JP2003334080A - 任意のペプチドを植物のタンパク顆粒で蓄積させる方法 - Google Patents
任意のペプチドを植物のタンパク顆粒で蓄積させる方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 任意のペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させ
る方法を提供することを課題とする。さらに、該方法に
用いるためのキットを提供することをも課題とする。 【解決手段】 液胞由来のタンパク顆粒IIに蓄積するイ
ネのグロブリンが液胞移行シグナルを有すると考え、該
液胞移行シグナルの同定を試みた結果、グロブリンの72
番目のロイシン残基から86番目のセリン残基までの15ア
ミノ酸残基をGFPのC末端に付加した融合タンパク質の細
胞内局在は、驚くべきことに、液胞由来のタンパク顆粒
IIではなく、液胞由来ではないタンパク顆粒Iであっ
た。また、該15アミノ酸残基の配列を基に、植物におい
て保存されているQCCXQ（Xは任意のアミノ酸）配列を見
いだした。任意のペプチドにQCCXQを付加することで、
該ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積できることが示唆さ
れる。
る方法を提供することを課題とする。さらに、該方法に
用いるためのキットを提供することをも課題とする。 【解決手段】 液胞由来のタンパク顆粒IIに蓄積するイ
ネのグロブリンが液胞移行シグナルを有すると考え、該
液胞移行シグナルの同定を試みた結果、グロブリンの72
番目のロイシン残基から86番目のセリン残基までの15ア
ミノ酸残基をGFPのC末端に付加した融合タンパク質の細
胞内局在は、驚くべきことに、液胞由来のタンパク顆粒
IIではなく、液胞由来ではないタンパク顆粒Iであっ
た。また、該15アミノ酸残基の配列を基に、植物におい
て保存されているQCCXQ（Xは任意のアミノ酸）配列を見
いだした。任意のペプチドにQCCXQを付加することで、
該ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積できることが示唆さ
れる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、任意のペプチドを
植物の胚乳組織へ蓄積させる方法に関する。
植物の胚乳組織へ蓄積させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】外来遺伝子産物をイネ胚乳組織で、登熟
過程で分解を受けずに高度に発現・蓄積させる方法は、
以下の3つの方法論がこれまでの知見から考えられ、ま
た実際に行われている。一つ目は所望のタンパク質又は
ペプチドをイネ又は他種の種子貯蔵タンパク質の可変部
位に挿入することによって、貯蔵タンパク質の一部とし
て液胞由来のタンパク顆粒II(PB-II)にターゲットさせ
る方法である。二つ目の方法は所望のタンパク質が元々
液胞移行シグナルを持っていない場合、所望のタンパク
質にシグナルペプチドをN末端に付加し、細胞壁アポプ
ラストに分泌させる方法である。三つ目の方法は所望の
タンパク質のN末端にシグナルペプチドを付加し、C末端
にはKDEL（配列番号：１７）又はHDEL（配列番号：１
８）等の既知の小胞体局在化シグナルを付加し、所望の
タンパク質を小胞体に蓄積させる方法である。
過程で分解を受けずに高度に発現・蓄積させる方法は、
以下の3つの方法論がこれまでの知見から考えられ、ま
た実際に行われている。一つ目は所望のタンパク質又は
ペプチドをイネ又は他種の種子貯蔵タンパク質の可変部
位に挿入することによって、貯蔵タンパク質の一部とし
て液胞由来のタンパク顆粒II(PB-II)にターゲットさせ
る方法である。二つ目の方法は所望のタンパク質が元々
液胞移行シグナルを持っていない場合、所望のタンパク
質にシグナルペプチドをN末端に付加し、細胞壁アポプ
ラストに分泌させる方法である。三つ目の方法は所望の
タンパク質のN末端にシグナルペプチドを付加し、C末端
にはKDEL（配列番号：１７）又はHDEL（配列番号：１
８）等の既知の小胞体局在化シグナルを付加し、所望の
タンパク質を小胞体に蓄積させる方法である。
【０００３】イネ胚乳には液胞由来でないタンパク顆粒
PB-I が存在し、主にプロラミンが蓄積する。PB-I は直
接小胞体から生成するため、液胞由来のタンパク顆粒PB
-IIとはその生成過程が大きく異なる。プロラミンのPB-
Iでの蓄積に関し、ワシントン州立大学のグループは、
プロラミンのmRNA が3'の非翻訳領域を介してPB-I上に
輸送され、そこでプロラミンが翻訳されると報告してい
る(Choi et al. Nature 2000, 407: 765-767)。
PB-I が存在し、主にプロラミンが蓄積する。PB-I は直
接小胞体から生成するため、液胞由来のタンパク顆粒PB
-IIとはその生成過程が大きく異なる。プロラミンのPB-
Iでの蓄積に関し、ワシントン州立大学のグループは、
プロラミンのmRNA が3'の非翻訳領域を介してPB-I上に
輸送され、そこでプロラミンが翻訳されると報告してい
る(Choi et al. Nature 2000, 407: 765-767)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、任意の
ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方法を提供する
ことにある。さらに、該方法に用いるためのキットを提
供することをも目的とする。
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、任意の
ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方法を提供する
ことにある。さらに、該方法に用いるためのキットを提
供することをも目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、液胞由来
のタンパク顆粒II(PB-II)に蓄積するイネのグロブリン
が液胞移行シグナルを有すると考え、該液胞移行シグナ
ルの同定を試みた。具体的には、GFPのN末端にダイズ種
子貯蔵タンパク質グリシニンA1aB1b のシグナルペプチ
ドを付加し、またGFPのC末端にはグロブリンのシグナル
ペプチドを除く全長、又は一部を付加した。遺伝子発現
のためのプロモーターはグロブリンのプロモーターを用
い、アグロバクテリウムを介した方法でイネ種子由来の
カルスに感染し、形質転換体を作出した。融合タンパク
質の胚乳組織での細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡を
用いて観察した。
