JP2003504606A

JP2003504606A - アルツハイマー病の診断または予知の方法とアルツハイマー病の予防または治療用組成物

Info

Publication number: JP2003504606A
Application number: JP2001509549A
Authority: JP
Inventors: モーゼ，バンサン; エルベク，ニコル; アモウエル，フィリップ
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2003-02-04
Also published as: WO2001004349A2; AU6823600A; EP1074634B1; ATE225405T1; WO2001004349A3; EP1074634A1; DE69903278D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者の、またはＡＤを発症する被験者の危険度の増大を予知する方法に関するものであり、ａ）ＤＮＡを含有する生体試料をＡＰＯＥ遺伝子のアレレに関して検定すること、およびｂ）タンパク質Ｌｐ（ａ）または糖タンパク質アポ（ａ）の血漿量を検定することを含み、ＡＰＯＥ遺伝子のε４アレレの存在および〔Ｌｐ（ａ）〕／アポ（ａ）の血漿量の増加によりアルツハイマー病を有するまたはＡＤを発症する患者の危険度の増大を表示する。本発明はさらに、少なくとも１種類のＡＰＯＥε４アレレを保有する患者において、Ｌｐ（ａ）の血漿量またはＬｐ（ａ）とその受容体との相互作用を低減させることからなるＡＤの予防または治療のための療法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の診断または予知のための方法に関する
。

【０００２】本発明はさらに、ＡＤを予防または治療するための療法を提供する。

【０００３】アルツハイマー病は、βアミロイドのプラーク、神経原線維変化、また多くの
場合アミロイドの血管障害に関連する大脳皮質性ニューロンの損失を伴う早期痴
呆を特徴とする脳の病理学である。アルツハイマー病の病因中に遺伝的影響があ
るのではないかということが強く疑われている（国際公開第94/01772号）。

【０００４】この遺伝的構成要素は、この病に罹る個体の間の家族的関連を説明するために
この病が年齢依存型の表現率を伴う常染色体優勢な形で遺伝することを示唆する
間接的な観察によって長年の間に前面に出てきた。最近の分子遺伝学的研究は、
染色体特異的な多形性遺伝的標識を探すことによってアルツハイマー病の推定さ
れる遺伝子を単離することを可能にした（Bird等の論文、Neurobiology of Agin
g 10,432-434 (1989)）。

【０００５】３つの染色体すなわち２１番染色体、１４番染色体、および１９番染色体の局
在化が、早期に兆候の現れる家族に特有の形態（兆候の現れる年齢が６０才未満
）に関係しているとして記述されている。２つの関連のある研究は、染色体領域
19q13.2が、晩年にアルツハイマー病の兆候の現れる家族に特有の形態と関連し
ていることを示唆している（Pericak-Vance等の論文、Am. J. Hum. Genet. 48,
1034-1050 (1991) およびSchellenberg等の論文、Ann. Neurol. 31, 223-227 (1
992)）。この染色体領域内ではアポリポタンパク質（APO）E-CI-CI′-CIIに対す
る遺伝子群が候補帯である。これら遺伝子の産物の中でアポリポタンパク質Ｅ（
APOE）は特に神経系の中に含まれる。APOEは老化したプラーク中に存在し、ペプ
チドβ−Ａ４に対する結合親和性を有する。Strittmatter等の論文（Proc. Natl
. Acad. Sci. 90,177-181 (1993)）には、晩年にアルツハイマー病の兆候の現れ
る家族に特有の形態におけるAPOE遺伝子のε4アレレ（対立遺伝子）の頻度の増
加について記述されている。この観察は、アルツハイマー病の家族に特有の形態
（Corder等の論文、Science 261,921-923 (1993)）および散発性の形態（Corder
等の論文、Science 261,921-923 (1993)およびSaundersらの論文、Neurobiology
13,1467-1472 (1993)）について確かめられた。

【０００６】その上、Schellenberg等の論文（Ann. Neurol. 31: 223-227 (1992)）には、
アポリポタンパク質CII遺伝子のＦアレレ（TaqI制限断片長多型（ＲＦＬＰ）ア
レレ）とアルツハイマー病の家族に特有の形態との間の遺伝的関連について報告
されている。

【０００７】さらに本発明者等は、被験者がＡＤを発症する危険度がAPOEε4アレレに加え
てAPO CIIアレレまたは／および短いD19S178アレレの存在と関係していることを
すでに国際公開第95/24504号において報告している。

【０００８】本発明の著者等はさらに、アルツハイマー病発症の危険度は、APOE遺伝子のプ
ロモーター中にAPOEタンパク質の発現の変態につながるＴ→Ｇの突然変異が存在
する場合に増加することを実証した。

【０００９】さらにAPOε4アレレは、ＡＤ患者における冠状動脈のアテローマ性動脈硬化症
と関連している（O.Kosunen等の論文、Stoke, vol. 26, n^o5 (1995)）。

