JP2003506021A - リン酸化Ｍｅｔタンパク質と結合する抗体による悪性疾患の予後判定および治療 - Google Patents

リン酸化Ｍｅｔタンパク質と結合する抗体による悪性疾患の予後判定および治療

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Abstract

(57)【要約】 リン酸化Metタンパク質とは結合するが、非リン酸化Metタンパク質とは結合しない抗体、ならびにかかる抗体を分泌するハイブリドーマが提供される。該抗体はpMetの発現が関予する悪性疾患の予後判定薬剤として有用であり、かかる疾患を有する個体において、転移性疾患を有するまたは発症する確率を求め、かつ、個体の生存見込みを求める方法に使用される。さらに、２つの新規な定量的予後指数(DeおよびDI)に基づく、Metの発現が関与する悪性疾患を有する個体の正確な予後判定を提供することを可能とする新規な方法が提供される。また本発明の抗体はMetの発現が関与する種々の疾患の治療に好適であり、かかる悪性疾患の治療のためにこれら抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は新規なモノクローナル抗体(mAbs)、mAbsを産生するハイブリドーマ、
モノクローナル抗体が結合する抗原のペプチド配列、悪性疾患の予後判定および
治療のための該モノクローナル抗体の使用、および悪性疾患の予後のための新規
な予後判定方法に関する。
【０００２】
【先行技術】
以下は本発明の背景をよりよく理解するものと思われる参照文献の一覧である
。
【０００３】
【参照文献】
【０００４】
【発明の背景】
Metプロトオンコジーンは、チロシンキナーゼ成長因子受容体ファミリーのメ
ンバーであるMetタンパク質および肝細胞増殖因子／スキャター因子(HGF/SF)真
受容体をコードする(Bottaro, D.P. et al., 1991)。MetおよびHGF/SFは乳癌に
関わっていることが示されているが、良性組織に比べた場合の乳癌におけるMet
の発現に関しては矛盾した報告がある。ある場合には、Metは正常な乳管では発
現・活性化されるが、ある乳癌では減少したことが示されている(Tsarfaty, I.)
。またあるものは、癌および良性疾患乳房組織間のMet発現の差が報告されてい
るが、予後とは関連づけられていない(Nagy, J., 1995)。乳癌におけるMetの過
剰発現および乳癌におけるMetとHGF/SFの同時発現もまた報告されている(Jin, L
. et al., 1993)。
【０００５】 Metタンパク質は乳癌の予後因子として提案されており(Ghoussoub, R.A.D. et
al., 1998およびBeviglia, L., 1997)、高レベルのHGF/SFがヒト乳癌の再発お
よび生存率の低下の予測因子であることが示されている(Yamashita, J., 1993)
。
【０００６】 Met受容体は、そのHGF/SFリガンドげ結合するとリン酸化される。リン酸化さ
れたMet(pMet)は細胞の増殖および移動を誘導する特異的シグナル伝達カスケー
ドを誘起し、転移に関わっていることが示されている(Vande Woude, 1997)。Met
シグナル伝達の生物学的作用はヒトMet結合部位における特異的チロシンのリン
酸化に依存していることが示されている(Ponzetto, 1994)。
【０００７】
【発明の概説】
本発明では、明示的に記載され、計算でき、あるいは測定できる２つの変数は
、これら２つの変数が互いに比例する場合は互いに同等であるとみなす。
【０００８】 本発明によれば、リン酸化Metタンパク質(pMet)は種々の転移癌の予後因子と
して、好ましくは乳癌の予後に有用であり得ることが分かった。このようにして
、リン酸化Met受容体(以下、「pMet」)とは結合するが、非リン酸化Met受容体(
以下、「Met」)とは結合しないモノクローナル抗体が開発された。
【０００９】 本発明によれば、抗pMet mAbsとヒト乳腺癌生検標本の悪性領域との結合レベ
ルと、同mAbsと同供試標本の非悪性領域との結合レベルを比較することで、生検
を採った個体に対する正確な予後判定をなすことができることが分かった。
【００１０】 このように本発明は、第１の態様により、リン酸化Metペプチドとは結合する
が、非リン酸化Metペプチドとは結合しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ株化細胞を提供する。かかるmAbsは以下、「抗pMet mAbs」と呼ぶ。
【００１１】 さらに、かかる疾患の予後判定のためには、抗pMet抗体がリン酸化型のMet結
合部位と結合するようなものであることが好ましいことが分かった。
【００１２】 このように本発明の本態様の好ましい実施形態によれば、Met結合部位に存在
する1以上のリン酸化チロシンと結合する抗pMet mAbsを産生するハイブリドーマ
株化細胞が提供される。
【００１３】 ヒトMet結合部位における主要なチロシンリン酸化部位はTyr1356である。最も
好ましくは、Met結合部位のリン酸化チロシンY1356と結合するmAbsを産生するハ
イブリドーマが提供される。
【００１４】 本発明のハイブリドーマ株化細胞の例としては、2000年4月12日にCentre for
Applied Microbiology and Research (CAMR), European Collection of Cell Cu
ltures (ECACC) 受託機関に受託番号00041122として寄託された、ハイブリドー
マ株化細胞がある。
【００１５】 本発明のさらなる態様によれば、上記のハイブリドーマ株化細胞によって産生
されたmAbsが提供される。かかるmAbsは、 (a) pMetとは結合するが、Metとは結合しないmAbs； (b) 完全抗体の抗原結合特性を実質的に保持する(a)の抗体のフラグメント；
および (c) 上記(a)および(b)の抗体のいずれか１つが結合する抗原エピトープと結
合する抗体 からなる群より選択される。
【００１６】 １つの実施形態によれば、本発明のmAbsはpMet結合部位と結合するもの、完全
抗体の抗原結合特性を実質的に保持するかかる抗体のフラグメント、およびかか
る抗体またはそれらのフラグメントが結合する抗原エピトープと結合する抗体で
ある。
【００１７】 好ましい実施形態によれば、本発明のmAbsはMetの１以上の自己リン酸化部位
と結合するもの、完全抗体の抗原結合特性を実質的に保持するこれら抗体のフラ
グメント、ならびにかかる抗体およびそれらのフラグメントが結合する抗原エピ
トープと結合し得る抗体である。
【００１８】 最も好ましくは、Metの主要なチロシンリン酸化部位であるTyr1356と結合する
mAbs、完全抗体の抗原結合特性を実質的に保持するこれら抗体のフラグメント、
ならびにかかる抗体およびそれらのフラグメントが結合する抗原エピトープと結
合する抗体である。
【００１９】 本発明によれば、抗pMet mAbsは、Metの発現が関与する種々の疾患の予後判定
、好ましくは乳癌の予後判定に使用できることも分かった。抗pMet mAbsはこの
目的のため、in vitro、en vivoまたはin vivoで用いてよい。従ってin vivo (i
n situ)予後判定に関しては、本発明は、そのさらなる態様の１つにより、上記
１以上のmAbsを好適な担体とともに含んでなる予後判定用組成物を提供する。
【００２０】 本発明のさらなる態様によれば、抗pMet mAbsはMetの発現が関与する種々の疾
患の治療、好ましくは乳癌の治療に有用であり得る。Mabsは例えば腫瘍細胞での
Met受容体レベルの発現または活性の一部の活性化を阻害する、またはダウンレ
ギュレートするための個体に投与してもよい。本発明のmAbsを含んでなる組成物
は種々の悪性疾患、特に乳癌の治療に使用することができる。このように本発明
のさらなる態様によれば、有効成分として有効量の本発明の１以上のmAbsを医薬
上許容される担体とともに含んでなる医薬組成物が提供される。
【００２１】 「有効量」とは、mAbsの量、すなわちそれを必要とする個体に投与した場合に
、疾患に関連した症状の軽減、および／または疾患の次の段階への進展の阻害も
しくは予防、例えば転移の阻害または予防がもたらされるmAbsの量である。Mabs
の有効量は疾患のタイプ、疾患の段階、治療する個体の生理学的パラメーター、
mAbsの性質などのようないくつかのパラメーターによって異なり、当業者により
決定することができる。
【００２２】 治療上有効量の本発明のmAbsをそれを必要とする個体に投与することを含んで
なるかかる疾患の治療方法も本発明の範囲内にある。
【００２３】 さらに、Metの発現が関与する疾患、特に乳癌の予後判定に用いられるキット
もまた本発明の範囲内にあり、該キットは抗pMet mAbs、該mAbsと該サンプルと
の結合レベルを求めるのに必要な試薬、供試サンプルについて計算した値と比較
する所定の限界値(下記を参照)、および使用説明書を含んでなる。
【００２４】 さらに本発明によれば、Metリン酸化部位Tyr1356に相当するホスホチロシンペ
プチドである本発明のmAbsの抗原が合成される。このように本発明のさらなる実
施形態によれば、 (a) アミノ酸(a.a)配列：配列番号1のVal His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn
Val Lys Cysを有するペプチド； (b) 上記(a)のペプチドと少なくとも85%の同一性を有するペプチド；および (c) 上記(a)または(b)のペプチドを含んでなるタンパク質またはペプチド からなる群より選択されるペプチドが提供される。
【００２５】 アミノ酸(aa)を表すために上記(および下記)で用いられている文字はIUPAC-IU
B Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨されている１文字アミノ
酸記号に従うものである。
