JP2003504026A - 新規のインターロイキン−１レセプターアンタゴニストおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規の核酸、これら核酸によってコードされた新規のポリペプチドおよびそれらの使用を提供する。 これら新規のポリヌクレオチドとポリペプチドの配列は、新規のインターロイキン−１レセプターアンタゴニストであると決定された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

１．関連出願 本願は、1998年７月31日に出願された米国特許出願第09/127,698号（代理人整
理番号第20411-749）の一部継続出願であり、かつ1998年６月19日に出願された
米国特許出願第09/099,818号（代理人整理番号第20411-743）の一部継続出願で
ある、1999年１月13日に出願された米国特許出願第09/229,591号（代理人整理番
号第20411-743 CON1）の一部継続出願であもる、1999年２月17日に出願された米
国特許出願第09/251,370号（代理人整理番号第20411-755）の一部継続出願であ
る、 1999年４月５日に出願された米国特許出願第09/287,210号の一部継続出願である
、1999年７月７日に出願された米国特許出願第09/348,942号の一部継続出願であ
る、1999年10月13日に出願された米国特許出願第09/417,455号の一部継続出願で
ある、1999年12月８日に出願された米国特許出願第09/457,626号の一部継続出願
である、2000年３月10日に出願された米国特許出願第09/523,552号（代理人整理
番号第28110/36211）の一部継続出願である、2000年５月22日に出願された米国
特許出願第09/576,008号の一部継続出願である。 米国特許出願第09/127,698号
（代理人整理番号第20411-749）および米国特許出願第09/099,818号（代理人整
理番号第20411-743）は、1998年４月３日に出願された米国特許出願第09/055,01
0号（代理人整理番号第20411-733）の一部継続出願である、1998年５月15日に出
願された米国特許出願第09/079,909号（代理人整理番号第20411-737）の一部継
続出願である、1998年５月20日に出願された米国特許出願第09/082,364号（代理
人整理番号第20411-738）の一部継続出願であり、これら全部は参考までに本願
明細書に取り込まれている。

【０００２】 ２．技術分野 本発明は、新規ポリヌクレオチド、およびそれらポリヌクレオチドによってコ
ードされるタンパク質を提供するものであり、さらにこれらポリヌクレオチドお
よびタンパク質に対する治療、診断および研究用途に関する。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】

３．背 景 タンパク質因子（例えば、リンホカイン、インターフェロン、CSF、ケモカイ
ンおよびインターロイキンなどのサイトカインを含む）の発見で目標とされた技
術は、ここ十年に及び急速に成熟してきている。 現在常用されているハイブリ
ダイゼーションクローニングおよび発現クローニング技術によって、新規ポリヌ
クレオチドが、発見されたタンパク質に直接関連する情報（すなわち、ハイブリ
ダイゼーションクローニングの場合にはタンパク質の部分的なDNA／アミノ酸配
列；発現クローニングの場合はタンパク質の活性）に負うというという意味で「
直接的に」クローニングされる。 さらに近年行われるようになった、今やよく
認識されている分泌リーダー配列モチーフの存在に基づいてDNAを単離する技術
である、シグナル配列クローニングなどの技術などの「間接的」クローニング技
術は、様々なPCRを用いたクローニング技術や低ストリンジェンシーハイブリダ
イゼーションクローニング技術と共に、リーダー配列クローニングの場合はその
分泌特性に依って、あるいはPCRを用いた技術の場合には細胞または組織の供給
源に依って、生物学的活性を有することが知られているタンパク質に対する数多
くのDNA/アミノ酸配列を入手可能とするまでに当該技術状態を発展させている。

【０００４】 本発明は、これらタンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドに関
する。 特に、本発明は、新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストに関
する。

【０００５】 インターロイキン-1のようなサイトカインは、内皮細胞での形態または機能上
の改変をもたらすことが知られている。 これら改変の一部は、「内皮細胞の活
性化」によるものである。 腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン-1(インター
ロイキン-1)およびγ-インターフェロン(IFN)のような他の免疫媒介体は、異な
るものを誘発するようであるが、凝血促進活性の増大(Bevilaqua (1986) PNAS,
83:4533-4537)、PGIおよび２生成(Rossi (1985), Science, 229: 174-176)、HLA
抗原発現(Pober (1987) J. Immunol., 138:3319-3324)、およびリンパ球接着分
子(Carender (1987) J. Immunol., 138:2149-2154)を含む、内皮細胞活性化のパ
ターンの一部に重複が認められる。 これらサイトカインが、低血圧症、脈管出
血および虚血を引き起こすことも報告されている(Goldblum et al., 1989, Trac
ey et al. Science 234:470, 1986)。 これらと他の生物学的応答修飾因子の主
な用量制限毒性は、低血圧症と脈管漏出である(Dvorak (1989) J.N.C.I., 81:49
7-502)。

【０００６】 生物学的応答を修飾するIL-1の能力は、様々な研究によって実証されている。
例えば、ウサギへのインターロイキン-1の投与(Wakabayashi et al., FASEB J 1
991;5:338: Okusawa et al., J. Clin Invest 1988;81:1162; Ohlsson et al.,
Nature 1990;348:550; Aiura et al., Cytokine 1991;4:498)および霊長類への
インターロイキン-1の投与(Fischer et al., Am J Physiol 1991;261;R442)によ
れば、低血圧症、頻脈、肺浮腫、腎不全が認められ、最終的には、用量依存的に
死に至った。 インターロイキン-1で処置した動物から採取した血清を検査した
ところ、他のサイトカインの上昇が認められ、ヒトの膵炎と似たようなレベルに
まで至る。 (Guice et al., J Surg Res 1991;51:495-499; Heath et al., Pan
creas 1993;66:41-45) 敗血症や膵炎のような疾患に対する全身性応答の主要な
媒介体として、また他のサイトカインカスケードの活性化体としてのインターロ
イキン-1の役割を支持する、目下のところ入手可能な大きな証拠がある。 (Din
arello et al., Arch Surg 1992;127:1350-1353)。

【０００７】 サイトカインインターロイキン-1は、炎症応答における主要な媒介体である（
参考までに、Dinearello (1991）Blood 77:1627-1652; Dinearello et al(1993
）New England J. Med. 328:106-113; Dinearello (1994）FASEB J. 8:1314-132
5を参照されたい)。 炎症におけるインターロイキン-1の重要性は、炎症条件を
緩和する高度に特異的なインターロイキン-1 レセプターアンタゴニストの能力
によって実証されている（参考までに、Dinearello (1991）Blood 77:1627-1652
; Dinearello et al(1993）New England J. Med. 328:106-113; Dinearello (19
94）FASEB J. 8:1314-1325; Dinearello (1993）Immunol. Today 14:260-264を
参照されたい)。 脈管内皮での細胞接着分子の上方調節のような、インターロ
イキン-1の前炎症性効果の多くが、転写調節のレベルで認められる。 細胞接着
分子および炎症応答に関与する他の遺伝子のインターロイキン-1による転写活性
化は、主にNF-κBによって媒介されているようである(Shirakawa et al. (1989)
Molc. Cell Biol. 9:2424-2430; Osborn et al., (1989) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86:2336-2340; Krasnow et al., (1991) Cytokine 3:372-379; Collins
et al., (1993) Trends Cardiovasc. Med. 3:92-97)。 インターロイキン-1に
応答して、NF-κB阻害因子IκBは分解され、そして、NF-κBは、DNAが結合し、
また転写を活性化ならしめる核の中に局在すべく、不活性細胞質状態から放出さ
れる(Liou et al. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5:477-487; Beg et al., (1
993) Mol. Cell. Bid. 13:3301-3310)。

【０００８】 インターロイキン-1は、敗血症ショックでの媒介体でもある。 細菌感染の致
命的合併症である敗血症ショックは、米国にて、毎年、150,000〜300,000名もの
患者を出している(Parrillo, J.E. (1989), Septic Shock in Humans: Clinical
Evaluation, Pathogenesis, and Therapeutic Approach (第２版）In: Textbook
of Critical Care Shoemaker, et al., 編纂、Saunders Publishing Co., フィ
ラデルフィア、ペンシルベニア州、pp.1006)。 心臓血管の崩壊と、敗血症が関
連する複合的な代謝の攪乱は、主に、動物へ投与した時に敗血症ショック様の状
態を引き起こす細菌内毒素(ET)によるものである(Natanson, et al. (1989), En
dotoxin and Tumor Necrosis Factor Challanges in Dogs Simulate the Cardio
vascular Profile of Human Septic Shock, J. Exp. Med. 169:823)。 このよ
うに、インターロイキン-1のモジュレーターが、待望されているのである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

４．発明の要旨 本発明の組成物には、新規の単離されたポリペプチド、詳細には新規のインタ
ーロイキン-1 レセプターアンタゴニストタンパク質（以後、IL-1Hy1またはIL-1
Hy1 レセプターアンタゴニストと称する）、当該ポリペプチドをコードする単
離されたポリヌクレオチド、すなわち、組換えDNA分子、クローニングされた遺
伝子またはその縮重変異体、特に、対立変異体などの天然に存在する変異体、そ
して当該ポリペプチドに存在する１以上のエピトープを特異的に認識する抗体が
包含される。

【００１０】 本発明の組成物は加うるに、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクタ
ーを含めたベクター、当該ポリヌクレオチドを含有するように遺伝的に設計され
た細胞を包含するものである。

【００１１】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：３または５のアミノ酸配
列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むが、これらに
限定されることはない。

【００１２】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：１、２、４または６のヌ
クレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；配列番号：１、２、４または６
の全長タンパク質コード配列を含んでなるポリヌクレオチド；配列番号：１、２
、４または６の成熟タンパク質コード配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む
が、これらに限定されることはない。 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号
：１、２、４または６のヌクレオチド配列の相補体とストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；前記したポリ
ヌクレオチドのいずれかの対立変異体であるポリヌクレオチド；前記したタンパ
ク質のいずれかの種相同体をコードするポリヌクレオチド；または、配列番号：
１、２、４または６のポリペプチドに特有のドメインまたはその先端が切除され
たポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むが、こ
れらに限定されることはない。

【００１３】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：７または８のゲノミック
クローンのヌクレオチド配列；配列番号：７または８の一つ以上のエクソンから
構築したポリヌクレオチド；配列番号：７または８の一つ以上のイントロンから
構築したポリヌクレオチド；配列番号：７または８の一つ以上のエクソンと配列
番号：７または８の一つ以上のイントロンから構築したポリヌクレオチド；配列
番号：７または８の全長タンパク質コード配列を含んでなるポリヌクレオチド；
配列番号：７または８の成熟タンパク質コード配列のヌクレオチド配列を含んで
なるポリヌクレオチドをさらに含むが、これらに限定されることはない。

【００１４】 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：７または８のヌクレオチド配列の相
補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチド；配列番号：７または８のイントロンまたはエクソンのいずれ
か一つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチド；前記したポリヌクレオチドのいずれかの対立変異
体であるポリヌクレオチド；前記したタンパク質のいずれかの種相同体をコード
するポリヌクレオチド；または、配列番号：７または８のポリペプチドに特有の
ドメインまたはその先端が切除されたポリペプチドを含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをさらに含むが、これらに限定されることはない。

【００１５】 本発明のポリヌクレオチドはさらにまた、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ATCC、10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-22
09、米国）に寄託されたクローンpIL-1HyのcDNAインサートのヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド；クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートから構築された
ポリヌクレオチドである配列番号：３または５のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド；クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートか
ら構築されたポリヌクレオチドである配列番号：３または５の全長タンパク質コ
ード配列を含むポリヌクレオチド；または、配列番号：３または５の成熟タンパ
ク質コード配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれるが、これ
らに限定されるものではない。

【００１６】 本発明のポリヌクレオチドは加うるに、如上のポリヌクレオチドのいずれかの
相補体を包含する。

【００１７】 本願で称するコレクションとして、唯一のポリヌクレオチドのコレクションと
することができる。 各配列の配列情報または同定情報のコレクションは、核酸
アレイに関して提供することができる。 ある態様にあっては、セグメントや配
列の情報は、そのセグメントを含んだポリヌクレオチドを検出する核酸アレイに
関して提供される。 これらアレイは、そのセグメントを含むポリヌクレオチド
に完全にマッチ（全マッチ）するか、あるいはミスマッチする核酸を検出するよ
うにデザインすることができる。 このコレクションは、コンピューターで読取
可能なフォーマットでも提供することができる。

【００１８】 本発明の単離されたポリペプチドには、配列番号：３または５のアミノ酸配列
を含むポリペプチド、配列番号：３または５の全長タンパク質；配列番号：５の
成熟タンパク質コード配列、好ましくは、SDS-PAGEによって決定された約16また
は17kDa、またはそれ以下の分子質量を有する成熟タンパク質のコード配列が包
含されるが、これらに限定されることはない。 あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、SDS-PAGEによる約15.5または約16.5kDaの分子質量を有し、または配列番
号：７または８のエクソンの一つ以上によってコードされたポリペプチドが包含
される。

【００１９】 本発明のポリペプチドにはさらに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ATCC、10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209、米
国）に寄託されたクローンpIL-1HY273のcDNAインサートによりコードされるアミ
ノ酸配列を含むポリペプチド；クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコ
ードされるアミノ酸配列から構築された配列番号：３または５の全長タンパク質
；または、クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされるアミノ酸
配列から構築された配列番号：３または５の成熟タンパク質コード配列、好まし
くは、SDS-PAGEによって決定された約16kDaまたはそれ以下、さらに好ましくは
、SDS-PAGEによって決定された約15.5kDaの分子質量を有する成熟タンパク質の
コード配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００２０】 本発明のタンパク質組成物はさらに、親水性の、例えば、薬学的に容認されう
る担体などの、容認されうる担体を含むとよい。

【００２１】 本発明はまた、ポリペプチドを製造するための方法に関し、この方法は、好適
な培養用培地にて本発明の細胞培養物を生育させる工程と、当該培養物からタン
パク質を精製する工程を含む。 好ましい実施態様には、かかる方法によって製
造されるタンパク質が、タンパク質の成熟型であるものが包含される。

【００２２】 本発明のポリヌクレオチドは、分子生物学の分野で当業者に公知の様々な技術
にて、多岐にわたって応用することができる。 これらの技術には、ハイブリダ
イゼーションプローブとしての使用、PCR用オリゴマーとしての使用、クロモソ
ームおよび遺伝子マッピングに対する使用、そしてアンチセンスDNAまたはRNA、
それらの化学的類似体の作製における使用などが包含される。 例えば、mRNAの
発現が特定の細胞または組織タイプに多大に左右される場合、本発明のポリヌク
レオチドを、例えば、in situハイブリダイゼーションなどで使用する、試料中
の特定の細胞または組織のmRNAの存在を検出するためのハイブリダイゼーション
プローブとして使用することができる。

【００２３】 他の実施態様の例として、ポリヌクレオチドは、発現遺伝子を同定するための
発現配列タグとして、あるいは、Vollrath et al.、Science、258巻、52〜59頁(
1992)で例証されているような、当該技術分野で公知のヒトゲノムの物理的マッ
ピングのための発現配列タグとして、診断において使用される。

【００２４】 本発明のポリペプチドは、現在のところ他のタンパク質に適用されている様々
な旧来の手法及び方法にて使用することができる。 例えば、本発明のポリペプ
チドは、当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製するために使用するこ
とができる。 本発明のポリペプチドは、分子量マーカーとして、また食品補助
剤としても使用することができる。

【００２５】 本発明のタンパク質と薬学的に容認されうる担体を含有する組成物を、哺乳類
被験者に治療上有効な量を投与する工程を含む、医療状態を予防、処置または緩
和するための方法も提供される。

【００２６】 さらに詳細には、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、
敗血症、急性膵炎、内毒素ショック、サイトカイン誘発性ショック、慢性関節リ
ウマチ、慢性関節炎、１型真性糖尿病による膵臓細胞損傷、対宿主性移植片病、
腸炎、肺疾患関連炎症、他の自己免疫疾患または炎症疾患、（慢性アレルギーお
よび慢性気管支炎を含む）アレルギーまたは気管支炎、急性または慢性骨髄性白
血病用または子宮内感染による早期分娩の予防のための抗増殖剤として利用する
ことができる。 特に意図しているものは、アレルギー反応または（ウィルス、
細菌、真菌、原生動物または他の生物によって引き起こされる）急性または慢性
感染に起因する炎症の処置である。

【００２７】 本発明の方法はさらに、試料中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの存在を検出するための方法に関する。 該方法は、例えば、前記した障害の
予知的および診断的評価の一部をなすものとして、またかかる病態の素因を呈す
る被験者を同定するために利用することができる。 さらに、本発明は前記した
障害の処置のための臨床試験に関わる、薬剤の有効性を評価するため、および患
者の病状の進行をモニターするための方法を提供する。

【００２８】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現
をモジュレートする化合物を同定するための方法も提供する。 かかる方法は、
例えば、前記したような障害の症状を緩和することができる化合物を同定するた
めに利用することができる。 かかる方法には、本発明のポリペプチドと相互作
用する（例えば、結合する）化合物およびその他の物質を同定するためのアッセ
イが包含されるが、これに限定されることはない。

【００２９】 本発明の方法には、前記したような障害を処置するための方法も包含され、こ
れは、前記障害に関連する症状または体質を呈する個体に、上記化合物を投与す
る工程を含んでもよい。 加えて、本発明は標的遺伝子産物の全般的な活性をモ
ジュレートする化合物およびその他の物質を投与することによって、前記疾患ま
たは障害を処置するための方法に関するものでもある。 化合物およびその他の
物質は、標的遺伝子の発現レベルまたは標的タンパク質の活性のいずれかに対し
て、かようなモジュレーションをもたらすことができるものである。

【００３０】 また、本発明は、IL-18によって媒介された炎症疾患状態の治療方法、すなわ
ち、その治療を必要とする者に、本発明のIL-1 Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプ
チドまたはアゴニストを、IL-18活性を阻害するのに効果的な量だけ投与する、
ことを含む方法も提供する。 さらに、in vitroおよびin vivoにて、IL-18活性
を阻害する方法も提供される。

【００３１】

【発明の実施の形態】

６．詳細な説明 6.1.定 義 「ヌクレオチド配列」なる語は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれら
ヌクレオチドの配列を称する。 「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる語は
、ヌクレオチドのヘテロポリマーを称し、本明細書にて互換可能に使用すること
とする。 一般に、本発明によって提供される核酸セグメントは、微生物もしく
はウイルスオペロン、または真核生物遺伝子に由来する調節エレメントを含む組
換え転写ユニットにて発現され得るものである合成核酸を提供すべく、ゲノムと
短いオリゴヌクレオチドリンカーの断片から、または一連のオリゴヌクレオチド
から、または個々のヌクレオチドから組立られたものでもよい。

【００３２】 「オリゴヌクレオチド断片」または「ポリヌクレオチド断片」、「一部分」、
または「セグメント」なる語は、mRNAまたはDNA分子の同じかまたは関連する一
部分を、同定または増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または様々なハイブ
リダイゼーション法で使用するのに充分な長さを有する、ポリペプチドヌクレオ
チド残基のストレッチを称する。

【００３３】 「オリゴヌクレオチド」または「核酸プローブ」は、本発明で提供されるポリ
ヌクレオチド配列に基づいて調製される。 オリゴヌクレオチドは、少なくとも
約15ヌクレオチド、そして通常少なくとも約20ヌクレオチドを有するような、ポ
リヌクレオチド配列の一部を含むものである。 核酸プローブは、約６kbよりも
少ないヌクレオチド、通常約１kbよりも少ないヌクレオチドを有するようなポリ
ヌクレオチドの一部分を含む。 偽陽性を排除すべく適切に試験を行った後、こ
れらのプローブは、例えば、細胞または組織に特異的mRNA分子が存在するか否か
を調べるために、またはWalsh et al（Walsh, P.S. et al., 1992、PCR Methods
Appl 1巻、241〜250頁）に記載される通り、クロモソームDNAから類似の核酸配
列を単離するために使用してもよい。

【００３４】 「プローブ」の語には、天然に存在するか、または組換え合成もしくは化学合
成された、一本鎖または二本鎖核酸が包含される。 プローブは、ニックトラン
スレーション、クレノウ・フィルイン反応、PCRまたは当該技術分野でよく知ら
れている他の方法によって標識付けするとよい。 本発明のプローブ、その調製
および／または標識付けは、Sambrook, J. et al., 1989、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; またはAusubel, F
. M. et al., 1989、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, ニューヨークNYに詳説されており、双方の文献とも引用することによって
その開示内容全体を本明細書に組入れることとする。

【００３５】 「ストリンジェント」なる語は、当該技術分野にてストリンジェントとして一
般に理解される条件を称する。 ストリンジェントな条件には、高いストリンジ
ェンシーの条件（すなわち、0.5 M NaHPO₄、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、
1 mM EDTAで65℃にてフィルターに結合したDNAにハイブリダイゼーションさせ
、そして68℃にて0.1×SSC/0.1％SDSで洗浄する）、および中程度のストリンジ
ェンシーの条件（すなわち、42℃にて0.2×SSC/0.1％SDSで洗浄する）が包含さ
れ得る。

【００３６】 デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合には、さ
らなる例となるハイブリダイゼーション条件に、37℃（14塩基のオリゴに対して
）、48℃（17塩基のオリゴに対して）、55℃（20塩基のオリゴに対して）、およ
び60℃（23塩基のオリゴに対して）にて、6×SSC/0.05％ピロホスフェートナト
リウムでの洗浄が包含される。

【００３７】 「組換え」の語は、本明細書においてポリペプチドまたはタンパク質を言及す
るのに用いる場合、ポリペプチドまたはタンパク質が組換え（例えば、微生物ま
たは哺乳動物）発現系に由来することを意味する。 「微生物」では、細菌また
は真菌（例えば、酵母）発現系で製造される組換えポリペプチドまたはタンパク
質を言及するものとする。 産物として、「組換え微生物」は元来の内在性物質
が実質的に含まれず、そして元来付随しているグリコシル化を伴う、ポリペプチ
ドまたはタンパク質で定義される。 ほとんどの細菌培養物、例えば、大腸菌の
培養物中で発現されるポリペプチドまたはタンパク質には、グリコシル化の修飾
はないはずであり、また酵母で発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、哺
乳動物細胞で発現されるものと概して相違するグリコシル化を有しているはずで
ある。

【００３８】 「組換え発現媒体またはベクター」なる語は、DNA(RNA)配列からポリペプチド
を発現するための、プラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを
称することとする。 発現媒体は、(1) 例えば、プロモーター、エンハンサー等
、遺伝子発現において調節的な役割を有している単数または複数の遺伝的エレメ
ント、(2) mRNAに転写されてタンパク質に翻訳される構造配列またはコーディン
グ配列、および(3) 適切な転写開始および終結配列、を組合わせたものを含む転
写ユニットを含んでいることができる。 酵母または真核細胞発現系での使用が
意図される構造ユニットには、好ましくは宿主細胞によって翻訳されるタンパク
質の細胞外分泌を可能ならしめるリーダー配列が含まれる。 あるいは、リーダ
ーまたは輸送配列無しに組換えタンパク質が発現される場合には、Ｎ−末端メチ
オニン残基を含んでいてもよい。 この残基は、その後引き続いて、発現された
組換えタンパク質から切除されてもされなくてもよく、しかして最終産物が得ら
れる。

【００３９】 「組換え発現系」なる語は、染色体DNAに組換え転写ユニットが安定に組込ま
れている宿主細胞、または染色体外に組換え転写ユニットを担持する宿主細胞を
意味する。 本明細書にて定義される組換え発現系は、発現されるべきDNAセグ
メントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントの誘導に際して、異種性ポ
リペプチドまたはタンパク質を発現するはずである。 この用語はまた、例えば
、プロモーターまたはエンハンサー等の、遺伝子発現において調節的な役割を有
している単数または複数の組換え遺伝子エレメントを安定に組込んだ宿主細胞も
含意する。 本明細書にて定義される組換え発現系は、発現されるべき内在性DN
Aセグメントまたは遺伝子に連結された調節エレメントの誘導に際して、細胞に
とって内在性のポリペプチドまたはタンパク質を発現するはずである。 細胞は
、原核細胞でも真核細胞でもよい。

【００４０】 「読み取り枠（オープンリーディングフレーム）」のORFなる語は、終止コド
ンを全く含まず、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレットを意味
し、そしてタンパク質に転写可能な配列のことである。

【００４１】 「発現モジュレーティング断片」のEMFなる語は、作動可能に連結されたORFま
たは他のEMFの発現をモジュレートする、一連のヌクレオチドを意味する。

【００４２】 本明細書にて使用する場合、EMFの存在によって配列の発現が変化する場合に
、配列が「作動可能に連結された配列の発現をモジュレートする」と称される。
EMFには、プロモーター、およびプロモーターをモジュレートする配列（誘導可
能エレメント）が包含されるが、これらに限定されることはない。 EMFのある
クラスは、特異的な調節因子または生理的事象に応答して作動可能に連結された
ORFまたは発現を誘導する断片である。

【００４３】 本明細書で使用する場合、「取り込みモジュレーティング断片」のUMFとは、
連結されたDNA断片の細胞への取り込みを媒介する一連のヌクレオチドを意味す
る。 UMFは、コンピューターに基づく下記システムで、標的配列または標的モチーフ
として知られているUMFを使用して容易に同定することができる。

【００４４】 UMFの存在と活性は、候補となるUMFをマーカー配列に付けることによって確認
することができる。 この結果得られる核酸分子は次いで、適切な条件下に適切
な宿主と共にインキュベートされ、そしてマーカー配列の取り込みが調べられる
。 前記したとおり、UMFは連結されたマーカー配列の取り込みの頻度を増加さ
せるはずである。

【００４５】 「活性体」なる語は、天然に存在する種々のポリペプチドの生物学的および／
または免疫学的活性を保持するポリペプチドのフォームを称するものとする。

【００４６】 「天然に存在するポリペプチド」なる語は、遺伝的に操作されていない細胞に
よって製造されるポリペプチドを称し、特に、アセチレーション、カルボキレー
ション、グリコシレーション、ホスホリレーション、リピデーションおよびアシ
レーションを含め、これらに限定されないが、ポリペプチドの転写後修飾が認め
られる様々なポリペプチドを含意する。

【００４７】 「誘導体」なる語は、通常にはヒトタンパク質に生じないような、ユビキチン
結合、ラベリング（例えば、放射性核種または様々な酵素を用いたラベリング）
、ペギレーション（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、およびオルニチン
のようなアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術により化学的に修
飾されたポリペプチドを称する。

【００４８】 「組換え変異体」なる語は、組換えDNA技術を使用して作出された、アミノ酸
挿入、欠失および置換により天然に存在するポリペプチドとは相違する種々のポ
リペプチドを称するものとする。 細胞輸送など目的となる活性を損なうことな
く、いずれのアミノ酸残基を置換、付加または欠失すればよいかを決定する上で
の方針は、特定のポリペプチドの配列を相同性ペプチドの配列と比較し、そして
相同性が高い領域になされるアミノ酸配列の変化の数を最小化することによって
見出され得るものである。

【００４９】 好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造的および／
または化学的特性を有する別のアミノ酸に置換えた結果、すなわち、保存的アミ
ノ酸置換であるとよい。 アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、可溶性
、疎水性、親水性および／または両親媒性に基づいてなされるとよい。 例えば
、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが包含され、
極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン
、アスパラギンおよびグルタミンが包含され、正荷電（塩基性）アミノ酸には、
アルギニン、リジンおよびヒスチジンが包含され、そして負荷電（酸性）アミノ
酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が包含される。 「挿入」または「
欠失」は、典型的には約１〜５個のアミノ酸の範囲とする。 組換えDNA技術を
使用し、そして得られる組換え変異体の活性をアッセイして、ポリペプチド分子
にアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に行うことにより、許容される変更
を実験的に決定してもよい。

【００５０】 あるいは、機能の改変が所望される場合には、挿入、欠失または保存的でない
変更を施して、改変型ポリペプチドを製造することができる。 かかる改変によ
って、例えば、本発明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特性の１以
上を変更することができる。 例えば、かような改変は、リガンド結合親和性、
鎖間親和性、または分解／回転速度などのポリペプチドの特性を変化させ得る。
さらに、かかる改変は、発現のために選択された宿主細胞における、発現、スケ
ールアップ等により適したポリペプチドを作製するように選択することができる
。 例えば、ジスルフィド架橋を除くために、システイン残基を欠失させるか、
または別のアミノ酸に置換することができる。

【００５１】 本明細書にて使用される場合、「実質的に同等」なる語は、ヌクレオチド配列
とアミノ酸配列の双方について、例えば、変異体配列など、参照配列と対象配列
との間で、その総合的な効果が悪影響をもたらすような機能的不同性を惹起しな
い、１以上の置換、欠失または付加により参照配列とは異なる配列を言及できる
ものとする。 通常、このような実質的に同等な配列は、本明細書に開示した配
列の１つとの相違が20％を超えないものである（すなわち、実質的に同等な配列
における個々の残基の置換、付加および／または欠失の数を、対応する参照配列
と比較して実質的に同等な配列中の総残基数で割った数が、約0.2以下である）
。 このような配列は、前掲の配列と80％の配列一致性を有すると言われている。 ある実施態様において、本発明の実質的に同等の、例えば、変異体の配列は、開
示した配列との相違が10％を超えず（90％の配列一致性）、さらなる実施態様で
は５％を超えず（95％の配列一致性）、そしてさらなる実施態様においては、２
％を超えない（98％の配列一致性）。 本発明の実質的に同等な、例えば、変異
体のアミノ酸配列は概して、前掲のアミノ酸配列と少なくとも約95％の配列一致
性を有し、一方、本発明の実質的に同等なヌクレオチド配列は、例えば、遺伝コ
ードの重複または縮重を考慮して、さらに低いパーセンテージの配列一致性を有
することができる。 本発明の目的のため、実質的に同等な生物学的活性および
実質的に同等な発現特性を有する配列は、実質的に同等と考えられる。 同等性
を調べるために、成熟配列のトランケーション（例えば、偽の終止コドンを作出
する変異によるものなど）は無視されるべきである。

【００５２】 このような実質的に同等な配列をコードする核酸配列、例えば、上記の一致率
を有する配列は、当業者に公知の標準的なハイブリダイゼーション法によって、
所定のとおりに単離および同定することができる。

【００５３】 所望の場合、ポリペプチドが細胞膜を透過するように導く「シグナルまたはリ
ーダー配列」を含むように、発現ベクターを設計してもよい。 このような配列
は、本発明のポリペプチドに自然に存在していても、または組換えDNA技術によ
り異種タンパク質供給源から供給されても構わない。

【００５４】 ポリペプチド「断片」、「部分」または「セグメント」は、少なくとも約５個
のアミノ酸、場合によっては少なくとも約７個のアミノ酸、通常は、少なくとも
約９〜13個のアミノ酸、そして多くの実施態様にあっては、少なくとも約17個以
上のアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。 活性であるためには、いず
れのポリペプチドも生物学的および／または免疫学的活性を呈するのに充分な鎖
長を有していなければならない。 好ましい実施態様によれば、IL-1 Hy1断片は
、SDS-PAGEによって決定された約16kDaまたはそれ以下の分子重量を有している
。 より好ましくは、このIL-1 Hy1断片は、約15.5kDaの分子質量を有している。

【００５５】 あるいは、同一または類似のこれらポリペプチドをコードする組換え変異体は
、遺伝コードの「縮重」を利用することによって合成または選択され得る。 様
々な制限部位を作り出すサイレント変化などの様々なコドンの置換を、特定の原
核細胞系または真核細胞系でのプラスミドもしくはウイルスベクターへのクロー
ニングや発現を至適化するように導入してもよい。 ポリヌクレオチド配列での
変異は、そのポリペプチドのいずれかの部分の特性を修飾して、リガンド結合親
和性、鎖間親和性または分解／回転速度などの特性を変化させるように、ポリペ
プチドに付加されるポリペプチドまたは他のポリペプチドのドメインを反映する
ものである。

【００５６】 本願で使用される「活性化された」細胞は、正常または疾患プロセスの一部を
担う神経分泌分子または酵素分子の移送を含めた、細胞外または細胞内膜輸送に
関与するものである。

【００５７】 本明細書中で使用する「精製された」なる語は、核酸またはポリペプチドに、
他の生物学的高分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質などが実質的に存
在しないことを表す。 ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは、前出の生物学的高分子で少なくとも95重量％、より好ましくは少なく
とも99.8重量％を構成するように精製される（但し、水、緩衝液および他の小分
子、特に1000ダルトン未満の分子量を有する分子は共存していてよい）。

【００５８】 本明細書にて使用される「単離された」なる語は、天然の供給源においてその
核酸またはポリペプチドと共に存在している少なくとも１つの他の成分（例えば
、核酸またはポリペプチド）から分離した核酸またはポリペプチドである。 あ
る実施態様によれば、核酸またはポリペプチドは、（何かあるとしても）溶媒、
緩衝剤、イオンまたはその溶液に通常存在する他の成分のみの存在下にある。 「単離された」および「精製された」なる語は、それらの天然の供給源中に存在
する核酸またはポリペプチドを包含するものではない。

【００５９】 「感染」なる語は、ウイルスまたはウイルスベクターを使用することにより、
好適な宿主細胞に核酸を導入することを称する。

【００６０】 「形質転換」なる語は、染色体外エレメントとしてか、または染色体への組込
みによって、DNAが複製可能となるように、好適な宿主細胞にDNAを導入すること
を意味する。

【００６１】 「トランスフェクション」なる語は、何らかのコーディング配列が実際に発現
されているか否かを問わず、好適な宿主細胞によって発現ベクターが保有されて
いることを称する。

【００６２】 「中間断片」なる語は、５〜1000塩基の鎖長、好ましくは10〜40塩基対の鎖長
を有する核酸を意味する。

【００６３】 「分泌」とは、好適な宿主細胞にて発現された場合に、そのアミノ酸配列のシ
グナル配列による結果としての輸送を含め、膜を越えて、または通過して輸送さ
れたタンパク質を称する。 「分泌」タンパク質には、発現細胞から全体（例え
ば、可溶性タンパク質）または一部（例えば、受容体）が分泌されるタンパク質
を包含するが、これらに限定されない。 また、「分泌」タンパク質は、非典型
的なシグナル配列を含むタンパク質（例えば、インターロイキン-1β、Krasney,
P.A.およびYoung, P.R. (1992）Cytokine 4(2): 134-143を参照)や、損傷細胞
からの遊離因子（例えば、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト、Arend, W
.P. et al. (1998) Annu.Rev.Immunol. 16:27-55を参照)をも包含する。

【００６４】 以上の用語はそれぞれ、別途の内容が述べられない限り、上記内容すべてを包
含するものとする。

【００６５】 本発明の核酸およびポリペプチド 本発明のヌクレオチド配列および核酸配列を以下に示す。 生物学的活性を呈
することができる本発明のタンパク質の断片も、本発明に包含される。 タンパ
ク質の断片は、一本鎖状でも、あるいは、例えば、共に引用することによって本
明細書に組入れた、H. U. Saragoviら、Bio/Technology 10巻、773〜778頁(1992
)およびR. S. McDowellら、J. Amer. Chem. Soc. 114巻、9245〜9253頁(1992)に
記載されるような既知の方法を使用して環状化してもよい。 このような断片は
、タンパク質結合部位の結合価の増大を含め、多くの目的のために、免疫グロブ
リンなどの担体分子に融合させてもよい。 例えば、タンパク質の断片は、免疫
グロブリンのFc部分に「リンカー」配列を介して融合させるとよい。 二価のフ
ォームのタンパク質の場合、IgG分子のFc部分へ、そのような融合を行うとよい
。 他の免疫グロブリンイソタイプも、このような融合体を作製するために使用され
得る。 例えば、タンパク質-IgM融合体が、本発明のタンパク質の二価のフォー
ムで作製されよう。

【００６６】 本発明はさらに、開示されたタンパク質の全長および成熟フォーム（例えば、
シグナル配列または前駆体配列を含まないもの）の双方を提供する。 かかるタ
ンパク質の全長のフォームは、各々開示されたクローンのヌクレオチド配列の翻
訳により、配列表に示されている。 かかるタンパク質の成熟フォームは、好適
な哺乳動物細胞またはその他の宿主細胞にて、開示された全長のポリヌクレオチ
ドを発現することによって得られる。 本発明のタンパク質が膜結合性である場
合、本発明によってかかるタンパク質の可溶性フォームも提供される。 このよ
うなフォームにあっては、タンパク質がその発現細胞からタンパク質が完全に分
泌させるべく、膜結合するタンパク質をもたらす領域の一部または全部は削除さ
れる。

【００６７】 本発明はまた、本明細書に開示されるcDNA配列に対応する遺伝子も提供する。
対応する遺伝子は、本明細書に開示される配列情報を使用して、既知の方法に従
って単離することができる。 このような方法は、同定のために開示された配列
情報からプローブまたはプライマーを調製し、および／または適切なゲノムライ
ブラリーもしくは遺伝的材料の他の供給源にて遺伝子を増幅することを含む。 開示されたポリヌクレオチドおよびタンパク質の種相同体も、本発明によって提
供される。 種相同体は、本明細書に提供された配列から好適なプローブまたは
プライマーを作り、そして所望の種由来の好適な核酸供給源をスクリーニングす
ることによって単離および同定することができる。 本発明はさらにまた、開示
されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立変異体、すなわち、そのポリヌ
クレオチドによってコードされるものと同一、相同またはそれに関連するタンパ
ク質もコードする単離されたポリヌクレオチドの天然に存在する選択的フォーム
をも包含する。 本発明の組成物は、組換えDNA分子、クローニングされた遺伝
子もしくはその縮重変異体、特に、対立変異体などの天然に存在する変異体、単
離された新規ポリペプチド、およびかかるポリペプチドに存在する１つ以上のエ
ピトープを特異的に認識する抗体を包含する。 開示されたポリヌクレオチドお
よびタンパク質の種相同体も、本発明によって提供される。 種相同体は、本明
細書で提供される配列から好適なプローブまたはプライマーを作り、そして所望
の種由来の好適な核酸供給源をスクリーニングすることによって単離され得る。

【００６８】 本発明はまた、開示されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立変異体、
すなわち、そのポリヌクレオチドによってコードされるものと同一、相同または
それに関連するタンパク質もコードする単離されたポリヌクレオチドの天然に存
在する選択的フォームをも包含する。

【００６９】 6.2.本発明の核酸 本発明の単離されたポリヌクレオチドには、配列番号：３または５のアミノ酸
配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが包含されるが、これに
限定されない。

【００７０】 本発明の単離されたポリヌクレオチドには、配列番号：１、２、４または６の
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号：１、２、４または６の全
長タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号：１、２、４
または６の成熟タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドがさらに包含され
るが、これらに限定されない。 本発明のポリヌクレオチドには、ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下に、配列番号：１、２、４または６のヌク
レオチド配列の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド、前出のポリヌク
レオチドのいずれかの対立変異体であるポリヌクレオチド、前出のタンパク質の
いずれかの種相同体をコードするポリヌクレオチド、または、配列番号：１、２
、４または６のポリペプチドの特有のドメインまたはその先端が切除されたポリ
ペプチドがさらに包含されるが、これらに限定されない。

【００７１】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：７または８のゲノミック
クローンのヌクレオチド配列；配列番号：７または８の一つ以上のエクソンから
（例えば、選択的に接合して）構築したポリヌクレオチド；配列番号：７または
８の一つ以上のイントロンから構築したポリヌクレオチド；配列番号：７または
８の一つ以上のエクソンと配列番号：７または８の一つ以上のイントロンから構
築したポリヌクレオチド；配列番号：７または８の全長タンパク質コード配列を
含んでなるポリヌクレオチド；配列番号：７または８の成熟タンパク質コード配
列のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドをさらに含むが、これらに
限定されない。

【００７２】 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：７または８のヌクレオチド配列の相
補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチド；配列番号：７または８のイントロンまたはエクソンのいずれ
か一つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチド；前記したポリヌクレオチドのいずれかの対立変異
体であるポリヌクレオチド；前記したタンパク質のいずれかの種相同体をコード
するポリヌクレオチド；または、配列番号：７または８のポリペプチドに特有の
ドメインまたはその先端が切除されたポリペプチドを含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをさらに含むが、これらに限定されない。

【００７３】 本発明のポリヌクレオチドはさらにまた、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ATCC、10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-22
09、米国）に寄託されたクローンpIL-1Hy273のcDNAインサートのヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド；クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートから構築され
たポリヌクレオチドである配列番号：３または５のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド；クローンpIL-1Hy273のcDNAインサート
から構築されたポリヌクレオチドである配列番号：３または５の全長タンパク質
コード配列を含むポリヌクレオチド；または、配列番号：３または５の成熟タン
パク質コード配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれるが、こ
れらに限定されない。