【００１０】こうして研究の結果、本発明の発明者等はアポ（ａ）がアルツハイマー病の危
険因子であるという発見に至った。

【００１１】ヒトのＬｐ（ａ）は、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）粒子と、アポリポ
タンパク質（ａ）〔アポ（ａ）〕と称される炭水化物を多く含む高度の疎水性の
タンパク質との集合によって形成されるリポタンパク質粒子である。Ｌｐ（ａ）
中ではアポ（ａ）の１個の分子がジスルフィド架橋によりアポB100成分と共役結
合しており、アポ（ａ）の存在がＬｐ（ａ）を全ての他のリポタンパク質の種と
区別している。

【００１２】タンパク質の質量の約３０％を構成する高い炭水化物含量に加えてアポ（ａ）
はまた、大きさおよび構造がかなり不均一である。アポ（ａ）は、その各々がプ
ラスミノーゲンと高度の相同性を示す３つの異質な構造ドメインによって形成さ
れる。プラスミノーゲンは、プロテアーゼドメインによって、またクリングルと
呼ばれる５つのドメインすなわち指定されたクリングル１〜５によって形成され
る。各クリングルは６個の保存システイン残基を含有し、これらがクリングルに
特有の三重ループ構造をもたらす３つのジスルフィド結合を形成する。アポ（ａ
）は、不活性なプロテアーゼのドメインおよびクリングル５ドメインの１つのコ
ピー（この両者はプラスミノーゲンの対応するドメインと〜８５％の相同性を示
す）と、プラスミノーゲンに似たクリングル４（Ｋ４）ドメインの複数のコピー
とを含有する。アポ（ａ）Ｋ４の複数のコピーはお互いに似ているが同一ではな
く１０種類の異質なクリングル型（Ｋ４−１〜１０型）に分けることができ、そ
れらのプラスミノーゲンのＫ４との相同性は７８％から８８％の範囲にある。ア
ポ（ａ）粒子当たりＫ４-１型および３〜１０型の各々に１つのコピーが存在す
るが、Ｋ４−２型には不定回数の反復（3 〜 >40）が存在し、したがってアポ（
ａ）の、またその結果Ｌｐ（ａ）の大きさの不均一性の原因である。

【００１３】次に本発明の発明者等は、APOEと同一の受容体と結合するＬｐ（ａ）の血漿量
の増加がＡＤと関連があるかどうかを試験し、血漿Ｌｐ（ａ）量の増加がAPOEε
4保有者中でＡＤの発症の付加的危険因子を構成する可能性があることを見出し
た。

【００１４】本発明者等が行なった調査の結果は、ＡＤの診断法を改良するための、より正
確にはＡＤを発症する危険度の増大を予知するための、ならびにＡＤと闘うため
に革新的な予防および治療戦略を立案するための基本原理を提供する。

【００１５】一態様において本発明は、ａ）患者または被検者のＤＮＡを含有する生体試料をAPOE遺伝子のアレレにつ
いて検定すること、およびｂ）タンパク質Ｌｐ（ａ）または糖タンパク質アポ（ａ）の血漿量を検定する
こと、を含むアルツハイマー病を有する患者の、またはＡＤを発症する被検者の危険度
の増大を予知する方法を提供し、APOE遺伝子のε4アレレの存在およびＬｐ（ａ
）／アポ（ａ）量の増加によりアルツハイマー病を有するまたはＡＤを発症する
患者の危険度の増大を表示する。

【００１６】本発明の意味する「Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）量の増加」とは、アポ（ａ）量が
健康な被検者の同一年齢集団に対して少なくとも8.6mg/dl増加することを意味す
る。

【００１７】タンパク質の血漿量についてはどの測定方法も適している。

【００１８】好ましい実施形態には、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫検定法（
ＥＬＩＳＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素検定法（ＩＥＭＡ）、
蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫検定、免疫凝集検定（ＩＡ）などがあ
る。

【００１９】免疫検定は、単クローン抗体および／または多クローン抗体を用いるサンドウ
ィッチ検定法を含む様々な種類のものであってもよい。

【００２０】免疫検定は、当技術分野で知られている１ステップ、２ステップ、または３ス
テップで行なうことができる。

【００２１】判定は、液相中または固体担体上で行なうことができる。

【００２２】Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）を認識する抗体は、Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）に対して
高度に特異的であらねばならない。

【００２３】好ましい実施形態において本発明の方法は、第一抗体がＫ４−１および２型の
反復に対抗するように働き（Ｌｐ（ａ）を捕捉するために）、またそれによって
形成される免疫複合体の検出を行なうためにセイヨウワサビのペルオキシダーゼ
と接合した第二抗体がＫ４−９型の反復に対抗するように向けられるサンドウィ
ッチＥＬＩＳＡ法を使ってＬｐ（ａ）／アポ（ａ）の血漿量を判定することから
なる。

