またはコード）、管様構造（または管）および星形構造（または星構造）が
観測された。より高い投与量（2および3.5μM）において、フラグメント化コー
ド様構造が明らかであった。bpV（pic）の存在下に、コードおよび管が1、2およ
び3.5μMにおいて観測された。

【００３９】 オルトバナジン酸塩の存在下に、コードは10μMにおいてなお明らかであり、
そして25μMにおいて死んだ細胞がまばらに分布していた。これらの結果が示唆
するように、pV化合物は内皮細胞の体制（organization）および末端の分化を妨
害する。さらに、bpV（phen）は管形成の阻害においてbpV（pic）よりもいっそ
う効力のあるので、補助的配位子の特質は重要である。

【００４０】 結果が示すところによれば、星形構造が影響を受ける（体制化（organization
）および末端の分化）かぎり、バナジン酸塩は抗血管形成作用を有する。バナジ
ン酸塩は、それぞれ、bpV（pic）およびbpV（phen）よりも少なくとも3および5
倍低い効力を有する。バナジン酸塩を使用して観測される抗血管形成作用は、Mo
ntesanoの教示（48）と一致しない。

【００４１】 事実、低い投与量において、すべての試験したバナジウム化合物は前血管形成
性であるように思われたが、より高い投与量（すなわち、ほとんど2倍の投与量
）において、同一化合物は明らかに抗血管形成性であることが観測された。基L
、L'はバナジウム化合物の効力に大きい影響を与える；例えば、フェナントリン
はピコリン酸の2倍の効力を有することが見出された。

【００４２】

【表１】

【００４３】 2 − ラット大動脈リングアッセイ ラット大動脈リングを以前に記載されているようにフィブリンマトリックスの
中に埋め込んだ（107）。成体ラットから切除した胸大動脈をハンクス平衡塩溶
液（HBSS）中でリンスし、周囲外膜を洗浄除去した。長さ1mmの大動脈リングを
切断し、培地中でリンスした。次いで大動脈リングの各々をフィブリンゲルマト
リックスに埋め込んだ。ラット大動脈リングの外表面から移動する血管に向かう
距離を測定することによって、フィブリンゲル中の微小血管の移動を定量した。
第15日に生物形態計測をNIH影像解析システムでディジタル化することによって
、測定を実施した（第3図および第4図）。

【００４４】 3 − ペルオキソバナジウム化合物はex ovo血管新生を阻害する a. 試験システムの定義 ヒヨコ胚の正常発生は外部血管系の形成を含む。外部血管系の形成は、卵黄膜
の中に位置し、卵黄（卵の卵黄）から発生する胚に栄養分を運ぶ。抗血管形成物
質を卵黄膜上に配置すると、抗血管形成物質は卵黄膜中の血管発生を阻害するこ
とができる。卵黄膜へのアクセスを促進するために、ヒヨコ胚を無菌培養ボック
ス（ペトリ皿）に移し、湿度・温度制御インキュベーターの中に入れた。次いで
胚はex ovo条件において数日間発育することができた。

【００４５】 被験化合物のアリコートをメチルセルロース溶液と混合し、薄いディスクに空
気乾燥させた。メチルセルロースは不活性マトリックスを形成し、それから被験
化合物はゆっくり拡散することができる。被験化合物を含有するメチルセルロー
スディスクを卵黄膜の血管周囲の外部境界上に配置され、ここで血管形成プロセ
スがなお活性であった。

【００４６】 近接血管発生に対する被検化合物を含有するディスクの作用を、すべての場合
において、対照緩衝液を含有するディスクの作用を比較した。ex ovo成長プロ
セスの第0日〜第1日に、胚の卵黄膜上にディスクを配置した；この時点において
、主血管の開始のみが卵黄に侵入している。次いで血管化を評価するまで（ほぼ
24時間）、胚を培養条件にした。すべての場合において、対照緩衝液を含有する
ディスクおよび化合物を含有するディスクを同一胚の卵黄膜上に同時に添加した
。両方のディスクを胚の頭尾軸に関して対称に配置して、被験化合物を対照と比
較したとき、個々の間の変動を最小にした。

【００４７】 b. 抗血管形成活性 陽性対照として異なる濃度のプロタミン（5〜20μg）または被験化合物（0.00
1〜10μg）を使用して、胚血管化試験（EVT）を実施した。培養1日後、ディスク
で被覆された領域の血管化レベルを1対の科学者により通常の盲検方式で等級づ
けた。ディスクの捜し出しを促進するために、卵黄膜上にディスクを配置した直
後に黒色Oリングをディスクの回りに配置した。EVTの評価目盛りは2つの異なる
スコアリングシステムに基づく。