【００７４】 本発明のポリヌクレオチドは加うるに、如上のポリヌクレオチドのいずれかの
相補体を包含する。

【００７５】 本発明のポリヌクレオチドはまた、前記ポリヌクレオチドと実質的に同等なヌ
クレオチド配列も包含される。 本発明のポリヌクレオチドは、前記したポリヌ
クレオチドと少なくとも約80％、より好ましくは通常は少なくとも約90％、そし
てさらに好ましくは通常は少なくとも約95％の配列一致性を有することができる
ものである。 本発明はさらに、前記したポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドと少なくとも約80％、より好ましくは通常は少なくとも約90％、そしてさ
らに好ましくは通常は少なくとも約95％の配列一致性を有するヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチドの相補体も提供する。 ポリヌクレオチドは、DNA（ゲ
ノム、cDNA、増幅または合成したDNA）またはRNAであり得る。 このようなポリ
ヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは、当業者によく知られてお
り、そして、例えば、所望の配列のポリヌクレオチドを常套的に単離することが
できるハイブリダイゼーション条件を調べるための方法を包含し得る。

【００７６】 本発明のポリヌクレオチドは、よく樹立された組換えDNA技術によって、様々
な他のヌクレオチド配列のいずれかに繋ぐことができる（Sambrook, J.ら(1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
NYを参照されたい）。 ポリペプチドに繋ぐ上で有用なヌクレオチド配列には、
当該技術分野でよく知られている、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、
ラムダファージ誘導体、ファージミド等の組合せが包含される。 従って、本発
明はまた、本発明のポリヌクレオチドを包含するベクター、およびポリヌクレオ
チドを含む宿主細胞も提供する。 一般に、ベクターは、少なくとも１つの生物
にて機能を有する複製起点と、利便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主
細胞用の選択可能マーカーを含んでいる。 本発明のベクターは、発現ベクター
、複製ベクター、プローブ作製用ベクターおよび配列決定ベクターを包含する。
本発明の宿主細胞は、原核細胞または真核細胞とすることができ、そして単細胞
生物でも多細胞生物の一部でもよい。

【００７７】 本発明のポリヌクレオチドは、機能性IL-1 Hy1の発現ができない、あるいはIL
-1 Hy1の変異体を発現する動物に関する、例えば、相同組み換えまたはノックア
ウト戦略を介して開発することもできる。 かような動物は、IL-1 Hy1のin
vivo活性の研究ならびにIL-1 Hy1のモジュレーターの研究におけるモデルとして
有用である。

【００７８】 本発明のポリペプチドのin vivoでの生物学的機能を決定する好ましい方法に
あっては、本発明によって提供された一つ以上の遺伝子が、動物の生殖系列にお
いて、相同組換えを用いて過剰発現されるか、あるいは不活性化される［Capecc
hi, Science 244: 1288-1292 (1989)］。 内因性または外因性プロモーター要
素の調節制御下で遺伝子が過剰発現されている動物は、トランスジェニック動物
として知られている。 相同組換えによって内因性遺伝子が不活性化されている
動物は、「ノックアウト」動物と称されている。 ノックアウト動物、好ましく
は、ヒト以外の動物は、本明細書に参考までに組み込んだ米国特許第5,557,032
号に記載されているようにして調製することができる。 トランスジェニック動
物は、生物学的プロセス、好ましくは疾患状態での本発明のポリペプチドの役割
を決定する上で有用である。 トランスジェニック動物は、脂質代謝をモジュレ
ートする化合物を同定するモデルシステムとして有用である。 トランスジェニ
ック動物、好ましくは、ヒト以外の動物は、本明細書に参考までに組み込んだ米
国特許第5,489,743号およびPCT公開公報第WO 94/28122号に記載されているよう
にして調製することができる。

【００７９】 本発明のポリペプチドの発現レベルを改変するために、本発明のポリヌクレオ
チドの全部または一部においてプロモーターが活性化または不活性化されたトラ
ンスジェニック動物を調製することができる。 上述した相同組換え法を用いて
不活性化を果たすことができる。 タンパク発現を高めるために、相同プロモー
ターを補充または対等に置換することで、活性化を果たすことができる。 相同
プロモーターは、特定の組織にプロモーター活性を付与することが知られている
一つ以上の異種エンハンサー要素を挿入して補充することができる。

【００８０】 IL-1 Hy1 DNA配列の知識は、内因性IL-1 Hy1の発現を許容または改善するため
の細胞の改変を可能ならしめる。 細胞がIL-1 Hy1を高レベルで発現せしめるべ
く、異種プロモーターの全部または一部を用いて、（例えば、相同組換えによっ
て）天然に産するIL-1 Hy1プロモーターの全部または一部を置換して、IL-1 Hy1
の発現を高めるために、細胞を修飾することができる。 配列をコードするIL-1
Hy1に作動可能に結合するよう、異種プロモーターは挿入される。 例えば、PCT
国際公開公報第WO94/12650号、PCT国際公開公報第WO92/20808号、およびPCT国際
公開公報第WO91/09955号を参照されたい。 異種プロモーターDNAに加えて、増
幅可能なマーカーDNA（例えば、ada、dhfr、それに、カルバミルリン酸シンター
ゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼをコード
する多機能性CAD遺伝子）および／またはイントロンDNAが、異種プロモーターDN
Aと同様にして挿入することができる。 IL-1 Hy1コーディング配列に結合して
いる場合に、標準的な選択方法によるマーカーDNAの増幅を行うと、細胞内にてI
L-1 Hy1コーディング配列が共増幅される。

【００８１】 本発明の範囲に含まれる配列は、記載した特定の配列に限定することはなく、
その対立変異体をも包含するものである。 対立変異体は、配列番号：１、２、
４、６、７または８で示される配列、それらの代表的な断片、または配列番号：
１、２、４、６、７または８と少なくとも99.9％一致するヌクレオチド配列を、
同種の別の単離物由来の配列と比較することによって容易に調べることができる
。 さらには、コドンの可変性に対応するよう、本発明は本明細書に開示した特
定のORFがコードすると同様のアミノ酸配列をコードする核酸分子をも包含する
。 換言すると、ORFのコーディング領域で、１つのコドンを同じアミノ酸をコード
する別のコドンに置換することなどは明らかに企図される。 双方向でORFなど
特定の断片の再配列（すなわち、両鎖の配列）決定を行うことによって、本明細
書に開示した特定の配列のいずれも、エラーについて簡単にスクリーニングでき
る。

【００８２】 本発明はさらに、配列番号：１、２、４、６、７または８またはその断片の配
列を有する核酸を含む組換え構築体を提供する。 本発明の組換え構築体は、プ
ラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含む、そのベクター中に正方
向または逆方向にて配列番号：１、２、４、６、７または８、またはその断片の
配列が挿入されている。 本発明のORFの１つを含むベクターの場合、ベクター
は、ORFに作動可能に連結された、例えば、プロモーターなどを包含する調節配
列をさらに含んでいるとよい。 本発明のEMFおよびUMFを含むベクターについて
は、ベクターはさらにEMFまたはUMFと作動可能に連結されたマーカー配列または
異種性ORFを含むとよい。 数多くの好適なベクターおよびプロモーターが当業
者によって知られており、本発明の組換え構築体を作製するために市場で入手す
ることができる。 以下のベクターが、例として挙げられる。 細菌用：pBs、p
hagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH4
6a（Stratagene）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia
）。 真核生物用：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG（Stratagene）、pSVK3
、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）。

【００８３】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、組換え法によってタンパク質を生産
するために、Kaufmanら、Nucleic Acids Res. 19巻、4485〜4490頁(1991)に開示
されるpMT2またはpED発現ベクターなどの発現制御配列に作動可能に連結しても
よい。 多くの好適な発現制御配列が、当該技術分野で知られている。 組換え
タンパク質を発現する一般的な方法も知られているところであり、R. Kaufman、
Methods in Enzymology、185巻、537〜566頁(1990)に例証されている。 本明細
書における「作動可能に連結される」なる語は、連結されたポリヌクレオチド／
発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）されている宿主細胞によってタン
パク質が発現するように、本発明の単離されたポリヌクレオチドと発現制御配列
とが、ベクターまたは細胞内に適応することを意味する。

【００８４】 プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクタ
ーまたは選択可能マーカーを有するその他のベクターを用いて、所望の種々の遺
伝子から選択され得る。 ２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である
。 特に好ましい細菌性プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP _R およびtrcが包含される。 真核細胞性プロモーターには、CMV初期、HSVチミジ
ンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメ
タロチオネイン-Iが包含される。 適切なベクターおよびプロモーターの選択は
、当該技術分野の通常技術レベル内のものである。 一般に、組換え発現ベクタ
ーは、複製起点と、例えばE. coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS. cerevisi ae TRP1遺伝子などの、宿主細胞の形質転換を可能ならしめる選択可能マーカーと
、そして下流の構造遺伝子の直接転写をもたらす、高発現遺伝子由来のプロモー
ターとを包含する。 かかるプロモーターは、とりわけ3-ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ(PGK)、a-因子、酸ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質などの糖
分解酵素をコードするオペロン由来のものが好ましい。 異種性構造配列は、転
写開始および終結配列と、そして好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞膜周
辺空間または細胞外培地への直接分泌をもたらすことができるリーダー配列と共
に、適切な相にて構築される。 任意に、異種性配列は、発現される組換え産物
の安定化またはその精製を容易にするためなどの、望ましい特徴を付与するＮ−
末端同定ペプチドを包含する融合タンパク質をコードし得るものとされる。 細
菌用の有用な発現ベクターは、機能性プロモーターを有する作動可能な読み取り
相にて、好適な翻訳開始および終結シグナルと共に、所望のタンパク質をコード
する構造DNA配列を挿入することによって構築される。 ベクターは、その保持
を確約すべく、また望まれる場合に宿主での増幅を提供すべく、１以上の表現型
選択可能マーカーと複製起点とを含んでいる。 形質転換のために好適な原核細
胞性宿主には、E. coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimuriumおよびシ
ュードモナス、ストレプトミセス、およびスタフィロコカス属に含まれる様々な
種が包含されるが、選択肢としてその他のものも可能である。

【００８５】 代表的であるが限定的ではない例として、細菌に対して有用な発現ベクターで
は、よく知られているクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメ
ントを含む市販のプラスミドに由来する、選択可能マーカーおよび細菌性複製起
点を含むものを挙げることができる。 かかる市販のベクターには、例えば、pK
K223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Uppsala、スウェーデン）およびGEM 1（Pr
omega Biotec、Madison、ウィスコンシン州、米国）が包含される。 これらpBR
322の「背骨」セクションは、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組合わせられる。 好適な宿主株を形質転換し、そして適切な細胞密度にな
るまで宿主株を生育した後、選択されたプロモーターを適切な手段（例えば、温
度シフトまたは化学的誘導）によって誘導または抑制解除し、そして細胞をさら
なる期間にわたって培養する。 通常は、細胞は遠心分離によって回収され、物
理的または化学的手段によって破壊され、そして、その結果得られる粗抽出物を
集めてさらに精製する。

【００８６】 本発明の核酸配列の範囲に包含されるのは、図２、５、８または９に示すDNA
配列またはその相補体の配列の断片に、ストリンジェント条件下でハイブリダイ
ズする核酸配列であり、前記断片は約10塩基対を超え、好ましくは約20〜50塩基
対か、100塩基対をさらに超えるものであるとよい。 本発明によれば、新規核
酸、またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列は、かかる核酸
またはその機能的等価物の適切な宿主細胞における発現をもたらす組換えＤＮＡ
分子を作製するために使用してもよい。

【００８７】 本発明の核酸配列はさらに、前記核酸の変異体をコードする配列にも関する。
これら変異アミノ酸配列は、天然または変異ポリヌクレオチドに適切なヌクレオ
チドの変更を導入することにより当該技術分野で知られている方法によって調製
することができる。 変異アミノ酸配列の構築には２つの変化因子、すなわち、
変異の位置および変異の性質がある。 当該核酸の変異アミノ酸配列は、好まし
くは、自然状態では起こらないアミノ酸配列を与えるようにポリヌクレオチドを
変異させることによって構築される。 これらアミノ酸の変化は、異なる種由来
の核酸で異なる部位（可変部位）にて、または保存性の高い領域（定常領域）で
作ってもよい。 このような位置にある部位は、好ましくは、例えば、先ず保存
的選択（例えば、疎水性アミノ酸を異なる疎水性アミノ酸とし）で、その後もっ
と隔たった選択（例えば、疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸とし）で、置換を行う
ことにより系列的に修飾し、次いで、標的部位で削除または挿入を行ってもよい
。 アミノ酸配列の削除は、一般に、約１〜30残基、好ましくは約１〜10残基の
範囲で、好ましくは隣接しているとよい。 アミノ酸の挿入には、１〜100残基
以上の鎖長の範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合と、さらに１また
は複数のアミノ酸残基の配列内への挿入が包含される。 配列内への挿入は、約
１〜10アミノ酸残基、好ましくは１〜５残基の範囲であるとよい。 末端への挿
入の例には、異なる宿主細胞における分泌のため、または細胞内標的化のために
必要とされる異種性シグナル配列が包含される。

【００８８】 好ましい方法において、新規核酸をコードするポリヌクレオチドは、部位特異
的突然変異誘発によって変更される。 この方法では、所望の変異アミノ酸のポ
リヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列と、さらに、変更され
る部位の両端側いずれにも安定な二重鎖を形成するよう変更されたアミノ酸の両
側の充分な隣接するヌクレオチドとを使用する。 一般に、部位特異的突然変異
誘発の技術は、当業者にはよく知られており、そしてこの技術はEdelmanら、DNA
、２巻、183頁(1983)などの出版物に例示されている。 ポリヌクレオチド配列
に部位特異的な変更を作り出すための汎用性があり有効な方法が、Zollerおよび
Smith、Nucleic Acids Res. 10巻、6487〜6500頁(1982)に公開されている。 新
規核酸の変異アミノ酸配列を作出するために、PCRを使用してもよい。 少量の
鋳型DNAを出発物質として使用する場合、鋳型DNAにおける対応領域と配列上僅か
に相違するプライマーで、所望の変異アミノ酸配列を作製することができる。
PCR増幅の結果、プライマーにより特定される位置でそのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドの鋳型と相違するDNA断片の産物の一集団が生じるのであ
る。 DNA断片の産物は、プラスミドの対応する領域と置き換わり、そしてこの結果、
所望の変異アミノ酸配列が得られる。

【００８９】 変異アミノ酸配列を作製するためのさらなる技術として、Wellsら、Gene、34
巻、315頁(1985)に記載のカセット突然変異誘発技術；ならびに、例えばSambroo
kら、前出、およびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelらにおけ
る技術など、当該技術分野にてよく知られている他の突然変異誘発技術がある。

【００９０】 遺伝コードが本来有する縮重のため、これら新規核酸のクローニングおよび発
現のために本発明を実施するに際して、実質的に同様のまたは機能的に同等なア
ミノ酸配列をコードする他のDNA配列を使用することもできる。 かようなDNA配
列には、ストリンジェント条件下に適切な新規核酸配列とハイブリダイズするこ
とができるDNA配列が包含される。

【００９１】 本発明のポリヌクレオチドは、免疫応答を引き出すために使用することもでき
る。 例えば、本明細書に参考までに取り込んだ、Fan et al., Nat. Biotech.
17:870-872 (1999)に記載されているように、ポリペプチドをコードする核酸配
列を、裸出プラスミドDNAの局所投与、または当該DNAの注射、好ましくは、筋内
注射の後に、コードしたポリペプチドに対する抗体を産生する目的で使用するこ
とができる。 好ましくは、これら核酸配列は、組換え発現ベクターに挿入され
、そして、裸出DNAの形態とすることができる。

【００９２】 6.3.宿 主 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝的に操作された
宿主細胞を提供する。 例えば、かかる宿主細胞は、既知の形質転換、トランス
フェクションまたは感染法を使用して、宿主細胞へと導入された本発明の核酸を
含む。 本発明はさらにまた、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝
的に操作された宿主細胞を提供するもので、かかるポリヌクレオチドは、細胞で
のポリヌクレオチドの発現を駆動する、宿主細胞とは異種性の調節配列と作動的
会合関係にある。

【００９３】 宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核生物の宿主細胞、酵母細胞などの下
等真核生物の宿主細胞であってよく、または、細菌細胞などの原核生物細胞でも
よい。 宿主細胞への組換え構築体の導入は、カルシウムホスフェートトランス
フェクション、DEAE、デキストランを用いたトランスフェクションまたはエレク
トロポレーション（Davis, L.ら、Basic Methods in Molecular Biology (1986)
）によって行うことができる。 本発明のポリヌクレオチドの１つを含む宿主細
胞は、単離断片によってコードされる遺伝子産物を製造する旧来の方法にて使用
することができ（ORFの場合）、あるいはEMFの制御下に異種性タンパク質を製造
するために使用することができる。

【００９４】 本発明のORFの１つ以上を発現するために、種々の宿主／ベクター系を使用す
ることができる。 これらには、HeLa細胞、Cv-1細胞、COS細胞およびSf9細胞な
どの真核生物の宿主、さらにはE. coliおよびB. subtilisなどの原核生物の宿主
が包含されるが、これらに限定されない。 最も好ましい細胞は、所定のポリペ
プチドまたはタンパク質を通常には発現していないものか、あるいはそのポリペ
プチドまたはタンパク質を低い天然レベルで発現しているものである。 成熟タ
ンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌または適切なプロモーターの制御下にあ
る他の細胞で発現させることができる。 このようなタンパク質を製造するため
に、本発明のDNA構築体に由来するRNAを使用した、無細胞翻訳系も用いることが
できる。 原核生物および真核生物宿主での使用に好適なクローニングおよび発
現ベクターは、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とした、Samb
rookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spr
ing Harbor, ニューヨーク(1989)に記載されている。

【００９５】 組換えタンパク質を発現するために、様々な哺乳動物細胞培養系も使用するこ
とができる。 哺乳動物細胞発現系の例には、Gluzman、Cell 23巻、175頁(1981
)に記載のサル腎線維芽細胞のCOS-7細胞、および例えば、C127、3T3、CHO、HeLa
およびBHK細胞系などの適合可能ベクターを発現することができる他の細胞系が
包含される。 哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーター、そし
てさらに必要な何らかのリボソーム結合タンパク質、ポリアデニレーション部位
、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、および5'フランキング非転写
配列を含むものとされよう。 SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列、例えば
、 SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニレー
ション部位を、必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供するために使用して
もよい。 細菌培養物で生産される組換えポリペプチドおよびタンパク質は、通
常、先ず細胞ペレットから抽出し、次いで１回以上の塩析、水性イオン交換また
はサイズ排除クロマトグラフィー工程に付される。 タンパク質再折りたたみ工
程も、成熟タンパク質の立体配置を完全なものにするために必要に応じて使用す
ることができる。 最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製工程
に採用することができる。 タンパク質の発現に用いられる細菌細胞は、凍結−
融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊または細部溶解剤の使用等を含めた
、種々の好都合な方法によって破壊することができる。

【００９６】 数多くの細胞型が、タンパク質の発現のために好適な宿主細胞として働き得る
。 哺乳動物宿主細胞には、例えば、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵
巣(CHO)細胞、ヒト腎293細胞、ヒト上皮A431細胞、ヒトColo205細胞、3T3細胞、
CV-1細胞、他の形質転換される霊長類細胞系、正常な二倍体細胞、一次組織のin vitro 培養物由来の細胞株、一次移植片、HeLa細胞、マウスＬ細胞、BHK、HL-60
、U937、HaKまたはJurkat細胞などが包含される。

【００９７】 あるいは、酵母などの下等真核細胞または細菌などの原核細胞で、タンパク質
を製造することが可能である。 潜在的に好適な酵母菌株には、Saccharomyces
cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candidaまたは異
種性タンパク質を発現することができる種々の酵母株が包含される。 潜在的に
好適な細菌株には、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhim
urium、または異種性タンパク質を発現することができる種々の細菌株が包含さ
れる。 タンパク質が酵母または細菌にて製造される場合、機能性タンパク質を
得るために、例えば、適切な部位のホスホリレーションまたはグリコシレーショ
ンなどによって、そこで生産されたタンパク質を修飾する必要があるかもしれな
い。 かかる共有結合は、既知の化学的方法または酵素的方法を用いて実施することが
できる。

【００９８】 本発明の他の実施態様において、誘導可能な調節エレメントの制御下に本発明
のポリヌクレオチドを含む内在性遺伝子を発現するように、細胞および組織を操
作してもよく、この場合、内在性遺伝子の調節配列を相同組換えによって置換す
ればよい。 本明細書に記載するとおり、遺伝子操作法によって合成される、異
なる遺伝子または新規調節配列から単離した調節配列で、遺伝子に存在する調節
領域を置換するのに遺伝子ターゲッティングを使用することができる。 このよ
うな調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場付着領域、天然の調節エレ
メント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位または当該配列の組合せを含む
とよい。 あるいは、RNAまたは製造されたタンパク質の構造または安定性に影
響を及ぼす配列が、置換、除去、付加もしくはポリアデニレーションシグナル、
mRNA安定化エレメント、スプライス部位、タンパク質の移送もしくは分泌を増強
または修飾するためのリーダー配列、またはタンパク質もしくはRNA分子の機能
もしくは安定性を変更もしくは改善するその他の配列を包めたターゲッティング
によるその他の修飾をなされてもよい。

【００９９】 ターゲッティング事象は、単なる調節配列の挿入、例えば、遺伝子の上流に新
しいプロモーターもしくはエンハンサーまたはそれらの両方を挿入すること等、
新しい調節配列の制御下に遺伝子を置くことであってよい。 あるいは、ターゲ
ッティング事象は、組織特異的な負の調節エレメントの欠失など、調節エレメン
トの単なる欠失であってもよい。 あるいは、ターゲッティング事象は、存在す
るエレメントを置換することであってもよく、例えば、天然に存在するエレメン
トよりも広い細胞型特異性、もしくは天然に存在するエレメントと相違する細胞
型特異性を有するエンハンサーで、組織特異的エンハンサーを置換することがで
きる。 ここで、天然に存在する配列は削除され、そして新しい配列が付加され
る。 あらゆる場合において、ターゲッティング事象の同定は、外来性DNAが宿
主細胞ゲノムへと組込まれた細胞の選択を許容するような、ターゲッティングDN
Aに隣接する１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を使用することによって難な
く行われ得る。 ターゲッティング事象の同定はまた、負に選択可能なマーカー
が外来性DNAに連結されるが、その負に選択可能なマーカーがターゲッティング
配列の側方にあるように、そして宿主細胞ゲノムに含まれる配列との正しい相同
性組換え事象の結果、負に選択可能なマーカーの安定な組込みは惹起されないよ
うにして、負の選択の特性を呈する１つ以上のマーカー遺伝子の使用することに
よっても、難なく行われ得る。 この目的のために有用なマーカーには、ヘルペ
ス単純ウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子または細菌のキサンチン−グアニン
ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（gpt）遺伝子が包含される。

【０１００】 本発明のかかる特徴で使用することができる遺伝子ターゲッティングまたは遺
伝子活性化技術は、Chappelの米国特許第5,272,071号、Sherwinらの米国特許第
5,578,461号、Seldenらの国際出願第PCT/US92/09627号（WO93/09222)、Skoultch
iらの国際出願第PCT/US90/06436号（WO91/06667）に、さらに詳細に記載されて
おり、これらを引用することにより、その開示内容全体を本明細書に組込むこと
とする。

【０１０１】 6.4.本発明のポリペプチド 配列番号：２は、配列番号：３のポリペプチド配列をコードする。 配列番号
：３のアミノ酸アラインメントと、ラット、マウス、ウサギおよびヒトのインタ
ーロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドを、図１に示した。 配列番号
：３は、ヒトのインターロイキン-1受容体アンタゴニストと高いアミノ酸相同性
（71％）を示し、そして、インターロイキン-1受容体アンタゴニストとは別個の
ものであるが、非常に関連性が大きな新規の分子を意味している。 これは、イ
ンターロイキン-1受容体アンタゴニスト関連遺伝子にて最初にクローニングされ
た配列である。 配列番号：３のこの発見は、インターロイキン-1受容体アンタ
ゴニスト関連遺伝子のファミリーの存在を示唆するものである。 別のファミリ
ーのメンバーが、分子プローブとして、配列番号：１または２を用いて同定する
ことができる。 配列番号：３は、先に特徴付けを行ったすべてのインターロイ
キン-1受容体アンタゴニスト配列（図１）とは異なる４つのアミノ酸挿入を含む
タンパク質をコードする。 この挿入によって、配列番号：３には、新規で、先
に認められなかった活性が付与されるであろう。 同様に、図７には、配列番号
：５のアミノ酸アラインメントと、ヒトIL-1Raの細胞質体（「HUMIL1RASIC」と
記した）とを示した。 このアラインメントは、２つの間での高い相同性を示し
ている、すなわち、48％のアミノ酸が同一であり、そして、54％が保存的なアミ
ノ酸置換である。

【０１０２】 インターロイキン-1は、その多くが生体に悪影響を及ぼす多面発現性の生物学
的活性を有しており、その分子が損傷を受けていなければ、この分子はしっかり
と調節されるはずである。 実際のところ、インターロイキン-1の作用を調節す
るインターロイキン-1阻害剤の幾つかの報告がある。 インターロイキン-1の阻
害活性は、単球細胞用に調製された培地、すなわち、単球細胞が接着性免疫複合
体にて成長するよう調製された培地にて報告されている。 Arena, W.P., et al
., 1985, Journal of Immun., 134:3868。 さらに、阻害剤が、尿に存在するこ
とも報告されている。 Seckinger, P. et al., 1987, Journal of Immun., 139
:1546。 最後に、精製およびクローニングされ、インターロイキン-1受容体ア
ンタゴニスト活性を有するタンパク質阻害剤が報告されている。 Hannum, et a
l., 1990, Nature, 343:336、およびEisenberg, S., et al., 1990, Nature, 34
3:341。

【０１０３】 インターロイキン-1阻害剤は尿中に存在するものと考えられており、そして、
Eisenberg, S., et al., 1990, Nature, 343:341、および、Carter, D., et al
(1990), Nature, 344:633で報告されているクローニングされたインターロイキ
ン-1受容体アンタゴニストと同一でなければ、一部が精製され、かつSeckinger,
P. et al.,およびSeckinger, P. et al., 1987, Journal of Immun., 139:1541
によって特徴付けられたものと類似のものである。

【０１０４】 インターロイキン-1受容体アンタゴニストは、インターロイキン-1自体の分泌
を招く同じ刺激物質の多くに応答して、マクロファージによって分泌された、天
然に産するペプチドである。 インターロイキン-1受容体アンタゴニストは、サ
イトカインに対する天然に産するアンタゴニストであり、様々な細胞型に関する
受容体を認識し、そして、受容体を塞ぐことによってインターロイキン-1が媒介
した応答をブロックする。 (Wakabayashi et al., FASEB J 1991;5:338; Okusa
wa et al. J. Clin Invest 1988;81:1162; Ohlsson et al., Nature 1990;348:5
50; Aiura, et al. Cytokine 1991;4:498; Fischer et al. Am J Physiol 1991;
261:R442)。 ヒトにあっては、インターロイキン-1受容体アンタゴニストは、
天然に産する分子のグループに属し、その３つのフォームが特徴付けられている
（２つはグリコシル化されており、１つはグリコシル化されていない）。

【０１０５】 Fischer et al. (Am J Physiol 1991:261:R442)は、インターロイキン-1に対
する天然に産するアンタゴニストを投与することで、サイトカインカスケードを
顕著に鈍化させ、また、生存細菌の致死量が投与されたヒヒでの生存性を高める
であろうことを実証した。 インターロイキン-1受容体アンタゴニストは、動脈
の平均血圧値と心出力を顕著に和らげ、また、重度の急性膵炎の生存性を改善す
る。（米国特許第5,508,262号） 細菌性敗血症の結果として認められる全身性
インターロイキン-1応答も顕著に消失し、これは、細菌性敗血症に対する全身性
応答の減少と相関している。

【０１０６】 Aiura et al., 9 Cytokine 1991;4:498での研究は、インターロイキン-1受容
体アンタゴニストが、低血圧性グラム陰性敗血症ショックのウサギモデルでは保
護的であることを示している。 この動物モデルにインターロイキン-1受容体ア
ンタゴニストを投与すると、対照と比較して、動脈の平均血圧値が維持されてお
り、また、肺の水も減少し、尿の排出も維持されていた。 この研究は、インタ
ーロイキン-1の役割と、グラム陰性敗血症ショックでのインターロイキン-1受容
体アンタゴニストの保護作用を実証している。 インターロイキン-1は、（急性
膵炎、敗血症、内毒素ショックをよびサイトカイン誘発ショックを含む）病因に
関わらず、複数の異なるストレスに対する患者の臨床応答での主要な媒体である
。

【０１０７】 本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号：３または５のアミノ酸配列を
含むポリペプチド；配列番号：３または５の全長タンパク質コード配列；配列番
号：３または５の成熟タンパク質コード配列；または、配列番号：７または８の
一つ以上のエクソンによってコードされたポリペプチドを含むが、これらに限定
されない。

【０１０８】 本発明のポリペプチオドはさらにまた、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC、10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209
、米国）に寄託されたクローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされ
たアミノ酸配列；クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされたア
ミノ酸配列から構築された配列番号：３または５の全長タンパク質；または、ク
ローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされたアミノ酸配列から構築
された配列番号：３または５の成熟タンパク質コード配列が含まれるが、これら
に限定されない。

【０１０９】 本発明のタンパク質組成物はさらに、親水性の、例えば、薬学的に容認されう
る担体などの、容認されうる担体を含む。

【０１１０】 本発明はさらに、ポリペプチドを製造するための方法に関し、この方法は、好
適な培養用培地にて本発明の細胞培養物を生育させる工程と、当該培養物からタ
ンパク質を精製する工程を含む。 例えば、本発明の方法には、本発明のポリヌ
クレオチドを含む好適な発現ベクターを含有する宿主細胞を、目的のポリペプチ
ドの発現を許容する条件下に培養することでポリペプチドを製造するためのプロ
セスが包含される。 ポリペプチドは、その培養物から、便宜的には培養用培地
から回収され、さらに精製することができる。 好ましい実施態様には、かかる
方法によって製造されるタンパク質が、全長または成熟型のタンパク質であるも
のが包含される。

【０１１１】 本発明は、配列番号：３または５のアミノ酸配列と実質的に等価のアミノ酸配
列を含むポリペプチドをさらに提供する。 本発明によるポリペプチドは、配列
番号：３または５と、少なくとも約95％、そして、好ましくは通常では少なくと
も約98の配列一致性を有することができる。

【０１１２】 本発明はさらに、本発明の核酸断片によって、または本発明の核酸断片の縮重
変異体によってコードされる、単離されたポリペプチドを提供する。 「縮重変
異体」なる語によって、ヌクレオチド断片として本発明の核酸断片（例えば、OR
F）と相違するが、遺伝コードの縮重のため、同じポリペプチド配列をコードす
るヌクレオチド断片が企図される。 本発明の好ましい好ましい核酸断片は、タ
ンパク質をコードするORFである。 本発明の単離されたポリペプチドまたはタ
ンパク質のいずれかを得るために、当該技術分野で知られている様々な方法論を
利用することができる。 最も簡単なレベルでは、アミノ酸配列は、市販のペプ
チド合成装置を使用して合成することができる。 これは、小さいペプチドや、
より大きなペプチドの断片を製造する上で特に有用である。 断片は、例えば、
天然のポリペプチドに対する抗体を作製する上で有用である。 また別の方法に
おいて、ポリペプチドまたはタンパク質は、そのポリペプチドまたはタンパク質
を天然に生産している細菌細胞から精製される。 当業者であれば、本発明の単
離されたポリペプチドまたはタンパク質の１つを得るために、ポリペプチドおよ
びタンパク質を単離するための既知の方法に難なく従うことができる。 これら
には、免疫クロマトグラフィー、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーなどが包含される
が、これらに限定されることはない。 例えば、Scopes、Protein Purification
: Principles and Practice、Springer-Verlag (1994); Sambrookら、Molecular
Cloning: A Laboratory Manual; Ausubelら、Current Protocols in Molecular
Biologyを参照されたい。

【０１１３】 本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、所望のポリペプチドまたはタンパ
ク質を発現するように改変された細胞から精製してもよい。 本明細書で使用す
る場合、細胞が遺伝子操作によって、通常生産していないか、あるいは通常は低
レベルだけしか生産されていないポリペプチドまたはタンパク質を生産するよう
になされている場合に、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように
改変されていると称される。 当業者であれば、本発明のポリペプチドまたはタ
ンパク質の１つを生産する細胞を作製するために、組換えまたは合成配列の何れ
かを導入または発現するための方法を、原核細胞または真核細胞に難なく適用す
ることができる。 精製されたポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子を
同定するための既知技術である、in vitro結合アッセイで使用することができる
。 これらの分子には、例えば、小分子、コンビナトリアルライブラリー由来の
分子、抗体またはその他のタンパク質が包含されるが、これらに限定されない。
結合アッセイにて同定された分子は、次いで、当該技術分野で知られているin
vivo組織培養または動物モデルにて、アンタゴニストまたはアゴニストについて
試験が行われる。 簡単に説明すると、分子は複数の細胞培養または動物にて滴
定され、その後、動物／細胞の死または動物／細胞の生存延長について調べる。

【０１１４】 加うるに、結合分子は毒素、例えば、リシンもしくはコレラ毒素、または細胞
に対する毒性を有する他の化合物と複合されてもよい。 毒素−結合分子複合体
は、次いで配列番号：３または５の結合分子の特異性によって、腫瘍細胞または
その他の細胞へのターゲッティングが行われる。

【０１１５】 本発明のタンパク質は、例えば、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含んでいる体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる、トランスジェニ
ックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの成分として、トランスジェニック
ウシ動物の産物として発現されてもよい。

【０１１６】 このタンパク質は、従来の周知の化学合成によって製造されてもよい。 合成
法による本発明のタンパク質の構築方法は、当業者によく知られたものである。
一次、二次または三次構造および／または立体構造特性をタンパク質と共有する
ことの利によって、合成法により構築されたタンパク質配列は、そのタンパク質
活性を含め、それと共通する生物学的特性を保有し得るのである。 しかして、
それらタンパク質は、治療用化合物のスクリーニングに、そして抗体作製のため
の免疫学的プロセスに、天然の精製タンパク質の生物学的または免疫学的代替物
として使用され得る。

【０１１７】 本発明によって提供されるタンパク質は、精製タンパク質と類似したアミノ酸
配列によってその特徴が示されるタンパク質であるが、修飾は自然に存在してい
たかまたは故意に操作してなされたものをも包含する。 例えば、ペプチドまた
はDNA配列における修飾は、既知の技術を用いて当業者により行うことができる
ものである。 タンパク質配列の修飾で興味の対象となるものに、コーディング
配列における選択されたアミノ酸残基の変更、置換、挿入または欠失が含まれる
。例えば、１つ以上のシステイン残基を欠失するかまたは他のアミノ酸と置換し
て分子の立体配置を変更するとよい。 かような変更、置換、挿入または欠失の
ための技術には、当該技術分野でよく知られている(例えば、米国特許第4,518,5
84号を参照されたい)。 好ましくは、かかる変更、置換、挿入または欠失は、
タンパク質の所望の活性を保持しているものとされる。

【０１１８】 タンパク質の活性全体もしくは一部分を保持していることが期待され、そして
そのためにスクリーニングやその他免疫学的方法のために有用であり得るタンパ
ク質の配列の他の断片および誘導体もまた、本明細書に開示の内容に基づき、当
業者によって難なく行われ得る。 このような修飾が、本発明に包含されるもの
と考えられる。

【０１１９】 タンパク質はさらにまた、１つ以上の昆虫発現ベクターにて好適な制御配列に
本発明の単離されたポリヌクレオチドを作動可能に連結し、そして昆虫発現系を
利用することによって製造することができる。 バキュロウイルス／昆虫細胞発
現系のための材料および方法は、例えば、Invitrogen、San Diego、カリフォル
ニア州、米国より市販されているMaxBat. RTM.キットなど、キットにて入手でき
、またかかる方法は、引用することにより本明細書に組入れた、SummersおよびS
mith、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記
載されるとおり、当該技術分野でよく知られている。 本明細書で用いる場合、
本発明のポリヌクレオチドを発現することができる昆虫細胞は、「形質転換」さ
れている。

【０１２０】 本発明のタンパク質は、組換えタンパク質を発現するのに好適な培養条件下で
、形質転換された宿主細胞を培養することによって調製される。 この結果得ら
れる発現タンパク質は、次いで、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー
などの既知の精製プロセスを使用して、かかる培養物（すなわち、培養培地また
は培養抽出物）から精製される。 タンパク質の精製はさらに、タンパク質と結
合する試薬を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡアガロース、ヘ
パリン−トヨパール.RTM.またはシバクロムブルー3GAセファロース.RTM.などの
アフィニティー樹脂を用いた１つ以上の工程；フェニルエーテル、ブチルエーテ
ル、またはプロピルエーテルなどの樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーを利用する１つ以上の工程；または免疫アフィニティークロマトグラフィー
なども包含していてよい。

【０１２１】 あるいは、本発明のタンパク質は、精製を容易ならしめる形態にて発現されて
もよい。 例えば、マルトース結合蛋白質(MBP)、グルタチオン-S-トランスフェ
ラーゼ(GST)またはチオレドキシン(TRX)の融合タンパク質などの融合タンパク質
として発現されるとよい。 かかる融合タンパク質を発現および精製するための
キットが、New England BioLab（Beverly、マサチューセッツ州）、Pharmacia（
Piscataway、ニュージャージー州）およびIn Vitrogenから、それぞれ市販され
ている。 タンパク質は、また、エピトープでタグ付し、次いでかかるエピトー
プに対する特異抗体を使用して精製することもできる。 このようなエピトープ
の１つ(「Flag」)は、Kodak(New Haven、コネチカット州）より市販されている
。

【０１２２】 最後に、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルな
どの、疎水性RP-HPLC媒体を利用した、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（RP-HPLC）工程を、さらなるタンパク質精製のために行ってもよい。 実
質的に均質の単離された組換えタンパク質を得るために、前記精製工程のいくつ
かまたはすべてを、種々に組合わせて行うこともできる。 かくして精製された
タンパク質は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含んでおらず、また、本発明
において「単離されたタンパク質」として定義されるものである。

【０１２３】 本発明のポリペプチドは、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト（IL-1
RA）類似体を含む。 これには、本発明のIL-1 RAの断片、ならびに一つ以上の
アミノ酸の欠失、挿入または置換を含むインターロイキン-1受容体アンタゴニス
トをも包含する。 また、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストの
類似体は、インターロイキン-1受容体アンタゴニストまたは類似体が、他の一つ
以上の部分、例えば、標的部分または他の治療用物質に融合してなる、インター
ロイキン-1受容体アンタゴニストまたはインターロイキン-1受容体アンタゴニス
トの修飾体の融合物をも包含する。 このような類似体は、活性および／または
安定性などの特性を改善するであろう。 インターロイキン-1受容体アンタゴニ
ストまたは類似体に融合する対象の例として、例えば、膵臓細胞へポリペプチド
を送達する標的、例えば、膵臓細胞に対する抗体、Ｔ細胞、単球細胞、樹状細胞
、顆粒球などの免疫細胞に対する抗体、ならびに膵臓細胞または免疫細胞にて発
現した受容体およびリガンドなどがある。 インターロイキン-1受容体アンタゴ
ニストに融合される他の対象として、例えば、シクロスポリン、SK506、アザチ
オプリン、CD3抗体およびステロイドのような免疫抑制剤などの治療に用いられ
る治療剤がある。 また、インターロイキン-1受容体アンタゴニストは、免疫刺
激剤、免疫モジュレーター、それに、α−またはβ−インターフェロンのような
その他のサイトカインに融合できる。

【０１２４】 6.5.遺伝子治療 IL-1 Hy1遺伝子産物の正常機能の喪失を招くIL-1 Hy1遺伝子の変異は、ヒトの
IL-1 Hy1関連疾患状態に関係する。 本発明は、正常なIL-1 Hy1活性を回復せし
めるための、またはIL-1 Hy1が関与するこれら疾患状態を治療するための遺伝子
治療も意図している。 好適な細胞への機能性IL-1 Hy1遺伝子の誘導は、ベクタ
ー、具体的には、ウィルスベクター（例えば、アデノウィルス、アデノ関連ウィ
ルスまたはレトロウィルス）を用いた、ex vivo、in situまたはin vivoでの誘
導、または物理的なDNA転移方法（例えば、リポソームまたは化学的処理）を利
用したex vivoでの誘導によって効果的に行うことができる。 例えば、Anderso
n, Nature、vol.392の増補版、no.6679、pp.25〜30 (1998)を参照されたい。
遺伝子治療技術についてのその他の見解として、Friedmann, Science, 244: pp.
1275- 1281 (1989); Verma, Scientific American: pp.68-84 (1990): およびMiller,
Nature, 357, pp.455-460 (1992)を参照されたい。