【００２６】 「少なくともX%の同一性を有する」とは、配列を最適に並べた場合の、比較さ
れる２配列において同一なアミノ酸残基の割合(%)をいう。従って85%のアミノ酸
同一性とは最適に並べた２以上のポリペプチド配列中のアミノ酸の85%が同一で
あることを意味する。
【００２７】 本発明のペプチドは例えば、その後に上記および下記のように用い得る抗体を
誘起するのに使用できる。本発明のペプチドを含んでなる組成物は、Metの発現
が関与する種々の疾患の治療に有用であり得る。このように、本発明はさらに、
有効成分として有効量(上記で本発明のmAbsに関して定義された通り)の本発明の
ペプチドを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２８】 さらに本発明は、本発明のペプチドと結合するAbs、および本発明のペプチド
と結合するmAbsを産生するハイブリドーマ株化細胞を提供する。
【００２９】 上記ペプチドのアミノ酸配列のいずれかをコードするDNA配列も、本発明の範
囲内に包含される。さらに、かかる１以上のDNA配列でトランスフェクトされた
細胞も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】 「悪性領域」とは、本発明によれば、悪性細胞が明らかに筋肉や周辺の結合組
織へ侵入しているが、未だ原発腫瘍実質内に留まっているサンプル中の領域と定
義される。非悪性領域とは、悪性組織に隣接しているがまだ含まれていないと思
われる、サンプル中の全組織構造と定義される。
【００３１】 さらに本発明によれば、抗pMet mAbsとサンプルの悪性領域との結合レベルが
、同mAbsと同サンプル中の非悪性領域との結合レベルよりも高い場合、そのサン
プルを採取した個体において転移性疾患を発症する高い危険性、ならびに同個体
の生存率が低いということが分かった。抗pMet mAbsとサンプルの悪性領域およ
び非悪性領域との結合レベルが同じ場合、または悪性領域中の抗pMet mAbsの結
合レベルが非悪性領域におけるものより低い場合には、供試個体の予後判定は陽
性となる。
【００３２】 このように本発明のさらなる態様によれば、原発癌を有する個体において、転
移性疾患を有するもしくは発症する確率を求め、かつ、その個体の生存見込みを
求める方法が提供され、該方法は (a) 供試個体からサンプルを採取し(該サンプルは悪性領域と非悪性領域を含
む)； (b) サンプルにおいて１以上の悪性領域と１以上の非悪性領域を識別し； (c) サンプルの１以上の悪性領域と、本発明の１以上の抗pMet mAbsとを、mA
bsとサンプルとの結合が可能な条件下で接触させ； (d) サンプルの１以上の非悪性領域と、１以上の抗pMet mAbsとを、mAbsとサ
ンプルとの結合が可能な条件下で接触させ； (e) 上記(c)と(d)におけるmAbsの結合の程度を比較し、上記(d)と比べて上記
(c)の結合レベルが実質的に高ければ、転移性疾患を有するまたは発症する高い
危険性、および該供試個体の生存率が低いことを示すことを含んでなる。
【００３３】 好ましい実施形態によれば、上記の方法は転移性疾患を有するまたは発症する
確率を求め、かつ、原発乳癌を有する個体の生存見込みを求める方法が提供され
る。
【００３４】 個体予後の評価を提供するために供試個体から採取したサンプルの２つの部分
における特定のタンパク質の発現レベルを比較することに基づく先行技術の方法
のほとんどは、定性的または「半定量的」結果(2+、3+、+/−などを用いる)を基
にしたものである。本発明のもう１つの態様によれば、新規な定量的予後指数(D
eおよびDI)が開発された。DIは供試サンプルの悪性領域と非悪性領域間の本発明
の抗体の染色強度の差および比率の双方から導いたものであり、一方、DEは評価
した画像の２領域間のエントロピー(e)レベルにおける発散を考慮したものであ
る。さらに、これらの新規な指数をもとに、Metの発現および／または活性化が
関与する原発癌を有する個体、好ましくは原発乳癌を有する個体に関する正確な
予後判定を提供し得る新規な方法が開発された。形態学的パラメーター、共焦レ
ーザー操作顕微鏡法(CLSM)、免疫蛍光(IF)解析およびDeまたはDI指数計算値を用
いるデジタル画像解析と組合せた本発明の方法を用いれば、サンプル中の選択領
域におけるpMet発現レベルの比率が定量的予後指数の形で表される。
【００３５】 また、本発明の新規な方法によれば、DeまたはDI指数の分布に基づいて乳癌患
者が以下の３つの群：悪性組織のpMetが隣接する非悪性組織のものより高い多様
性を持つか、またはそれより高いレベルである(N<T)ことを示す大きな負のDeま
たはDI指数を有する第１群、大きな正のDeまたはDI指数が非悪組織のpMetが悪性
組織のものよりも高い多様性を持つか、またはそれより高いレベルである(N>T)
ことを示す第２群、および両領域のpMetの多様性またはレベルが同等である(N≒
T)第３群に分けられることが分かった。本発明によれば、DeまたはDI指数分布群
はサンプルが採取された個体の予後と相関していることが分かった。ある供試個
体が属す予後群を決定するには、上・下限界値の２つの限界値が予め決定される
。供試サンプルのDeまたはDI指数は上記および下記のように計算し、次ぎにその
値を所定の限界値と比較して分析する。限界値は特異的なパラメーターセット(
例えば、免疫蛍光IF解析に用いられたAbsの種類)に関して、また限界値が一定で
あり、供試サンプルのDeまたはDI指数計算値と比較するのに用いることができる
これらのパラメーターに関して決定される。予後が最もよくないのは、Deまたは
DI指数計算値が下限界値よりも低い場合である。次ぎに供試個体が転移性疾患を
有するまたは発症する確率が最も高ければ生存見込みは低い。DeまたはDI指数計
算値が所定の上限界値より高ければ、供試個体が転移性疾患を有するまたは発症
する確率は低くなり(「中程度の」予後)、DeまたはDI指数計算値が所定の下限界
値よりも高く、所定の上限界値よりも低ければ、供試個体が転移性疾患を有する
または発症する確率は最低となり、かつ、生存見込みが良くなる(「より良い」
予後)。
【００３６】 このように本発明のもう１つの態様によれば、Metの発現および／または活性
が関与する原発癌を有する個体において、転移性疾患を有するまたは発症する確
率を求め、かつ、その個体の生存見込みを求める方法が提供され、該方法は (a) 該個体からサンプルを採取し(該サンプルは少なくとも１つの悪性領域と
少なくとも１つの正常領域を含む)； (b) 該サンプルにおいて１以上の悪性領域と１以上の非悪性領域を識別し； (c) 該サンプル中の１以上の悪性組織を所定数N個の部分領域に分け(各部分
領域は同一の所定面積aを有する)； (d) 該サンプル中の１以上の非悪性組織を所定数M個の部分領域に分け(各部
分領域は同一の所定面積aを有する)； (e) 該サンプルと抗pMet mAbsとを、該抗pMet mAbsと該NおよびM領域に存在
するいずれかのpMetとの結合が可能な条件下で接触させ； (f) 該サンプル中のN領域の悪性組織の各々、および該サンプル中のM領域の
非悪性組織の各々における少なくとも１つの抗pMet抗体の結合程度を求め、該N
およびM領域の各々１つの各画素における抗pMet抗体の結合程度が第１の整数L1
および第２の整数L2の間であり； (g) L1およびL2の間の各整数iにおいて、 (ga) tpi(ROIにおける)を抗pMet抗体の結合程度がiに等しい悪性領域の画
素数と定義し； (gb) npiを抗pMet抗体の結合程度がiに等しい非悪性領域の数と定義し； (h) 第１の下の限界値と第２の上の限界値を求め； (i) 代数方程式： De＝fen−fet ただし、
【数７】 なお、すべての場合、iはL1≦I≦L2
【数８】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2)
【数９】 に従って予後値Deを計算する {ここで、De指数が該下限界値より低ければ、該個体が転移性疾患を有するまた
は発症する可能性が高いこと、および生存見込みが低いことを示し、De指数が所
定の上限界値より高ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症する確
率が中程度であって、よりよい生存見込みを示し、また、De指数が該下限界値よ
り高く、該上限界値より低ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症
する確率が低く、良好な生存見込みを示す} ことを含んでなる。
【００３７】 このように、本発明のもう１つの態様によれば、pMetの発現レベルが関与する
疾患を有する個体において、転移性疾患を有するまたは発症する確率を求め、か
つ、その個体の生存見込みを求める方法が提供され、該方法は (a) 該個体からサンプルを採取し(該サンプルは少なくとも１つの悪性領域と
少なくとも１つの正常領域を含む)； (b) 該サンプルにおいて１以上の悪性領域と１以上の非悪性領域を識別し； (c) 該サンプル中の１以上の悪性組織を所定数N個の部分領域に分け(各部分
領域は同一の所定面積aを有する)； (d) 該サンプル中の１以上の非悪性組織を所定数M個の部分領域に分け(各部
分領域は同一の所定面積aを有する)； (e) 該サンプルと、請求項５ないし７のいずれか１項に記載の抗pMet mAbsと
を、該抗pMet mAbsと該NおよびM領域に存在するいずれかのpMetとの結合が可能
な条件下で接触させ； (f) 該サンプル中のN領域の悪性組織の各々、および該サンプル中のM領域の
非悪性組織の各々における少なくとも１つの抗pMet抗体の結合程度を求め(なお
、該NおよびM領域の各々１つの各画素における抗pMet抗体の結合程度が第１の整
数L1および第２の整数L2の間である)； (g) L1およびL2の間の各整数iにおいて、 (ga) tpi(ROIにおける)を抗pMet抗体の結合程度がiに等しい悪性領域の画
素数と定義し； (gb) npiを抗pMet抗体の結合程度がiに等しい非悪性領域の数と定義し； (h) 第１の下限界値と第２の上限界値を求め； (i) 代数方程式： DI＝Dn−Dt ただし、
