JP2003502007A

JP2003502007A - ジンクフィンガークラスのｄｎａ結合タンパク質の設計方法

Info

Publication number: JP2003502007A
Application number: JP2000532426A
Authority: JP
Inventors: ジョージ，エス．マイケルズ，; ライク − ヒイオミケルサール，; リチャード，ジェー．フェルドマン，
Original assignee: ゲノムダイナミクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2003-01-21
Also published as: EP1062227A2; AU758728B2; US6205404B1; WO1999042474A3; AU2871199A; CA2321088A1; KR20010041088A; WO1999042474A2; IL137952A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、あらゆる予定標的二本鎖ＤＮＡ配列との結合の可能性を有するＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）の設計に向けられる。タンパク質の設計のための規則、最適ＤＢＰに関するスクリーニングのための算法、その規則および算法を用いるコンピューターシステム、タンパク質を包含する一般式、ならびにタンパク質の使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］潜在的な核酸結合タンパク質をコードする真核生物遺伝子の超科は、Ｃｙｓ₂
−Ｈｉｓ₂（Ｃ₂Ｈ₂）クラスのジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含有する。
これらの特徴的構造特色を有するタンパク質は、遺伝子発現の調節に重要な役割
を演じる[1-4]。配列比較、突然変異分析および近年の結晶学的研究は、各フィ
ンガードメインが、原則として、ＤＮＡトリプレット内のいくつかのまたはすべ
ての３塩基対との接触によりＢ型ＤＮＡの主溝と相互作用することを明示してい
る。これらの塩基特異性相互作用は、タンパク質ドメインのａ−ヘリックス領域
[5-10]の特定位置のアミノ酸（ＡＡ）側鎖により媒介される。

【０００２】 1,300より大きいＺＦモチーフのＡＡ配列が同定されているが、しかし、正確
なＤＮＡ結合部位は２〜３のタンパク質に関してのみ知られている。ＤＮＡ接触
領域に関する利用可能な情報は、主に富グアニン−シトシン鎖[5-9]と、より少
ない富アデニン−チミン部位[11、12]に関する。実験データに基づいて、ＺＦ配
列を好ましいＤＮＡ結合部位と関連させる規則に関する最初の提案が成されてい
る[13、14]。しかしながら、ＺＦタンパク質−ＤＮＡ認識に関する一般規則は提
案されていない。これは、コンピューターモデリング[2、3、5]も結晶学的分析[
7]もＺＦ−ＤＮＡ接触領域における全体的構造変異性に関する十分な情報を提供
していない、という事実のためであると思われる。

【０００３】異なるＺＦ−ＤＮＡ相互作用に関する特定の接触位置における立体条件を特性
化するための物理的原子−分子モデルを用いる場合、本発明に至る研究の目的は
、ＺＦドメインのＣ₂Ｈ₂クラスに関するＺＦ−ＤＮＡ認識のための一般規則を確
定することであった。この目的が達成されれば、本発明の計画の仕事は、有効な
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドを設計するための算法、ならびに算法
を用いるコンピューターシステムを開発することであった。これらの目標の達成
は、Rebar等やBeerli等[15、16]の開示により特性化された知識である本分野の
知識の大きな進展を表す。これら２つの開示は、新規のＤＮＡ結合特異性を有す
る特定のジンクフィンガーの、ファージ表示系を用いた選択に関する。他方、本
発明の開示は、あらゆる所定のＤＮＡ配列のためのＤＮＡ結合タンパク質の設計
に関する。

【０００４】［発明の概要］本発明はＣ₂Ｈ₂ジンクフィンガーモチーフを介して結合するＤＮＡ結合タンパ
ク質（複数のＤＢＰまたは個々のＤＢＰ）の設計および明細に向けられる。本明
細書中に記載した研究を基礎にして、このような結合を最適化する一般規則が確
定され、そして最適ＤＮＡ結合特性を有するＤＢＰのクラスを説明する式が構築
されている。さらに、あらゆる所定のＤＮＡ配列に対する高結合親和性を有する
ＤＢＰの設計をもたらす規則に基づいて、プログラムが開発されてきた。最後に
、最適結合を有さないけれども、十分且つ有用なＤＮＡ結合特性を有するＤＢＰ
の設計のための規則が確定されている。

【０００５】［発明の詳しい説明］Ｃ₂Ｈ₂ＺＦモチーフのＤＮＡとの結合を支配する一般規則は、1851の考え得る
ＺＦドメインと、６４の考え得る塩基対トリプレットのすべてを含有するＤＮＡ
モデルとのＤＢＰモデルの相互作用の物理的分子モデリングとの間の相同につい
てのデータベース分析の組合せを用いることにより発展された。ＤＢＰモデルは
、牛乳の半ガロン水差しのサイズおよび形状に近似する。ＤＮＡモデルは、長さ
約４フィート、直径１フィートである。ＤＮＡモデルの軸は水平であり、回転し
て６４の塩基対トリプレットの各々を観察し得る。ＤＮＡモデルに関して出たり
入ったりしてＤＢＰモデルを動かすことにより、アミノ酸および核酸接触を観察
し得る。

【０００６】以下の説明において本発明の化学的先例を詳述するが、しかしＤＢＰ−ＤＮＡ
相互作用を支配する一連の規則の完全性は、発明期間中のデータベース分析と物
理的モデリングとの連続した、派生的交錯によってのみ得られた。ＺＦモチーフ
の種々の場所でのアミノ酸の保存および可変性に関する観察は、先ず、ＺＦモチ
ーフの物理的モデルを構築することにより、そして次に、特定のＤＢＰと指定Ｄ
ＮＡbpトリプレットとの相互作用を物理的にモデリングすることにより実施され
た。物理的モデリングは、データベースのさらなる分析に通じるアミノ酸および
核酸相互作用のパターンを示した。データベース分析と物理的モデリングとの間
のこの交錯の反復は、接触パターンの性質の概念上の改善および展開を可能にし
た。これらのパターンが出現した時、ＺＦモチーフ中のアミノ酸の系統的変異が
、６４の塩基対トリプレットの各々に関して約束された。ＤＢＰとＤＮＡ間の相
互作用の物理的モデリングは、代替アミノ酸がＺＦモチーフ中に容易に導入され
、その結果生じるタンパク質がＤＮＡに対して物理的にモデリングするため、有
効であった。水素結合、ならびに水および疎水性物質接触が次にモデリングされ
、明白に確定され、そして非常に迅速に計数され得る。この物理的モデリングか
ら、ＤＮＡと特異的に相互作用するＤＢＰの設計のための判定基準を組み入れた
一連の一般規則が展開された。

【０００７】ＺＦ配列の分析および列の有用性を、図１に示す。ＴＦＩＩＩＡタンパク質は
、物理的測定および修飾、ならびに理論的データ分析の両方に関して、ＺＦタン
パク質のためのモデルとして広範に用いられる。９ジンクフィンガードメインの
各々に関して、この図のＴＦＩＩＩＡアミノ酸配列は、亜鉛結合アミノ酸、２つ
のシステイン（ＣＹＳ）および２つのヒスチジン（ＨＩＳ）が４縦列で整列され
るように並べられた。この整列を成し遂げるためには、種々の場所の配列中にダ
ッシュを挿入して、付加的アミノ酸を有するドメインを提供しなければならない
。同型の整列がＺＦタンパク質ＭＫＲ２およびKruppelタンパク質に関して成さ
れている。ＭＫＲ２配列整列は、非常に密集している。そのＺＦドメインが同一
サイズのものであるため、いかなる挿入も必要ない。ＴＦＩＩＩＡと比較して、
ＭＫＲ２は、特定の二本鎖ＤＮＡの塩基とのタンパク質のアミノ酸の相互作用を
研究するためのなおさらに均一なモデルとして作用する。本発明に到達するため
に、ＭＫＲ２は、ＤＢＰ−ＤＮＡ相互作用を支配する一般規則を演繹するための
配列基本として専ら用いられてきた。

【０００８】ＺＦタンパク質Ｚｉｆ２６８からの３つのＺＦおよびコンセンサスＤＮＡ結合
部位を含有する錯体の結晶学的分析は、ＺＦ−Ｂ−ＤＮＡ認識サブサイトの局在
化を同定するのに役立った。突然変異誘発および配列研究結果も結晶構造データ
に適合するため、同一の接触領域が他のＺＦ−ＤＮＡ錯体の相互作用に関与する
ことを期待するのは、合理的である[5、6、8-10]。したがって、ＺＦタンパク質
の以下のＺＦ構成成分は、逆平行ＤＮＡ読み取り工程において重要な役割を演じ
る、と考えられる：１）タンパク質のａ−ヘリックス領域の直前のＡＡ、２）ａ
−ヘリックス領域内の三番目残基、即ち定常ロイシンの直前のもの、および３）
この領域の６番目の残基、即ち不変ヒスチジンの直前のもの、である。

【０００９】これらの構成成分は、式１で示された一般化ＺＦ配列（ａ−ヘリックスおよび
ｂ−構造領域に下線を施してある）中のそれぞれＺ₃、Ｚ₂およびＺ₁として下記
に示される：

【００１０】

【式１】Y/FXCX_2-4CG/D K/RXFXZ₃ XXZ₂LXZ₁HX_3-5HT/SG/EX_0-2EK/RP β／構造領域 α−ヘリックス（式中、Ｘはアミノ酸であり、Ｘ_2-4は２〜４アミノ酸長のペプチドであり、Ｘ₃ _-5 は３〜５アミノ酸長のペプチドであり、Ｘ_0-2は０〜２アミノ酸長のペプチド
であり、そしてＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹは標
準一文字コードによる特定のアミノ酸を示す）。「／」により分けられた文字の
対は、その位置が指定された２つの特定のアミノ酸のいずれかにより満たされ得
ることを示す。

【００１１】前記の式を記憶に留めて、以下のような３つ（第一、第二および第三）の接触
位置を有する逆平行トリヌクレオチド−ペプチド錯体の生成を心に描くことがで
きる。

【００１２】５’−Ｎ₁−Ｎ₂−Ｎ₃−３’ ＣＯＯＨ−Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₃−ＮＨ₂ Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体の結晶学的研究も、接触基が相互作用する方法の指
標を示した。PavletichとPabo[7]は、Ｚｉｆ２６８が主溝中のコードＤＮＡ鎖の
塩基との１１の重要な水素結合（Ｈ結合）を形成する、と推論した。最初の接触
位置（前記の位置の指示を参照）の２つのアルギニン残基は、グアニンのＮ７お
よびＯ６原子と水素結合を作る。３つのアルギニン残基は、同一方法で、第三接
触位置のグアニンと水素結合する。さらに、この位置の各アルギニン残基は、ａ
−ヘリックスの第二残基として生じるアスパラギン酸のカルボキシレート基との
水素結合、塩橋相互作用を生成する。Ｚｉｆ２６８の第二ＺＦの中央接触位置の
ヒスチジン残基のＮδ原子は、グアニンのＮ７またはＯ６原子に水素結合を与え
る。ＺＦポリペプチド−ＤＮＡ錯体中のグアニンとの相互作用におけるアルギニ
ンおよびヒスチジン残基の役割は、特定部位の突然変異誘発の実験により確証さ
れる[5、6、9、14]。対応するオペレーター部位と錯化されるラムダおよびファ
ージ434リプレッサーのＤＮＡ結合ドメインの結晶学的研究は、グアニンはリシ
ン、アスパラギン、グルタミンおよびセリン残基によってもＨ結合され得る、と
いうことを明示した[17、18]。おそらく、残りの極性ＡＡ（トレオニンおよびチ
ロシン）は、グアニンと類似の結合を形成し得る。

【００１３】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体のフィンガー１および３では、第二（中央）の重要
な位置が、ＤＮＡの対応する領域のシトシンと接触しないグルタミン酸により占
められる[7]。しかしながら、ＺＦタンパク質−ＤＮＡ結合検定は、天然結合部
位において、この相互作用がグルタミン酸とアスパラギン酸に関しては生じない
ことを示している[5、6、9、14、19]。DesjarlaisとBerg[14]は、シトシンとア
スパラギン酸との間の相互作用に関するＨ結合式を提案した。その著者等は、シ
トシンとの相互作用におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸に対する選択が
第三接触位置（Ｚ₃）におけるグルタミンまたはアルギニンの、そして第二位置
（Ｚ₂）におけるセリンまたはアスパラギン酸の存在による、と強調した。Narde
lli等[5]の突然変異誘発実験は、シトシンがグルタミン残基と相互作用し得る、
ということを明示する。これは、同様の極性基を有するアスパラギンに関しても
言える。シトシンは、セリンおよびトレオニン残基中のヒドロキシル酸素原子と
も当然Ｈ結合を作り得る。

【００１４】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体中のチミンは、認識工程に関与するとは思えない。
しかしながら、ラムダリプレッサー、ＤＮＡ結合ドメインＤＮＡおよびエングレ
イルドホメオドメイン−ＤＮＡ錯体の結晶構造研究、ならびにＺＦタンパク質−
ＤＮＡ結合検定は、チミンが非極性残基（アラニン、ロイシン、イソロイシン、
バリン）との疎水性接触および極性ＡＡ（リシン、アルギニン、グルタミン）と
のＨ結合の両方を成し得ることを実証する[8、11、14、17、20]。

【００１５】ラムダおよびファージ434リプレッサー、対応するオペレーター部位を有する
ＤＮＡ結合ドメイン錯体のＸ線結晶学的試験は、アデニン塩基がグルタミンとの
２つのＨ結合を形成する、即ち、１）グルタミン側鎖のアミドＮＨ₂基はアデニ
ンのＮ７原子にＨ結合を供与し、そして２）アミドＯ原子はＮ６原子からＨ結合
を受け入れることを明示した[17、18］。同様のＨ結合は、２つのホメオドメイ
ン錯体のアデニンおよびアスパラギン残基間に見出されている[20、21］。ＺＦ
タンパク質−ＤＮＡ結合検定も、ＺＦ接触位置において、アデニンがグルタミン
およびアスパラギンとの強い相互作用を作ることを示す[8、11、12、14]。グル
タミン酸およびアスパラギン酸のカルボン酸基がグルタミンおよびアスパラギン
アミドＯ原子の場合と同様にＨ結合を受容し得るＯ原子を有することを考慮する
と、アデニンはグルタミンおよびアスパラギン酸と単一水素結合を形成し得ると
考えてもよい。実際、LetovskyとDynan[19]は、部位特異的突然変異誘発研究に
おいて、ＺＦの中央接触位置にグルタミン酸残基を含有する転写因子Sp1は、野
生型コンセンサス認識部位（−ＧＣＧ−）より３倍だけまたはそれより弱くアデ
ニン置換変異体（−ＧＡＧ−）と結合する、ということを示している。さらに、
DesjarlaisとBerg[14]およびBerg[8]は、アデニンは（Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯
体中のグアニンと同様に）、ヒスチジン残基と１つのＨ結合を作り得ると考えて
いる。ヒスチジンだけでなくその他の極性アミノ酸（アルギニン、リシン、チロ
シン、セリンおよびトレオニン）もアデニンの原子Ｎ７とＨ結合を形成し得ると
おもわれる。

【００１６】 1,851の登録を含有する潜在的なＺＦタンパク質ドメインのデータベースが集
められている。このデータベースをコンピューターで用いて、ＺＦドメイン間の
相同を観察し得る。

【００１７】数年前、Seeman等[22]は、単一Ｈ結合は、多数の縮重を生じるので、あらゆる
特定の塩基対を独自に同定するためには不適切であると結論した。アスパラギン
またはグルタミンがアデニンと結合し、そしてアルギニンがグアニンと結合する
場合、主溝で生じるように、認識の忠実性は２つのＨ結合を用いて達成され得る
、と彼等は提案した。

【００１８】前記の結果に基づいて、本明細書中に記載したモデルを用いて、以下のＡＡの
ＺＦ接触位置での塩基認識を検査することは合理的であった：１）グアニン−Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ２）シトシン−Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ３）チミン−Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ４）アデニン−Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｓ、Ｔプラスチック空間充填原子−分子およびイオンモデル[23、24]が、ＺＦ−ＤＮ
Ａ錯体模造物を築造するために用いられてきた。これらの分子モデルは、高分子
物質のモデリングに非常に適したそれらのコネクター、それらの便宜な尺度（1c
m=1Å＝0.1nm）およびそれらの改良された理論的パラメーターの並外れた堅固さ
のために、選択された。100°および105°の結合角を有する四面体炭素原子、二
面体酸素原子（120°）および四面体リン原子（102°および118°）の新モジュ
ールは、Ｂ−ＤＮＡモデルにおけるデオキシリボース縮みおよび糖−リン酸塩鎖
配座の正確なモデリングを保持した。ＤＢＰモデル中のペプチド結合は、炭素原
子（結合角116°、120.5°および123.5°）および窒素原子（122°および119°
）の特定のモジュールを互いに固定することにより模造された。亜鉛イオンは、
ＺＦヒスチジンおよびシステイン残基のＮおよびＳ原子モジュールに四面体的に
固定される球（Ｒ＝0.85cm）によりモデル中に表された。側方固定ＤＢＰモデル
を伴う長水平３４塩基Ｂ型ＤＮＡモデルが、ドッキング実験のために用いられた
。

【００１９】対象研究の第一段階では、Ｚｉｆ２６８フィンガー１、２および３のモデルが
組み立てられ、ＺＦ−Ｂ−ＤＮＡ錯体の一般的空間配向が観察された。第二段階
では、ＺＦ−ＤＮＡ錯体の重要な位置における前記のＡＡの異なる組合せに対す
る６４のヌクレオチドトリプレットのすべての立体適合性がモデル化された。

【００２０】Ｚｉｆ２６８ペプチド−ＤＮＡ錯体のプラスチック分子モデルが、結晶学的デ
ータを基礎にして組み立てられた[7]。ＺＦ−ＤＮＡ主鎖接触物および主溝中の
ＡＡおよび塩基間のＨ結合の模造後、Ｚｉｆ２６８の全体的整列はＤＮＡ鎖と逆
平行である、ということが確証された。最も安定なＺＦ−ＤＮＡ非特異的相互作
用は、ホスホジエステル酸素原子と、Ｚｎ²⁺イオンに固定された最初の不変ヒス
チジン残基との間のＨ結合であると思われる。二次ｂ鎖上の保存アルギニンも、
一次ＤＮＡ鎖上のホスホジエステル酸素原子と接触する。しかしながら、Ｚｉｆ
２６８のフィンガー２および３は、３−ｂｐサブサイトに関する等価リン酸塩と
接触するが、一方、フィンガー１Ｈ結合は一ヌクレオチドによりシフトされる。
アルギニンおよびセリン残基により作られる別の４つのＺＦ−ＤＮＡ主鎖接触は
、ＺＦモジュール構造に関してより不規則である。

【００２１】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶錯体中に見出される１１の重要なＨ結合はすべて、
プラスチックモデルで観察されている。予測通り、第二フィンガーの最初の接触
位置のトレオニン残基はチミンから遠すぎて、Ｈ結合を作れない。しかしながら
、結晶構造分析の結果とは異なって、モデル研究は、フィンガー１および３の第
二接触位置におけるグルタミン酸残基とシトシンとの間の水素結合の可能性を明
らかに示した。