【００４８】 血管形成の評価 血管形成を盲検方式で評価した。メチルセルロースディスクの下に横たわる卵
黄膜の領域を、2つのスコアリングシステム（「N／＋」または「1−2−3」）を
使用して、血管化の程度についてスコアを付けた。下記の選択基準を使用した： N／＋システム： すべての下記条件が満足されるとき、「正常」についての「N」のスコアが帰
属される： 評価した領域における血管は、異常な偏りなしに、それらの通路に沿って成長
した。側副分岐密度は正常であり、そして横方向分岐の成長通路もまた正常であ
った。

【００４９】 下記条件の少なくとも1つが満足されるとき、「＋」のスコアが帰属される： ・ 主要な血管は評価した領域を横切って成長するが、それらの通路は明瞭に
影響を受けた（屈曲）。 ・ 主要な血管は評価した領域を横切って成長するが、側副分岐密度は明瞭に
減少した。 ・ 主要な血管は評価した領域を浸透するが、それらの成長通路は急速に偏っ
た。 ・ 血管の中にキンクが観測された。 ・ 主要な血管は評価した領域を浸透するが、成長が阻止された。その点を越
えた成長は観測されなかった。 ・ 主要な血管がディスクの近位へりに到達したとき、成長通路が著しく偏っ
た。 1−2−3等級づけシステム： 下記条件が満足されるとき、3のスコアが帰属される： ・ 評価した領域の中に存在する血管は、異常な偏りなしに、それらの通路に
沿って成長した。側副分岐密度は正常であり、そして横方向分岐もまた異常であ
った。 下記条件の少なくとも1つが満足されるとき、2のスコアが帰属される： ・ 主要な血管は評価した領域を横切って成長するが、それらの通路は明瞭に
影響を受けた（屈曲）。 ・ 主要な血管は評価した領域を横切って成長するが、側副分岐密度は明瞭に
減少した。

【００５０】 下記条件の少なくとも1つが満足されるとき、1のスコアが帰属される： ・ 主要な血管は評価した領域を浸透するが、それらの成長通路は急速に偏っ
た。 ・ 血管の中にキンクが観測された。 ・ 主要な血管は評価した領域を浸透するが、成長が阻止された。その点を越
えた成長は観測されなかった。 ・ 主要な血管がディスクの近位へりに到達したとき、成長通路が著しく偏っ
た。 3のスコアは血管の発育が正常であることを意味するが、1のスコアは血管形成
活性の程度が最大であることを示した。

【００５１】

【表２】

【００５２】 プロタミン、bpV（phen）、およびオルトバナジン酸塩を使用して、投与量応
答阻害が得られた（第1図）。概算IC₅₀はbpV（phen）について0.1μg、オルトバ
ナジン酸塩について0.6μg、そしてプロタミンについて11μgであった（スコア
リングシステムを無視する）。収集した実験データの要約を表IIに示す。 これらの結果が示すように、bpV（phen）は血管形成プロセスの効力のあるイ
ンヒビターである。主題（バナジン酸塩）についての先行技術は、反対の事実、
すなわち、バナジン酸塩化合物が血管形成を促進するという事実、を教示した。

【００５３】 4 − in vivoマトリゲル（Matrigel）プラグアッセイ このアッセイを以前に記載されているように実施した（108）。簡単に述べる
と、マトリゲル（Matrigel）（4℃において液体）を200ng／mlのECGSと混合し、
4匹のC57B1／6N雌マウスに皮下注射した（1ml／マウス）。注射後、マトリゲル
を重合させてプラグを形成した。7日後、動物を殺し、マトリゲルプラグを除去
し、10％中性緩衝化ホルマリン溶液（Sigma Chemical Co.）中で固定し、パラ
フィンに埋め込んだ。組織学的切片をマッソン（Masson）トリクロームで染色し
、各皮下マトリゲル（s.c. Matrigel）プラグについて3つの顕微鏡視野中で移
動した細胞の数を数えることによって、血管形成のスコアを付けた。

【００５４】 実験を実施して、bpV（phen）がin vivo血管形成を阻害するかどうかを決定
した。内皮細胞は血管形成因子ECGSを含有するマトリゲルプラグの中に侵入し、
血管を形成した。動物を5つのグループ（4マウス／グループ）に分割し、2つの
対照グループに処置を与えなかったか、あるいは毎日PBSを腹腔内注射し、そし
て3つのグループに種々の投与量（10、50および100μg）のbpV（phen）を第1日
から第7日を毎日投与した（100μlの溶液を毎日腹腔内投与した）。これらの結
果が示すように、bpV（phen）は効力のあるin vivo血管形成インヒビターであ
る（第5図）。10μg／マウスまたはより高い投与量の毎日投与量は、侵入したマ
トリゲルプラグを有する内皮細胞の数を半分だけ減少させた。