【数１０】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2)
【数１１】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2)
【数１２】 に従って予後値Deを計算する {ここで、DI指数が該下限界値より低ければ、該個体が転移性疾患を有するまた
は発症する可能性が高いこと、および生存見込みが低いことを示し、DI指数が所
定の上限界値より高ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症する確
率が中程度であって、よりよい生存見込みを示し、また、DI指数が該下限界値よ
り高く、該上限界値より低ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症
する確率が低く、良好な生存見込みを示す} ことを含んでなる。
【００３８】 好ましい実施形態によれば、原発乳癌を有する個体の転移性疾患を有するまた
は発症する確率を求め、かつ、生存見込みを求めるための上記方法が提供される
。
【００３９】 上記の他、本発明によれば、癌患者、好ましくは乳癌患者から採取した供試サ
ンプルの悪性領域および非悪性領域各々のpMetタンパク質とMetタンパク質のレ
ベル間の比がまた、該個体の予後値を有することが分かった。このように本発明
によれば、サンプルの悪性領域および非悪性領域各々において抗pMet/抗Met比を
求め、上記比の最終比を求める。測定したMetレベルとpMet De指数計算値の比を
もとに予後因子も計算できる。
【００４０】 新規なDeまたはDI指数の計算に基づく本発明の上記方法は主として乳癌患者か
ら採取したサンプル中のMetのレベルおよび／または活性化に関して記載される
が、本発明に従い、それは隣接する非悪性組織と比べて悪性組織中の検出可能な
タンパク質の異なる発現が関与する他の悪性疾患の予後判定に利用してもよい。
供試個体から採取したサンプルの悪性領域と非悪性領域とで関連するタンパク質
の発現レベルを求め、指数を上記のようにして計算し、指数計算値に基づいて予
後判定が提供され得る。
【００４１】
【発明の詳細な記述】
本発明の第１の態様によれば、リン酸化Metと結合するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマが提供される。「リン酸化Met」とは、少なくとも１つ
のチロシンがリン酸化されているmetタンパク質のいずれもをさす。典型的には
ヒトMet中のリン酸化チロシンとしては、Met結合部位にある３つのチロシン1349
、1356および1365がある。かかるハイブリドーマは当技術分野で公知のいずれの
方法によって製造してもよい(例えば、Kohler, G., and Millstein, C., Nature
, 256:495-497 (1975))。典型的には本発明によれば、その免疫原性を高めるペ
プチド(例えばKLH)と結合した、少なくとも１つのMetリン酸化部位、好ましくは
Tyr1356を含んでなるホスホチロシンペプチドを動物、典型的にはマウスに繰り
返し注射する。次ぎに免疫マウスから回収した血清を、ELISA、ウエスタンブロ
ッティング(WB)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫沈降法(IP)などのような当
技術分野で公知の方法のいずれか１つを用いて抗pMetスクリーニングする。スク
リーニングに関しては、マウスの免疫化に用いたペプチドをpMetタンパク質また
はpMetタンパク質を含む細胞および組織と同様に用いればよい。
【００４２】 次ぎにハイブリドーマ株化細胞を、免疫動物、典型的にはマウスの、高力価の
抗pMet抗体を有する脾臓細胞とメラノーマ細胞とを融合させ、上記のように再び
ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって製造される。一般に本発
明のmAbsを分泌する不死化株化細胞はまた、EBV形質転換、抗体結合部位をーど
するDNA構築物による適当な株化細胞のトランスフェクションなどのようなそれ
自体公知のさらなる手段によって得てもよい。
【００４３】 本発明はまた、pMetに特異的に結合する抗体も提供する。本発明のmAbsは上記
Met結合部位の３つのチロシンリン酸化部位である、Tyr1349、Tyr1356またはTyr 1365 の１つと結合することが好ましい。「抗体」とは、クラスIgG、IgM、IgD、I
gAおよびIgEのいずれかの抗体をさす。典型的には本発明の抗体は上記のように
ハイブリドーマ株化細胞によって作製されるが、当業者に十分公知の組換え遺伝
子法によって作製してもよい。抗体は動物由来、典型的にはマウス由来のもの、
ならびにキメラ抗体、「ヒト化抗体」などであってもよい。
【００４４】 本発明の抗体が組換え法によって作製される場合、抗体類似体も本発明の１つ
の態様をなす。本発明の範囲内にある抗体類似体は、本発明のmAbsの、本発明の
ペプチドまたはpMetを発現する細胞もしくは組織に対するAg結合特性を実質的に
保持するものである。「実質的に保持する」とは、同じペプチドに対する完全抗
体の結合と統計的に有意な差がない、上記および下記の方法のいずれかによって
求められるpMet類似体の結合を意味するものと理解すべきである。
【００４５】 抗pMet mAbsとサンプルの各領域との結合レベルは免疫組織化学、FACS解析、E
LISA、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ウエスタンブロッティング(WB)などのよう
な当技術分野で公知の方法のいずれか１つによって測定される。しかしながら本
発明の好ましい実施形態によれば、抗pMet mAbsとサンプルの領域との結合レベ
ルは共焦レーザー走査顕微鏡法(CLSM)および抗pMet抗体で免疫染色したサンプル
のコンピューター画像解析を用いて測定する。抗pMet mAbsとサンプルの種々の
領域との相対的結合レベルは、例えばパーセンテージ陽性領域(PPA)画像解析法(
Tsarfaty, I. et al., Science, 257:1258-1261, 1992)のような当技術分野で公
知の方法を用いて比較すればよい。抗体と種々の領域との結合間の差の統計的有
意性はマイクロソフト・エクセル(Microsoft, Redmond, WA)のスチューデントの
t検定など、当技術分野で公知の統計方法のいずれかによって計算すればよい。
【００４６】 本発明のmAbsと、供試個体から採取したサンプル中の悪性領域との結合は、mA
bsの結合の差が、これとともに記載される実験法によって得られる結果とともに
用いる、当技術分野で公知の統計的方法のいずれか(例えば、スチューデントのt
検定)によって求められた統計的に有意な差であるときには、同サンプルの非悪
性領域とのその結合とは「統計的に異なる」とみなされる。
【００４７】 本発明のモノクローナル抗体はまた、放射活性基、蛍光基、検出可能な生成物
を生成する反応を触媒し得る酵素、アビジンによって検出できるビオチン基など
のような種々の検出可能な薬剤で標識してもよい。抗体の標識は当技術分野で公
知の方法のいずれかによって行ってよい。
【００４８】 当業者には明らかであろうが、本発明の抗体またはペプチドのアミノ酸配列は
、例えば１以上のアミノ酸の付加、欠失、または保存的もしくは非保存的置換に
より改変してもよい。
【００４９】 「保存的置換」とは、あるクラスのアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による
置換をいい、ここでクラスは去通の物理化学的アミノ酸側鎖特性、および標準Da
yhoffフレケンシー・エクスチェンジ・マトリックスまたはBLOSUMマトリックス
によって求められる、天然に見られる相同タンパク質における高い置換頻度によ
って定義される。〔一般に６つのクラスのアミノ酸側鎖が同定されており、クラ
スI(Cys)；クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；クラスIII(Asn、Asp、Gln、Gl
u)；クラスIV(His、Arg、Lys)；クラスV(Ile、Leu、Val、Met)；およびクラスVI
(Phe、Tyr、Trp)が挙げられる。〕例えば、AspとAsn、GlnまたはGluなどの他の
クラスIIの残基との置換は保存的置換である。「非保存的置換」とは、あるクラ
スのアミノ酸と別のクラスのアミノ酸の置換、例えばクラスIIの残基のAlaと、A
sp、Asn、GluまたはGlnなどのクラスIIIの残基との置換をさす。
【００５０】 完全抗体の抗体結合特性を実質的に保持する本発明の抗体フラグメントもまた
本発明の範囲内にある。かかるフラグメントとしては、Fcタンパク質を欠いた抗
体、一本鎖抗体、実質的に抗体の可変抗原結合ドメインのみからなるフラグメン
ト、FabまたはF(ab)2フラグメントなどが挙げられる。抗体またはそのフラグメ
ントの抗原性は、上記のようにその抗体またはフラグメントとpMetペプチドまた
はそのペプチドを含む細胞もしくは組織との結合を、同Abまたはフラグメントと
非リン酸化Metタンパク質またはそれを含む細胞もしくは組織との結合と比較し
て試験することで調べられる。
【００５１】 本発明の抗体および類似体はまた化学修飾してもよい。「化学修飾」とは、そ
のアミノ酸残基の少なくとも１つが、プロセッシングまたは他の転写後修飾など
の天然のプロセスによるか、あるいは当技術分野で十分公知の化学修飾技術によ
って修飾されるタンパク質を意味する。多数の公知の修飾としては、限定される
ものではないが、典型的にはアセチル化、アシル化、アミド化、ADP-リボシル化
、グリコシル化、GPIアンカー形成、液体もしくは脂質誘導体の共有結合、メチ
ル化、ミリスチル化、PEG化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、または同