【００２４】 APOEの多型現象の判定は、当技術分野でよく知られている任意の方法により行
なわれる。

【００２５】一実施形態においてこの方法は、 i）少なくともAPOE遺伝子またはその部分を増幅する第一のプライマー対で、
患者または被検者由来のＤＮＡを含有する生体試料中のＤＮＡを増幅し、 ii）ステップ１の増幅生成物を可視化すること、およびそれによってAPOEのε4アレレの存在を決定することを含む。

【００２６】「ＤＮＡを含有する生体試料」とは、これには限定されないが例えば、血漿；
血清髄液；リンパ液；皮膚の外分泌物；呼吸、腸、および尿生殖路；涙；唾液；
血球；腫瘍；器官；組織；およびインビトロ細胞培養成分を含む個体由来のポリ
ヌクレオチド分析物を含有することが疑われる組織または液体の試料を意味する
。

【００２７】ステップi) は、核酸増幅法を本質的に含むことが知られている方法により増
幅すべき核酸配列に隣接する領域と特異的に雑種形成するプライマー対を使って
行なわれる。

【００２８】この方法は、好ましくはＤＮＡ増幅法すなわちＰＣＲである（Innis等の著書
、「PCR protocols : A guide to Methods and Applications」 (Academic Pres
s, San Diego, California, 1990)）。

【００２９】好適なプライマーについては当技術分野に記述があり、すなわちHixson等の論
文、J. Lipid Res. 31,545-548 (1990) に記載のものが含まれる。ＰＣＲを行な
うための試薬および装置は市販されている。

【００３０】別の好適な方法もよく知られており、当業界で広く行なわれている（例えば、
米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、ならびにWu等の論文、Genomics 4
, 560-569 (1989)を参照されたい）。

【００３１】ステップii) は、緊縮型雑種形成および洗浄条件下で標的配列のそれと安定な
雑種を形成するポリヌクレオチドプローブを用いて、増幅した生成物の雑種形成
を検出することによって行なわれる。

【００３２】 APOEε4用プローブはAPOEε4アレレ領域および前記領域の全範囲または一部か
ら誘導され、APOEε4領域に特異的な雑種形成を可能にする。

【００３３】プローブの長さは、少なくともヌクレオチド３０個が有利である。

【００３４】プローブには、標識またはリポーター分子に付着した単離されたポリヌクレオ
チドがある。

【００３５】更なる態様によれば本発明は、少なくともAPOE遺伝子の一部を増幅することが可能な第一のプライマー対と、ＤＮＡ試料中のAPOEε4アレレの存在を検定するための試薬と、Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）を認識する少なくとも１種類の抗体とを含む、ＡＤを有する患者の、またはＡＤを発症する被験者の危険度の増大を
予知するためのキットを提供する。

【００３６】試薬は有利には、APOEε4に特異的なプローブである。

【００３７】キットはまた、ＤＮＡを増幅するための少なくとも１種類の試薬を含む。試薬
は有利には、ポリメラーゼの連鎖反応を行なうことができるポリメラーゼ酵素で
ある。一例はTaqポリメラーゼである。

【００３８】本発明のキットはまた、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を行なうための試
薬を備える。

【００３９】好ましい実施形態において抗体は、酵素すなわちセイヨウワサビのペルオキシ
ダーゼと接合した単クローン抗体である。

【００４０】本発明はさらに、アルツハイマー病を予防または治療するための療法を提供す
る。

【００４１】したがって別の態様において本発明は、少なくとも１種類のAPOε4アレレを保
有する被検者におけるアルツハイマー病の予防または治療用の薬物の製造のため
にＬｐ（ａ）の血漿量を低下させることが可能な化合物の使用法を提供する。

【００４２】第一の実施形態において化合物は、アポ（ａ）遺伝子の転写の修飾因子である
。

【００４３】好ましい例は、レチノイン酸（Biochem. Biophys. Res. Commun. 8, 238 (1):
48〜52 (1997, Sept.)）およびダナゾール（Biochem. Biophys. Res. Commun.
14, 227 (2): 570-5 (1996, Oct.)）である。

【００４４】第二の実施形態において化合物は、アポ（ａ）遺伝子の発現の修飾因子である
。

【００４５】この化合物は、一般にはオリゴヌクレオチドリボザイム（Circulation 3 (18)
: 1898-909 (1998, Nov.)）である。

【００４６】これらの化合物は、アポ（ａ）の合成を改変、好ましくは低下させる。

【００４７】第三の実施形態において化合物は、アポ（ａ）タンパク質の折りたたみを改良
する。

【００４８】この化合物は一般に、ジスルフィド架橋の形成を阻止することができる化合物
すなわち抗酸化物質である。

【００４９】第四の実施形態において化合物は、アポ（ａ）タンパク質のグリコシル化を改
良する。

【００５０】この型の一例はカタノスペルミン（J. Bio/Chem. 21,272 (8): 5078-55 (1997
Feb.)）である。

【００５１】第五の実施形態において化合物は、アポ（ａ）タンパク質と細胞表面の結合を
改良する。

【００５２】この化合物は一般には抗生物質すなわちネオマイシンなどのデオキシストレプ
タミン科の抗生物質である（J. Lipid. Res. 37 (10): 2055-64 (1996 Oct.)）
。