【００２２】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶構造中に観察された認識位置の６つのグアニン−Ａ
Ａ接触のうち、５つがアルギニンにより作られ、１つだけがヒスチジンにより作
られた、ということは注目に値する。このヒスチジン−グアニン相互作用が中心
特定位置の１つだけであった、ということは、一層興味深い。アルギニンと比較
してヒスチジンのサイズがより小さいことを考慮すると、中央位置がグアニンと
より大きいアルギニン残基との間の接触を妨げる立体的束縛を有するが、しかし
２つのＨ結合を形成するその能力のために、後者の対合はエネルギー的に好都合
であるに違いないと考えられ得る。異なる認識位置の空間的状態を調べるために、一次鎖中に、１）トリプレットＧ
ＧＧおよび２）ａ）第一のＺｎ結合ヒスチジンの側基、およびｂ）重要なＡＡト
リプレットＲ₁Ｒ₂Ｒ₃およびＲ₁Ｈ₂Ｒ₃に関する基を有するＺＦα−ヘリックスタ
ンパク質断片（α−ヘリックス直前のＡＡを含む）のモデルを含有するＢ−ＤＮ
Ａモデルが築造された。α−ヘリックス断片のモデルは、ホスホジエステル酸素
原子をヒスチジン残基と接合するＨ結合の模造によりＢ−ＤＮＡモデルに固定さ
れた。次に、特定の塩基−ＡＡ接触がこれらの錯体で検査された。錯体ＧＧＧ−
Ｒ₁Ｈ₂Ｒ₃のみが、Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶構造に見出される重要なＨ結合の
距離に対応する位置に接触基を含有する、ということが明らかにされた。錯体Ｇ
ＧＧ−Ｒ₁Ｒ₂Ｒ₃は立体的に望ましくなく、外側接触位置ではグアニンおよびア
ルギニンが２つのＨ結合により接合され得るが、しかし中央位置では、このよう
な対は、限定空間のために含有され得ない、ということを分子モデリングは明示
する。物理的モデルから得られる観察は、中心接触位置におけるいくつかのＡＡ−塩基
接触に対する立体的束縛の想定を確証した。錯体Ｇ₁Ｇ₂Ｇ₃−Ｒ₁Ｈ₂Ｒ₃の場合、
グアニンＮ７およびＯ６原子から対応するＡＡのＣ_a原子までの以下の概算距離
が確定されている：Ｇ₁Ｎ７−Ｒ₁＝７Å、Ｇ₁Ｏ６−Ｒ₁＝８Å、Ｇ₂Ｎ７−Ｈ₂＝
５．５Å、Ｇ₂Ｏ６Ｈ₂＝６．５Å、Ｇ₃Ｎ７−Ｒ₃＝８ÅおよびＧ₃Ｏ６−Ｒ₃＝７
Å。

【００２３】モデルを用いて、Ｂ−ＤＮＡおよびα−ヘリックス塩基構造の研究は、第二Ｚ
Ｆ−ＤＮＡ認識位置における立体束縛に関する分子的基礎を明らかにした。主溝
中のＤＮＡトリプレットの第一および第三塩基の類似原子基（例えば、グアニン
のＮ７原子）を、直線でつなぎ合わせると、この線から約１．５Å離れた中央（
第二）塩基の対応する基が生じる。同様に、このような線によりＺＦの第一およ
び第三接触位置のＡＡのＣ_α原子を接合すると、これも約１．５Åの距離にある
中央位置にＣ_α原子を生じる。したがって、中央接触位置の重要なＡＡを考慮し
た空間は、約１．５Å両側から圧縮される。

【００２４】ＺＦ−ＤＮＡ主鎖接触に関する前記のデータの分析、ならびにモデルから得ら
れた観察は、第一および第三ＺＦ−ＤＮＡ認識位置間の空間状態にはかなりの差
がある、という結論を導き出した。第一位置では、ＡＡのＣ_α原子はホスホジエ
ステル酸素原子から約６．５Åの距離であって、この場合、ＺＦタンパク質は、
不変ヒスチジン残基によりＤＮＡ主鎖に固定される。ヒスチジンによるこのＺＦ
α−ヘリックス部分の安定固定のために、第一の接触位置での配座再配列の自由
が制限される。Ｃ_α原子は、対応する側鎖に関して、それが一次ＤＮＡ鎖中に局
在される塩基の平面で２〜３Å「上下」に動かされるか、あるいは、この平面に
垂直に１〜２Å動かされうる。

【００２５】他方で、ＺＦα−ヘリックス領域のＮ末端のＤＮＡ主鎖への固定は、むしろ緩
く且つ可変性で、したがって、第三接触位置のＣ_α原子および対応するＡＡに関
する比較的大きい再配列を可能にする。後者接触位置は、この位置のＣ_α原子が
主固定場所からより遠く（ヒスチジン残基に結合されるホスホジエステル原子か
ら約10,5Å）、この位置における対応するＡＡはα−ヘリックスの一部ではない
、という事実によって望ましい。最も重要な知見は、前記の環境のために、第三
接触部位の重要なＡＡは明らかに、対応する塩基対平面において非常に異なる位
置を占め得る、というものである。これは、この残基が、ある錯体中で、相補的
ＤＮＡ鎖の塩基と非常に密接し得ることを意味する。このような幾何学的形状の
外見に関する理由の１つは、Ｂ−ＤＮＡの典型的右手らせんねじれが、一次鎖上
の主塩基よりさらに接近可能な第三接触部位の核酸第二鎖上に相補的塩基を作る
ためである。分子モデルは明らかに、第三の、そして部分的には第二の接触位置
でも、このＤＮＡ鎖がＺＦ−核酸認識工程に関与し得る、ということを示す。Ｚ
ｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶錯体では、ＤＮＡ一次鎖のみに結合される各ＺＦドメイ
ンのα−ヘリックスは、塩基対の平面に関して約４５°の角度で傾けられる[7]
。第二ＤＮＡ鎖が、第三および第二接触位置を包含する重要なＨ結合を介して、
読み取り工程に関与する場合、α−ヘリックス軸の方向は、塩基対平面に対して
さらに垂直である必要がある。

【００２６】したがって、物理的分子モデルの使用によるＺＦ−ＤＮＡ錯体模造のこのより
詳細な研究は、３つの接触領域の各々における立体条件が異なることを示す。こ
れらの立体条件は、ＺＦ−ＤＮＡ認識規則に反映される。

【００２７】ＺＦ−ＤＮＡ認識工程の立体条件についての一般的観察を生じる前記で得られ
た情報に基づいて、重要な接触位置における種々のＡＡ−塩基組合せの広範なモ
デル試験が試みられた。この検査結果を、ＺＦ−ＤＮＡ読取りコードおよび認識
に関する主規則として示す（表１、２および３）。規則は、結晶学的特定部位の
突然変異誘発、ＤＮＡ結合および配列分析データと良好に一致する。式Ｉの配列および図２（ジンクフィンガードメインおよびＤＮＡ鎖とのその相互
作用の模式的表現を提供する）の二次元構造略図を参照しながら、本研究は、以
下のような所定のジンクフィンガードメイン中の３つの重要な接触位置の同一性
を確証した：１）トリプレット中の第一ヌクレオチドとα−ヘリックスのＣＯＯＨ末端の定
常ヒスチジンの前の第一ＡＡとの間；２）トリプレット中の第二ヌクレオチドとα−ヘリックスのＣＯＯＨ末端の定
常ヒスチジンの前の第四ＡＡとの間；３）トリプレット中の第三ヌクレオチドとα−ヘリックスのＣＯＯＨ末端の定
常ヒスチジンの前の第七ＡＡとの間。

【００２８】ＺＦ−ＤＮＡ認識錯体の３つの接触部位の立体条件は異なる。第一接触位置は
比較的大きく且つ厳密に固定され、これが、より長いＡＡの、十分な特異性およ
び親和性を有する一次ＤＮＡ鎖上の塩基との結合を可能にする。第二位置は圧縮
され、若干低い特異性および親和性を有する、より小さいＡＡを収容し得る。第
三位置は、相補的ＤＮＡ鎖との接触を含めたかなりの配座的再配列を可能にする
。

【００２９】表１では、一次鎖上の所定のＤＮＡトリプレットの各ヌクレオチドに関して、
主（カラムＡ）および代替的（カラムＢ）塩基結合ＡＡが示されている。特異性
および親和性はともに、カラムＡ中に残基を含入する際に考慮された。Seeman等
[22]によりすでに提案されたように、認識の忠実度は、それらが主溝のより大き
い位置を占め、そしてピリミジンより多くの水素結合部位を提供するために、プ
リン塩基（グアニンおよびアデニン）の場合に、より良好に保持される。したが
って、最強のＡＡ相互作用は、各々が２つの水素結合によりグアニンまたはアデ
ニンに結合する、アルギニン、グルタミンおよびアスパラギンの相互作用である
と考えられる。アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン
の親和性は、しばしば、カルボキシレートまたはアミド酸素原子とＤＮＡ主鎖、
ホスホジエステル酸素原子との間の水橋の形成により増強された。ファンデルワ
ールス相互作用は比較的弱いが、しかしそれらは、疎水性ＡＡ（アラニン、バリ
ン、ロイシンおよびイソロイシン）によるチミンメチル基の認識にある役割を演
じ得る。

【００３０】表１に示したように、多数のＺＦ−ＤＮＡ錯体において、一次ＤＮＡ鎖のヌク
レオチドトリプレットにおける塩基認識は、一次鎖を介して完全に起こり得るわ
けではなく、一次および相補的ＤＮＡ鎖の両方との同時結合によるか、あるいは
専ら相補的鎖による。相補的ＤＮＡ鎖からの「助け」を用いない場合、いくつか
のトリプレットの場合には、認識工程を実現するためには、重要なＡＡの一次Ｄ
ＮＡ鎖のヌクレオチドとの結合は非常に弱い。考え得るすべてのＡＡ置換が、Ｚ ₁ −Ｚ₃位置における相互作用の強度に関して検査された。一次鎖上の２つより少
ない水素結合を有するドメインは、不安定であると考えられた。

【００３１】表２は、対応するＤＮＡトリプレットとの相互作用に関する最高親和性を有す
るＺＦＡＡトリプレットを示す。これらのＺＦトリプレットは、表１のカラムＡ
に示された主要残基のみを含有する。表２は、特定の接触領域におけるＺＦ−Ｄ
ＮＡ認識工程を保持する結合エネルギー構成成分（Ｈ結合、水橋、ファンデルワ
ールス相互作用）も示す。

【００３２】表２から分かるように、３つの接触領域において考え得る相互作用（Ｈ結合、
水橋およびファンデルワールス相互作用）の数と組合される、ＺＦ結合の工程に
おける相補的ＤＮＡ鎖の関与は、最適組合せが用いられた場合、６４のすべての
ＤＮＡトリプレットを用いた錯体形成が達成され得ることを示すのを可能にする
。表２は、最大数のＨ結合、最強の３つの型の相互作用が、トリプレットの第一
ヌクレオチドがグアニンまたはアデニンである場合に得られる、ということを示
す。

【００３３】考え得るＨ結合の数が最大より少ないヌクレオチドトリプレットでは、欠乏は
しばしば、重要なＡＡおよび糖−リン酸塩主鎖間の有意量の水架橋により部分的
に補償される。

【００３４】トリプレットの第一ヌクレオチドがチミンであり、そしてＨ結合の数が最低で
ある場合でも、１）Ｚ₃位置のＡＡと第三接触位置におけるアデニンおよび相補
的チミンとの間の２つのＨ結合の形成、ならびに２）おそらくは、第二接触位置
におけるチミンとセリンまたはトレオニンとの間の単一Ｈ結合は、ＴＴＮトリプ
レットでも十分な親和性を有するＺＦタンパク質を結合し得ることを意味する。

【００３５】いずれの場合においても、最大効力のＤＢＰを得るためには、フランキング接
触点（１および３）において最強相互作用を有することに注意が払われるべきで
ある。弱い組合せを用いなければならない場合には、それらは、中心接触点（２
）に位置する場合には、より低い作用を有する。しかしながら、接触点における
弱い結合でも、特異性を確立するためには重要である、ということに留意するこ
とは重要である。

【００３６】表３は、表２の主ＺＦＡＡトリプレット、ならびに所定のＤＮＡトリプレット
のそれぞれの塩基との有効な結合を提供すると予測される代替的ＡＡ（表１のカ
ラムＢに示した）を示す。表３は、特定の接触領域におけるＺＦ−ＤＮＡ認識工
程を保持する結合エネルギー構成成分（Ｈ結合、水橋、ファンデルワールス相互
作用）も示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【表２】

【００３９】コドンＺ１Ｚ１水素結合水接触疎水性接触カラムＡカラムＢ凡例表中、／は、代替的アミノ酸を分け、下付文字を有さないＸは、一次鎖とのそのすべての相互作用を有し、Ｘ₁は、一次鎖との多少の相互作用および相補的鎖との多少の相互作用を有
し、Ｘ₂は、相補的鎖と相互作用を有し、Ｘ₃は、一次および相補的鎖の両方との相互作用を有し、 −は、アミノ酸と塩基との間の１つの水素結合であり、＝は、アミノ酸と塩基との間の２つの水素結合であり、 ^*は、アミノ酸と、主鎖のホスホジエステル酸素原子との間の水橋を介した
１つの水素結合であり、＃は、アミノ酸と塩基との間の１つ又はそれ以上のファンデルワールス接触
であって、（）中のアミノ酸は、１つまたは２つのその他の考え得るタンパク質−ＤＮ
Ａ認識相互作用が存在しない場合の一次鎖の塩基との相互作用を有する。

【００４０】

【表３】

【００４１】

【表４】

【００４２】凡例表中、／は、代替的アミノ酸を分け、下付文字を有さないＸは、一次鎖とのそのすべての相互作用を有し、Ｘ₁は、一次鎖との多少の相互作用および相補的鎖との多少の相互作用を有
し、Ｘ₂は、相補的鎖と相互作用を有し、Ｘ₃は、一次および相補的鎖の両方との相互作用を有し、 −は、アミノ酸と塩基との間の１つの水素結合であり、＝は、アミノ酸と塩基との間の２つの水素結合であり、 ^*は、アミノ酸と、主鎖のホスホジエステル酸素原子との間の水橋を介した
１つの水素結合であり、＃は、アミノ酸と塩基との間の１つ又はそれ以上のファンデルワールス接触
であって、（）中のアミノ酸は、１つまたは２つのその他の考え得るタンパク質−ＤＮ
Ａ認識相互作用が存在しない場合の一次鎖の塩基との相互作用を有する。

【００４３】

【表５】

【００４４】

【表６】

【００４５】凡例表中、／は、代替的アミノ酸を分け、下付文字を有さないＸは、一次鎖とのそのすべての相互作用を有し、Ｘ₁は、一次鎖との多少の相互作用および相補的鎖との多少の相互作用を有
し、Ｘ₂は、相補的鎖と相互作用を有し、Ｘ₃は、一次および相補的鎖の両方との相互作用を有し、 −は、アミノ酸と塩基との間の１つの水素結合であり、＝は、アミノ酸と塩基との間の２つの水素結合であり、 ^*は、アミノ酸と、主鎖のホスホジエステル酸素原子との間の水橋を介した
１つの水素結合であり、＃は、アミノ酸と塩基との間の１つ又はそれ以上のファンデルワールス接触
であって、（）中のアミノ酸は、１つまたは２つのその他の考え得るタンパク質−ＤＮ
Ａ認識相互作用が存在しない場合の一次鎖の塩基との相互作用を有する。

【００４６】

【表７】

【００４７】

【表８】

【００４８】表中、／は、代替的アミノ酸を分ける。

【００４９】

【表９】

【００５０】

【表１０】

【００５１】６４の異なるＤＮＡトリプレット（表１、２および３）を有する種々のＺＦα
−ヘリックス錯体の分子モデリング分析の結果、ならびに３つの接触位置におけ
る空間的特殊性についての知見は、ＺＦ−ＤＮＡ認識規則に反映される。表１、
２および３に記載した規則に基づいて、あらゆる標的ＤＮＡ配列に対して最適な
結合親和性を有するＤＢＰが設計され得る。表１〜３中の「カラムＡ」の表示、
即ち「Ａ規則」は、所定コドン（トリプレット）に対する最適結合を有するアミ
ノ酸を示す。表１〜３の「カラムＢ」の表示、即ち「Ｂ規則」は、所定のトリプ
レットに対する二次的な、しかし依然として有意の結合親和性を有するアミノ酸
を示す。

【００５２】カラムＡ規則は、６個のＨ結合、０個の水接触および０個の疎水性接触を有し
、評価エネルギー（５ｘ６）＋（２ｘ０）＋（１ｘ０）＝３０の最強トリプレッ
ト認識から、２個の水素結合、０個の水接触および２個の疎水性接触を有し、評
価エネルギー（５ｘ２）＋（２ｘ０）＋（１ｘ２）＝１２までの範囲である。カ
ラムＡ規則は普通は、位置Ｚ₁、Ｚ₂およびＺ₃におけるちょうど１または２個の
アミノ酸の選択を有する。カラムＢ規則は、比較すると、位置Ｚ₁、Ｚ₂およびＺ ₃ の各々における３個の考え得るアミノ酸から、位置Ｚ₁、Ｚ₂およびＺ₃の各々に
おいて異なる接触配列で、１８個という多くのアミノ酸までを有する。カラムＢ
エネルギーの評価において、位置Ｚ₁、Ｚ₂およびＺ₃における３つのアミノ酸の
多数の異なる群分けが認められる。最小エネルギーは、３個の水素結合、０個の
水接触および０個の疎水性接触を有し、評価エネルギー（５ｘ３）＋（２ｘ０）
＋（１ｘ０）＝１５である。これらの組合せに関する最大エネルギー評価は、平
均で、３個の水素結合および２個の水接触または２個の疎水性接触であり、評価
エネルギー（５ｘ３）＋（２ｘ２）＋（１ｘ０）＝１９から（５ｘ３）＋（２ｘ
０）＋（１ｘ２）＝１７まで下がる。したがって、カラムＢ規則は、エネルギー
範囲が３０から下がって１２までのカラムＡ規則より狭いエネルギー範囲（即ち
１９から下がって１５まで）を有する。カラムＢ規則に関する狭エネルギー範囲
は、６４の異なる規則が６４のカラムＡ規則と同様にはエネルギーを基礎にして
識別しないことを意味する。

【００５３】例えば、表２に記載したように、ＤＮＡ塩基トリプレットグアニン−シトシン
−シトシン（ＧＣＣ）と最適に結合するＤＢＰは、トリプレットとの結合を生じ
させるタンパク質の部分が、配列Ｚ₃ＸＸＺ₂ＬＸＺ₁Ｈ（式中、Ｚ₁はＤＮＡトリ
プレットの位置１と相互作用するアルギニンであり、Ｚ₂はＤＮＡトリプレット
の位置２と相互作用するグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｚ₃はＤＮＡト
リプレットの位置３と相互作用するアルギニンであり、Ｘは任意のアミノ酸であ
り、Ｌはロイシンであり、そしてＨはヒスチジンである）を有するセグメントを
その中に含有するＺＦドメインであるものである。