【０１２５】 本発明のヌクレオチドのいずれか、または本発明のポリペプチドをコードする
遺伝子の導入も、染色体外物質（一過性発現）または人工染色体（安定発現）を
用いて達成することができる。 細胞の所望の性能または活性を高めかつ付与す
るために、本発明のタンパク質の存在下で、細胞をex vivoで培養することもで
きる。 そして、治療目的で、処理した細胞をin vivoで導入することができる
。 あるいは、その他のヒトの疾患状態において、IL-1 Hy1の発現防止またはIL-1 H
y1の活性阻害が、疾患の状態を処置する上で有用であることも意図している。
アンチセンス療法または遺伝子治療を、本発明のポリペプチドの発現を制限的に
調節するために適用することも意図している。 タンパク質の発現を阻害するそ
の他の方法として、当該技術分野で周知の方法による、本発明の核酸、その補体
、または翻訳したそのRNA配列へのアンチセンス分子の導入、標的削除法のよう
な手法を用いた本発明の核酸の除去、または組織特異的なサイレンサーのような
負の調節エレメントの挿入などがある。 さらに、本発明のポリペプチドは、本
発明のポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするアンチセンス分子の
導入、または本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の除去によって阻害する
ことができる。

【０１２６】 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを発現するためにin vivoで遺伝
子工学的に加工された細胞を提供するものであり、当該ポリヌクレオチドは、細
胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞とは非相同な調節配列と作動
可能な関係にある。 これら方法は、本発明のポリヌクレオチドの発現を増大ま
たは減少せしめるために用いることができる。

【０１２７】 DNA配列の知識は、内因性ポリペプチドの発現を許容、増大または減少するた
めの細胞の改変を可能ならしめる。 細胞がタンパク質を高レベルで発現せしめ
るべく、異種プロモーターの全部または一部を用いて、（例えば、相同組換えに
よって）天然に産するプロモーターの全部または一部を置換して、ポリペプチド
の発現を高めるために、細胞を修飾することができる。 配列をコードする所望
のタンパク質に作動可能に結合するよう、異種プロモーターは挿入される。 例
えば、PCT国際公開公報第WO94/12650号、PCT国際公開公報第WO92/20808号、およ
びPCT国際公開公報第WO91/09955号を参照されたい。 異種プロモーターDNAに加
えて、増幅可能なマーカーDNA（例えば、ada、dhfr、それに、カルバミルリン酸
シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼ
をコードする多機能性CAD遺伝子）および／またはイントロンDNAが、異種プロモ
ーターDNAと同様にして挿入することができる。 所望のタンパク質のコーディ
ング配列に結合している場合に、標準的な選択方法によるマーカーDNAの増幅を
行うと、細胞内にて所望のタンパク質のコーディング配列が共増幅される。

【０１２８】 本発明のその他の実施態様によると、内因性遺伝子の調節配列が相同組換えに
よって置換可能な場合に、誘発可能な調節エレメントの制御下にある本発明のポ
リヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように、細胞と組織を加工するこ
とができる。 本明細書にて言及したように、遺伝子に内在する調節領域を置換
するために、異なる遺伝子から単離された調節配列または遺伝子工学的方法によ
って合成された新規の調節配列を用いて、遺伝子の標的化を行うことができる。

【０１２９】 かような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格付随領域、負の調節
エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位または前記配列の組み合わ
せから構成することができる。 あるいは、RNAまたは産生したタンパク質の構
造または安定性に影響を与える配列を、置換、削除、追加、あるいは標的化によ
って修飾することができる。 これら配列として、ポリアデニレーションシグナ
ル、mRNA安定化エレメント、スプライス部位、タンパク質の輸送または分泌部分
を改善または修飾するためのリーダー配列、またはタンパク質またはRNA分子の
機能または安定性を改変または改善するその他の配列がある。

【０１３０】 ターゲッティング事象は、単なる調節配列の挿入、例えば、遺伝子の上流に新
しいプロモーターもしくはエンハンサーまたはそれらの両方を挿入すること等、
新しい調節配列の制御下に遺伝子を置くことであってよい。 あるいは、ターゲ
ッティング事象は、組織特異的な負の調節エレメントの欠失など、調節エレメン
トの単なる欠失であってもよい。 あるいは、ターゲッティング事象は、存在す
るエレメントを置換することであってもよく、例えば、天然に存在するエレメン
トよりも広い細胞型特異性、もしくは天然に存在するエレメントと相違する細胞
型特異性を有するエンハンサーで、組織特異的エンハンサーを置換することがで
きる。 ここで、天然に存在する配列は削除され、そして新しい配列が付加され
る。 あらゆる場合において、ターゲッティング事象の同定は、外来性DNAが宿
主細胞ゲノムへと組込まれた細胞の選択を許容するような、ターゲッティングDN
Aに隣接する１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を使用することによって難な
く行われ得る。 ターゲッティング事象の同定はまた、負に選択可能なマーカー
が外来性DNAに連結されるが、その負に選択可能なマーカーがターゲッティング
配列の側方にあるように、そして宿主細胞ゲノムに含まれる配列との正しい相同
性組換え事象の結果、負に選択可能なマーカーの安定な組込みは惹起されないよ
うにして、負の選択の特性を呈する１つ以上のマーカー遺伝子の使用することに
よっても、難なく行われ得る。 この目的のために有用なマーカーには、ヘルペ
ス単純ウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子または細菌のキサンチン−グアニン
ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（gpt）遺伝子が包含される。

【０１３１】 本発明のかかる特徴で使用することができる遺伝子ターゲッティングまたは遺
伝子活性化技術は、Chappelの米国特許第5,272,071号、Sherwinらの米国特許第
5,578,461号、Seldenらの国際出願第PCT/US92/09627号（WO93/09222)、Skoultch
iらの国際出願第PCT/US90/06436号（WO91/06667）に、さらに詳細に記載されて
おり、これらを引用することにより、その開示内容全体を本明細書に組込むこと
とする。

【０１３２】 6.6.クローンの寄託 以下のクローン、pIL-1Hy273は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン(ATCC) 10801 University Avenue, Manassas, Virginia に、1999年３月12
日にブダペスト条約に基づいて寄託した。 クローンpIL-1Hy273の2,648塩基対
の cDNAインサートは、ベクターpSPORT1に含まれ、そして、Not1およびSal1制限部
位で側面を接している。 このクローンは、後述の実施例に記載したような、プ
ラスミドクローンが代表的である。

【０１３３】

【表１】

【０１３４】 6.7.用途および生物学的活性 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、以下に示す１つ以上の用途ま
たは生物学的活性（本明細書に引用したアッセイに関連するものも含める）を呈
することが期待される。 本発明のタンパク質に対して記載した用途および活性
は、かかるタンパク質の投与もしくは使用によって、またはかかるタンパク質を
コードするポリヌクレオチドの投与もしくは使用（例えば、遺伝子療法、または
DNAの導入に好適なベクターで）によって提供され得る。

【０１３５】 6.7.1.研究用途および有用性 本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、様々な目的に対して研究共同
体により使用され得る。 ポリヌクレオチドは、分析、特徴付けまたは治療用途
のための組換えタンパク質を発現するために；対応するタンパク質が優先的に発
現されている（構成性発現あるいは、組織分化もしくは発生の特定の段階または
疾患状態でのいずれか）組織に対するマーカーとして；サザンゲルの分子量マー
カーとして；染色体を同定するための、もしくは関連する遺伝子の位置をマッピ
ングするための染色体マーカーもしくはタグ（ラベルされた場合）として；潜在
性のある遺伝的障害を同定すべく患者の内在性DNAと比較するため；ハイブリダ
イズを行い、しかして新規の関連DNA配列を発見するためのプローブとして；遺
伝的フィンガープリンティング法のためのPCRプライマーを誘導する情報源とし
て；他の新規ポリヌクレオチドを発見するプロセスで既知配列を「差し引く」た
めのプローブとして；発現パターンの実験も含め、「遺伝子チップ」またはその
他の支持体に付けるためのオリゴマーを選択および製造する目的で；DNA免疫付
与技術を使用して、抗タンパク質抗体を作出するため；そして、抗DNA抗体を作
出するか、別の免疫応答を誘発するための抗原として、使用することができる。

【０１３６】 ポリヌクレオチドが、他のタンパク質に結合するか、または潜在的結合性を有
するタンパク質をコードする場合（例えば、受容体−リガンド相互作用における
結合など）、ポリヌクレオチドはさらに、結合が生じる他のタンパク質をコード
するポリヌクレオチドを同定するため、または結合の相互作用の阻害剤を同定す
るために、相互作用捕捉アッセイ（例えば、Gyurisら、Cell 75巻、791〜803頁(
1993)）においても使用することができる。

【０１３７】 本発明によって提供されるタンパク質は、高処理能力（ハイ・スループット）
スクリーニング用の複数のタンパク質のパネルにおいて；抗体を作出するためか
、または別の免疫応答を惹起するため；生物学的流体中のタンパク質（またはそ
の受容体）のレベルを定量的に調べるべく設計されたアッセイにおける試薬（ラ
ベルされた試薬を含む）として；対応するタンパク質が優先的に発現されている
（構成性発現かまたは、組織分化もしくは発生もしくは疾患状態の特定段階での
発現のいずれか）組織におけるマーカーとして；そして、当然ながら、関連受容
体またはリガンドを単離するため等の種々の目的または用途を包含する、生物学
的活性を調べるためのアッセイにおいて同様に使用することができる。 タンパ
ク質が他のタンパク質に結合するかまたは潜在的な結合性を有している場合（例
えば、受容体−リガンド相互作用における場合など）、結合が生じる他のタンパ
ク質を同定するために、あるいは、結合の相互作用性の阻害剤を同定するために
、タンパク質を使用することができる。 これらの結合の相互作用に関与するタ
ンパク質は、結合の相互作用性のペプチドまたは小分子の、阻害剤またはアゴニ
ストをスクリーニングするためにも使用することができる。

【０１３８】 これらの研究用途のいずれかまたはすべてが、研究成果として商業化するため
、試薬用またはキット形式へと開発されることが可能である。

【０１３９】 前記の用途を実施するための方法は、当該技術分野でよく知られている。 か
ような方法を開示している文献には、「Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al」第２版、, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. F
ritsch and T. Maniatis編集、1989、および「Methods in Enzymology: Guide t
o Molecular Cloning Techniquies」、Acadmic Press, Berger, S. L. and A. R
. Kimmel編集、1987が包含される。

【０１４０】 6.7.2.栄養上の利用 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、栄養供給源または栄養補給剤
としても使用することができる。 かかる用途には、タンパク質またはアミノ酸
補給剤としての用途、炭素供給源としての用途、チッ素供給源としての用途およ
び炭水化物の供給源としての用途が包含されるが、これらに限定されない。 こ
のような場合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、特定の生物の餌
に添加することができ、または、粉剤、丸剤、液剤、懸濁剤またはカプセル剤な
どの形状として、独立した固体または液体調製物として投与することもできる。
微生物の場合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、微生物が培養さ
れる培地に添加することができる。

【０１４１】 6.7.3.サイトカインおよび細胞増殖／分化活性 本発明のタンパク質は、サイトカイン、細胞増殖（誘導もしくは阻害のいずれ
か）または細胞分化（誘導もしくは阻害のいずれか）活性を呈し得るか、または
特定の細胞集団における他のサイトカインを誘導し得る。 本発明のポリヌクレ
オチドは、かかる特質を呈するポリペプチドをコードし得るものである。 今日
までに発見された多くのタンパク質因子は、あらゆる既知のサイトカインを含め
、１つ以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を呈し、しかしてこのア
ッセイがサイトカイン活性の簡便な確認法として役立つ。 本発明のタンパク質
の活性は、32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8
、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7eおよびCMKを包含する（これ
らに限定されない）細胞系のための数多くの、常法たる因子依存性細胞増殖アッ
セイのいずれかによって証明される。 本発明のタンパク質の活性は、他の手段
の内とりわけ、以下の方法によって測定されるとよい。

【０１４２】 T-細胞または胸腺細胞増殖に対するアッセイには、Current Protocols in Imm
unology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach,
W. Strober編集、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 出
版(Chapter 3、In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Ch
apter 7, Immunologic studies in Humans); Takaiら, J. Immunol. 137:3494-3
500, 1986; Bertagnolliら, J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolliら
, Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli,ら, I. Immunol. 149
: 3778-3783, 1992; Bowman et al, I. Immunol. 152: 1756-1761, 1994、に記
載されるものが包含されるが、これらに限定されない。

【０１４３】 サイトカイン製造および／または脾臓細胞、リンパ節細胞もしくは胸腺細胞の
増殖に対するアッセイには、ポリクローナルＴ細胞刺激、Kruisbeek A. M. and
Shevach, E. M.、Current Protocols in Immunology. J. E. e.a. Coligan編集
、Vol 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; および、
マウスおよびヒトインターロイキン−γの測定., Schreiber, R. D.、Current P
rotocols in Immunology. J. E. e.a. Coligan編集 Vol 1 pp. 6.8.1-6.8.8, Jo
hn Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載されるものが包含されるが、これらに
限定されない。

【０１４４】 造血およびリンパ球新生細胞の増殖および分化に対するアッセイには、マウス
およびヒトインターロイキン−２およびインターロイキン−４の測定, Bottomly
, K., Davis, L. S. and Lipsky, P. E.、Current Protocols in Immunology. J
. E. e.a. Coligan編集 Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toron
to. 1991; deVriesら, J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreauら, Nature
336:690-692, 1988; Greenbergerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-
2938, 1983, マウスおよびヒトインターロイキン−６の測定--Nordan, R.、Curr
ent Protocols in Immunology. J. E. e.a. Coligan編集 Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.
5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smithら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
.S.A. 83:1857-1861, 1986;ヒトインターロイキン−11の測定--Bennett, F., Gi
annotti, J., Clark, S. C. and Turner, K. J.、Current Protocols in Immuno
logy. J. E. e.a. Coligan 編集 Vol 1 pp. 6. 15.1 John Wiley and Sons, Tor
onto. 1991; マウスおよびヒトインターロイキン−９の測定--Ciarletta, A., G
iannotti, J., Clark, S. C. and Turner, K. J.、Current Protocols in Immun
ology. J. E. e.a. Coligan 編集Vol 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Tor
onto. 1991に記載されるものが包含されるが、これらに限定されない。

【０１４５】 抗原に対するＴ−細胞クローン応答に対するアッセイ（とりわけ、APC-T細胞
相互作用に影響するタンパク質を同定するものと、増殖およびサイトカイン製造
を測定することによって直接的なＴ−細胞効果を同定するもの）には、Current
Protocols in Immunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies
, E. M. Shevach, W Strober編集、Greene Publishing Associates and Wiley-I
nterscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; C
hapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic
studies in Humans); Weinbergerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-60
95, 1980; Weinbergerら, Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981; Takaiら, J. Imm
unol. 137: 3494-3500, 1986; Takaiら, J. Immunol. 140:508-512, 1988に記載
されるものが包含されるが、これらに限定されない。

【０１４６】 6.7.4.免疫刺激または抑制活性 本発明のタンパク質は、限定を意図するものではないが、アッセイにおいて本
明細書に記載された活性を含め、免疫刺激または免疫抑制活性も呈するとよい。
本発明のポリヌクレオチドは、このような活性を呈するポリペプチドをコードす
ることができる。 タンパク質は、様々な免疫不全および障害（重症複合免疫不
全(SCID)を包含する）の処置において、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の
生育および増殖を調節する（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーシ
ョン）上で、さらにはNK細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性をもたらす上で
、有用であり得る。 これらの免疫不全は、遺伝的なものであっても、あるいは
、ウイルス（例えば、HIV)や、細菌もしくは真菌感染によって惹起されるもので
あっても、または自己免疫異常に起因するものであってもよい。 さらに詳細に
は、HIV、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、リーシュマニア
亜種、マラリア亜種、およびカンジダ症などの様々な真菌感染を包含する、ウイ
ルス、細菌、真菌により惹起される感染性疾患、またはその他の感染が、本発明
のタンパク質を使用して処置され得る。 当然ながら、この点に関連して、本発
明のタンパク質は、一般に免疫系を強化することが望まれ得る場合、すなわち、
ガンの処置においても有用であり得る。

【０１４７】 IL-1は、胸腺癌、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、骨の巨大細胞腫瘍、急性骨髄性白
血病、口腔表皮性癌および扁平上皮細胞癌などの様々な器官における癌の腫瘍細
胞の成長を促進することが知られているので、癌の徴候および症状を改善するた
めに、増大したIL-1レベルが関係するこれら癌疾患状態を、本発明のIL-1 Hy1ポ
リペプチドを用いて処置することが期待される。

【０１４８】 本発明のタンパク質を使用して処置され得る自己免疫異常は、例えば、結合組
織疾患、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺炎
症、ギラン・バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重
症筋無力症、移植片−宿主疾患および自己免疫性炎症性眼疾患が包含される。 かかる本発明のタンパク質（または、抗体を含むそのアンタゴニスタ）は、喘息
（特に、アレルギー性喘息）、または（慢性気管支炎を含む）気管支炎、および
他の呼吸の不具合などといった、アレルギー反応およびアレルギー状態（例えば
、アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物反応、昆虫毒アレルギー、マスト
サイトーシス、アレルギー性鼻炎、過敏性肺炎、蕁麻疹、血管浮腫、湿疹、アト
ピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多発性紅斑、スティーブンス−ジョン
ソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性器角結膜炎、巨大乳
頭結膜炎および接触アレルギー）の処置において有用でもあり得る。 免疫抑制
が所望される（例えば、臓器移植を含める）他の状態も、本発明のタンパク質（
または、そのアンタゴニスタ）を使用して処置可能である。 アレルギー反応に
関するIL-1 Hy1ポリペプチドまたはそのアンタゴニストによる治療効果は、反復
接触エンハンスメント試験（Lastbom et al., Toxicology 125:59-66, 1988）、
皮膚穿刺試験（Hoffmann et al., Allergy 54:446-54, 1989）、モルモット皮膚
過敏性試験（Vohr et al., Arch. Toxocol. 73:501-9）、およびマウス局所リン
パ節アッセイ（Kimber et al., J. Toxocol. Environ. Health 53:563-79）など
、in vivoで、動物モデルによって評価することができる。

【０１４９】 本発明のタンパク質を使用して、数多くの方法で免疫反応させることも可能で
あり得る。 ダウンレギュレーションは、既に進行している免疫応答を阻害もし
くは阻止する態様であっても、または免疫応答の誘導の防止にかかるものであっ
てもよい。 活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞の応答を抑制することにより、もし
くはＴ細胞における特異的な寛容を誘導することにより、またはそれら双方によ
って、活性化Ｔ細胞の機能を阻害してもよい。 Ｔ細胞応答の免疫抑制は、通常
は活性、非抗原特異性のプロセスであり、これは抑制剤にＴ細胞が継続的に曝さ
れることが必要である。 寛容は、Ｔ細胞における非応答性または反応不顕性を
誘導することを包含しており、通常、抗原特異的である点において免疫抑制と区
別可能であって、寛容化剤への曝露が終わった後も持続する。 操作上は、寛容
化剤の非存在下に特異抗原に曝した際のＴ細胞の応答欠如によって、寛容を立証
することができる。

【０１５０】 １つ以上の抗原機能をダウンレギュレートまたは防止すること（Ｂリンパ球抗
原機能（例えば、B7など）を含めるが、これに限定されない）、例えば、活性化
Ｔ細胞による高レベルリンホカイン合成の防止などが、組織、皮膚および臓器移
植の状況において、また移植片対宿主病(GVHD)で有用であろう。 例えば、Ｔ細
胞機能の阻止の結果、組織移植における組織破壊の低減が引き起こされるはずで
ある。 通常、組織移植において、Ｔ細胞による外来物としての認識と、それに
続き移植体を破壊する免疫反応を通じて移植の拒絶が惹起される。 本発明の治
療用組成物を投与することで、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカイン合成
が妨げられ、しかして免疫を抑制するものとして作用する。 さらに、共刺激の
欠如が、Ｔ細胞を反応不顕性化するのにも充分で、それにより被験者に寛容が誘
導されるかもしれない。 Ｂリンパ球抗原阻害剤による長期寛容の誘導によって
、これら阻害剤の反復投与の必要性が回避されるかもしれない。 被験者で充分
な免疫抑制または寛容を成し遂げるために、複数のＢリンパ球抗原の組合わせの
機能を阻害することも必要であるかもしれない。

【０１５１】 臓器移植拒絶またはGVHDの防止における、特定の阻害剤の有効性は、ヒトにお
ける有効性を予測させるものである動物モデルを使用して評価することができる
。 使用することができる適切な系の例には、ラットでの同種間心臓移植と、マ
ウスでの異種間膵島細胞移植とが包含され、これらは双方とも、Lenschowら, Sc
ience 257:789-792 (1992) およびTurkaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
11102-11105 (1992)に記載されるごとく、CTLA4Ig融合タンパク質の免疫抑制効
果をin vivoで検査するのに使用されている。 加えて、GVHDのマウスモデル（P
aul 編集、Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-8
47を参照されたい）を、その疾患の発生に対するＢリンパ球抗原機能の効果をin
vivoで調べるために使用することができる。

【０１５２】 抗原機能の阻害はさらに、自己免疫疾患を処置するために治療上有用であり得
る。 多くの自己免疫異常は、自身の組織に対して反応性を有し、そして疾患の
病理に関わるサイトカインおよび自己抗体の製造を促進するＴ細胞の不適切な活
性化の結果である。 自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は、病徴を低減または排
除し得る。 Ｔ細胞の刺激を阻害する試薬の投与を、Ｔ細胞活性化を阻害するた
めに、そして疾患プロセスに関わるかもしれない自己抗体またはＴ細胞由来のサ
イトカインの生産を防止するために使用することができる。 加うるに、阻害剤
は長期間にわたる疾患の軽減を導き得る自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的な寛容を
誘導するかもしれない。 自己免疫異常の防止または緩和における阻害剤の有効
性は、ヒト自己免疫疾患の充分特徴付けられた、数多くの動物モデルを使用して
調べることができる。 その例には、ネズミ実験的自己免疫脳炎、MRL/lpr/lpr
マウスまたはNZBハイブリッドマウスにおける全身性紅斑性狼瘡、ネズミ自己免
疫コラーゲン関節炎、NODマウスおよびBBラットにおける糖尿病、ならびにネズ
ミ実験的重症筋無力症が包含される（Paul 編集、Fundamental Immunology, Rav
en Press, New York, 1989, pp. 840-856を参照されたい）。

【０１５３】 免疫応答を上方制御する手段としての抗原機能（例えば、Ｂリンパ球抗原機能
）のアップレギュレーションもまた、治療に有用であるかもしれない。 免疫応
答のアップレギュレーションは、現存する免疫応答を増強するかまたは初期免疫
応答を誘発する形をとるとよい。 例えば、免疫応答を高めることは、インフル
エンザ、感冒および脳炎などの全身性ウイルス疾患に対して有用であるかもしれ
ない。

【０１５４】 あるいは、Ｔ細胞を感染患者から取り出し、本発明のポリペプチドのいずれか
を発現しているウイルス抗原でパルス付けされたAPCと、あるいは本発明の可溶
性ペプチドの刺激型と一緒に、in vitroでＴ細胞を共刺激し、そしてin vitroで
活性化したＴ細胞を患者に再び導入することにより、感染患者において抗生活免
疫応答は増強され得る。 抗ウイルス性免疫応答を増強する別の方法としては、
患者から感染細胞を単離し、かかる細胞が本発明のタンパク質全体またはその一
部を細胞表面上に発現するように、本明細書における開示に従って、本発明のタ
ンパク質をコードする核酸で細胞をトランスフェクトして、トランスフェクトさ
れた細胞を患者に再び導入する方法がある。 そうすれば感染細胞は、共刺激シ
グナルをＴ細胞へin vivoで伝達し、それによりＴ細胞を活性化することができ
るはずである。

【０１５５】 本発明のペプチドは、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免
疫免疫応答を誘発するために、Ｔ細胞に必要な刺激シグナルを付与することもで
きる。 加えて、MHCクラスＩまたはMHCクラスII分子が欠如しているか、あるい
は充分な量のMHCクラスＩもしくはMHCクラスII分子を再度発現できない腫瘍細胞
を、MHCクラスＩα鎖タンパク質およびβ₂ミクログロブリンタンパク質、または
MHCクラスIIα鎖タンパク質およびMHCクラスIIβ鎖タンパク質の核酸の全体もし
くは一部（例えば、細胞質ドメインが欠切された部分）をコードする核酸でトラ
ンスフェクトして、それにより細胞表面上にMHCクラスＩまたはMHCクラスIIタン
パク質を発現させることができる。 適切なクラスＩまたはクラスII MHCを、Ｂ
リンパ球抗原（例えば、B7-1、B7-2、B7-3）の活性を有するペプチドと組合せて
発現すると、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対する、Ｔ細胞による免疫応答
が誘発される。 任意に、不変異体鎖などのように、MHCクラスII関連タンパク
質の発現を阻害するアンチセンス構築体をコードする遺伝子もまた、Ｂリンパ球
抗原の活性を有するペプチドをコードするDNAと共に共トランスフェクトされ得
、しかして腫瘍関連抗原の呈示を促進し、そして腫瘍特異的免疫性を誘発するこ
とができる。 このように、ヒト被験者におけるＴ細胞による免疫応答を誘発す
ることで、当該被験者における腫瘍特異的慣用を充分に克服することができる。

【０１５６】 本発明のタンパク質の活性は、種々の手段のうちでも以下に記載する方法によ
って測定され得るものである。

【０１５７】 胸腺細胞または脾臓細胞への細胞毒性に対する好適なアッセイには、Current
Protocols in Imrnunology、J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulie
s, E. M. Shevach, W. Strober編集、Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Func
tion 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmannら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmannら, J. Immunol. 128
:1968-1974, 1982; Handaら, J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takaiら, I.
Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takaiら, J. Immunol. 140:508-512, 1988; He
rrmannら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmannら, J.
Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handaら, J. Immunol. 135:1564-1572, 1985;
Takaiら, J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowmanら, J. Virology 61:1992-
1998; Takaiら, J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolliら, Cellular Im
munology 133:327-341, 1991 ; Brownら, J. Immunol. 153:3079-3092, 1994に
記載されたものが包含されるが、それらに限定されない。

【０１５８】 Ｔ細胞依存性イムノグロブリン応答およびアイソトープスイッチングに対する
アッセイ（とりわけ、Ｔ細胞依存性抗体応答をモジュレートするタンパク質およ
びTh1/Th2プロファイルに作用するタンパク質を同定するもの）には、Maliszews
ki, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; およびAssays for B cell function: I
n vitro antibody production, Mond, J. J. and Brunswick, M.、Current Prot
ocols in Immunology. J. E. e.a. Coligan 編集Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John
Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載されたものが包含されるが、それらに限
定されない。

【０１５９】 リンパ球混合反応(MLR)アッセイ（とりわけ、Th1およびCTL応答を優先的に生
み出すタンパク質を同定するもの）には、Current Protocols in Immunology, J
. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strobe
r編集、Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (Chapter
3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, I
mmunologic studies in Humans); Takaiら, J. Immunol. 137:3494-3500, 1986;
Takaiら, J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolliら, J. Immunol. 149:
3778-3783, 1992に記載されたものが包含されるが、それらに限定されない。

【０１６０】 樹状細胞依存性アッセイ（とりわけ、天然のＴ細胞を活性化する樹状細胞によ
って発現されるタンパク質を同定するもの）には、Gueryら, J. Immunol. 134:5
36-544, 1995; Inabaら, Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 199
1; Macatoniaら, Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgadorら, J
ournal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nairら, Journal of Vi
rology 67:4062-4069, 1993; Huangら, Science 264:961-965, 1994; Macatonia
ら, Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwajら, Jo
urnal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994;およびInabaら, Journal
of Experimental Medicine 172:631-640, 1990に記載されたものが包含されるが
、それらに限定されない。

【０１６１】 リンパ球生存／アポトーシスに対するアッセイ（とりわけ、スーパー抗原誘導
後のアポトーシスを妨げるタンパク質およびリンパ球恒常性を調節するタンパク
質を同定する）には、Darzynkiewiczら, Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyc
aら, Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczycaら, Cancer Research 53:1945-1951,
1993; Itohら, Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology
145:4037-4045, 1990; Zamaiら, Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczycaら, In
ternational Journal of Oncology 1:639-648, 1992に記載されたものが包含さ
れるが、それらに限定されない。

【０１６２】 Ｔ細胞の方向付けおよびその初期工程に影響を及ぼすタンパク質に対するアッ
セイには、Anticaら, Blood 84:111-117, 1994; Fineら, Cellular Immunology
155:111-122, 1994; Galyら, Blood 85:2770-2778, 1995; Tokiら, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991に記載されたものが包含されるが、それら
に限定されない。

【０１６３】 6.7.5.造血調節活性 本発明のタンパク質は、造血の調節において有用であり得、また結果的に、骨
髄細胞またはリンパ系細胞の欠陥の処置において有用であり得る。 コロニー形
成細胞または因子依存性細胞系を支持する最低限の生物学的活性での造血調節へ
の関与、例えば、赤血球系前駆細胞の成長および増殖を単独または他のサイトカ
インと併せて支持し、それにより、例えば、様々な貧血の処置、または赤血球前
駆細胞および／もしくは赤血球細胞の産生を刺激すべく、放射線療法／化学療法
と併用する上での有用性；顆粒球および単球／マクロファージなどの骨髄細胞の
成長および増殖（すなわち、旧来のCSF活性）と、例えば、結果として生じる骨
髄抑制を防止する化学療法との併用；巨核球の成長および増殖を支持して、結果
的に血小板の成長および増殖を支持し、それにより、血小板減少症などの様々な
血小板障害の予防または処置を可能にすること、また一般的には血小板輸液の代
替または補完目的の使用；および／または前記造血細胞のいずれか、そしてすべ
てに成熟することができ、従って、様々な幹細胞障害（限定を意図するものでは
ないが、再生不良性貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症を含めた通常では移
植で処置される障害など）における治療用途や、さらには、正常細胞もしくは遺
伝子療法用に遺伝的に操作された細胞として、in-vivoまたはex-vivoのいずれか
（すなわち、骨髄移植もしくは末梢前駆細胞移植（同種もしくは異種）との併用
）で、放射線療法／化学療法後の幹細胞区画の再増殖における治療用途が認めら
れる造血幹細胞の成長および増殖への関与、を示唆するものである。

【０１６４】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の中でも、以下の方法によって測定す
ることができる。

【０１６５】 様々な造血細胞系の増殖および分化に対する好適なアッセイは、前記のとおり
である。

【０１６６】 胎児幹細胞分化に対する（とりわけ、胎児の分化造血に影響を及ぼすタンパク
質を同定する）アッセイには、Johanssonら Cellular Biology 15:141-151, 199
5; Kellerら, Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; McCianahan
ら, Blood 81:2903-2915, 1993に記載されたものが包含されるが、それらに限定
されない。

【０１６７】 幹細胞の生存および分化に対する（とりわけ、リンパ−造血を調節するタンパ
ク質を同定する）アッセイには、Methylcellulose colony forming assays, Fre
shney, M. G. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney,ら 編集 V
ol pp. 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Hirayamaら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony
forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. and Bri
ddell, R. A. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney,ら 編集 V
ol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Nebenら, Experiment
al Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Plo
emacher, R. E. in Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney,ら 編集
Vol pp. 1 -21, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Long term bone ma
rrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M.
and Allen, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney,ら 編集
Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Long term cultu
re initiating cell assay, Sutherland, H. J. In Culture of Hematopoietic
Cells. R. I. Freshneyら 編集 Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc., New York
, N.Y. 1994に記載されたものが包含されるが、それらに限定されない。

【０１６８】 6.7.6.組織成長活性 本発明のタンパク質はまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織の成
長または再生のため、さらに創傷治癒ならびに組織修復および置換のために、そ
して火傷、切開および潰瘍の処置に使用される組成物における有用性も有してい
る。

【０１６９】 本発明のタンパク質で、骨が正常に形成されない場合に軟骨および／または骨
の成長を誘導するものは、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨損傷もし
くは欠損の治癒に適用できる。 本発明のタンパク質を用いるこのような調製物
は、閉鎖骨折そして開放骨折の低減における予防的用途、さらに人工関節の固定
の向上にも用途を有する。 骨形成剤によって誘導される新生骨形成は、先天性
、外傷誘発性または腫瘍学的切除で誘発された頭蓋欠損の修復に寄与し、そして
美容整形外科においても有用である。

【０１７０】 本発明のタンパク質は、歯周病およびその他の歯修復プロセスの処置において
も使用され得る。 かかる薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し、骨形成
細胞の成長を刺激し、または骨形成細胞の前駆体の分化を誘導し得る。 本発明
のタンパク質はさらに、骨および／または軟骨修復の刺激を通じて、または炎症
の阻害、もしくは炎症プロセスによって媒介される組織破壊のプロセス（コラゲ
ナーゼ活性、破骨細胞活性等）を阻害することによるものなど、骨粗鬆症または
骨関節炎の処置においても有用である。

【０１７１】 本発明のタンパク質に寄与可能となり得る組織再生活性の別の範疇に、腱／靭
帯形成がある。 本発明のタンパク質で、腱／靭帯様組織もしくは他の組織の形
成を、かかる組織が正常に形成されない条件下で誘導するものは、ヒトおよびそ
の他の動物における、腱もしくは靭帯の披裂、変形および他の腱または靭帯の欠
損の治癒に適用できる。 腱／靭帯様組織を誘導するタンパク質を用いた調製物
は、腱もしくは靭帯組織への損傷を防止する予防的用途と、さらに骨またはその
他の組織への腱もしくは靭帯の固定の向上、または腱もしくは靭帯組織への欠損
を修復するための用途も有している。 本発明の組成物によって誘導される新生
腱／靭帯様組織形成は、先天性、外傷誘発性またはその他の原因による腱もしく
は靭帯欠損の修復に寄与し、そして、腱もしくは靭帯の付着もしくは修復のため
の美容整形外科においても有用である。 本発明の組成物は、腱形成細胞もしく
は靭帯形成細胞を誘引する環境、腱形成細胞もしくは靭帯形成細胞の成長を刺激
する環境、腱形成細胞もしくは靭帯形成細胞の前駆体の分化を誘導する環境、ま
たは組織修復に作用させるべくin vivoに戻すためのex vivoの腱／靭帯細胞もし
くは前駆体の成長を誘導する環境を提供し得る。 本発明の組成物は、腱炎、心
皮巣症候群およびその他の腱もしくは靭帯欠損の処置においても有用である。 これら組成物は、適切なマトリックスおよび／または当該技術分野で担体として
周知の封鎖剤をも含み得る。

【０１７２】 本発明のタンパク質はまた、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生
、すなわち、中枢および末梢神経系疾患ならびに神経障害の処置のため、そして
機械的および外傷性障害で、神経細胞もしくは神経組織への変性、死または外傷
に関わるものの処置のためにも有用であり得る。 さらに詳細には、タンパク質
は、末梢神経の傷害、末梢性神経障害および局所性神経障害などの末梢神経系の
疾患、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン氏病、ハンチントン病、筋萎縮
性側索硬化症およびシャイ・ドレーガー症候群などの中枢神経系疾患の処置にお
いて有用であり得る。 本発明によって処置され得るさらなる状態には、脊髄障
害、頭部外傷および卒中などの脳血管疾患等、機械的および外傷性障害が包含さ
れる。 化学療法または他の医学療法に起因する末梢神経障害もまた、本発明の
タンパク質を使用して処置することができる。

【０１７３】 本発明のタンパク質は、限定を意図するものではないが、圧迫潰瘍、脈管不全
に関連する潰瘍、外科的および外傷性創傷などを含めた進行性創傷のより良好な
もしくはより迅速な封鎖を促進するためにも使用され得る。

【０１７４】 本発明のタンパク質は、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を
含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋もしくは心筋）および脈管（血管内皮を含む）組
織などの、その他の組織の発生または再生に対する活性、あるいはかかる組織を
含む細胞の成長を促進する活性をも呈し得るものである。 望ましい効果の一部
は、正常組織の再生を可能とする、線維性瘢痕の阻害もしくはモジュレーション
によるものである。 本発明のタンパク質は、血管形成活性も呈し得る。

【０１７５】 本発明のタンパク質はさらに、腸の保護もしくは再生および肺もしくは肝線維
症、様々な組織での再灌流障害、ならびに全身的なサイトカイン損傷に起因する
状態のためにも有用であり得る。

【０１７６】 本発明のタンパク質はまた、前記組織の前駆細胞または細胞からの分化の促進
または阻害、あるいは前記組織の成長の阻害をする上で有用であり得る。

【０１７７】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の内でも、以下の方法によって測定さ
れるとよい。

【０１７８】 組織産生活性に対するアッセイには、国際特許公開第WO95/16035号（骨、軟骨
、腱）；国際特許公開第WO95/05846号（神経、ニューロン）；国際特許公開第WO
91/07491号（皮膚、内皮）に記載されたものが包含されるが、それらに限定され
ない。

【０１７９】 創傷治癒活性に対するアッセイには、Winter, Epidermal Wound Healing, pps
. 71-112 (Maibach, H. I. and Rovee, D. T., 編集), Year Book Medical Publ
ishers, Inc., Chicago, as modified by Eaglstein and Mertz, J. Invest. De
rmatol 71:382-84(1978)に記載されたものが包含されるが、それらに限定されな
い。

【０１８０】 6.7.7.アクチビン／インヒビン活性 本発明のタンパク質は、アクチビン関連またはインヒビン関連活性も呈し得る
ものである。 本発明のポリヌクレオチドは、かかる特性を呈するポリペプチド
をコードするものであるとよい。 インヒビンは、卵胞刺激ホルモン(FSH)の放
出を阻害する能力によって特徴付けられ、一方、アクチビンは、卵胞刺激ホルモ
ン(FSH)の放出を促進する能力によって特徴付けられる。 かくして、本発明の
タンパク質は、単独または、インヒビンα−ファミリーのメンバーとのヘテロダ
イマーにて、インヒビンの雌性哺乳動物における受精能を低減し、および優性哺
乳動物における精子形成を低減する能力に基づく避妊薬として有用であるかもし
れない。 他のインヒビンを充分な量投与することで、これら哺乳動物における
不妊症を誘導することができる。 あるいは、本発明のタンパク質は、ホモダイ
マーにて、もしくはインヒビンβ群の他のタンパク質サブユニットとのヘテロダ
イマーにて、下垂体前葉の細胞からのFSH放出を刺激するアクチビン分子の能力
に基づく、受精能誘導治療剤としても有用であり得る。 例えば、米国特許第4,
798,885号を参照されたい。 本発明のタンパク質は、ウシ、ヒツジ、ブタなど
の家畜の一生の繁殖能力を増大するために、性的に未成熟な哺乳動物における受
精能の開始を早めるためにも有用であり得る。

【０１８１】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の内でも、以下の方法によって測定さ
れるとよい。

【０１８２】 アクチン／インヒビン活性に対するアッセイには、Valeら, Endocrinology 91
:562-572, 1972; Lingら, Nature 321:779-782, 1986; Valeら, Nature 321:776
-779, 1986; Masonら, Nature 318:659-663, 1985; Forageら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 83:3091-3095, 1986に記載されたものが包含されるが、それらに限
定されない。

【０１８３】 6.7.8.化学走性／ケモカイン活性 本発明のタンパク質は、例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細
胞、好酸球、上皮および／もしくは内皮細胞などを含めた哺乳動物細胞に対する
化学走性またはケモカイン活性（例えば、ケモカインとしての作用）を有し得る
。 本発明のポリヌクレオチドは、かかる特質を呈するポリペプチドをコードす
ることができるものである。 化学走性およびケモカインタンパク質を、所望の
作用部位に所望の細胞集団を移動させるかまたは誘引するために使用することが
できる。 化学走性またはケモカインタンパク質は、創傷および組織に対するそ
の他の外傷の処置において、さらに局所的な感染の処置においても、特に利点を
提供するものである。 例えば、腫瘍または感染部位へのリンパ球、単球または
好中球の誘引の結果、腫瘍または感染物質に対する免疫応答の改善へと導くこと
ができる。

【０１８４】 タンパク質またはペプチドは、特定の細胞集団の方向付けられた指向または動
きを直接的または間接的に刺激することができれば、かかる特定の細胞集団に対
する化学走性活性を有することとなる。 好ましくは、このタンパク質またはペ
プチドは、細胞の方向付けられた動きを直接的に刺激する能力を有している。 特定のタンパク質が、細胞の集団に対する化学走性活性を有しているかどうかは
、細胞化学走性に対する様々な既知のアッセイにて、かかるタンパク質またはペ
プチドを使用することによって難なく調べることができる。

【０１８５】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の内でも、以下の方法によって測定さ
れるとよい。

【０１８６】 化学走性活性に対するアッセイ（化学走性を誘導または防止するタンパク質を
同定するアッセイ）は、膜を越えて細胞が移動することを誘導するタンパク質の
能力、そしてある細胞集団が別の細胞集団に接着することを誘導するタンパク質
の能力を測定するアッセイからなる。 移動と接着に対する好適なアッセイには
、Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan. A. M. Kruisbeek, D. H.
Marguiles, E. M. Shevach, W. Strober編集、Pub. Greene Publishing Associ
ates and Wiley-Interscience (Chapter 6.12, Measurement of alpha and beta
Chemokines 6.12.1-6.12.28; Taubら J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995;
Lindら APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al Eur. J. Immunol. 25:1744-17
48; Gruberら J. of Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et at. J. Immu
nol. 153:1762-1768, 1994に記載されたものが包含されるが、それらに限定され
ない。

