JP2003502372A - 創傷治癒および光傷害の防止におけるニトロキシドの使用 - Google Patents

創傷治癒および光傷害の防止におけるニトロキシドの使用

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Abstract

(57)【要約】 ニトロキシド含有化合物を局所適用することにより、光老化およびその他のタイプの太陽光傷害を防止する方法ならびに創傷治癒を促進させる方法を提供する。光老化およびその他のタイプの太陽光傷害を防止するためならびに創傷治癒を促進させるための、ニトロキシド含有化合物を含有する医薬組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
太陽に対する露出からもたらされる紫外線照射のヒト皮膚における作用が、今
日の長寿人工にとって進展している関心事である。老化に伴う外観に関連する変
化の大部分が長年の太陽による傷害からもたらされる(Warren等、J. Am. Acad.
Dermatol., 1991年25: 751〜760; Frances, C.およびRobert, L., Int. J. Derm
atol., 1984, 23: 166〜179)。表面真皮の劇的な変化は光老化に共通の深い皺や
弛緩を伴う。光老化後の皮膚の主要な組織病理学的変化は、日常的な組織病理学
的試験においてエラスチンのシミ形成特性を有する物質の蓄積であり、したがっ
て、ソーラーエラストシス（弾力線維症）と呼ばれる。免疫組織化学的なシミ形
成は、エラスチン(Chen等、J. Invest. Dermatol., 1986年, 87: 334〜337; Mer
a等、Br. J. Dermatol., 1987年, 117: 21〜27)、フィブリルリン(Chen等、J. I
nvest. Dermatol., 1986年, 87: 334〜337; Dahlback等、J. Invest. Dermatol.
, 1990, 94: 284〜291; Bernstein等、J. Invest. Dermatol., 1994, 103: 182
〜186) およびバーシカン[正常な弾性線維成分(Zimmerman等、J. Cell. Biol.,
1994年, 124: 817〜825)]から構成されるソーラーエラストシスを含む貧弱にし
か形成されない線維を示した。エラスチン、フィブリルリンおよびバーシカンの
mRNAの同等の増加が、同じ個体からの正常皮膚から誘導される線維芽細胞と比較
して、光による傷害皮膚から誘導される線維芽細胞中で示された(Bernstein等、
J. Invest. Dermatol., 1994, 103: 182〜186)。太陽による傷害皮膚中のエラス
チンmRNAレベルの上昇は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(c
hloramphenicol acetyltransferase: CAT)レポーター遺伝子に結合されたヒトエ
ラスチンプロモーターから構成されるDNA構成をもつ線維芽細胞の一過性トラン
スフェクションにより示されているように、エラスチンプロモーター活性の上昇
をもたらす((Bernstein等、J. Invest. Dermatol., 1994, 103: 182〜186)。
【０００２】 紫外線照射に対して皮膚を露出した後に遊離基を発生することは当業界に周知
である。遊離基作用は、紫外線照射に対する露出からもたらされる赤化および紅
斑の原因であることが示されている。多くの抗酸化剤が光保護剤として試験され
てきたが、これらの薬剤の保護を与える能力が一様でないことをこれらの検討か
らもたらされた結果は示している。
【０００３】 Miyachi Y., J. Dermatol. Sci. 1995, 9:75-86は、光酸化の見地から光老化
について総説を与え、光老化の調節剤として抗酸化剤の使用を示唆する。具体的
には、スーパーオキシドジスムターゼ(superoxide dismutase: SOD)を用いた検
討を記載する。しかし、日焼け止め剤が紫外線照射からより良い保護を与えたと
結論された。
【０００４】 Bissett等のPhotodermatol. Photoimmunol. Photomed. 1990, 7:56-62は、紫