【００５４】表１または３に記載したように（所定のコドンに関するＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃位
置のための「カラムＢ」登録を参照）、ＤＮＡ塩基トリプレットグアニン−シト
シン−シトシン（ＧＣＣ）と、最適にでない場合、有効に結合するＤＢＰは、ト
リプレットとの結合を生じさせるタンパク質の部分が、配列Ｚ₃ＸＸＺ₂ＬＸＺ₁
Ｈ（式中、Ｚ₁はＤＮＡトリプレットの位置１と相互作用するヒスチジン、リシ
ン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンおよびトレオニンから成る群
から選択されるアミノ酸であり、Ｚ₂はＤＮＡトリプレットの位置２と相互作用
するグルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アルギ
ニン、ヒスチジンおよびリシンから成る群から選択されるアミノ酸であり、Ｚ₃
はＤＮＡトリプレットの位置３と相互作用するグルタミン、アスパラギン、グル
タミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リシン、チロシン、セリンおよびトレ
オニンから成る群から選択されるアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、
Ｌはロイシンであり、そしてＨはヒスチジンである）を有するセグメントをその
中に含有するＺＦドメインであるものである。

【００５５】もちろん、中間体親和性のＤＢＰ、即ち、Ｚ₁、Ｚ₂およびＺ₃接触アミノ酸が
「Ａ」および「Ｂ」規則の組合せにより選択されるものが設計され得ることが理
解される。例えば、トリプレットＧＣＣとの結合のためのＺＦドメイン内のセグ
メントＺ₃ＸＸＺ₂ＬＸＺ₁Ｈ中では、Ｚ₁はアルギニンであり、Ｚ₂はグルタミン
またはグルタミン酸であり、そしてＺ₃はグルタミン、アスパラギン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リシン、チロシン、セリンおよびトレオニ
ンから成る群から選択され得る。

【００５６】このようなタンパク質のための基本的築造ブロックは、次式で表される：

【００５７】

【式２】ＮＨ₂−ＺｉＦ_c−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ_cは次式： Y/FXCX_2-4CG/DK/RXFXZ₃XXZ₂LXZ₁HX_3-5H（ここで、Ｚ₁、Ｚ₂およびＺ₃はＤＮＡト
リプレットの３つの塩基に対応するために表１、２または３から選択されるアミ
ノ酸であり、式の残りの構成成分は式Ｉの説明中で前記されたのと同様である）
の形態のＺＦドメインである）。

【００５８】本発明の好ましい実施態様では、所定のＤＮＡトリプレットとの結合のための
ジンクフィンガードメインは、表２における、あるいは表１または表３のカラム
Ａにおける適切なＡＡの選択により設計される。本発明の別の実施態様では、Ｚ
Ｆドメインは、表１または３のカラムＢにおける所定のＤＮＡトリプレットに関
して記載されたＡＡの中からの選択により設計される。

【００５９】このような一ドメインは、標的配列の各トリプレットに必要である；３塩基の
みの標的列に関しては、前記の式はタンパク質を定義する。

【００６０】ＤＮＡの標的列が６塩基である場合、ＤＢＰ設計は以下のように延長される：

【００６１】

【式３】ＮＨ₂−ＺｉＦ₁−｛リンカー｝−ＺｉＦ₂−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ₁およびＺｉＦ₂は、６つの塩基の第一および第二トリプレットと
結合するよう、ＺｉＦ_cに関して上に示されているのと同様に、設計されたＺＦ
ドメインであり、そして｛リンカー｝は以下のパターン：Ｔ／ＳＧ／ＥＸ_0-2ＥＫ／ＲＰ（式中、構成成分は式１に前記したのと同様である）に一致するアミノ酸配列である）。

【００６２】１）ＤＮＡの標的列が９、１２またはそれより多くの３の倍数個の塩基を含有
し、２）３ｎ＋３塩基のためにＤＢＰを設計する必要があり、そして、３）最初
の３ｎ個の塩基が以下の配列：

【００６３】

【式４】ＮＨ₂−ＺｉＦ₁−｛リンカー｝−ＺｉＦ₂−｛リンカー｝−…−｛リンカー｝−
ＺｉＦ_n−ＣＯＯＨにより示される場合には、ＤＢＰ設計は回帰的に延長され、そして必要なＤＢＰ
は以下の配列：

【００６４】

【式５】ＮＨ₂−ＺｉＦ₁−｛リンカー｝−ＺｉＦ₂−｛リンカー｝−…−｛リンカー｝−
ＺｉＦ_n−｛リンカー｝− ＺｉＦ_n+1−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ_n+1は、塩基対の標的配列のｎ番目＋１トリプレットと結合する
ために、ＺｉＦ_cに関して前記したのと同様に、設計されるＺＦドメインである
）により特定される。

【００６５】図３は、ｎ＝３であるＺＦタンパク質、即ち、リンカー配列により連結される
３つのＺＦドメイン（即ちｎ＝３）を有し、９（３ｎ）塩基の標的ＤＮＡ列と結
合するよう設計されるものを図式的に示す。

【００６６】前記の規則は、あらゆる所定のＤＮＡトリプレットとの結合のための最適アミ
ノ酸（単数または複数）の容易な確定を可能にし、したがってＤＮＡトリプレッ
トとの結合のためのＤＢＰの理想的構成成分であり得るＺＦドメイン中の３個の
アミノ酸の同定および位置決定を可能にする。

【００６７】規則の適用は、次に、ＺＦドメインの一組の数ｎ_dを含有するＤＢＰの設計に
拡張され得るが、この場合、ＤＰＢは所定のＤＮＡ配列内の３ｎ_dヌクレオチド
の標的伸長物と結合する。ヌクレオチドの標的３ｎ_d伸長、ならびにＤＢＰ中の
ｎ_dドメインの収集および序列は、ＤＰＢおよび標的ＤＮＡ配列に関する結合エ
ネルギーが、スクリーニングされる全ＤＮＡ分子内の３ｎ_dヌクレオチドのあら
ゆる伸長を有する組数ｎ_dのＺＦドメインを含有するＤＢＰのあらゆる対合に関
して考え得る最高であるようなものである。

【００６８】したがって、第一に重要な本発明の実施態様は、あらゆる長さのＤＮＡ配列に
関するこのようなＤＢＰの設計方法である。該方法は、前記の規則を、所望の特
性を有する独特のＤＢＰを確定するためのｎ_dＺＦドメインを含有するＤＢＰに
対するそれらの親和性により配列内の３ｎ_dヌクレオチドの考え得るすべてのセ
グメントをスクリーニングし、等級付けする手段と組合せて用いる。

【００６９】さらに特に、本発明は、所定の遺伝子内の標的ＤＮＡ配列と選択的に結合する
リンカー配列により連結される多ＺＦドメインを有するＤＢＰの設計方法であっ
て、前記ＺＦドメインの各々が次式： A₁XCX_2-4CA₂A₃XFXZ₃XXZ₂LXZ₁HX_3-5H を、そして前記リンカーの各々が次式： A₄A₅X_0-2EA₆P （式中、（ｉ）Ｘはあらゆるアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘ_2-4は２〜４アミノ酸
長のペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘ_3-5は３〜５アミノ酸長のペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ_0-2は０〜２アミノ酸長のペプチドであり、（ｉｖ）Ａ₁はフェニルア
ラニンおよびチロシンから成る群から選択され、（ｖ）Ａ₂はグリシンおよびア
スパラギン酸から成る群から選択され、（ｖｉ）Ａ₃はリシンおよびアルギニン
から成る群から選択され、（ｖｉｉ）Ａ₄はトレオニンおよびセリンから成る群
から選択され、（ｖｉｉｉ）Ａ₅はグリシンおよびグルタミン酸から成る群から
選択され、（ｉｘ）Ａ₆はリシンおよびアルギニンから成る群から選択され、（
ｘ）Ｃはシステインであり、（ｘｉ）Ｆはフェニルアラニンであり、（ｘｉｉ）
Ｌはロイシンであり、（ｘｉｉｉ）Ｈはヒスチジンであり、（ｘｉｖ）Ｅはグル
タミン酸であり、（ｘｖ）Ｐはプロリンであり、そして（ｘｖｉ）Ｚ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃は塩基接触アミノ酸である）を有する方法であって、以下の：（ａ）スクリーニングされるゲノムを決定する工程と、（ｂ）結合のためのゲノム中の標的ＤＮＡ配列を選択する工程と、（ｃ）ジンクフィンガードメインの数をｎ_dに決定する工程と、（ｄ）ｎ_zが以下の関係：ｎ_z＝３ｎ_d を用いて確定される第一のルーチンを用いて、標的ＤＮＡ配列を、各々のブロッ
クがｎ_zヌクレオチドを含有するヌクレオチドブロックに分ける工程と、（ｅ）本明細書の表１〜３に記載したＡ規則および／またはＢ規則により、
標的遺伝子配列の最初の５’ヌクレオチドから数えた場合に工程（ｄ）からの最
初のヌクレオチドブロックと結合して、ブロック特異的ＤＢＰを生じるＤＢＰの
各ＺＦドメインにＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てて、そして
各々次式：結合エネルギー_{ト゛メイン}＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎水性接触数）を用いて確定される結合エネルギー、即ち結合エネルギーの生成物としてのこの
ような各ブロック特異的ＤＢＰの各ＺＦドメインの「結合エネルギー_{フ゛ロック}」、ポリペプチドの全ジンクフィンガードメインの「結合エネルギー_{ト゛メイン}」を計算する工程と、（ｆ）第二のルーチンを用いて工程（ｄ）からのＤＢＰをさらに分けて、３
つのＺＦドメインを有するさらに分割されたＤＢＰを生成する工程と、（ｇ）第三のルーチンを用いてゲノムに対して工程（ｆ）からのさらに分割
されたＤＢＰをスクリーニングして、ゲノム中の各々のさらに分割されたＤＢＰ
に関するゲノム中の結合部位の数を確定して、そして以下の式：結合エネルギー_部位 _n＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎
水性接触数）を用いて、このような部位の各々に関して結合エネルギーを割り当てる工程と、（ｈ）以下の式：Ｒ_b＝結合エネルギー_{フ゛ロック}／工程（ｇ）からの全てのさらに分割されたＤＢＰに関する全結合エネルギー_部位 _nの和を用いて、工程（ｅ）からの各ヌクレオチドブロック特異的ＤＢＰに関して第四
のルーチンを用いて結合エネルギーの比Ｒ_bを計算する工程と、（ｉ）ｎ_d≧４である場合の各々のさらに分割されたＤＢＰに関して工程（
ｆ）〜（ｈ）を反復する工程と、（ｊ）ｎ_zヌクレオチドを含有する標的ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドブロ
ックに関して工程（ｄ）〜（ｉ）を反復する工程と、（ｋ）工程（ｈ）から得られたＲ_b数値を順位化する工程と、（ｌ）許容可能なＲ_b値を有するＤＢＰを選択する工程とから成る算法を包含する方法に関する。

【００７０】本発明のこの観点の好ましい実施態様を以下に示す。

【００７１】１）ＤＢＰのＲ_b数値が標的ＤＮＡ配列と結合する工程（ｈ）の全ＤＢＰに関
して最高数値である前記の設計方法。

【００７２】２）工程（ｈ）で確定されるＤＢＰＲ_b数値が少なくとも10,000である前記
の方法。

【００７３】３）ＺＦドメインの数ｎ_dが９である前記の方法。

【００７４】４）工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃に塩基
接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ａから選択される前記の方法。

【００７５】本発明は、所定の遺伝子内の標的ＤＮＡ配列と選択的に結合するリンカー配列
により連結される多ＺＦドメインを有するＤＢＰを設計するためのコンピュータ
ーシステムであって、前記ＺＦドメインの各々が次式： A₁XCX_2-4CA₂A₃XFXZ₃XXZ₂LXZ₁HX_3-5H を、そして前記リンカーの各々が次式： A₄A₅X_0-2EA₆P （式中、（ｉ）Ｘはあらゆるアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘ_2-4は２〜４アミノ酸
長のペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘ_3-5は３〜５アミノ酸長のペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ_0-2は０〜２アミノ酸長のペプチドであり、（ｉｖ）Ａ₁はフェニルア
ラニンおよびチロシンから成る群から選択され、（ｖ）Ａ₂はグリシンおよびア
スパラギン酸から成る群から選択され、（ｖｉ）Ａ₃はリシンおよびアルギニン
から成る群から選択され、（ｖｉｉ）Ａ₄はトレオニンおよびセリンから成る群
から選択され、（ｖｉｉｉ）Ａ₅はグリシンおよびグルタミン酸から成る群から
選択され、（ｉｘ）Ａ₆はリシンおよびアルギニンから成る群から選択され、（
ｘ）Ｃはシステインであり、（ｘｉ）Ｆはフェニルアラニンであり、（ｘｉｉ）
Ｌはロイシンであり、（ｘｉｉｉ）Ｈはヒスチジンであり、（ｘｉｖ）Ｅはグル
タミン酸であり、（ｘｖ）Ｐはプロリンであり、そして（ｘｖｉ）Ｚ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃は塩基接触アミノ酸である）を有する方法であって、以下の：（ａ）スクリーニングされるゲノムを決定する工程と、（ｂ）結合のためのゲノム中の標的ＤＮＡ配列を選択する工程と、（ｃ）ＺＦフィンガードメインの数をｎ_dに決定する工程と、（ｄ）ｎ_zが以下の関係：ｎ_z＝３ｎ_d を用いて確定される第一のルーチンを用いて、標的ＤＮＡ配列を、各々のブロッ
クがｎ_zヌクレオチドを含有するヌクレオチドブロックに分ける工程と、（ｅ）本明細書の表１〜３に記載したＡ規則および／またはＢ規則により、
標的遺伝子配列の最初の５’ヌクレオチドから数えた場合に工程（ｄ）からの最
初のヌクレオチドブロックと結合して、ブロック特異的ＤＢＰを生じるＤＢＰの
各ＺＦドメインにＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てて、そして
各々次式：結合エネルギー_{ト゛メイン}＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎水性接触数）を用いて確定される結合エネルギー、即ち結合エネルギーの生成物としてのこの
ような各ブロック特異的ＤＢＰの各ＺＦドメインの「結合エネルギー_{フ゛ロック}」、ＤＢＰの全ドメインの「結合エネルギー_{ト゛メイン}」を計算する工程と、（ｆ）第二のルーチンを用いて工程（ｄ）からのＤＢＰをさらに分けて、３
つのＺＦドメインを有するさらに分割されたＤＢＰを生成する工程と、（ｇ）第三のルーチンを用いてゲノムに対して工程（ｆ）からのさらに分割
されたＤＢＰをスクリーニングして、ゲノム中の各々のさらに分割されたＤＢＰ
に関するゲノム中の結合部位の数を確定して、そして以下の式：結合エネルギー_部位 _n＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎
水性接触数）を用いて、このような部位の各々に関して結合エネルギーを割り当てる工程と、（ｈ）以下の式：Ｒ_b＝結合エネルギー_{フ゛ロック}／工程（ｇ）からの全てのさらに分割されたＤＢＰに関する全結合エネルギー_部位 _nの和を用いて、工程（ｅ）からの各ヌクレオチドブロック特異的ＤＢＰに関して第四
のルーチンを用いて結合エネルギーの比Ｒ_bを計算する工程と、（ｉ）ｎ_d≧４である場合の各々のさらに分割されたＤＢＰに関して工程（
ｆ）〜（ｈ）を反復する工程と、（ｊ）ｎ_zヌクレオチドを含有する標的ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドブロ
ックに関して工程（ｄ）〜（ｉ）を反復する工程と、（ｋ）工程（ｈ）から得られたＲ_b数値を順位化する工程と、（ｌ）許容可能なＲ_b値を有するＤＢＰを選択する工程とから成る算法を含む設計手段を包含するコンピューターシステムにも関する。

【００７６】本発明において、設計方法とコンピューターシステムとの両方について前述の
（ｈ）で定められたＲ_bは、１０，０００の下限を有する。好ましくはＲ_bは１０ ⁶ より大きい。

【００７７】本発明のこの観点の好ましい実施態様を以下に示す：１）ＤＢＰのＲ_b数値が標的ＤＮＡ配列と結合する工程（ｈ）の全ＤＢＰに関
して最高数値である前記のコンピューターシステム。

【００７８】２）工程（ｈ）で確定されるＤＢＰＲ_b数値が少なくとも10,000である前記
のコンピューターシステム。

【００７９】３）ＺＦドメインの数ｎ_dが９である前記のコンピューターシステム。

【００８０】４）工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃の塩基
接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ａから選択される前記のコンピュ
ーターシステム。

【００８１】本発明の方法およびコンピューターシステムはさらに、図４〜９のブロック流
れ図により説明される。

【００８２】図４は、ＤＢＰ設計工程が実行されるコンピューターシステムの構成成分を示
す。任意の製造者の中央処理装置デジタルコンピューター（１）が、本発明者等
により書かれたコンピュータープログラム（２）とともに提示される。コンピュ
ータープログラム（２）は、ＤＮＡ−トリプルエネルギー規則（６）、ゲノム記
述子（９）、ゲノムＤＮＡ配列（１０）および遺伝子特徴（５）として記載され
た一連のファイルを読み取る。中央処理機（１）は、この情報をＤＢＰブロッキ
ング断片ファイル（７）およびゲノムのための最適ＤＢＰ設計（８）に変換する
。

【００８３】図５は、図４中のコンピュータープログラム（２）が２つの部分を有すること
を示す。ゲノムデータは先ず、ゲノム処理によりブロッキング断片ファイルファ
ンクション（２）に変換される。これらのファイルは次に、ゲノムファンクショ
ンのためのＤＢＰ設計（３）により用いられる。

【００８４】図５のブロッキング断片へのゲノム処理ファイルブロック（２）を、図６に詳
細に示す。１１から下って３までのすべてのｎ_dに関して、ゲノム説明体ファイ
ル（１２）およびゲノムＤＮＡ配列ファイル（３２）が読み取られ、非分類化断
片ファイル（７）に変換される。この同一非分類化断片ファイル（１４）は、コ
ンピューター製造者により提供される分類ファンクション（１３）により分類化
断片ファイル（１５）に変換される。同一分類化断片ファイル（３０）は読み取
られ、そして最終的にＤＢＰサイズブロッキングファイル（２２）に変換される
。

【００８５】図５のゲノムのためのＤＢＰ設計ブロック（３）を、図７でより詳細に示す。
１１から下って３までのｎ_dに対応するゲノム説明体ファイル（３）、遺伝子特
徴ファイル（７）、ゲノムＤＮＡ配列ファイル（９）およびＤＢＰサイズブロッ
クファイル（３７）は読み取られ、ゲノムＤＮＡを先ず遺伝子に、次にゲノムの
ための最適ＤＢＰ設計のファイル（３８）に変換されるために用いられる。変換
および設計工程は、ゲノム中のすべての遺伝子に関して成される。