【０１８７】 6.7.9.止血および血栓溶解活性 本発明のタンパク質は、止血または血栓溶解活性を呈することもできる。 本
発明のポリヌクレオチドは、かかる特質を呈するポリペプチドをコードすること
ができるものである。 このようなタンパク質は、様々な凝固障害（血友病など
の遺伝病を含む）の処置に有用であることが期待され、あるいは外傷、外科手術
もしくは他の場合などに起因する創傷の処置における、凝固および他の止血現象
を増強することが期待される。 本発明のタンパク質は、血栓の溶解または形成
阻害のためにも、またそれらの結果引き起こされる状態（例えば、心臓および中
枢神経系血管の梗塞（例えば、卒中）など）の処置および防止のためにも有用で
あり得る。

【０１８８】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の内でも、以下の方法によって測定さ
れるとよい。

【０１８９】 止血および血栓溶解活性に対するアッセイには、Linetら, J. Clin. Pharmaco
l. 26:131-140, 1986; Burdickら, Thrombosis Res. 45:413-419, 1987; Humphr
eyら, Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35:467-474, 19
88に記載されたものが包含されるが、それらに限定されない。

【０１９０】 6.7.10.受容体／リガンド活性 本発明のタンパク質は、受容体、受容体リガンドまたは受容体／リガンド相互
作用の阻害剤もしくはアゴニストとしての活性も示し得る。 本発明のポリヌク
レオチドは、かかる特性を呈するポリペプチドをコードすることができる。 か
かる受容体とリガンドの例には、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、
受容体キナーゼおよびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらの
リガンド、細胞−細胞相互作用に関わる受容体およびそれらのリガンド（細胞接
着分子（セレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンドなど）ならびに抗原
提示、抗原認識ならびに細胞性および体液性免疫応答の発生に関わる受容体／リ
ガンド対を含むが、それらに限定されない）を含むが、それらに限定されない。
受容体およびリガンドは、関連する受容体／リガンド相互作用の、可能なペプチ
ドまたは小分子阻害剤のスクリーニングのためにも有用である。 本発明のタン
パク質（受容体およびリガンドの断片を含むが、それらに限定されない）は、そ
れ自体が受容体／リガンド相互作用の阻害剤として有用であり得る。

【０１９１】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の内でも、以下の方法によって測定さ
れるとよい。

【０１９２】 受容体−リガンド活性に対する好適なアッセイには、Current Protocols in I
mmunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevac
h, W. Strober編集、Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscie
nce (Chapter 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditi
ons 7.28.1-7.28.22), Takaiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1
987; Biererら, J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosensteinら, J. Exp. M
ed. 169:149-160; Stoltenborgら, J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Sti
ttら, Cell 80:661-670, 1995に記載されたものが包含されるが、それらに限定
されない。

【０１９３】 例として、本発明の新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストは、サイ
トカイン受容体用のリガンドとして使用でき、これにより、その受容体の生物学
的活性をモジュレートする。 使用されるサイトカイン受容体の例として、イン
ターロイキン-1 Ｉ型またはインターロイキン-1 II型受容体があるが、これらに
限定されない。 本発明の新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストは、
サイトカイン受容体のような特定の受容体に対して、アゴニスト活性、部分的な
アゴニスト活性、アンタゴニスト活性または部分的なアンタゴニスト活性を発現
し、特定の細胞型において、当業者に周知の従来技術によって決定することがで
きる。 ある実施態様によれば、サイトカイン受容体（例えば、インターロイキ
ン-1 Ｉ型またはII型受容体）を発現する１つ以上の細胞を、本発明のタンパク
質と接触せしめる。 本発明のタンパク質と接触せしめる細胞の例として、繊維
芽細胞やＴ細胞のような哺乳類細胞があるが、これらに限定されない。 好まし
くは、本発明の新規のタンパク質は、その受容体の生物学的活性が阻害されるよ
うに、サイトカイン受容体（例えば、インターロイキン-1受容体）のためのアン
タゴニストとして作用する。

【０１９４】 アゴニストまたはアンタゴニストまたは部分的なアゴニストとしての薬剤また
はタンパク質を特徴付ける研究によれば、部分的なアゴニストが、拮抗リガンド
として他のタンパク質の使用を必要としている。 本発明の新規タンパク質は、
インターロイキン-1受容体に対する親和性を呈する。 よって、本発明のタンパ
ク質は、例えば、インターロイキン-1受容体が関与するアッセイでの拮抗物質と
して使用できる（例えば、実施例12）。 あるいは、本発明のタンパク質は、従
来の方法によって、放射性同位元素、比色分子または毒素分子を結合して標識付
けすることもできる。 （"Guide to Protein Purification" Murray P. Deutsc
her(編纂) Methods in Enzymology Vol.182 (1990) Academic Press社、サンデ
ィエゴ）および、in vivoとin vitro双方でのインターロイキン-1受容体への結
合において用いた。 放射性同位元素の例として、トリチウムおよび炭素-14が
あるが、これらに限定されない。 比色分子の例として、フルオレサミンのよう
な蛍光分子、またはローダミンまたはその他の比色分子があるが、これらに限定
されない。 毒素の例として、リアシンがあるが、これらに限定されない。 例
によれば、このような分子に結合したタンパク質は、インターロイキン-1受容体
の in vivoまたはin vitro代謝に関与する研究において有用である。

【０１９５】 6.7.11.新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドを用い
た 薬剤のスクリーニング 本発明は、新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドまた
はその結合断片を、様々な薬剤スクリーニング技術で利用することで、化合物の
スクリーニングにおいて特に有用である。 かような試験で用いられた新規のイ
ンターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドまたは断片は、溶液中に含
まれず、固相支持体に付着して、細胞表面に生成するか、または細胞間に存在す
る。 薬剤スクリーニングのある方法では、このポリペプチドまたは断片を発現
する組み換え核酸で安定的に形質転換される原核または真核宿主細胞を利用する
。 かような細胞は、活動性のものでも、固定されたものでも、標準的な結合ア
ッセイに用いることができる。 例えば、新規のインターロイキン-1受容体アン
タゴニストポリペプチドまたは断片と試験される薬剤との間での複合体の形成を
測定したり、あるいは新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプ
チドと、当該技術分野で周知の適切な細胞系との間での複合体の形成の減り方を
検定する。

【０１９６】 6.7.11.1 抗インターロイキン-1受容体活性のアッセイ ある実施態様によれば、本発明のポリペプチドのインターロイキン-1受容体ア
ンタゴニスト活性は、決定方法、すなわち、(1) インターロイキン-1、インター
ロイキン-1受容体、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプ
チド、および／またはそのアゴニストおよびアンタゴニスト（またはアゴニスト
またはアンタゴニスト薬剤候補物質）、および／または本発明のインターロイキ
ン-1受容体アンタゴニストポリペプチドに特異的な抗体を含む混合物を形成し、
(2) 前記本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチド、およ
び／またはそのアゴニストおよびアンタゴニスト（またはアゴニストまたはアン
タゴニスト薬剤候補物質）、および／または本発明のインターロイキン-1受容体
アンタゴニストポリペプチドに特異的な抗体の存在を除けば、インターロイキン
-1がインターロイキン-1受容体と結合するような条件下で、該混合物をインキュ
ベートし、および(3) インターロイキン-1のインターロイキン-1受容体への特異
的な結合の有無を検出する、ことを含む方法を用いて決定される。

【０１９７】 6.7.11.2 アンタゴニストおよびアゴニストのアッセイ 血清を含まないDulbeccoの修飾イーグル培地にて、ヒトのHepG2細胞を、37℃
で、18〜24時間インキュベートした。 様々な濃度のインターロイキン-1を補充
した同じ培地および様々な濃度の本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニ
ストを補充した同じ培地にて、細胞の分離単層をインキュベートした。 単層を
、等張性の緩衝液で念入りに濯ぎ、(35-S)メチオニン、250mu ci/mlのメチオニ
ンを含まない培地でインキュベートし、そして、合成の評価を行うために、15〜
30分の時間をかけて基質を適用した。 細胞培養液を廃棄し、単層を再度濯ぎ、
そして、細胞溶解用緩衝液で再懸濁した。 これら細胞溶解物での新たに合成さ
れた放射標識した肝臓タンパク質を、免疫沈降、SDS-PAGEおよび蛍光間接撮影法
によって検出する。

【０１９８】 6.7.12.抗炎症活性 本発明のタンパク質は、抗炎症活性も呈し得る。 抗炎症活性は、炎症性応答
に関与する細胞に対して刺激を与え、細胞−細胞相互作用（例えば、細胞接着な
ど）を阻害もしくは促進し、炎症プロセスに関与する細胞の化学走性を阻害もし
くは促進し、細胞の管外遊出を阻害もしくは促進することによって、または炎症
応答をより直接的に阻害もしくは促進するその他の因子の産生を刺激もしくは抑
制することによって、達成され得るものである。 かかる活性を呈するタンパク
質は、限定を意図するものではないが、感染に関わる暗示（敗血症性ショック、
敗血症もしくは全身性炎症反応症候群(SIRS)など）、虚血性再灌流傷害、致死的
内毒素、関節炎、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン
で誘導される肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病またはTNFもしくはIL-1などの
サイトカインの過剰産生に起因する疾患を含めた、慢性もしくは急性状態の何れ
の炎症状態を処置するのにも使用することができる。 本発明のタンパク質はま
た、アナフィラキシーおよび抗原物質もしくは材料への過敏症を処置するのにも
有用であるかもしれない。 特に、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴ
ニストは、例えば、限定を意図するものではないが、敗血症、急性膵炎、内毒素
ショック、サイトカイン誘発ショック、慢性関節リウマチ、慢性関節炎、Ｉ型真
性糖尿病由来の膵臓細胞損傷、対宿主性移植片病、腸炎疾患、気管支炎および慢
性気管支炎を含む肺疾患関連炎症、他の自己免疫疾患、またはアレルギー、とり
わけ慢性アレルギーを含む炎症疾患に関与する障害の予防および／または治療の
ための方法の一部として、また、急性または慢性骨髄性白血病などのための抗増
殖剤、または子宮内感染に起因する早期分娩の予防において、予防または状態の
治療のために利用される。

【０１９９】 6.7.12.1.IL-13抗炎症活性の調節 本発明のIL-1-Hy1タンパク質は、抗炎症サイトカインIL-13の発現を誘導する
ことができる。 結果として、IL-1 Hy1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドま
たはIL-1 Hy1活性のアンタゴニストが、IL-13活性が関与している任意の多くの
病理学状態で、治療的干渉のために使用できる。

【０２００】 たとえば、最近の動物モデルでのデータは、IL-13が、アトピー喘息 （Ahmed
et al., Exp Clin Immunogenet 17（1）：18-22 （2000））、気管支上皮粘膜分
泌の刺激および平滑筋過応答 （Heinzmann et al., Hum Mol Genet 9（4）：549
-59 （2000））を促進する中心となるサイトカインであることを示唆している。

【０２０１】 IL-13シグナル伝達の変異体は、ヒト喘息の重要なプロモーターである （Hein
zmann et al.,Hum Mol Genet 9（4）：549-59（2000））。 IL-4とレセプター
成分およびシグナル伝達系路を共有しているIL-13が、免疫グロブリンEおよび好
酸球に依存しない態様で、アレルギー性喘息の発現に必要かつ十分であることが
明らかになった （Wills-Karp et al., 282（5397）：2258-61（1998））。 従
って、IL-1 Hy1アンタゴニストを介したIL-13活性の阻害は、喘息の副作用を減
少させることが期待される。

【０２０２】 しかしながら、他のデ-タは、（ヒトIL-4ではなくて）IL-13が、気道中の好酸
球刺激活性の生成を減少させることに関与する可能性のある機構にて、TNF−α
−または抗原-感作モルモットで抗炎症活性を示すことを示唆している（Watson
et al., J.Respir, Cell Mol Biol. 20（5）：1007-12（1999））。 IL-13は、
少なくとも部分的に気管支粘膜への好酸球の漸増を促進することを介して、アト
ピー性および非アトピー性喘息の病因において役割を果たす可能性がある （Humbert et al.,J Allergy Clin Immunol 99（5）：657-65（1997））。

【０２０３】 IL-13の投与は、１型糖尿病の予防での潜在的な治療的アプローチとして提案
されてきた（Kretowski et al., Scand J Immunol 51（3）：321-5 （2000））
。 糖尿病-プロンノノベース糖尿病（NOD）マウスでの１型糖尿病の発達でのIL-13
処置により、hIL-13が、NODマウス中での免疫炎症糖尿病化経路をダウンレギュ
レートできることが示唆された（Zaccone et al., Diabetes 48（8）：1522-8
（1999））。 従って、IL-Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびアンタゴ
ニストの投与は、１型糖尿病の予防または治療に有用であることが予想される。

【０２０４】 最近の発見により、アレルギー性反応の調節でのIL-12およびIL-13に関する役
割が示唆され、グルココルチコイドの臨床的効果が、少なくとも部分的に、サイ
トカイン産出の調節を介して仲介されるという概念を支持している （Naseer et
al., Am J Respir Crit Care Med 155（3）：845-51（1997））。 さらなる発
見によって、アレルゲンおよび寄生体の種々のアレイに対する生理学的応答の調
節におけるIL-13の異なった役割が示唆されている（Corry,Curr Opin Immunol 1
1（6）：610-4（1999））。 例えば、IL-13は、トランスジェニックマウスでの
IL-13が、IL-4の発現が無い場合でさえも通常抵抗性のC57BL/6マウス種を、森林
型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）感染に対して感受性にすることを示
すデータに示唆されるように、森林型熱帯リーシュマニア感染に対する感受性を
決定する鍵となる因子であることが示されている（Matthew et al., J Immunol
164（3）：1458-62（2000））。 同様に、蠕虫誘導炎症および線虫感染に対す
る保護免疫でのIL-13の役割が、IL-13が免疫応答および感染に対する宿主保護に
おいて、IL-4と等しいか、またはより大きな重要性を持ちうることを示唆した最
近の観察で示された（Finkelman et al., Curr Opin Immnol 1999 Aug；11（4）
：420-6）。 また、データは、腸線虫感染への抵抗性におけるIL-13の役割を示
唆している（Bancroft et al., J Immunol 160（7）：3453-61（1998））。 ま
た、他のデータは、IL-13発現が、アレルゲン誘導遅延型鼻応答（LNR）の顕著な
性質であること、およびステロイド治療に続くLNRの阻害が、部分的にIL-13発現
の阻害に関与している可能性があることを示唆している（Ghaffar et al.,
Am J Respir Cell Mol Biol 17（1）：17-24（1997））。 IL-13発現の増加は
また、慢性静脈洞炎を伴うアレルギー性または非アレルギー性患者の重要な特徴
である（al Ghamdi et al., J Otolaryngol 26（3）：160-6 （1997））。 IL-
13は、アトピー性皮膚炎（AD）の発達においていくつかの役割を果たしている可
能性がある（Takamatsu et al., Dermatology 196（4）：377-81（1998））。
IL-13のmRNAのレベルは、対照と比較して、ADの患者のPBMCにて有意に高く、こ
のことは、IL-13発現の増加が、ADの患者でのIgEのin vivo合成を調節する可能
性があることを示唆している（Katagiri et al., Clin Exp Immnol 108（2）：2
89-94 （1997））。

【０２０５】 IL-13はまた、IL-10のものと同様であるが、しかし依存しない様式で、LPS-誘
導致死内毒素血症からの保護を提供し、従って、敗血症ショックの処置において
有益である可能性のあるサイトカイン免疫調節剤のリストに加えることができる
（Muchamuel et al., J Immunol 158（6）：2898-903（1997））。 IL-13（0.5
μｇ／マウス）は、LPS感作の24時間または４時間前、または同時のいずれかで
投与した場合に、リポポリサッカライド（LPS）の致死効果を劇的に減少させる
（Nicoletti et al.,Eur J Immunol 27（6）：1580-3（1997））。 従って、IL
-1Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他のアゴニストは、内毒素血症の
副作用に対して保護することが期待される。

【０２０６】 IL-13はまた、関節炎の病原の種々の側面を抑制すると報告され（Evans et
al., Intern Med 38（3）：233-9（1999））、従って、IL-1Hy1ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、または他の薬剤は、関節炎の処置に有用であることが期待さ
れる。

【０２０７】 IL-13の関与がまた、種々の他の病理学的状態で示唆された。 例えば、デー
タは、ホーキンス病でのインターロイキン13の役割を示唆している（Fricker,Mo
l Med Today 5（11）：463（1999））。 IL-13は、STAT6を活性化し、虚血／再
灌流によって誘導される肝臓傷害を抑制する。 IL-13は、肝臓好中球漸増を抑
制し、幹細胞傷害および肝臓浮腫いずれも減少させる（Yoshidome et al.,Am J
pathol 155（4）：1059-64（1999））。 IL-13の投与は、重症ブドウ膜炎に対
する治療に対して有用であるようにみられる（Roberge et al.,Br J Ophthalmol
82（10）：1195-8（1998））。 インターロイキン13（IL-13）受容体はまた、
いくつかの試験したAIDS-KS細胞株にて過剰発現していることが観察された（Hus
ain et al., Clin Cancer Res 3（2）：151-6（1997））。 IL-13のようなTh2
サイトカインは、木村病の発達にて役割を果たす（Katagiri et al., Br J Derm
atol 137（6）：972-7（1997））。 その結果から、子宮内膜症の女性の腹膜液
におけるIL-13量の減少が、マクロファージの活性の抑制を欠く可能性があり、
これがこの疾患の全体の病因に関与することを示唆している（McLaren et al.,H
um Reprd 12（6）：1307-10（1997））。 IL-13は、全身性硬化症（SSc）の患
者での全身性炎症の血清学的指標であり得る（Hasegawa et al., J Rheumatol 2
4（2）：328-32（1997））。

【０２０８】 6.7.12.2 IL-18、IL-12およびIFN-γ関連疾病の調節 IL-1Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびアゴニストの投与はまた、 IL-18、IL-12および／またはIFNγ関連疾病の処置に関して有用であると期待さ
れる。 IL-1Hy1は、IL-18およびIL-12誘導IFN-γ産生を含むIL-18およびIL-12
の活性を阻害する。

【０２０９】 IL-18は、活性化Ｔ細胞集団の刺激、NK細胞細胞溶解活性の増強、INFγ分泌の
誘導、Fasリガンド発現および機能の増強、および活性化Ｔ細胞による顆粒球−
マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）産生の刺激を含む様々な生物学的活
性を持つことが明らかになった。 IL-18は、ウイルスおよび細胞内感染を中和
し、腫瘍形成を抑制することが示された。 しかしながら、IL-18はまた、内毒
素誘導ショック、（内毒素誘導肝障害、肝炎、胆道閉鎖症および肥満関連脂肪肝
を含む）肝臓傷害、および自己免疫疾患を含む、慢性炎症疾患の病原的進展に関
与する。 IL-18産生に関連する他の疾病には、メリオドーシス、プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ欠失、森林型熱帯リーシュマニアおよび黄色ブドウ球菌（
Staphylococcus aureus）感染、吸血性リンパ組織球増多症、単核細胞症および
虚血または虚血／再灌流傷害が含まれる。

【０２１０】 炎症は、（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、ウイルス、真菌および原生動物
および蠕虫のような寄生虫を含む）病原性微生物による感染、（腎臓、肝臓、心
臓、肺または角膜のような固体器官の拒絶、ならびに移植片対宿主疾患（GVHD）
を含む骨髄移植移植片拒絶を含む）移植拒絶の結果であると考えられ、または、
局在化慢性または急性自己免疫またはアレルギー反応の結果であり得る。 自己免疫疾患には、急性糸球体腎炎、リウマチ様または反応性関節炎、慢性糸球
体腎炎、クローン病のような炎症腸疾患、潰瘍性大腸炎および壊死腸炎、顆粒球
伝達関連症候群、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬のような皮膚病、全身性
エリテマトーデス（SLE）、自己免疫甲状腺炎、多発性硬化症、いくつかの形態
の糖尿病、または対象の自己免疫系による攻撃が結果として病原性組織破壊とな
る任意の他の自己免疫状態が含まれる。 アレルギー性応答には、アレルギー性
関節炎、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎、急性または遅延型過敏症が含まれる
。 全身性炎症疾患状態には、には、外傷、火傷、（例えば、心筋梗塞および発
作を含む、心臓、脳、腸または末梢血管での血栓のような）虚血現象に続く再灌
流傷害、敗血症、ARDSまたは多重器官機能不全症候群が含まれる。 炎症細胞の
増加もまた、アテローム性動脈硬化症プラークにて起こる。

【０２１１】 全身性炎症応答の内毒素活性化は、細菌および／または内毒素関連ショック、
発熱、頻脈、頻呼吸、サイトカイン過刺激、血管透過性の増加、低血圧、補体活
性化、血管内凝固の散在化、貧血、血小板減少症、白血球減少症、肺水腫、成人
呼吸窮迫症候群、腸虚血、腎不全および欠損、および代謝アシドーシスを含む多
くの疾病を導く。

【０２１２】 肝炎は、急性または慢性状態として出現する肝臓炎症および壊死によって特徴
づけられる肝臓疾病を示す。 これらの肝臓疾病には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ
型肝炎（非Ａ、非Ｂ肝炎）、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎のようなウイルス誘導肝炎、ア
セトアミノフェン肝毒性、ハロタン肝毒性、メチルドーパ肝毒性、イアオニアジ
ド肝毒性、バルプロン酸ナトリウム肝毒性、フェニトイン肝毒性、クロロプロマ
ジン肝毒性、アミオダロン肝毒性、アミオオイダロン肝毒性、エリスロマイシン
肝毒性、経口避妊薬肝毒性、17,α-アルキル−弛緩同化作用ステロイド肝毒性お
よびトリメトプリムスルファメトキサゾール肝毒性のような毒素および薬剤誘導
肝炎、胆汁鬱滞性肝炎、アルコ-ル性肝炎、自己免疫慢性活性肝炎、およびＴ細
胞仲介肝炎が含まれる。 肝臓傷害を引き起こす他の状態は、先天性二元閉鎖、
肥満関連脂肪肝および常染色体退縮血球貪食リンパ組織球増殖（HLH）である。

【０２１３】 IL-18誘導IFNγは、肝臓傷害において役割を果たす。 IFNγは、Tsuji et al
（J.Immunol. 162：1049-55, 1999）にて記述されたようなプロピオン酸菌属挫
瘡感染に続くLPS-誘導肝臓傷害を仲介することが示された。 多数のマクロファ
ージおよびリンパ球が、結果として肉芽腫の肝臓内形成となるP.acnes感染に対
する応答での部分的な領域に浸潤する。 IFNγ−ノックアウトマウスは、マク
ロファージの浸潤が少なく、肉芽種の数および大きさの減少を示した。 後続の
低用量のLPSによる処置によった結果、多量肝臓壊死を引き起こし、正常マウス
では、IL-12、IL-18およびTNF-αを増加させる一方で、ノックアウトマウスは、
IL-12、IL-18およびTNF-α血清濃度の劇的な減少を示した。 IFNγ中和抗体の
添加もまた、IL-18およびIL-12濃度の減少を引き起こした。 肝臓傷害のこのモ
デルは、LPS誘導肝臓傷害が、IL-18、IL-12およびIFN-γの濃度の増加と関連す
ることを指し示している。 IL-1βがLPSにて誘導されることが知られているの
で、IL-1βもまたこの疾病で役割を果たしている。 IL- Raでの処置は、IL-18誘導IFN-γ産生およびIL-1βによる肝臓傷害の程度を調節
する可能性がある。

【０２１４】 IL-18はまた、コンカバリンＡでの処置がFiorucci et alにて記述されたよう
に、マウスにて肝炎を誘導する免疫仲介肝炎モデルに関与すると示された （Gastroenterology 118：404-21, 2000）。 このモデルでは、CD＋Ｔ細胞およ
びTh1-様サイトカインが、Fas仲介肝臓細胞死を引き起こす。 アスピリンの酸
化窒素誘導体での処置で、IFNγ、IL-18、IL-12、IL-1βおよびTNF-αの産生を
減少させることによって、この細胞死に対して保護される。 さらに、IL-18に
対する中和抗体は、IFNγ産生の減少および、conAによって誘導された肝臓傷害
の減少を引き起こした。

【０２１５】 HLHは、早期幼児期に顕在化する致死常染色体劣性形質疾患である。 この疾
患は、発熱、肝脾腫大症、血球減少症および活性化リンパ球およびマクロファー
ジによる生器官の広範囲な浸潤によって特徴づけられる。 HLHの患者は、IL-18
の血清濃度の上昇を示す。 IL-18は、HLH患者におけるTh1細胞の誘導において
重要な役割を果たす（Takada et al.,Br.J.Haemtaol.106：182-9,1999）。

【０２１６】 IL-1Hy1は、IFNγのIL-18誘導産生を抑制する。 上記したモデルにおいて、I
L-18活性の程度は知られていない。 IL-1βはLPSによって誘導されることが知
られており、IL-1βもまたこれらの状態の病原性において、役割を果たす可能性
がある。 望ましい量のHL-1Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他のア
ゴニストの存在によって、IL-18誘導IFNγ産物およびIL-18の双方による疾患の
程度が調節される可能性がある。

【０２１７】 IL-12は、IFNγ産生、およびNK細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の細胞溶解活性を
増強することが知られている。 これらの免疫調節効果により、癌および感染性
疾患の治療におけるIL-12の役割が推察されてきた。 しかしながら、これらの
同様の治療効果はまた、多発性硬化症、移植拒絶、細胞毒性のような自己免疫疾
患および慢性炎症状態を促進しうる。

【０２１８】 IL-12およびIFN-γは、多発性硬化症（MS）の病因に関与する。 実験的アレ
ルギー性脳脊髄炎動物モデル（EAE）において、中枢神経系における脱髄性効果
が、MSを患っているヒトと同様に起こる。 最近IFNγが、MSの治療に使用され
ている。 IFNγ処置の機構は、MS患者におけるIFNγ産生Ｔ細胞の数を減少させ
るものである可能性がある（Rep et al.,J.Neuroimmunol.96：92-100,1999）。

【０２１９】 さらに、血液リンパ球でのIFNγ産生が、MS患者の障害スコアと相関すること
が明らかになった（Perereit et al., Mult.Scler.6：19-23, 2000）。 IL-12に対する抗体が、マウスにおけるEAEのスーパー抗原の誘導および自発性再
発を予防することが明らかになった（Constantineseu et al., J.Immunol.161：
5097-5104, 1998）。 これらすべての研究は、ヒト患者におけるMSの進展にお
けるIL-12誘導IFNγ産生の関与を指摘している。 従って、IFNγ産生を減少さ
せるためのIL-1Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他のアゴニストでの
処置が、MS患者に対する有用な治療である可能性がある。

【０２２０】 IL-12とIL-2の組合せが、in vivoにおける相乗抗腫瘍用活性を持つ。 しかし
ながら、この組合せは、臨床試験において、結果として、有意な毒性および続く
ショックならびに死亡率となる（Cohen, Science 270：908, 1995）。 Carson
et al.,（J.Immunol., 162：4943-5, 1999）で研究されたネズミモデルにおいて
、致死全身性炎症応答がNK細胞依存であり、IL-1、TNF-αおよびIFNγのような
系での他のエフェクター分子に関与しないこと確定された。 IL-1Hy1ポリヌク
レオチド、ポリペプチドまたは他のアゴニストは、IN-12誘導IFN-γ産生を阻害
することが期待され、NK細胞細胞溶解性活性のようなIL-12の生物学的活性を阻
害することが期待される。 IL-Ra投与を介したNK細胞活性は、IL-12抗腫瘍治療
の結果である毒性を減少させる可能性がある。

【０２２１】 IL-12および／またはIL-18活性におけるIL-1Hy1の効果は、これらのサイトカ
インの生物学的活性を測定することによって決定してよい。 IL-12および IL-18両方が、Ｔ細胞においてIFNγ産生を誘導することが知られている。 IFN-
γに加えて、IL-12およびIL-18の組合せが、IL-3、IL-6およびTNFの産生を増加
させる。 IL-1Hy1での処置が、IL-12およびIL-18によって誘導されるIFNγの産
出を減少させることが期待される。 IL-1Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチド
または他のアゴニストにて処置した患者からの組織または体液試料中のIFNγの
循環または局所濃度は、IL-18およびIL-12関連疾病におけるIL-1Hy1の治療的効
果の指標である可能性がある。 組織試料には、炎症または他の疾患に関与する
領域からの組織試料が含まれる。 体液試料には、例えば、全血、血漿、血清、
脳脊髄液、滑液、（洗浄液または滲出液を含む）腹膜液、（洗浄液または滲出液
を含む）胸膜液、（洗浄液または滲出液を含む）傷液が含まれる。

【０２２２】 さらに、IL-12は、NK細胞を活性化し、血清IgE濃度を減少させることが知られ
ている。 これらのアッセイはまた、IL-12関連疾病に対するIL-1Hy1処置効果を
測定するのに使用してもよい。 IL-1Hy1ポリヌクレオチド、ポリペプチドまた
は他のアゴニストにて処置した患者におけるNK細胞細胞溶解活性は、患者の血液
試料のin vitroでの大腸癌またはリンパ腫細胞を溶解する能力を測定することに
よってアッセイできる（Lieberman et al., J.Sur.Res.,50：410-415, 1992）。

【０２２３】 さらに、IL-1Hy1にて処置した患者からのIgEの血清濃度は、IL- 12関連疾病に対する処置の効果を決定するために測定できる（Kiniwa et al.,J.
Clin.Invest.,90：262-66,1992）。

【０２２４】 6.7.13.白 血 病 白血病および関連障害は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チドの機能を促進または阻害する治療剤を投与することによって、処置または防
止され得る。 このような白血病および関連障害には、急性白血病、急性リンパ
球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性
、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性
白血病（以上の障害の総説については、Fishmanら, 1985, Medicine, 第2版、J.
B. Lippincott Co., Philadelphia）が包含されるが、それらに限定されない。

【０２２５】 6.7.14.神経系障害 神経系の障害は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの活
性をモジュレートする化合物で、介入の効率について調べることができる細胞型
に関与しており、そのため、かように治療用途の徴候を観察することで処置する
ことができるもので、それには神経系の傷害、そして軸索の連絡切断、ニューロ
ンの減損もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こすような疾患または障
害が包含されるが、それらに限定されない。 本発明によって処置され得る患者
（ヒトおよびヒト以外の哺乳動物患者を含む）の神経系傷害には、中枢（脊髄、
脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の傷害が包含されるが、それらに
限定されることはない。 (i) 物理的傷害によって惹起される傷害、または、例えば、神経系の一部を切断
する傷害もしくは圧縮傷害などの外科に関わる傷害を包含する外傷性傷害； (ii) 神経系の一部における酸素の欠乏が、脳梗塞もしくは脳虚血を含めた神経
障害もしくは神経死を引き起こす虚血性傷害、または脊髄梗塞もしくは虚血； (iii) 感染の結果、例えば、膿瘍によって、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状
ヘルペス、もしくは単純ヘルペスウイルスによる感染に関わるか、もしくはライ
ム病、結核、梅毒に関わって、破壊もしくは傷害を与えられた神経系の一部にお
ける感染性傷害； (iv) 限定を意図するものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハ
ンチントン舞踏病もしくは筋萎縮性側索硬化症を包含する変性プロセスの結果、
破壊もしくは傷害を与えられた神経系の一部における変性傷害； (v) 限定を意図するものではないが、ビタミンＢ12欠乏、葉酸欠乏、ウェルニッ
ケ病、タバコ−アルコール性弱視、マルキアファーヴァ・ビニャーミ病（脳梁の
一次変性）およびアルコール性小脳変性を包含する栄養障害もしくは代謝の障害
によって、破壊もしくは傷害を与えられた神経系の一部における栄養性疾患もし
くは栄養障害に関わる傷害； (vi) 限定を意図するものではないが、糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル
麻痺）、全身性エリテマトーデス、ガン腫、もしくはサルコイドーシスを包含す
る全身性疾患に関わる神経学的傷害； (vii) アルコール、鉛、もしくは特定の神経毒を含む毒性物質によって惹起され
る傷害；および (viii) 限定を意図するものではないが、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス
に関わる脊髄症、横断脊髄障害を包含する脱髄疾患もしくは様々な病因、進行性
多巣性白質脳症、および橋中央ミエリン溶解によって破壊もしくは傷害を与えら
れた神経系の一部における脱髄傷害。

【０２２６】 神経系障害の処置のために有用な本発明の治療剤は、ニューロンの生存または
分化を促進する生物学的活性を試験することによって選択され得る。 例えば、
以下の効果、すなわち、 (i) 培養でのニューロンの生存時間の増大； (ii) 培養もしくはin vivoでのニューロンの出芽の増大； (iii) 培養もしくはin vivoでのニューロン関連分子、例えば、運動ニューロン
に関してはコリンアセチルトランスフェラーゼもしくはアセチルコリンエステラ
ーゼなどの産生の増大；または (iv) in vivoでのニューロン機能障害の症状の減少 の何れかを奏する治療剤が本発明において有用であるが、それらに限定されな
い。 このような効果は、当該技術分野で知られている方法によって測定され得
る。 好ましい非限定的な実施態様において、ニューロンの生存の増大はArakaw
aら (1990, J. Neurosci. 10:3507-3515)によって測定され得；ニューロンの出
芽の増大はPestronkら (1980, Exp. Neurol. 70:65-82)またはBrownら (1981, A
nn. Rev. Neurosci. 4:17-42)によって測定され得；ニューロン関連分子の産生
の増大は、測定されるべき分子によって、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体
結合、ノザンブロットアッセイ等によって測定され得；そして、運動ニューロン
障害機能は、例えば、衰弱、運動ニューロン伝導速度、もしくは機能的能力障害
などの運動ニューロン障害の身体的症状を評価することによって測定され得る。

【０２２７】 特定の実施態様において、本発明によって処置され得る運動ニューロン障害に
は、梗塞、感染、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、運動ニューロンと神経系の
他の成分にも作用し得る変性疾患もしくは悪性腫瘍、そして筋萎縮性側索硬化症
など選択的にニューロンに作用する障害を含み、そして進行性脊髄筋萎縮症、進
行性延髄麻痺、一次萎縮性側索硬化症、幼児性および若年性筋萎縮、小児の進行
性延髄麻痺（ファチオ・ロンデ症候群）、灰白髄炎および小児麻痺後症候群、な
らびに遺伝性運動知覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・ツース病）などの
障害が包含されるが、それらに限定されない。

【０２２８】 6.7.15.他の活性 本発明のタンパク質は、１つ以上の以下の他の活性または効果、すなわち；限
定を意図するものではないが、細菌類、ウイルス類、真菌類および寄生体類を含
む感染性因子の成長、感染もしくは機能を阻害すること、または前記薬剤で死滅
させること；限定を意図するものではないが、身長、体重、髪の色、目の色、皮
膚、痩せ具合に対する肥満度もしくは他の組織の色素沈着、または器官もしくは
体の部分サイズもしくは外観（例えば、胸部の増大もしく縮小、骨の形態もしく
は外観の変化など）を含む身体的特徴に変化をもたらすこと（抑制または増強す
ること）；バイオリズムまたはカリカディックサイクルもしくはリズムに変化を
もたらすこと；雄性または雌性の対象の生殖能力に変化をもたらすこと；食事の
脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン類、ミネラル類、コファクターま
たは他の栄養因子もしくは成分（類）の代謝、異化、同化、加工、利用、貯蓄ま
たは排除に変化をもたらすこと；限定を意図するものではないが、食欲、性的衝
動、ストレス、（認識障害を含む）認識、（抑うつ性の障害を含む）減退および
暴力行動を含む行動特徴に変化をもたらすこと；鎮痛効果または他の痛みを緩和
する効果を提供すること；造血細胞系以外の細胞系における胚幹細胞の分化と成
長をプロモーションすること；ホルモン活性または内分泌活性；酵素の場合、前
記酵素の欠失を是正し、欠失に関連した疾患を治療すること；過増殖性障害（例
えば、乾癬など）の治療；イムノグロブリン様活性（例えば、抗原または補体と
結合する能力など）；ならびに、このようなタンパク質、またはこのようなタン
パク質と交差反応性のある別の材料または実体物に対する免疫応答を生じるため
のワクチン組成物において抗原として行動する能力、を示してもよい。

【０２２９】 6.8.治療方法 本発明の新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストは、様々な治療方法
において、無数の適用態様がある。 治療上の適用例を、以下に例示するが、こ
れらに限定されない。

【０２３０】 6.8.1.敗血症 本発明の一態様では、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリ
ペプチドの有効量を、敗血症が進行する危険性が高かったり、すでに敗血症が進
行している患者へ投与する。 前者の例として、外科処置を受けた患者などがあ
る。 投与形態は特に重要ではないものの、敗血症の迅速な進行が故に阻害剤を
全身に素早く行き渡らせる必要からして、非経口の投与が好ましい。 よって、
好ましい投与態様は、外科処置の前、処置の間、または処置の後に、少量の丸剤
を静脈注射で送達する方法である。 本発明のインターロイキン-1受容体アンタ
ゴニストポリペプチドの用量は、通常は、処方医師によって決定される。 この
用量は、患者の年齢、体重および応答に応じて変化するであろう。 通常は、用
量当たりに投与された阻害剤の量は、約0.1〜25mg／体重kg、好ましくは、約0.1
〜10mg／体重kgの量である。 非経口投与にあっては、本発明のインターロイキ
ン-1受容体アンタゴニストポリペプチドは、薬学的に許容可能な非経口賦形剤と
組み合わせた注射可能な形態に調製される。 かような賦形剤は、当該技術分野
では周知のものであり、その例として、水、生理食塩水、リンガー液、デキスト
ロース液、および少量のヒトの血清アルブミンからなる溶液がある。 この賦形
剤には、阻害剤の等張性と安定性を維持する小量の添加剤が含まれる。 かよう
な溶液の調製は、当該技術分野の範囲内のものである。 通常、サイトカイン阻
害剤は、賦形剤を、約１〜８mg/mlから10mg/mlの濃度で含むように調製される。

【０２３１】 6.8.2.関節炎および炎症 慢性関節リウマチに対するインターロイキン-1阻害剤による免疫抑制効果は、
実験用動物モデル系にて決定される。 実験モデル系は、アジュバンドで誘発し
た関節炎を患ったラットとし、また、プロトコールは、J. Holoshitz, et al.,
1983, Science, 219:56、またはB. Waksman et al., 1963, Int.Arch.Allergy
Appl. Immunol., 23:129に記載されたものとする。 疾患の誘発は、一般的には
、殺菌したマイコバクテリウム結核菌を含む完全フロインドアジュバンド(CFA)
の懸濁液の単一注射によって行われる。 投与経路は変更できるが、ラットの場
合には、尻尾の根元にアジュバンド混合物を注射する。 阻害剤は、リン酸緩衝
液(PBS)にて、約１〜５mg/kgの用量で投与される。 対照には、PBSのみを投与
する。

【０２３２】 インターロイキン-1阻害剤の効果を試験する手順は、殺菌したマイコバクテリ
ウム結核菌を含むCFAを皮内に注射し、次いで、直後に阻害剤を投与し、そして
、１日おきに24日目まで処置を行うことからなる。 マイコバクテリウムCFAを
注射してから、14、15、18、20、22および24日目に、前出のJ. Holoskitzに記載
されたようにして、全体的な関節炎スコアを得る。 データの解析にて、関節炎
スコアの減少が測定されることで、阻害剤が関節の膨張に急激な影響を与えるこ
とを指し示すであろう。

【０２３３】 6.8.3.糖尿病 インターロイキン-1は、真性糖尿病(DM)での小島細胞の破壊に関与しているこ
とが示されている(Mandrup-Paulsen, T., K. Bendtzen, J. Nerup, C.A. Dinare
llo, M. Svenson and J.H. Nielson [1986] Diabetologia 29:63-67)。 本発明
のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドは、遺伝背景と家族歴
を踏まえた疾患感受性によって同定されたDMの初期症例での小島細胞に与える、
リンパ球およびマクロファージが媒介した損傷を制限する。 初期DMを患った患
者個々での膵臓β小島細胞の炎症破壊は、膵臓にて抗インターロイキン-1効果を
呈する本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドの非経口
投与によって軽減される。