外線Ｂ(ultraviolet B: UVB)照射前にα−トコフェロール、アスコルビン酸、没
食子酸プロピルおよびTroloxのようなスーパーオキシド−捕獲性抗酸化剤の溶液
で局所処理したマウスが未処理マウスよりも傷害が顕著に少なかったことを示し
た。しかし、グルタチオン、β−カロチン、BHT、マンニトール、ジビニルグリ
コール、パンテティン、尿素およびヒスチジンを含む試験した追加の抗酸化剤ま
たはラジカル捕獲剤はUVB照射に対して有意な保護を与えなかった。さらに、こ
れらの検討では、UVA照射誘導マウス皮膚傷害の重篤度がこれらの抗酸化剤の局
所適用により軽減しなかった。したがって、光老化の累積的作用を防止するため
に使用される現在のアプローチが不適切であることが明らかである。
【０００５】 歴史的に、照射腫瘍学(radiation oncology)の分野で一層の研究がなされてき
た。イオン性照射由来の傷害と紫外線誘導傷害の一部とは、遊離基酸素種の形成
が原因であることが示されてきた。スルフヒドリル化合物は確認された最初の照
射保護剤のうちの一種であった。それらの保護作用は、照射誘導遊離基を捕獲お
よび／または酸化された分子に対する等価物を減少させるそれらの能力によると
思われる。造血サイトカインも照射保護剤として研究されてきた。それらは照射
露出後の造血機能をより迅速に回復させることにより保護すると思われる。
【０００６】 最近、ニトロキシドと呼ばれる新規な種類の放射線保護剤が記載されてきた。
分類として、ニトロキシドは、その他の遊離基を含む種々の生物学的関連化合物
と反応する安定な遊離基成分である(Nilsson等、 J. Biol. Chem., 1989, 264:1
1131-11135)。数種のニトロキシド自身が遊離基、具体的にオキシラジカルと反
応したという観察により、放射線保護剤としてこれらの化合物の研究に導いた(S
aminu 等、 Free Radical Biol. Med., 1989, 6:141-148)。
【０００７】 Tempol [4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチル-ピペリジニルオキシ、遊離基]
は、隣接するメチル基の対称対により立体的に安定化されたn-オキシドをもつピ
ペリジニル-n-オキシルである。この化合物はAldrich Chemical Co., Milwaukee
、WIより商業的に入手できる。それはNADPのようなスピンラベル生物学的分子に
最も一般的に使用される。
【０００８】 Tempolは、ハイポキサンチン／キサンチンオキシダーセーから発生したスーパ
ーオキシドからおよび過酸化水素媒介細胞毒性から哺乳類細胞を保護する、スー
パーオキシドジムスターゼ(SOD)類似体として機能することが示された(Mitchell
等、Biochem., 1990, 29:2802-2807; Samuni等、J. Biol. Chem., 1988, 263:17
921-17924)。Tempolは、イオン性照射に対してインビトロおよびインビボ保護の
双方を与えること(Mitchell等、Arch. Biochem. Biophys., 1991, 289:62-70)、
および強烈に照射された皮膚の領域の範囲内で毛髪の成長の回復を速めることに
より照射誘導脱毛症に対して保護すること(Goffman等、Int. J. Rad. Onc. Biol
. Phys., 1992, 22:803-806)も示された。この保護により、毛嚢幹細胞の直接保
護およびその他のニトロキシドの開発に結びつくことが示唆された。
【０００９】 米国特許第5,840,734号明細書は太陽光のUVAおよびUVB光線により起こる光老
化、日焼けおよび皮膚癌の防止におけるTempolの使用について記載する。 Tempol以外のニトロキシド含有化合物の局所適用が光老化、ならびに太陽光、
さらに具体的には紫外線照射に対する露出からもたらされる日焼けや皮膚癌のよ
うなその他の傷害を防止し得ることが今や信じられる。さらに、ニトロキシド含
有化合物の局所適用が、急性および慢性創傷の治癒を促進させるのに効果的であ
ることが信じられる。
【００１０】
【発明の概要】
本発明はニトロキシド含有化合物の新規な用途に関する。Tempol以外のニトロ
キシド含有化合物の局所適用が光老化、ならびに太陽光照射によりもたらされる