【００８６】図７の「カレント−サブ−ウインドウがカレント−ブロッキング−ファイル中
にあるか否かを確定する」ブロック（２２）を、図８でより詳細に詳述する。

【００８７】図７の「ブロック断片の結合エネルギーを計算する」ブロック（２４）を、図
９でより詳細に詳述する。種々のｎ_dの種々のＤＢＰに算法を適用することにより、ｎ_dが９である値が算法
の最良の出発点であり、即ち、その工程は９フィンガーＤＢＰに関する探索を用
いて開始されるべきであることが、実験的に決定された。これは、種々のＤＢＰ
を評価するのに用いられる選択判定基準Ｒ_bに関してより良好に理解され得る。
短いＤＢＰ、例えばｎ_d＝４または５のものでは、すべての結合エネルギー_{ト゛メイン} の生成物として幾何学的に増大する結合エネルギー_{フ゛ロック}は有意に低く、そして結合エネルギー_部位 _nは比較的大きい。しかしながら、ｎ_dが増大すると、Ｒ_bの
分子は劇的に増大するが、一方、「バックグラウンド」または「ノイズ」を表す
分母は有意に変化しないことが観測された。したがって、ｎ_d＝９の場合は、不
適当なコンピューターニーズの可能性を生じることなく、結合の高親和性および
特異性の保証を提供する。

【００８８】しかし、本発明は、ｎ_d≦９のＤＢＰの設計に限定されない、ということが強
調されるべきである。そのことに関しては、ｎ_d＝９は最良の出発点であること
が見出されているが、しかし所定の状況に関する最良のＤＢＰは、標的ＤＮＡ配
列の長さにもかかわらず、ｎ_d＜９であるものにし得るとも考えられる。本発明
の概念は、必要な場合には、あらゆる長さのＤＢＰの設計に適用され得る。

【００８９】いかなる場合にも、Ｎヌクレオチドの所定のＤＮＡ配列に関しては、Ｎ−２７
、９−フィンガーＤＢＰ配列が存在する。これらの各々は、前に開示した設計法
の（ｅ）部に記載した３−ヌクレオチドセグメントの各々に関してエネルギー関
数を評価することにより、結合の強度に関して等級付けされ得る。

【００９０】初期コンピューター実験では、選択可能配列は８、７、６、５および４−フィ
ンガーサブサイトを有し得なかった。しかしながら、本発明のシステムに関して
は、サブサイト結合エネルギーの和だけは最小にする必要がある。その結果、サ
ブサイト結合エネルギーが３−フィンガーサブサイトから来るか、４−フィンガ
ーサブサイトからか、または（一般原則として）さらに大きいサブサイトからさ
え来るかは問題ではない。論理的排除からエネルギー的排除へのこの単純変化は
、酵母菌ゲノムの検査によってはそれほど多くはないが、しかし虫ゲノムの検査
によってより多く発せられた。

【００９１】当該算法の中心部分は、許容可能なｎ_d−フィンガー部位（例えば、９−フィ
ンガーＤＢＰに関しては２７−塩基セグメント）を見出す場合、類似部位が存在
するかを知るための全ゲノム中のすべての他のｎ_d−フィンガー部位に対する探
索である。これが実際に成される場合には、最高Ｒ_b値を有するＤＢＰが選択さ
れる。さらに、算法は、所定の９−フィンガー部位に対して全ゲノム中に等価の
８−フィンガー、７−フィンガー、６−フィンガー、５−フィンガーおよび４−
フィンガーサブサイトが存在するかを知るために点検する。許容可能でない９−
フィンガー部位が見出された場合には、算法は、適切な８−フィンガー部位に関
して探索する。必要な場合には、探索は、７−フィンガー部位等に関して、許容
可能ＤＢＰ結合部位が見つかるまで、続けられる。

【００９２】９−フィンガーＤＢＰに関する探索内で、算法は、「フレーム」と呼ばれる２
７塩基配列のすべてを調べる。各フレームは、ＤＮＡとのその相互作用、および
３−フィンガーサブサイトまで下がって他のすべてのサブフレームの相互作用を
確定するために評価される。ゲノム中の各フレームおよびサブフレームの実例数
が、ソフトウェアの遂行のゲノム処理段階中に記録されている。フレームまたは
サブフレームの配列は、各ＺＦの結合エネルギーの生成物として評価される。各
ＺＦドメインは、３つのＤＮＡ塩基を認識する。ＺＦが認識する根元的ＤＮＡ配
列は、ＺＦとＤＮＡとの間にどれだけ多くの水素結合、水接触および疎水性接触
が存在するかを確定する。

【００９３】所定のｎ_z−塩基部位がゲノム中の他の場所に生じるか否かを算法が検出する
方法は、部位に関してＢ木を調べることによる。全ゲノムは、ｎ_d−フィンガー
部位の各々に関して処理される。本算法は、無数の断片を分類し、併合するため
の手段を含有し、最後に、すべての異なるフィンガーサイズに関してブロック断
片のすべての等級化一覧が生成される。

【００９４】実施例１ＤＢＰに関する典型的探索およびその設計方法の例を、以下に示す。それは、
１００ヌクレオチド（即ち、Ｎ＝１００）の標的ＤＮＡ配列を結合するための９
−フィンガーＤＢＰ（即ち、ｎ_d＝９）に関するスクリーニングを包含する。配
列は、全１００ヌクレオチド配列において、すべての２７−ヌクレオチド配列に
関して、位置１から開始して、即ち、１−２７、２−２８、３−２９等で、スク
リーニングされる。これが成されたら、９−フィンガーを３−フィンガーセクシ
ョンに、即ち１−３、２−４、３−５等に分解する。算法は、結合の相対強度に
関して精査し、それを探す。その考えは、ＤＢＰ結合対サブサイト結合の比、Ｒ _b を最大にし、したがって最大数のサブサイトと相互作用する９量体のものを排
除する。

【００９５】本発明の算法を、以下の実施例で説明するように、エス・セレビシエ(S. cerv
isiae)およびシー・エレガンス(C. elegans)のゲノムに適用した。

【００９６】実施例２本算法を、酵母菌ゲノムのスクリーニングに適用した。それぞれ１１０および
４４７遺伝子を含有する酵母菌の２本の染色体をプロセッシングした。各遺伝子
に関して、算法は、サブサイト結合エネルギーの最低合計を有するｎ_d−フィン
ガー配列を選択した。酵母菌では、３−フィンガーブロック断片の数は、ほとん
ど最大（即ち、最大４¹²に対して４⁹）である。虫ゲノム（実施例３参照）では
、３−フィンガーブロック配列は、無条件に最大である。酵母菌では、４−フィ
ンガーブロック配列は数が大きいが、しかし５−フィンガーブロック配列の集団
は比較的小さい。虫では、４−フィンガーブロック配列は５−フィンガーブロッ
ク配列より数が大きいが、しかし後者は酵母菌と比較して、数がより大きい。将
来、虫からヒトに進行する場合、４−フィンガーブロック配列は飽和に近く（即
ち、４¹²に近く）なり得る、と予測され得る。

【００９７】算法分析は、酵母菌の１６本の染色体のうちの２本に関して実施した。最初の
２本の染色体中の５５７遺伝子は、酵母菌ゲノムにおける全染色体の特性の現実
に即した像を示すと思われる。標本計算を全酵母菌ゲノムに関して実行したが、
しかしこれらの結果は、遺伝子のちょうど２本の染色体分の特性を計算すること
により生成されたものと異ならない。酵母菌ゲノムの分析全体の知見の典型であ
る、１００酵母菌遺伝子の分析の結果を、表４に示す。

【００９８】本算法の力はさらに、図１０〜１４に示した結果で実証される。図は、試験が
集中された２本の酵母菌染色体の５５７遺伝子のすべてに関して得られた結果を
示す。

【００９９】許容可能な９−フィンガーＤＢＰの各々の強度が計算され得る。図１０は、許
容可能な９−フィンガーＤＢＰのすべての結合強度が均一に分布されることを示
す。この曲線が下方に曲がる場合には、より強いフレームがより好ましい。この
曲線が上方に曲がる場合には、より弱いフレームが好ましい。

【０１００】図１１は、許容可能な９フィンガーＤＢＰの結合エネルギー（結合エネルギー _{フ゛ロック} ）が１０¹¹〜１０¹³結合単位間で均一に分布されることを示す。

【０１０１】図１２は、擬似サブサイト結合エネルギー（結合エネルギー_部位）の合計の分
布が、１０⁶〜１０⁸結合単位の範囲でそれ自体均一であることをを示す。

【０１０２】図１３は、図１２の非対数バージョンである。それは、許容可能な９−フィン
ガーＤＢＰのほとんどが５ｘ１０⁶未満の擬似サブサイト結合エネルギーを有す
ることを示す。

【０１０３】図１４は、図１１の値対図１２の値の比を出すことにより作成された、９フィ
ンガーＤＢＰに関するＲ_bのグラフである。このチャートは、許容可能な９フィ
ンガーＤＢＰのＤＢＰ結合強度対擬似サブサイト相互作用の結合エネルギーの合
計の比が１０⁴から１０⁶まで変わることを示す。

【０１０４】本発明の分析道具は、単一酵母菌遺伝子YAR073の、特にコード領域のすぐ上流
のプロモーターの３００ｂｐ領域のさらなる分析にも用いた。遺伝子のこの部分
の各２７塩基フレームに関するサブサイト結合エネルギー（ＳＢＥ）の全合計を
確定した。結果を、図１５にグラフで示す。一次結合エネルギー（ＢＥ）も確定
し、相関が、ＳＢＥ値とＢＥ：ＳＢＥの比（Ｒ_b）の値との間に見出された。さ
らに（図１６）、Ｒ_b値のプロットのピークが同一遺伝子の転写因子の足跡（別
個の試験で確定）に対応する、ということも分かった。

【０１０５】実施例３ C. elegansの１００遺伝子への本発明の算法の適用は、本システムがS. cerev
isiaeに対すると同様にC. elegansに対してもうまく適用し得ることを示した。
１００C. elegans遺伝子の分析結果を、表５に示す。

【０１０６】図１７では、分析したC. elegans遺伝子の１つに関して、５−フィンガーＤＢ
Ｐだけが設計され得ることが分かる。別の遺伝子に関しては、７−フィンガーＤ
ＢＰだけが設計され得た。これら２つの遺伝子、２および３２は、９−量体が設
計され得るものに対してそれらの遺伝子（１００のうち９８を除外した）に関し
てだけの分析結果を示すため、表５には示していない。あらゆる場合に、図１７
に示した結果は、全C. elegansゲノムの分析に関する予測と一致し、即ち、５−
から９−フィンガーＤＢＰの分布はS. cerevisiaeとは多少異なる。

【０１０７】図１８は、S. cerevisiaeに関して図１４で示したのと同一の、C. elegansに
関する分析を示す。図１８は、図１４で観察されたのと同様のＲ_b値分布を示す
。

【０１０８】実施例２および３は、２つの広範に亘って全く異なる生物のゲノムに関するＤ
ＢＰの設計に対する本発明の適用可能性を実証する。酵母菌ゲノムへの、そして
特に虫ゲノムへの本算法の適用の種々の結果は、算法道具の力を示し、そして実
はその基礎を、即ち、それは単に無作為および／または理論的分析を提供するだ
けではないことを、実証する。これらの分析に基づいて、本発明の算法は、ヒト
のゲノムを含めたあらゆる当該生物のゲノムのあらゆる所望のセグメントに関す
るＤＢＰの設計にまで及び得る、と予測される。

【０１０９】本発明の算法は生物体の全ゲノムに対する探索を包含するが、しかし、本発明
の試験結果は、所定の生物のゲノムについての完全知識の欠如が、その生物に関
するＤＢＰの設計に対する本発明の適用への障害とはならないことを、強く示し
ている。S. cerevisiae（単細胞生物）およびC. elegans（多細胞生物）に関し
て本明細書中に示した試験で得られたブロック配列の知識を用いて、高等真核生
物の系に許容される配列の妥当な見積もりを成し得る、と予測できる。

【０１１０】例えば、酵母菌および虫に関する本発明の試験は、ゲノム「ノイズ」、この状
況においては擬似結合部位エネルギーが、比較的一定であり、これは、より高等
な、より複雑な生物に同様に投影され得る、ということを示す。言い換えれば、
推定または拡張し得るＤＮＡ配列の実証済の組合せから、より複雑なゲノムの分
析に対する本発明の算法により、しかしながら、有効なＤＢＰの設計の目的をと
もなって、その中の特定の配列を知ることができる。さらに、大型生物、例えば
ディー・メラノガステル(D. melanogaster)の全ゲノムが分かれば、それらはさ
らに、ヒトを含めた高等生物のゲノムの分析のための鍵を提供する。

【０１１１】前記のようにＤＢＰは、標準タンパク質合成技術を用いて築造し得るし、また
は標準遺伝子コードを用いて、その発現がＤＢＰである遺伝子を特殊化し、構築
するための基礎として用い得る。

【０１１２】そのようにして設計されるタンパク質は、ＤＮＡ標的配列との正確且つ緊密な
結合を必要とするあらゆる適用に用い得る。例えば、ＤＢＰは、本発明によれば
、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性と結合され得る。その結果生じた分子を標的Ｄ
ＮＡと結合すると、前記のＤＮＡを、ＤＢＰ結合部位から固定置換で切断し得る
。

【０１１３】同様に、標的ＤＮＡ配列がプロモーターである場合には、結合すると所定の遺
伝子、あるいはそのプロモーターの制御下の遺伝子の発現を変える（即ち、増強
し、減衰し、または終結さえする）よう作用するプロモーター特異的ＤＢＰを生
成し得る。

【０１１４】別の適用としては、ＤＢＰは、固体支持体に結合される場合は、特定のＤＮＡ
配列を結合するよう設計し得る。このような固体支持体としては、スチレンビー
ズ、アクリルアミドウエルプレートまたはガラス基質が挙げられる。

【０１１５】前記の特定の適用を、ならびに本発明により考え得る全範囲の適用を実現する
ために、ＤＢＰは、任意の長さの前および／または後ドメインアミノ酸配列の付
加的特徴を含むよう前記した設計を行うことができる。この例としては、例えば
塩基性ＤＢＰとエンドヌクレアーゼとの、またはレポーターとの、またはＤＰＢ
が固体支持体に結合され得る配列との結合が挙げられる。したがって、本発明は、以下の形態の長さの３ｎ（ここで、ｎ≧１）塩基対の予
定標的二本鎖ＤＮＡ配列と結合するＤＢＰを含む：ＮＨ₂−Ｘ_0-m−ＺｉＦ₁−［｛リンカー｝−ＺｉＦ_i］…−［｛リンカー｝−Ｚｉ
Ｆ_n］−Ｘ_0-p−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ₁〜ＺｉＦ_nのそれぞれは、前記の形態のＺＦドメインであり、｛
リンカー｝は前記のようなアミノ酸配列であり、Ｘ_0-mは０〜ｍのアミノ酸の配
列を表し、Ｘ_0-pは０〜ｐのアミノ酸の配列を表す）。ｍおよびｐに関する値、
およびアミノ酸の同定は、所定の適用のためにＤＢＰと結合される特定のタンパ
ク質（単数または複数）またはアミノ酸配列（単数または複数）により確定され
る。

【０１１６】本発明のさらに別の実施態様では、特定のＺＦモチーフ内の２つのシステイン
および２つのヒスチジンアミノ酸と錯体を形成するＺｎ⁺²原子は、Ｃｏ⁺²または
Ｃｄ⁺²原子により置換され得るので、したがって、「コバルトフィンガー」また
は「カドミウムフィンガー」を作る。

【０１１７】表２に示した規則（「規則組Ａ」）は、ＺＦ−ＤＮＡ認識における最適組合せ
のための「第一選択」規則とみなされる。しかしながら、表１または表３のカラ
ムＢ（「規則組Ｂ」）に示したように、有用なＺＦ−ＤＮＡ錯体を生成し得るＤ
ＮＡ結合タンパク質の設計に重要であると予測される多数の代替的ＡＡ組合せが
存在することは、強調されるべきである。

【０１１８】

【表１１】

【０１１９】

【表１２】

【０１２０】論争のための完全S. cerevisiaeゲノムの精査−各遺伝子のコード領域に対し
て設計されるＤＢＰ染色体遺伝子遺伝子中の最適ＤＮＡ配列ＤＢＰ中の特定アミノ酸ＤＢＰ結合エネルギー結合エネルギー対擬似結合エネルギーの比

【０１２１】

【表１３】

【０１２２】

【表１４】

【０１２３】論争のための完全C. elegans ゲノムの精査−各遺伝子のコード領域に対して
設計されるＤＢＰ染色体遺伝子遺伝子中の最適ＤＮＡ配列ＤＢＰ中の特定アミノ酸ＤＢＰ結合エネルギー結合エネルギー対擬似結合エネルギーの比

【０１２４】参考文献 1. Miller, J., McLachlan, A.D. and Klug, A. (1985) EMBO J. 4, 1609-1614.
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【図面の簡単な説明】

【図１】種々の既知のＤＢＰ中のＺＦドメインの列を示す図である。

【図２】標的ＤＮＡトリプレットと単一ＺＦドメインとの間の相互作用を示す模式図で
ある。

【図３】９塩基の標的ＤＮＡ列と３ドメインＤＢＰとの間の相互作用を示す模式図であ
る。

【図４】即時ＤＢＰ設計工程が実行されるコンピューターシステムのブロック流れ図で
ある。

【図５】図４のコンピュータープログラムブロック（２）がさらに分解されるブロック
流れ図である。

【図６Ａ】図５のブロッキング断片へのゲノム処理ファイルブロック（２）がさらに分解
されるブロック流れ図である。

【図６Ｂ】図５のブロッキング断片へのゲノム処理ファイルブロック（２）がさらに分解
されるブロック流れ図である。

【図６Ｃ】図５のブロッキング断片へのゲノム処理ファイルブロック（２）がさらに分解
されるブロック流れ図である。

【図６Ｄ】図５のブロッキング断片へのゲノム処理ファイルブロック（２）がさらに分解
されるブロック流れ図である。

【図７Ａ】図５のゲノムブロック（３）に関する設計ＤＢＰがさらに分解されるブロック
流れ図である。

【図７Ｂ】図５のゲノムブロック（３）に関する設計ＤＢＰがさらに分解されるブロック
流れ図である。

【図７Ｃ】図５のゲノムブロック（３）に関する設計ＤＢＰがさらに分解されるブロック
流れ図である。

【図７Ｄ】図５のゲノムブロック（３）に関する設計ＤＢＰがさらに分解されるブロック
流れ図である。

【図７Ｅ】図５のゲノムブロック（３）に関する設計ＤＢＰがさらに分解されるブロック
流れ図である。

【図８】図７のブロック（２２）がさらに分解されるブロック流れ図である。

【図９Ａ】図７のブロック（２４）がさらに分解されるブロック流れ図である。

【図９Ｂ】図７のブロック（２４）がさらに分解されるブロック流れ図である。

【図１０】分析した酵母菌遺伝子中の許容可能な９フィンガーＤＢＰの結合強度の分布を
示すグラフである。

【図１１】分析した酵母菌遺伝子に関して見出された許容可能な９フィンガーＤＢＰの結
合エネルギーの値を示すグラフである。

【図１２】分析した酵母菌遺伝子中のＤＢＰサブサイト（擬似）結合エネルギーの分布を
示すグラフである。

【図１３】図１２に示した分布を非対数様式で示すグラフである。

【図１４】許容可能な９フィンガーＤＢＰに関して、分析した酵母菌遺伝子中の結合エネ
ルギー対サブサイト（擬似）結合エネルギーの比を示すグラフである。

【図１５】酵母菌遺伝子YAR073の300bpプロモーター領域の２７塩基対（bp）フレームの
各々に関する擬似結合エネルギーの値を示すグラフである。

【図１６】酵母菌遺伝子YAR073の300bpプロモーター領域の２７塩基対（bp）フレームの
各々に関する結合エネルギー対サブサイト（擬似）結合エネルギーの比を示すグ
ラフである。