様の方法のいずれかが挙げられる。
【００５２】 本発明のmAbsはin vitro(ex vivo)ならびにin vivo双方における原発乳癌を有
する個体の予後判定剤として使用できる。Mabsのin vitro使用は上記され、また
実施例で記載される。一般にmAbsは生検標本、組織、細胞または細胞を含む体液
である供試個体から採取したサンプルと接触させ、抗体とサンプルとの結合レベ
ルを当技術分野で公知の方法の１つを用いて求める。MAbsがin situにおける予
後判定に用いられる場合、mAbsは検出可能なマーカー(例えば放射性マーカー)に
結合して、体内でそれらを検出できるような方法で個体に投与する。この目的の
ためには抗体は本発明の少なくとも１つのmAbsを好適な担体とともに含んでなる
組成物内で投与される。担体は典型的には当技術分野で公知の生理学上許容され
るバッファーのいずれか１種(例えばPBS)のような可溶性担体、または例えばラ
テックスビーズのような固相担体である。
【００５３】 本発明のさらなる治療的態様によれば、有効成分として本発明の１以上のmAbs
を好適な担体とともに含んでなる医薬組成物もまた使用できる。担体は上記のよ
うなものなど、当技術分野で公知の担体のいずれか１種であってよい。治療上有
効量の本発明のmAbsをそれを必要とする個体に投与することによる原発乳癌の治
療も本発明の範囲内にある。治療上有効な量とは悪性疾患の症状を緩和、症状を
軽減、またはそれらを完全に消失させ得る量である。治療上有効量はある場合に
は原発乳癌患者の転移性疾患の発症を予防し、またある場合には転移病巣の数ま
たはそれらの大きさを減じるものであり得る。
【００５４】 本発明の予後判定用および治療用の組成物は典型的には、非経口投与、例えば
静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)または筋肉内(i.m.)の手段によりそれを必要とする
個体に投与される。
【００５５】 本発明によればリン酸化Metペプチドは、もっと長いタンパク質の酵素消化ま
たは化学消化によって得られる。さらに、それらはpMetを含む細胞または組織か
ら抽出してもよい。さらにリン酸化pMetペプチドはまた、例えばペプチドシンセ
サイザーを用いて固相ペプチド合成(F-moc法)のような当技術分野で公知の方法
によって合成してもよい。得られたペプチドはRP-HPLCによるなど、当技術分野
で公知の方法によって分離する。
【００５６】 本発明はまた、本発明のmAbsを用いて上記の方法を実施するためのキット、例
えば予後判定アッセイキットを提供する。１つの実施形態によれば、予後判定キ
ットは通常、１以上の容器中の１以上の上記mAbs、mAbの特異的結合パートナー
のコンジュゲート、検出可能なシグナルを生じ得る標識、およびその使用に関す
る説明書を含む。標識は予めモノクローナル抗体と結合させてもよいし、あるい
は標識は、次ぎにmAbと特異的に結合する担体分子と結合させてもよい。キット
はまた供試サンプルのDe指数計算値と比較するための上・下De指数値を含む。ま
た、キットの使用説明書も含まれる。
【００５７】 これまでのところ乳癌の予後は典型的にはいくつかの因子によって決定される
が、最も重要なものとしてはリンパ節の関わりである。しかし、リンパ節の関わ
り見られないことに基づいて同じ予後を持つ患者の10%から30%の間で乳癌が再発
する。従って、リスクがある患者、および補助的治療から利益を得た患者を識別
する臨床試験が大いに必要とされる。さらに、原発乳癌を有する個体における転
移性腫瘍の存在の早期診断はかかる個体の治療法を決定する上で重要となる。現
状では転移性腫瘍の存在は後期で検出される場合が非常に多い。
【００５８】 本発明によれば、定量的予後DeまたはDI指数を計算するための新規な方法が開
発された。これらの指数をもとに、原発乳癌患者の正確な予後判定が提供でき、
すなわち患者が転移性疾患を有するまたは発症する確率ならびに供試個体の生存
見込みを比較的正確に求めることができる。本発明の方法によれば、サンプルは
供試個体から採取し、典型的には個体の腫瘍領域から採った生検である。典型的
には本発明による評価はスライドガラス上で標本にした生検のパラフィン切片で
行うものであるが、本発明によればまた、サンプルはMetタンパク質を発現する
組織、細胞または細胞を含む体液から調製したサンプルであってもよい。
【００５９】 「原発乳癌患者」とは、乳癌腫瘍が検出される個体と理解すべきである。この
個体は典型的には治療的手術、放射線治療、補助的治療などである初期治療処置
を受けたものである。片側に原発乳癌を有する患者はもう一方には原発癌は持っ
ていなかった。これらの患者はリンパ節陽性(すなわち腫瘍の原位置から離れた
リンパ節で悪性細胞が検出される)かリンパ節陰性のいずれかである。
【００６０】 「予後」は転移性疾患を有するまたは発症する確率、ならびに生存見込みの２
つの因子の組合せに関するものである。「転移性疾患」は個体中の原発乳癌の位
置以外のいずれかの位置に悪性細胞が存在することに関する。生存見込みは個体
における原発癌の検出と死の間の中央予測値に関する。
【００６１】 本発明の方法によれば、DeまたはDI指数は抗pMet mAbsと、供試個体から採取
したサンプルの悪性領域および非悪性領域との結合に基づいて計算される。上記
および下記で説明されるようにDeまたはDI指数の種々の組合せに基づいて２つの
限界値が予め決定される。これら所定の値は特定のパラメーターセットに関して
は一定である。単に一例であるが、Log-RankおよびWilcoxon P値、さらに以下に
記載される統計的方法に基づき、抗Met Absを用いて、DeおよびDIの下限界値が
それぞれ-60および-13であると決定され、DeおよびDI指数の上限界値がそれぞれ
90および10であると決定された。このような場合、-60より低いDe指数、または-
13より低いDI指数を有する患者の予後は悪く、90より高いDe指数、または10より
高いDI指数を有する患者は中程度の予後を示し、-60から90の間のDe、または-13
から10の間のDI指数を有する患者は最も良好な予後を示す。これらの計算限界値
は抗pMet Absを用いた場合、または他のいずれかのパラメーター(結合の検出方
法など)を変化させた場合には、明らかに異なってくる。
【００６２】 本発明の方法はリンパ節の関わりが見られない患者、ならびにその関わりが診
断された患者の双方に有用である。患者の予後を知ることは、転移性疾患の発症
を予防する上で、またはもう一方では良好な予後を示す患者では強烈で有害な化
学療法を避ける上で、どの治療計画が最も有望であるか決定する実質的な助けと
なる。予後判定は例えば患者をどの方法によって試験すべきかなどを見積もる助
けとなる。
【００６３】 DeまたはDI予後指数の計算に基づく本発明の方法はまた、非悪性組織に比べて
悪性組織においては腫瘍会合タンパク質の異なる発現を伴うその他の悪性疾患の
予後判定にも有用であり得る。さらに、この方法はまた、個体の種々の組織また
は組織部分において特定のタンパク質の発現に差があるその他のタイプの障害お
よび疾患の予後判定にも使用できる。
【００６４】
【実施例】
以下、添付の図面をしばしば参照しながら実施例を挙げて本発明の種々の態様
を説明するが、これらの実施例に限定するものではない。
【００６５】 1.抗pMet mAbのpMetに対する特異性 1.1 抗pMetモノクローナル抗体の産生 Tyr1356はMethu受容体の主要なチロシン自己リン酸化部位である。Met自己リ
ン酸化部位に相当するホスホチロシンペプチド(Val His Val Asn Ala Thr Tyr(P
O3H) Val Asn Val Lys Cys)を合成し、質量分析法により解析した。リン酸化し
たペプチドとKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)とを結合して免疫原性を
増強した。
【００６６】 7匹のマウスをこの抗原で免疫化した。同じ抗原を5回追加抗原投与した後、マ
ウスから採血した。これらの血清を免疫化抗原を用いてELISAおよびウエスタン
ブロット(WB)解析により抗pMet抗体についてスクリーニングした。リン酸化ペプ
チドで免疫化した7匹のマウスのうち4匹が抗pMet抗体の高い力価を示した。
【００６７】 最も高い力価を有するマウスの脾臓を採収し、骨髄腫細胞と融合してハイブリ
ドーマ系統を得た。ハイブリドーマクローンをリン酸化Metペプチドを用いてELI
SAによりスクリーニングした。非リン酸化型の同じペプチドとKLHを用いて非特
異的反応の検討を行った。特異的陽性の結果を示す25クローンを増殖させ、同じ
抗原を用いてELISAにより再検討した。図1よりわかるように、ECACC受託番号000
41122のハイブリドーマ、クローンIf8、7c11およびIf6は弱い非特異的反応に高
い反応性を示したが、クローン3g4はリン酸化Metペプチドに比較的弱いが重要な
反応性を示した。
【００６８】 1.2 抗pMet mAbのDA3細胞抽出物との結合 クローンIf8、If6、3g4および7c11の上清を、処理したおよび未処理のDA3細胞
溶解物両方が含まれるブロットを用いてWB解析により解析した(図2A、各々レー
ン3、4、5、6)。
【００６９】 DA3はジメチルベンゾアントラセンにより誘導されたBALB/cマウスの腫瘍から
クローニングされた乳腺癌細胞系であり、転移性細胞系である。DA3細胞は、HGS
/SF処理で迅速にリン酸化されるMetタンパク質p140metを高レベルで発現する。
【００７０】 mAbがpMetと反応するかどうかを調べるため、DA3細胞をHGS/SFで室温で10分間
処理した。処理したおよび未処理のDA3細胞溶解物を抗マウスMetポリクローナル
抗体C260を用いて免疫沈降させた; 免疫沈降物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付し、続いて抗P-Tyr(4G10-UBI)(図2B2)またはmAb If8(レーン3)、If6(