【００５５】 in vitro、ex ovo、およびin vitro分析システムを使用して、pV化合物の
血管形成可能性を試験した。これらの結果が示すように、先行技術の教示から期
待されることと対照的に、pV化合物は血管形成プロセスの効力のあるインヒビタ
ーである（下文参照）、そしてこれは高い投与量のバナジン酸塩を含む。

【００５６】 B） ペルオキソバナジウム化合物およびエンドセリン産生 表IIに記載するデータは、ETの血漿レベルに対するbpV（phen）の作用を示す
。この研究において、ラットにbpV（phen）（0.5mg／100g体重）を腹腔内注射し
た後、インスリンまたはベヒクルを投与した。インスリン投与（1.5μg／100g体
重、またはベヒクル）後2分に、ETの血漿レベルを測定した。インスリン投与はs
eric ET濃度を強い増加を誘導した（55）。この増加はbpV（phen）により完全
に壊滅された。さらに、bpV（phen）は血漿ETのインスリン刺激レベルを対照レ
ベルよりも下に減少させた。これらの結果が示すように、bpV（phen）はETのイ
ンスリン誘導放出を阻害し、引き続いてこれは糖尿病合併症、例えば、血管症ま
たは腎症に導くことがある。

【００５７】

【表３】

【００５８】 凍結乾燥およびC2カラム（500mg）上の抽出後、ET（ET−1、ET−2、ET−3）を
RIA（Amersham kii RPA 555）により測定した。結果は平均±SD、p＜0.0209
である、対照（n＝4）／インスリン、pV（n＝3）。

【００５９】 C） ペルオキソバナジウム化合物および再狭窄 表IVに記載するデータは、再狭窄に対する原発性胆汁性肝硬変bpV（bipy）の
作用を示す。雄Spraque−Dawleyラット（325〜350g）をRogarsetic、すなわち、
ケタミン塩酸塩およびキシラジン塩酸塩の混合物で麻酔した。動物を14〜31ラッ
トの2つのグループに分割し、処置を使用するか、または使用しないで左頸動脈
のバルーン血管形成を実施した（109）。処置グループに、血管形成日に開始し
て、bpV（bipy）（10mg／kg／i.p. b.i.d.）を14日間投与した。各グループの
各動物について左外部頸動脈のバルーン血管形成を実施したが、反対横方向頸動
脈を各分析について対照として使用した。左頸動脈バルーン血管形成を無菌的条
件下に実施した。

【００６０】 左外部頸動脈を単離し、動脈切開を実行した。次いで2F Fogarty動脈塞栓切
除カテーテルを左総頸動脈の中に挿入し、大動脈弓付近に位置決定した。次いで
バルーンを膨張させ、ねじり運動でその挿入点に後退させた。この手順を2回反
復し、外部頸動脈を結紮した。処置したラットおよび対照として非処置ラットの
正常の、非バルーン処置頸動脈間の新内膜増殖（NIP）測度として、管腔（L）、
内膜（I）、中膜（M）、I／M比および（M−L／P）の計算値において差は存在し
なかった（データは示されていない）。処置はNIPおよびI／M比の30％の減少、I
の厚さの21％の減少およびLの開口の28％の増加を引き起こした。こうして、bpV
（bipy）を使用する処置は、ラットモデルにおける頸動脈管形成後の血管改造度
の有意な減少を明らかにした。

【００６１】 上記結果はバナジウム化合物の抗血管形成および抗再狭窄の可能性を例示する
。pV化合物を投与して、いくつかの血管形成依存的症状の進行ならびに管形成後
の血管改造をコントロールすることができる。バナジン酸塩は抗腫瘍化合物であ
るので、本発明のpV化合物は抗腫瘍治療剤として機能し、そしてこの活性の一部
分は抗血管形成作用のためであろう。医薬組成物は約0.1〜100μM、好ましくは2
〜40μMの細胞外濃度を達成することができる効力のあるpV化合物を含んでなる
。ラットにおいて、インスリン投与後のエンドセリン増加を逆転するとき、20μ
M／kgの投与量は有望であった。その上、バナジウム「オキソ」化合物よりもい
っそう効力のありかつ少ない副作用を誘発すると従来述べられている、pV化合物
は所望の投与量を達成するように投与することができる。例えば、血糖レベルに
対するin vivo作用は報告された（1、3）。