【図１７】分析したC. elegans遺伝子中の許容可能なＤＢＰのサイズの分布を示すグラフ
である。

【図１８】許容可能なＤＢＰに関する分析したC. elegans遺伝子中の結合エネルギー対サ
ブサイト（擬似）結合エネルギーの比を示すグラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年６月３０日（１９９９．６．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の名称】ジンクフィンガークラスのＤＮＡ結合タンパク質の設計方法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］潜在的な核酸結合タンパク質をコードする真核生物遺伝子の超科は、Ｃｙｓ_２ −Ｈｉｓ_２（Ｃ_２Ｈ_２）クラスのジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含有する
。これらの特徴的構造特色を有するタンパク質は、遺伝子発現の調節に重要な役
割を演じる［１−４］。配列比較、突然変異分析および近年の結晶学的研究は、
各フィンガードメインが、原則として、ＤＮＡトリプレット内のいくつかのまた
はすべての３塩基対との接触によりＢ型ＤＮＡの主溝と相互作用することを明示
している。これらの塩基特異性相互作用は、タンパク質ドメインのａ−ヘリック
ス領域［５−１０］の特定位置のアミノ酸（ＡＡ）側鎖により媒介される。

【０００２】１，３００より大きいＺＦモチーフのＡＡ配列が同定されているが、しかし、
正確なＤＮＡ結合部位は２〜３のタンパク質に関してのみ知られている。ＤＮＡ
接触領域に関する利用可能な情報は、主に富グアニン−シトシン鎖［５−９］と
、より少ない富アデニン−チミン部位［１１、１２］に関する。実験データに基
づいて、ＺＦ配列を好ましいＤＮＡ結合部位と関連させる規則に関する最初の提
案が成されている［１３、１４］。しかしながら、ＺＦタンパタ質−ＤＮＡ認識
に関する一般規則は提案されていない。これは、コンピューターモデリング［２
、３、５］も結晶学的分析［７］もＺＦ−ＤＮＡ接触領域における全体的構造変
異性に関する十分な情報を提供していない、という事実のためであると思われる
。

【０００３】異なるＺＦ−ＤＮＡ相互作用に関する特定の接触位置における立体条件を特性
化するための物理的原子−分子モデルを用いる場合、本発明に至る研究の目的は
、ＺＦドメインのＣ_２Ｈ_２クラスに関するＺＦ−ＤＮＡ認識のための一般規則を
確定することであった。この目的が達成されれば、本発明の計画の仕事は、有効
なジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドを設計するための算法、ならびに算
法を用いるコンピューターシステムを開発することであった。これらの目標の達
成は、Ｒｅｂａｒ等やＢｅｅｒｌｉ等［１５、１６］の開示により特性化された
知識である本分野の知識の大きな進展を表す。これら２つの開示は、新規のＤＮ
Ａ結合特異性を有する特定のジンクフィンガーの、ファージ表示系を用いた選択
に関する。他方、本発明の開示は、あらゆる所定のＤＮＡ配列のためのＤＮＡ結
合タンパク質の設計に関する。

【０００４】［発明の概要］本発明はＣ_２Ｈ_２ジンクフィンガーモチーフを介して結合するＤＮＡ結合タン
パク質（複数のＤＢＰまたは個々のＤＢＰ）の設計および明細に向けられる。本
明細書中に記載した研究を基礎にして、このような結合を最適化する一般規則が
確定され、そして最適ＤＮＡ結合特性を有するＤＢＰのクラスを説明する式が構
築されている。さらに、あらゆる所定のＤＮＡ配列に対する高結合親和性を有す
るＤＢＰの設計をもたらす規則に基づいて、プログラムが開発されてきた。最後
に、最適結合を有さないけれども、十分且つ有用なＤＮＡ結合特性を有するＤＢ
Ｐの設計のための規則が確定されている。

【０００５】［発明の詳しい説明］Ｃ_２Ｈ_２ＺＦモチーフのＤＮＡとの結合を支配する一般規則は、１８５１の考
え得るＺＦドメインと、６４の考え得る塩基対トリプレットのすべてを含有する
ＤＮＡモデルとのＤＢＰモデルの相互作用の物理的分子モデリングとの間の相同
についてのデータベース分析の組合せを用いることにより発展された。ＤＢＰモ
デルは、牛乳の半ガロン水差しのサイズおよび形状に近似する。ＤＮＡモデルは
、長さ約４フィート、直径１フィートである。ＤＮＡモデルの軸は水平であり、
回転して６４の塩基対トリプレットの各々を観察し得る。ＤＮＡモデルに関して
出たり入ったりしてＤＢＰモデルを動かすことにより、アミノ酸および核酸接触
を観察し得る。

【０００６】以下の説明において本発明の化学的先例を詳述するが、しかしＤＢＰ−ＤＮＡ
相互作用を支配する一連の規則の完全性は、発明期間中のデータベース分析と物
理的モデリングとの連続した、派生的交錯によってのみ得られた。ＺＦモチーフ
の種々の場所でのアミノ酸の保存および可変性に関する観察は、先ず、ＺＦモチ
ーフの物理的モデルを構築することにより、そして次に、特定のＤＢＰと指定Ｄ
ＮＡｂｐトリプレットとの相互作用を物理的にモデリングすることにより実施さ
れた。物理的モデリングは、データベースのさらなる分析に通じるアミノ酸およ
び核酸相互作用のパターンを示した。データベース分析と物理的モデリングとの
間のこの交錯の反復は、接触パターンの性質の概念上の改善および展開を可能に
した。これらのパターンが出現した時、ＺＦモチーフ中のアミノ酸の系統的変異
が、６４の塩基対トリプレットの各々に関して約束された。ＤＢＰとＤＮＡ間の
相互作用の物理的モデリングは、代替アミノ酸がＺＦモチーフ中に容易に導入さ
れ、その結果生じるタンパク質がＤＮＡに対して物理的にモデリングするため、
有効であった。水素結合、ならびに水および疎水性物質接触が次にモデリングさ
れ、明白に確定され、そして非常に迅速に計数され得る。この物理的モデリング
から、ＤＮＡと特異的に相互作用するＤＢＰの設計のための判定基準を組み入れ
た一連の一般規則が展開された。

【０００７】ＺＦ配列の分析および列の有用性を、図１に示す。ＴＦＩＩＩＡタンパク質は
、物理的測定および修飾、ならびに理論的データ分析の両方に関して、ＺＦタン
パク質のためのモデルとして広範に用いられる。９ジンクフィンガードメインの
各々に関して、この図のＴＦＩＩＩＡアミノ酸配列は、亜鉛結合アミノ酸、２つ
のシステイン（ＣＹＳ）および２つのヒスチジン（ＨＩＳ）が４縦列で整列され
るように並べられた。この整列を成し遂げるためには、種々の場所の配列中にダ
ッシュを挿入して、付加的アミノ酸を有するドメインを提供しなければならない
。同型の整列がＺＦタンパク質ＭＫＲ２およびＫｒｕｐｐｅｌタンパク質に関し
て成されている。ＭＫＲ２配列整列は、非常に密集している。そのＺＦドメイン
が同一サイズのものであるため、いかなる挿入も必要ない。ＴＦＩＩＩＡと比較
して、ＭＫＲ２は、特定の二本鎖ＤＮＡの塩基とのタンパク質のアミノ酸の相互
作用を研究するためのなおさらに均一なモデルとして作用する。本発明に到達す
るために、ＭＫＲ２は、ＤＢＰ−ＤＮＡ相互作用を支配する一般規則を演繹する
ための配列基本として専ら用いられてきた。

【０００８】ＺＦタンパク質Ｚｉｆ２６８からの３つのＺＦおよびコンセンサスＤＮＡ結合
部位を含有する錯体の結晶学的分析は、ＺＦ−Ｂ−ＤＮＡ認識サブサイトの局在
化を同定するのに役立った。突然変異誘発および配列研究結果も結晶構造データ
に適合するため、同一の接触領域が他のＺＦ−ＤＮＡ錯体の相互作用に関与する
ことを期待するのは、合理的である［５、６、８−１０］。したがって、ＺＦタ
ンパク質の以下のＺＦ構成成分は、逆平行ＤＮＡ読み取り工程において重要な役
割を演じる、と考えられる：１）タンパク質のａ−ヘリックス領域の直前のＡＡ
、２）ａ−ヘリックス領域内の三番目残基、即ち定常ロイシンの直前のもの、お
よび３）この領域の６番目の残基、即ち不変ヒスチジンの直前のもの、である。

【０００９】これらの構成成分は、式１で示された一般化ＺＦ配列（ａ−ヘリックスおよび
ｂ−構造領域に下線を施してある）中のそれぞれＺ_３、Ｚ_２およびＺ_１として下
記に示される：

【００１０】（配列番号１）式１Ｙ／ＦＸＣＸ_２−４ＣＧ／ＤＫ／ＲＸＦＸＺ_３ＸＸＺ_２ＬＸＺ_１ＨＸ_３−５ＨＴ
／ＳＧ／ＥＸ_０−２ＥＫ／ＲＰ β／構造領域 α−ヘリックス（式中、Ｘはアミノ酸であり、Ｘ_２−４は２〜４アミノ酸長のペプチドであり、
Ｘ_３−５は３〜５アミノ酸長のペプチドであり、Ｘ_０−２は０〜２アミノ酸長の
ペプチドであり、そしてＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔおよ
びＹは標準一文字コードによる特定のアミノ酸を示す）。「／」により分けられ
た文字の対は、その位置が指定された２つの特定のアミノ酸のいずれかにより満
たされ得ることを示す。

【００１２】５’−Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−３’ ＣＯＯＨ−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−ＮＨ_２Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体の結晶学的研究も、接触基が相互作用する方法の指
標を示した。ＰａｖｌｅｔｉｃｈとＰａｂｏ［７］は、Ｚｉｆ２６８が主溝中の
コードＤＮＡ鎖の塩基との１１の重要な水素結合（Ｈ結合）を形成する、と推論
した。最初の接触位置（前記の位置の指示を参照）の２つのアルギニン残基は、
グアニンのＮ７およびＯ６原子と水素結合を作る。３つのアルギニン残基は、同
一方法で、第三接触位置のグアニンと水素結合する。さらに、この位置の各アル
ギニン残基は、ａ−ヘリックスの第二残基として生じるアスパラギン酸のカルボ
キシレート基との水素結合、塩橋相互作用を生成する。Ｚｉｆ２６８の第二ＺＦ
の中央接触位置のヒスチジン残基のＮδ原子は、グアニンのＮ７またはＯ６原子
に水素結合を与える。ＺＦポリペプチド−ＤＮＡ錯体中のグアニンとの相互作用
におけるアルギニンおよびヒスチジン残基の役割は、特定部位の突然変異誘発の
実験により確証される［５、６、９、１４］。対応するオペレーター部位と錯化
されるラムダおよびファージ４３４リプレッサーのＤＮＡ結合ドメインの結晶学
的研究は、グアニンはリシン、アスパラギン、グルタミンおよびセリン残基によ
ってもＨ結合され得る、ということを明示した［１７、１８］。おそらく、残り
の極性ＡＡ（トレオニンおよびチロシン）は、グアニンと類似の結合を形成し得
る。

【００１３】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体のフィンガー１および３では、第二（中央）の重要
な位置が、ＤＮＡの対応する領域のシトシンと接触しないグルタミン酸により占
められる［７］。しかしながら、ＺＦタンパク質−ＤＮＡ結合検定は、天然結合
部位において、この相互作用がグルタミン酸とアスパラギン酸に関しては生じな
いことを示している［５、６、９、１４、１９］。ＤｅｓｊａｒｌａｉｓとＢｅ
ｒｇ［１４］は、シトシンとアスパラギン酸との間の相互作用に関するＨ結合式
を提案した。その著者等は、シトシンとの相互作用におけるアスパラギン酸また
はグルタミン酸に対する選択が第三接触位置（Ｚ_３）におけるグルタミンまたは
アルギニンの、そして第二位置（Ｚ_２）におけるセリンまたはアスパラギン酸の
存在による、と強調した。Ｎａｒｄｅｌｌｉ等［５］の突然変異誘発実験は、シ
トシンがグルタミン残基と相互作用し得る、ということを明示する。これは、同
様の極性基を有するアスパラギンに関しても言える。シトシンは、セリンおよび
トレオニン残基中のヒドロキシル酸素原子とも当然Ｈ結合を作り得る。

【００１４】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体中のチミンは、認識工程に関与するとは思えない。
しかしながら、ラムダリプレッサー、ＤＮＡ結合ドメインＤＮＡおよびエングレ
イルドホメオドメイン−ＤＮＡ錯体の結晶構造研究、ならびにＺＦタンパク質−
ＤＮＡ結合検定は、チミンが非極性残基（アラニン、ロイシン、イソロイシン、
バリン）との疎水性接触および極性ＡＡ（リシン、アルギニン、グルタミン）と
のＨ結合の両方を成し得ることを実証する［８、１１、１４、１７、２０］。

【００１５】ラムダおよびファージ４３４リプレッサー、対応するオペレーター部位を有す
るＤＮＡ結合ドメイン錯体のＸ線結晶学的試験は、アデニン塩基がグルタミンと
の２つのＨ結合を形成する、即ち、１）グルタミン側鎖のアミドＮＨ_２基はアデ
ニンのＮ７原子にＨ結合を供与し、そして２）アミドＯ原子はＮ６原子からＨ結
合を受け入れることを明示した［１７、１８］。同様のＨ結合は、２つのホメオ
ドメイン錯体のアデニンおよびアスパラギン残基間に見出されている［２０、２
１］。ＺＦタンパク質−ＤＮＡ結合検定も、ＺＦ接触位置において、アデニンが
グルタミンおよびアスパラギンとの強い相互作用を作ることを示す［８、１１、
１２、１４］。グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボン酸基がグルタミン
およびアスパラギンアミドＯ原子の場合と同様にＨ結合を受容し得るＯ原子を有
することを考慮すると、アデニンはグルタミンおよびアスパラギン酸と単一水素
結合を形成し得ると考えてもよい。実際、ＬｅｔｏｖｓｋｙとＤｙｎａｎ［１９
］は、部位特異的突然変異誘発研究において、ＺＦの中央接触位置にグルタミン
酸残基を含有する転写因子Ｓｐ１は、野生型コンセンサス認識部位（−ＧＣＧ−
）より３倍だけまたはそれより弱くアデニン置換変異体（−ＧＡＧ−）と結合す
る、ということを示している。さらに、ＤｅｓｊａｒｌａｉｓとＢｅｒｇ［１４
］およびＢｅｒｇ［８］は、アデニンは（Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ錯体中のグアニ
ンと同様に）、ヒスチジン残基と１つのＨ結合を作り得ると考えている。ヒスチ
ジンだけでなくその他の極性アミノ酸（アルギニン、リシン、チロシン、セリン
およびトレオニン）もアデニンの原子Ｎ７とＨ結合を形成し得るとおもわれる。

【００１６】１，８５１の登録を含有する潜在的なＺＦタンパク質ドメインのデータベース
が集められている。このデータベースをコンピューターで用いて、ＺＦドメイン
間の相同を観察し得る。

【００１７】数年前、Ｓｅｅｍａｎ等［２２］は、単一Ｈ結合は、多数の縮重を生じるので
、あらゆる特定の塩基対を独自に同定するためには不適切であると結論した。ア
スパラギンまたはグルタミンがアデニンと結合し、そしてアルギニンがグアニン
と結合する場合、主溝で生じるように、認識の忠実性は２つのＨ結合を用いて達
成され得る、と彼等は提案した。

【００１８】前記の結果に基づいて、本明細書中に記載したモデルを用いて、以下のＡＡの
ＺＦ接触位置での塩基認識を検査することは合理的であった：１）グアニン−Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ２）シトシン−Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ３）チミン−Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ４）アデニン−Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｓ、Ｔプラスチック空間充填原子−分子およびイオンモデル［２３、２４］が、ＺＦ
−ＤＮＡ錯体模造物を築造するために用いられてきた。これらの分子モデルは、
高分子物質のモデリングに非常に適したそれらのコネクター、それらの便宜な尺
度（１ｃｍ＝１Å＝０．１ｎｍ）およびそれらの改良された理論的パラメーター
の並外れた堅固さのために、選択された。１００°および１０５°の結合角を有
する四面体炭素原子、二面体酸素原子（１２０°）および四面体リン原子（１０
２°および１１８°）の新モジュールは、Ｂ−ＤＮＡモデルにおけるデオキシリ
ボース縮みおよび糖−リン酸塩鎖配座の正確なモデリングを保持した。ＤＢＰモ
デル中のペプチド結合は、炭素原子（結合角１１６°、１２０．５°および１２
３．５°）および窒素原子（１２２°および１１９°）の特定のモジュールを互
いに固定することにより模造された。亜鉛イオンは、ＺＦヒスチジンおよびシス
テイン残基のＮおよびＳ原子モジュールに四面体的に固定される球（Ｒ＝０．８
５ｃｍ）によりモデル中に表された。側方固定ＤＢＰモデルを伴う長水平３４塩
基Ｂ型ＤＮＡモデルが、ドッキング実験のために用いられた。

【００２０】Ｚｉｆ２６８ペプチド−ＤＮＡ錯体のプラスチック分子モデルが、結晶学的デ
ータを基礎にして組み立てられた［７］。ＺＦ−ＤＮＡ主鎖接触物および主溝中
のＡＡおよび塩基間のＨ結合の模造後、Ｚｉｆ２６８の全体的整列はＤＮＡ鎖と
逆平行である、ということが確証された。最も安定なＺＦ−ＤＮＡ非特異的相互
作用は、ホスホジエステル酸素原子と、Ｚｎ^２＋イオンに固定された最初の不変
ヒスチジン残基との間のＨ結合であると思われる。二次ｂ鎖上の保存アルギニン
も、一次ＤＮＡ鎖上のホスホジエステル酸素原子と接触する。しかしながら、Ｚ
ｉｆ２６８のフィンガー２および３は、３−ｂｐサブサイトに関する等価リン酸
塩と接触するが、一方、フィンガー１Ｈ結合は一ヌクレオチドによりシフトされ
る。アルギニンおよびセリン残基により作られる別の４つのＺＦ−ＤＮＡ主鎖接
触は、ＺＦモジュール構造に関してより不規則である。