レーン4)、3g4(レーン5)および7c11(レーン6)の上清を用いて免疫ブロット解析
を行った。
【００７１】 図2よりわかるように、試験した4種類のハイブリドーマの上清がHGS/SFで活性
化されたDA3細胞から得られる抽出物と(種々の程度で)結合することが示された
。
【００７２】 1.3 mAbのmet+hgf/sfトランスフェクト細胞系のMetとの反応性 HMH細胞、ヒトMetおよびヒトHGS/SFを同時発現するNIH/3T3マウス繊維芽細胞
は自己分泌ループにより構成的に活性化されるMetを高レベルで発現する。NIH/3
T3およびHMH細胞溶解物をIf8 pMet mAbで免疫沈降させ、続いて抗ヒトMet Ab C2
8(図3A、各々1および2)を用いて免疫ブロットした。負の対照、NIH/3T3細胞はい
ずれの反応性も示さなかった(図3A1)が、抗ヒトMet19Sで免疫沈降させ、抗p-Tyr
mAb(4G10)を用いて免疫ブロットした正の対照、HMH細胞は強い反応性を示した(
図3A3)。これらの結果から、If8がとりわけリン酸化Metを認識していることがわ
かる。mAbがリン酸化Met(赤色)と反応するという所見をさらに確認するため、同
じ細胞をMetに対するC28ウサギポリクローナルAbと5種類のmAb候補上清(緑色)各
々のうちの1つによって同時染色した。Metの発現が検出可能なレベルにないNIH/
3T3細胞を対照とした。例として、3g4についての結果を図3に示す。HMH細胞のク
ローン3g4では高レベルの蛍光フルオレセイン染色が認められたが、3T3対照細胞
ではバックグラウンドレベルの染色でしかなかった(図3B緑色の染色)。C28によ
る染色はより優れた強度を有し、細胞質および膜領域の両方で認められた(図3B
赤色の染色)。3g4およびC28染色の結果を重ね、同時局在性解析を行った。同時
局在性は主として細胞膜で観察された(図3B黄色)。これらの結果から、実際に3g
4 mAbが主として細胞表面に局在するpMetを認識していることが示される。mAb染
色は細胞質にも顕れた。
【００７３】 1.4 ハイブリドーマIf8のmAbのY1354Metmuに対する特異性 If8 AbのY1354Metmuに対する特異性を確認するため、NIH/3T3細胞をHGF/SFで
トランスフェクトし、Metmu結合部位の3つの主なチロシンに、それらをフェニル
アラニン(phe)に変える点変異を導入して7つの異なる発現ベクターを構築した。
この構築体を、従前に記載したヒトHGF/SFをコードするプラスミド(Rong et al.
, Mol. Cell. Biol., 12: 5152-8, 1992)とともにNIH/3T3細胞に同時トランスフ
ェクトした。導入した変異により、種々のクローンに名前を付けた: 野生型クロ
ーンをYYY、変異型Metクローン: FFY、FYY、FYF、YFY、YFF、YYFおよびFFFとし
た。すべてNIH/3T3トランスフェクト細胞で同様のレベルのMetが認められた(図3
Cカラム3および4-赤色)が、PMetの染色はY1354-変異型トランスフェクト細胞で
比較的弱かった(図3Cカラム2-緑色)。pMet(緑色)およびMet染色(赤色)には同時
局在性があり、CLSM同時染色解析では黄色染色として顕れた(図3Cカラム5)。結
合部位での他のチロシンの変異は染色に作用していなかった(図3C全カラムのa-d
)。これらの結果から、実際にIf8 mAbがpMetを認識しており、チロシン1354に特
異的であることが明らかとなる。
【００７４】 1.5 抗pMet mAbとHGS/SFで活性化されたDA3細胞との結合 DA3細胞を用いてmAbのさらなる解析を行った。Metが高レベルで構成的にリン
酸化されるHMH細胞とは違い、DA3細胞ではHGS/SFによる処理後にMetが活性化(リ
ン酸化)される(図4A、B)。処理したDA3細胞のmAb染色は未処理細胞の染色レベル
の少なくとも10倍強いものであった(図4C、時間0と10との比較)。同様の染色の
増強が抗p-Tyr Abにも認められた(データは示していない)。
【００７５】 1.6 MetおよびpMetの同時局在性 同時に検出されたMet(図5Ad-緑色)およびpMet(図5Ac-赤色)のサンプルで、Zei
ss co-localization手法を用いて同時局在性解析を行った。この手法により、緑
色(Y軸)および赤色(X軸)蛍光の各画素の分布を示したグラフが得られる。蛍光強
度の範囲が画素分布を示したから選択される。これらの選択された強度で同時に
局在する部分が青色の像として緑/赤色像上に重ねられる(図5Ab)。かかる解析は
図5Aの小さなグラフでで示される。MetおよびpMet染色の同時局在性により免疫
染色においてpMet Abを使用しうる可能性がさらに示され、pMet Abの特異性が明
らかとなる。
【００７６】 上記の結果から、実際に本発明の抗pMet mAbがpMetと特異的に反応することが
明らかとなる。
【００７７】 2.抗Metおよび抗pMet mAbの乳腺腫瘍生検標本との結合 以下の実施例に記載の作業を抗Met Abを用いて行った。抗pMet mAbを同じ試験
に用いる。
【００７８】 材料および方法 2.1 患者および組織学的材料 2カ所: 1)Centre Rene Huguenin in Saint-Cloud, France、1978〜1993年(86
腫瘍、このうちの79は腺癌であった)および2)Israeli hospitals、1975〜1990年
(96腫瘍、このうちの90は腺癌であった)で治療した患者から、切除した原発乳癌
を集めた。患者年齢の中央値は57.5歳(範囲27〜89歳)であった。患者は治療的手
術を受けた(定型的乳房切断、50(27.5%)患者; 非定型的乳房切断、105(57.7%)患
者および乳腺腫瘤摘出、27(14.8%))。全182患者のうち116人がリンパ節転移陰性
と決定された。182患者のうち114人のエストロゲンおよびプロゲステロン受容体
について調べたところ、50.9%がエストロゲン受容体陽性、46.0がプロゲステロ
ン受容体陽性であった。病気の再発を身体検査、放射線検査および臨床検査なら
びに／または他の関連診断法により、詳細に記録した。追跡期間の中央値は9年(
1〜18年)であった。無転移性の生存は手術から遠隔転移が確認されるまでの時間
として定義した。全体の自由生存(overall free survival)は手術から死または
最後の身体検査までの時間として定義した。すべての事例での死は乳癌が原因で
あった。この既往研究の患者は次の基準、片側性原発乳癌であること、 診断時
に他の原発癌がないこと、および臨床的追跡されることを満たした。評価は最初
に得られた生検サンプル(パラフィン切片)で行った。スライド上の最初の組織サ
ンプルに腫瘍組織とともに近傍の、転移のない正常な末端導管上皮が含まれてい
ない場合には、さらなる切片を正常および腫瘍組織の両方が含まれる同じブロッ
クまたは近傍のブロックから作製した。
【００７９】 2.2 組織調製および染色方法 ヒト原発乳癌のパラフィンブロックを5〜6μmの連続切片とした。組織サンプ
ルをヘマトキシリン-エオシン(HE)で染色し、「正常」および腫瘍領域を確認し
た。
【００８０】 2.3 原発乳癌生検のMetおよびpMet発現の評価 乳癌腫瘍切片からパラフィンを除去し、リン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄し、抗pMe
t(If8)および抗Metポリクローナル一次抗体(C28)とともにインキュベートし、PB
Sで洗浄し、FITC標識抗マウス抗体およびローダミン標識抗ウサギAbとともにイ
ンキュベートした。Nomarski光学(微分干渉コントラスト顕微鏡法)によって切片
の画像を得、倒立型Zeiss LSM 4共焦点顕微鏡を用いて蛍光染色を視覚化した。
各サンプルでは、生検の非悪性および悪性領域のMetおよびpMet発現を評価した
。非悪性領域とは転移がないと思われる新形成組織近傍の組織学的領域として定
義される。発明者らは「悪性」を、悪性細胞が明らかに筋肉または周囲の結合組
織を侵しているが、それが原発腫瘍実質内にまだ存在する領域として定義した。
【００８１】 2.4 乳癌生検におけるMetのウエスタン解析 乳癌および近傍の正常組織を手術により患者生検から切り取り、液体窒素で凍
結させた。組織をプロテアーゼ阻害剤カクテル(Boehringer Mannheim, Germany)
を加えた1ml溶解バッファー(20mM Tris-HCl、pH 7.8、100mM NaCl、50mM NaF、1
% NP-40、0.1% SDS、2mM EDTA、10%グリセロール)でホモジナイズした。100μg
のタンパク質を7.5%SDS-PAGEで分離し、C-28抗体(1:500)を用いてウエスタン解
析を行った。競合試験ではC-28免疫化ペプチドを抗体とともに室温で2時間イン
キュベートした後、ブロットのインキュベーションを行った。アクチン解析では
ウエスタンブロットを68-kdマーカーに満たないものを切り離し、抗アクチン抗
体(Boehringer Mannheim)と反応させた。Met発現の対照としてHT29大腸細胞を使
用した(31)。HRP-結合タンパク質A(1:5000)(Amersham, Arlington Heights, IL)
、ECL反応およびX線フイルムへの照射(Fuji, Japan)を用いて視覚化を行った。
【００８２】 ＜結果＞ 2.5 ヒト乳腺癌生検標本の悪性および非悪性組織におけるpMetの発現の違い 2.5.1 免疫染色 ヒト乳腺癌生検の正常対悪性組織における様々なレベルのMet発現の典型的な
画像を図6に示している。正常な組織学的領域には導管は含まれているが、腫瘍
はないと思われた。一方「腫瘍」には悪性細胞が含まれており、多くの場合、筋
肉または結合組織へ明らかに侵襲していた。主観的評価では、約40%の事例で正
常組織(図6a、c)のMet発現が近傍の乳癌組織(図6b、d)のものよりも高かった。
これに対し、約40%の事例では正常組織のMet発現と腫瘍組織のものとの間に有意
差が認められないことがわかった。N=Tの場合の例を図6(高い場合 e-fおよび低