【０２３４】 6.8.4.抗血圧降下性アルギニンを含まない調剤 治療用非経口調剤とは、薬学的に許容される賦形剤と共に、約３〜４g/lのイ
ソロイシン、約４〜６g/lのロイシン、約３〜４g/lのリシン、約１〜２g/lのメ
チオニン、約１〜２g/lのフェニルアラニン、約２〜３g/lのスレオニン、約0.5
〜1.5g/lのトリプトファン、約３〜４g/lのバリン、約４〜５g/lのアラニン、約
１〜２g/lのヒスチジン、約３〜４g/lのプロリン、約１〜２g/lのセリン、約0.2
5〜0.75g/lのチロシン、約４〜５g/lのグリシンおよび約２〜３g/lのアスパラギ
ン酸を含むものと定義される。 非経口調剤の他の好ましい態様では、この調剤
は、オルニチンをさらに含み、最も具体的には約１〜２g/lの濃度で含む。 非
経口調剤のさらに他の態様では、この調剤は、シトルリンをさらに含み、最も具
体的には約１〜約２g/lの濃度で含む。 この調剤のさらに他の態様では、シト
ルリンとオルニチンが共に含まれ、再び前述した濃度で用いられる。

【０２３５】 この方法は、薬理学的に許容される賦形剤と共に、すでに前記した濃度のすで
に前記したアミノ酸を含む、アルギニン不含の調剤を用いる。 また、この調剤
は、動物の尿素サイクル基質の生理学的要求濃度を満たすよう供給すべく、オル
ニチン、シトルリンまたは双方をさらに含む。 最も好ましくは、この調剤は、
非経口調剤として提供される。

【０２３６】 この方法の他の態様として、化学療法剤関連低血圧症を治療する方法を含む。
最も好ましい態様として、この方法は、全身性低血圧症の動物を検出するために
化学療法剤を投与した動物での収縮期血圧が約100mmHg以下にまで低下すること
をモニターし、治療上有効濃度のインターロイキン-1受容体アンタゴニストの投
与と同時または先行して投与された血漿または血清アルギニン濃度を低下せしめ
るに十分なアルギニン不含調剤の治療上有効量を用いた治療方法で、全身性低血
圧症の動物を処置し、そして、収縮期血圧が少なくとも約100mmHgにまで上昇し
たことが検出できるまで動物の治療を続ける、ことを含む。 最も好ましくは、
アルギニン不含調剤は、非経口調剤とする。

【０２３７】 好ましい態様において、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポ
リペプチドは、動物の低血圧症、特に、内毒素または敗血症ショックに曝すこと
で生じた低血圧症を処置するために、抗低血圧症アルギニン不含調剤との組み合
わせにおいて使用される。

【０２３８】 約100mmHg以下の収縮期血圧を示す患者を、この治療の対象とした。 この患
者は、米国特許第5,334,380号に記載された必須および非必須アミノ酸の混合物
を含むアルギニン不含調剤の連続供給に付される。 この患者は、同時に、本発
明のインターロイキン-1 Hy1受容体アンタゴニストポリペプチドで処置される。

【０２３９】 血液サンプルを患者から採血し、そして、血清または血漿画分でのアルギニン
のレベルが決定される。

【０２４０】 6.9.医薬製剤および投与経路 本発明のタンパク質（組換えおよび非組換え供給源に由来するものを含むが、
それらに限定されることなく、種々の供給源に由来する）は、必要とする患者に
、様々な障害を治療または改善するための用量で、前記タンパク質自体で、また
は前記タンパク質を適当な担体または（複数の）賦形剤と混合した医薬組成物で
投与してもよい。 このような組成物は（タンパク質および担体に加えて）、希
釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野でよく知
られた他の材料も含有していてもよい。 「薬学的に許容しうる」という用語は
、有効成分の生物学的活性の効果を妨害しない（複数の）非毒性の材料を意味す
る。 前記担体の特徴は、投与経路に依存するであろう。 また、本発明の医薬
組成物は、例えば、M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6
、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN、TNF0
、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリス
ロポエチンなどのサイトカイン類、リフォカイン類、または他の造血因子も含有
していてもよい。

【０２４１】 この医薬組成物は、前記タンパク質の活性を高めるか、あるいはその活性また
は治療における使用を引き立たせる他の薬剤をさらに含有していてもよい。 こ
のような追加の因子および／または薬剤は、本発明のタンパク質と共に相乗効果
を生じるため、または副作用を最小にするために、医薬組成物に含有されていて
もよい。 IL-1 Hy1と共に投与することができるタンパク質として、1999年５月
20日に出願された米国特許出願第09/316,081号に記載のIL-1aやIL-1HY2のような
その他のIL-1受容体アンタゴニストポリペプチドがある。 逆に、本発明のタン
パク質は、サイトカイン、リフォカイン、その他の造血因子、血栓溶解性もしく
は抗血栓性因子、または抗炎症剤の副作用を最小にするために、特定のサイトカ
イン、リフォカイン、他の造血因子、血栓溶解性もしくは抗血栓性因子、または
抗炎症剤の製剤に含有されていてもよい。 本発明のタンパク質は、それ自身ま
たは他のタンパク質との多量体（例えば、ヘテロダイマーもしくはホモダイマー
）または複合体において活性であってもよい。 結果として、本発明の医薬組成
物は、そのような多量体化した形態または複合体化した形態で本発明のタンパク
質を含んでいてもよい。

【０２４２】 本願化合物の製剤および投与の技術は、"Remington's Pharmaceutical Scienc
es," Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版に見い出しうる。 さらに治療
有効用量については、例えば、関連した医療状態の治療、治癒、予防もしくは改
善などの症状の改善、またはこのような状態の治療、治癒、予防または改善の速
度の増大を、結果としてもたらすに充分な化合物の量を参照する。 単独で投与
される個々の有効成分を適用する際は、治療上の有効用量は前記成分単独を参照
する。 組合わせて適用する際には、治療効果をもたらす有効成分の組合わせた
量、治療上の有効用量が連続してまたは同時に、組合せて投与されるかどうかを
参照する。

【０２４３】 本発明の治療または使用方法を実行する際、本発明のタンパク質の治療上の有
効量を治療すべき状態を有する哺乳類動物に投与する。 本発明のタンパク質は
、本発明の方法に従って、単独、あるいはサイトカイン類、リフォカイン類また
は他の造血因子を用いる治療などの他の療法との組合わせかのいずれかで投与し
てもよい。 １つ以上のサイトカイン類、リフォカイン類または他の造血因子と
共に投与する場合、本発明のタンパク質を、前記サイトカイン（類）、リフォカ
イン（類）、他の造血因子（類）、血栓溶解性もしくは抗血栓性因子類と同時に
、または連続的に投与してもよい。 連続的に投与する場合、担当する医師が前
記サイトカイン（類）、リフォカイン（類）、他の造血因子（類）、血栓溶解性
もしくは抗血栓性因子類と組合わせて、本発明のタンパク質を投与する適当な順
序を決定するであろう。

【０２４４】 6.9.1.投与経路 適当な投与経路は、例えば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与または腸投与；
髄腔内注射、直接心室内注射、静脈注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注
射に加えて、筋肉注射、皮下注射、骨髄内注射を含む非経口送達を含んでいても
よい。 前記医薬組成物において、または本発明の方法を実施するために用いら
れる本発明のタンパク質は、経口摂取、吸入、局所適用または皮膚注射、皮下注
射、腹腔内注射、非経口注射もしくは静脈注射などの、様々な通常の方法で投与
は、行うことができる。 患者への静脈投与が、好ましい。

【０２４５】 これとは別に、前記化合物を、例えば、関節炎の関節中にまたは線維症組織へ
の直接的な前記化合物の注射により、しばしばデポ製剤または持続性製剤の形態
で、全身的な手法よりもむしろ局所的な手法で投与してもよい。 緑内障手術の
合併症としてよく生じる傷跡を残す過程を予防するために、前記化合物を、例え
ば、点眼液として局所的に投与してもよい。 さらにまた、薬物を標的化した薬
物送達システムにおいて、例えば、関節炎組織または線維症組織を標的とする、
例えば、特異的な抗体でコーティングしたリポソームの形態で投与してもよい。
前記リポソームは標的化され、そして、罹患した組織によって選択的に吸収され
るであろう。

【０２４６】 6.9.2.組成物／製剤 それゆえに、本発明に従って使用する医薬組成物は、薬学的に用いることがで
きる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む１つ以上
の生理的に許容できる担体を用いる通常の方法で形成してもよい。 これら医薬
組成物は、それ自体既知の方法で、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣形
成、研和、乳化、カプセル充填、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造し
てもよい。 適当な製剤は、選択される投与経路に依存する。 治療上の有効量
の本発明のタンパク質が経口投与されるとき、本発明のタンパク質は、錠剤、カ
プセル剤、粉剤、溶液またはエリキシル剤の形態にできる。 錠剤形態で投与さ
れるとき、本発明の医薬組成剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体
を追加的に含んでいてもよい。 前記錠剤、カプセル剤および粉剤は、約５〜95
％の本発明のタンパク質を含み、好ましくは、約25〜90％の本発明のタンパク質
を含む。 液体形態で投与するとき、水、石油、ピーナッツ油、鉱油、大豆油ま
たは胡麻油などの動物性もしくは植物性油、または合成油などの液体担体を加え
てもよい。 前記医薬調製物の液体形態は、生理的塩溶液、デキストロースもし
くは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリ
エチレングリコールなどのグリコール類をさらに含んでいてもよい。 液体形態
で投与するとき、前記医薬調製物は、約0.5〜90重量％の本発明のタンパク質を
含み、好ましくは約１〜50重量％の本発明のタンパク質を含む。

【０２４７】 治療上の有効量の本発明のタンパク質を静脈注射、皮膚注射または皮下注射に
より投与するとき、本発明のタンパク質は、発熱物質を含まず、非経口的に許容
しうる水溶液の形態であろう。 充分に考慮されたpH、等張性、安定性などを備
えたこのような非経口的に許容しうるタンパク質溶液の調製物は、当該技術に存
在するものである。 静脈注射、皮膚注射または皮下注射用の好ましい医薬組成
物は、本発明のタンパク質に加えて、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキ
ストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸リンゲル注射
などの等張ビヒクル、または当該技術分野で既知の他のビヒクルを含む。 本発
明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤または当業者にと
って既知の他の添加剤をも含んでいてもよい。 注射用に、本発明の薬剤を水溶
液中で、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液または生理的食塩緩衝液などの
生理的に和合する緩衝液中で製剤化してもよい。 経粘膜投与用に、浸透すべき
バリアーに適した浸透剤を製剤中に用いる。 このような浸透剤は、当該技術分
野において、一般的によく知られている。

【０２４８】 経口投与用に、前記化合物は、活性化合物と当該技術分野において周知の薬学
的に許容しうる担体とを組合わせることによって容易に製剤化できる。 このよ
うな担体により、治療すべき患者による経口摂取のための、錠剤、ピル剤、糖衣
錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして
本発明の化合物を製剤化できる。 経口使用のための医薬調製物は、固体賦形剤
を加えることができ、錠剤または糖衣錠の核を得るために、得られた混合物を粉
砕し、必要に応じて、随意に好ましい助剤を添加した後に、顆粒の混合物に加工
する。 適した賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたは
ソルビトールを含む、糖類などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦
デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調
製物である。 必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン
酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩などの崩壊剤を添加しても
よい。 糖衣錠の核は、適当なコーティングを伴って提供される。 この目的で
、濃縮糖溶液を用いてもよく、この溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニル
ピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸
化チタン、ラッカー溶液類、および適当な有機溶媒または溶媒混合物類を随意に
含有する。 色素類または顔料類は、同定または活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴付けるために、錠剤または糖衣コーティングに添加してもよい。

【０２４９】 経口的に用いることができる医薬調製物は、ゼラチンからできている押込め嵌
めカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤
とからなるソフトなシールドカプセルを含む。 この押込め嵌めカプセルは、有
効成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタ
ルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに任意の安定化剤と
の混合物として含有できる。 ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、脂肪
油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール類などの適当な液体中に
溶解または懸濁してもよい。 加えて、安定化剤を添加してもよい。 経口投与
用の全ての製剤は、このような投与に適した投与形態であるべきである。 バッ
カル投与用に、組成物は、通常の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形
態としてもよい。

【０２５０】 吸入投与用に、本発明に従った使用のための化合物は、適当な高圧ガス、例え
ば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフ
ルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用した、加圧パックまたは
ネブライザーからのエアロゾルスプレー噴射の形態で好都合に送達される。 加
圧したエアロゾルの場合、投与単位は、測定した量を送達するための値を提供す
ることによって決定してもよい。 吸入器またはインサフレーターに用いる、例
えば、ゼラチンなどのカートリッジおよびカプセルは、化合物と、ラクトースま
たはデンプンなどの適当な粉体ベースとの粉体混合物を含有して製剤化してもよ
い。 化合物は、注射による、例えば、ボーラス投与または継続点滴による非経
口投与用に製剤化してもよい。 注射用の製剤は、単位投与形態で、例えば、ア
ンプルでまたは多用量容器にて、添加された保存剤と共に提供されてもよい。 組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳化剤のような形態
でもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの製剤化剤を含有し
ていてもよい。

【０２５１】 非経口投与用の医薬製剤は、水可溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。 加
えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製してもよい。 適当な親油性溶媒またはビヒクルには胡麻油などの脂肪油、またはオレイン酸エ
チルもしくはトリグリセライド類などの合成脂肪酸エステル類、またはリポソー
ム類が含まれる。 水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム
、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘性を増大する物質を含有し
ていてもよい。 任意に、前記懸濁液は、適当な安定化剤または化合物の安定性
を増大し高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤も含んでいてもよい。 あるいは、有効成分は、使用前に、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水など
の、適当なビヒクルを構成するための粉体形態であってもよい。

【０２５２】 また、化合物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリド類などの通常の坐剤
ベースを含有する、坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物に製剤化されてもよ
い。 前述の製剤に加え、化合物はまた、デポ調製物としても製剤化されてもよ
い。 このような持続性製剤は（例えば、皮下的にもしくは筋肉内に）、移植に
よって、または筋肉注射によって投与してもよい。 従って、例えば、化合物は
、適当なポリマーまたは親水性材料（例えば、許容しうる油中の乳化剤として）
もしくはイオン交換樹脂と共に、または、やや難溶性の誘導体として、例えば、
やや難溶性の塩として製剤化してもよい。

【０２５３】 本発明の親水性化合物用の薬学的担体は、ベンジルアルコール、無極性界面活
性剤、水混和性有機溶媒および水性相を含んでなる共溶媒系である。 共溶媒系
は、VPD共溶媒系であってもよい。 VPDは、無水エタノールにおける値にすると
、65重量／容量％ポリエチレングリコール300、８重量／容量％の無極性界面活
性剤ポリソルベート80、および３重量／容量％ベンジルアルコールの溶液である
。 VPD共溶媒系(VPD:5W)は、水溶液中５％デキストロースで１：１に希釈したVPDか
らなる。 この共溶媒系は、親水性化合物をよく溶かし、それ自体は全身投与に
おいて低毒性しか生じない。 当然、共溶媒系の比率は、その溶解性と毒性の特
徴を壊さない限りで変化させてもよい。 さらに、共溶媒系成分の同一性は、変
化してもよい；例えば、他の低毒性無極性界面活性剤をポリソルベート80に代え
て用いてもよく；ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変えてもよく
；他の生体適合性ポリマーを、ポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピ
ロリドンと置き換えてもよく；かつ、デキストロースの代わりに他の糖類または
多糖類を置き換えてもよい。 あるいは、親水性の医薬化合物用の他の送達シス
テムを使ってもよい。 リポソーム類および乳化剤は、親水性薬物用の送達ビヒ
クルまたは担体のよく知られた例である。 通常は、より大きな毒性が負担にな
るが、ジメチルスルフォキシドなどの特定の有機溶媒を用いてもよい。 加えて
、化合物は、治療薬を含有する固体親水性ポリマーの半透性マトリックスなどの
、持効性システムを用いて送達してもよい。 種々の持効性材料が確立されてお
り、当該技術分野でよく知られている。 持効性カプセル剤は、それらの化学的
性状に依存して、数週間から100日を超えて化合物を放出しうる。 治療試薬の
化学性状と生物学的安定性に依存して、タンパク質の安定化のための追加の戦略
を用いてもよい。

【０２５４】 医薬組成物はまた、適当な固体またはゲル相担体または賦形剤を含んでいても
よい。 これらの担体または賦形剤の具体例としては、これらに限定されないが
、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン類、セルロース誘
導体類、ゼラチン、およびポリエチレングリコール類などのポリマーなどが挙げ
られる。 本発明の多くのプロテイナーゼ阻害化合物を、薬学的に和合しうる対
イオンとの塩として提供してもよい。 このような薬学的に許容しうる塩基付加
塩は、フリーの酸の生物学的有効性と性質を保持している塩であり、水酸化ナト
リウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルア
ミン、モノアルキルアミン、二塩基性アミノ酸類、酢酸ナトリウム、安息香酸カ
リウム、トリエタノールアミンなどの無機または有機塩基との反応によって得ら
れる。

【０２５５】 本発明の医薬組成物は、本発明の（複数の）タンパク質とタンパク質またはペ
プチド抗原との複合体の形態であってもよい。 前記タンパク質および／または
ペプチド抗原は、ＢおよびＴリンパ球の両方に対する刺激シグナルを誘導するで
あろう。 Ｂリンパ球は、それらの表面イムノグロブリン受容体を介して抗原と
反応するであろう。 Ｔリンパ球は、MHCタンパク質による抗原提示に続いてＴ
細胞受容体(TCR)を介して抗原と反応するであろう。 MHCと宿主細胞上のクラス
ＩおよびクラスIIのMHC遺伝子によってコードされたタンパク質を含む構造的に
関連するタンパク質が、Ｔリンパ球に対して（複数の）ペプチド抗原を提示させ
るために働くであろう。 抗原成分は、精製したMHCペプチド複合体単独として
、またはＴ細胞に直接的にシグナルを送ることができる共刺激分子と共に供給で
きるであろう。 あるいは、TCRおよびＴ細胞上の他の分子と結合できる抗体に
加えて、表面イムノグロブリンおよびＢ細胞上の他の分子と結合できる抗体を、
本発明の医薬組成物と組合わせることができる。 本発明の医薬組成物は、他の
薬学的に許容しうる担体に加え、水溶液中のラメラ層、液晶、不溶性単層または
ミセルのような凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性の薬剤と本発明のタ
ンパク質が組合わされたリソゾームの形態であってもよい。 リポソーム製剤用
の適当な脂質として、モノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リ
ゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などがあるが、これらに限定されない
。 例えば、全て本明細書に参考文献として組込まれる、米国特許第4,235,871
号；第4,501,728号；第4,837,028号および第4,737,323号において記載されてい
るように、このようなリポソーム製剤の調製は、当該技術分野のレベルに含まれ
る。

【０２５６】 本発明の医薬組成物における本発明のタンパク質の量は、治療すべき状態の種
類と重篤度に依存するであろうし、患者が経験した先の治療の種類に依存するで
あろう。 最終的には、担当する医師が、それぞれ個々の患者を治療するために
本発明のタンパク質の量を決定するであろう。 最初に、担当医が低用量で本発
明のタンパク質を投与し、患者の反応を観察するであろう。 より多くの用量の
本発明のタンパク質を、患者にとって至適な治療効果が得られ、さらに薬用量が
増加しない量まで投与してもよい。 本発明の方法を実行するために用いる種々
の医薬組成物は、体重１kgあたり本発明のタンパク質を約0.01μｇから約100mg
（好ましくは約0.1μｇから約10mg、さらに好ましくは約0.1μｇから約１mg）含
有すべきことが企図される。 骨、軟骨、腱または靱帯再生のために有用な本発
明の組成物については、治療方法は、組成物を局所に、全身的に、またはインプ
ラントもしくはデバイスとして局所的に投与することを含む。 投与時、本発明
に用いる治療組成物は、もちろん、発熱物質を含まない、生理的に許容しうる形
態である。 さらに、組成物は、望ましくは、骨、軟骨または組織損傷の部位に
送達するために粘性形態において注入されるかカプセルに入れてもよい。 局所
投与は、傷の治癒と組織修復に適していてもよい。 前記したような組成物にも
任意に含まれる本発明のタンパク質以外の治療に有用な薬剤は、選択的にまたは
追加的に、本発明の方法における組成物と共に同時にまたは連続的に投与しても
よい。 骨および／または軟骨形成にとって好ましくは、組成物が骨および／ま
たは軟骨損傷の部位にタンパク質含有組成物を送達でき、骨および軟骨を発達さ
せる構造を提供し、最適に身体に再吸収されうるマトリックスを含んでいるであ
ろう。 このようなマトリックスは、他の移植された医療適用のために現在使用
されている材料で形成されていてもよい。

【０２５７】 マトリックス材料の選択は、生体適合性、生体内分解性、物理的性質、表面上
の外観および界面の性質に基づく。 組成物の特別な適用は、適した製剤を限定
するであろう。 組成物として可能性のあるマトリックスは、生体内分解性で、
化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三石灰、ヒドロキシアパタイト、ポ
リ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ無水物類であってもよい。 他の可能性の
ある材料は、生体内分解性でかつ生物学的によく定義された、骨または皮膚コラ
ーゲンなどである。 さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質類または細胞
外マトリックス成分を含んでなる。 他の可能性のあるマトリックスは、非生体
内分解性で化学的に定義される、焼結したヒドロキシアパタイト、生体ガラス、
アルミン酸塩類、または他のセラミックなどである。 マトリックスは、ポリ乳
酸とヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンとリン酸三石灰などの、前記したタ
イプの材料のいずれかとの組合せを含んでもよい。 バイオセラミックは、ポア
サイズ、粒子サイズ、粒子形、および生体内分解性を変えるために、カルシウム
−アルミン酸塩−リン酸塩の組成および加工において変更してもよい。 現時点
で好ましいのは、150〜800ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子形態の乳酸
とグリコール酸の50：50（モル重量）コポリマーである。 いくつかの適用にお
いて、タンパク質組成物がマトリックスから解離するのを防ぐために、カルボキ
シメチルセルロースまたはオーソローガス血餅などの、封鎖剤を利用するのに有
用であろう。

【０２５８】 前記封鎖剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ
ピル−メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含む、（ヒドロ
キシアルキルセルロースを含む）アルキルセルロース類などのセルロース性材料
であり、最も好ましくはカルボキシメチルセルロース(CMC)の陽イオン性塩であ
る。 他の好ましい封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（
エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマ
ーおよびポリ（ビニルアルコール）が含まれる。 本明細書で有用な封鎖剤の量
は、全製剤重量に基づいて0.5〜20重量％であり、好ましくは１〜10重量％であ
り、これは前記タンパク質のポリマーマトリックスからの脱着を防ぎ、組成物の
適当な取り扱いを提供するために必要な量を示しているが、初代細胞がマトリッ
クスに侵入するのを防ぐほどの量ではなく、これにより、タンパク質に初代細胞
の骨形成活性を援助する機会が与えられる。 さらなる組成物において、本発明
のタンパク質は、骨および／または軟骨欠損、傷、または問題となっている組織
の治療に有益な他の薬剤と組合わせてもよい。 これら薬剤には、上皮成長因子
(EGF)血小板由来成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF-αおよび
TGF-β）、およびインスリン様成長因子(IGF)などの種々の成長因子が含まれる
。

【０２５９】 また、現在のところ、この治療組成物は、獣医学的適用にも価値がある。 ヒ
トに加えて、特に飼い慣らされた動物およびサラブレッドの馬は、本発明のタン
パク質を用いたこのような治療が望まれる医療対象である。 組織再生に用いる
べきタンパク質含有医薬組成物の投与計画は、タンパク質の行動を修飾する様々
な因子、例えば、形成が望まれる組織重量の量、損傷の部位、損傷を受けた組織
の状態、傷の大きさ、損傷を受けた組織のタイプ（例えば、骨）、医療対象の年
齢、性別、および食餌、感染の厳しさ、投与の回数および他の臨床的因子を考慮
して担当医によって決定されるであろう。 薬用量は、再構成に用いるマトリッ
クスのタイプによって変化してもよいし、医薬組成物における他のタンパク質の
包含によって変化してもよい。 例えば、最終組成物へのIGF1（インスリン様成
長因子Ｉ）などの、他の既知の成長因子の添加は、薬用量にも変化をもたらすか
もしれない。 進行は、組織／骨の成長および／または修復の周期的な評価、例
えば、Ｘ線、組織形態決定およびテトラサイクリン標識によってモニターできる
。

【０２６０】 本発明のポリヌクレオチド類は、遺伝子治療にも用いることができる。 この
ようなポリヌクレオチド類は、in vivoかex vivoのいずれかで哺乳類対象におけ
る発現のために細胞に導入できる。 本発明のポリヌクレオチド類はまた、細胞
または器官に核酸を導入する他の既知の方法（ウイルスベクターまたはむき出し
のDNAの形態における方法が含まれるが、これらに限定されない）で投与しても
よい。 増殖させるため、または細胞に所望の効果をもたらすか活性を生じさせ
るために、前記細胞を、ex vivoで本発明のタンパク質の存在下で培養してもよ
い。 処置された細胞は、次いで、治療目的でin vivoで導入することができる。

【０２６１】 6.9.3.有効薬用量 本発明での使用に適した医薬組成物は、その意図される目的を達成する有効量
の有効成分を含有する組成物を含む。 さらに詳細には、治療上の有効量は、治
療を受ける対象の存在する症状の進行を妨げたり、緩和する効果がある量を意味
する。 有効量の決定は、特に本明細書の詳細な開示に照らし、充分に当業者の
能力の範囲内である。 本発明の方法に用いるいかなる化合物についても、治療
上の有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定できる。 例えば、用量は、
細胞培養で決定したようなIC₅₀を含んだ循環濃度を達成する動物モデルで処方で
きる（すなわち、C-プロテイナーゼ活性の最大阻害の半分を達成するテスト化合
物の濃度）。 このような情報は、ヒトにおける有用な用量をさらに精密に決定
するために使うことができる。

【０２６２】 治療上の有効用量は、患者の症状を結果的に改善または延命する化合物の量を
参照する。 前記化合物の毒性および治療効力は、例えば、LD₅₀（個体群の50％
が死亡する量）およびED₅₀（個体群の50％に治療効果が出る量）を決定するため
の、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定できる。
毒性と治療効果との用量割合が治療インデックスであり、LD₅₀とED₅₀の比として
表現できる。 高い治療インデックスを示す化合物が好ましい。 ヒトに使用す
る薬用量の範囲を処方するために、これらの細胞培養アッセイおよび動物研究か
ら得られたデータを用いることができる。 このような化合物の薬用量は、好ま
しくは、ほとんど毒性がないか全く毒性のないED₅₀を含む循環濃度の範囲内にあ
る。 薬用量は、用いる投与形態と用いる投与経路に依存して、この範囲内で変
化してもよい。 正確な処方、投与経路および薬用量は、患者の状態を考慮して
個々の医師によって選択することができる。 例えば、Finglら、1975,"The Pha
rmacological Basis of Therapeutics", 第１章第１頁中参照。 投与量および
間隔は、Ｃ−プロテイナーゼ阻害効果、または最小効果濃度(MEC)を維持するの
に充分な活性部分の血漿レベルを提供するために個々に調節してもよい。 MEC
は、各化合物について変化するであろうが、in vitroのデータ；例えば、本明細
書に記載したアッセイを用いて、Ｃ−プロテイナーゼの50〜90％の阻害を達成す
るのに必要な濃度から評価できる。 MECを達成するのに必要な薬用量は、個々
の特徴および投与経路に依存するであろう。 しかしながら、HPLCアッセイまた
はバイオアッセイは、血漿濃度を決定するために用いることができる。

【０２６３】 投与間隔は、MEC値を用いても決定することができる。 化合物は、期間の10
〜90％、好ましくは30〜90％、最も好ましくは、50〜90％の時間をかけて、MEC
以上の血漿レベルを維持する計画を用いて投与すべきである。 局所投与または
選択的取り込みの場合、薬物の有効局所濃度は血漿濃度とは関係がなくてもよい
。

【０２６４】 投与される化合物の量は、当然のことながら、治療される対象、対象の体重、
苦痛の深刻度、投与方法および処方した医師の判断に依存するであろう。

【０２６５】 6.9.4.包 装 前記組成物は、所望すれば、有効成分を含む１つ以上の単位投与形態を含んで
いてもよいパックまたはディスペンサーデバイス内に収容してもよい。 前記パ
ックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイルを含
んでいてもよい。 前記パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための
使用説明書を伴っていてもよい。 和合しうる薬学的担体中に製剤化された本発
明の化合物を含む組成物を調製してもよく、適当な容器に置き、指示した状態の
治療のためのラベルを付してもよい。

【０２６６】 6.10.抗 体 本発明の別の側面は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
このような抗体は、モノクローナル抗体かポリクローナル抗体のいずれかとする
ことが可能であり、もちろん、トランスジェニック動物で産生されたものなど、
これらの断片およびヒト化した形態または全ヒト形態とすることも可能である。
本発明は、本発明に従った抗体を産生するハイブリドーマをさらに提供する。 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの検出および／または精製において有用
である。

【０２６７】 また、本発明のタンパク質は、前記タンパク質と特異的に反応するポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体を得るために、動物を免疫化するために用いても
よい。 免疫原としてタンパク質全体かその断片のいずれかを用いて、このよう
な抗体を得てもよい。 前記ペプチド免疫原は、さらに、カルボキシ末端にシス
テイン残基を含有していてもよく、スカシガイのヘモシアニン(KLH)などのハプ
テンと接合する。 例えば、R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149
-2154(1963);J. L. Krstenansky, ら、FEBS Lett. 211, 10(1987)に記載されて
いるように、このようなペプチドの合成方法は、当該技術分野において既知であ
る。 本発明のタンパク質と結合するモノクローナル抗体は、前記タンパク質の免疫検
出用の有用な診断薬剤となろう。 前記タンパク質と結合する中和モノクローナ
ル抗体も、前記タンパク質に関連する状態と、前記タンパク質の異常発現が含ま
れるガンのいくつかの形態の治療の両方に有用な治療用物質でありうる。 癌に
かかった細胞または白血病細胞の場合、前記タンパク質に対する中和モノクロー
ナル抗体は、前記タンパク質によって媒介されるガン細胞の転移性の拡大を、検
出および予防するのに有用でありうる。 一般に、所望の抗体を産生することが
できるハイブリドーマと同様に、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調
製する技術は、当該技術分野でよく知られている(Campbell. A. M., Monoclonal Antibodies Technology; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecul er Biology, Elsevier Science Publishers, アムステルダム, オランダ(1984)
;St. Groth ら, J. Immunol. 35:1-21(1990); KohlerおよびMilstein, Nature 2
56:495-497(1975))、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor
ら, Immunology Today 4:72(1983);Coleら, in Monoclonal Antibodies and Can cer Therapy, Alan R. Liss, Inc.(1985), 77-96頁)。

【０２６８】 抗体を産生することが知られているいかなる動物（マウス、ウサギなど）も、
本発明のペプチドまたはポリペプチドで免疫できる。 免疫化の方法は、当該技
術分野でよく知られている。 このような方法には、前記ポリペプチドの皮下注
射または腹腔内注射が含まれる。 当業者は、免疫化に用いた本発明のORFによ
ってコードされたタンパク質の量が、免疫された動物、前記ペプチドの抗原性お
よび注射した部位によって変化することを認識するはずである。 免疫原として
用いたタンパク質は、タンパク質の抗原性を増大するためにアジュバント中にお
いて投与するか修飾してもよい。 タンパク質の抗原性を増大する方法は、当該
技術分野でよく知られており、抗原とヘテローガスタンパク質（グロブリンやβ
−ガラクトシダーゼなど）とのカップリング方法、または免疫化している間のア
ジュバントの包含による方法が含まれるが、これらに限定されない。

【０２６９】 モノクローナル抗体については、免疫化した動物由来の脾臓細胞を除去し、SP
2/0-Ag14ミエローマ細胞などの、ミエローマ細胞と融合せしめて、モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ細胞とする。 当該技術分野でよく知られている多く
の方法のいずれか１つの方法によって、所望の特徴をもつ抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を同定することができる。 これらには、ELISAアッセイ、ウエス
タンブロット分析、またはラジオイムノアッセイを用いたハイブリドーマのスク
リーニングが含まれる(Lutzら, Exp. Cell Research. 175:109-124(1988))。

【０２７０】 所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローン化し、当該技術分野でよく知
られている手順を用いてサブクラスを決定する(Campbell. A. M., Monoclonal A ntibodies Technology; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecule r Biology, Elsevier Science Publishers, アムステルダム, オランダ(1984))
。 一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第4,946,778号）は、
本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するために適合できる。

【０２７１】 ポリクローナル抗体については、血清を含む抗体を、免疫化した動物から単離
し、前記手順の一つを使って所望の特異性をもった抗体の存在をスクリーニング
する。 本発明は、検出可能に標識付けされた形態の前記抗体をさらに提供する
。 抗体は、ラジオアイソトープ、親和性標識（ビオチンやアビジンなど）、酵
素標識（ホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなど）
、蛍光標識（FITCやローダミンなど）、常磁性原子などを使用して、検出可能な
ように標識を付けることができる。 このような標識付の手順は、当該技術分野
でよく知られており、例えば、(Sternberger, L.A.ら , J. Histochem. Cytoche m. 18:315(1970); Bayer, E. A.ら, Meth. Enzym. 62:308(1979);Engval, E.ら,
Immunol.109:129(1972); Goding, J. W. J. Immunol. Meth.13:215(1976))を参
照されたい。

【０２７２】 本発明の標識した抗体は、興味あるポリペプチドの断片を発現するために、細
胞または組織を同定するin vitro、in vivo、およびin situアッセイのために用
いることができる。 前記抗体は、直接治療または他の診断にも用いてよい。 本発明はさらに、固体支持体上に固定化された前記抗体を提供する。 前記固体
支持体の具体例として、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよ
びセファロースなどの複合炭水化物、アクリル樹脂、ならびにポリアクリルアミ
ドおよびラテックスビーズなどが挙げられる。 抗体をこのような固体支持体と
カップリングさせる技術は、当該技術分野でよく知られている(Weir, D. M.ら,
"Handbook of Experimental Immunology" 第4版, Blackwell Scientific Publi
cations, オックスフォード,英国、第10章(1986);Jacoby, W.D. ら, Meth. Enzy m . 34 Academic Press, ニューヨーク(1974))。 本発明の固定化された抗体は
、in vitro、in vivo、およびin situアッセイならびに本発明のタンパク質のイ
ムノアフィニティー精製に用いることができる。

【０２７３】 6.11.コンピュータ読み取り可能配列 この実施態様の１つの適用において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピュ
ータ読み取り可能媒体上に記録することができる。 本明細書で用いる「コンピ
ュータ読み取り可能媒体」とは、コンピュータで直接読むことができ、かつアク
セスできる媒体のいずれをもいう。 このような媒体として、フロッピー（登録
商標）（登録商標）ディスク、ハードディスク保存媒体および磁気テープなどの
磁気保存媒体；CD-ROMなどの光学的保存媒体；RAMおよびROMなどの電気保存媒体
；ならびに磁器／光学保存媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドなどが
あるが、これらに限定されない。 当業者であれば、本発明のヌクレオチド配列
を、そこに記録しているコンピュータ読み取り可能媒体を含んでなる製品を作成
するために、現在知られているコンピュータ読み取り可能媒体のいくつかを、ど
の様にして使うのかを容易に認識することができる。 本明細書での「記録され
た」とは、コンピュータ読み取り可能媒体上に保存する工程をいう。 当業者で
あれば、現在知られているコンピュータ読み取り可能媒体上に情報を保存するた
めの方法のいずれかを、本発明のヌクレオチド配列情報を含んでなる製品を製造
するために容易に採用することができる。

【０２７４】 種々のデータ保存構造が、本発明のヌクレオチド配列がそこに記録されている
コンピュータ読み取り可能媒体を創造するために、当業者は入手することができ
る。 データ保存構造の選択は、一般的に保存された情報にアクセスするために
選択した手段に基づくであろう。 加えて、コンピュータ読み取り可能媒体上に
本発明のヌクレオチド配列情報を保存するために、種々のデータプロセッサープ
ログラムおよびファーマットを使うことができる。 前記の配列情報は、WordPe
rfectおよびMicrosoft Wordなどの市販のソフトウェアでフォーマットした、ワ
ードプロセッシングのテキストファイルで示すか、DB2、Sybase、Oracleなどの
、データベースアプリケーションに保存されたASCIIファイルの形態で示すこと
ができる。 当業者であれば、本発明のヌクレオチド配列情報を記録したコンピ
ュータ読み取り可能媒体を得るために、かなり多数のデータプロセッサ構造フォ
ーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）に容易に適合するこ
とができる。 配列番号：１、２、４、６または７のヌクレオチド配列またはそ
の代表的な断片、またはコンピュータ読み取り可能な形態の配列番号：１、２、
４、５、６または７または８と、少なくとも99.9％以上一致するヌクレオチド配
列を提供することによって、当業者はルーチンに種々の目的で前記配列情報にア
クセスすることができる。 コンピュータソフトウェアは、公に入手でき、当業
者は、コンピュータ読み取り可能媒体に提供された配列情報にアクセスすること
ができる。 以下に記載する例示によって、核酸配列中の読み取り枠(ORF)を同
定するためにSybaseシステム上のBLAST(Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-41
0(1990))およびBLAZE(Brutlagら, Comp. Chem. 17:203-207(1993))検索アルゴリ
ズムを実行するソフトウェアを、どの様に使うかを示す。 このようなORFは、
断片をコードするタンパク質であってもよく、発酵反応、および商業的に有用な
代謝物の製造において用いる酵素などの商業的に重要なタンパク質の製造におい
て有用でありうる。

【０２７５】 本明細書において、「コンピュータに基づくシステム」とは、本発明のヌクレ
オチド配列情報を分析するために用いられるハードウェア手段、ソフトウェア手
段およびデータ保存手段をいう。 本発明のコンピュータに基づくシステムの最
小限のハードウェア手段は、中央処理装置(CPU)、入力手段、出力手段およびデ
ータ保存手段を含んでなる。 当業者は、目下入手できるコンピュータに基づく
システムのいずれか一つが、本発明に用いるのに適していることが容易に認識で
きる。 先に述べたように、本発明のコンピュータに基づくシステムは、本発明
のヌクレオチド配列を保存してなるデータ保存手段、ならびに検索手段をサポー
トして実行するために必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段を含む。
本明細書において用いる「データ保存手段」とは、本発明のヌクレオチド配列情
報を保存できるメモリー、または本発明のヌクレオチド配列情報を保存した製品
にアクセスできるメモリーアクセス手段をいう。

【０２７６】 本明細書において、「検索手段」とは、データ保存手段に保存された配列情報
と標的配列または標的構造モチーフを比較するために、コンピュータに基づくシ
ステム上で実行される一つ以上のプログラムをいう。 検索手段は、特定の標的
配列または標的モチーフと適合する既知配列の断片または領域を同定するために
用いる。 種々の既知のアルゴリズムは、公に開示されており、検索手段を処理
するための種々の市販のソフトウェアがあり、本発明のコンピュータに基づくシ
ステムに用いることができる。 このようなソフトウェアの具体例として、MacP
attern (EMBL)、BLASTNおよびBLASTA（NPOLYPEPTIDEIA）が挙げられるが、これ
らに限定されない。 このコンピュータに基づくシステムに用いるために、相同
検索を処理するためのいずれか一つの入手可能なアルゴリズムまたは実行するソ
フトウェアパッケージを適合できることは、当業者が容易に認識できる。 本明
細書において、「標的配列」とは、６つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のア
ミノ酸の核酸またはアミノ酸配列とすることができるる。 標的配列が長くなる
ほど、標的配列がデータベースにおいてランダムな発生として存在することが少
なくなろうことが、当業者には容易に認識できる。 標的配列の最も好ましい配
列の長さは、約10〜100アミノ酸または約30から300ヌクレオチド残基である。
しかしながら、遺伝子発現およびタンパクプロセッシングに関連する配列断片な
どの、商業上重要な断片の検索は、より短い長さであってもよいことが充分に認
識されるであろう。

【０２７７】 本明細書において用いる「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」とは、
前記標的モチーフの折りたたみによって形成される三次元立体配置に基づいて選
択された（複数の）配列であるところの、合理的に選択された配列または配列の
組合せをいう。 当該技術分野において知られている種々の標的モチーフがある
。タンパク質標的モチーフとして、酵素活性部位およびシグナル配列が含まれる
が、これらに限定されない。 核酸標的モチーフとして、プロモーター配列、ヘ
アピン構造および誘導可能な発現エレメント（タンパク質結合配列）があるが、
これらに限定されない。

【０２７８】 6.12.三重らせん構造 加えて、本発明の断片は、広範に記載したように、三重らせん構造またはアン
チセンスDNAまたはRNAによって遺伝子発現をコントロールするために用いること
ができ、何れの方法もDNAたはRNAとのポリヌクレオチド配列の結合に基づいてい
る。 これらの方法への使用に適したポリヌクレオチド類は、通常20〜40塩基長
であり、転写に関連する遺伝子の領域と相補的であるように設計される（三重ら
せん−Leeら, Nucl. Acids Res. 6:3073(1979);Cooneyら, Science 15241:456(1
988);および、Dervanら, Science 251:1360(1991)参照）またはmRNA自身（アン
チセンス−Olmno, J. Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as An tisense Inhibitors of Gene Expression , CRC Press, Boca Raton,フロリダ(19
88)）。 アンチセンスRNAハイブリダイゼーションによりmRNA分子のポリぺプチ
ドへの翻訳をブロックするが、三重らせん構造は、結果として、DNAからのRNA転
写の-遮断-を好適に行う。 両方の技術は、モデル系で効果的であることが実証
されている。 本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重らせん
オリゴヌクレオチドの設計に必要である。