【００２２】Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶構造中に観察された認識位置の６つのグアニン−Ａ
Ａ接触のうち、５つがアルギニンにより作られ、１つだけがヒスチジンにより作
られた、ということは注目に値する。このヒスチジン−グアニン相互作用が中心
特定位置の１つだけであった、ということは、一層興味深い。アルギニンと比較
してヒスチジンのサイズがより小さいことを考慮すると、中央位置がグアニンと
より大きいアルギニン残基との間の接触を妨げる立体的束縛を有するが、しかし
２つのＨ結合を形成するその能力のために、後者の対合はエネルギー的に好都合
であるに違いないと考えられ得る。異なる認識位置の空間的状態を調べるために、一次鎖中に、１）トリプレットＧ
ＧＧおよび２）ａ）第一のＺｎ結合ヒスチジンの側基、およびｂ）重要なＡＡト
リプレットＲ_１Ｒ_２Ｒ_３およびＲ_１Ｈ_２Ｒ_３に関する基を有するＺＦα−ヘリッ
クスタンパク質断片（α−ヘリックス直前のＡＡを含む）のモデルを含有するＢ
−ＤＮＡモデルが築造された。α−ヘリックス断片のモデルは、ホスホジエステ
ル酸素原子をヒスチジン残基と接合するＨ結合の模造によりＢ−ＤＮＡモデルに
固定された。次に、特定の塩基−ＡＡ接触がこれらの錯体で検査された。錯体Ｇ
ＧＧ−Ｒ_１Ｈ_２Ｒ_３のみが、Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶構造に見出される重要な
Ｈ結合の距離に対応する位置に接触基を含有する、ということが明らかにされた
。錯体ＧＧＧ−Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３は立体的に望ましくなく、外側接触位置ではグアニ
ンおよびアルギニンが２つのＨ結合により接合され得るが、しかし中央位置では
、このような対は、限定空間のために含有され得ない、ということを分子モデリ
ングは明示する。物理的モデルから得られる観察は、中心接触位置におけるいくつかのＡＡ−塩基
接触に対する立体的束縛の想定を確証した。錯体Ｇ_１Ｇ_２Ｇ_３−Ｒ_１Ｈ_２Ｒ_３の
場合、グアニンＮ７およびＯ６原子から対応するＡＡのＣ_ａ原子までの以下の概
算距離が確定されている：Ｇ_１Ｎ７−Ｒ_１＝７Å、Ｇ_１Ｏ６−Ｒ_１＝８Å、Ｇ_２Ｎ７−Ｈ_２＝５．５Å、Ｇ_２Ｏ６Ｈ_２＝６．５Å、Ｇ_３Ｎ７−Ｒ_３＝８Åおよび
Ｇ_３Ｏ６−Ｒ_３＝７Å。

【００２５】他方で、ＺＦα−ヘリックス領域のＮ末端のＤＮＡ主鎖への固定は、むしろ緩
く且つ可変性で、したがって、第三接触位置のＣ_α原子および対応するＡＡに関
する比較的大きい再配列を可能にする。後者接触位置は、この位置のＣ_α原子が
主固定場所からより遠く（ヒスチジン残基に結合されるホスホジエステル原子か
ら約１０，５Å）、この位置における対応するＡＡはα−ヘリックスの一部では
ない、という事実によって望ましい。最も重要な知見は、前記の環境のために、
第三接触部位の重要なＡＡは明らかに、対応する塩基対平面において非常に異な
る位置を占め得る、というものである。これは、この残基が、ある錯体中で、相
補的ＤＮＡ鎖の塩基と非常に密接し得ることを意味する。このような幾何学的形
状の外見に関する理由の１つは、Ｂ−ＤＮＡの典型的右手らせんねじれが、一次
鎖上の主塩基よりさらに接近可能な第三接触部位の核酸第二鎖上に相補的塩基を
作るためである。分子モデルは明らかに、第三の、そして部分的には第二の接触
位置でも、このＤＮＡ鎖がＺＦ−核酸認識工程に関与し得る、ということを示す
。Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ結晶錯体では、ＤＮＡ一次鎖のみに結合される各ＺＦド
メインのα−ヘリックスは、塩基対の平面に関して約４５°の角度で傾けられる
［７］。第二ＤＮＡ鎖が、第三および第二接触位置を包含する重要なＨ結合を介
して、読み取り工程に関与する場合、α−ヘリックス軸の方向は、塩基対平面に
対してさらに垂直である必要がある。

【００２９】表１では、一次鎖上の所定のＤＮＡトリプレットの各ヌクレオチドに関して、
主（カラムＡ）および代替的（カラムＢ）塩基結合ＡＡが示されている。特異性
および親和性はともに、カラムＡ中に残基を含入する際に考慮された。Ｓｅｅｍ
ａｎ等［２２］によりすでに提案されたように、認識の忠実度は、それらが主溝
のより大きい位置を占め、そしてピリミジンより多くの水素結合部位を提供する
ために、プリン塩基（グアニンおよびアデニン）の場合に、より良好に保持され
る。したがって、最強のＡＡ相互作用は、各々が２つの水素結合によりグアニン
またはアデニンに結合する、アルギニン、グルタミンおよびアスパラギンの相互
作用であると考えられる。アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよび
グルタミンの親和性は、しばしば、カルボキシレートまたはアミド酸素原子とＤ
ＮＡ主鎖、ホスホジエステル酸素原子との間の水橋の形成により増強された。フ
ァンデルワールス相互作用は比較的弱いが、しかしそれらは、疎水性ＡＡ（アラ
ニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）によるチミンメチル基の認識にあ
る役割を演じ得る。

【００３０】表１に示したように、多数のＺＦ−ＤＮＡ錯体において、一次ＤＮＡ鎖のヌク
レオチドトリプレットにおける塩基認識は、一次鎖を介して完全に起こり得るわ
けではなく、一次および相補的ＤＮＡ鎖の両方との同時結合によるか、あるいは
専ら相補的鎖による。相補的ＤＮＡ鎖からの「助け」を用いない場合、いくつか
のトリプレットの場合には、認識工程を実現するためには、重要なＡＡの一次Ｄ
ＮＡ鎖のヌクレオチドとの結合は非常に弱い。考え得るすべてのＡＡ置換が、Ｚ
_１−Ｚ_３位置における相互作用の強度に関して検査された。一次鎖上の２つより
少ない水素結合を有するドメインは、不安定であると考えられた。

【００３４】トリプレットの第一ヌクレオチドがチミンであり、そしてＨ結合の数が最低で
ある場合でも、１）Ｚ_３位置のＡＡと第三接触位置におけるアデニンおよび相補
的チミンとの間の２つのＨ結合の形成、ならびに２）おそらくは、第二接触位置
におけるチミンとセリンまたはトレオニンとの間の単一Ｈ結合は、ＴＴＮトリプ
レットでも十分な親和性を有するＺＦタンパク質を結合し得ることを意味する。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【表２】

【００３９】コドンＺ１Ｚ１水素結合水接触疎水性接触カラムＡカラムＢ凡例表中、／は、代替的アミノ酸を分け、下付文字を有さないＸは、一次鎖とのそのすべての相互作用を有し、Ｘ_１は、一次鎖との多少の相互作用および相補的鎖との多少の相互作用を有
し、Ｘ_２は、相補的鎖と相互作用を有し、Ｘ_３は、一次および相補的鎖の両方との相互作用を有し、 −は、アミノ酸と塩基との間の１つの水素結合であり、＝は、アミノ酸と塩基との間の２つの水素結合であり、 ^＊は、アミノ酸と、主鎖のホスホジエステル酸素原子との間の水橋を介した
１つの水素結合であり、＃は、アミノ酸と塩基との間の１つ又はそれ以上のファンデルワールス接触
であって、（）中のアミノ酸は、１つまたは２つのその他の考え得るタンパク質−ＤＮ
Ａ認識相互作用が存在しない場合の一次鎖の塩基との相互作用を有する。

【００４０】

【表３】

【００４１】

【表４】

【００４２】凡例表中、／は、代替的アミノ酸を分け、下付文字を有さないＸは、一次鎖とのそのすべての相互作用を有し、Ｘ_１は、一次鎖との多少の相互作用および相補的鎖との多少の相互作用を有
し、Ｘ_２は、相補的鎖と相互作用を有し、Ｘ_３は、一次および相補的鎖の両方との相互作用を有し、 −は、アミノ酸と塩基との間の１つの水素結合であり、＝は、アミノ酸と塩基との間の２つの水素結合であり、 ^＊は、アミノ酸と、主鎖のホスホジエステル酸素原子との間の水橋を介した
１つの水素結合であり、＃は、アミノ酸と塩基との間の１つ又はそれ以上のファンデルワールス接触
であって、（）中のアミノ酸は、１つまたは２つのその他の考え得るタンパク質−ＤＮ
Ａ認識相互作用が存在しない場合の一次鎖の塩基との相互作用を有する。

【００４３】

【表５】

【００４４】

【表６】

【００４５】凡例表中、／は、代替的アミノ酸を分け、下付文字を有さないＸは、一次鎖とのそのすべての相互作用を有し、Ｘ_１は、一次鎖との多少の相互作用および相補的鎖との多少の相互作用を有
し、Ｘ_２は、相補的鎖と相互作用を有し、Ｘ_３は、一次および相補的鎖の両方との相互作用を有し、 −は、アミノ酸と塩基との間の１つの水素結合であり、＝は、アミノ酸と塩基との間の２つの水素結合であり、 ^＊は、アミノ酸と、主鎖のホスホジエステル酸素原子との間の水橋を介した
１つの水素結合であり、＃は、アミノ酸と塩基との間の１つ又はそれ以上のファンデルワールス接触
であって、（）中のアミノ酸は、１つまたは２つのその他の考え得るタンパク質−ＤＮ
Ａ認識相互作用が存在しない場合の一次鎖の塩基との相互作用を有する。

【００４６】

【表７】

【００４７】

【表８】

【００４８】表中、／は、代替的アミノ酸を分ける。

【００４９】

【表９】

【００５０】

【表１０】

【００５２】カラムＡ規則は、６個のＨ結合、０個の水接触および０個の疎水性接触を有し
、評価エネルギー（５ｘ６）＋（２ｘ０）＋（１ｘ０）＝３０の最強トリプレッ
ト認識から、２個の水素結合、０個の水接触および２個の疎水性接触を有し、評
価エネルギー（５ｘ２）＋（２ｘ０）＋（１ｘ２）＝１２までの範囲である。カ
ラムＡ規則は普通は、位置Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３におけるちょうど１または２個
のアミノ酸の選択を有する。カラムＢ規則は、比較すると、位置Ｚ_１、Ｚ_２およ
びＺ_３の各々における３個の考え得るアミノ酸から、位置Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３の各々において異なる接触配列で、１８個という多くのアミノ酸までを有する。
カラムＢエネルギーの評価において、位置Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３における３つの
アミノ酸の多数の異なる群分けが認められる。最小エネルギーは、３個の水素結
合、０個の水接触および０個の疎水性接触を有し、評価エネルギー（５ｘ３）＋
（２ｘ０）＋（１ｘ０）＝１５である。これらの組合せに関する最大エネルギー
評価は、平均で、３個の水素結合および２個の水接触または２個の疎水性接触で
あり、評価エネルギー（５ｘ３）＋（２ｘ２）＋（１ｘ０）＝１９から（５ｘ３
）＋（２ｘ０）＋（１ｘ２）＝１７まで下がる。したがって、カラムＢ規則は、
エネルギー範囲が３０から下がって１２までのカラムＡ規則より狭いエネルギー
範囲（即ち１９から下がって１５まで）を有する。カラムＢ規則に関する狭エネ
ルギー範囲は、６４の異なる規則が６４のカラムＡ規則と同様にはエネルギーを
基礎にして識別しないことを意味する。

【００５３】例えば、表２に記載したように、ＤＮＡ塩基トリプレットグアニン−シトシン
−シトシン（ＧＣＣ）と最適に結合するＤＢＰは、トリプレットとの結合を生じ
させるタンパク質の部分が、配列Ｚ_３ＸＸＺ_２ＬＸＺ_１Ｈ（配列番号２）（式中
、Ｚ_１はＤＮＡトリプレットの位置１と相互作用するアルギニンであり、Ｚ_２は
ＤＮＡトリプレットの位置２と相互作用するグルタミンまたはグルタミン酸であ
り、Ｚ_３はＤＮＡトリプレットの位置３と相互作用するアルギニンであり、Ｘは
任意のアミノ酸であり、Ｌはロイシンであり、そしてＨはヒスチジンである）を
有するセグメントをその中に含有するＺＦドメインであるものである。

【００５４】表１または３に記載したように（所定のコドンに関するＺ_１、Ｚ_２およびＺ_３位置のための「カラムＢ」登録を参照）、ＤＮＡ塩基トリプレットグアニン−シ
トシン−シトシン（ＧＣＣ）と、最適にでない場合、有効に結合するＤＢＰは、
トリプレットとの結合を生じさせるタンパク質の部分が、配列Ｚ_３ＸＸＺ_２ＬＸ
Ｚ_１Ｈ（式中、Ｚ_１はＤＮＡトリプレットの位置１と相互作用するヒスチジン、
リシン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンおよびトレオニンから成
る群から選択されるアミノ酸であり、Ｚ_２はＤＮＡトリプレットの位置２と相互
作用するグルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、ア
ルギニン、ヒスチジンおよびリシンから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｚ_３はＤＮＡトリプレットの位置３と相互作用するグルタミン、アスパラギン、
グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リシン、チロシン、セリンおよび
トレオニンから成る群から選択されるアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であ
り、Ｌはロイシンであり、そしてＨはヒスチジンである）を有するセグメントを
その中に含有するＺＦドメインであるものである。

【００５５】もちろん、中間体親和性のＤＢＰ、即ち、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３接触アミノ酸
が「Ａ」および「Ｂ」規則の組合せにより選択されるものが設計され得ることが
理解される。例えば、トリプレットＧＣＣとの結合のためのＺＦドメイン内のセ
グメントＺ_３ＸＸＺ_２ＬＸＺ_１Ｈ（配列番号２）中では、Ｚ_１はアルギニンであ
り、Ｚ_２はグルタミンまたはグルタミン酸であり、そしてＺ_３はグルタミン、ア
スパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、リシン、チロシン、
セリンおよびトレオニンから成る群から選択され得る。

【００５７】

【式２】ＮＨ_２−ＺｉＦ_ｃ−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ_ｃは次式：Ｙ／ＦＸＣＸ_２−４ＣＧ／ＤＫ／ＲＸＦＸＺ_３ＸＸＺ_２ＬＸＺ_１ＨＸ_３−５Ｈ（
配列番号１の部位１〜２０）（ここで、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はＤＮＡトリプレ
ットの３つの塩基に対応するために表１、２または３から選択されるアミノ酸で
あり、式の残りの構成成分は式Ｉの説明中で前記されたのと同様である）の形態のＺＦドメインである）。

【００６１】

【式３】ＮＨ_２−ＺｉＦ_１−｛リンカー｝−ＺｉＦ_２−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ_１およびＺｉＦ_２は、６つの塩基の第一および第二トリプレット
と結合するよう、ＺｉＦ_ｃに関して上に示されているのと同様に、設計されたＺ
Ｆドメインであり、そして｛リンカー｝は以下のパターン：Ｔ／ＳＧ／ＥＸ_０−２ＥＫ／ＲＰ（配列番号１の部位２１〜２６）（式中、構成成分は式１に前記したのと同様である）に一致するアミノ酸配列である）。

【００６３】

【式４】ＮＨ_２−ＺｉＦ_１−｛リンカー｝−ＺｉＦ_２−｛リンカー｝−…−｛リンカー｝
−ＺｉＦ_ｎ−ＣＯＯＨにより示される場合には、ＤＢＰ設計は回帰的に延長され、そして必要なＤＢＰ
は以下の配列：

【００６４】

【式５】ＮＨ_２−ＺｉＦ_１−｛リンカー｝−ＺｉＦ_２−｛リンカー｝−…−｛リンカー｝
−ＺｉＦ_ｎ−｛リンカー｝−ＺｉＦ_ｎ＋１−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ_ｎ＋１は、塩基対の標的配列のｎ番目＋１トリプレットと結合す
るために、ＺｉＦ_ｃに関して前記したのと同様に、設計されるＺＦドメインであ
る）により特定される。

【００６７】規則の適用は、次に、ＺＦドメインの一組の数ｎ_ｄを含有するＤＢＰの設計に
拡張され得るが、この場合、ＤＰＢは所定のＤＮＡ配列内の３ｎ_ｄヌクレオチド
の標的伸長物と結合する。ヌクレオチドの標的３ｎ_ｄ伸長、ならびにＤＢＰ中の
ｎ_ｄドメインの収集および序列は、ＤＰＢおよび標的ＤＮＡ配列に関する結合エ
ネルギーが、スクリーニングされる全ＤＮＡ分子内の３ｎ_ｄヌクレオチドのあら
ゆる伸長を有する組数ｎ_ｄのＺＦドメインを含有するＤＢＰのあらゆる対合に関
して考え得る最高であるようなものである。

【００６８】したがって、第一に重要な本発明の実施態様は、あらゆる長さのＤＮＡ配列に
関するこのようなＤＢＰの設計方法である。該方法は、前記の規則を、所望の特
性を有する独特のＤＢＰを確定するためのｎ_ｄＺＦドメインを含有するＤＢＰに
対するそれらの親和性により配列内の３ｎ_ｄヌクレオチドの考え得るすべてのセ
グメントをスクリーニングし、等級付けする手段と組合せて用いる。