【００５３】第六の実施形態において化合物は、アポ（ａ）とアポ B100タンパク質の結合
を改良する。

【００５４】この化合物は、リシン（例えばεアミノカプロン酸（Arterioscler Thromb. V
asc. Biol. 18 (11): 1738-44 (1998 Nov.)））、アルギニン、またはフェニル
アラニン（Biochemistry 26, 37 (21); 7892-8 (1998 May)）の類似体、または
抗アポ（ａ）抗体からなってもよい。

【００５５】別法では、化合物はアポ（ａ）を認識する抗体からなってもよい（J. Biol. C
hem. 18, 269 (46): 28716-23 (1994 Nov)）。

【００５６】第三、四、五、および六の実施形態による化合物は、アポ（ａ）／Ｌｐ（ａ）
の産生の低下をもたらす。

【００５７】更なる態様において本発明は、少なくとも１種類のAPOε4アレレを保有する被
検者におけるアルツハイマー病の予防または治療用の薬物の製造のために、アポ
（ａ）／Ｌｐ（ａ）とその受容体の結合を阻害する化合物の使用法を提供する。

【００５８】第一の実施形態において化合物は、アポ（ａ）Ｋ４−６〜７型とコレステロー
ルによって作動する受容体との結合部位を塞ぐものである（J. Biol. Chem. 13,
271 (50): 32096-104 (1996 Dec.)）。

【００５９】第二の実施形態において化合物は一種のＬＰＲ（低密度リポタンパク質の受容
体関連タンパク質）である。

【００６０】一般に化合物は、α‐２マクログロブリンまたは表面プロテオグリカン、すな
わちヘパリナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、または塩素酸ナトリウムからな
る（FASEB J. 12 (15): 1765-76 (1998 Dec.)）。

【００６１】下記の非限定的な実施例および添付図面は本発明を例示するものである。

【００６２】方法：臨床試験研究の協力者はカフカス地方生まれで、欧州で募集された。彼らは臨床的に入
念に調査された。ＡＤの診断がDSM-III-R基準（American Psychiatric Associat
ion, 1987）およびNINCDS-ADRDA（Mc Kahn等の論文、Neurol. 34: 939-944 (198
4)）に対して行なわれ、被検者は痴呆に関して何のDSM-III-R条件も存在せず、
認識機能が完全に保存された状態で存在する非痴呆の対照として類別された。対
照の募集は１９９３年２月から８月の間に行なわれたのに対し、ＡＤを有する被
検者は１９９４年５月から１９９５年６月の間に募集された。女性協力者は全て
閉経期後であった。各協力者に対して合計20mlの血液をＥＤＴＡ上で採集し氷上
で保管し、４時間以内に遠心分離にかけた。血漿を単離し、分割量を−８０℃で
保管した。

【００６３】実験法ＥＬＩＳＡ検定に用いるまでは決して解凍しなかった試料のＬｐ（ａ）の血
漿レベルを定量した（Marcovina等の論文、Clin. Chem. 41/2:246-255 (1995)）
。この方法は、捕捉抗体としてIgG-a6、また検出される抗体としてセイヨウワサ
ビのペルオキシダーゼと接合したIgG-a40を利用する。IgG-a6はアポ（ａ）Ｋ４
−１および２型の反復を認識する。アポ（ａ）イソ型のサイズを決定するために
、血漿タンパク質を２％ＳＤＳ−アガロースゲル上でサイズ分画し、それらの泳
動に基づいて十分特徴を調べられている標準に対する相対的なアポ（ａ）イソ型
のサイズを決定した（Mooser等の論文、Am. J. Hum. Gen. 61:402-417 (1997)）
。加えて本発明者等は、アポ（ａ）遺伝子の５′フランキング領域中の(TTTTA)_n ペンタヌクレオチド反復の多型現象の特徴を調べ（Mooser等の論文、Human Mol.
Gen. 4:173-181 (1995)）、APOEの遺伝子型決定を行なった（Hixson等の論文、
J. Lipid. 31: 545-548 (1990)）。