のタンパク顆粒II(PB-II)に蓄積するイネのグロブリン
が液胞移行シグナルを有すると考え、該液胞移行シグナ
ルの同定を試みた。具体的には、GFPのN末端にダイズ種
子貯蔵タンパク質グリシニンA1aB1b のシグナルペプチ
ドを付加し、またGFPのC末端にはグロブリンのシグナル
ペプチドを除く全長、又は一部を付加した。遺伝子発現
のためのプロモーターはグロブリンのプロモーターを用
い、アグロバクテリウムを介した方法でイネ種子由来の
カルスに感染し、形質転換体を作出した。融合タンパク
質の胚乳組織での細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡を
用いて観察した。
【０００６】検討の結果、グロブリンの21番目のグリシ
ニン残基(G21)から111番目のグルタミン残基(Q111)をGF
PのC末端に付加した融合タンパク質の細胞内局在は、驚
くべきことに、液胞由来のタンパク顆粒II(PB-II)では
なく、液胞由来ではないタンパク顆粒I(PB-I)であっ
た。さらに、G21から Q111 までを2つに分け、G21から
R59まで、又はR68 からQ111までをGFPのC末端に付加
し、上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を観察
した。その結果R68 からQ111までをGFPのC末端に付加し
た融合タンパク質がタンパク顆粒I(PB-I)に局在した。
さらに、R68 からQ111までを再び2分割し、L72 からS86
まで、又は A92から S104までをGFPのC末端に付加し、
上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を観察し
た。その結果、L72 からS86までの15アミノ酸残基をGFP
のC末端に付加した融合タンパク質がタンパク顆粒I(PB-
I)に局在した。
ニン残基(G21)から111番目のグルタミン残基(Q111)をGF
PのC末端に付加した融合タンパク質の細胞内局在は、驚
くべきことに、液胞由来のタンパク顆粒II(PB-II)では
なく、液胞由来ではないタンパク顆粒I(PB-I)であっ
た。さらに、G21から Q111 までを2つに分け、G21から
R59まで、又はR68 からQ111までをGFPのC末端に付加
し、上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を観察
した。その結果R68 からQ111までをGFPのC末端に付加し
た融合タンパク質がタンパク顆粒I(PB-I)に局在した。
さらに、R68 からQ111までを再び2分割し、L72 からS86
まで、又は A92から S104までをGFPのC末端に付加し、
上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を観察し
た。その結果、L72 からS86までの15アミノ酸残基をGFP
のC末端に付加した融合タンパク質がタンパク顆粒I(PB-
I)に局在した。
【０００７】また、該15アミノ酸残基の配列は、イネプ
ロラミン遺伝子ファミリーで保存された領域（Matsukaw
a et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999, 63, 18
51-1858）と高い相同性があることが判明した。特に2つ
の連続するシステイン残基とその前後のグルタミン残基
（QCCQQ）（配列番号：１４）が16.6 kDaプロラミン
（λRP16）と13kDaプロラミン（pProl17、λRM7）で保
存されている。10kDaプロラミン(λRP10)ではグルタミ
ンがメチオニンに置換した配列QCCMQ（配列番号：１
５）となっている。トウモロコシの種子貯蔵タンパク質
15kDaゼインとエンバクの種子貯蔵タンパク質アベニン
にも類似の配列、それぞれ、QCCQQ（配列番号：１４）
およびQCCRQ（配列番号：１６）が存在する。それらの
共通配列としてQCCXQ（Xは任意のアミノ酸）（配列番
号：１）を見いだした。上記知見は、この保存された共
通配列QCCXQ（配列番号：１）を、任意のペプチドに付
加することで、該ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積でき
ることを示している。
ロラミン遺伝子ファミリーで保存された領域（Matsukaw
a et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999, 63, 18
51-1858）と高い相同性があることが判明した。特に2つ
の連続するシステイン残基とその前後のグルタミン残基
（QCCQQ）（配列番号：１４）が16.6 kDaプロラミン
（λRP16）と13kDaプロラミン（pProl17、λRM7）で保
存されている。10kDaプロラミン(λRP10)ではグルタミ
ンがメチオニンに置換した配列QCCMQ（配列番号：１
５）となっている。トウモロコシの種子貯蔵タンパク質
15kDaゼインとエンバクの種子貯蔵タンパク質アベニン
にも類似の配列、それぞれ、QCCQQ（配列番号：１４）
およびQCCRQ（配列番号：１６）が存在する。それらの
共通配列としてQCCXQ（Xは任意のアミノ酸）（配列番
号：１）を見いだした。上記知見は、この保存された共
通配列QCCXQ（配列番号：１）を、任意のペプチドに付
加することで、該ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積でき
ることを示している。
【０００８】即ち、本発明は、任意のペプチドを植物の
胚乳組織へ蓄積させる方法に関し、より具体的には、 〔１〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意の
ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方法、 （ａ）（i）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少な
くとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに
蓄積する活性を有するペプチドと（ii）任意のペプチド
との融合ペプチドをコードするDNAを含むベクターを植
物細胞に導入する工程 （ｂ）該植物細胞を植物体に再生させる工程 〔２〕（i）のペプチドが配列番号：２に記載のアミノ
酸配列を有する、〔１〕に記載の方法、 〔３〕（i）のペプチドが配列番号：３に記載のアミノ
酸配列を有する、〔１〕に記載の方法、 〔４〕植物がイネである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに
記載の方法、 〔５〕〔１〕の方法に用いるためのキットであって、下