【００６９】さらに特に、本発明は、所定の遺伝子内の標的ＤＮＡ配列と選択的に結合する
リンカー配列により連結される多ＺＦドメインを有するＤＢＰの設計方法であっ
て、前記ＺＦドメインの各々が次式：Ａ_１ＸＣＸ_２−４ＣＡ_２Ａ_３ＸＦＸＺ_３ＸＸＺ_２ＬＸＺ_１ＨＸ_３−５Ｈ（
配列番号３）を、そして前記リンカーの各々が次式：Ａ_４Ａ_５Ｘ_０−２ＥＡ_６Ｐ（配列番号４）（式中、（ｉ）Ｘはあらゆるアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘ_２−４は２〜４アミノ
酸長のペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘ_３−５は３〜５アミノ酸長のペプチドであ
り、（ｉｖ）Ｘ_０−２は０〜２アミノ酸長のペプチドであり、（ｉｖ）Ａ_１はフ
ェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、（ｖ）Ａ_２はグリシン
およびアスパラギン酸から成る群から選択され、（ｖｉ）Ａ_３はリシンおよびア
ルギニンから成る群から選択され、（ｖｉｉ）Ａ_４はトレオニンおよびセリンか
ら成る群から選択され、（ｖｉｉｉ）Ａ_５はグリシンおよびグルタミン酸から成
る群から選択され、（ｉｘ）Ａ_６はリシンおよびアルギニンから成る群から選択
され、（ｘ）Ｃはシステインであり、（ｘｉ）Ｆはフェニルアラニンであり、（
ｘｉｉ）Ｌはロイシンであり、（ｘｉｉｉ）Ｈはヒスチジンであり、（ｘｉｖ）
Ｅはグルタミン酸であり、（ｘｖ）Ｐはプロリンであり、そして（ｘｖｉ）Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は塩基接触アミノ酸である）を有する方法であって、以下の：（ａ）スクリーニングされるゲノムを決定する工程と、（ｂ）結合のためのゲノム中の標的ＤＮＡ配列を選択する工程と、（ｃ）ジンクフィンガードメインの数をｎ_ｄに決定する工程と、（ｄ）ｎ_２が以下の関係：ｎ_ｚ＝３ｎ_ｄを用いて確定される第一のルーチンを用いて、標的ＤＮＡ配列を、各々のブロッ
クがｎ_ｚヌクレオチドを含有するヌクレオチドブロックに分ける工程と、（ｅ）本明細書の表１〜３に記載したＡ規則および／またはＢ規則により、
標的遺伝子配列の最初の５’ヌクレオチドから数えた場合に工程（ｄ）からの最
初のヌクレオチドブロックと結合して、ブロック特異的ＤＢＰを生じるＤＢＰの
各ＺＦドメインにＺ_１、Ｚ_２およびＺ_３の塩基接触アミノ酸を割り当てて、そし
て各々次式：結合エネルギー_ドメイン＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ_２Ｏ接触数）＋
（疎水性接触数）を用いて確定される結合エネルギー、即ち結合エネルギーの生成物としてのこの
ような各ブロック特異的ＤＢＰの各ＺＦドメインの「結合エネルギー_ブロック」
、ポリペプチドの全ジンクフィンガードメインの「結合エネルギー_ドメイン」を
計算する工程と、（ｆ）第二のルーチンを用いて工程（ｄ）からのＤＢＰをさらに分けて、３
つのＺＦドメインを有するさらに分割されたＤＢＰを生成する工程と、（ｇ）第三のルーチンを用いてゲノムに対して工程（ｆ）からのさらに分割
されたＤＢＰをスクリーニングして、ゲノム中の各々のさらに分割されたＤＢＰ
に関するゲノム中の結合部位の数を確定して、そして以下の式：結合エネルギー_部位ｎ＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ_２Ｏ接触数）＋（
疎水性接触数）を用いて、このような部位の各々に関して結合エネルギーを割り当てる工程と、（ｈ）以下の式：Ｒ_ｂ＝結合エネルギー_ブロック／工程（ｇ）からの全てのさらに分割され
たＤＢＰに関する全結合エネルギー_部位ｎの和を用いて、工程（ｅ）からの各ヌクレオチドブロック特異的ＤＢＰに関して第四
のルーチンを用いて結合エネルギーの比Ｒ_ｂを計算する工程と、（ｉ）ｎ_ｄ≧４である場合の各々のさらに分割されたＤＢＰに関して工程（
ｆ）〜（ｈ）を反復する工程と、（ｊ）ｎ_２ヌクレオチドを含有する標的ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドブロ
ックに関して工程（ｄ）〜（ｉ）を反復する工程と、（ｋ）工程（ｈ）から得られたＲ_ｂ数値を順位化する工程と、（ｌ）許容可能なＲ_ｂ値を有するＤＢＰを選択する工程とから成る算法を包含する方法に関する。

【００７１】１）ＤＢＰのＲ_ｂ数値が標的ＤＮＡ配列と結合する工程（ｈ）の全ＤＢＰに関
して最高数値である前記の設計方法。

【００７２】２）工程（ｈ）で確定されるＤＢＰＲ_ｂ数値が少なくとも１０，０００であ
る前記の方法。

【００７３】３）ＺＦドメインの数ｎ_ｄが９である前記の方法。

【００７４】４）工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ_１、Ｚ_２およびＺ_３に塩
基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ａから選択される前記の方法。

【００７５】本発明は、所定の遺伝子内の標的ＤＮＡ配列と選択的に結合するリンカー配列
により連結される多ＺＦドメインを有するＤＢＰを設計するためのコンピュータ
ーシステムであって、前記ＺＦドメインの各々が次式：Ａ_１ＸＣＸ_２−４ＣＡ_２Ａ_３ＸＦＸＺ_３ＸＸＺ_２ＬＸＺ_１ＨＸ_３−５Ｈ（
配列番号３）を、そして前記リンカーの各々が次式：Ａ_４Ａ_５Ｘ_０−２ＥＡ_６Ｐ（配列番号４）（式中、（ｉ）Ｘはあらゆるアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘ_２−４は２〜４アミノ
酸長のペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘ_３−５は３〜５アミノ酸長のペプチドであ
り、（ｉｖ）Ｘ_０−２は０〜２アミノ酸長のペプチドであり、（ｉｖ）Ａ_１はフ
ェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、（ｖ）Ａ_２はグリシン
およびアスパラギン酸から成る群から選択され、（ｖｉ）Ａ_３はリシンおよびア
ルギニンから成る群から選択され、（ｖｉｉ）Ａ_４はトレオニンおよびセリンか
ら成る群から選択され、（ｖｉｉｉ）Ａ_５はグリシンおよびグルタミン酸から成
る群から選択され、（ｉｘ）Ａ_６はリシンおよびアルギニンから成る群から選択
され、（ｘ）Ｃはシステインであり、（ｘｉ）Ｆはフェニルアラニンであり、（
ｘｉｉ）Ｌはロイシンであり、（ｘｉｉｉ）Ｈはヒスチジンであり、（ｘｉｖ）
Ｅはグルタミン酸であり、（ｘｖ）Ｐはプロリンであり、そして（ｘｖｉ）Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は塩基接触アミノ酸である）を有する方法であって、以下の：（ａ）スクリーニングされるゲノムを決定する工程と、（ｂ）結合のためのゲノム中の標的ＤＮＡ配列を選択する工程と、（ｃ）ＺＦフィンガードメインの数をｎ_ｄに決定する工程と、（ｄ）ｎ_ｚが以下の関係：ｎ_ｚ＝３ｎ_ｄを用いて確定される第一のルーチンを用いて、標的ＤＮＡ配列を、各々のブロッ
クがｎ_ｚヌクレオチドを含有するヌクレオチドブロックに分ける工程と、（ｅ）本明細書の表１〜３に記載したＡ規則および／またはＢ規則により、
標的遺伝子配列の最初の５’ヌクレオチドから数えた場合に工程（ｄ）からの最
初のヌクレオチドブロックと結合して、ブロック特異的ＤＢＰを生じるＤＢＰの
各ＺＦドメインにＺ_１、Ｚ_２およびＺ_３の塩基接触アミノ酸を割り当てて、そし
て各々次式：結合エネルギー_ドメイン＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ_２Ｏ接触数）＋
（疎水性接触数）を用いて確定される結合エネルギー、即ち結合エネルギーの生成物としてのこの
ような各ブロック特異的ＤＢＰの各ＺＦドメインの「結合エネルギー_ブロック」
、ＤＢＰの全ドメインの「結合エネルギー_ドメイン」を計算する工程と、（ｆ）第二のルーチンを用いて工程（ｄ）からのＤＢＰをさらに分けて、３
つのＺＦドメインを有するさらに分割されたＤＢＰを生成する工程と、（ｇ）第三のルーチンを用いてゲノムに対して工程（ｆ）からのさらに分割
されたＤＢＰをスクリーニングして、ゲノム中の各々のさらに分割されたＤＢＰ
に関するゲノム中の結合部位の数を確定して、そして以下の式：結合エネルギー_部位ｎ＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ_２Ｏ接触数）＋（
疎水性接触数）を用いて、このような部位の各々に関して結合エネルギーを割り当てる工程と、（ｈ）以下の式：Ｒ_ｂ＝結合エネルギー_ブロック／工程（ｇ）からの全てのさらに分割され
たＤＢＰに関する全結合エネルギー_部位ｎの和を用いて、工程（ｅ）からの各ヌクレオチドブロック特異的ＤＢＰに関して第四
のルーチンを用いて結合エネルギーの比Ｒ_ｂを計算する工程と、（ｉ）ｎ_ｄ≧４である場合の各々のさらに分割されたＤＢＰに関して工程（
ｆ）〜（ｈ）を反復する工程と、（ｊ）ｎ_ｚヌクレオチドを含有する標的ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドブロ
ックに関して工程（ｄ）〜（ｉ）を反復する工程と、（ｋ）工程（ｈ）から得られたＲ_ｂ数値を順位化する工程と、（ｌ）許容可能なＲ_ｂ値を有するＤＢＰを選択する工程とから成る算法を含む設計手段を包含するコンピューターシステムにも関する。

【００７６】本発明において、設計方法とコンピューターシステムとの両方について前述の
（ｈ）で定められたＲ_ｂは、１０，０００の下限を有する。好ましくはＲ_ｂは１
０^６より大きい。

【００７７】本発明のこの観点の好ましい実施態様を以下に示す：１）ＤＢＰのＲ_ｂ数値が標的ＤＮＡ配列と結合する工程（ｈ）の全ＤＢＰに関
して最高数値である前記のコンピューターシステム。

【００７８】２）工程（ｈ）で確定されるＤＢＰＲ_ｂ数値が少なくとも１０，０００であ
る前記のコンピューターシステム。

【００７９】３）ＺＦドメインの数ｎ_ｄが９である前記のコンピューターシステム。

【００８０】４）工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ_１、Ｚ_２およびＺ_３の塩
基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ａから選択される前記のコンピ
ューターシステム。

【００８４】図５のブロッキング断片へのゲノム処理ファイルブロック（２）を、図６に詳
細に示す。１１から下って３までのすべてのｎ_ｄに関して、ゲノム説明体ファイ
ル（１２）およびゲノムＤＮＡ配列ファイル（３２）が読み取られ、非分類化断
片ファイル（７）に変換される。この同一非分類化断片ファイル（１４）は、コ
ンピューター製造者により提供される分類ファンクション（１３）により分類化
断片ファイル（１５）に変換される。同一分類化断片ファイル（３０）は読み取
られ、そして最終的にＤＢＰサイズブロッキングファイル（２２）に変換される
。

【００８５】図５のゲノムのためのＤＢＰ設計ブロック（３）を、図７でより詳細に示す。
１１から下って３までのｎ_ｄに対応するゲノム説明体ファイル（３）、遺伝子特
徴ファイル（７）、ゲノムＤＮＡ配列ファイル（９）およびＤＢＰサイズブロッ
クファイル（３７）は読み取られ、ゲノムＤＮＡを先ず遺伝子に、次にゲノムの
ための最適ＤＢＰ設計のファイル（３８）に変換されるために用いられる。変換
および設計工程は、ゲノム中のすべての遺伝子に関して成される。

【００８７】図７の「ブロック断片の結合エネルギーを計算する」ブロック（２４）を、図
９でより詳細に詳述する。種々のｎ_ｄの種々のＤＢＰに算法を適用することにより、ｎ_ｄが９である値が算
法の最良の出発点であり、即ち、その工程は９フィンガーＤＢＰに関する探索を
用いて開始されるべきであることが、実験的に決定された。これは、種々のＤＢ
Ｐを評価するのに用いられる選択判定基準Ｒ_ｂに関してより良好に理解され得る
。短いＤＢＰ、例えばｎ_ｄ＝４または５のものでは、すべての結合エネルギー_ド _メインの生成物として幾何学的に増大する結合エネルギー_ブロックは有意に低く
、そして結合エネルギー_部位ｎは比較的大きい。しかしながら、ｎ_ｄが増大する
と、Ｒ_ｂの分子は劇的に増大するが、一方、「バックグラウンド」または「ノイ
ズ」を表す分母は有意に変化しないことが観測された。したがって、ｎ_ｄ＝９の
場合は、不適当なコンピューターニーズの可能性を生じることなく、結合の高親
和性および特異性の保証を提供する。

【００８８】しかし、本発明は、ｎ_ｄ≦９のＤＢＰの設計に限定されない、ということが強
調されるべきである。そのことに関しては、ｎ_ｄ＝９は最良の出発点であること
が見出されているが、しかし所定の状況に関する最良のＤＢＰは、標的ＤＮＡ配
列の長さにもかかわらず、ｎ_ｄ＜９であるものにし得るとも考えられる。本発明
の概念は、必要な場合には、あらゆる長さのＤＢＰの設計に適用され得る。

【００９１】当該算法の中心部分は、許容可能なｎ_ｄ−フィンガー部位（例えば、９−フィ
ンガーＤＢＰに関しては２７−塩基セグメント）を見出す場合、類似部位が存在
するかを知るための全ゲノム中のすべての他のｎ_ｄ−フィンガー部位に対する探
索である。これが実際に成される場合には、最高Ｒ_ｂ値を有するＤＢＰが選択さ
れる。さらに、算法は、所定の９−フィンガー部位に対して全ゲノム中に等価の
８−フィンガー、７−フィンガー、６−フィンガー、５−フィンガーおよび４−
フィンガーサブサイトが存在するかを知るために点検する。許容可能でない９−
フィンガー部位が見出された場合には、算法は、適切な８−フィンガー部位に関
して探索する。必要な場合には、探索は、７−フィンガー部位等に関して、許容
可能ＤＢＰ結合部位が見つかるまで、続けられる。

【００９３】所定のｎ_ｚ−塩基部位がゲノム中の他の場所に生じるか否かを算法が検出する
方法は、部位に関してＢ木を調べることによる。全ゲノムは、ｎ_ｄ−フィンガー
部位の各々に関して処理される。本算法は、無数の断片を分類し、併合するため
の手段を含有し、最後に、すべての異なるフィンガーサイズに関してブロック断
片のすべての等級化一覧が生成される。

【００９４】実施例１ＤＢＰに関する典型的探索およびその設計方法の例を、以下に示す。それは、
１００ヌクレオチド（即ち、Ｎ＝１００）の標的ＤＮＡ配列を結合するための９
−フィンガーＤＢＰ（即ち、ｎ_ｄ＝９）に関するスクリーニングを包含する。配
列は、全１００ヌクレオチド配列において、すべての２７−ヌクレオチド配列に
関して、位置１から開始して、即ち、１−２７、２−２８、３−２９等で、スク
リーニングされる。これが成されたら、９−フィンガーを３−フィンガーセクシ
ョンに、即ち１−３、２−４、３−５等に分解する。算法は、結合の相対強度に
関して精査し、それを探す。その考えは、ＤＢＰ結合対サブサイト結合の比、Ｒ
_ｂを最大にし、したがって最大数のサブサイトと相互作用する９量体のものを排
除する。

【００９５】本発明の算法を、以下の実施例で説明するように、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃ
ｅｒｖｉｓｉａｅ）およびシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノムに
適用した。

【００９６】実施例２本算法を、酵母菌ゲノムのスクリーニングに適用した。それぞれ１１０および
４４７遺伝子を含有する酵母菌の２本の染色体をプロセッシングした。各遺伝子
に関して、算法は、サブサイト結合エネルギーの最低合計を有するｎ_ｄ−フィン
ガー配列を選択した。酵母菌では、３−フィンガーブロック断片の数は、ほとん
ど最大（即ち、最大４^１２に対して４^９）である。虫ゲノム（実施例３参照）で
は、３−フィンガーブロック配列は、無条件に最大である。酵母菌では、４−フ
ィンガーブロック配列は数が大きいが、しかし５−フィンガーブロック配列の集
団は比較的小さい。虫では、４−フィンガーブロック配列は５−フィンガーブロ
ック配列より数が大きいが、しかし後者は酵母菌と比較して、数がより大きい。
将来、虫からヒトに進行する場合、４−フィンガーブロック配列は飽和に近く（
即ち、４^１２に近く）なり得る、と予測され得る。

【０１００】図１１は、許容可能な９フィンガーＤＢＰの結合エネルギー（結合エネルギー
_ブロック）が１０^１１〜１０^１３結合単位間で均一に分布されることを示す。

【０１０１】図１２は、擬似サブサイト結合エネルギー（結合エネルギー_部位）の合計の分
布が、１０^６〜１０^８結合単位の範囲でそれ自体均一であることをを示す。

【０１０２】図１３は、図１２の非対数バージョンである。それは、許容可能な９−フィン
ガーＤＢＰのほとんどが５ｘ１０^６未満の擬似サブサイト結合エネルギーを有す
ることを示す。

【０１０３】図１４は、図１１の値対図１２の値の比を出すことにより作成された、９フィ
ンガーＤＢＰに関するＲ_ｂのグラフである。このチャートは、許容可能な９フィ
ンガーＤＢＰのＤＢＰ結合強度対擬似サブサイト相互作用の結合エネルギーの合
計の比が１０_４から１０_６まで変わることを示す。

【０１０４】本発明の分析道具は、単一酵母菌遺伝子ＹＡＲ０７３の、特にコード領域のす
ぐ上流のプロモーターの３００ｂｐ領域のさらなる分析にも用いた。遺伝子のこ
の部分の各２７塩基フレームに関するサブサイト結合エネルギー（ＳＢＥ）の全
合計を確定した。結果を、図１５にグラフで示す。一次結合エネルギー（ＢＥ）
も確定し、相関が、ＳＢＥ値とＢＥ：ＳＢＥの比（Ｒ_ｂ）の値との間に見出され
た。さらに（図１６）、Ｒ_ｂ値のプロットのピークが同一遺伝子の転写因子の足
跡（別個の試験で確定）に対応する、ということも分かった。

【０１０５】実施例３Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの１００遺伝子への本発明の算法の適用は、本システムが
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対すると同様にＣ．ｅｌｅｇａｎｓに対してもうま
く適用し得ることを示した。１００Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の分析結果を、表
５に示す。

【０１０６】図１７では、分析したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の１つに関して、５−フィン
ガーＤＢＰだけが設計され得ることが分かる。別の遺伝子に関しては、７−フィ
ンガーＤＢＰだけが設計され得た。これら２つの遺伝子、２および３２は、９−
量体が設計され得るものに対してそれらの遺伝子（１００のうち９８を除外した
）に関してだけの分析結果を示すため、表５には示していない。あらゆる場合に
、図１７に示した結果は、全Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムの分析に関する予測と一
致し、即ち、５−から９−フィンガーＤＢＰの分布はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
とは多少異なる。

【０１０７】図１８は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関して図１４で示したのと同一の、Ｃ
．ｅｌｅｇａｎｓに関する分析を示す。図１８は、図１４で観察されたのと同様
のＲ_ｂ値分布を示す。

【０１０９】本発明の算法は生物体の全ゲノムに対する探索を包含するが、しかし、本発明
の試験結果は、所定の生物のゲノムについての完全知識の欠如が、その生物に関
するＤＢＰの設計に対する本発明の適用への障害とはならないことを、強く示し
ている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（単細胞生物）およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（
多細胞生物）に関して本明細書中に示した試験で得られたブロック配列の知識を
用いて、高等真核生物の系に許容される配列の妥当な見積もりを成し得る、と予
測できる。

【０１１０】例えば、酵母菌および虫に関する本発明の試験は、ゲノム「ノイズ」、この状
況においては擬似結合部位エネルギーが、比較的一定であり、これは、より高等
な、より複雑な生物に同様に投影され得る、ということを示す。言い換えれば、
推定または拡張し得るＤＮＡ配列の実証済の組合せから、より複雑なゲノムの分
析に対する本発明の算法により、しかしながら、有効なＤＢＰの設計の目的をと
もなって、その中の特定の配列を知ることができる。さらに、大型生物、例えば
ディー・メラノガステル（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の全ゲノムが分かれ
ば、それらはさらに、ヒトを含めた高等生物のゲノムの分析のための鍵を提供す
る。