日焼けや皮膚癌のようなその他の傷害を防止し得ることが今や信じられる。さら
に、ニトロキシド含有化合物の局所適用が、急性および慢性創傷の治癒も促進さ
せることが信じられる。したがって、ニトロキシド含有化合物が、日焼け止め剤
としてばかりでなく創傷治癒にも有用であることが信じられる。こうして、本発
明は、日焼け止め剤としての用途および創傷治癒における用途のためのニトロキ
シド含有化合物を含む組成物にも関する。
【００１１】
【発明の詳細な記述】
ニトロキシドは、スーパオキシドジスムターゼに類似の抗酸化剤触媒活性を有
する安定な遊離基である。インビボで存在するニトロキシドは、その他の物質と
相互作用し、カタラーゼ類似活性も示す。したがって、ニトロキシド含有化合物
は当業界で多くの用途について記載されてきた。例えば、米国特許第5,462,946
号明細書は、イオン性照射、粘膜炎、全身照射の作用および照射誘導脱毛に対し
て皮膚を保護するのに使用するための金属独立ニトロキシド化合物(metal indep
endent nitroxide compound)の有効量を含有する生物学的適合性組成物を開示す
る。この態様では、ニトロキシド含有組成物を、軟膏、ローションもしくはクリ
ームとして局所的に、静脈的にまたはピルや口中錠による経口的に投与される。
この特許明細書は下記に述べる症状に対する防止剤として有用なニトロキシド含
有化合物も教示する。すなわち、成人肺性呼吸困難症の回避のために酸素露出を
増やすこと；乳児の酸素誘導水晶体退縮および硝子膜症；酸化的ストレス誘導白
内障；心筋梗塞および卒中のような心臓血管現象、膵臓炎、腸潰瘍ならびに臓器
移植の治療の際の再灌流傷害；動物細胞培養もしくは植物培養細胞における過剰
酸化が原因の細胞毒性；化学療法剤の細胞毒性作用；ならびに突然変異性薬剤お
よび癌性薬剤に対する防止剤である。この特許明細書は、関節炎症状に対する抗
炎症剤効果としてこれらの化合物の使用も教示する。この態様では、ニトロキシ
ド含有組成物は非経口的、関節内または経口摂取を通して投与される。この特許
明細書は、経口的にまたは非経口的に投与すると老化遅延剤として、そして経口
的にまたは静脈から投与すると体重減少にこれらの化合物を使用することも教示
する。
【００１２】 米国特許第5,824,781号、第5,840,701号および第5,817,632号各明細書は、生
理学的に適合できるマクロ分子と会合状態のニトロキシドの使用を基礎とする遊
離基毒性を軽減する組成物および方法を教示する。これらの組成物は、血液代替
物、放射線防護剤、造影剤、虚血および再灌流傷害、特に脳卒中に対する保護剤
として、そしてインビボ酵素類似体として有用であることが示唆されている。
【００１３】 ニトロキシド含有化合物を含有する組成物の局所適用が、光老化、日焼けおよ
び皮膚癌を含む光傷害に対する保護のみならず、創傷治癒の促進においても有用
であることが今や確信される。本発明の目的のため、「ニトロキシド(nitroxide
s)」または「ニトロキシド含有化合物」という用語は、安定なニトロキシド遊離
基を意味する。ニトロキシド含有化合物の例は当業界で周知であり、例えば、米
国特許第5,462,946号明細書のような先行文献に教示されている。光老化、日焼
けおよび皮膚癌を含む光傷害に対する保護のための組成物中のTempolの使用は、
特に上記の定義から除外される。
【００１４】 慢性的な太陽露出の結果として表在真皮に顕著な変化が起こる。主な変化は、
ソーラーエラストシスと称される大量の異常弾性物質の沈着である。ソーラーエ
ラストシスはエラスチンおよびフィブリリンmRNAおよびエラスチンプロモーター
活性の上昇に伴うことが示された。光傷害に対して保護するためのこれらの化合
物の能力を評価するために、レポーター遺伝子に結合されたヒトエラスチンプロ
モーターを含む種々のインビボおよびインビトロモデルが開発されてきた。
【００１５】 例えば、皮膚光老化をモデル化する、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼレポーター遺伝子(chloramphenicol acetyltransferase reporter ge
ne: CAT)に結合された5.2 kbヒトエラスチンプロモーターを発現するトランスジ
ェニックマウス系が開発された(Bernstein 等、 J. Invest. Dermatol., 1995,