記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含むキット、 （ａ）（i）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少な
くとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに
蓄積する活性を有するペプチドと（ii）任意のペプチド
との融合ペプチドをコードするDNA （ｂ）（i）のペプチドをコードするDNA （ｃ）（ａ）または（ｂ）のDNAを含むベクター 〔６〕（i）のペプチドが配列番号：２に記載のアミノ
酸配列を有する、〔５〕に記載のキット、 〔７〕（i）のペプチドが配列番号：３に記載のアミノ
酸配列を有する、〔５〕に記載のキット、 〔８〕植物がイネである、〔５〕〜〔７〕のいずれかに
記載のキット、を、提供するものである。
胚乳組織へ蓄積させる方法に関し、より具体的には、 〔１〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意の
ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方法、 （ａ）（i）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少な
くとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに
蓄積する活性を有するペプチドと（ii）任意のペプチド
との融合ペプチドをコードするDNAを含むベクターを植
物細胞に導入する工程 （ｂ）該植物細胞を植物体に再生させる工程 〔２〕（i）のペプチドが配列番号：２に記載のアミノ
酸配列を有する、〔１〕に記載の方法、 〔３〕（i）のペプチドが配列番号：３に記載のアミノ
酸配列を有する、〔１〕に記載の方法、 〔４〕植物がイネである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに
記載の方法、 〔５〕〔１〕の方法に用いるためのキットであって、下
記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含むキット、 （ａ）（i）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少な
くとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに
蓄積する活性を有するペプチドと（ii）任意のペプチド
との融合ペプチドをコードするDNA （ｂ）（i）のペプチドをコードするDNA （ｃ）（ａ）または（ｂ）のDNAを含むベクター 〔６〕（i）のペプチドが配列番号：２に記載のアミノ
酸配列を有する、〔５〕に記載のキット、 〔７〕（i）のペプチドが配列番号：３に記載のアミノ
酸配列を有する、〔５〕に記載のキット、 〔８〕植物がイネである、〔５〕〜〔７〕のいずれかに
記載のキット、を、提供するものである。
【０００９】なお、本発明において、「ペプチド」と
は、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した化合物
を指す。従って、鎖長の長いペプチドである「ポリペプ
チド」や「タンパク質」もまた本発明の「ペプチド」に
含まれる。
は、アミノ酸同士がペプチド結合により結合した化合物
を指す。従って、鎖長の長いペプチドである「ポリペプ
チド」や「タンパク質」もまた本発明の「ペプチド」に
含まれる。
【００１０】本発明において、タンパク顆粒とは種子等
の貯蔵組織に見られる脂質二重膜で囲まれたオルガネラ
を意味し、内部に主に貯蔵タンパク質を蓄積する。イネ
の胚乳には生成の起源の異なる2種類のタンパク顆粒が
存在する。貯蔵タンパク質のグルテリンやグロブリンが
蓄積するタンパク顆粒 (PB-II) は液胞から生成するの
に対し、貯蔵タンパク質のプロラミンが蓄積するタンパ
ク顆粒 (PB-I) は小胞体から直接生成する。PB-II の形
状は不定形であるのに対し、PB-Iは球状顆粒であること
が特徴である。
の貯蔵組織に見られる脂質二重膜で囲まれたオルガネラ
を意味し、内部に主に貯蔵タンパク質を蓄積する。イネ
の胚乳には生成の起源の異なる2種類のタンパク顆粒が
存在する。貯蔵タンパク質のグルテリンやグロブリンが
蓄積するタンパク顆粒 (PB-II) は液胞から生成するの
に対し、貯蔵タンパク質のプロラミンが蓄積するタンパ
ク顆粒 (PB-I) は小胞体から直接生成する。PB-II の形
状は不定形であるのに対し、PB-Iは球状顆粒であること
が特徴である。
【００１１】本発明における「DNA」には、特に断りが
ない限り、その形態に制限はなく、ゲノムDNA、cDNAお
よび化学合成DNAが含まれる。
ない限り、その形態に制限はなく、ゲノムDNA、cDNAお
よび化学合成DNAが含まれる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、任意のペプチドを植物
の胚乳組織へ蓄積させる方法を提供する。本発明の方法
においては、まず、（i）QCCXQ（配列番号：１）のアミ
ノ酸配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタ
ンパク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと（ii）
任意のペプチドとの融合ペプチドをコードするDNAを含
むベクターを植物細胞に導入し、次いで、上記植物細胞
を植物体に再生させる。
の胚乳組織へ蓄積させる方法を提供する。本発明の方法
においては、まず、（i）QCCXQ（配列番号：１）のアミ
ノ酸配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタ
ンパク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと（ii）
任意のペプチドとの融合ペプチドをコードするDNAを含
むベクターを植物細胞に導入し、次いで、上記植物細胞
を植物体に再生させる。
【００１３】本発明における上記（i）のペプチドは、Q
CCXQ（配列番号：１）のアミノ酸配列を少なくとも含
み、かつ、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに蓄
積する活性を有する限り、QCCXQ（配列番号：１）以外
のアミノ酸配列には特に制限はない。該ペプチドは、好
ましくはQCC(Q/M/R)Q（配列番号：２）のアミノ酸配列
を含み、より好ましくは(L/M)(R/Q)(M/Q/R)QCC(Q/M/R)Q
(L/M/Q)(Q/R/M/A)X(V/M/I)（配列番号：３）のアミノ酸
配列を含み、さらに好ましくはLRMQCCQQLQDV（配列番