【００６４】ヒトの脳中のアポ（ａ）の免疫組織化学的分析１５の死体解剖例のすべてが試験された。脳を１０％ホルマリン中で４週間固
定し、〜3×2×1cmのブロックを前頭部と頭頂部の連合野（それぞれブロドマン
領８〜９および３９〜４０）および側頭領域から摘出した。側頭領域には海馬お
よび内鼻皮質が含まれる。ブロックをパラフィン中に埋め込み、5μmの薄片を組
織的および免疫組織化学的分析に用いた。老化したプラークはチオフラビンＳ法
を用いて染色し、βアミロイド（DAKO, Zug, Switzerland）に対して向けられる
単クローン抗体（Ｍ８７２）を用いた免疫組織化学によって試験され、一方神経
原線維変化はGallyasの銀手法を用いて染色した。試験された死体解剖１５例の
中で１０例はKhachaturian（Arch. Neurol. 42:1097-1105 (1985)）によって提
案されたＡＤの神経病理学的診断用の定量的な組織学的基準を満たしたのに対し
、残りの５例には何のＡＤ型の大脳皮質の変化も検出されなかった。アポ（ａ）
の免疫検出に関しては、内因性のペルオキシダーゼ活性を取り除くために薄片を
脱パラフィン化し、再水和し、0.3%メタノール性過酸化物で３０分間処理した。
次いで薄片を希釈した正常なウサギの血清（1:100）により３７℃で３０分間処
理し、IgG-a5（50μg/mlに希釈したもの）またはIgG-a40（10μg/mlに希釈した
もの）と共に４℃で夜通しインキュベートした。検出は硫酸アンモニウムニッケ
ル法または製造業者（DAKO）の助言に従ってＡＢＣキットを用いて行ない、続い
てヘマトキシリンで対比染色を行なった。対照用薄片は、一次抗体の除外後また
は関連性のない単クローン抗体と共にインキュベートした後に試験された。

【００６５】統計解析統計解析はＳＡＳソフトウェアリリース6.10（SAS Institute Inc, Cary, NC
）により行なった。平均値および標準偏差（SD）を量的変数について計算した。
必要な場合はピアソンのχ²またはフィッシャーの直接法を用いて分類別データ
を検定した。多変量ロジスティック回帰モデルを用いて調整されたＯＲおよび９
５％ＣＩを推定した。考慮に入れた共変量は年齢と性別である。

【００６６】結果：リポタンパク質（ａ）〔Ｌｐ（ａ）〕のレベルは、非痴呆の対照の個体296名
と、年齢６５才以上で痴呆と診断された被検者（晩年に兆候の現れたＡＤ）200
名（70.2%）を含むアルツハイマー病の被検者285名から採集した血漿試料で定量
した。

【００６７】協力者を少なくとも１種類のAPOEε4アレレの存在に従って区分し、それらの
特徴を下記の表に記載した。予想した通り痴呆の被検者（170/285、60%）中のAP
OEε4アレレ保有者の割合は、対照群（74/296、25%；罹病確率（ＯＲ）4.4、９
５％信頼区間（ＣＩ）3.1-6.4；p<0.00001）よりも高かった。４つの群において
男性の割合は女性よりも低かった。痴呆の被検者は対照よりも高齢であった。し
かしながら、対照またはＡＤの被検者において年齢はAPOEε4保有者およびAPOE
ε4非保有者に関して同様であった。

【００６８】予想した通り４つの群において血漿Ｌｐ（ａ）量の分布は低い値の方へ著しく
偏っているのに、対数変換した値は正規分布に近かった。

【００６９】 APOEε4保有者における痴呆の被験者の血漿Ｌｐ（ａ）量は対照の血漿Ｌｐ（
ａ）量よりも高く（9.8mg/dl対6.9mg/dl（中央値）、p=0.049、下記の表）、血
漿Ｌｐ（ａ）量が<10mg/dlの被検者の割合は対照より低かった（51%対66%、p=0.
03）。APOEε4保有者の痴呆と非痴呆の間の血漿Ｌｐ（ａ）量の分布の違いは、
冠状動脈疾患の有無の被検者に関して報告されているものと非常によく似ている
（Sandholzer等の論文、Arterioscl. Thromb. Vas. Biol. 12:1214-1216 (1992)
）。これに対して、APOEε4非保有者においては血漿Ｌｐ（ａ）量の中央値は痴
呆の有無の被検者に関して同様であった（8.6mg/dl対8.5mg/dl、p=0.82）。この
観察の結果は、痴呆と非痴呆のAPOEε4保有者の間の血漿Ｌｐ（ａ）量の分布の
違いが痴呆自体によるものでなく、またこれら２つの群の間の年齢の違いによる
ものでもないことを示唆している。