【００６２】

【表４】

【００６３】 D） ペルオキソバナジウム化合物および炎症応答 本発明は、新規な免疫モジュレーターおよびアジュバント分子としてpV化合物
を提供する。pV化合物bpV（phen）はin vitro（マクロファージ；ケモカイン遺
伝子の発現）およびin vivo（ネズミモデル；サイトカイン遺伝子の発現、サイ
トカインおよびケモカインの発生および種々の刺激に応答する細胞リクルートメ
ント）免疫モジュレーターとして、そして既知リーシュマニア抗原をベースとす
るバナジン酸塩化合物の保護作用を最大とするアジュバントとして使用すること
ができる。

【００６４】 上記bpV（phen）化合物は、サイトカイン（例えば、IL−12、IFNγ、IL−1β
）およびケモカイン（例えば、RANTES、MIP−1α、β、MIP−2、IP−10、MCP−1
）遺伝子の発現を誘導してアゴニストに応答する細胞のリクルートメントを増強
し、結局ワクチン接種の関係においてアジュバントとして作用する、その能力に
基づいて効力のある免疫モジュレーターである。

【００６５】 1 − bpV（phen）処置はリーシュマニア感染に応答する炎症前分子の分泌お よび多形核リクルートメントを増強する ネズミ空気嚢モデルを使用して、bpV（phen）処置動物におけるL. major皮膚
注射後に起こる、初期炎症事象を研究した（第6図）。第6A図に示すように、L.
majorおよびLPS（陽性対照）は、注射後6時間に測定したとき、空気嚢滲出物
における有意な白血球リクルートメントを誘導することができた。興味深いこと
には、bpV（phen）処置BALB/Cマウスは、L. majorプロマスチゴート（10⁷寄生
生物／ml）嚢内注射に応答して、同一時間内で細胞の5倍大きいリクルートメン
トを発現した。

【００６６】 さらに、これらの細胞からのDiff−Quick染色シトスピン調製物について実施
した示差的計数（第6B図）が明らかに示すように、リクルートされた白血球の約
70％は好中球である（18％の好酸球および12％のマクロファージ）が、L. majo
rプロマスチゴートを注射された未処置動物において、リクルートされた細胞の
約48％は好中球であり、細胞集団の残部は好酸球（26％）およびマクロファージ
（26％）から成っていた。

【００６７】 このデータが明らかに示すように、bpV（phen）は初期炎症応答のすぐれたモ
ジュレーターであり、そしてL. major感染の進行に対する主要な衝撃を有する
ことができる。なぜなら、炎症細胞のリクルートメントの劇的増加の主要な原因
は、既にリーシュマニア病因を拘束する重要性について認識されている、好中球
にあるからである。 この実験に平行して、bpV（phen）処置マウスにおけるリーシュマニア誘導NO
のin vivo発生および炎症前メディエイターを空気嚢滲出物中で測定した（第7
図）。

【００６８】 このデータの組は、L. major感染に応答するその発生の増強により明らかに
されるように、bpV（phen）がきわめてすぐれたNOモジュレーターであるという
考えを強化する（第7A図）。このNO発生の増加はbpV（phen）処置動物において
観測される殺菌活性をさらに増加するばかりでなく、かつまたbpV（phen）処置
動物において観測される強い炎症応答の一部分説明した。なぜなら、NOは炎症の
重要なメディエイターおよび好中球移動のレギュレーターとして認識されている
からである（111、112）。

【００６９】 さらに、bpV（phen）処置は、L. majorプロマスチゴートを接種した動物の空
気嚢滲出物中で測定して、いくつかの炎症前サイトカイン（IL−6およびIL−1β
）およびケモカイン（MCP−1およびMIP−2）の増加を示した（第7B図）。MIP−2
は好中球の特異的化学誘引因子として認識されている（113）が、MCP−1は炎症
部位に対する強力な単球／マクロファージリクルート因子に示すことが示されて
いる。さらに、炎症前サイトカインIL−1βおよびIL−6は、MCP−1およびMIP−2
の発現調節（115）を包含する炎症の発生において重要な役割を演ずるよく知ら
れているケモカインモジュレーターである（114）。

【００７０】 2 − bpV（phen）処置動物の脾臓におけるIL−12、IL−2およびIFNγ mRNA 発現のアップレギュレーション 第8図に示すように、実験に使用されてないマウスの脾臓において、多プロー
ブRNアーゼプロテクションアッセイを使用してモニターした、in vivobpV（phe
n）誘導サイトカイン遺伝子は、PBSを注射した動物に比較して、24時間までに有
意にアップレギュレートされた（すなわち、IL−12、IL−10、IL−2およびIFNγ
）。我々の観測は、PTPインヒビターbpV（phen）が強力な免疫モジュレーターで
あり、NO発生をモジュレートして皮膚リーシュマニア症をコントロールすること
が認識されている、保護的Th1型サイトカインの活性化に好適であるという証拠
を提供する（116、117）。