号：４）のアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはLGLR
MQCCQQLQDVS（配列番号：５）のアミノ酸配列を含む
（ここで、(L/M)、(R/Q)、(M/Q/R)、(Q/M/R)、(L/M/
Q)、(Q/R/M/A)および(V/M/I)は、それぞれ、記載されて
いるアミノ酸残基のうち、どのアミノ酸残基でもよいこ
とを意味している）。
CCXQ（配列番号：１）のアミノ酸配列を少なくとも含
み、かつ、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに蓄
積する活性を有する限り、QCCXQ（配列番号：１）以外
のアミノ酸配列には特に制限はない。該ペプチドは、好
ましくはQCC(Q/M/R)Q（配列番号：２）のアミノ酸配列
を含み、より好ましくは(L/M)(R/Q)(M/Q/R)QCC(Q/M/R)Q
(L/M/Q)(Q/R/M/A)X(V/M/I)（配列番号：３）のアミノ酸
配列を含み、さらに好ましくはLRMQCCQQLQDV（配列番
号：４）のアミノ酸配列を含み、さらに好ましくはLGLR
MQCCQQLQDVS（配列番号：５）のアミノ酸配列を含む
（ここで、(L/M)、(R/Q)、(M/Q/R)、(Q/M/R)、(L/M/
Q)、(Q/R/M/A)および(V/M/I)は、それぞれ、記載されて
いるアミノ酸残基のうち、どのアミノ酸残基でもよいこ
とを意味している）。
【００１４】本発明のペプチドは、天然型蛋白質または
その一部であってもよく、また、これら天然型アミノ酸
配列を改変したものであってもよい。アミノ酸を改変す
る場合において、基となるペプチドの活性を維持したい
場合には、アミノ酸側鎖の性質が近似したアミノ酸へ改
変することが好ましい。アミノ酸側鎖の性質としては、
例えば、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、
V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、
S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、
I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、
Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カ
ルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、
E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げ
ることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標
記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1または複数個
のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ
酸による置換により修飾されたアミノ酸配列がその生物
学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,
D. F.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81,
5662-5666 、Zoller, M. J.& Smith, M. Nucleic Acid
s Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al.,
Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-
6413 ）。
その一部であってもよく、また、これら天然型アミノ酸
配列を改変したものであってもよい。アミノ酸を改変す
る場合において、基となるペプチドの活性を維持したい
場合には、アミノ酸側鎖の性質が近似したアミノ酸へ改
変することが好ましい。アミノ酸側鎖の性質としては、
例えば、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、
V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、
S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、
I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、
Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カ
ルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、
E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げ
ることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標
記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1または複数個
のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ
酸による置換により修飾されたアミノ酸配列がその生物
学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,
D. F.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81,
5662-5666 、Zoller, M. J.& Smith, M. Nucleic Acid
s Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al.,
Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-
6413 ）。
【００１５】アミノ酸配列を改変する方法としては、例
えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et
al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smi
th,M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,
W. et al. (1984) NucleicAcids Res. 12, 9441-945
6、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol.