【０２７９】 6.13.診断アッセイおよびキット 本発明は、本発明の核酸プローブまたは抗体を用いて、テスト試料内の本発明
のORFまたはその相同体の１つの存在または発現を同定するための方法を、さら
に提供する。

【０２８０】 一般に、本発明のポリヌクレオチドを検出する方法は、試料と前記ポリヌクレ
オチドと結合して複合体を形成する化合物とを、複合体を形成するのに充分な期
間接触させる工程、および前記複合体を検出する工程を含み、複合体が検出され
れば、試料中の本発明のポリヌクレオチドを検出することができる。 このよう
な方法はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて、試料を
当該条件下で本発明のポリヌクレオチドとアニールする核酸プライマーに接触さ
せる工程、およびアニールしたポリヌクレオチドを増幅する工程を含み、ポリヌ
クレオチドが増幅されれば、本発明のポリヌクレオチドを試料中に検出すること
ができる。

【０２８１】 一般に、本発明のポリペプチドを検出する方法は、試料と前記ポリペプチドと
結合して複合体を形成する化合物とを、複合体を形成するのに充分な期間接触さ
せる工程、および前記複合体を検出する工程を含み、複合体が検出されれば、試
料中の本発明のポリペプチドを検出することができる。 詳細には、このような
方法は、テスト試料を本発明の１つ以上の抗体または１つ以上の核酸プローブと
共にインキュベーションすること、およびテスト試料中の成分と前記核酸プロー
ブまたは抗体との結合をアッセイする工程を包含する。

【０２８２】 テスト試料に応じて、核酸プローブまたは抗体をインキュベーションするため
の条件は、変動してもよい。 インキュベーション条件は、アッセイに用いたフ
ォーマット、用いた検出方法、ならびにアッセイに用いた核酸プローブまたは抗
体のタイプおよび性状に依存する。 本発明の核酸プローブまたは抗体を用いる
ために一般に入手できるハイブリダイゼーション、増幅または免疫学的アッセイ
フォーマットを容易に適合できることは、当業者が認識するであろう。 これら
アッセイの具体例は、Chard, T., An Introduction to Radioimmunoassay and
Related Techniques, Elsevier Science Publishers, アムステルダム, オラン
ダ(1986); Bullock, G. R. ら, Techniques in Immunocytochemistry, Academic
Press, オーランド, フロリダ、第１巻(1982), 第２巻(1983), 第３巻(1985);T
ijssen, P., Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques i n Biochemistry and Moleculer Biology, Elsevier Science Publishers, アム
ステルダム, オランダ(1985)に見出すことができる。 本発明のテスト試料には
、細胞、細胞のタンパク質もしくは膜抽出物、または痰、血液、血清、血漿、も
しくは尿などの生物学的流体が含まれる。 前記方法に用いるテスト試料は、ア
ッセイフォーマット、検出方法の性状、およびアッセイされる試料として用いる
組織、細胞もしくは抽出物によって変わるであろう。 細胞のタンパク質抽出物
または膜抽出物を調製する方法は、当該技術分野でよく知られており、利用する
システムと和合しうる試料を得るために容易に適合できる。

【０２８３】 本発明の別の実施態様において、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を
含むキットが提供される。 特に、本発明は、厳重な監視状態下で、(a) 本発明
のプローブまたは抗体の１つを含む第１の容器；および(b) 以下の１つ以上を含
む１つ以上の他の容器、すなわち、洗浄試薬、結合したプローブまたは抗体の存
在を検出できる試薬、を含んでなる１つ以上の容器を収容するためのコンパート
メントキットを提供する。

【０２８４】 詳細には、コンパートメントキットは、分離した容器に試薬を含むいかなるキ
ットも包含する。 このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、
またはプラスチックもしくは紙のストリップを含む。 このような容器によって
、試料と試薬が交差汚染せず、各容器の薬剤または溶液が１つのコンパートメン
トから別のコンパートメントに定量的な様式で添加できるような、１つのコンパ
ートメントから別のコンパートメントへの効率的な移送が可能となる。 このよ
うな容器には、テスト試料を受けるであろう容器、アッセイに用いる抗体を含む
容器、洗浄試薬（リン酸緩衝液、トリス緩衝液など）を含む容器、および結合し
た抗体またはプローブを検出するために用いる試薬を含む容器が含まれる。 検
出試薬のタイプには、標識した核酸プローブ、標識した第２の抗体、または選択
肢として、第１抗体を標識するならば、前記標識抗体と反応できる酵素結合試薬
または抗体結合試薬が含まれる。 本発明にて開示したプローブおよび抗体を、
当該技術分野でよく知られている確立されたキットフォーマットの１つに容易に
組込むことができることは、当業者が容易に認識するであろう。

【０２８５】 6.14.スクリーニングアッセイ 本発明の単離したタンパク質およびポリヌクレオチドを使用して、本発明は、
配列番号：１、２、４、６、７または８の配列を有するポリヌクレオチドより得
られるORFによってコードされるポリペプチド、かかる核酸によってコードされ
たポリペプチドの特異的ドメインに結合し、または配列番号：１、２、４、６、
７または８の配列を有する核酸に結合する物質を獲得および同定する方法を、さ
らに提供する。 詳細には、前記方法は、以下の工程、すなわち、 (a) 物質に、本発明のORFによってコードされた単離されたタンパク質または本
発明の核酸を接触させ、および (b) その物質が、当該タンパク質または当該核酸に結合するか否かを決定する、 工程を含む。

【０２８６】 一般に、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物を同定するためのこのよ
うな方法は、化合物を本発明のポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド／化合物
複合体を形成するのに充分な時間接触させる工程、および、その複合体を検出す
る工程を含み、ポリヌクレオチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリ
ヌクレオチドに結合する化合物を同定することができる。

【０２８７】 同様に、一般に、それ故、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する
ためのこのような方法は、化合物を本発明のポリペプチドに、ポリペプチド／化
合物複合体を形成するのに充分な時間接触させる工程、およびその複合体を検出
する工程を含み、ポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌ
クレオチドに結合する化合物を同定することができる。

【０２８８】 本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法は、細胞におい
て、化合物を本発明のポリペプチドに、ポリペプチド／化合物複合体を形成する
のに充分な時間接触させ、該複合体は細胞においてレポーター遺伝子配列の発現
を駆動するものであり、次いで、レポーター遺伝子配列の発現を検出することに
よって、ポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチ
ドに結合する化合物が同定されるように、その複合体を検出する工程も含むこと
ができる。

【０２８９】 このような方法によって同定される化合物に、本発明のポリペプチドの活性を
モジュレートする（すなわち、化合物不在下で観察される活性に対して、その活
性を増加または減少させる）化合物を包含することができる。 あるいは、この
ような方法によって同定される化合物に、本発明のポリヌクレオチドの発現をモ
ジュレートする（すなわち、化合物不在下で観察される発現レベルに対して、発
現を増加または減少させる）化合物を包含することができる。 本発明の方法に
よって同定された化合物などの化合物は、活性／発現をモジュレートする能力に
ついて、当該技術分野でよく知られている標準的なアッセイを使用して試験する
ことができる。

【０２９０】 前記のアッセイでスクリーニングされる物質には、ペプチド、炭化水素、ビタ
ミン誘導体、またはその他の医薬物質を包含することができるが、それらに限定
されない。 物質は、無作為に選択およびスクリーニングするか、またはタンパ
ク質モデリング技術を使用して、合理的に選択もしくは設計することができる。

【０２９１】 ランダムスクリーニングのためには、ペプチド、炭化水素、医薬物質などの物
質を無作為に選択し、そして本発明のORFによってコードされるタンパク質に結
合する能力についてアッセイする。 あるいは、物質は合理的に選択または設計
され得る。 本明細書において、物質が特定のタンパク質の立体配置に基づいて
選択される場合に、物質は「合理的に選択または設計される」と称される。 例
えば、当業者であれば、合理的に設計されたペプチド、例えば、Hurby ら, Appl
ication of Synthetic Peptides: Antisense Peptides," Synthetic Peptides, A User 's Guide , W.H. Freeman, NY (1992), pp. 289-307, およびKaspczakら, Biochemistry 28:9230-8 (1989)を参照されたい、または医薬物質等を作製すべ
く、特異的なペプチド配列に結合することができるペプチド、医薬物質等を作製
するための現在利用可能な手法を難なく適用することができる。

【０２９２】 前記の物質に加えて、本発明の物質のあるクラスでは、広義には、本発明の ORFまたはEMFの一つへの結合を通じて遺伝子発現を制御するために使用できる。
前記のとおり、かかる物質は、無作為なスクリーニング、または合理的な設計／
選択をすることができる。 ORFおよびEMFのターゲッティングによって、当業者
には、配列特異的もしくはエレメント特異的物質であって、単一のORFもしくは
同じEMFの発現制御に依存している複数のORFのいずれかの発現をモジュレートす
るものを設計することが可能となる。 DNA結合物質のあるクラスは、DNAもしく
はRNAに結合することで、ハイブリダイズもしくは三重らせん構造を形成する塩
基残基を含む物質である。 かかる物質は、旧来のホスホジエステル、リボ核酸
骨格に基づくもの、あるいは塩基付着能を有する様々のスルフヒドリルもしくは
ポリマー誘導体とすることができる。

【０２９３】 これらの方法での使用のために好適な物質は、通常、20〜40塩基を含んでおり
、そして転写に関与する遺伝子の領域に相補的（三重らせん−Leeら, Nucl. Aci ds Res. 6:3073 (1979); Cooneyら, Science 241:456 (1988); およびDervanら,
Science 251:136 (1991)を参照されたい）、またはmRNA自体に相補的（アンチ
センス−Okano. J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Ant isense Inhibitors of Gene Expression , CRC Press, Boca Raton, FL (1988)）
となるように設計される。 三重らせんの形成は、最適には、結果として、DNA
からのRNA転写の遮断が引き起こされ、一方で、アンチセンスRNAハイブリダイゼ
ーションは、mRNA分子のポリペプチドへの転写を阻害する。 双方の技術は、モ
デル系にて有効であることが立証されている。 本発明の配列に含まれる情報は
、アンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチド、およびその他のDNA結合
物質を設計するために欠くことができない。 本発明のORFの内の１つによって
コードされるタンパク質に結合する物質は、ORFによってコードされたタンパク
質の活性をモジュレートすることにで、細菌感染を制御する際の診断試薬として
使用することができる。 本発明のORFの内の１つによってコードされたタンパ
ク質に結合する物質は、医薬組成物を作製する既知の技術を使用して製剤化でき
る。

【０２９４】 6.15.プローブとしての核酸の用途 本発明の他の特徴は、天然に存在する核酸配列とハイブリダイズすることがで
きる、ポリペプチドに特異的な核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供する
ことである。 本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：１、２
、４、６、７または８のヌクレオチド配列に由来するものであるとよい。 対応
する遺伝子は、限られた数の組織、特に、成人組織にしか発現されないので、配
列番号：１、２、４、６、７または８に由来するハイブリダイゼーションプロー
ブは、かかる組織の細胞型のRNAが試料中に存在することを指し示す指標として
使用することができる。

【０２９５】 好適なハイブリダイゼーション技術、例えば、in situハイブリダイゼーショ
ンなどを採用することができる。 米国特許第4,683,195号および第4,965,188号
に記載されたようなPCRで、ヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドに対
するさらなる用途が提供される。 PCRにて使用されるかようなプローブは、組
換えを起源とするものでも、化学合成されたものでも、またはそれらの組合せで
もよい。 プローブは、一致する配列の検出のために別々のヌクレオチド配列を
含むもの、あるいは密接に関連するゲノム配列の同定のために可能性を有する縮
重プールを含むものとされよう。

【０２９６】 核酸に対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを製造するための他の手
段には、mRNAプローブの産生のためのベクターへの核酸配列のクローニングが包
含される。 かかるベクターは、当該技術分野で知られており、市販もされてお
り、そしてT7またはSP6 RNAポリメラーゼとしてのRNAポリメラーゼと、適切な放
射活性標識されたヌクレオチドを添加することによって、in vitroでRNAプロー
ブを合成するために使用することができる。 ヌクレオチド配列は、対応するゲ
ノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを構築するた
めに使用され得る。 本発明で提供されるヌクレオチド配列は、よく知られた遺
伝的および／または染色体マッピング技術を使用して、染色体または染色体の特
異領域にマッピングされ得る。 これら技術には、in situハイブリダイゼーシ
ョン、既知染色体マーカーに対する連鎖解析、ライブラリーまたは既知染色体に
特異的なフロー選別された染色体調製物を用いたハイブリダイゼーションスクリ
ーニング等が包含される。 染色体播塗物の蛍光in situハイブリダイゼーショ
ンの技術は、殊に、Verma et al.,(1988) Human Chromosomes: A Manual of Bas
ic Techniques, Pergamon Press, New York NYに記載されている。

【０２９７】 染色体調製物の蛍光in situハイブリダイゼーションおよびその他の物理的染
色体マッピング技術は、他の遺伝的マップデータに相関し得る。 遺伝的マップ
データの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981 f)に見出すことがで
きる。 物理的染色体マップ上の核酸の位置と、特異疾患（あるいは、特異疾患
に対する素因）との間の相関は、その遺伝疾患に関わるDNAの領域を定める助け
となり得る。 本発明のヌクレオチド配列は、正常、保因または罹患個体の間の
遺伝子配列の相違を検出するために使用される。 ヌクレオチド配列は、組換え
DNA技術のよく知られた方法を使用して、精製されたポリペプチドを産生するこ
とができる。 遺伝子が単離された後、その発現のための方法を教示する多くの
出版物があり、その一つに、Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Met
hods and Enzymology, Vol 185, Academic Press, San Diegoがある。 ポリペ
プチドは、原核細胞または真核細胞のいずれかの、様々な宿主細胞にて発現され
得る。 宿主細胞は、特定のポリペプチドのヌクレオチド配列が単離された種と
同じ種に由来するものでも、異なる種に由来するものでもよい。 組換えDNA技
術によってポリペプチドを製造する利点として、精製のために適切な量のタンパ
ク質が得られること、および精製法の簡素化が可能となることがある。

【０２９８】 14.1 配列決定用チップおよびアレイの調製 基礎的な例として、20×20cmのアレイを得るために組合せ可能な、３×３mmの
面積のチップを得るために、50ミクロン表面に接触させた６−マーを用いること
がある。 他の例として、５×５mmの面積の９−マーのチップを作製するために
、10×10ミクロン表面に接着させた９−マーのオリゴヌクレオチドの使用がある
。 そのようなチップの4000ユニットを、30×30cmアレイを作製するために使用
してよい。 4,000〜16,000オリゴチップが、正方形アレイ内に並べられる。
これも上述したように、プレートまたはチューブ状の集団を、配列決定キットの
一部分として、アレイにパッケージしてよい。

【０２９９】 アレイは、互いに物理的に、または疎水性表面にて分離されてよい。 疎水性
ストリップ分離を用いるための１つの可能な方法は、QAラボラトリーズ（QA Lab
oratories、Toronto、Canada）によって販売されているIso-Grid Microbiology
Systemのような技術を使用することである。

【０３００】 疎水性グリッド膜フィルター（HGMF）は、解析食物微生物学にて、約10年間使
用されており、そこで数値範囲を拡大し、色の計数を自動化する固有の特徴を有
する。 市販のグリッドとして、1600（40×40）正方形セルからなる黒色疎水性
インクグリッドが印刷された正方形（60×60cm）のポリスルホンポリマー（Gelm
an Tuffryn HT-450、0.45u穴サイズ）からなるQAラボラトリーズ（QA Laborator
ies、Toronto、Canada）から入手可能なISO-GRID（登録商標）がある。 HGMFは
、まず、吸引濾過によって微生物懸濁液を接種しておき、分化用培地または選択
培地上でインキュベートされている。

【０３０１】 微生物の増殖は、膜上の公知の位置および大きさのグリッドセルに対して確認
されているので、HGMFは、従来のプレートまたは膜フィルターよりもMPN器具に
より近く機能する。 Peterkin et al.（1987）は、これらのHGMFが、HGMF複写
器を使用する場合、ゲノムライブラリーを伝達し、保存するのに使用できること
を報告した。 このような器具は、ISO-GRIDの1600セルの各々から増殖物を複写
し、作製すべきマスターHGMFの多くのコピ-を可能にする（Peterkin et al.,198
7）。

【０３０２】 Sharpe et al.（1989）もまた、QAラボラトリーズ（QA Laboratories、Toront
o、Canada）から入手可能なISO-GRID HGMFや、自動化HGMF計数器（MI-100 Inter
preter）、それにRP-100Replicatorを使用している。 これらは、多くの微生物
培養液を保持し、スクリーニングするための技術として報告されている。

【０３０３】 Peterkinおよびその共同研究者たちは後に、疎水性グリッド−膜フィルターを
用いたDNAプローブのスクリーニングのための方法を記述した（Peterkin et al.
,1989）。 これらの著者は、HGMF上での直接の効果的なコロニーハイブリッド
形成のための方法を報告した。 HGMFが印刷されたエポキシスルホンポリマーの
低いDNA結合能力のため、あまり良い結果は得られていなかった。 しかしなが
ら、Peterkin et al.（1989）は、膜の表面へのDNAの結合が、DNAとの接触の前
に、複写およびインキュベートしたHGMFをポリエチレンイミン、ポリカチオンで
処理することで改善されたことを報告している。 この初期の研究は、細胞DNA
接着を使用しており、本発明とは異なる目的ではあるが、記述された方法論は、
フォーマット3 SBHに簡単に適用可能である。

【０３０４】 有用な配列をすぐに同定するために、Peterkin et al.（1989）は種々のクロ
ーンからの放射標識プラスミドDNAを使用し、調製したHGMF上のDNAに対するその
特異性を試験した。 この方法において、簡単に、そして再生産的に調製できる
HGMF複写物上の100の微生物に対するコロニーハイブリッド形成によって、組換
え体プラスミドからのDNAをすぐに選別できた。

【０３０５】 小クリップ（２〜３mm）での操作、および数千の反応の平行実施。 本発明の
溶液は、対応するアレイにおいてクリップおよびプローブを保持している。 一例として、250,000の９−マーを含むクリップを、その間に１mMの溝が横たわ
る８×12様式（96チップ）で並べた、８×８mMのプレート（15μM／オリゴヌク
レオチド、Pease et al.,1994）状のシリコーンウェハー上に合成する。 プロ
ーブを、多チャンネルピペットまたはピンアレイのいずれかによって、１つのチ
ップ上に１つのプローブを加える。 4000すべての６−マーをスコア化するため
に、42個のチップアレイを、異なるものを用いるか、１つのチップアレイの組を
何回か再利用しなければならない。

【０３０６】 上記の場合、アプリケーションの初期名称を使用する。 Ｆ＝９；Ｐ＝６およ
びＦ＋Ｐ＝15。 クリップは、BxNnの式、式中、xが特定化塩基Ｂの数であり、
ｎが非特定化塩基の数であり、ｘ＝４〜10であり、ｎ＝１〜４であらわされるプ
ローブを有していてもよい。 より効率のよいハイブリッド形成を実施するため
に、そして、任意の支持体オリゴヌクレオチドの潜在的影響を避けるために、特
定の塩基を非特定の塩基によって取り囲むことができ、従って、（N）nBx（N）m
のような式によって表すことができる。

【０３０７】 14.2 支持体結合オリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチド、すなわち、小核酸セグメントは、例えば、自動化オリゴ
ヌクレオチド合成機を用いて一般的に実施されているような、化学的方法によっ
て直接オリゴヌクレオチドを合成することによって簡単に調製してよい。

【０３０８】 支持体結合オリゴヌクレオチドは、ガラス、ポリスチレンまたはテフロン（登
録商標）のような任意の好適な支持体を用いて、当業者に公知の任意の公知の方
法にて調製してよい。 ある戦略によれば、標準の合成機にて合成したオリゴヌ
クレオチドが、正確にスポットされる。 固定化は、受動的吸着を用いて（Inou
ye & Hondo,1990）、UV光を用いて（Nagata et al.,1985、Dahlen et al.,1987
、Morriey & Collins,1989）、または塩基改変DNAの共有結合を用いて（Keller
et al.,1988；1989）実施することができる。 すべての参考文献は、本明細書
に特に組み込まれている。

【０３０９】 使用可能な他の戦略として、強力なビオチン−アビジン相互作用をリンカーと
して利用することが挙げられる。 例えば、Broude et al.（1994）は、これら
は二重プローブであるけれども、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズ上
に固定化したビオチン化プローブの使用を記述している。 ストレプトアビジン
でコートしたビーズは、ダイナル（Dynal,Oslo）より購入してよい。 もちろん
、これらと同様の結合化学反応は、ストレプトアビジンを持つ任意の表面をコー
トするのに適用可能である。 ビオチン化プローブは、例えば、オペロン・テク
ノロジー社（Operon Technologies、Alameda, CA）のようなさまざまな発売元よ
り購入することができる。

【０３１０】 ヌンク・ラボラトリーズ（Nunc Laboratories、Naperville, IL）もまた、好
適に使用可能な物質を販売している。 ヌンク・ラボラトリーズ社は、それによ
ってDNAを、マイクロウェル表面に共有結合させることができる、Covalink NHと
呼ばれる方法を開発した。 Covalink NHとは、別の共有結合を提供するブリッ
ジヘッドとして役立つ二級アミノ基（＞NH）を融合したポリスチレン表面である
。 Covalink Modulesは、ヌンク・ラボラトリーズ社より購入することができる
。 DNA分子は、ホスホルアミデート結合によって5’-末端にて独占的にCovalin
kに結合し、１pmol以上のDNAの固定化が許容される（Rasmussen et al.,1991）
。

【０３１１】 5’末端でのDNA分子の共有結合のためのCovaLink NHストリップの使用が記述
されている（Rasmussen et al.,1991）。 この技術において、ホスホルアミデ
ート結合が使用される（Chu et al.,1983）。 これは、単共有結合のみを使用
した固定化が好ましい場合に有利である。 ホスホルアミデート結合は、DNAを
２mm長のスペーサー腕を介してポリスチレン表面上に共有的に繋いだスペーサー
腕の末端に位置するCovaLink NH二級アミン基と結合させる。 ホスホルアミデ
ート結合を介してオリゴヌクレオチドをCovaLink NHと結合させるために、オリ
ゴヌクレオチド末端は5’末端リン酸基を持たなければならない。 おそらく、C
ovaLinkへ共有結合することはビオチンにとって可能であり、次いでストレプト
アビジンをプローブに結合するために使用する。

【０３１２】 特に、結合方法には、水中へのDNAの溶解（7.5ng／μl）および95℃で10分間
の変性、および10分間の氷上での冷却が含まれる。 次いで、氷冷0.1M 1-メチ
ルイミダゾール、pH7.0（1-MeIm₇）を10mMの1-MeIm₇の最終濃度まで加える。 次いで一本鎖DNA溶液を、氷上に置きながら、CovaLink NHストリップ（75μl／
ウェル）内に分散させる。

【０３１３】 10mMの1-MeIm₇中に溶解したカルボジイミド0.2M 1-エチル-3-（3-ジメチルア
ミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）を、新たに調製し、ウェルあたり25μl
を加える。 このストリップを、50℃にて５時間インキュベートする。 インキ
ュベーションした後、このストリップを、例えば、ヌンク−イムノ・ワッシュ （Nunc-Immuno Wash）を用いて洗浄した。 まず、ウェルを３回洗浄し、次いで
、それを５分間洗浄溶液に浸し、最後に３回洗浄した（洗浄溶液は、50℃に加熱
した0.4N NaOH、0.25％ SDSである）。

【０３１４】 本発明での使用にさらに好適な方法は、参考文献として本明細書に組み込まれ
た、PCT公開公報第WO 90/03382号（Southern & Maskos）に記載されたものも企
図される。 支持体に結合したオリゴヌクレオチドを調製するこの方法には、ヌ
クレオシド3’反応物をリン酸基を介して、共有リン酸ジエステル結合によって
、支持体が有する脂肪族ヒドロキシ基に結合させることが含まれる。 次いで、
オリゴヌクレオチドを支持されたヌクレオシド上で合成し、支持体からオリゴヌ
クレオチドを剥がさない標準の条件下で、保護基を合成オリゴヌクレオチドより
除去する。 好適な反応物には、ヌクレオシドリン酸アミダイトおよびリン酸水
素ヌクレオチドが含まれる。

【０３１５】 DNAプローブアレイの調製ためのDNAプローブの調製に関するオンチップ戦略を
使用してよい。 例えば、参考までに本明細書に組み込んだFodor et al.,
（1991）によって記述されたような、アドレス可能なレーザー活性化光脱保護を
、ガラス表面上の直接のオリゴヌクレオチド化学合成で使用してよい。 プロー
ブはまた、Van Ness et al.（1991）によって記述されたようなナイロン支持体
上に固定化してよく、またはDuncan & Cavalier（1988）の方法を用いてテフロ
ン（登録商標）に結合してよい。 すべての参考文献は、本明細書に特に組み込
んでいる。

【０３１６】 Van Ness et al.（1991）に記述されたように、オリゴヌクレオチドをテフロ
ン（登録商標）支持体に結合させるために、塩化シアヌル酸でのオリゴヌクレオ
チドの5’−アミノのアルキル化および選択的活性化を介したナイロン表面の活
性化が必要である。

【０３１７】 支持体が結合したオリゴヌクレオチドを調製する１つの方法として、Pease et
al.,（1994、参考までに本明細書に組み込んでいる）に記載されたフォトリソ
グラフィーを使用することである。 これらの著者は、固定化オリゴヌクレオチ
ドプローブのアレイ（DNAチップ）を作製するために、最近のフォトリソグラフ
ィー技術を用いた。 高密度の小型化アレイにおいて、光をオリゴヌクレオチド
プローブの合成を指向するために使用しているこれらの方法は、光に不安定な5
’-保護N-アシル-デオキシヌクレオシドホスホルアミダイト、表面リンカー化学
反応、および多用途組合せ合成戦略を使用する。 分離して定義された256もの
オリゴヌクレオチドプローブのマトリックスをこの様式で作製してよく、次いで
、本明細書で記述したような好適なフォーマット3にて使用してよい。

【０３１８】 14.3 核酸断片の調製 配列決定すべき核酸は、cDNA、ゲノムDNA、染色体DNA、顕微解剖染色体バンド
、コスミドまたはYACインサート、および任意の増幅工程を経ていないmRNAを含
むRNAのような、任意の適切な供給源より入手してよい。 例えば、Sambrook et
al.（1989）は、哺乳動物細胞からの高分子量DNAの単離のための3つのプロトコ
ールを記述している（p.9.14-9.23）。

【０３１９】 DNA断片を、M13、プラスミドまたはラムダベクター内のクローンとして調製し
てよく、および／または、PCRまたは他の増幅方法によってゲノムDNAまたはcDNA
より直接調製してよい。 試料は、マルチウェルプレートに調製するか、または
分配してよい。 約100〜1000ngのDNA試料を、２〜500mlの最終容量で調製して
よい。

【０３２０】 次いで、核酸を、例えば、Sambrook et al.（1989）の9.24-9.28で記述された
ような制限酵素の使用、超音波および水酸化ナトリウム処理による剪断など、を
含む当業者に公知の任意の方法にて断片化してよい。

【０３２１】 Schriefer et al.（1990、参考までに本明細書に組み込んだ）によって記述さ
れたような、低圧力剪断もまた適切である。 この方法において、DNA試料を、
さまざまな低〜中圧力にて、小フレンチ圧力セルに通す。 レバー器具により、
低〜中圧力に制御された圧力がセルへ適用できる。 これら研究の結果は、低圧
力剪断が、音波および酵素的DNA断片化方法の有用な代替法であることを示唆し
ている。

【０３２２】 DNAを断片化するための特に好適な方法として、Fitzgerald et al.（1992）に
よって記述された２塩基認識エンドヌクレアーゼ、CviJIを用いるものも企図さ
れている。 これらの著者は、ショットガンクローニンおよび配列決定に好適で
あると企図された特定の大きさへのDNAの急速断片化および画分化のための方法
を記述している。 本発明は、この技術がまた、この配列決定技術での使用のた
めの、無作為で、しかし比較的小さなDNA断片を作製するのに特に有用であるこ
とを構想している。

【０３２３】 制限エンドヌクレアーゼ、CviJIは、通常、平滑末端を残すように、ＧとＣの
間の認識配列PuGCPyを開裂する。 典型的な反応条件は、この酵素の特異性を変
化させ（CviJI^**）、小分子pUC19（2688塩基対）からDNA断片をある程度無作為
に分配する。 Fitzgerald et al.（1992）は、急速ゲル濾過法によってサイズ
画分化し、末端修復無しで、lacZを除いたM13クローニングベクターに直接ライ
ゲーションしたpUC19のCviJI^**消化を用いて、この断片化戦略の無作為性を定量
的に評価した。 76クローンの配列解析は、CviJI^**が、PuGCPyに加えて、pyGCP
yおよびPuGCPuを制限したこと、および新規配列データが、無作為断片化と一致
した割合で蓄積されたことを示している。

【０３２４】 この文献で報告されているように、音波処理およびアガロースゲル断片化と比
較した場合のこの方法の利点として、少量のDNAのみが必要であること（２〜５u
gの代わりに0.2〜0.5ug）、および、より少ない工程（プレライゲーション、末
端修復、化学的抽出、またはアガロースゲル電気泳動および溶出が不要である）
で実施できることを含む。 これらの利点はまた、フォーマット3によって配列
決定するためにDNAを調製する場合に使用できることも提唱している。

【０３２５】 核酸断片を得、または調製する様式に関わらず、ハイブリッド形成可能な一本
鎖断片を得るために、DNAを変性させることが重要である。 このことは、 DNA溶液を80〜90℃にて２〜５分間インキュベートして実施する。 次いで、こ
の溶液をすぐに２℃にまで冷却して、チップに接触させる以前のDNA断片の再変
性を防ぐ。 リン酸基をまた、本技術分野で公知の方法にてゲノムDNAより除去
する。

【０３２６】 14.4 DNAアレイの調製 アレイは、ナイロン膜のような支持体上にDNAをスポットすることで調製して
よい。 スポッティングは、約20nlのDNA溶液をナイロン膜に転写することによ
って繰り返して、金属ピンのアレイ（その位置は、マイクロタイタープレート中
のウェルのアレイに相当する）を使用してもよい。 オフセットプリントによっ
て、ウェルの密度よりも高いドットの密度を形成する。 使用した標識の型によ
って、１〜25ドットを１mm²中に適用する。 予め選択した数の列および段にス
ポットをしないことで、分離サブセット（サブアレイ）を形成してよい。 １つ
のサブアレイ中の試料は、異なる固体からのDNAの同一のゲノム区画（または同
一遺伝子）であってよく、または異なった、重なり合ったゲノムクローンであっ
てよい。 それぞれのサブアレイは、同一の試料の複製スポッティングを表して
よい。 ある例として、選択した遺伝子区画は64人の患者から増幅してよい。
それぞれの患者に関して、増幅した遺伝子区画は、１枚の96ウェルプレート中で
あってよい（すべての96ウェルが同一の試料を含む）。 64人の患者それぞれの
プレートが調製される。 96ピンの器具を使用することで、すべての試料を１枚
の８×12cm膜上にスポットすることができる。 サブアレイは、64試料、それぞ
れの患者からの１試料を含むことができる。 96サブアレイが同一である場合、
ドット範囲は１mm²とすることができ、サブアレイ間に１mmの空間が存在してい
てもよい。

【０３２７】 他の方法として、物理的スペーサー、例えば、膜上のプラスチックグリッド型
枠によって仕切られる膜またはプレート（NUNC、Naperville、Illinoisより入手
可能）を使用することであり、そのグリッドは、マルチウェルプレート、または
疎水性ストリップの底に適用した膜の種類と同一である。 固定した物理的スペ
ーサーは、平面蛍燐光体貯蔵スクリーンまたはＸ線フィルムへの曝露によるイメ
ージングには好ましくはない。

【０３２８】 14.5.配列の比較 そのようにして得られた各配列を、Applied Biosystems によって開発され、
INHERIT(商標名)670配列分析システムに組込まれたた検索アルゴリズムを使用し
て、GenBankの配列と比較した。 このアルゴリズムにおいて、パターン特定言
語（TRW社、ロスアンジェルス、カリフォルニア州により開発されたもの）を使
用して、相同性の領域を調べた。 どのように配列比較を行うか決定する３つの
パラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウ補正値および許容測定誤差であっ
た。 これら３つのパラメータの組合せを使用して、照会配列と相同な領域を含んでい
る配列について、DNAデータベースを検索し、そして適切な配列を初期値をもっ
てスコア付けした。 続いて、これら相同領域を、偶然の一致から相同領域を区
別するために、ドットマトリックスプロットを使用して調べた。 相同性検索の
結果を示すために、スミス−ウォーターマン・アラインメントを使用した。 ペ
プチドおよびタンパク質配列の相同性は、DNA配列の相同性で使用したと類似の
方法により、INHERIT(商標名)670配列分析システムを用いて確かめた。 パター
ン特定言語およびパラメータウィンドウを使用して、初期値をもってスコア付け
された相同性の領域を含んでいる配列について、タンパク質データベースを検索
した。 偶然の一致から有意な相同性の領域を区別するために、ドット−マトリ
ックス相同性プロットを調べた。

【０３２９】 あるいは、基本的局所アラインメント検索ツールを表すBLASTを使用して、局
所配列アラインメント（Altschul SF (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul
, SF ら(1990) J Mol Biol 215:403-10）について検索を行う。 BLASTによって
、配列の類似性を決定するためのヌクレオチドおよびアミノ酸双方の配列のアラ
インメントが作成される。 アラインメントの局所的な特質のために、BLASTは
、正確な一致を調べる上でまたは相同体を同定する上で特に有用である。 ギャ
ップを含まない一致については観念的であるので、モチーフ−スタイル検索を実
行するには不適切である。 BLASTアルゴリズム出力の基本的な単位は、高スコ
ア付けセグメント対(HSP)である。 HSPは、任意であるが、同じ長さの２つの配
列断片で、そのアラインメントが局所的に極大であり、そのアラインメントスコ
アが、ユーザーに設定された閾値もしくは遮断スコアに、適合するかまたはそれ
を超えるものからなる。 BLASTアプローチは、照会配列とデータベース配列と
の間のHSPを探し、見出されたすべての一致部分の統計的有意性を評価し、そし
てユーザーが選択した有意性の閾値を満たすような一致部分のみを報告するすも
のである。 パラメータＥによって、データベース配列一致部分を報告するため
の、統計的に有意な閾値が確立される。 Ｅは、全データベース検索の内容に含
まれるHSP（または複数のHSPの組合せ）の発生の機会の期待される頻度の上限と
して解釈される。 その一致性が、Ｅを満たすデータベース配列のすべてが、プ
ログラム出力に報告されるのである。

【０３３０】 本発明を、以下の実施例に例示する。 実施例１は、新規インターロイキン-1
受容体アンタゴニストの同定に関する。 実施例２は、ヒト組織での半定量的PC
Rによる配列番号：２の発現の検討に関する。 実施例３は、配列番号：２を用
いた染色体の局在性について記載している。 実施例４は、配列番号：２に対応
する遺伝子座のイントロン／エクソン構造の決定に関する。 実施例５は、イン
ターロイキン-1受容体結合ドメインの同定および受容体結合性アッセイに関する
。 実施例６および７は、IL-1 Hy1のヌクレオチド配列の決定に関する。 実施例８
および11は、IL-1 Hy1ゲノミッククローンの単離とマッピングに関する。 実施
例９は、大腸菌でのIL-1 Hy1の発現に関する。 実施例10は、IL-1 Hy1の生物学
的使用に関する。 実施例12は、IL-1 Hy1ポリペプチドの組換えタンパク質発現
および精製に関する。 実施例13は、IL-1受容体へのインターロイキン-1 Hy1受
容体アンタゴニストの結合性に関する。 実施例14は、IL-1 Hy1 IL-1アンタゴ
ニスト活性の確認に関する。 実施例15は、IL-1β誘発したIL-6産生の阻害に関
する。 実施例16は、IL-1 Hy1の分子質量の決定に関する。 実施例17は、活性
化THP-1細胞でのIL-1 Hy1の発現に関する。 実施例18は、免疫組織化学法によ
るヒト組織でのIL-1 Hy1タンパク質発現の検出に関する。 実施例19は、DNAプ
ローブを用いたin situハイブリダイゼーションによるIL-1 Hy1の検出に関する
。 実施例20は、リボプローブを用いたin situハイブリダイゼーションによるI
L-1 Hy1の検出に関する。 実施例21は、IL-1 Hy1によるIL-13産生の誘発に関す
る。 実施例22は、インターフェロン−γの発現の誘発について測定を行った、
IL-1 Hy1によるIL-18活性の阻害に関する。 実施例23は、皮膚繊維芽細胞でのI
L-1 Hy1発現について記載している。 実施例24は、IL-1 Hy1で誘発したICAM-1
発現について記載している。 実施例25は、マウスゲノミックIL-1 Hy1配列の決
定について記載している。 実施例26は、IL-1 Hy1が関与する動物試験に関する
。

【０３３１】

【実施例】

本発明は、以下の実施例によって例証される。 本明細書の開示を考慮して、
当業者であれば本発明の範囲に様々な実施態様や変更を施すことができるはずで
ある。 従って、本発明の広範な態様が意図されており、以下の実施例により限
定的に解釈されるべきでないことはもちろんである。

【０３３２】 7.0.産業上の利用性 7.1.実施例１ 胎児肝−脾臓のcDNAライブラリーから得られた新規インターロイキン-1受容体 アンタゴニスト 複数の新規核酸を、ヒト胎児肝−脾臓組織から調製されたb²HFLS20W cDNAライ
ブラリーから、Bonaldoら, Genome Res. 6:791-806 (1996)に記載されるとおり
に、標準的PCR、SBH配列シグネーチャー分析およびサンガー配列決定技術を使用
して得た。 ライブラリーのインサートを、そのインサートに近接するベクター
配列に対して特異的なプライマーを使用したPCRで増幅した。 これらの試料を
、ナイロン膜にスポットし、配列シグネーチャーを与えるべくオリゴヌクレオチ
ドプローブについて問い合わせを行った。 これらクローンは、類似または一致
配列の群にクラスター形成させ、そして単一の代表的なクローンを、ゲル配列決
定のために各群から選択した。 増幅されたインサートの5'配列は、次いで、典
型的なサンガー配列決定プロトコルにて逆M13配列決定プライマーを使用して推
定を行った。 PCR産物を精製し、そして蛍光染色終止サイクル配列決定に付し
た。 377 Applied Biosystems(ABI)配列決定装置を使用して、単流ゲル配列決定を行
った。 これらのインサートのうち２つが、このライブラリーからこれまでに得
られておらず、そして、これまで公開データベースに報告されていない新規配列
として同定された。 これらの配列を、図２に、配列番号：１〜２として示す。
これら核酸配列に対応するポリペプチド配列を、図３に配列番号：３として示し
ている。 これらアミノ酸配列は、インターロイキン-1受容体アンタゴニストに
対して顕著な相同性を有する。

【０３３３】 7.2.実施例２ 配列番号：２を用いた発現の検討 炎症応答の調節における配列番号：２の役割を検討するために、半定量式ポリ
メラーゼ連鎖反応に基づいた技術を用いて遺伝子発現を分析した。 cDNAライブ
ラリーを、関連のある組織（３つの白血球調製物［２つは刺激済、１つは刺激せ
ず］、心臓、肺、脾臓、胎盤、精巣、胎児肝臓、成人肝臓、骨髄、リンパ節、マ
クロファージ、内皮細胞、胎児皮膚および臍帯）からの発現遺伝子の供給源とし
て用いた。 遺伝子特異的プライマーを、試料から（配列番号：２の5'端から番
号付けした第105〜772位および第161〜690位の塩基に相当する）配列番号：２の
配列の一部を増幅するために用いた。 増幅産物はアガロースゲルで分離され、
ナイロンフィルターに移され、化学的に結合された。 そして、このフィルター
を、クレノウポリメラーゼ、ランダムプライム法を用いて、配列番号：２の全長
配列から生成した、放射性標識した(³³Pα-dCTP)二本鎖プローブでハイブリダイ
ズした。 このフィルターを（高ストリンジェントで）洗浄し、そして、数時間
にわたって燐光イメージスクリーニングに曝すために用いた。 バンドは、特定
のライブラリーでの配列番号：２の配列を含むcDNAの存在と、それに、対応する
細胞型または組織でのmRNA発現を指し示している。