105, 269-273)。フェノトタイプとして正常であるが、これらのマウスの細胞は
、エラスチンプロモーター活性が紫外線照射(UV)のような刺激に応答して測定さ
れることのできるヒトエラスチンプロモーター/CAT構成を有する。このモデルで
は、毛がまだ生えていない４〜５日齢マウス、および当該マウスから誘導された
細胞培養物は、皮膚光傷害を抑制できる化合物を確認する迅速で感度の高い手段
を与えることが示された(Bernstein等、 J. Invest. Dermatol., 1995, 105, 26
9-273; Bernstein等、 Photochem. Photobiol., 1996, 64:369-74; Bernstein等
、 J. Am. Acad. Dermatol., 1997, 37:725-729)。
【００１６】 マウスの皮膚の直接照射によるインビボおよびこれらのマウスから誘導された
細胞の照射によるインビトロの双方の紫外線照射に応答するヒトエラスチンプロ
モーター活性の研究をできるトランスジェニック無毛マウスモデルも開発された
。これらの実験のためにトランスジェニックマウスの生産に使用される無毛マウ
スはCrl:SKHl-hrBR系 (Charles River)のものが好ましい。この無毛マウス系は
よく特徴が分かっており、前臨床皮膚学的および光生物学的研究に日常的に使用
されているからである。これらのトランスジェニック無毛マウスは全長または部
分長のエラスチンプロモーターを発現することができる。「部分長のヒトエラス
チンプロモーター(truncated human elastin promoter)」という用語は、UVによ
り活性化され、全長5.2 kbヒトエラスチンプロモーターよりも短いヒトエラスチ
ンプロモーター、例えば、pEP62、 pEP35、 pEP10、 pEP27、およびpEP6 (Kahar
i等、J. Biol. Chem., 1990, 265(16):9485-9490) を意味する。好適な実施態様
では、部分長エラスチンプロモーターはpEP6である。全長または部分長プロモー
ターの活性を検出するのを容易にするためクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼレポーター遺伝子(CAT)のようなレポーター遺伝子に結合されたプ
ロモーターも好ましい。
【００１７】 これらのモデルは、組織特異的および発生調節様式でエラスチンプロモーター
活性を発現する。このモデルで紫外線の小さな増加の関数としてプロモーター活
性を検討でき、これは分析の感度を示す。さらに、紫外線照射の単回露出のみの
後で量的データを得ることができる。
【００１８】 したがって、米国特許第5,462,946号明細書に記載されているようなニトロキ
シド含有化合物を、皮膚に対するUVAおよびUVB傷害に対する保護を与えるそれら
の能力を実証するために、これらのトランスジェニックマウスに局所適用するこ
とができる。次いで、これらのトランスジェニックマウスを太陽光照射に露出す
る。最後の光処理２４時間後のCAT活性を示すために、これらのマウスを犠牲に
して殺し、皮膚を採取する。照射処理もニトロキシド処理も受けていない対照マ
ウスの基準線CAT活性を一つの値に標準化する。次に、基剤単独および基剤とニ
トロキシドとで処理したマウスのCAT活性の相対増加を決定する。エラスチンプ
ロモーター活性が皮膚老化の主要な事象であるので、これらのマウスはヒト光老
化のマウスモデルを表す。
【００１９】 別に、光傷害および／または酸化的傷害に対する保護に対するニトロキシド含
有化合物の能力を、エラスチンプロモーターで安定的にまたは短期的にトランス
フェクトされた細胞で立証することができる。一実施態様では、これらの細胞は
、全長または部分長ヒトエラスチンプロモーターを発現できるトランスジェニッ
クマウスから誘導される。あるいは、細胞は、不死化された細胞系(immortalize
d cell lines)から誘導してもよい。これらの実験では、これらの細胞をニトロ
キシド含有化合物を用いて処理をする。次いで、処理した細胞を太陽光シミュレ
ートであるUVBまたはUVA照射に露出し、細胞中のヒトエラスチンプロモーター活
性を決定する。エラスチンプロモーター活性を有意に上昇させるために、UVA露