154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U
SA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 8
5, 2763-2766）が挙げられる。
えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et
al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smi
th,M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,
W. et al. (1984) NucleicAcids Res. 12, 9441-945
6、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol.
154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci U
SA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 8
5, 2763-2766）が挙げられる。
【００１６】このようにして調製されたペプチドが、実
際に、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに蓄積す
る活性を有するか否かは、実施例記載のように、GFPな
どの標識となるタンパク質と該アミノ酸配列との融合タ
ンパク質の細胞内局在を顕微鏡を用いて観察することで
判断することができる。また、該活性のレベルは、標識
となるタンパク質が、GFPなどの蛍光タンパク質であれ
ば、その蛍光強度で測定することができる。
際に、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに蓄積す
る活性を有するか否かは、実施例記載のように、GFPな
どの標識となるタンパク質と該アミノ酸配列との融合タ
ンパク質の細胞内局在を顕微鏡を用いて観察することで
判断することができる。また、該活性のレベルは、標識
となるタンパク質が、GFPなどの蛍光タンパク質であれ
ば、その蛍光強度で測定することができる。
【００１７】本発明における上記（ii）のペプチドとし
ては、特に制限はない。植物の胚乳組織におけるタンパ
ク顆粒Ｉに蓄積させたい所望のペプチドを本発明におい
て用いることができる。ペプチドとしては、例えば、栄
養価の高いアミノ酸組成を持つペプチド、ヒトや家畜等
に対し生理的機能を持ったペプチド、食用ワクチン、抗
体、酵素タンパク質等の付加価値の高いペプチドが挙げ
られる。これらのペプチドに加えて、ペプチド自体の付
加価値はあまり高くない場合でも、タンパク顆粒 (PB-
I) にターゲットさせることで、PB-I の物性を改変する
ことが期待できるペプチドも例として挙げられる。即ち
プロラミン以外のペプチドをPB-I で蓄積させること
で、PB-I 内でのプロラミンタンパク質間の相互作用に
影響を及ぼし、結晶化を阻害することが期待できる。こ
のような特性を持ったペプチドとして、例えば保水性の
高いペプチドや親水性のアミノ酸残基を多く含むペプチ
ド等が挙げられる。
ては、特に制限はない。植物の胚乳組織におけるタンパ
ク顆粒Ｉに蓄積させたい所望のペプチドを本発明におい
て用いることができる。ペプチドとしては、例えば、栄
養価の高いアミノ酸組成を持つペプチド、ヒトや家畜等
に対し生理的機能を持ったペプチド、食用ワクチン、抗
体、酵素タンパク質等の付加価値の高いペプチドが挙げ
られる。これらのペプチドに加えて、ペプチド自体の付
加価値はあまり高くない場合でも、タンパク顆粒 (PB-
I) にターゲットさせることで、PB-I の物性を改変する
ことが期待できるペプチドも例として挙げられる。即ち
プロラミン以外のペプチドをPB-I で蓄積させること
で、PB-I 内でのプロラミンタンパク質間の相互作用に
影響を及ぼし、結晶化を阻害することが期待できる。こ
のような特性を持ったペプチドとして、例えば保水性の
高いペプチドや親水性のアミノ酸残基を多く含むペプチ
ド等が挙げられる。
【００１８】本発明において（i）のペプチドと（ii）
のペプチドとの融合ペプチドをコードするDNAは、（i）
のペプチドをコードするDNAと（ii）のペプチドをコー
ドするDNAとを結合させて作製することができる。ま
た、該融合ペプチドをコードするDNAには、シグナルペ
プチドをコードするDNAを結合させる。シグナルペプチ
ドとしては、特に制限はなく、例えば、ダイズ種子貯蔵
タンパク質グリシニンA1aB 1b のシグナルペプチドなど
が挙げられる。
のペプチドとの融合ペプチドをコードするDNAは、（i）
のペプチドをコードするDNAと（ii）のペプチドをコー
ドするDNAとを結合させて作製することができる。ま
た、該融合ペプチドをコードするDNAには、シグナルペ
プチドをコードするDNAを結合させる。シグナルペプチ
ドとしては、特に制限はなく、例えば、ダイズ種子貯蔵
タンパク質グリシニンA1aB 1b のシグナルペプチドなど
が挙げられる。
【００１９】これらDNAは生物（好ましくは植物）由来
のゲノムDNAまたはmRNAからPCR法などを利用して調製し
てもよく、また、化学合成してもよい。これらDNAの結
合は、通常の遺伝子工学的手法により行うことができ
る。これらDNAの結合様式に特に制限はないが、例え
ば、（ii）のペプチドのC末端に、（i）のペプチドが付
加されるように、それぞれのペプチドをコードするDNA
を結合させることができる。また、シグナルペプチド
は、（ii）のペプチドのN末端に付加されるように、そ
れぞれのペプチドをコードするDNAを結合させることが
できる。
のゲノムDNAまたはmRNAからPCR法などを利用して調製し
てもよく、また、化学合成してもよい。これらDNAの結
合は、通常の遺伝子工学的手法により行うことができ
る。これらDNAの結合様式に特に制限はないが、例え
ば、（ii）のペプチドのC末端に、（i）のペプチドが付
加されるように、それぞれのペプチドをコードするDNA
を結合させることができる。また、シグナルペプチド
は、（ii）のペプチドのN末端に付加されるように、そ
れぞれのペプチドをコードするDNAを結合させることが
できる。
【００２０】本発明において、上記融合ペプチドをコー
ドするDNAを含むベクターの植物細胞への導入は、当業
者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム
法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パー
ティクルガン法、により実施することができる。
ドするDNAを含むベクターの植物細胞への導入は、当業
者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム
法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パー
ティクルガン法、により実施することができる。
【００２１】上記アグロバクテリウム法を用いる場合、
例えば、超迅速単子葉形質転換性（特許第3141084号）
を用いることが可能である。また、例えばNagelらの方
法（Microbiol. Lett., 1990, 67, 325.）が用いられ
る。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバク
テリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換された
アグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方
法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば
植物体に導入した後、上記融合ペプチドをコードするDN
Aが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含
む。一般に、該プロモーターの下流には上記融合ペプチ
ドをコードするDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはタ
ーミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換
えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に
応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモー
ターとして、例えばイネのグロブリンプロモーター、カ
リフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロ
コシのユビキチンプロモーター（特開平2-79983号公
報）等を挙げることができる。
例えば、超迅速単子葉形質転換性（特許第3141084号）
を用いることが可能である。また、例えばNagelらの方
法（Microbiol. Lett., 1990, 67, 325.）が用いられ
る。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバク
テリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換された
アグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方
法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば
植物体に導入した後、上記融合ペプチドをコードするDN
Aが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含
む。一般に、該プロモーターの下流には上記融合ペプチ
ドをコードするDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはタ
ーミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換
えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に
応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモー
ターとして、例えばイネのグロブリンプロモーター、カ
リフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロ
コシのユビキチンプロモーター（特開平2-79983号公
報）等を挙げることができる。
【００２２】また、上記ターミネーターは、カリフラワ
ーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノ
パリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示す
ることができるが、植物体中で機能するプロモーターや
ターミネーターであれば、これらに限定されない。
ーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノ
パリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示す
ることができるが、植物体中で機能するプロモーターや
ターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００２３】上記融合ペプチドをコードするDNAを含む
ベクターを導入する植物細胞としては、イネ、トウモロ
コシ、エンバク、コムギ、オオムギ等を含むイネ科植物
に由来する植物細胞を例示することができるが、これら
に制限されない。また、植物細胞の形態に特に制限はな
く、例えば、葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植
物細胞、カルス、懸濁培養細胞、外植片等が挙げること
ができる。
ベクターを導入する植物細胞としては、イネ、トウモロ
コシ、エンバク、コムギ、オオムギ等を含むイネ科植物
に由来する植物細胞を例示することができるが、これら
に制限されない。また、植物細胞の形態に特に制限はな
く、例えば、葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植
物細胞、カルス、懸濁培養細胞、外植片等が挙げること
ができる。
【００２４】上記融合ペプチドをコードするDNAを含む
ベクターの導入により形質転換した植物細胞を効率的に
選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜
マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を
含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入すること
が好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子
は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマ
イシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノス
リシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
等が挙げられる。
ベクターの導入により形質転換した植物細胞を効率的に
選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜
マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を
含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入すること
が好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子
は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマ
イシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノス
リシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
等が挙げられる。
【００２５】組み換えベクターを導入した植物細胞は、
導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選
抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。こ
れにより形質転換された植物培養細胞を得ることができ
る。
導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選
抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。こ
れにより形質転換された植物培養細胞を得ることができ
る。
【００２６】植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当