い場合 i-l)に示している。約20%の事例では正常組織(図6l、m、o)のMet発現が
近傍の乳癌(図6n、p)に比べて低いことがわかった(N＜T)。
【００８３】 2.5.2 ウエスタンブロット解析 発明者らは正常および腫瘍組織抽出物のMet発現が患者間でも違いがあるかど
うかを調べるため、ウエスタン解析を行った。２人の患者のサンプルを図7Aに示
している。一方の患者のサンプルでは正常組織において腫瘍組織より高いMet発
現が認められた(図7A、各々レーン3および4)が、もう一方の患者のサンプルでは
腫瘍において正常組織より高いMet発現が認められた(図7A、各々レーン7および8
)。また、発明者らは競合C-28ペプチドの存在下でC-28の免疫染色が弱まること
に気がついた(参照、図7B、パネル1および2)。同じ切片をC-28抗Metポリクロー
ナル抗体およびヒトMet受容体細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体(D1)
の両方で染色して免疫蛍光特異性をさらに示した。この解析により、両抗体(図7
C、パネル1および2)が同じ反応性パターンを示すことがわかる。この反応性パタ
ーンは像の重なりである黄色い部分(図7C、パネル3)と蛍光強度における正の相
関(図7C、パネル4)により示される。さらに、正常および腫瘍領域の両方を含む
数人の患者の複数の切片では切片間で同等の蛍光強度が示され、管状乳管小葉単
位と大管細胞間では蛍光シグナルにおいて有意な差は示されなかった(データは
示されていない)。
【００８４】 2.5.3 画像解析ならびに本発明のDeおよび／またはDI指数の利用による相
対pMet発現レベルの定量化 a. 供試サンプルの指数の計算 乳房生検切片の正常および腫瘍領域は免許を有する病理医がHE染色したスライ
ドで確認した。病理医がHEに相当する非染色連続切片で確認された正常および腫
瘍領域に印を付けた。次ぎに、印を付けた非染色スライドで免疫染色を行った。
次いで、Zeiss LSM 310共焦点顕微鏡(Oberkochen, Germany)を用いてNomarski微
分干渉コントラスト(N/DIC)顕微鏡法および蛍光性により免疫染色切片の画像を
得た。正常および腫瘍領域両方の注目する領域(ROI)について、Optimas画像解析
ソフトウェア(Seattle, WA)を用い、形態的特徴に従ってNomarski画像上にカー
ソルで輪郭を描いた。この方法によれば、いずれの観察者のROI選択時の「明る
い」蛍光領域への偏りも排除される。輪郭が示された領域を蛍光画像に重ね、RO
I範囲のデジタル情報を収集した(Klineberg, E., et al., Cell Vision, 5: 402
-406, 1996)。共焦点画像のデジタル情報は画像内の各点(画素)の明度を表すグ
レー値(0〜255)からなる。次いで蛍光画像の画素強度ヒストグラムを各ROIにつ
いて確定した。
【００８５】 2つの指数を新しく導き、同じ生検間のMet発現の差を示した。この指数により
、1患者の乳房生検切片の正常および腫瘍ROI間の変量Met発現が定量的に測定で
きる。
【００８６】 De指数は以下の代数方程式: De=fen-fel ただし、
【数１３】 なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2
【数１４】 なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2
【数１５】 で定義される。
【００８７】 DI指数は以下の代数方程式: DI=Dn=Dl ただし、
【数１６】 で定義される。
【００８８】 免疫染色、CLSM解析および定量化は、すべての臨床情報をふせて行った。
【００８９】 統計的方法 DeおよびDI指数の分布を調べ、以下に示す3種類の生物学的群に分類した。無
転移および全生存の分析をKaplan-Meier分析(Kaplan, E. L. and Meier, P., J.
Am. Stat. Soc., 53: 457-481, 1958)により行った。Kaplan-Meier分析を一通
り行い、3群(Tandon, A. K. et al., N. Engl. J. Med., 322: 297-302, 1990)
への最適な分類を決定した。
【００９０】 部分群分析は診断時にリンパ節転移の症候のなかったリンパ節転移陰性患者で
行った。計算はSAS(SAS Institute, Inc., SAS/STAT Software; Changes and En
hancements through Release 6.11, Cary, NC, 1996)およびS-Plus(Statistical
Sciences, S-PLUS Guide to Statistical and Mathematical Analysis, Versio
n 3.3, StatSci, Mathsoft, Inc., Seattle, WA, 1995)ソフトウェアにより行っ
た。
【００９１】 2.5.4 DeおよびDI指数ならびに限界値による患者の3群への分類 182の原発乳癌標本のMet発現を評価した。各サンプルでは、生検の正常および
腫瘍領域両方のMet発現をDeおよびDI指数により評価し、デジタルCLSM出力処理
を行った。これらの結果を用いて、乳癌におけるMet発現の変化の臨床的有意性
を調べた。
【００９２】 表示されたDe指数(図9dceg各々)およびDI指数(図12、a、b)の度数の視覚検査
により「正常」範囲に中間群(N=T)がある3つの群が存在することが示された。大
きな負のDeまたはDI指数は腫瘍のMet発現が近傍の正常組織より高いことを示し(
N＜T)、大きな正のDeまたはDI指数は正常組織のMet発現が腫瘍組織より高いこと
を示している(N＞T)。マーカーの有意性を評価するために異なる群の間で限界値
を確立する必要がある。そのため、発明者らはDeおよびDI指数の両方に対して種
々の組合せを用い、各指数の3群の限界値を定めた。図9はlog-rankおよびWilcox
onによるDe指数分析のp値を示している。log-rank統計ではDe=-60およびDe=90で
その最大に達した。
【００９３】 DI値度数の度数分布表を図12aに示している。ノンパラメトリック分析によっ
て定めた限界値は広範囲の値を示し、DI計算機によって統計的に有意な結果が得
られなかった。図12bはlog-rankおよびWilcoxonによるこの分析のp値を示してい
る。図5cに示したKaplan-Meier分析の例では、限界値-13および10に対してlog-r
ankでは0.014およびWilcoxonでは0.0095という結果が得られた。
【００９４】 3.本発明の方法による原発乳癌患者の予後判定 3.1 乳癌患者のMet発現 log-rankおよび離散Cox 比例ハザード回帰分析を行い、示されたMet発現群(N
＜T、N=TおよびN＞T)が全体の生存および無転移性の生存の予後の指標となるか
どうかを調べた。3群の全体の生存についてのKaplan-Meierプロット(図10)には
有意差があった{p=0.0023(log-rank)、p=0.0104(Wilcoxon)}。よって、全体の生
存では、N＜T群が予後の悪さの予測には有意であった。
【００９５】 3.2 リンパ節転移陰性乳癌患者のMet発現 リンパ節転移陰性患者の腫瘍におけるMet発現の相対レベル(N＜T、N=TおよびN
＞T)を同じ患者の正常組織のレベルと比較した。これら3群間の全体の生存には
有意差があった{p=0.0041(log-rank)およびp=0.0102(Wilcoxon)}。全体の生存デ
ータから、N=T群の11%が死亡し、N＜TおよびN＞T群の各々37.5%および25%が死亡
したことがわかった。後の2群(N＜TおよびN＞T)を合せた場合、10年を超えた段
階で、N=T群では88人のうち10人だけ(11%)が死亡、一方N＜T+N＞T群では28人の
うち19人(37%)が死亡していた。このようにしてデータを分類した場合も生存に
おける差が統計的に有意であった{p=0.0012(log-rank)およびp=0.0027(Wilcoxon
)}が、無転移性の生存に関してはMet発現の相対レベルに有意差はなかった。
【００９６】 従って、本発明の方法はリンパ節転移陰性(第1期)乳癌患者の予後の判定に特
に有用である。
【００９７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ELISAアッセイにおける、If8(ECACC受託番号00041122)のハイブ
リドーマをはじめとする数種のハイブリドーマのmAbsと、pMet（灰色）またはMe
t（斜線）との結合を示す概略図である。
【図２】 2A： 未処理のDA3細胞の細胞溶解物(0分)またはHGS/SFで10分間
処理したDA3細胞の細胞溶解物(10分)で作成した免疫ブロットを示す写真である
。細胞溶解物を7.5%SDS-PAGEで分離し、以下の供試mAb: If8(レーン3)、If6(レ
ーン4)、3g4(レーン5)、7c11(レーン6)を用いて免疫ブロットした。 2B： 図2Aのものと同じ細胞から調製した細胞溶解物の免疫ブロットを示す写
真である。なおこれらはC260抗マウスMetペプチド抗体で免疫沈降させ、7.5%SDS
-PAGEで分離し、以下のもの: 抗MetポリクローナルAb(レーン1)、抗P-Tyr Ab(レ
ーン2)、If8(レーン3)、If6(レーン4)、3g4(レーン5)、7c11(レーン6)を用いて
免疫ブロットしたものである。
【図３Ａ】 NIH/3T3(図3A、レーン1)およびHMH(図3A、レーン2)細胞溶解物
の免疫ブロットを示す写真である。なおこれらはIf8 pMet mAbで免疫沈降させ、
抗ヒトMet抗体C28を用いて免疫ブロットしたNIH/3T3細胞を負の対照(図3A1)とし
て用い、抗ヒトMet19Sで免疫沈降させ、抗p-Tyr mAb(4G10)を用いて免疫ブロッ
トしたHMH細胞を正の対照(図3A3)として用いた。
【図３Ｂ】 NIH/3T3細胞およびHMH細胞の免疫蛍光染色を示す写真である。