【００７１】 さらに、サイトカインの調節に対するPTPの役割に関してほとんど知られてい
ないが、異なるシグナリング事象がサイトカイン遺伝子の調節に対するPTPの制
御下にあるか、あるいはないかを本発明の観測は明らかにした。全体的に、これ
らの最後の実験において、病原体リーシュマニアに応答していくつかの保護的炎
症および免疫学的機能をアップレギュレートし、そして哺乳動物における皮膚リ
ーシュマニア症の制限において重要な役割を演ずることができるpV化合物bpV（p
hen）の能力を明瞭に証明した。

【００７２】 3 − サイトカイン遺伝子発現に対するbpV（phen）の作用 種々の濃度のこのPTPインヒビターをB10Rマクロファージに4時間添加した。mR
NA発現をRNアーゼプロテクションアッセイにより測定した。RANTES、MIP−1α／
β、MIP−2、IP−10およびMCP−1ケモカインのmRNAレベルはbpV（phen）に応答
して増加した（第9A図）。MCP−1、MIP−2、MIP−1βおよびRANTESは投与量依存
的方法でbpV（phen）の添加により誘導されたが、IP−10およびMIP−1αは著し
く低い濃度（10μM）において発現された。こうして、10μMで使用したbpV（phe
n）はサイトカイン遺伝子発現の誘導に最も有効な投与量であるように思われる
。さらに、それらの発現はbpV（phen）処置により異なるようにモジュレートさ
れることを我々は認め、これにより異なる型のPTPは種々のケモカインの調節に
おいて特異的役割を演ずるに違いないことが示唆される。

【００７３】 pV化合物処置後のケモカイン発現の反応速度論を決定するために、B10Rマクロ
ファージを10μMのbpV（phen）と増加する時間間隔でインキュベートした。全RN
Aを種々の時点においてマクロファージから抽出し、RNアーゼプロテクションア
ッセイに付した。MIP−1α、MIP−2、IP−10、およびMCP−1ケモカインmRNAの一
時的誘導が存在し、4時間に最大レベルに到達し、その後急速に減少したが、MIP
−1βについて、最適な発現は処置後8時間に達成された。しかしながら、RANTES
mRNAの発現は時間依存的方法で24時間にわたって増加した（第9B図）。こうし
て、bpV（phen）に応答するケモカイン発現の誘導条件は異なるケモカインとと
もに変化するように思われる。

【００７４】 これらの結果が明瞭に示すように、bpV（phen）はあるケモカインに対して他
のケモカインよりも強い作用を有した。デンシトメトリー分析によるmRNA発現の
測定（データは示されていない）は、MIP−1β＞RANTES＞IP−10に比較してbpV
（phen）の存在下にMIP−2＞MIP−1α＞MCP−1のより大きい誘導を証明した。 bpV（phen）により宿主PTPのモジュレーションは、B10Rネズミマクロファージ
におけるRANTES、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、IP−10およびMCP−1サイトカイ
ン遺伝子発現の誘導において有効であることを我々は報告する。

【００７５】 しかしながら、その作用は各ケモカインに従い変化し、特異的ケモカインに対
するいっそう効力のある作用を示した。事実、RNアーゼプロテクションアッセイ
は、MIP−1β＞RANTES＞IP−10に比較してbpV（phen）の添加によりMIP−2＞MIP
−1α＞MCP−1のより大きい誘導を示した。こうして、我々の結果は、PTPを活性
化すると、ケモカイン産生に関係するシグナリングプロセスの重要な陰性レギュ
レーターとしてPTPを表示するように思われる。これは、PTPは多数の細胞のシグ
ナリング、例えば、B細胞レセプター（BCR）（118）およびエリトロポイエチン
レセプター（119）を陰性的に調節するという、いくつかの研究と一致する。

【００７６】 4 − リーシュマニアワクチン接種試験の関係におけるアジュバントとして
のbpV（phen）の使用 bpV（phen）のアジュバントの可能性を、リーシュマニア感染の関係においてi
n vivoで試験し、感染チャレンジに対する完全な保護を生じた。 過去において、ワクチン接種のために全および可溶性リーシュマニア抗原（SL
A）の使用は報告され、感染性チャレンジに対してある保護レベルを可能とした
（86）。ネズミモデルを使用して、SLA投与と組み合わせてbpV（phen）モジュレ
ートしたサイトカインおよびケモカイン発生（上に報告したように）がリーシュ
マニア感染に対する保護に導くことができるかどうかについて我々は試験した。
マウスにPBSおよびbpV（phen）を対照として、そして毎日のbpV（phen）注射（5
00nM、5日間）を使用するか、または使用しないSLA（100μg）を投与した。