出前に8-メトキシプソラレンの添加が、ある細胞培養実験で必要な場合がある。
【００２０】 次いで、露出に対して保護を与えるニトロキシド含有化合物の能力を示すため
に、得られた活性を、同じ線量の太陽光シミュレートUVBまたはUVA照射に露出し
たがニトロキシド含有化合物で処理していない対照細胞と比較する。
【００２１】 ヒポキサンチンやキサンチンオキシダーゼ系のような反応性酸素種を発生させ
る作用物質(means)をこれらの細胞培養物内に配合すると、酸化的傷害を保護す
るニトロキシド含有化合物の能力を実証する感度の高いシステムを提供する。こ
れらの実験では、反応性酸素種の発生作用物質を添加する前にニトロキシド含有
化合物を細胞培養物に加える。次いで、反応性酸素種発生作用物質を加え、選択
した一定の時間後、培養物内のヒトエラスチンプロモーター活性を決定する。ヒ
トエラスチンプロモーターの決定時間は慣例的な実験にしたがって選択すること
ができ、ここで、細胞とヒポキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼシステム
とインキュベートするための最適時間間隔を決定する。さらに具体的には、イン
キュベートのための最適時間間隔は、露出時間を増加させてヒポキサンチンおよ
びキサンチンオキシダーゼシステムに細胞を露出させ、２４時間インキュベート
を通して種々の時点でプロモーター活性を決定することにより決定される。最適
時間は、CAT活性がピークの時点として決定される。ニトロキシド含有化合物は
酸化的傷害に対して保護を与える。このような保護は、対照細胞と比較して、化
合物および反応性酸素種発生作用物質に露出された細胞中のエラスチン活性の減
少により分析で立証される。
【００２２】 ニトロキシド含有化合物を含む組成物の局所適用は創傷治癒にも有用であると
思われる。創傷治癒を促進させるニトロキシド含有化合物の能力は、Bernstein
等 J. Dermatologic Surgery and Oncology 1993, 19(6):564-570 ならびにBern
stein等、 J. Invest. Dermatol. 1991, 97:430-434に記載されているモルモッ
トモデルのようなよく確立された創傷治癒動物モデルで立証できる。これらの実
験では、ニトロキシド含有化合物を含有する組成物を、モルモットの被照射皮弁
創(skin flap wound)に局所適用できる。次いで、未処理動物と比較した、引っ
張り強さ（創破裂強度(wound bursting strength)とも呼ばれる）を増強させる
組成物の能力はおおよそ治癒の７日後に立証される。
【００２３】 したがって、ニトロキシド含有化合物を含有する組成物は、局所適用すると日
焼け止め剤としておよび創傷治癒促進に有用であることが期待される。局所適用
されるニトロキシド含有化合物を含有する組成物の例には、クリーム、ローショ
ンおよびスプレー等があるがこれらに限定されない。ニトロキシド含有化合物を
クリーム、ローションおよびスプレーに配合する方法、ならびにこのような配合
物のための医薬用添加剤は当業者に周知である。本開示により当業者に明らかな
ように、このような組成物は、二次的または追加の日焼け止め剤、ラジカル捕獲
剤、例えば、ビタミンＣおよびビタミンＥならびにそれらの類似体（これらに限
定されない）、抗炎症剤、または追加の創傷治癒剤をさらに含むことができる。
日焼け止め剤として使用するとき、太陽に露出する前に組成物を皮膚に適用する
のが好ましい。しかし、露出後にこれらの組成物を適用してもこの露出より皮膚
にもたらされる傷害を軽減させることができる。本発明のこれらの組成物は、太
陽に高過敏症の個体、例えば、ガン、乾癬およびその他の症状のためのソラレン
処置を受ける個体、皮膚癌、乾癬およびその他の症状のための光力学的療法を受
けている個体、色素性乾皮症、白皮症または低下した内因性メラニン色素からも
たらされるその他の症状のような遺伝子回復欠陥を患っている個体（これらの個
体に限定されない）を保護するのに特に有用である。創傷治癒に使用されるとき
、組成物を傷に直接適用するのが好ましい。
【００２４】
【実施例】
本発明をさらに説明するために下記の非限定的実施例を示す。 （実施例１）ヒトエラスチンプロモーターを発現するトランスジェニックマウ
ス CATレポーター遺伝子に結合した5.2ｋｂヒトエラスチンプロモーターを発現する