【００７０】Ｌｐ（ａ）と、またリガンド（VLDL-R（Argraves等の論文、J. Clin. Invest.
100: 2170-2181 (1997)）、LRP（Marz等の論文、FEBS 325: 271-275 (1993)）
、およびGP330／メガリン（Niemeier等の論文、Arterioscler Thromb. Vas. Bio
l. (1998) およびLa Ferla等の論文、J. clin. Invest. 100: 310-320 (1997)）
としてのAPOEを有する受容体との結合は、アポリポタンパク質（ａ）（アポ（ａ
）（Marz等の論文、同上））、すなわちLDLのアポリポタンパク質Ｂに共有結合
で付着してＬｐ（ａ）を形成する特有かつ高度に多型の糖タンパク質（Utermann
等の論文、Science 246: 904-910 (1989)）のサイズに左右される。アポ（ａ）
イソ型のサイズはアポ（ａ）遺伝子内のＫ４のコピーの数によって規定される。
この問題に取り組むために、本発明者等は被検者の４つの群中のアポ（ａ）イソ
型のサイズを試験した。全体としては免疫ブロット分析によって検出可能なアポ
（ａ）イソ型を保有しない被検者の割合は１０％（57/581）であった。検出可能
なバンドを１本だけ有する被検者に対するアポ（ａ）イソ型、または検出可能な
バンドを２本有する被検者に対するもっと小さなアポ（ａ）イソ型のサイズの度
数分布は、４つの群の間で同様であった（下記の表）。予想した通りアポ（ａ）
イソ型のサイズと血漿Ｌｐ（ａ）の間には逆の関係が見られ、この関係は調査し
た４つの群に関して同様であった。

【００７１】次に、本発明者等はアポ（ａ）遺伝子の５′フランキング領域中に位置した (
TTTTA)_5-12多型現象の特徴を調べた。この多型現象は、Ｌｐ（ａ）の血漿量に影
響を及ぼすアポ（ａ）遺伝子のサイズおよび配列により強い連鎖不平衡状態にあ
る。別の集団で観察されるように最も多いアレレは、TTTTA反復が８コピー（69.
3%）であるのに対し、１０コピー（14.9%）、９コピー（13.9%）、１１コピー（
1.6%）を含有するアレレは少ない。この集団ではTTTTA反復の５，６，７、また
は１２コピーを含有するアレレの頻度は0.5%未満であった。４つの群の間ではTT
TTAアレレの分布に顕著な違いは観察されなかった。これらの分析をすべて合わ
せると、ＡＤとアポ（ａ）の間の関連が、アポ（ａ）遺伝子におけるアポ（ａ）
イソ型または特異的アレレのサブセットに限定されないことを示している。

【００７２】Ｌｐ（ａ）の血漿が高レベルで存在する場合にＡＤを有する危険度を決定する
ために、本発明者等は多変量ロジスティック回帰分析を行なった。群全体に対す
る血漿Ｌｐ（ａ）量の中央値である8.6mg/dlを閾値に選んだ。APOEε4非保有者
では調査された年齢にわたってＯＲの変化は何も観察されなかった（図１）。こ
れに対してAPOEε4保有者では血漿Ｌｐ（ａ）量の>8.6mg/dlの存在がＡＤの危険
度の漸進的増加と関連しており、＞６５才の被験者（ｎ＝対照68人およびＡＤ被
検者143人）における1.2（95%信頼区間0.7〜2.1）から、＞７０才の被験者（ｎ
＝59人および94人）に対する2.1（1.1〜4.1）、＞７５才の被験者（ｎ＝48人お
よび42人）に対する5.1（1.9〜13.8）、および＞８０才の被検者（ｎ＝30人およ
び9人）に対する15.2（1.7〜13.5）まで上昇した。同様の結果は、早期に兆候を
示した被検者を分析から除外した場合にも、または血漿Ｌｐ（ａ）量に別の閾値
を選んだ場合にも得られた。

【００７３】Ｌｐ（ａ）は、ハリネズミ、大型類人猿類、およびヒトを含む限られた数の種
由来の血漿中で同定されている。血漿中を循環するアポ（ａ）は肝臓中で合成さ
れる。加えてアポ（ａ）転写物は、サルの精巣および脳中で同定され、また、よ
り少ない程度では肺および副腎中で同定されている。しかしながらアポ（ａ）糖
タンパク質がヒトまたはサルの脳中に存在するかどうかは知られていない。Ｌｐ
（ａ）とＡＤの間の関連に形態的根拠があるかどうかを調べるために本発明者等
は、病理学的に判明したＡＤ型の大脳皮質の変化を伴う１０人のヒトの脳、およ
びＡＤの徴候のない５人のヒトの脳について免疫組織化学的分析を行なった。そ
れぞれＮ末端（Ｋ４−２型）およびＣ末端（Ｋ４−９型）に対して向けられ、プ
ラスミノーゲンと交差反応しないマウスの単クローン抗体IgG-a5およびIgG-a40
を用いてアポ（ａ）を免疫検出した。両抗体は同一のパターンを示し、かつ一次
抗体が除かれたまたは関連性のない抗体が用いられた対照の薄片においては何の
シグナルも検出されなかったので、そのシグナルは特異的であった。すべてのＡ
Ｄ例において、老化したプラーク（図２、パネルＡ）中に、神経原線維変化およ
び顆粒空胞変性を伴うニューロンのサブセット中に、また反応性ミクログリアお
よび星状膠細胞（パネルＢおよびＣ）中にアポ（ａ）の免疫反応性が検出された
。小さな比率の明らかに変化していないニューロンもまた染色された（パネルＣ
）。加えて強いアポ（ａ）の免疫反応性が、軟膜の血管および実質血管の内皮細
胞中に検出された。ＡＤ型の大脳皮質変化のない患者由来の脳で内皮細胞上に強
いアポ（ａ）の免疫反応性が見られたのに対し、わずかなニューロンのみがアポ
（ａ）免疫陽性を示した。これらのニューロンには組織的に検出可能な変化がな
かった。これらの分析は、アポ（ａ）がＡＤ中に存在するニューロンの変質に関
係している可能性があることを示唆した。