【０１１５】前記の特定の適用を、ならびに本発明により考え得る全範囲の適用を実現する
ために、ＤＢＰは、任意の長さの前および／または後ドメインアミノ酸配列の付
加的特徴を含むよう前記した設計を行うことができる。この例としては、例えば
塩基性ＤＢＰとエンドヌクレアーゼとの、またはレポーターとの、またはＤＰＢ
が固体支持体に結合され得る配列との結合が挙げられる。したがって、本発明は、以下の形態の長さの３ｎ（ここで、ｎ≧１）塩基対の予
定標的二本鎖ＤＮＡ配列と結合するＤＢＰを含む：ＮＨ_２−Ｘ_０−ｍ−ＺｉＦ_１−［｛リンカー｝−ＺｉＦ_ｉ］…−［｛リンカー｝
−ＺｉＦ_ｎ］−Ｘ_０−ｐ−ＣＯＯＨ（式中、ＺｉＦ_１〜ＺｉＦ_ｎのそれぞれは、前記の形態のＺＦドメインであり、
｛リンカー｝は前記のようなアミノ酸配列であり、Ｘ_０−ｍは０〜ｍのアミノ酸
の配列を表し、Ｘ_０−ｐは０〜ｐのアミノ酸の配列を表す）。ｍおよびｐに関す
る値、およびアミノ酸の同定は、所定の適用のためにＤＢＰと結合される特定の
タンパク質（単数または複数）またはアミノ酸配列（単数または複数）により確
定される。

【０１１６】本発明のさらに別の実施態様では、特定のＺＦモチーフ内の２つのシステイン
および２つのヒスチジンアミノ酸と錯体を形成するＺｎ^＋２原子は、Ｃｏ^＋２ま
たはＣｄ^＋２原子により置換され得るので、したがって、「コバルトフィンガー
」または「カドミウムフィンガー」を作る。

【０１１８】

【表１１】

【０１１９】

【表１２】

【０１２０】論争のための完全Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムの精査−各遺伝子のコード
領域に対して設計されるＤＢＰ染色体遺伝子遺伝子中の最適ＤＮＡ配列ＤＢＰ中の特定アミノ酸ＤＢＰ結合エネルギー結合エネルギー対擬似結合エネルギーの比

【０１２１】

【表１３】

【０１２２】

【表１４】

【０１２３】論争のための完全Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムの精査−各遺伝子のコード領域に
対して設計されるＤＢＰ染色体遺伝子遺伝子中の最適ＤＮＡ配列ＤＢＰ中の特定アミノ酸ＤＢＰ結合エネルギー結合エネルギー対擬似結合エネルギーの比

【０１２４】参考文献１．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ａ．Ｄ．ａｎｄＫｌｕｇ，Ａ
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Ｌｅｔｔ．２８３，２３−２６．７．Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，Ｎ．Ｐ．ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２５２，８０９−８１７．８．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８９，１１１０９−１１１１０．９．Ｋｒｉｗａｃｋｉ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｔ．Ａ．ａｎｄＣａｒａ
ｄｏｎｎａ，Ｊ．Ｐ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８９，９７５９−９７６３．１０．Ｊａｃｏｂｓ，Ｇ．Ｈ．（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１，４５０７−４
５１７．１１．Ｇｏｇｏｓ，Ｊ．Ａ．，Ｈｓｕ，Ｔ．，Ｂｏｌｔｏｎ，Ｊ．ａｎｄｋａ
ｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，１９５１−１９５
５．１２．Ｆａｉｒａｌｌ，Ｌ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，
Ａ．Ａ．ａｎｄＲｈｏｄｅｓ，Ｄ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
６，３４９−３６６．１３．Ｋｌｅｖｉｔ，Ｒ．Ｅ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３，１３６７
ａｎｄ１３９３．１４．Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．（１９９２
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，７３４５−７３４９
．１５．Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅ
ｎｔＮｏ．５，７８９，５３８，Ａｕｇｕｓｔ４，１９９８．１６．Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇａｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．，
ａｎｄＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１４６２８−１４６３３．１７．Ｊｏｒｄａｎ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９８８）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２４２，８９３−８９９．１８．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ａ．Ｋ．，Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｄｒｏｔｔａ
ｒ，Ｍ．，Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．ａｎｄＨａｒｒｉｓｏｎＳ．Ｃ．（１９８
８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，８９９−９０７．１９．Ｌｅｔｏｖｓｋｙ，Ｊ．，Ｄｙｒａｎ，Ｗ．Ｓ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７，２６３９−２６５３．２０．Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｌａｎ
ｃｏ，Ｅ．，Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ｂ．ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９
０）Ｃｅｌｌ６３，５７９−５９０．２１．Ｗｏｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｖｅｒｓｈｏｎ，Ａ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９９１）Ｃｅｌｌ６
７，５１７−５２８．２２．Ｓｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄＲｉｃ
ｈ，Ａ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ７３，
８０４−８０８．２３．Ｍｉｋｅｌａａｒ，Ｒ．−Ｈ．，Ｂｒｕｓｋｏｖ，Ｖ．Ｉ．ａｎｄＰｏ
ｌｔｅｖ，Ｖ．Ｉ．（１９８５）Ｎｅｗｐｒｅｃｉｓｉｏｎｓｐａｃｅ−ｆ
ｉｌｌｉｎｇａｔｏｍｉｃ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｏｄｅｌｓ，Ｐｕｓｈｃ
ｈｉｎｏ．２４．Ｍｉｋｅｌｓａａｒ，Ｒ．（１９８６）ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ４，１６２−１６３．

【図面の簡単な説明】

【図１】種々の既知のＤＢＰ中のＺＦドメインの列を示す図である。ＴＦＩＩＩＡフィ
ンガー１〜９は、それぞれ、配列表中の配列番号２０７〜２１５として示される
。ＸｅｎｏｐｕｓＸｆｉｎフィンガー３１は、配列番号２１６として示される
。ＡＤＲ１フィンガーは、配列番号２１７として示される。ＭＫＲ２フィンガ
ー１〜９は、それぞれ配列番号２１８〜２２６として示され、そしてＫｒｕｐｐ
ｅｌフィンガー１〜５は、それぞれ配列番号２２７〜２３１として示される。

【図１５】酵母菌遺伝子ＹＡＲ０７３の３００ｂｐプロモーター領域の２７塩基対（ｂｐ
）フレームの各々に関する擬似結合エネルギーの値を示すグラフである。

【図１６】酵母菌遺伝子ＹＡＲ０７３の３００ｂｐプロモーター領域の２７塩基対（ｂｐ
）フレームの各々に関する結合エネルギー対サブサイト（擬似）結合エネルギー
の比を示すグラフである。

【図１７】分析したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子中の許容可能なＤＢＰのサイズの分布を示
すグラフである。

【図１８】許容可能なＤＢＰに関する分析したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子中の結合エネル
ギー対サブサイト（擬似）結合エネルギーの比を示すグラフである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１Ｂ

【補正方法】追加

【補正の内容】

【図１Ｂ】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月２４日（２００１．１０．２４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１１８】

【表１１】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１１９】

【表１２】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２１】

【表１３】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１２２】

【表１４】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図２】

【手続補正７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図３】

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図４】

【手続補正９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図５】

【手続補正１０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６Ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図６Ａ】

【手続補正１１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図６Ｂ】

【手続補正１２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６Ｃ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図６Ｃ】

【手続補正１３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６Ｄ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図６Ｄ】

【手続補正１４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７Ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７Ａ】

【手続補正１５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７Ｂ】

【手続補正１６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７Ｃ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７Ｃ】

【手続補正１７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７Ｄ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７Ｄ】

【手続補正１８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７Ｅ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７Ｅ】

【手続補正１９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図８】

【手続補正２０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９Ａ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図９Ａ】

【手続補正２１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図９Ｂ】

【手続補正２２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１０】

【手続補正２３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１１】

【手続補正２４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１２】

【手続補正２５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１３】

【手続補正２６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１４】

【手続補正２７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１５】

【手続補正２８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１６】

【手続補正２９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１７】

【手続補正３０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者フェルドマン，リチャード，ジェー．アメリカ合衆国 20855−1019 メリーランド，ダーウッド，ミルクリークドライヴ 17800 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA05 HA01 4H006 AA02 AC90 4H045 AA10 AA20 BA17 CA10 CA20 CA30 CA40 CA50 EA50 5B046 AA00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】所定の遺伝子内の標的ＤＮＡ配列と選択的に結合するリンカ
ー配列により連結される多ＺＦドメインを有するＤＢＰの設計方法であって、前
記ＺＦドメインの各々が次式： A₁XCX_2-4CA₂A₃XFXZ₃XXZ₂LXZ₁HX_3-5H を、そして前記リンカーの各々が次式： A₄A₅X_0-2EA₆P （式中、（ｉ）Ｘはあらゆるアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘ_2-4は２〜４アミノ酸
長のペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘ_3-5は３〜５アミノ酸長のペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ_0-2は０〜２アミノ酸長のペプチドであり、（ｉｖ）Ａ₁はフェニルア
ラニンおよびチロシンから成る群から選択され、（ｖ）Ａ₂はグリシンおよびア
スパラギン酸から成る群から選択され、（ｖｉ）Ａ₃はリシンおよびアルギニン
から成る群から選択され、（ｖｉｉ）Ａ₄はトレオニンおよびセリンから成る群
から選択され、（ｖｉｉｉ）Ａ₅はグリシンおよびグルタミン酸から成る群から
選択され、（ｉｘ）Ａ₆はリシンおよびアルギニンから成る群から選択され、（
ｘ）Ｃはシステインであり、（ｘｉ）Ｆはフェニルアラニンであり、（ｘｉｉ）
Ｌはロイシンであり、（ｘｉｉｉ）Ｈはヒスチジンであり、（ｘｉｖ）Ｅはグル
タミン酸であり、（ｘｖ）Ｐはプロリンであり、そして（ｘｖｉ）Ｚ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃は塩基接触アミノ酸である）を有する方法であって、以下の：（ａ）スクリーニングされるゲノムを決定する工程と、（ｂ）結合のためのゲノム中の標的ＤＮＡ配列を選択する工程と、（ｃ）ＺＦドメインの数をｎ_dに決定する工程と、（ｄ）ｎ_zが以下の関係：ｎ_z＝３ｎ_d を用いて確定される第一のルーチンを用いて、標的ＤＮＡ配列を、各々のブロッ
クがｎ_zヌクレオチドを含有するヌクレオチドブロックに分ける工程と、（ｅ）本明細書の表１〜３に記載したＡ規則および／またはＢ規則により、
標的遺伝子配列の最初の５’ヌクレオチドから数えた場合に工程（ｄ）からの最
初のヌクレオチドブロックと結合して、ブロック特異的ＤＢＰを生じるＤＢＰの
各ＺＦドメインにＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てて、そして
各々次式：結合エネルギー_{ト゛メイン}＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎水性接触数）を用いて確定される結合エネルギー、即ち結合エネルギーの生成物としてのこの
ような各ブロック特異的ＤＢＰの各ＺＦドメインの「結合エネルギー_{フ゛ロック}」、ＤＢＰの全ＺＦドメインの「結合エネルギー_{ト゛メイン}」を計算する工程と、（ｆ）第二のルーチンを用いて工程（ｄ）からのＤＢＰをさらに分けて、３
つのＺＦドメインを有するさらに分割されたＤＢＰを生成する工程と、（ｇ）第三のルーチンを用いてゲノムに対して工程（ｆ）からのさらに分割
されたＤＢＰをスクリーニングして、ゲノム中の各々のさらに分割されたＤＢＰ
に関するゲノム中の結合部位の数を確定して、そして以下の式：結合エネルギー_部位 _n＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎
水性接触数）を用いて、このような部位の各々に関して結合エネルギーを割り当てる工程と、（ｈ）以下の式：Ｒ_b＝結合エネルギー_{フ゛ロック}／工程（ｇ）からの全てのさらに分割されたＤＢＰに関する全結合エネルギー_部位 _nの和を用いて、工程（ｅ）からの各ヌクレオチドブロック特異的ＤＢＰに関して第四
のルーチンを用いて結合エネルギーの比Ｒ_bを計算する工程と、（ｉ）ｎ_d≧４である場合の各々のさらに分割されたＤＢＰに関して工程（
ｆ）〜（ｈ）を反復する工程と、（ｊ）ｎ_zヌクレオチドを含有する標的ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドブロ
ックに関して工程（ｄ）〜（ｉ）を反復する工程と、（ｋ）工程（ｈ）から得られたＲ_b数値を順位化する工程と、（ｌ）許容可能なＲ_b値を有するＤＢＰを選択する工程とから成る算法を包含する方法。
【請求項２】選択されたＤＢＰが、そのＲ_b数値が標的ＤＮＡ配列と結合
する工程（ｈ）の全ＤＢＰに関して最高数値であるものである請求項１記載の方
法。
【請求項３】工程（ｈ）で確定されるＤＢＰＲ_b数値が少なくとも10,00
0である請求項１記載の方法。
【請求項４】ＺＦドメインの数ｎ_dが９である請求項１記載の方法。
【請求項５】工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ａから選択される請
求項１記載の方法。
【請求項６】工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ｂから選択される請
求項１記載の方法。
【請求項７】工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組ＡおよびＢから選択
される結合である請求項１記載の方法。
【請求項８】所定の遺伝子内の標的ＤＮＡ配列と選択的に結合するリンカ
ー配列により連結される多ＺＦドメインを有するＤＢＰを設計するためのコンピ
ューターシステムであって、前記ＺＦドメインの各々が次式： A₁XCX_2-4CA₂A₃XFXZ₃XXZ₂LXZ₁HX_3-5H を、そして前記リンカーの各々が次式： A₄A₅X_0-2EA₆P （式中、（ｉ）Ｘはあらゆるアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｘ_2-4は２〜４アミノ酸
長のペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘ_3-5は３〜５アミノ酸長のペプチドであり、
（ｉｖ）Ｘ_0-2は０〜２アミノ酸長のペプチドであり、（ｉｖ）Ａ₁はフェニルア
ラニンおよびチロシンから成る群から選択され、（ｖ）Ａ₂はグリシンおよびア
スパラギン酸から成る群から選択され、（ｖｉ）Ａ₃はリシンおよびアルギニン
から成る群から選択され、（ｖｉｉ）Ａ₄はトレオニンおよびセリンから成る群
から選択され、（ｖｉｉｉ）Ａ₅はグリシンおよびグルタミン酸から成る群から
選択され、（ｉｘ）Ａ₆はリシンおよびアルギニンから成る群から選択され、（
ｘ）Ｃはシステインであり、（ｘｉ）Ｆはフェニルアラニンであり、（ｘｉｉ）
Ｌはロイシンであり、（ｘｉｉｉ）Ｈはヒスチジンであり、（ｘｉｖ）Ｅはグル
タミン酸であり、（ｘｖ）Ｐはプロリンであり、そして（ｘｖｉ）Ｚ₁、Ｚ₂およ
びＺ₃は塩基接触アミノ酸である）を有する方法であって、以下の：（ａ）スクリーニングされるゲノムを決定する工程と、（ｂ）結合のためのゲノム中の標的ＤＮＡ配列を選択する工程と、（ｃ）ＺＦドメインの数をｎ_dに決定する工程と、（ｄ）ｎ_zが以下の関係：ｎ_z＝３ｎ_d を用いて確定される第一のルーチンを用いて、標的ＤＮＡ配列を、各々のブロッ
クがｎ_zヌクレオチドを含有するヌクレオチドブロックに分ける工程と、（ｅ）本明細書の表１〜３に記載したＡ規則および／またはＢ規則により、
標的遺伝子配列の最初の５’ヌクレオチドから数えた場合に工程（ｄ）からの最
初のヌクレオチドブロックと結合して、ブロック特異的ＤＢＰを生じるＤＢＰの
各ＺＦドメインにＺ₁、Ｚ₂およびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てて、そして
各々次式：結合エネルギー_{ト゛メイン}＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎水性接触数）を用いて確定される結合エネルギー、即ち結合エネルギーの生成物としてのこの
ような各ブロック特異的ＤＢＰの各ＺＦドメインの「結合エネルギー_{フ゛ロック}」、ＤＢＰの全ＺＦドメインの「結合エネルギー_{ト゛メイン}」を計算する工程と、（ｆ）第二のルーチンを用いて工程（ｄ）からのＤＢＰをさらに分けて、３
つのＺＦドメインを有するさらに分割されたＤＢＰを生成する工程と、（ｇ）第三のルーチンを用いてゲノムに対して工程（ｆ）からのさらに分割
されたＤＢＰをスクリーニングして、ゲノム中の各々のさらに分割されたＤＢＰ
に関するゲノム中の結合部位の数を確定して、そして以下の式：結合エネルギー_部位 _n＝（５ｘ水素結合数）＋（２ｘＨ₂Ｏ接触数）＋（疎
水性接触数）を用いて、このような部位の各々に関して結合エネルギーを割り当てる工程と、（ｈ）以下の式：Ｒ_b＝結合エネルギー_{フ゛ロック}／工程（ｇ）からの全てのさらに分割されたＤＢＰに関する全結合エネルギー_部位 _nの和を用いて、工程（ｅ）からの各ヌクレオチドブロック特異的ＤＢＰに関して第四
のルーチンを用いて結合エネルギーの比Ｒ_bを計算する工程と、（ｉ）ｎ_d≧４である場合の各々のさらに分割されたＤＢＰに関して工程（
ｆ）〜（ｈ）を反復する工程と、（ｊ）ｎ_zヌクレオチドを含有する標的ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドブロ
ックに関して工程（ｄ）〜（ｉ）を反復する工程と、（ｋ）工程（ｈ）から得られたＲ_b数値を順位化する工程と、（ｌ）許容可能なＲ_b値を有するＤＢＰを選択する工程とから成る算法を含む設計手段を包含するコンピューターシステム。
【請求項９】選択されたＤＢＰが、そのＲ_b数値が標的ＤＮＡ配列と結合
する工程（ｈ）の全ＤＢＰに関して最高数値であるものである請求項８記載のコ
ンピューターシステム。
【請求項１０】工程（ｈ）で確定されるＤＢＰＲ_b数値が少なくとも10,
000である請求項８記載のコンピューターシステム。
【請求項１１】ＺＦドメインの数ｎ_dが９である請求項８記載のコンピュ
ーターシステム。
【請求項１２】工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂お
よびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ａから選択される
請求項８記載のコンピューターシステム。
【請求項１３】工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂お
よびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組Ｂから選択される
請求項８記載のコンピューターシステム。
【請求項１４】工程（ｅ）の各ヌクレオチドブロックに関してＺ₁、Ｚ₂お
よびＺ₃の塩基接触アミノ酸を割り当てるための規則が規則組ＡおよびＢから選
択される結合である請求項８記載のコンピューターシステム。