ホモ系トランスジェニックマウスを使用することができた。Hsu-Wong等、J. Bio
l. Chem., 1994年, 269: 18072〜18075。これらのマウスは、組織特異的および
発生調節方式でヒトエラスチンプロモーターを発現する。四〜五日齢時において
肉眼で見える毛の生長がまだないのでこの齢のマウスを使用しなければならなか
った。
【００２５】 あるいは、CATレポーター遺伝子に結合した全長5.2ｋｂヒトエラスチンプロモ
ーターまたはCATレポーター遺伝子に結合した部分長ヒトエラスチンプロモータ
ーpEP6 (Kahari等、J. Biol. Chem., 265(16):9485-9490, 1990)を発現するCrl:
SKHl-hrBR系 (Charles River)のホモ系無毛トランスジェニックマウスを使用で
きた。
【００２６】 （実施例２）太陽光線シミュレート照射 Schott WG 320 フィルター(Schott Glaswerke, Mainz, Germany) により濾過
したキセノンアークランプを含むMultiport Solar Simulator (Solar Light Com
pany, Philadelphia, PA) を太陽光線シミュレート照射(solar simulating radi
ation: SSR) をするために使用した。太陽光線シミュレーターの出力を3D UVメ
ーター(Solar Light Company)により測定し、ヒト最小紅斑線量 (minimal eryth
ema doses: MEDs)として表示した。ランプの発光スペクトルを地表に達する太陽
照射を密接にシミュレートした。太陽光線シミュレーターからの光線ガイドを、
マウスの背の表面に接触させた光中に置き、SSRが投与されている間束縛して移
動を防止した。未照射対照マウスもSSRを受けないように拘束した。
【００２７】 （実施例３）CAT分析 トランスジェニックマウスの皮膚中およびこれらの動物から樹立した細胞培養
物中のヒトエラスチンプロモーター／CATレポーター遺伝子構成の発現を測定す
るために、CAT活性を決定した。皮膚からCATを抽出するために、0.25Tis-HCl (p
H 7.5) 中で組織ホモゲナイザー (Brinkmann Instruments, Inc. Westbury, NY)
を使用して標本を均質化した。均質化物を15分間4℃で10,000 X g遠心分離し、
上澄み液中の蛋白質の濃度を市販蛋白質定量用キット (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA) により決定した。100μgの蛋白質を含有する上澄み液のアリコッ
トを、周知の手順に従う[14C]クロラムフェニコールを用いるインキュベートに
よりCAT活性の分析のために使用した。放射性クロラムフェニコールのアセチル
化および非アセチル化形態を薄層クロマトグラフィーにより分離し、CAT 活性を
各試料中の全放射能の百分率としてアセチル化形態中の放射能により決定した。
【００２８】 （実施例４）悪化した創傷の治癒モデル 雌性成熟Hartleyハムスター(400-550g)を塩酸ケタミン(90 mg/kg)および塩酸
キシラジン(5 mg/kg)を用いて腹腔内投与することにより麻酔し、次いで毛を剃
った。皮膚層を２個のクランプを用いて引っ張り、固定することによりスリット
を備えたプレキシガラス箱を使用して皮膚層を分離した。これらのクランプを切
開しようとする皮膚の領域より十分外側に置いた。照射処理領域内に皮膚層を配
置し、動物の残部は処理ビームより外側にあった。身体全体に対して照射を遮蔽
することは臨床環境を似せ、骨髄誘導要素の消耗をできるだけ避け、これはニト
ロキシドの投与により影響される治癒反応に必要であり得る。1 cm厚さのプレキ
シガラス塊を処理した皮膚上に置き、表面上ならびに深部中に皮膚投与量を確実
にした。ハムスターは、2.4 Gy/分の線量割合で4 MeV線形加速器(SHM Nuclear C
orporation, Sunnyvale, CA)により送達した4 MeV x-線を使用して、15 Gyまで
脾腹の処理位置に照射した。この線量は、１４日で対照傷害よりも傷害強度にお
いて50％悪化を生じさせることが立証されている(Gorodetsky等、 Radiat. Res.