【０３３４】 配列番号：２は、非常に限られたヒト組織にて発現した。 試験した16個のヒ
ト組織の内、配列番号：２の発現がしっかりと調節されていることを示すシグナ
ルをもたらした試料は、胎児皮膚と臍帯だけであった。 これら双方のIL-1 Ra
の発現は、組織と細胞型との部分集合にて限定的に認められるに過ぎず、双方共
に皮膚において本質的な発現を果たしたが、他の組織または刺激を与えていない
細胞型ではその発現は認められなかった。 このように、配列番号：２の発現パ
ターンはIL-1 Ra遺伝子のそれと類似しており、このことは、配列番号：２によ
ってコードされた新規のサイトカインが、炎症応答の調節において某かの役割を
果たしていることを指し示すものである。

【０３３５】 7.3.実施例３ 配列番号：２を用いた染色体局在化の検討 染色体マッピング技術は、研究者による染色体の特定領域への遺伝子の結合を
可能ならしめる。 染色体マッピングは、スタンフォードG3放射線ハイブリッド
パネル（Rsearch Genetics）を用いて実施した。 このパネルは、配列タッグ部
位(STS)をもたらす遺伝子特異的プライマー(5'-プライマー：CCCCACTGGATGGTGCT
ACTG;(配列番号：15)、3'プライマー：GGGAAGAGATAGGAAAGGTAG(配列番号：16))
を用いてスクリーニングし、PCRスクリーニングの結果は、スタンフォードヒト
ゲノムセンター(SHGC)にある、スタンフォード放射線ハイブリッドマッピングe-
メールサーバーに送信した。 放射線ハイブリッドフレームワークマップでの遺
伝子位置は、配列番号：２に対応するSTSを、最良の連鎖によって、SHGCマーカ
ーに結合することによってもたらされる。

【０３３６】 その結果は、配列番号：２は、第２染色体の長腕上に位置することを示してい
た。 STSは、LOD(確率対数)スコアが12.25で、cR-1000が５のマーカーSHGC-702
0に結合し、このことは、STSがこのマーカーの120kb（キロベース）以内に位置
していることを示している。 換言すれば、SHGC-7020は、IL-1 Ra遺伝子の120k
b以内に位置している。 よって、配列番号：２に対応するSTSは、IL-1 Ra遺伝
子の約240キロベース以内に位置しており、IL-1 Ra遺伝子と非常に近接している
。

【０３３７】 進化プロセスの間に多メンバー遺伝子ファミリーをもたらす染色体内遺伝子複
製現象によって、遺伝子ファミリーメンバーは、しばしば染色体の特異領域に結
合する。 インターロイキン-1遺伝子は、第二染色体にマッピングされた。 具
体的には、インターロイキン-1遺伝子（IL-1a、IL-1b）および受容体（IL-1 RI
およびIL-1 RII）のすべて、ならびに受容体アンタゴニストIL-1 Raは、第２染
色体の長腕に認められた。 同じ領域での配列番号：２の配列の同定によって、
インターロイキン-1遺伝子座への配列番号：２の物理的結合をもたらし、このこ
とは、配列番号：２によってコードされたサイトカインが、炎症反応のモジュレ
ーターとして機能することを証明するものである。

【０３３８】 7.4.実施例４ 配列番号：２に対応する遺伝子座のイントロン／エクソン配列 遺伝子ファミリー内にあるメンバーは、それらが共通の先祖前駆体から得られ
る観点からして、ゲノミック組織をよく維持している。 IL-1a、IL-1bおよびIL
-1 Raのイントロン／エクソン配列は、高度に保存されており、このことはそれ
らが共通の先祖遺伝子に由来するであろうことを実証するものである。 我々は
、配列番号：２を含んだ人工の細菌染色体(BAC)を単離した。 遺伝子特異的プ
ライマーを用いて、クローンの5'方向に配列決定を行い、コード配列（配列番号
：２と同じ）とイントロン配列の概要を明らかにした。 イントロン／エクソン
構造は、IL-1 Raと、配列番号：２を含むBAC断片との間で同一であり、このこと
は、これら二つの配列が同じファミリーのメンバーであり、また、共通の遺伝子
前駆対に由来するものであることを証明するものである。

【０３３９】 7.5.実施例５ インターロイキン-1受容体結合ドメインおよび インターロイキン-1受容体アッセイ IL-1βおよびIL-1 Raの双方の受容体結合領域を、部位特異的突然変異誘発お
よびタンパク質修飾の研究によって、タンパク質のカルボキシ末端の半分（すな
わち、IL-1βの88〜105残基）において、18個のアミノ酸領域にマッピングした
。 IL-1βおよびIL-1 Raの双方と配列番号：３とのアミノ酸アライメントは、配列
番号：３が受容体結合領域を含んでいることを実証していた。 配列番号：３は
、この領域において、IL-1 Raと39％が同一であり、また、IL-1βと22％が同一
であった（39％が保存されていた）。 比較において、IL-1受容体に結合するこ
とが知られているIL-1 Raは、この領域において、28％が同一であり、また、50
％が保存されていた。 配列番号：３でのこの領域と、IL-1βおよびIL-1 Raの
双方の受容体結合領域との間での顕著な類似性は、配列番号：３が、IL-1受容体
結合領域をも含んでいることを示すものである。 受容体結合領域における３つ
のタンパク質すべてのアラインメントを、図４に示した。

【０３４０】 配列番号：３がIL-1受容体結合領域を含んでいるため、配列番号：３と、この
受容体結合領域を含む配列番号：３の先端が切除された形態のものとは、IL-1受
容体を発現する細胞および組織を同定するための試薬として有用である。 Hann
um et al. Nature 343:336-340 (1990)に記載のIL-1受容体結合アッセイが用い
られる。 要するに、放射線活性の強い組み換えの配列番号：３を、[35S]硫黄
を含むM9培地にて配列番号：３を発現する大腸菌を成育し、そして、モノ-Sカラ
ムでのクロマトグラフィーによって標識付けした配列番号：３を精製することに
よって調製する。 標識付けした配列番号：３を、標準的なIL-1結合アッセイ条
件下で、[35S]の結合条件下で、細胞または組織と共にインキュベートした。 [
35S]の結合が大きいことは、IL-1受容体の存在を示すものである。

【０３４１】 7.6.実施例６ ヒトのインターロイキン-1βとヒトのインターロイキン-1受容体アンタ ゴニストに対して配列相同性をもった155個のアミノ酸タンパク質を コードするヌクレオチド配列の決定 配列番号：４で標識付けされた、図５に記載のヌクレオチド配列は、図６に記
載の配列番号：５の翻訳されたアミノ酸配列をコードする。 胎児皮膚cDNAライ
ブラリー由来のクローンのプールから得た、PCR産物を単離することによって、
伸長したヌクレオチド配列を得た。 要するに、胎児皮膚cDNAライブラリーを、
約40,000コロニーのプールを持ったアンピシリン含有プレートに置いた。 これ
らコロニーをLB培地に戻し、そして、配列番号：２（図２）を含んだプールを検
出するためにPCRを用いた。 二つのプールが、同定された。 ベクターおよび
遺伝子特異的プライマーを用いたPCRは、そのcDNAの5'部分を増幅した。 二つ
の増幅産物から配列を得るために、入れ子にしたプライマーを用いた。 部分配
列を書き出し、そして、全長配列に「当て嵌める(contig)」ために、Laser gene
（登録商標）ソフトウェアを用いた。

【０３４２】 配列番号：４は、一般的な疎水性のリーダーペプチドを欠いた、155個のアミ
ノ酸のタンパク質をコードし、このことは、このタンパク質が、ヒトのIL-1 Ra
遺伝子産物の細胞質イソ体に類似した細胞質分子として保持されていることを示
唆するものである。 図７には、配列番号：５と（「HUMIL1RASIC」と名付けた
）ヒトのIL-1 Raの細胞質イソ体とのアミノ酸アライメントを示している。 こ
のアライメントは、二つの間の相同性の高さを示すものであり、48％のアミノ酸
が同一であり、また、54％が保存的アミノ酸置換であった。 ３つの残基が、（
図７において星印を付した）IL-1βによる受容体活性に不可欠であることが証明
された。 IL-1 Raでの対応する残基は相違しており、IL-1 Raのアンタゴニスト活性が付与
されている。 これら残基は、IL-1 Raに関するR21、W23およびK152であって、
また、成熟IL-1βに関するT9、R11およびD145である。 配列番号：５は、（IL-
1 Raにて対応する残基と同一である）R10ならびに（IL-1βにて対応する残基と
、それぞれ、同様および同一である）K12およびD148の双方の残基の組み合わせ
を含んでいる。 全体的な相同性およびアゴニスト／アンタゴニスト部位特異的
配列相同性は、配列番号：５を、炎症応答でのタンパク質モジュレーターとして
明確に規定している。

【０３４３】 7.7.実施例７ 配列番号：４での３つのプライム伸長 配列番号：６（図８）は、配列番号：４の核酸配列の3'端を伸長したものであ
る。 配列番号：６は、配列番号：４に関して先述したようにして、胎児皮膚 cDNAライブラリーから得た。

【０３４４】 7.8.実施例８ 配列番号：１、２および４に対応するゲノミッククローンの単離とマッピング ヒトのBACゲノミックライブラリー（Research Genetics）を、PCRに基づいた
アッセイによって、ゲノミック配列の4533〜4553位にハイブリダイズする遺伝子
特異的プライマー(273-D、5'-CCCCACTGGATGGTGCTACTG-3'（配列番号：15))、そ
して、4849〜4869位にハイブリダイズする273-E、5'-GGGAAGAGATAGGAAAGGTAG-3'
（配列番号：16)を用いてスクリーニングした。 要するに、遺伝子特異的プラ
イマーを、標準的なPCR条件を用いて、鋳型としてのBAC DNAを増幅するために用
いた。 予想した大きさに対応するDNAの断片を生産するBACについて、研究を継続した。
BAC393-I6が単離され、そして、配列番号：２に由来するの遺伝子特異的プライ
マーを用いて、そのDNAの配列決定を行った。 その配列（長さ16403塩基）を、
図９に示す。 IL-1 Raコード配列は、５つのエクソンにまたがって分布してい
ることが認められた。 イントロンとエクソンのサイズに従って、スプライス供
与体と受容体部位を、以下に示した。

【０３４５】

【表２】

【０３４６】 7.9.実施例９ 大腸菌での配列番号：３の発現 配列番号：２の全コード領域を原核発現ベクターにサブクローニングすること
によって、大腸菌にて配列番号：３を発現した。 使用した発現ベクター(pQE16
)は、QIA発現原核タンパク質発現系(Qiagen)から得た。 タンパク質発現に有用
なこのベクターの特徴として、転写を駆動する効率的なプロモーター(ファージT
5)であることと、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を添加する
ことで誘発できるlacオペレーター系によって得られる発現制御と、コードされ
たHis₆タッグがある。 後者は、ニッケル原子に非常に強固に結合することがで
きる、６つのヒスチジンアミノ酸残基からなるものである。 このベクターは、
そのカルボキシ末端にHis₆タッグが融合した組換えタンパク質を発現するために
用いることができ、ニッケルが結合したアフィニティーカラムにて、このタンパ
ク質の迅速かつ効率的な精製が可能となる。

【０３４７】 配列番号：２（開始コドンは含むが、ストップコドンは含まない）のコード配
列を、PCR反応用プライマーAP1(5' gaagatctatggtcctgagtggggccctg-3')(配列番
号：25)とAP2(5' gaagatctgtcacactgctggaagtagaa-3')(配列番号：26)を用いて
増幅した。 双方のプライマーは、その5'端に、クローニング目的のためのBglI
I制限部位を有している。 増幅時に得られたPCR断片は、インサートをベクター
に挿入するための位置ずれした端部を得るために、BglIIで制限した。 ジヒド
ロ葉酸レダクターゼコード配列を含むセグメントを除去し、また、PCR断片の端
部と適合する位置ずれした端部も得るために、pQE16プラスミドをBglIIとBamHI
で消化した。 p16BB-273を得るために、このPCR断片を、消化したpQE16ベクタ
ーに連結した。 この連結したものは、電気穿孔法によって電気反応性の大腸菌
細胞(Qiagen社から入手したM15[pREP4]株)に形質転換し、そして、形質転換した
細胞を、アンピシリン含有プレートに播いた。 遺伝子特異的プライマーとベク
ター特異的プライマーを利用したPCR反応を用いて、適切な配向の適正なインサ
ートについて、コロニーをスクリーニングした。 次いで、正しい配向と配列を
確証するために、陽性のものの配列決定を行った。 配列番号：３を発現するた
めに、適正な組み換えクローンを含むコロニーを、100μg/mlのアンピシリン、2
5μg/mlのカナマイシンを含むL-培地に接種し、培養物を、37℃で、一晩、成育
せしめた。 次いで、飽和した培養物を同じ培地で20倍に希釈し、600nmでの光
学密度が0.5に達するまで成育せしめた。 この時点にて、タンパク質発現を誘
発するために、最終濃度が１mMになるようIPTGを添加した。 この培養物を、さ
らに５時間成育せしめ、次いで、3000×ｇ、15分間の遠心分離によって、細胞を
回収した。

【０３４８】 得られたペレットは、20mM Tris-塩酸 (pH 7.5)(Pierce社のB-PER(登録商標)
試薬）を含む非刺激性の非イオン性洗浄剤を用いて溶解するか、または濁った細
胞懸濁液が半透明になるまで超音波処理した。 得られた溶解物を、非変性条件
下でニッケル含有カラム（Qiagen社のニッケル-NTA回転カラム）を用いてさらに
精製した。 要するに、この溶解物を、300mM 塩化ナトリウムと10mM イミダゾ
ールを含む系に移し、そして、ヒスチジンがタッグされた組み換えタンパク質が
ニッケルカラムへの結合を許容ならしめるよう、回転カラムにて700×ｇで遠心
分離した。 次いで、このカラムを洗浄用緩衝液(50mM NaH₂PO₄、pH8.0: 300mM
塩化ナトリウム；20mM イミダゾール)で２度洗浄し、そして、溶出用緩衝液(50m
M NaH₂PO₄、pH8.0: 300mM 塩化ナトリウム；250mM イミダゾール)で溶出した。

【０３４９】 以上の手順はすべて４℃にて実施した。 精製したタンパク質を、SDS-PAGEで
確認した。 配列番号：３の予想サイズと符合する、16kDの分子量にて強い単一のバンドが認
められた。

【０３５０】 7.10.実施例10 配列番号：３および５の使用 7.10.1.医学用造影 本発明での新規のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドは、
医学用造影、例えば、感染、炎症およびインターロイキン-1受容体アンタゴニス
ト受容体分子を有する他の部位を造影する上において有用である。 例えば、Ku
nkel et al., 米国特許第5,413,778号を参照のこと。 このような方法は、標識
物質の化学的付着、薬学的に許容される担体に取り込まれた標識付けしたインタ
ーロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドの患者への投与、および標的部
位での標識付けしたインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドのin vivo での造影に関与する。

【０３５１】 7.10.2.膵炎 急性浮腫性壊死性膵炎を、コレシストキニンの類似体であるカエルレインを用
いて、体重が35ｇ以上の成体の雄のスイスマウスに誘発した。 これらマウスを
４つのグループに分け、その内の３つのグループについては、50 mu g/kgのカエ
ルレインを腹膜内(IP)注射によって、先述したようにして、３時間にわたって、
４用量を投与する。 (Murayama et al., Arch Surg 1990;125;1570-1572; Tani
et al., International J Pancreatology 1987;2;337-348; Schoenberg et al.
, Free Radical Biology & Medicine 1992;12;515-522; Heath et al., Pancrea
s 1993;66;41-45; Saluja et al., Amer Physiological Society 1985;G702-G71
0; Manso et al., Digestive Diseases and Sciences 1992;37;364-368)。

【０３５２】 グループ１は、生理食塩水だけをIP注射してなる対照のグループ（ｎ＝９）で
ある。 グループ２は、処置を施していない対照の疾病グループ（ｎ＝12）であ
る。 グループ３は、膵炎を誘発する１時間前に３回の注射（10mg/kg/時間）を
行ったグループ（ｎ＝12）である。 グループ４は、膵炎を誘発した１時間後に
３回の注射（10mg/kg/時間）を行ったグループ（ｎ＝12）である。

【０３５３】 適当な時間を置いた後に、すべての動物を安楽死せしめ、血液を回収し、そし
て、膵臓を外科的に摘出して計量を行った。 アミラーゼ、リパーゼ、IL-6およ
びTNFレベルに関して血清をアッセイした。 各膵臓を、固定および染色し、そ
して、間質性浮腫、顆粒球浸潤、小胞空胞形成および小胞細胞に関して、盲検的
にして、組織学的等級付けを行った。 これにより、インターロイキン-1受容体
アンタゴニストの血清レベルが決定され、そして、用量、血清レベル、全身的サ
イトカイン応答および膵臓損傷の程度との間の比較が可能となる。

【０３５４】 インターロイキン-6、インターロイキン-1、インターロイキン-1受容体アンタ
ゴニストおよびTNFを、市販のELISAキット（Genzyme社、ボストン、マサチュー
セッツ州）によって測定される。 すべての検体を、３度測定に付した。 アミ
ラーゼとリパーゼの血清レベルは、Kodak Ectachem 700自動分析器(Eastman Kod
ak社、ロチェスター、ニューヨーク州)で計測する。

【０３５５】 迅速な摘出とそれに続く10％ホルマリンでの固定の後、当該技術分野で周知の
ようにして、組織細片を調製する。 当該技術分野で周知のようにして、この組
織をパラフィンに埋設し、次いで、標準的な方法にて、ヘマトキシリンとエオシ
ンで染色する。 これら細片を検定し、そして、協会認定の病理医による盲検的
等級付けを行う。

【０３５６】 7.10.3.インターロイキン-1誘発細胞増殖の阻害 マウスD10 T細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル
、メリーランド州）から入手する。 細胞を、10mM HEPES緩衝液（pH 7.4)と10
％ウシ胎児血清を含む、ダルベッコの修飾培地とハムのF-12培地(1:1)にて維持
する。 すべての組織培養試薬は、カブトガニ遊走細胞アッセイによって決定された0.25
ng/ml未満の内毒素を含んでいた。

【０３５７】 インターロイキン-1依存性T-細胞系であるマウスD10細胞は、インターロイキ
ン-1分裂促進活性を測定するために用いる。 インターロイキン-1存在下での、
本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドの有無による細
胞増殖は、先述したような、チミジン（上限3H）の取り込みによってアッセイさ
れる(Bakouche, O., et al., J. Immunol. 138:4249-4255, 1987)。 好ましい
態様にあっては、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチ
ドのアンタゴニストおよびアゴニストは、候補化合物と、インターロイキン-1お
よび本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドとを添加し
、および候補化合物によってもたらされる細胞増殖での変化を測定することによ
って、このアッセイにて同定される。

【０３５８】 7.10.4.インターロイキン-1誘発細胞の細胞毒性の阻害 インターロイキン-1誘発した細胞毒性の阻害を、例えば、96ウェルマイクロ滴
定プレートに置かれた6000細胞／ウェルの密度のA375腫瘍細胞のような、好適な
細胞系を用いて研究する。 終夜放置した後、インターロイキン-1(３〜300ng/m
l)を、NAAまたはNMAの存在下または不在下にて添加する。 細胞を３日間インキ
ュベートした後、さらに２時間かけて、チミジン（上限3H）を添加する（１muCi
／ウェル）。 細胞を、ガラス繊維ディスク（PHD細胞回収：ケンブリッジテク
ノロジー社、ウォータータウン、マサチューセッツ州）上に回収した。 ディス
クを一晩風乾し、モデル 1900TR シンチレーションカウンター（Packard Instru
ment Division、ダウナーグローヴ、イリノイ州）で放射能を測定する。

【０３５９】 7.10.5.平滑筋細胞での亜硝酸塩合成の誘発 大動脈の平滑筋細胞を、成体の雄のFischer344ラットの大動脈の中間層のセグ
メントを外移植することによって培養する。 大動脈を無菌的に除去し、その内
腔と外腔表面の双方をすりはがすことによって、外膜細胞と内皮細胞を清浄する
。 中間層断片は、細胞が出現するまで成長培地によって湿度が保たれている、
Primaria 25-cm sup ２組織培養用フラスコ(Becton-Dickinson、リンカーンパー
ク、ニュージャージー州)にて接着できるようになる。 培養物には、週に２度
、10％ウシ胎児血清、25mM HEPES緩衝液(pH 7.4)、２mM L-グルタミン、40 mu g
/ml内皮細胞成長補助剤(Biomedical Technologies社、Stoughton、マサチューセ
ッツ州）および10 mu g/mlゲンタマイシン(GIBCO BRL、グランドアイランド、ニ
ューヨーク州)を含む培地199が補充される。 最初の培養物が集密してくれば、
それらはトリプシン処理に付され、外植片は廃棄される。 これら研究のために
、通路12〜14から得た細胞を、96ウェルプレートの１ウェル当たり20,000の密度
で接種し、集密時（60,000〜80,000細胞／ウェル）に用いる。 これら細胞は、
起伏のある形態を持った典型的な平滑筋細胞の表現型を呈しており、また、平滑
筋のアクチンを強く染色する。

【０３６０】 ラットの大動脈平滑筋細胞を、10％子ウシ血清、25mM HEPES緩衝液、pH7.4、
２mM グルタミン、80U/ml ペニシリン、80mu g/mlストレプトマイシン、２mu g/
mlフンギゾーン、それにインターロイキン-1、IFN-γおよび様々な阻害剤を含む
RPMI-1640培地でインキュベートする。 所望の時点にて、培養培地中の亜硝酸
塩濃度を、96-ウェルマイクロ滴定プレートリーダー(Gross, S.S., et al. Bioc
hem.Biophys. Res. Commun. 178:823-829, 1991)を利用した標準的なグライエス
アッセイ(Green, L., et al. Anal. Biochem. 126:131-138, 1982)を用いて測定
する。 そして、100mlのグライエス試薬（0.5％スルファニル酸、0.05％ナフタ
レンジアミンおよび2.5％燐酸）を、等量の培養培地に加え、OD sub 550を計測
し、そして、標準曲線を参照して亜硝酸塩濃度と相関せしめる。 細胞不在下で
インキュベートした培地のバックグラウンドOD sub 550を、実験値から控除する
。

【０３６１】 ラットの大動脈平滑筋細胞を、10％子ウシ血清、25mM HEPES緩衝液(pH7.4)、
２mM グルタミン、80U/ml ペニシリン、80mu g/mlストレプトマイシン、２mu g/
mlフンギゾーン、30mu g/mlリポ多糖（大腸菌0111:B4）および50U/ml IFN-γを
含むRPMI-1640培地でインキュベートする。 24時間後に細胞を回収し、細胞質
ゾルを調製する(Gross, S.S., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178:82
3-829, 1991)。 細胞質ゾルのNO合成酵素活性を、先述のFe sup 2+ミオグロビ
ン法によってアッセイする(Gross, S.S., et al. Biochem. Biophys. Res. Comm
un. 178:823-829, 1991)。

【０３６２】 7.10.6.リンパ節の重量増大によって決定された同種反応性 本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポリペプチドの全身投与が
、同種細胞によってもたらされたアロ抗原に対する局在化したＴ細胞依存性の免
疫応答を抑制することを示すための実験を実施した。 マウスの足蹠に、惹起し
た同種脾臓細胞を注射する。 そして、このマウスの反対側の足蹠に、惹起した
同系の脾臓細胞を注射する。 同種反応（リンパ球の増殖と炎症が目印となる）
が同種細胞を投与した足蹠に認められ、この反応は、抗原の沈着部位を排出する
膝窩リンパ節の対照に対する大きさと重量の増大を決定するか、または細胞質の
増大によって決定することができる。

【０３６３】 病原体をもたない特定の８〜12週齢のBALB/c(H-2 sup d)およびC57BL/6(H-2 s
up d)マウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor, メイン州)を、この実験で用い
た。 48匹のBALB/cマウスを16のグループに分け、（特に断りの無い限り）各グ
ループに３匹を割り当てた。 各グループのマウスには、異なる処置を施した。
０日目に、全マウスの左足蹠に、抗原として、50μlのRPMI-1640(Gibco)でのC57
BL/6マウス由来の107の惹起した(2500R)同系脾臓細胞を皮内に注射し、また、同
じマウスの反対側の右足蹠には、BALB/cマウス由来の10 sup 7の惹起した(2500R
)同系脾臓細胞を注射する。

【０３６４】 抗原を投与して７日後に、マウスを屠殺し、そして、外科的切除によって、左
右の膝窩から膝窩リンパ節(PLN)を取り出す。 リンパ節を計量し、そして、同
種細胞の注射部位を排出するリンパ節の重量(mg)と同系細胞の注射部位を排出す
るリンパ節の重量との差異(DELTA)を求める。 同系細胞の注射部位を排出する
リンパ節の重量は、それらがMSAまたは本発明のインターロイキン-1受容体アン
タゴニストポリペプチドのいずれで処置したマウスから得たものであっても、約
１mgであり、また、細胞の注射を行わなかったマウスから得たリンパ節の重量と
は大差がなかった。

【０３６５】 7.10.7.In vivoでの臓器移植片拒絶の抑制 新生児のC57BL/6(H-2 sup d)の心臓は、Trager et al., Transplantation 47:
587, 1989およびVan Buren et al., Transplant. Proc. 15:2967, 1983にて修正
が加えられたFulmer et al., Am. J. Anat. 113:273, 1963の方法を利用して、
成体のBALB/c(H-2 sup d)被移植マウスの耳介へ移植される。 移植した心臓の
生存を、移植片の脈動を目視にて検査する。 脈動は、移植後の５または６日後
から、麻酔をかけた被移植マウスの耳−心臓移植片に柔らかな反射光をあて、解
剖用顕微鏡で検査することによって決定される。 移植片拒絶の時間は、収縮活
動が終わる移植後の日数として定義される。

【０３６６】 被移植マウスには０日目に移植が施され、そして、０〜６日目にかけて、腹腔
内経路および皮下経路のいずれかで、本発明のインターロイキン-1受容体アンタ
ゴニストポリペプチドとMSA(マウス血清アルブミン、100ng)を併用したもの、ま
たはMSAだけを注射する。 第二の心臓移植実験では、０〜２日目にかけて、腹
腔内経路だけで、MSAのみを注射する。

【０３６７】 7.10.8.炎症性関節炎の抑制 20匹のラットを、各グループに５匹が割り当てられるよう、グループＧ〜Ｊの
４グループに分ける。 mBSAで免疫処置して21日目に、炎症性関節炎反応が誘発
される。 同じ日に、負の対照グループに、0.2mlの体積の生理食塩水を注射す
る。 被験グループには、本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストポ
リペプチドの量を増やして注射する。 インターロイキン-1を、正の対照とする
グループに注射する。 処置した関節の最大領域の直径を、抗原を関節内に注射
した０日目として、２、４、６および８日目に測径器で測定する。

【０３６８】 7.11.実施例11 配列番号：６に対応するゲノミッククローンの単離とマッピング 図10Ａ−Ｃに、図９Ａ−Ｃに示したゲノミック配列（配列番号：７）を伸長し
たものであるゲノミッククローン（配列番号：８）を示す。 配列番号：８には
、配列番号：６に示した（未翻訳の３つの主要な）伸長配列を含む。 このゲノ
ミッククローン（配列番号：８）の単離は、実施例８に記載したものを同じであ
った。 長さが7605ヌクレオチドの配列を、図10Ａ−Ｃに示す。 このクローン
でのエクソンの構成を、以下に示す。

【０３６９】

【表３】

【０３７０】 7.12.実施例12 組み換えタンパク質発現および精製 Ｎ末端疎水性配列を欠いたインターロイキン-1受容体アンタゴニストコード配
列（配列番号：３）を持った発現ベクターを、pRSETベクター（アンピシリン耐
性を付与する）でのHis₆タッグ（６つのヒスチジンアミノ酸残基）と発現タッグ
（抗体タッグ）の後に置いた。 組み換えタンパク質のアミノ末端に融合したHi
s₆タッグは、ニッケルが結合したアフィニティーカラムを用いた迅速かつ効率的
な精製が可能ならしめる。

【０３７１】 この構築物を大腸菌(クロラムフェニコール耐性を付与するpLYSプラスミドを
持ったBL-21)に形質転換し、そして、IPTG（最終で１mM）を用いて誘発した。
細菌ペレットを、50mM Tris pH7.5に懸濁した。 １mg/mlのリソチームの存在下
で細胞を溶解する（湿細胞１ｇ当たり10mlの緩衝液）ために、音波破砕を採用し
た。 細胞滓を、遠心分離で除去した。 イミダゾールを、100mM 25 塩化ナト
リウムを用いて、最終濃度が10mMとなるよう添加した。 抽出物を、ニッケルキ
レートカラムに適用した。 50mM〜300mMのイミダゾールの直線勾配を用いて、
タンパク質を、このカラムから溶出した。 ピークを回収した後、セファデック
スG-25カラムにて、20mMリン酸ナトリウム緩衝液へ脱塩した。 タンパク質をＱ
−セファロースカラムに適用し、そして、０〜350mMの勾配を用いて溶出した。

【０３７２】 最終の組み換えタンパク質をフィルター濾過し、そして、−20℃で保存した。

【０３７３】 7.13.実施例13 インターロイキン-1受容体へのインター ロイキン-1受容体アンタゴニストの結合 本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストがインターロイキン-1受容
体に結合することを実証するために、細胞結合アッセイを行った。 要するに、
100倍量以上の量のタッグ付けしていないインターロイキン-1β（IL-1β）リガ
ンドの存在および非存在下での組み換えタンパク質の細胞結合（実施例12を参照
）を、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト組み換えタンパク質での発現タ
ッグに特異的な蛍光抗体を用いて、蛍光活性化細胞選別機(FACS)にて分析を行っ
た。 各反応において、、10⁶個の細胞NHDF（正常ヒト皮膚繊維芽細胞）を、100
μlのFACS緩衝液（希釈したPBSおよび３％子ウシ血清および0.01％アジド）にて
再懸濁した。 100μlの細胞懸濁液内の５nM組み換えインターロイキン-1受容体
アンタゴニストを添加することで細胞の結合を行い、また、ある反応での競合物
として、500nMの組み換えIL-1βも添加した。 細胞を、氷上で１時間インキュ
ベートした。 これら細胞をペレット化し、200μlの0.2mM BS3（架橋剤）を添
加し、そして、細胞を氷上で30分間維持した。 次に、10μlの１M Tris pH 7.5
を添加し、そして、細胞を氷上で15分間維持した。 これら細胞をペレット化し
、FACS緩衝液で１度洗浄し、100μlのFACS緩衝液にて再懸濁し、そして、２μl
の一次抗体（抗−発現タッグ抗体１mg/ml）を添加し、次いで、氷上で30分間イ
ンキュベートした。 これら細胞をペレット化し、FACS緩衝液で洗浄し、そして
、FACS緩衝液（100μlの体積）にて再懸濁した。 抗−マウスIg（１mg/ml）の
２μlの二次抗体（フィコエリトリン接合したもの）を添加し、そして、細胞を3
0分間インキュベートした。 これら細胞を再度ペレット化し、FACS緩衝液で２
度洗浄し、0.5mlのFACS緩衝液にて再懸濁し、そして、FACSにて分析した。 組
み換えのタッグしたインターロイキン-1受容体アンタゴニストで処置した細胞に
おいて、蛍光のずれが認められた。 この結合は、タッグを付けていないIL-1β
タンパク質との競合から外れているので、特異性が認められた。 これら結果は
、IL-1受容体への本発明のインターロイキン-1受容体アンタゴニストタンパク質
の結合を示唆している。

【０３７４】 リガンドとして非標識IL-1Hy1 受容体アンタゴニスト（IL-1 Hy1 Receptor An
tagonist、IL-1 Hy1 RA）を用いて、アッセイを繰り返した。 蛍光の移動が、
組換え体タグ化IL-1 Hy1で処理した細胞に関して観察された。 結合が非タグ化
IL-1 Hy1 RAタンパク質の存在下で減少したので、この結合は特異的であった。

【０３７５】 これらの結果は、本発明のIL-1 Hy1タンパク質のIL-1受容体への結合を確かに
した。

【０３７６】 7.14 実施例14 IL-1アンタゴニスト活性の確認 IL-1アンタゴニスト活性を、以下のようなアッセイに基づいて、プロスタグラ
ンジンE₂(PGE₂）を用いて測定した。 NHDF細胞を、アッセイの24時間前に、 96ウェル中のウェル当たり２×10⁴細胞播いた。 次いで、細胞を、5％CO₂イン
キュベーター内で37℃にて16時間、25pg／mlの組換え体ヒトIL-1β（R&D システ
ムズ（R&D Systems））にて処理した。 IL-1Hy1によるIL-1β刺激PGE2放出の阻
害を研究するために、細胞を異なる量のIL-1Hy1にて、IL-1βの添加前に、２時
間前処理した。 次いで、上清を回収し、細胞残骸を遠心にて取り除いた。 上清中のPGE2の量を、取り扱い説明書に従って、PEG₂アッセイ系（R&D システム
ズ）を用いてELISAにて測定した。

【０３７７】 NHDF細胞をIL-1Hy1のみで処理した場合、PGE₂活性は全く測定されなかった。
IL-1Hy1がIL-1β誘導PGE₂産出を阻害できたかどうかを決定するために、IL-1β
での刺激前に、細胞を異なる濃度のIL-1Hy1にて前処理した。 IL-1Hy1は、図11
で示すように、用量依存的で、IL-1β誘導PGE₂産生を阻害できた。 これらの結
果は、IL-1Hy1が、in vitroで、IL-1raと同様の機構で作用していることを示唆
しており、重なり合った機能を持つことを示唆している。

【０３７８】 あるいはアッセイを、以下のようにCCD1098ヒト繊維芽細胞（ATCC 受託番号 CRL2127）で構築した。 ウェル当たり約２×10⁶細胞を、細胞刺激の前日に96ウ
ェルプレートに播いた。 刺激した日に、細胞を新鮮な培地で１回洗浄し、それ
ぞれのウェルで200μlの新鮮な培地と取り替えた。 細胞をIL-1β（最終濃度１
ng／ml）または対照のサイトカインのみで刺激した。 PGE₂阻害を試験するため
に、異なる濃度のIL-1Hy1またはIL-1raをIL-1βと共にウェルに加えた。 細胞を刺激して16時間後、培養プレートを4000rpmにて５分間遠心し、細胞残骸
物を取り除いた。 100μlの上清を取り、R&Dシステムズによって製造されたPGE ₂ アッセイキットを用いてPGE₂の存在に関して試験した。 アッセイは、取扱説
明書に従って実施した。 このアッセイの結果は、IL-1Hy1が部分的に、用量依
存的にIL-1β刺激PGE₂産生を阻害すること（1000倍過剰にて約40〜60％阻害）を
確かにした。 IL-1Hy1のより高精製調製物が、本アッセイにて完全な阻害を示
す可能性がある。 比較において、IL-1raは100倍過剰で、PGE2産生を完全に阻
害した。

【０３７９】 7.15 実施例15 IL-1β誘導IL-6産生の阻害 インターロイキン−1β誘導IL-6産生の阻害を、臍帯血からのヒト内皮細胞 （Huvec）を用いて研究した。 Huvec細胞を、細胞刺激の前日に96ウェルプレー
ト中にウェル当たり２×10⁴個の細胞をまいた。 刺激した日に、細胞を新鮮な
培地（100μg／mlのヘパリン、50μg／mlの内皮増殖補助物質および10％胎児ウ
シ血清を含むF12培地）で１回洗浄し、それぞれのウェルで200μlの新鮮な培地
（補助物質なし）と取り替えた。 次いで、Huvec細胞を100pg／ml（最終濃度）
で刺激した。 このアッセイは、IL-1βで実施したけれども、任意の対照のサイ
トカインを使用できる。 IL-6阻害を試験するために、異なった濃度のIL-1Hy1
（10×〜1000×IL-1βの濃度の範囲）またはIL-1ra（10×〜1000×IL-1βの濃度
の範囲）をIL-1βと共にウェルに加えた。

【０３８０】 細胞刺激の16時間後、培養プレートを５分間、4000rpmにて遠心し、細胞残骸
物を取り除いた。 100μlの上清を取り、取扱説明書に従って、ヒトIL-6イムノ
アッセイキット（R&D システムズ）を用いてIL-6の存在に関して試験した。

【０３８１】 IL-1Hy1は、用量依存的にて部分的にIL-1β-刺激IL-6産生を阻害した。 IL-6
が腫瘍壊死因子（TNF）、プロ炎症サイトカインの産生を阻害するという事実を
みると、IL-1Hy1が部分的にのみIL-1Hy1によるIL-6産生を阻害するという事実は
、副作用が減少することによって、IL-1Hy1での炎症疾患状態の処理に有用であ
る可能性がある。 IL-1Hy1のさらに高精製調製物が、本アッセイで完全な阻害
を示す可能性がある。

【０３８２】 7.16 実施例16 ヒト細胞で発現しているIL-1Hy1の分子量の決定 ヒト細胞で発現しているIL-1Hy1の分子量を決定するために、ヒト細胞株THP-1
を、IL-1Hy1の存在を検出するように設計した実験で使用した。 Mulero, et al
.,BBRC 263（3）:7.2-7.6（1999）に記述されているように、THP-1細胞は、ホル
ボールエステル（PMA）で分化させ、続いてリポポリサッカライド（LPS）にて刺
激した場合、中程度のIL-1Hy1を発現する。 簡単に記すと、THP-1細胞（ATCC）
を、上記Mulero et al.で記述された条件および培地下でコンフレントまで増殖
させ、200ng／mlのPMA（シグマ（Sigma））で処理し、48時間、37℃にてインキ
ュベートした。 次いで、細胞に２μg／mlのLPS（シグマ）を与え、37℃にて24
時間インキュベートした。 次いで、細胞および培地を、プロテアーゼ阻害剤（
ペプスタチン、ロイペプチンおよびアプロチニン、シグマ）の存在下で回収した
。 回収後、細胞をPLB溶解緩衝液（プロメガ（Promega）中で溶解させた。 培
地を遠心にて処理し、細胞残骸物を除去し、セントリプレップ（アミコン（Amic
on））を用いて20倍濃縮した。

【０３８３】 組換え体IL-1Hy1もまた、以下のように産生した。 プラスミドpYZ5829（T7プ
ロモーター）を、IL-1Hy1 cDNAをNdeIおよびBamHIで消化し、得られた断片をNde
I-BamHI消化pRSET Bベクター（インビトロジェン（Invitrogen）中にクローニン
グすることで構築した。 この構造物は、配列番号：４の5’メチオニンコドン
を含んでいる。 大腸菌（E.coli）BL21plysE（インビトロジェン）細胞にこの
ベクターを形質導入し、２Ｌフラスコ中で培養した（１リットル培養あたり約２
ｇの湿性細胞ペーストの産生量）。 細胞を、Emulsiflexホモジナイザーを用い
て、10ml／ｇの湿性細胞ペーストの20mMリン酸ナトリウム、pH7.5中に分散させ
た。 ５Ｍの酢酸を加え、pHを4.8まで滴定し、これで大腸菌タンパク質を沈殿
させ、細胞上清を遠心した。 IL-1Hy1は、上清に残る。 ５Ｍの酢酸を上清に
加えてpH4.5まで滴定し、さらにタンパク質を沈殿させ、得られた懸濁液を再び
遠心した。 次いで、得られた上清を、pH4.5でSP-Sepharose陽イオン交換カラ
ム（ファルマシア（Pharmacia））にのせた。 IL-1Hy1を、０〜250mM NaCl直線
勾配（10×カラム用量）で溶出し、＞90％純粋名タンパク質を得た。 タンパク質含有画分をため、5M NaOHにてpH8.0まで滴定し、1M Trisを50mMまで
、硫酸アンモニウムを0.75Mまで加え、溜めた液をブチル−Sepharoseカラム（フ
ァルマシア）にのせた。 IL-1Hy1を、逆塩勾配（20カラム用量）で溶出した。
タンパク質を５〜10mg／mlまで濃縮し、Sephadex G25（ファルマシア）上で、pH
７での20mMリン酸ナトリウム緩衝液中の緩衝液交換にて脱塩した。 得られた溶
液を、Q-Sepharose（ファルマシア）陽イオン交換カラムにのせ、IL-1Hy1をフロ
ースルーにて回収した。 塩化ナトリウムを0.1Mまで加え、タンパク質溶液を25
mg／mlまで濃縮して、−70℃にて保存した。

【０３８４】 THP-1および上述した微生物産生組換え体IL-1Hy1タンパク質調製物を、SDS-PA
GEゲル上にのせ、ウエスタンブロッティングにてフィルター（Immobilon-P、ミ
リポア（Millipore）に転写した。 次いで、フィルターを、従来の方法（例え
ば、Harlow et al.,「抗体：研究室マニュアル（Antibodies：A Labopratory Ma
nual）」、Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY（1998）
を参照のこと）を用いてIL-1Hy1ペプチド、RLTQLPENGGWNAにてウサギを免役する
ことで調製したIL-1Hy1に特異的なポリクローナル抗IL-1Hy1抗体および免役した
ウサギからの対照前免疫血清でプローブ化した。