【００７７】 2週後、すべてのグループに同様にそれらのそれぞれの処置を与えた。最後に
、ワクチン接種後4週に、すべての動物を感染性リーシュマニア（Leishmania）
（5×10⁶ L. major、右側の足に注射した）でチャレンジし、感染後4週にわた
って感染の進行を追跡した（第10図）。SLA＋bpV（phen）により仲介された保護
は成功した。なぜなら、有意な足の炎症および皮膚の病変の発生はすべての他の
実験グループに比較して観測されなかったからである。 本発明を好ましい態様により説明したが、本発明の精神および特質から逸脱し
ないで種々の変化および変更が特許請求の範囲内で可能である。

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よびLodish、H. F.（1995）。エリトロポイエチンレセプターに対するSH−PTP1
の特異的リクルートメントはJAK2の不活性化および増殖シグナルの停止。Cell
80：729−738。

【図面の簡単な説明】

【図１】 第1図は、ヒト静脈臍内皮細胞（HUVEC）の成長速度に対するbpV（phen）、bpV
（bipy）およびバナジン酸塩の濃度応答作用を図解する。

【図２】 第2A図および第2B図は、ヒヨコ胚の卵黄膜について血管化試験を使用するbpV
（phen）、オルトバナジン酸塩（Van）およびプロタミン（Prot）に対する抗血
管形成応答を示す。各点は最小15の胚（15〜28）を表す。第2A図において、N／
＋スコアリングシステムを使用して血管新生を評価した；抗血管形成を示す胚の
比率は投与量とともに増加し、bpV（phen）は最も効力のある因子であった。第2
B図において、1−2−3スコアリングシステムを使用して血管新生を評価した；血
管形成スコアは投与量とともに減少し、bpV（phen）は最も効力のある因子であ
った。

【図３】 第3図は、フィブリン中に埋め込まれた大動脈リングからの細胞移動の顕微鏡
写真である（×12）。試料対照（A）に比較して、細胞移動は種々の投与量のbpV
（phen）の存在下に障害された（1、3.5μM；B，C）3.5μM（C）において強い阻
害が存在した。bpV（pic）（3.5、10、25μM；D、E、F）の存在下に、阻害は10
〜25μMにおいて見られた。オルトバナジン酸塩の存在下に、25μM（G）におい
て部分的阻害に到達し、3.5μM（H）において作用は存在しなかった。bpV（pic
）の存在下の十分に定められた微小血管の移動は10μMにおいて明らかであるが
、対照試料において非常に細い細胞ストランドがしばしば観測された。

【図４】 第4図は、オルトバナジン酸塩（プレーンバー）；bpV（phen）（淡い灰色のバ
ー）；およびbpV（pic）（暗い灰色のバー）の存在下に大動脈リングからの細胞
移動の定量を示す。対照は空のバーとして表されている。平均および平均の標準
誤差が示されている。スチューデント−ニューマン−ケウルス（Student−Newma
n−Keuls）法を統計的解析のために使用した（p値＝0.001）。

【図５】 第5図は、皮下マトリゲル（s.c. Matrigel）アッセイにおいてbpV（phen）は
in vivo血管形成を阻害することを示す。実験結果を示すグラフは、各s.c. Ma
trigelプラグについて3つの顕微鏡視野において移動する細胞の数を表す。視野
はプラグのへりから等距離である。（1）Matrigelプラグの移植後に処置を受け
なかった、4匹のマウス。（2）移植後7日間10μgのbpV（phen）を毎日投与され
た、4匹のマウス。（3）移植後7日間50μgのbpV（phen）を毎日投与された、4匹
のマウス。（4）移植後7日間100μgのbpV（phen）を毎日投与された、4匹のマウ
ス。（5）移植後7日間PBSを毎日投与された、4匹のマウス。

【図６】 第6図は、リーシュマニア・メイジャー（L. major）プロマスチゴートの嚢内
注射に応答してbpV（phen）処置BALB/Cマウスの空気嚢滲出物の中にリクルート
された好中球、好酸球およびMφを示す。無エンドトキシンPBS、LPS（20μg／ml
）、L. majorおよびbpV（phen）（500nM i.p.、2時間）＋L. majorで接種後6
時間に注射した動物から、空気嚢を収集した。同様に実施した2回の実験の平均
±SD（n＝4マウス）を表す。リクルートされた特定の白血球集団について観測さ
れた差は、それらのそれぞれの対照を超えて有意であった（p＜0.01、スチュー
デントのt検定）。