【００７４】 APOEε4に特異的な高い血漿Ｌｐ（ａ）量とＡＤの間の関連を説明するために
様々なシナリオを提案することができる。APOEε4の保有者は、外傷または卒中
などの脳の発作後にＡＤを発症する危険度がより高い。一方、高い血漿Ｌｐ（ａ
）量は脳梗塞と関連性がある。APOEε4の非保有者ではこのような血管の損傷が
機能上の結果を生じないかまたはわずかであると考えられる。これとは対照的に
APOEε4の保有者ではニューロンの可形性および再生能力が限られているため、
このような血管の損傷がＡＤの発症に漸進的につながっていく可能性がある。こ
のシナリオはそれ自体、ＡＤの発生機序における血管因子の仮説を補強すること
になる。Ｌｐ（ａ）（またはAPOEを運ぶＬｐ（ａ）粒子の分画）の結合が、ニュ
ーロンへのコレステロールの送達を増加させる一因である可能性があるというこ
ともまた考えられる。コレステロールは、その遮断がニューロンに対して有利に
作用することがインビトロで示唆されているように毒性がある可能性がある。最
後にアポ（ａ）は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子またはトロンビン
などの他のクリングル含有タンパク質の邪魔をする可能性がある。

【００７５】以上のことをまとめると、このデータはAPOEε4が関連するＡＤの発症におい
て修飾因子の特性として影響を及ぼす高い血漿Ｌｐ（ａ）量と矛盾しない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、血漿Ｌｐ（ａ）量が>8.6mg/dlで存在する場合の、APOEε4非保有者（
破線）およびAPOEε4保有者（実線）における罹病確率（ＯＲ）とＡＤを有する
患者の兆候の現れる年齢との間の関係を示す。APOEはHixson等の論文、J. Lipid
Res. 31:545-548に記載の遺伝子型であり、血漿Ｌｐ（ａ）レベルの定量化はＥ
ＬＩＳＡ検定および明確な特異性をもつ単クローン抗体（Marcovina等の論文、C
lin. Chem. 41/2:246-255 (1995)）を用いて行なった。罹病確率は、対数変換し
た血漿Ｌｐ（ａ）量に関する多変量ロジスティック回帰分析を用いて計算した。
信頼区間は本文中に示す。

【図２】図２は、ＡＤ型の大脳皮質の変化を伴うヒトの脳のアポ（ａ）の免疫検出にお
いて観察されるパターンを示す。下記に記載の方法によりIgG-a5抗体を用いてＡ
Ｄ型の大脳皮質の変化を伴う２人の被検者の脳についてアポ（ａ）が存在するか
どうかを試験した。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年２月１３日（２００２．２．１３）