【０３８５】 IL-1Hy1は培地のみでは検出されなかった。 17kDaのバンドが、（5’開始メ
チオニンコドンから翻訳された）大腸菌から調製した組換え体IL-1Hy1タンパク
質をのせたレーンで検出された。 ２つのバンドがTHP-1細胞溶解物中で検出さ
れた。 約17kDaの分子量を示している組換え体微生物発現IL-1Hy1と同様の分子
量に相当する弱いバンドと、およそ15.5kDaの分子量を示している主要なバンド
である。 約15.5kDaのバンドの存在により、天然に存在するIL-1Hy1タンパク質
が、哺乳動物細胞内で処理される可能性があることが示唆される。 加えて、成
熟推定処理形態は、配列番号：４のヌクレオチド位置73（配列番号：５のアミノ
酸位置１に相当する）で開始されている開始メチオニンコドンより発現される17
kDa形態よりも有意に小さい。 〜15.5kDa IL-1Hy1が、約16kDaの予想分子量を
与える、配列番号：４のヌクレオチド部位103（配列番号：５のアミノ酸位置11
に相当する）にて開始している他の開始メチオニンコドンの産物である可能性が
ある。 また、〜15.5kDaのIL-1Hy1が、配列番号：５のアミノ酸位置13のアスパ
ラギン酸の後ろでタンパク質分解的に処理された産物である可能性もある。

【０３８６】 配列番号：５は、配列番号：４で同定されたオープンリーディングフレームに
相当する推定アミノ酸配列である。 本発明は、SDS-PAGEによって決定したよう
な、約16kDaかそれ以下の、好ましくは約15.5kDaの分子量を持っている配列番号
：５のポリペプチド断片（C-末端またはN-末端断片いずれか）を企図する。 本発明はまた、とりわけ、アミノ酸残基11または14いずれかの位置で開始された
配列番号：４のN-末端短片化断片、並びにそのようなN-末端短片化断片をコード
しているポリヌクレオチドを企図している。

【０３８７】 実施例17 活性化THP-1細胞でのIL-1 Hy1発現 THP-1細胞を、まさに実施例16にて上述したようにPMAおよびLPSにて活性化し
た。 細胞および培地を血清を含まない培地中でさらに24時間後に回収し、細胞
溶解物を上述のように調製した。 対照、非活性化THP-1細胞もまた、PMAまたは
LPSなしの培地中で同じ時間細胞を培養することで調製し、細胞溶解物を上述の
ように調製した。

【０３８８】 ウエスタンブロッティングによって、活性化THP-1細胞からの細胞溶解物中にI
L-1Hy1タンパク質が検出され、一方で非活性化細胞からの細胞溶解物中ではIL-1
Hy1はほんの少ししか検出されなかった。 これらの結果は、IL-1Hy1タンパク質
発現が、活性化THP-1細胞でアップレギュレートされることを示唆している。

【０３８９】 実施例18 免疫組織化学によるヒト組織中のIL-1Hy1タンパク質発現の検出 ３つの異なるヒト組織試料のスライド（慢性アレルギー状態を患っている患者
からの扁桃、皮膚およびアレルギー性鼻ポリープ）を、実施例16にて上述したよ
うに調製したウサギポリクローナル抗IL-1Hy1抗体にて染色した。 抗IL-1Hy1抗
体結合を、ビオチン化ヒツジ抗ウサギ二次抗体、続いてストレプトアビジン-HRP
検出にて検出した。 染色を視覚的に検出するために、スライドをクロモゲン3,
3’-ジアミノベンジジン（DAB；褐色染色）にて処理し、ヘマトキシリンによっ
て対比染色（青色核染色）した。 陰性対照を、同様の方法で、抗IL-1Hy1抗体
なしで染色した。

【０３９０】 さらに、二重標識染色を以下のように実施した（Myers,J.A.,Mehta,P.,Hunter
,A.W.,Berstein,S.A.,Erickson,P.A.「自動化二重標識：免疫組織化学（Automat
ed Double-Label：Immunohistochemistry）」、Journal of Surgical Pathology
,1：105-113（1995）、Myers,J.A.,D'Andrea,M.R.,Hunter,A.W.,Mehta,P.,Berst
ein,S.A.,Erickson,P.A.、「自動化二重標識：in situハイブリッド形成および
免疫組織化学（Automated Doule-Label：In Situ Hybridization and Immunohis
tochemistry）」、Journal of Surgical Pathology,1：191-201（1995）を参照
のこと）。 抗IL-1Hy1一次抗体染色を、急速赤色をクロモゲンとして使用した
こと（赤色染色）を除いて、直上に記述したように実施した。 以下に記述した
（細胞表現型マーカーに特異的な）二次抗体をビオチン化二次抗体、続いてス
トレプトアビジン-HRPを用いて検出した。 DABをクロモゲンとして使用した（
褐色）。 スライドをヘマトキシリン（青色核染色）にて対比染色し、光学顕微
鏡上で視覚化した。

【０３９１】 結果は、IL-1Hy1タンパク質が皮膚上皮細胞の細胞質中に局在したことを示し
た。 扁桃において、いくつかの胚中心および上皮クリプス中の散乱細胞にて陽
性染色が存在した。 Ｔ細胞（CD45ROマーカー）、Ｂ細胞（CD20マーカー）、マ
クロファージ（CD68マーカー）、または単球、マクロファージおよびランゲルハ
ンス細胞（CD14マーカー）では染色がなかった。

【０３９２】 アレルギー性鼻ポリープの切片を、IL-1Hy1タンパク質とIgEに対する抗体で二
重標識染色し、抗IL-1Hy1と抗CD138にて二重標識染色した。 次いで、組織切片
を二次抗体およびストレプトアビジン−HRPと反応させ、クロモゲン3-アミノ-9-
エチルカルバゾール（AEC、赤色染色）で処理した。 アレルギー性鼻ポリープ
において、IL-1Hy1タンパク質がプラズマ細胞（CD138陽性）にて発現しており、
IgEには陰性である。 これらの結果は、IL-1Hy1が、アレルギー性鼻ポリープを
調節する役割を果たしていることを示唆している。 従って、IL-1Hy1またはそ
の活性のアンタゴニスト（たとえば抗体）が、アレルギー性鼻炎および喘息のよ
うなアレルギー性反応の処置に有用である可能性がある。 IL-1Hy1またはその
アンタゴニストの効果は、本明細書で記述され、または本技術分野で公知の任意
のアレルギー動物モデルで確認することができる。

【０３９３】 連続切片免疫染色をまた、正常鼻組織、慢性感染鼻ポリープ、アレルギー性鼻
ポリープ、正常肺、慢性感染による慢性気管支炎の患者からの肺組織を含むヒト
組織において実施した。 組織切片を、上記実施例16にて記述したように調製し
たウサギポリクローナル抗IL-1Hy1抗体と反応させた。 抗IL-1y1抗体の結合を
、ビオチン化ヒツジ抗ウサギ二次抗体、続いてストレプトアビジン- AP検出にて検出した。 染色を視覚的に検出するために、スライドをクロモゲン
（急速赤色）にて処理し、ヘマトキシリン（青色核染色）にて対比染色した。

【０３９４】 結果は、アレルギー性鼻ポリープおよび慢性感染鼻ポリープが、正常鼻ポリー
プよりも多くのIL-1Hy1タンパク質を発現している細胞を含んでいたことを示唆
している。 さらに、主要なIL-1Hy1発現タンパク質は、IgA産生プラズマ細胞で
ある。 処理した肺組織において、慢性気管支炎肺組織は、正常の肺組織に比べ
てより多いIL-1Hy1発現細胞を含んでいた。 IL-1Hy1発現細胞には、プラズマ細
胞、マクロファージおよび気管支上皮細胞が含まれ、発現はプラズマ細胞で最も
高かった。 これらの結果は、IL-1HY1発現細胞が、アレルギー性、感染、また
は炎症組織の部位にて漸増し、アレルギーおよび／または急性または慢性感染に
よる炎症を調節するのに役割を果たしていることを示唆している。

【０３９５】 さらなる実験を、これらの結果を検証するために実施した。 正常鼻組織、ア
レルギー性鼻ポリープ、慢性感染鼻ポリープ、正常肺および慢性感染肺を持つ患
者からの生検試料を上述のようにIL-1Hy1発現細胞（HLC）に関して試験した。
この研究において、アレルギー性鼻ポリープにおいて、正常鼻（両細胞集団に関
して、p＝0.074）および慢性感染鼻組織（HLCに関してp＝0.07、好塩基球に関し
てp＝0.08）においてよりも、IL-1Hy1発現細胞および好塩基球が多く存在した。

【０３９６】 また、好塩基球に対して差ははっきりしてはいないが、慢性肺組織において、
正常肺組織においてよりもIL-1Hy1発現細胞および好塩基球が多かった（HLCに関
してp＝0.128、好塩基球に関してp＝0.197）。 アレルギー性鼻ポリープおよび
慢性感染肺組織に関して、これらの結果は最初の実験で観察された結果と一致し
ていた。

【０３９７】 確率値（対の試料のスチューデントＴ検定に基づいたｐ値）は、範囲が0.07〜
1.97であるが、少ない試料数（ｎ＝３）のために有意な差ではない。 研究を広
げることで、より完全な統計学的差が得られるであろう。

【０３９８】 実施例19 DNAプローブを用いたIn situハイブリッド形成による ヒト組織でのIL-1Hy1タンパク質発現の検出 IL-1Hy1 mRNAを発現している組織および細胞型を決定するために、胎児肝臓-
脾臓cDNAライブラリーからのRTA00000273.c.07クローンの（完全なIL-1Hy1オー
プンリーディングフレームを含む）985ヌクレオチドEcoRIおよびHindIII断片を
、切片化ヒト組織のパネル上でプローブとして使用した。 このプローブは、取
り扱い説明書を用いて、ベーリンガ−マンハイム社（Boehringer-Mannheim）に
よって供給されたジゴキシゲニン標識化キットを用いて標識化した。 自動化in
situハイブリッド形成を、QualTek Molecular Labsにて実施した（Myers,et al
., J.Surg.Path.,1：191-203（1995）を参照のこと）。 すべての組織を、 10％中性緩衝化ホルマリンにて固定化し、パラフィン包埋し、4μm切片に切断し
た。

【０３９９】 皮膚、脳および扁桃内の細胞が、IL-1Hy1プローブに特異的にハイブリッド形
成した。 強いシグナルが、皮膚上皮の基底層で検出された。 扁桃内の散在性
細胞もまた強い強度のシグナルを産生した。 脳小脳組織は、白色物質中の動脈
を取り囲んで発見された浸潤していると推定される白血球中での発現の証拠を示
している。 同一固体からの小脳の異なる切片は、分子層中に局在する予想され
るグリア細胞の染色を示している。

【０４００】 実施例20 リボプローブを用いたin-situハイブリッド形成 によるヒト組織中のIL-1Hy1 mRNA発現の検出 以下のリボプローブの３つの組を、取り扱い説明書に従ってベーリンガーマン
ハイム社のジゴキシゲニン標識化キットを用いて標識した。

【０４０１】

【表４】

【０４０２】 ヒト正常扁桃の連続切片をDIG-標識化IL-1Hy1リボプローブ、および以下の細
胞表現型マーカータンパク質、CD20（B細胞）、K167（増殖細胞）、CD3（T細胞
）、CD1a（樹状およびランゲルハンス細胞）、CD14（単球、マクロファージおよ
びランゲルハンス細胞）、CD68（マクロファージ）、LN5（マクロファージ、マ
ントルゾーン細胞および組織球）および上皮膜抗原に対する抗体に曝露した。染
色は上述したように行った。

【０４０３】 IL-1 Hy1遺伝子は、（Ｂ細胞が活性化された領域中の）いくつかの胚中心、お
よび上皮窩中の散乱細胞で発現された。マクロファージまたは活性化Ｂ細胞の亜
集団に発現されているかどうかは明らかではなかった。

【０４０４】 実施例21 IL-1Hy1によるIL-13の誘導 IL-1 Hy1によるIL-13の産生に影響を与える能力を、以下のように試験した。
実験の１日前に、正常のヒト気管支上皮細胞（NHBE）（クロネティクス（Clonet
ics）、San Diego,CA）または正常ヒト小気道上皮細胞（SAEC）（クロネティク
ス）を、１mlの増殖培地（クロネティック）中に８×10⁴個の細胞／mlまいた。

【０４０５】 実験の日に、細胞をIL-1 Hy1（１μg／ml 最終濃度）またはIL-1β（１ng/ml
最終濃度）いずれかで刺激した。 ５％ CO₂中37℃での20時間のインキュベーシ
ョンの後、細胞上清を回収した。 細胞残骸物を遠心にて除去し、上清中のIL-1
3の量を、取り扱いプロトコールに従って、IL-13 ELISAキット（バイオソース・
インターナショナル（Biosource Internatinal））を用いることで定量した。

【０４０６】 結果は、IL-1βはNHBE細胞中でのみIL-13産生を誘導した一方で、IL-1 Hy1が
、試験した濃度で、試験した両方の細胞型でのIL-13産生を誘導できたことを示
唆した。 SAEC細胞において、IL-1 Hy1は、基準より110倍のIL-13産生を誘導し
、NHBE細胞においては、IL-1 Hy1は60倍のIL-13産生を誘導した。 NHBE細胞に
おいて、IL-1βは、基準より同じ60倍までIL-13を誘導した。 これらの結果は
、上述したIL-6およびPGE₂アッセイでの先の結果をも併せて考えると、IL-1β活
性におけるIL-1 Hy1の阻害効果が、IL-13産生の増加、続いてIL-1β合成の減少
と、間接的関係である可能性がある。

【０４０７】 実施例22 IL-1Hy1によるIL-18活性の阻害 以下の実験により、IFN-γの誘導によって測定したように、IL-1Hy1のIL-18活
性を阻害する能力を評価した。 ヒトリンパ球（PBMC）を健康なボランティアド
ナーからの末梢血のフィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）密度勾配分離に
よって入手した。 単離後すぐに、PBMCを、RPMI1640-10％胎児ウシ血清を含む
増殖培地で２回洗浄し、３×10⁵細胞／ウェルを96ウェルプレートに播いた。

【０４０８】 細胞を、抗CD3抗体（R&Dシステムズ、Minneapolis, MN）をすべての試料に最
終濃度0.5μg／mlで加えることで刺激した。 刺激の時点で、ウェルをまた５％
CO₂、37℃にて36時間、100ng/mlヒト組換え体IL-18（R&Dシステムズ）で処理し
た。 それぞれのプレート上のウェルの部分（３重）を処理せず、刺激PBMC細胞
によって産生されたIFNの基礎濃度の基準として使用した。 IL-18処置は、PBMC
細胞を、基礎濃度と比べてIFN-γの産生を増加させる。

【０４０９】 IL-18刺激IFNγ産生のIL-1Hy1による阻害に関してアッセイするために、100×
〜1000×倍濃度のIL-1Hy1（IL-18濃度と比較して）を、刺激の時点でIL-18と共
にウェルに加えた。 細胞刺激の36時間後、増殖プレートを5分間4000rpmで遠心
し、細胞残骸物を除去した。 上清を取り扱いプロトコールに従って、Qantikin
e IFNγ ELISAキット（R&Dシステムズ）を用いてIFNγに関してアッセイした。

【０４１０】 結果は、IL-18のみがIFNγ産生を刺激すること、およびIL-1 Hy1が、用量依存
的にIL-18刺激を阻害し、完全阻害が500倍〜1000倍過剰IL-1Hy1にて観察された
ことを示唆している。 IL-1 Hy1が、IFNγ産生を減少させる機構を検定するた
めに、以下のアッセイを実施した。

【０４１１】 ヒトリンパ球（PBMC）を上述のようにして得て、洗浄し、播き、抗CD3にて刺
激し、最終濃度100ng／mlのIL-18（R&Dシステムズ）で処理した。 次いで、抗
IL-18受容体抗体、抗受容体アクセサリ−タンパク質ポリクローナル抗血清、抗I
L-1 I型受容体抗体および抗IL1 II型受容体抗体（すべてR&Dシステムズ、Minnea
polis,MN）を含むいくつかのブロッキング抗体を使用してIFNγの阻害を試験し
た。 異なる量のそれぞれの抗体をIL-18と共にウェルに加え、細胞刺激の36時
間後に、培養プレートを5分間4000rpmで遠心し、細胞残骸物を除去した。 上清を取扱説明書に従って、Qantikine IFNγ ELISAキット（R&Dシステムズ）を
用いてIFNγに関してアッセイした。

【０４１２】 抗体がない場合、IL-18は以上で観察されたように、基準レベルと比較して IFNγを刺激した。 しかしながら、抗IL-18受容体抗体、抗アクセサリータンパ
ク質抗体、およびII型ではなく、抗IL-1 I型受容体抗体がIL-18誘導IFNγ産生を
阻害した。

【０４１３】 これらの結果は、IL-1受容体の活性を拮抗する化合物が、IFNγ産生の誘導に
よって測定されるように、IL-18活性を阻害することを示唆している。

【０４１４】 実施例22 インタ-ロイキン1受容体へのIL-1Hy1の結合 細胞結合アッセイを実施し、本発明のIL-1Hy1がインタ-ロイキン1（IL-1）受
容体に結合するかどうかを決定した。 簡単には、蛍光活性化細胞ソーティング
（FACS）を使用して、IL-1Hy1組換え体タンパク質中の発現タグに対して特異的
である蛍光抗体を用いて、100倍多い量の非標識化IL-1受容体アンタゴニスト（I
L-1 RA）リガンドの存在下、または非存在下で、組換え体タンパク質（実施例12
を参照のこと）の結合を測定した。 それぞれの反応で、10⁶個の正常ヒト皮膚
繊維芽細胞（NHDF）を、100μlの（滅菌PBS、3％ウシ血清および0.01％アザイド
含有）FACS緩衝液中に懸濁させた。 細胞結合反応液は、100μl細胞懸濁液中５
nMの組換え体IL-1Hy1を含み、１つの反応の結合競合には500nMの組換え体IL-1 R
Aが含まれた。 細胞を氷上で１時間インキュベートした。 細胞を遠心してペ
レット状にし、200μlの0.2mM BS3（架橋剤）を加え、細胞を30分間氷上に維持
した。 次に、10μlの１M Tris pH7.5を加え、細胞を15分間氷上でインキュベ
ートした。 細胞を遠心してペレット状にし、FACS緩衝液にて１回洗浄し、100
μl容量のFACS緩衝液中に再懸濁させ、２μlの一次抗体（抗発現タグ抗体１mg／
ml）を加え、インキュベーションを氷上でさらに30分間続けた。 細胞を遠心してペレット状にし、FACS緩衝液にて洗浄し、FACS緩衝液（10μl容
量）中に再懸濁した。 二次抗体（フィコエリスリン共役）、２μlの抗マウスI
g（１mg／m）を加え、細胞を30分間氷上でインキュベートした。 細胞を再び遠
心にてペレットにし、FACS緩衝液にて２回洗浄し、0.5mlのFACS緩衝液中に再懸
濁させ、FACS中で解析した。

【０４１５】 蛍光の移動が、組換え体タグ化IL-1 Hy1で処理した細胞に関して観察された。
結合が非タグ化IL-1 RAタンパク質の存在下で減少したので、この結合は特異的
であった。 これらの結果は、本発明のIL-1Hy1タンパク質のIL-1受容体への結
合を示唆している。

【０４１６】 実施例23 皮膚繊維芽細胞中のIL-1 Hy1の発現 ウエスタンブロット解析を、ヒト皮膚繊維芽細胞中のIL-1 Hy1ポリペプチド発
現を検出するために実施した。 正常ヒト包皮繊維芽細胞（ATCC番号 CCD1098）
をPLB溶解緩衝液にて溶解し、溶解物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し
、溶解させたタンパク質を実施例16で記述したようにフィルターへ移した。 フィルターを、実施例16で記述したように調製したIL-1 Hy1に特異的なポリクロ
ーナル抗IL-1 Hy1抗体でプローブ化した。

【０４１７】 結果は、IL-1 Hy1ポリペプチドがヒト包皮繊維芽細胞で検出可能であることを
示唆した。

【０４１８】 実施例24 IL-1 Hy1によるICAM-1発現の誘導 気道炎症は、好中球の局所流入によって特徴づけられ、ICAM-1のような接着分
子の発現を増加させる。 IL-1 Hy1が、気道炎症で役割を果たすかどうかを決定
するために、ICAM-1発現小気道上皮細胞におけるIL-1 Hy1の効果を、Tosi et al.（Am.J.Resip.Cell.Mol.Biol.,7：214-221,1992）に記載の方法に従って
試験した。

【０４１９】 小気道上皮細胞（SAEC）を、クロネティクス（Clonetics、San Diego、CA）よ
り得、取扱説明書に従ってSAGM培地（クロネティクス）中に保持した。 SAEC細
胞を３×10⁵細胞／60mmプレコートディッシュに播いた。 60mmディッシュは、1
0μg／mlのフィブロネクチン（シグマ（Sigma、St.Louis,MO））、30μg／mlの
コラーゲン（Vitogen 100、Cohesion、Palo Alto、CAとして公知である）、およ
び10μg／mlウシ血清アルブミン（シグマ）の混合液でプレコートした。

【０４２０】 播いて24時間後、細胞を増殖培地で１回洗浄し、次いで、１ng/mlでのIL-1β
および／または10倍、100倍、1000倍などの濃度でのIL-1Hy1で24時間処理した（
すなわち刺激した）。 IL-1βおよびIL-1Hy1を指示に従い個別に、または同時
に加えた。 24時間のインキュベーションの後、細胞をPBSで洗浄し、0.5％トリ
プシンで処理し、0.1mlのFACS緩衝液（３％胎児ウシ血清／0.01％アジド／PBS）
中に再懸濁させた。 次いで、細胞を、R-フィコエリフィリン（PE）（ファルミ
ンゲン（Pharmingen））と共役した抗ICAM-1抗体とともに30分間インキュベート
した。[PEとは何?] 続いて、（実施例13に記載したように）細胞を洗浄し、蛍
光活性化細胞ソーター上での解析のために25mlのFACS緩衝液に再懸濁した。 FA
CS解析により、IL-1βでの処理が、130％発現までICAM-1を増加させたこと、お
よびIL-1Hy1がさらにICAM-1発現させるためにIL-1βと相乗作用したことが示唆
された。 IL-1βと同様の10倍過剰量のIL-1 Hy1の存在は、IL-1β刺激のみと比
較して、30〜40％までICAM-1発現の発現を増加させた。 しかしながら、IL-1Hy
1のみでの刺激がICAM-1発現上で可変効果を有していた。

【０４２１】 実施例25 IL-1 Hy1マウスゲノミック配列の決定 マウスIL-1 Hy1遺伝子を含むBACクローンを、ヒトIL-1 Hy1 cDNAクローンを用
いたサザーンハイブリダイゼーションによって単離した。 IL-1 Hy1マウスゲノ
ミック配列は、BACクローンを常法によって配列決定して得、それを配列番号：3
1として記載した。 推定のマウスIL-1 Hy1 cDNA配列は、465個のヌクレオチド
（配列番号：32）の配列であり、155個のアミノ酸のポリペプチドをコードする
。 推定アミノ酸を、配列番号：33として記載した。 マウスとヒトの IL-1 Hy1アミノ酸配列を比較したところ、91％の相同性が認められた。

【０４２２】 実施例26 IL-1 Hy1を用いた動物研究 Ａ．耐性および毒性研究 IL-1 Hy1ポリペプチドの最大耐性用量（MTD）および急性毒性を、マウスで決
定した。 組換え体ヒトIL-1 Hy1を、大腸菌に発現させ、上述のように均質にな
るまで精製した。 精製したIL-1 Hy1の濃度は24.4mg／mlであり、それぞれの用
量を、100mMの塩化ナトリウムおよび20mMのリン酸ナトリウムpH7.0の0.2ml容量
中で投与した。

【０４２３】 MTD研究に関して、およそ30gの体重の3匹のアウトブレッドマウス（CDI）に、
尾静脈を介したIL-1 Hy1処方初期静脈投与（150mg／kg）を与えた。 これらの
マウスを数時間、および翌朝再び観察したが、臨床兆候は認められなかった。

【０４２４】 急性毒性研究に関して、約30ｇの体重の６匹のアウトブレッドマウス４群それ
ぞれに、尾静脈を介してIL-1 Hy1の単一静脈用量を与えた。 それぞれの群に異
なる用量のIL-1 Hy1（賦形剤のみ、3.75mg／kg、37.5mg／kg、150mg／kg）を与
え、数日間にわたって１日中観察した。 マウスには、異常な臨床兆候は認めら
れなかった。 ７日目に、マウスを安楽死させ、大まかな検死では、なんの異常
な発見もなかった。 これらの結果は、IL-1 Hy1が、150mg／kgの用量では、マ
ウスにおいて耐性に富んでいることを示唆している。

【０４２５】 Ｂ．IL-1βによって刺激された血清コルチコステロン濃度 におけるIL-1 Hy1ポリペプチドの効果 マウスでのIL-1β刺激コルチコステロン濃度におけるIL-1 Hy1の効果を、in
vivoでのIL-1 Hy1活性を測定することで調査した。 ３匹のマウスの群それぞれ
に、組換え体IL-1 Hy1ポリペプチドまたは賦形剤のみの単一静脈内投与（500μg
／マウス）を与えた。 初期注射の30分後、各マウスに、IL-1β（250ng／マウ
ス、R&D システムズ）または賦形剤のみを皮下に与えた。 すべてのマウスを
皮下注射して３時間後に殺した。 コルチコステロンの血清濃度を、取り扱いプ
ロトコールに従って、RIAキット（ICNバイオケミカルズ（Biochemicals）を用い
て測定した。 方法は、Carter et al.（Nature 344：63-637）で記述されてい
る。

【０４２６】 賦形剤のみを注射したマウスは、コルチコステロン血清濃度の増加を示さず、
基準濃度が220.33ng／mlであることを決定した。 IL-1βの注入は、血清コルチ
コステロン濃度を615.06ng／mlまで上昇させた。 しかしながら、IL-1β処理の
前のIL-1 Hy1は、IL-1β刺激コルチコステロン濃度を459.22ng／mlまで減少させ
た。 これらの結果は、IL-1 Hy1ポリペプチドが、in vivoでのIL-1β誘導活性
を阻害すること、およびIL-1 Hy1のin vivo機能の少なくとも1つがIL-1を拮抗す
ることであることを示唆している。

【０４２７】 以上例示した実施態様は、本発明の一つの特徴を例示することを意図してなさ
れたものに過ぎず、機能的に同等の組成物および方法が、本発明の範囲に入るべ
きものであり、その開示によって本発明の範囲を限定的に解釈されるべきではな
い。 実際、本発明を実施するに当たって、数多くの修飾および変更をなすこと
が、本発明の好ましい実施態様を考慮すれば当業者に想起されるはずである。
従って、本発明の範囲の限定は、特許請求の範囲においてなされる限定のみによ
ってなされるべきである。 本明細書に引用した文献はすべて、引用することに
よりその全体を本明細書に組入れることとする。

【０４２８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 配列番号：３の配列と、ヒト（配列番号：30）、マウス（配列番
号：９）、ラット（配列番号：10）およびウサギインターロイキン-1 レセプタ
ーアンタゴニスト（配列番号：11）との配列アラインメントである。 Ａはアラ
ニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイ
ン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉは
イソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラ
ニン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙは
チロシン、Ｖはバリン、Ｘはこれら20個のアミノ酸のいずれかである。 ギャッ
プは、ダッシュとして表している。 ４配列すべてについてアミノ酸の番号を、
順に付けていった。

【図２】 b²HFLS20W cDNAライブラリーから、標準PCR法、ハイブリダイゼ
ーションシグネーチャー分析による配列決定、および単流ゲル配列決定技術を用
いて得られた核酸配列を示す。 これらの配列は、配列番号：１および２として
いる。 Ａはアデノシン、Ｃはシトシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン、そし
てＮはこれら４塩基のいずれかである。

【図３】 配列番号：２のヌクレオチド１〜240に対応するアミノ酸配列を
示す。 これらの配列は、配列番号：３としている。 Ａはアラニン、Ｒはアル
ギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｅはグルタ
ミン酸、Ｑはグルタミン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、
Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロ
リン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、Ｖは
バリン、Ｘはこれら20個のアミノ酸のいずれかである。

【図４】 配列番号：３の同種領域（配列番号：３の13〜30位のアミノ酸）
と、ヒトインターロイキン-1βのレセプター結合領域（配列番号：12）およびヒ
トインターロイキン-1 レセプターアンタゴニスト（配列番号：13）との配列ア
ラインメントである。 ３つのドメインすべてにおいて保存されていた残基を、
太字で記した。

【図５】 配列番号：４に記載の核酸配列（配列番号：４の297〜1282位の
ヌクレオチドは、配列番号：２に対応する）が示されており、これは実施例６に
記載されている。 最初の11個の核酸は、ベクター配列に対応する。

【図６】 配列番号：４（配列番号：５の76〜155位のアミノ酸は、配列番
号：３に対応する）によってコードされたアミノ酸配列が示されている。 この
アミノ酸配列は、配列番号：５として記載され、また実施例６に記載されている
。

【図７】 配列番号：５（配列番号：５の１〜155位のアミノ酸）とヒトIL-
1 Ra（配列番号：14；"HUMIL1RASIC"と明記した）の細胞質形とのアミノ酸アラ
インメントを提示する。 これら二つの配列間の相同性については、実施例６に
記載されている。

【図８】 配列番号：４に対応する核酸配列の伸長部分（下線を付した配列
）である配列番号：６が示されており、これは実施例７に記載されている。

【図９】 Ａ〜Ｃは、配列番号：１、２および46に対応するゲノミック配列
を示している。 この配列をもたらすゲノミッククローン（配列番号：７）の単
離は、実施例８に記載されている。 Ａはアデノシン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ノシン、Ｔはチミジンである。 不明瞭な箇所については、次のように記載した
。 ＲはＡまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＷはＡまたはＴ、ＹはＣまたはＴ、Ｓは
ＣまたはＧ、ＫはＧまたはＴ、ＶはＡまたはＣまたはＧ、ＨはＡまたはＣまたは
Ｔ、ＤはＡまたはＧまたはＴ、ＢはＣまたはＧまたはＴ、およびＮはこれら４塩
基のいずれかである。

【図１０】 Ａ〜Ｃは、図９Ａ〜Ｃに記載のゲノミック配列（配列番号：７
）の伸長部分であるゲノミッククローン（配列番号：８）を示している。 配列
番号：８は、配列番号：６に記載のインターロイキン-1 レセプターアンタゴニ
スト伸長部分のための、配列番号：６に記載の伸長配列を含んでいる。 この配
列をもたらすゲノミッククローン（配列番号：７）の単離は、実施例11に記載さ
れている。 Ａはアデノシン、Ｃはシトシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジンで
ある。 不明瞭な箇所については、次のように記載した。 ＲはＡまたはＧ、Ｍ
はＡまたはＣ、ＷはＡまたはＴ、ＹはＣまたはＴ、ＳはＣまたはＧ、ＫはＧまた
はＴ、ＶはＡまたはＣまたはＧ、ＨはＡまたはＣまたはＴ、ＤはＡまたはＧまた
はＴ、ＢはＣまたはＧまたはＴ、およびＮはこれら４塩基のいずれかである。

【図１１】 IL-1β誘発によるPGE₂産生を阻害するIL-1 Hy1の用量依存性を
示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/18 Ａ６１Ｐ 15/06 ４Ｃ０８４ 3/10 19/02 ４Ｃ０８５ 11/00 29/00 ４Ｈ０４５ 15/06 １０１ 19/02 31/00 29/00 35/00 １０１ 35/02 31/00 37/06 35/00 37/08 35/02 39/02 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 39/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/58 Ｚ 33/53 37/00 １０２ Ｃ１２Ｒ 1:19 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 5/00 Ａ 37/00 １０２ Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 49/02 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０９／４５７，６２６ (32)優先日 平成11年12月８日(1999．12．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５２３，５５２ (32)優先日 平成12年３月10日(2000．3．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５７６，００８ (32)優先日 平成12年５月22日(2000．5．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CA25 CA26 CB01 CB03 CB08 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 AA12 BA80 CA04 CA09 DA06 EA04 GA11 HA01 HA14 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ20 QQ52 QR32 QR40 QR56 QR60 QR75 QR82 QS24 QS25 QS28 QS34 QX07 4B064 AG01 AG27 AG31 CA02 CA19 CC24 DA01 DA05 DA07 DA08 DA13 DA14 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA20 BA21 BA22 CA17 CA18 CA23 CA53 DA13 DA59 NA14 ZA59 ZA66 ZA81 ZA96 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB31 ZB35 ZC35 ZC37 ZC42 4C085 HH03 HH13 KA26 KA27 KA29 KA36 LL18 LL20 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA22 EA28 EA50 EA51 EA52 FA72 FA74

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチド、すなわち； (a) 配列番号：１のヌクレオチド配列； (b) 配列番号：２のヌクレオチド配列； (c) 配列番号：４のヌクレオチド配列； (d) 配列番号：６のヌクレオチド配列； (e) 配列番号：７のヌクレオチド配列； (f) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされたアミノ酸配列を
   含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； (g) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートの全長タンパク質コード配列を含むヌ
   クレオチド配列； (h) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートの成熟タンパク質コード配列を含むヌ
   クレオチド配列； (i) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートのヌクレオチド配列； (j) 配列番号：３または５の全長タンパク質配列をコードするヌクレオチド配列
   ； (k) 配列番号：３または５の成熟タンパク質配列をコードするヌクレオチド配列
   ；または、 (l) 配列番号：３または５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌク
   レオチド配列、を含む単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、請求
   項１に記載のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、単離されたポリ
   ヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体を含む、単離さ
   れたポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクタ
   ー。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベ
   クター。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝操作さ
   れた宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝操作さ
   れた宿主細胞であって、該宿主細胞において該ポリヌクレオチドの発現を制御す
   る調節配列と作動可能な関係に操作された宿主細胞。
8. 【請求項８】 単離されたポリペプチド、すなわち； (a) 配列番号：３または５のアミノ酸配列； (b) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされたアミノ酸配列；
   (c) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされた全長タンパク質
   を含むアミノ酸配列；または (d) クローンpIL-1Hy273のcDNAインサートによってコードされた成熟タンパク質
   を含むポリペプチド、を含む単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載のポリペプチドに対する抗体。
11. 【請求項１１】 試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出するた
    めの方法であって、以下の工程、すなわち、 (a) 試料を、該ポリヌクレオチドと結合して複合体を形成する化合物に、複合体
    を形成するのに充分な期間接触させ、および、 (b) 該複合体を検出する、工程を含み、複合体が検出されれば、請求項１に記載
    のポリヌクレオチドが検出される方法。
12. 【請求項１２】 試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出するた
    めの方法であって、以下の工程、すなわち、 (a) 試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、当該条件下
    で請求項１に記載のポリヌクレオチドとアニールする核酸プライマーに接触させ
    、および (b) 請求項１に記載のポリヌクレオチドを増幅する、工程を含み、ポリヌクレオ
    チドが増幅されれば、請求項１に記載のポリヌクレオチドが検出される方法。
13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチドが、請求項８に記載のポリペプチド
    をコードするRNA分子であり、そして、前記方法が、アニールしたRNA分子をcDNA
    ポリヌクレオチドに逆転写する工程をさらに含む請求項12に記載の方法。
14. 【請求項１４】 試料中の請求項８に記載のポリペプチドを検出するための
    方法であって、以下の工程、すなわち、 (a) 試料を、前記ポリペプチドと結合して複合体を形成する化合物に、複合体を
    形成するのに充分な期間接触させ、および (b) 前記複合体を検出する、工程を含み、複合体が検出されれば、請求項８に記
    載のポリペプチドが検出される方法。
15. 【請求項１５】 請求項８に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定す
    るための方法であって、以下の工程、すなわち、 (a) 化合物を、請求項８に記載のポリペプチドに、ポリペプチド／化合物複合体
    を形成するのに充分な期間接触させ、および (b) 前記複合体を検出する、工程を含み、ポリペプチド／化合物複合体が検出さ
    れれば、請求項８に記載のポリペプチドと結合する化合物が同定される方法。
16. 【請求項１６】 請求項８に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定す
    るための方法であって、以下の工程、すなわち、 (a) 細胞において、化合物を請求項８に記載のポリペプチドに、ポリペプチド／
    化合物複合体を形成するのに充分な時間接触させ、その複合体は細胞においてレ
    ポーター遺伝子配列の発現を駆動するものであり、および (b) レポーター遺伝子配列発現を検出することにより複合体を検出する、 工程を含み、ポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、請求項８に記載の
    ポリペプチドと結合する化合物が同定される方法。
17. 【請求項１７】 請求項８に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
    以下の工程、すなわち、 (a) 請求項７に記載の宿主細胞を、該細胞内に含まれるポリペプチドを発現させ
    るのに充分な期間培養し、および (b) 工程１の細胞からペプチドを単離する、工程を含む方法。
18. 【請求項１８】 インターロイキン-1 レセプターに結合することができる
    請求項８に記載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 インターロイキン-1 レセプターのアンタゴニストである
    請求項８に記載のポリペプチド。
20. 【請求項２０】 インターロイキン-1 レセプターの生物学的活性をモジュ
    レートする方法であって、該レセプターと請求項８に記載のポリペプチドとを接
    触する、工程を含む方法。
21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドが、放射性標識で標識付けされる請求項
    ８に記載のポリペプチド。
22. 【請求項２２】 前記ポリペプチドが、呈色標識に結合される請求項８に記
    載のポリペプチド。
23. 【請求項２３】 インターロイキン-1 レセプターを標識付けする方法であ
    って、請求項21に記載の標識付けしたポリペプチドと接触せしめる、工程を含む
    方法。
24. 【請求項２４】 前記方法が、in vitroで行われる請求項23に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記方法が、in vivoで行われる請求項24に記載の方法。
26. 【請求項２６】 請求項８に記載のポリペプチドを含むキット。
27. 【請求項２７】 配列番号：５に記載のアミノ酸配列のポリペプチド断片を
    コードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記断片が、SDS-PAGEによっ
    て決定された約16kDaまたはそれ以下の分子質量を有するポリヌクレオチド。
28. 【請求項２８】 前記ポリペプチド断片の分子質量が、約15.5kDaである請
    求項27に記載の単離されたポリヌクレオチド。
29. 【請求項２９】 配列番号：５に記載のアミノ酸配列の単離されたポリペプ
    チド断片であって、前記ポリペプチド断片が、SDS-PAGEによって決定された約16
    kDaまたはそれ以下の分子質量を有するポリペプチド断片。
30. 【請求項３０】 前記ポリペプチド断片の分子質量が、約15.5kDaである請
    求項29に記載の単離されたポリペプチド。
31. 【請求項３１】 異種ポリペプチドに融合した請求項28または29に記載のポ
    リペプチド断片を含む融合タンパク質。
32. 【請求項３２】 請求項31に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレ
    オチド。
33. 【請求項３３】 配列番号：１、２、４、６または７の少なくとも一つに記
    載の配列情報またはその断片の配列情報を含む、ポリヌクレオチドのコレクショ
    ン。
34. 【請求項３４】 前記コレクションが、核酸アレイに関して提供される請求
    項33に記載のコレクション。
35. 【請求項３５】 前記コレクションが、コンピューターで読取可能なフォー
    マットで提供される請求項33に記載のコレクション。
36. 【請求項３６】 IL-1のレベル増大が関与する癌の治療方法であって、その
    治療を必要とする患者に、前記癌の症状を改善するに効果的な量のIL-1 Hy1を投
    与する、工程を含むIL-1のレベル増大が関与する癌の治療方法。
37. 【請求項３７】 前記癌が、胸腺癌、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、骨の巨大細
    胞腫瘍、急性骨髄性白血病、口腔表皮性癌および扁平上皮細胞癌からなるグルー
    プから選択される請求項36に記載の方法。
38. 【請求項３８】 炎症の治療方法であって、その治療を必要とする患者に、
    前記炎症の症状を改善するに効果的な量のIL-1 Hy1を投与する、工程を含む炎症
    の治療方法。
39. 【請求項３９】 前記炎症が、感染によるものである請求項38に記載の方法
    。
40. 【請求項４０】 前記炎症が、アレルギー反応によるものである請求項38に
    記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記炎症が、慢性気管支炎に関連するものである請求項38
    に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記炎症が、関節炎に関連するものである請求項38に記載
    の方法。
43. 【請求項４３】 前記炎症が、糖尿病に関連するものである請求項38に記載
    の方法。
44. 【請求項４４】 前記炎症が、内毒素血症に関連するものである請求項38に
    記載の方法。
45. 【請求項４５】 IL-18によって媒介された炎症疾患状態の治療方法であっ
    て、その治療を必要とする者に、IL-18活性を阻害するに効果的な量の請求項８
    に記載のIL-1 Hy1またはその活性変異体を投与する、ことを含む治療方法。