【図７】 第7図は、pV処置マウスにおけるin vivoリーシュマニア（Leishmania）誘導
炎症前メディエイターの発生を示す。（A）無エンドトキシンPBS、L. majorお
よびbpV（phen）および引き続くL. majorの添加後6時間に収集した空気嚢滲出
物中の硝酸塩レベルを測定した。値は独立して実施した2回の実験の平均±SDで
ある。（B）前述したように収集した空気嚢滲出物の中に分泌した炎症前サイト
カイン（IL−6およびIL−1β）およびケモカイン（MCP−1およびMIP−2）を、下
においていっそう詳細に説明するようにELISAにより測定した。値は独立して実
施した2回の実験の平均±SDである。滲出物上清中で測定された炎症前分子のレ
ベルはL. major感染に応答して有意に増強され（p＜0.01、スチューデントのt
検定）、そしてさらにそれらのそれぞれの対照を超えてbpV（phen）により増加
された。IL−6、IL−1β、MCP−1およびMIP−2分泌は、L. major単独に比較し
てL. major感染させ、bpV（phen）処置した動物において、それぞれ、128、2、
8および68倍多かった。PBS対照はバックグラウンドに等しかった。

【図８】 第8図は、BALB/Cマウスの脾臓におけるin vivobpV（phen）誘導サイトカイン
遺伝子の発現を示す。BALB/Cマウスの脾臓において、bpV（phen）に対する応答
するTh1（IFN−γ、IL−2、IL−12）およびTh2（IL−4およびIL−10）サイトカ
インの発現を24時間にわたってモニターした。下においていっそう詳細に説明す
るように多プローブRNアーゼプロテクションアッセイを使用して、サイトカイン
遺伝子の発現をモニターした。得られた結果を独立して実施した3回の実験を表
す。

【図９】 第9図は、ネズミB10RマクロファージにおけるケモカインmRNA発現に対するbpV
（phen）の作用を示す。（A）種々の濃度のbpV（phen）（1〜50μM）の存在また
は非存在下に、細胞を2時間インキュベートした。全RNAを単離し、RNアーゼプロ
テクションにより分析した。（B）ネズミB10Rマクロファージにおけるケモカイ
ン遺伝子の反応速度論的発現。10μMのbpV（phen）の存在または非存在下に、細
胞を増加する時間（1γ4時間）の間インキュベートした。全RNAを抽出した後、R
Nアーゼプロテクションアッセイを実施した。遊離RNAプローブは最も左側のライ
ンに示されている。増加倍数をオートラジオグラムのデンシトメトリーから計算
した。

【図１０】 第10図は、リーシュマニアワクチン接種の試験においてアジュバントとしての
bpV（phen）の使用を示す。5日間bpV（phen）（500μM）を毎日注射するか、あ
るいはしないで可溶性リーシュマニア・メイジャー（Leishmania major）抗原
（SLA；100μg）をBalb／Cマウスに接種した。2週後、動物に第2組の上記処置を
与えた。対照動物にSLAを接種しないでPBSまたはbpV（phen）単独を与えた。ワ
クチン接種後4週に、右後足に注射した5×10⁶Leishmania major定常期プロマス
チゴートで動物とチャレンジした。毎週の基準で足の厚さをキャリパーで測定す
ることによって、感染の進行を追跡した。足の厚さの減少について測定した差は
、それらのそれぞれの対照を超えて有意であった（p＜0.01、スチューデントのt
検定、n＝5〜10匹の動物／グループ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ １２１ １２１ Ｃ０７Ｄ 213/22 Ｃ０７Ｄ 213/22 213/79 213/79 471/04 １１２ 471/04 １１２Ｔ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドワロン，シャルル カナダ国，ケベック ジー２エー ３エル ２，モントシャテル，リュ ドゥアメル， 13545 (72)発明者 バッティスティーニ，ブルーノ ジョセフ カナダ国，ケベック ジー７エー ４エッ クス９，サン−ニコラ，リュ フランソワ ーズ−ロランジェ，355 (72)発明者 オリビエ，マルタン カナダ国，ケベック ジー１ティー １ビ ー６，シレリー，ブールバール ローリ エ，2204 (72)発明者 ポスネル，バリー カナダ国，ケベック エイチ３ゼット １ ゼット２，ウエストマウント，ウッド ア ベニュ 360 Ｆターム(参考） 4C055 AA00 BA02 BA57 CA01 DA01 EA01 GA02 4C065 AA04 AA18 BB09 CC09 DD02 EE02 HH01 JJ01 KK01 LL01 PP01 4C086 AA01 AA02 BC19 CB09 GA08 HA28 ZA36 ZB11 ZC20 ZC75 (54)【発明の名称】 タンパク質チロシンホスファターゼインヒビター（ＰＴＰ）としてのペルオキソバナジウム化合 物、血管形成、再狭窄およびエンドセリン産生に対するそれらの阻害作用、並びに免疫応答に対 するそれらの刺激作用