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/58 Ａ６１Ｋ 31/58 ４Ｃ２０６ 31/7088 31/7088 38/00 39/395 Ｄ 38/16 45/00 39/395 Ａ６１Ｐ 25/28 45/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｐ 25/28 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｃ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/04 Ｇ０１Ｎ 33/92 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人サントルオスピタリエユニベルシテールボドワドゥローザンヌスイス国，ツェーハー−1011 ローザンヌ，リュドゥブニョン，９ (71)出願人アンスティテュナシオナルドゥラサントゥエドゥラルシェルシェメディカル（イーエヌエスエーエールエム) フランス国，エフ−75013 パリ，リュドゥトルビア，101 (72)発明者モーゼ，バンサンスイス国，ツェーハー−1011 ローザンヌ，シュブ，リュデュブニョン，９ (72)発明者エルベク，ニコルフランス国，エフ−59750 マルクアンバロール，リュフェリックスフォール，10 (72)発明者アモウエル，フィリップフランス国，エフ−59700 マルクアンバロール，リュデュケスヌ，75 Ｆターム(参考） 2G045 AA01 CA26 DA62 DA66 DA67 FA11 FB03 4B063 QA07 QA19 QQ02 QQ42 QR62 QS25 QS33 4C084 AA02 AA17 BA44 DA38 ZA162 4C085 AA13 BB11 DD88 4C086 AA01 AA02 DA12 EA16 MA01 MA04 ZA16 4C206 AA01 AA02 DA12 FA01 FA53 HA32 MA01 MA04 ZA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）APOE遺伝子のアレレに関してＤＮＡを含有する生体試料
を検定すること、およびｂ）タンパク質Ｌｐ（ａ）または糖タンパク質アポ（ａ）の血漿量を検定する
こと、を含むアルツハイマー病を有する患者の、またはＡＤを発症する被験者の危険度
の増大を予知する方法であって、前記APOE遺伝子のε4アレレの存在およびＬｐ（ａ）／アポ（ａ）の血漿量の
増加により患者がアルツハイマー病を有するまたはＡＤを発症する危険度の増大
を表示する、方法。
【請求項２】Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）の量を、免疫検定法すなわち免疫酵
素検定法を使って検定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】第一抗体がＫ４−１および２型の反復に対抗するように働き
（Ｌｐ（ａ）を捕捉するために）、またそれによって形成される免疫複合体の検
出を行なうためにセイヨウワサビのペルオキシダーゼと接合した第二抗体がＫ４
−９型の反復に対抗するように向けられるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を使って
Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）量を検定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】 i) 患者または被験者由来の、少なくともAPOE遺伝子または
その部分を増幅する第一のプライマー対と組み合わさったＤＮＡの生体試料中の
ＤＮＡを増幅すること、および ii) ステップi) の増幅産物を可視化し、それによってAPOEε4アレレの存在を
検定すること、を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】 APOE遺伝子の少なくとも一部を増幅することが可能な第一の
プライマー対と、ＤＮＡ試料中のAPOEε4アレレの存在を検定するための試薬と、Ｌｐ（ａ）／アポ（ａ）を認識する少なくとも１種類の抗体、とを含むキット。
【請求項６】前記試薬がAPOEε4に特異的なプローブである、請求項５に
記載のキット。
【請求項７】さらにＤＮＡを増幅するための少なくとも１種類の試薬を含
む、請求項５または６に記載のキット。
【請求項８】さらにポリアクリルアミドゲルの電気泳動を行なうための試
薬を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】前記抗体が酵素すなわちセイヨウワサビのペルオキシダーゼ
と接合している、請求項５に記載のキット。
【請求項１０】少なくとも１種類のAPOε4アレレを保有する被験者のアル
ツハイマー病の予防または治療用薬物の製造のためにＬｐ（ａ）の血漿量を低下
させることが可能な化合物を使用すること。
【請求項１１】前記化合物がアポ（ａ）遺伝子の転写を改良する、すなわ
ちダナゾールまたはレチノイン酸からなる、請求項１０に記載の化合物の使用。
【請求項１２】前記化合物がアポ（ａ）遺伝子の発現を改良する、すなわ
ちオリゴヌクレオチドリボザイムからなる、請求項１０に記載の化合物の使用。
【請求項１３】前記化合物がアポ（ａ）／Ｌｐ（ａ）タンパク質の産生を
阻害する、請求項１０に記載の化合物の使用。
【請求項１４】前記化合物がアポ（ａ）タンパク質の折りたたみを改良す
る、すなわちジスルフィド架橋の形成を阻害する抗酸化物質からなる、請求項１
３に記載の化合物の使用。
【請求項１５】前記化合物がアポ（ａ）タンパク質のグリコシル化を改良
する、すなわちカタノスペルミンからなる、請求項１３に記載の化合物の使用。
【請求項１６】前記化合物がアポ（ａ）タンパク質と細胞表面の結合を改
良する、すなわちデオキシストレプタミン科の抗生物質からなる、請求項１３に
記載の化合物の使用。
【請求項１７】前記化合物がアポ（ａ）とアポB100タンパク質の結合を改
良する、すなわちリジン、アルギニン、またはフェニルアラニンの類似体、また
は抗アポ（ａ）抗体からなる、請求項１３に記載の化合物の使用。
【請求項１８】少なくとも１種類のAPOε4アレレを保有する被験者のアル
ツハイマー病の予防または治療用薬物の製造のための、アポ（ａ）／Ｌｐ（ａ）
とその受容体の結合を阻害することが可能な化合物の使用。
【請求項１９】アポ（ａ）／Ｌｐ（ａ）とその受容体の結合を阻害する前
記化合物が、アポ（ａ）Ｋ４−６〜７型の部位とコレステロールによって引き起
こされる受容体との結合を妨げる化合物である、請求項１８に記載の化合物の使
用。
【請求項２０】アポ（ａ）／Ｌｐ（ａ）とその受容体の結合を阻害する前
記化合物が、ＬＲＲ（低密度リポタンパク質の受容体関連のタンパク質）と相互
に作用する化合物すなわちα−２マクログロブリンまたは表面プロテオグリカン
からなる、請求項１７に記載の化合物の使用。