細胞に3g4 mAb上清（上列、緑色）および抗ヒトMet C28抗体（下列、赤色）で間
接免疫蛍光染色を施した。染色はCLSMにより解析した。同時局在性解析では緑色
および赤色の染色が重なり（中央列）、緑色および赤色の染色が同時に局在する
位置が黄色で示されている。
【図３Ｃ】 HGF/SFで、またはMet結合部位におけるチロシン変異体の種々
の組合せでトランスフェクトした3T3細胞の、MetおよびpMetを同時染色した間接
免疫蛍光染色を示す写真である。第1、3および5列は野生型Y1354トランスフェク
ト細胞の染色を示しており、第2、4および6列は変異型Y1354トランスフェクト細
胞の染色を示している。Y1354野生型/変異型と組み合わせたMetmn結合部位にお
けるさらなるTyr変異を列挙し: (a)Y1347の置換; (b)Y1363の置換; (c)Y1347の
置換、ならびにY1354野生型/変異型と組み合わせた結合部位を列挙する: (a)Y13
47の置換; (b)Y1363の置換; (c)Y1347およびY1363両方の置換; (d)野生型Tyr。
すべて、Pheへの置換であった。細胞にIf8 Mab(第1および2列、緑色)および抗マ
ウスMet C260(第3および4列、赤色)による間接免疫蛍光染色を施し、染色をCLSM
により解析した。同時局在性解析では赤色および緑色の染色が重なっていた。赤
色および緑色の染色が同時に局在する位置が黄色で示されている(第5および6列)
。
【図４】 DA3乳房細胞におけるMetリン酸化の時間推移を示す写真である。 4A： 7.5%SDS-PAGEで分離し、C260抗マウスMet抗体で免疫沈降させ、その後C
260抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った、DA3細胞(0分)またはHGS/SF
で5、10および20分間処理したDA3細胞の溶解物を示す。 4B： ウエスタンブロット解析に用いた抗体が抗pMet抗体(If8)であった図4A
の溶解物の写真である。 4C： HGS/SFで0、5、10および20分間処理したDA3細胞の間接免疫蛍光法を示
す写真である。染色(赤色染色)はmAb If8によって行った。
【図５】 種々の乳房組織生検におけるpMetのレベルを示す写真である。乳
腺癌のパラフィン包埋切片に抗ヒトMet C28抗体(赤色)およびIf8 mAb(緑色)によ
る間接免疫蛍光染色を施し、染色はCLSMにより解析した。同時局在性解析では緑
色および赤色の染色が重なっていた。赤色および緑色の染色が同時に局在する位
置が黄色で示されている。 5A： 正常な乳管におけるMet(c)およびpMet(d)の発現を示す。同時局在性解
析(a)、コンピューターによる同時局在性(中央囲み)を青色(b)で示している。 5B： If8で免疫染色した(a、c)または抗ヒトMet C28(赤色)およびIf8(緑色)
抗体で同時染色した(b、d)、正常(c-d)および腫瘍(a-d)ヒト乳房切片におけるme
t/pMet発現レベルの比較を示す。 5C： Met/pMetで同時染色した種々の乳癌切片を示す。上列は低MetおよびpMe
tのサンプル; 中央列は高Metおよび高pMetのサンプル; 下列は高Metおよび低pMe
tのサンプルである。
【図６】 乳癌生検におけるMetタンパク質発現の免疫組織化学的CLSMを示
す写真である。画像(a、c、e、g、i、k、mおよびo)は正常乳癌生検のものであり
、画像(b、d、f、h、j、l、nおよびp)は腫瘍乳癌生検のものである。強度は、黒
(最小)から、赤、橙、黄、および白(最大)の色階級列で分類する、Zeiss “Glow
Scale”ルックアップ表に基づいて色分けした。パネルa-dは正常組織のMetのレ
ベルが腫瘍に比べて高い場合(N＞T)である。パネルe-lはN-Tの場合の典型である
。パネルe-hはパネルi-lに示されるものよりも総じて高い場合の典型である。パ
ネルm-pは腫瘍のMetのレベルがより高い場合(N＜T)である。
【図７Ａ】 正常および腫瘍乳房組織のウエスタンブロット解析を示す写真
である。HT29細胞抽出物をC-28 Met抗体(1)でまたは競合抗原の存在下、C-28抗
体で染色した(2)。正常乳房組織(3、5、7、9)および腫瘍乳房組織(4、6、8、10)
をC-28 Met抗体(3、4、7、8)でまたは競合抗原の存在下、C-28抗体で染色した(5
、6、9、10)。レーン3、4、7および8のサンプルには抗アクチン抗体とも反応さ
せ、腫瘍および正常組織のタンパク質レベルを測定した。対レーン3/4ではN＞T
、レーン7/8ではT＞Nを示している。
【図７Ｂ】 乳癌切片の、C-28抗体単独での(1)または競合抗原の存在下(2)
での免疫蛍光法およびCLSM解析を示す。パネル1に比べ、パネル2での強度の低下
が明らかである。
【図７Ｃ】 抗Met D1モノクローナル抗体(1、赤色)およびC-28(2、緑色)に
よる同時染色のCLSM解析を示す。パネル3のD1およびC-28像の重なりでは2つのシ
グナルが同時に局在する位置が黄色で示されている。パネル4はパネル3の蛍光強
度のX-Yグラフである。
【図８】 抗Met抗体を用いたDe指数の分布および累積率を示す概略図であ
る。182患者のDe回数の分布(バー)を累積率(ライン)で示している。
【図９】 抗Met Abを用いた生存分析における種々のDe限界値についての統
計的有意性の分布を示す概略図である。種々の組合せの上・下限界値を用いた場
合の生存分析におけるp値の分布を示している。生存曲線の比較評価は Log-Rank
(灰色バー)およびWilcoxon(斜線バー)統計により行った。
【図１０】 乳癌の予後指標としての腫瘍におけるMet発現の変化を示す概
略図である。182人の患者の全生存曲線を示している。
【図１１Ａ】 リンパ節転移陰性乳癌患者のMet発現の変化を示す概略図で
ある。リンパ節転移陰性患者の全体の生存曲線である: n＞t、n=tおよびn＜t。
【図１１Ｂ】 リンパ節転移陰性乳癌患者のMet発現の変化を示す概略図で
ある。リンパ節転移陰性患者の生存曲線である: n=tおよびn＜または＞t。
【図１２Ａ】 DI指標(バー)および累積率(ライン)について得られた値の度
数分布図である:
【図１２Ｂ】 種々の組合せの上・下限界値を用いた生存分析の統計的有意
性を示す(横に並んだバー-Log-Rank、灰色バー-Wilcoxon)。
【図１２Ｃ】 13および10各々の上・下限界値により分類した患者の全体の
存についてのKaplan-Meier分析について示している(▲-N＞T、■-N=T、●N＜T)
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/30 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/30 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA45 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ79 QR48 QR66 QS11 QS33 QS36 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA14 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 BA01 BA02 BA08 BA23 BA35 CA59 CA62 MA02 NA14 ZA812 ZB072 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB11 CC02 CC21 CC23 EE01 GG01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA76 DA86 EA28 EA50 FA72 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リン酸化Met(pMet)とは結合するが、非リン酸化Metとは結合
    しないモノクローナル抗体(mAbs)を産生するハイブリドーマ株化細胞。
  2. 【請求項２】 該抗pMet mAbsが、リン酸化型のMet結合部位に存在する1以
    上のリン酸化チロシンと結合する、請求項１に記載のハイブリドーマ株化細胞。
  3. 【請求項３】 該リン酸化チロシンがTyr1356である、請求項２に記載のハ
    イブリドーマ株化細胞。
  4. 【請求項４】 2000年4月12日にCentre for Applied Microbiology and Res
    earch (CAMR), European Collection of Cell Cultures (ECACC) 受託機関に受
    託番号00041122として寄託された、ハイブリドーマ株化細胞。
  5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のハイブリドーマ株
    化細胞によって産生されたモノクローナル抗体(mAbs)、または完全抗体の抗原結
    合特性を実質的に保持する該抗体のフラグメント。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の抗体のいずれか１つが結合する抗原エピト
    ープと結合する抗体。
  7. 【請求項７】 請求項４に記載の抗体が結合する抗原エピトープのいずれと
    も結合する抗体。
  8. 【請求項８】 該mAbsがpMet結合部位と結合する、請求項５または６に記載
    のモノクローナルAbs。
  9. 【請求項９】 該mAbsが、リン酸化型のMet結合部位に存在する1以上のリン
    酸化チロシンと結合する、請求項８に記載のモノクローナルAbs。
  10. 【請求項１０】 主要なチロシンであるリン酸化Tyr1356と結合する、請求
    項９に記載のモノクローナルAbs。
  11. 【請求項１１】 請求項５ないし１０のいずれか１項に記載の１以上のmAbs