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血管形成性病因成分を有する疾患を治療するための、下記一
   般式： 【化１】 （式中、 Tはバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル
   から成る群から選択される遷移金属であり、 Yは酸素またはヒドロキシルであり、 ZおよびZ'は酸素およびペルオキシドから独立して選択され、そして LまたはL'は1つの電子対を表すことができる任意の基である。） を有する化合物の使用。
2. 【請求項２】 血管形成性病因成分を有する疾患を治療するための薬剤の製
   造における請求項1に記載の式を有する化合物の使用。
3. 【請求項３】 タンパク質チロシンホスファターゼを阻害することによって
   血管形成性病因成分を有する疾患を治療するための請求項1に記載の式を有する
   化合物の使用。
4. 【請求項４】 タンパク質チロシンホスファターゼを阻害することによって
   血管形成性病因成分を有する疾患を治療するための薬剤の製造における請求項1
   に記載の式を有する化合物の使用。
5. 【請求項５】 エンドセリン産生を含む疾患を治療するための請求項1に記
   載の式を有する化合物の使用。
6. 【請求項６】 エンドセリン産生を含む疾患を治療するための薬剤の製造に
   おける請求項1に記載の式を有する化合物の使用。
7. 【請求項７】 血管形成後の再狭窄を予防するための請求項1に記載の式を
   有する化合物の使用。
8. 【請求項８】 血管形成後の再狭窄を予防するための薬剤の製造における請
   求項1に記載の式を有する化合物の使用。
9. 【請求項９】 炎症および炎症性分子の分泌のモジュレーターとしての請求
   項1に記載の式を有する化合物の使用。
10. 【請求項１０】 炎症および炎症性分子の分泌をモジュレートするための薬
    剤の製造における請求項1に記載の式を有する化合物の使用。
11. 【請求項１１】 保護的免疫応答の発生における重要性が認識されかつ免疫
    細胞の強いモジュレーターであることが認識されているサイトカインおよびケモ
    カインの活性化を誘導するための請求項1に記載の式を有する化合物の使用。
12. 【請求項１２】 保護的免疫応答の発生における重要性が認識されかつ免疫
    細胞の強いモジュレーターであることが認識されているサイトカインおよびケモ
    カインの活性化を誘導するための薬剤の製造における請求項1に記載の式を有す
    る化合物の使用。
13. 【請求項１３】 前記サイトカインがIL−12、IFN−γ、IL−1αまたはIL−
    1βであり、そして前記ケモカインがRANTES、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、IP
    −10またはMCP−1である、請求項11または12に記載の使用。
14. 【請求項１４】 アジュバントとしての請求項1に記載の式を有する化合物
    の使用。
15. 【請求項１５】 リーシュマニア寄生生物または他の病原体に対するワクチ
    ン接種の間におけるアジュバントとしての請求項1に記載の式を有する化合物の
    使用。
16. 【請求項１６】 Tがバナジウムである、請求項1〜15のいずれか一項に記載
    の使用。
17. 【請求項１７】 Yが酸素である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の使用
    。
18. 【請求項１８】 Zが酸素であり、そしてZ'がペルオキシドである、請求項1
    〜17のいずれか一項に記載の使用。
19. 【請求項１９】 ZおよびZ'がペルオキシドである、請求項1〜17のいずれか
    一項に記載の使用。
20. 【請求項２０】 LおよびL'がフェナントリンの窒素原子である、請求項1〜
    19のいずれか一項に記載の使用。
21. 【請求項２１】 LおよびL'がピコリン酸の窒素原子または酸素原子である
    、請求項1〜19のいずれか一項に記載の使用。
22. 【請求項２２】 LおよびL'がビピリジンの窒素原子である、請求項1〜19の
    いずれか一項に記載の使用。
23. 【請求項２３】 前記化合物が下記構造： 【化２】 を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
24. 【請求項２４】 前記化合物が下記構造： 【化３】 を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
25. 【請求項２５】 前記化合物が下記構造： 【化４】 を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。