業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki. et a
l., Plant Physiol, 1995, 100, 1503-1507.）。例えば
イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法につい
ては、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ
DNAを導入し、植物体（インド型イネ品種が適してい
る）を再生させる方法（Datta, S K. et al., In Gene
Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Ed
s.), 1995, 66-74.）、電気パルスによりプロトプラス
トへDNAを導入し、植物体（日本型イネ品種が適してい
る）を再生させる方法（Toki. et al., Plant Physiol,
1992, 100, 1503-1507.）、パーティクルガン法により
細胞へDNAを直接導入し、植物体を再生させる方法（Chr
istou, et al., Bio/technology, 1991, 9, 957-962.）
およびアグロバクテリウムを介してDNAを導入し、植物
体を再生させる方法（Hiei. et al., Plant J, 1994,
6, 271-282.）等、いくつかの技術が既に確立し、本願
発明の技術分野において広く用いられている。本発明に
おいては、これらの方法を好適に用いることができる。
業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki. et a
l., Plant Physiol, 1995, 100, 1503-1507.）。例えば
イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法につい
ては、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ
DNAを導入し、植物体（インド型イネ品種が適してい
る）を再生させる方法（Datta, S K. et al., In Gene
Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Ed
s.), 1995, 66-74.）、電気パルスによりプロトプラス
トへDNAを導入し、植物体（日本型イネ品種が適してい
る）を再生させる方法（Toki. et al., Plant Physiol,
1992, 100, 1503-1507.）、パーティクルガン法により
細胞へDNAを直接導入し、植物体を再生させる方法（Chr
istou, et al., Bio/technology, 1991, 9, 957-962.）
およびアグロバクテリウムを介してDNAを導入し、植物
体を再生させる方法（Hiei. et al., Plant J, 1994,
6, 271-282.）等、いくつかの技術が既に確立し、本願
発明の技術分野において広く用いられている。本発明に
おいては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２７】形質転換細胞から再生させた植物体は、次
いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物
体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、
成熟して結実して種子を得ることができる。
いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物
体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、
成熟して結実して種子を得ることができる。
【００２８】なお、このように再生され、かつ栽培した
形質転換植物体中の導入された外来DNAまたは核酸の存
在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法
によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析する
ことによって確認することができる。この場合、形質転
換植物体からのDNAまたは核酸の抽出は、公知のJ.Sambr
ookらの方法（Molecular Cloning, 第2版, Cold Spring
Harbor laboratory Press, 1989）に準じて実施するこ
とができる。
形質転換植物体中の導入された外来DNAまたは核酸の存
在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法
によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析する
ことによって確認することができる。この場合、形質転
換植物体からのDNAまたは核酸の抽出は、公知のJ.Sambr
ookらの方法（Molecular Cloning, 第2版, Cold Spring
Harbor laboratory Press, 1989）に準じて実施するこ
とができる。
【００２９】再生させた植物体中に存在する上記融合ペ
プチドをコードするDNAを、PCR法を用いて解析する場合
には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型
として増幅反応を行う。また、該核酸がDNAである場合
には、該DNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基
配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応
を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変
性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、上記
融合ペプチドをコードするDNAを含むDNA断片の増幅生成
物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例
えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種の
DNA断片が分画されて、そのDNA断片が上記融合ペプチド
をコードするDNAに対応することを確認することが可能
である。
プチドをコードするDNAを、PCR法を用いて解析する場合
には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型
として増幅反応を行う。また、該核酸がDNAである場合
には、該DNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基
配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応
を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変
性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、上記
融合ペプチドをコードするDNAを含むDNA断片の増幅生成
物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例
えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種の
DNA断片が分画されて、そのDNA断片が上記融合ペプチド