    を、好適な担体とともに含んでなる、予後判定用組成物。
  12. 【請求項１２】 有効成分としての請求項５ないし１０のいずれか１項に記
    載の１以上のmAbsを、医薬上許容される担体とともに含んでなる、医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 pMet発現が関与する障害または疾患の予後判定に用いるキ
    ットであって、請求項５ないし１０のいずれか１項に記載の１以上の抗pMet mAb
    s、該mAbsと該サンプルとの結合レベルを求めるのに必要な試薬、上・下限界値
    および使用説明書を含んでなる、キット。
  14. 【請求項１４】 該疾患が癌である、請求項１３に記載のキット。
  15. 【請求項１５】 該癌が乳癌である、請求項１４に記載のキット。
  16. 【請求項１６】 (a) アミノ酸(a.a)配列：配列番号1のVal His Val Asn A
    la Thr Tyr Val Asn Val Lys Cysを有するペプチド； (b) 上記(a)のペプチドと少なくとも85%の同一性を有するペプチド；および (d) 上記(a)または(b)のペプチドを含んでなるタンパク質またはペプチド からなる群より選択される、請求項５ないし１０のいずれか１項に記載のmAbsの
    抗原であるペプチド。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載のいずれかのペプチドのアミノ酸配列を
    コードするDNA配列。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の１以上のDNA配列を含んでなる細胞。
  19. 【請求項１９】 請求項１６に記載のペプチドと結合するモノクローナル抗
    体を産生するハイブリドーマ株化細胞。
  20. 【請求項２０】 請求項１６に記載のペプチドと結合する抗体。
  21. 【請求項２１】 有効成分として有効量の請求項１６に記載のペプチドを含
    んでなる医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 pMetの発現が関与する悪性疾患を有する個体において、転
    移性疾患を有するもしくは発症する確率を求め、かつ、その個体の生存見込みを
    求める方法であって、 (a) 供試個体からサンプルを採取し(該サンプルは悪性領域と非悪性領域を含
    む)； (b) サンプルにおいて１以上の悪性領域と１以上の非悪性領域を識別し； (c) サンプルの１以上の悪性領域と、請求項５ないし１０のいずれか１項に
    記載の１以上の抗pMet mAbsとを、mAbsとサンプルとの結合が可能な条件下で接
    触させ； (d) サンプルの１以上の非悪性領域と、１以上の抗pMet mAbsとを、mAbsとサ
    ンプルとの結合が可能な条件下で接触させ； (e) 上記(c)と(d)におけるmAbsの結合の程度を比較し、上記(d)と比べて上記
    (c)の結合レベルが実質的に高ければ、転移性疾患を有するまたは発症する高い
    危険性、および該供試個体の生存率が低いことを示す ことを含んでなる、方法。
  23. 【請求項２３】 該悪性疾患が乳癌である、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 pMetの発現が関与する疾患を有する個体において、転移性
    疾患を有するまたは発症する確率を求め、かつ、その個体の生存見込みを求める
    方法であって、 (a) 該個体からサンプルを採取し(該サンプルは少なくとも１つの悪性領域と
    少なくとも１つの正常領域を含む)； (b) 該サンプルにおいて１以上の悪性領域と１以上の非悪性領域を識別し； (c) 該サンプル中の１以上の悪性組織を所定数N個の部分領域に分け(各部分
    領域は同一の所定面積aを有する)； (d) 該サンプル中の１以上の非悪性組織を所定数M個の部分領域に分け(各部
    分領域は同一の所定面積aを有する)； (e) 該サンプルと、請求項５ないし１０のいずれか１項に記載の抗pMet mAbs
    とを、該抗pMet mAbsと該NおよびM領域に存在するいずれかのpMetとの結合が可
    能な条件下で接触させ； (f) 該サンプル中のN領域の悪性組織の各々、および該サンプル中のM領域の
    非悪性組織の各々における少なくとも１つの抗pMet抗体の結合程度を求め(なお
    、該NおよびM領域の各々１つの各画素における抗pMet抗体の結合程度が第１の整
    数L1および第２の整数L2の間である)； (g) L1およびL2の間の各整数iにおいて、 (ga) tpi(ROIにおける)を抗pMet抗体の結合程度がiに等しい悪性領域の画
    素数と定義し； (gb) npiを抗pMet抗体の結合程度がiに等しい非悪性領域の数と定義し； (h) 第１の下限界値と第２の上限界値を求め； (i) 代数方程式： De＝fen−fet ただし、 【数１】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2) 【数２】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2) 【数３】 に従って予後値Deを計算する {ここで、De指数が該下限界値より低ければ、該個体が転移性疾患を有するまた
    は発症する可能性が高いこと、および生存見込みが低いことを示し、De指数が所
    定の上限界値より高ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症する確
    率が中程度であって、よりよい生存見込みを示し、また、De指数が該下限界値よ
    り高く、該上限界値より低ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症
    する確率が低く、良好な生存見込みを示す} ことを含んでなる、方法。
  25. 【請求項２５】 該疾患が乳癌である、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該個体がリンパ節転移陰性乳癌を有する、請求項２３また
    は請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該個体がリンパ節転移陽性乳癌を有する、請求項２３また
    は請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 該De指数が比(pMetT/MetT)/(pMetN/MetN)をもとに計算さ
    れる、請求項２４ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 pMetの発現が関与する悪性疾患を有する個体において、転
    移性疾患を有するまたは発症する確率を求め、かつ、その個体の生存見込みを求
    める方法であって、 (a) 該個体からサンプルを採取し(該サンプルは少なくとも１つの悪性領域と
    少なくとも１つの正常領域を含む)； (b) 該サンプルにおいて１以上の悪性領域と１以上の非悪性領域を識別し； (c) 該サンプル中の１以上の悪性組織を所定数N個の部分領域に分け(各部分
    領域は同一の所定面積aを有する)； (d) 該サンプル中の１以上の非悪性組織を所定数M個の部分領域に分け(各部
    分領域は同一の所定面積aを有する)； (e) 該サンプルと、請求項５ないし１０のいずれか１項に記載の抗pMet mAbs
    とを、該抗pMet mAbsと該NおよびM領域に存在するいずれかのpMetとの結合が可
    能な条件下で接触させ； (f) 該サンプル中のN領域の悪性組織の各々、および該サンプル中のM領域の
    非悪性組織の各々における少なくとも１つの抗pMet抗体の結合程度を求め(なお
    、該NおよびM領域の各々１つの各画素における抗pMet抗体の結合程度が第１の整
    数L1および第２の整数L2の間である)； (g) L1およびL2の間の各整数iにおいて、 (ga) tpi(ROIにおける)を抗pMet抗体の結合程度がiに等しい悪性領域の画
    素数と定義し； (gb) npiを抗pMet抗体の結合程度がiに等しい非悪性領域の数と定義し； (h) 第１の下限界値と第２の上限界値を求め； (i) 代数方程式： DI＝Dn−Dt ただし、 【数４】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2) 【数５】 (なお、すべての場合、iはL1≦i≦L2) 【数６】 に従って予後値Deを計算する {ここで、DI指数が該下限界値より低ければ、該個体が転移性疾患を有するまた
    は発症する可能性が高いこと、および生存見込みが低いことを示し、DI指数が所
    定の上限界値より高ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症する確
    率が中程度であって、よりよい生存見込みを示し、また、DI指数が該下限界値よ
    り高く、該上限界値より低ければ、該供試個体が転移性疾患を有するまたは発症
    する確率が低く、良好な生存見込みを示す} ことを含んでなる、方法。
  30. 【請求項３０】 該疾患が乳癌である、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 該個体がリンパ節転移陰性乳癌を有する、請求項３０に記
    載の方法。
  32. 【請求項３２】 該個体がリンパ節転移陽性乳癌を有する、請求項３０に記
    載の方法。
  33. 【請求項３３】 該DI指数が比(pMetT/MetT)/(pMetN/MetN)をもとに計算さ
    れる、請求項２９ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
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