1988, 115:135-144)。照射を２日行ってから創傷を形成させた。この間隔は、
創傷形成前３週までのその他のいずれの間隔よりも最も顕著な創傷悪化をもたら
すことが立証されたからである(Gorodetsky等、Radiat. Res. 1988, 115:135-14
4)。
【００２９】 照射した皮膚層の中心が正中線に対して側方3.5 cmになるように処置部位を選
択した。各ハムスターの反対側の皮膚層を分離し、照射した皮膚層と同様にして
クランプ固定したが、照射はしなかった。これを対照として使用した。外科用メ
スを用いて正中線から3.5 cmの各処置領域に、対をなす5 cm線状切開を形成した
。切開当たりに、6 Accustaple model 40Rステンレス製外科用ステープル(Dekna
tel,Queens Village, NY)を用いて切開同士の間隔を詰めた。７匹のハムスター
を使用し、各々が照射皮膚および被照射皮膚に切開を施した。創傷形成後、ハム
スターを個々に収容し、それらが他のハムスターの処置部位を触らせないように
した。
【００３０】 創傷形成７日後、ペントトールナトリウムを過剰投与してハムスターを殺した
。創傷を創傷形成７日後に評価した。これは、創傷がWBS分析により評価できる
のに十分な強度がある最も早い時期だからである。処置部位に皮膚弁が形成され
、皮膚を取り除いた。次いで、手操作プレスと鋭くしたスチール製テンプレート
を使用して、１ｃｍ幅の創傷ストリップを各切開部位の中心から除去した。各ス
トリップは、創傷の両側に1.5 cmの正常組織を有し、組織が創破裂強度決定の間
固定されることができるようにした。創傷ストリップを切除後直ちにリン酸塩緩
衝化生理食塩水中に入れ、切除後３時間以内に破裂強度決定を行った。破裂強度
はInstron 1102 TMS材料試験器(Instron Corporation, Canton, MA)上で測定し
た。25 cm/分の横断速度を使用してストリップを一軸延伸に付した。t-検定分析
に一対値を受けさせることにより創傷破裂強度を評価した(StatWorks, Cricket
Software, Inc., Philadelphia, PA)。
【００３１】 （実施例５）ニトロキシド処理創傷 実施例４に記載したようにして皮膚層を照射し、各動物の両皮膚層に照射を受
けさせた。上述のようにして切開をし、次いで、傷にニトロキシド含有化合物を
局所適用した。対照創傷として何も処置しないか基剤のみを局所適用した。ニト
ロキシド含有化合物の塗布後、傷を密閉した。７日後皮膚を採取し、実施例４に
記載したようにして創傷形成および引っ張り強度を測定した。t-検定分析に一対
値または不対値を受けさせることにより創傷破裂強度を評価した(StatWorks, Cr
icket Software, Inc., Philadelphia, PA)。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月２６日（２００１．１２．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 太陽光線に露出されたヒトを光傷害から保護する方法であっ
    て、ヒトの皮膚を光傷害から保護するのに効果的な量で当該皮膚にニトロキシド
    含有化合物を局所適用することを含み、但し、ニトロキシド含有化合物にテンポ
    ールを含まない、太陽光線に露出されたヒトを光傷害から保護する方法。
  2. 【請求項２】 太陽光に対して皮膚を露出する前にニトロキシド含有化合物
    を適用する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 太陽光に対して皮膚を露出させてからニトロキシド含有化合
    物を適用する請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 太陽に対して感度が高められた個体を太陽によりもたらされ
    る傷害から保護する方法であって、感度が高められた個体の皮膚に太陽に対して
    当該個体を露出する前にニトロキシド含有化合物を局所適用することを含み、但
    し、ニトロキシド含有化合物にテンポールを含まない方法。
  5. 【請求項５】 光老化およびその他の太陽による傷害の防止のための医薬組
    成物であって、ニトロキシド含有化合物、第二の日焼け止め剤またはラジカル捕
    獲剤、および医薬用添加剤を含み、但し、ニトロキシド含有化合物にテンポール
    を含まない医薬組成物。
  6. 【請求項６】 患者の創傷にニトロキシド含有化合物を局所適用することを
    含む患者の創傷治癒を促進させる方法。
  7. 【請求項７】 創傷が急性創傷または慢性創傷である請求項６に記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 ニトロキシド含有化合物と医薬用添加剤とを含有する創傷治
    癒を促進させるための局所適用用医薬組成物。
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