をコードするDNAに対応することを確認することが可能
である。
【００３０】一旦、染色体内に上記融合ペプチドをコー
ドするDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、
該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得る
ことが可能である。また、該植物体やその子孫あるいは
クローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊
茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、そ
れらを基に該植物体を量産することも可能である。
ドするDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、
該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得る
ことが可能である。また、該植物体やその子孫あるいは
クローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊
茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、そ
れらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００３１】また、形質転換植物体において、任意のペ
プチドが胚乳組織に蓄積しているか否かは、形質転換個
体と非形質転換個体の種子の全タンパク質を抽出し、SD
S-ポリアクリルゲル電気泳動法によって、タンパク質を
分離し、両者を比較することによって、目的ペプチドの
蓄積を確認することができる。また目的ペプチドに対す
る抗体を用いれば、ウェスターンブロット法やELISA法
等で定量的な解析も可能となる。
プチドが胚乳組織に蓄積しているか否かは、形質転換個
体と非形質転換個体の種子の全タンパク質を抽出し、SD
S-ポリアクリルゲル電気泳動法によって、タンパク質を
分離し、両者を比較することによって、目的ペプチドの
蓄積を確認することができる。また目的ペプチドに対す
る抗体を用いれば、ウェスターンブロット法やELISA法
等で定量的な解析も可能となる。
【００３２】また、本発明は、本発明の方法を実施する
ために有用なキットを提供する。このキットには、例え
ば、（１）上記融合ペプチドをコードするDNA、（２）
（i）のペプチドをコードするDNA、（３）（１）または
（２）のDNAを含むベクター、を含むことができる。本
発明のキットに含まれる他の構成物としては、例えば、
ゲノムDNAライブラリー、cDNAライブラリー、ベクタ
ー、植物細胞、各種試薬などが例示できる。
ために有用なキットを提供する。このキットには、例え
ば、（１）上記融合ペプチドをコードするDNA、（２）
（i）のペプチドをコードするDNA、（３）（１）または
（２）のDNAを含むベクター、を含むことができる。本
発明のキットに含まれる他の構成物としては、例えば、
ゲノムDNAライブラリー、cDNAライブラリー、ベクタ
ー、植物細胞、各種試薬などが例示できる。
【００３３】
【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに具体的
に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。 [実施例１]イネ種子貯蔵タンパク質のグロブリンは液胞
由来のタンパク顆粒II(PB-II)に蓄積する。このこと
は、グロブリンが液胞移行シグナルをタンパク質の特定
の部位に持っていることを示唆する。本発明者らはグロ
ブリンの液胞移行シグナルを同定することを課題として
研究に着手した。レポータータンパク質としてGFPタン
パク質sGFP(S65T) を用いた。このGFPのN末端にダイズ
種子貯蔵タンパク質グリシニンA1aB1b のシグナルペプ
チドを付加し、またGFPのC末端にはグロブリンのシグナ
ルペプチドを除く全長、又は一部を付加した。遺伝子発
現のためのプロモーターはグロブリンのプロモーターを
用い、アグロバクテリウムを介した方法（超迅速単子葉
形質転換性（特許第3141084号））でイネ種子由来のカ
ルスに感染し、形質転換体を作出した。融合タンパク質
の胚乳組織での細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡を用
いて観察した。グロブリンの21番目のグリシニン残基(G
21)から111番目のグルタミン残基(Q111)をGFPのC末端に
付加した融合タンパク質の細胞内局在は、驚くべきこと
に、液胞由来のタンパク顆粒II(PB-II)ではなく、液胞
由来ではないタンパク顆粒I(PB-I)であることが示唆さ
れた。すなわち、上記GFP融合タンパク質の細胞内局在
は、タンパク顆粒I(PB-I)と考えられる、主に直径0.5か
ら2.3 ミクロンの多数の球状顆粒であった。
に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。 [実施例１]イネ種子貯蔵タンパク質のグロブリンは液胞
由来のタンパク顆粒II(PB-II)に蓄積する。このこと
は、グロブリンが液胞移行シグナルをタンパク質の特定
の部位に持っていることを示唆する。本発明者らはグロ
ブリンの液胞移行シグナルを同定することを課題として
研究に着手した。レポータータンパク質としてGFPタン
パク質sGFP(S65T) を用いた。このGFPのN末端にダイズ
種子貯蔵タンパク質グリシニンA1aB1b のシグナルペプ
チドを付加し、またGFPのC末端にはグロブリンのシグナ
ルペプチドを除く全長、又は一部を付加した。遺伝子発
現のためのプロモーターはグロブリンのプロモーターを
用い、アグロバクテリウムを介した方法（超迅速単子葉
形質転換性（特許第3141084号））でイネ種子由来のカ
ルスに感染し、形質転換体を作出した。融合タンパク質
の胚乳組織での細胞内局在は共焦点レーザー顕微鏡を用
いて観察した。グロブリンの21番目のグリシニン残基(G
21)から111番目のグルタミン残基(Q111)をGFPのC末端に
付加した融合タンパク質の細胞内局在は、驚くべきこと
に、液胞由来のタンパク顆粒II(PB-II)ではなく、液胞
由来ではないタンパク顆粒I(PB-I)であることが示唆さ
れた。すなわち、上記GFP融合タンパク質の細胞内局在
は、タンパク顆粒I(PB-I)と考えられる、主に直径0.5か
ら2.3 ミクロンの多数の球状顆粒であった。
【００３４】本発明者らは、上記GFP融合タンパク質が
タンパク顆粒I(PB-I)に蓄積するための必要部位の同定
に着手した。まずG21から Q111 までを2つに分け、G21
から R59まで、又はR68 からQ111までをGFPのC末端に付
加し、上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を観
察した。その結果R68 からQ111までをGFPのC末端に付加
した融合タンパク質がタンパク顆粒I(PB-I)に局在し
た。更に必要な領域を絞り込むためにR68 からQ111まで
を再び2分割し、L72 からS86まで、又は A92から S104
までをGFPのC末端に付加し、上記と同様に形質転換体を
作出し細胞内局在を観察した。その結果、L72 からS86
までの15アミノ酸残基をGFPのC末端に付加した融合タン
パク質がタンパク顆粒I(PB-I)に局在した（図１および
２）。
タンパク顆粒I(PB-I)に蓄積するための必要部位の同定
に着手した。まずG21から Q111 までを2つに分け、G21
から R59まで、又はR68 からQ111までをGFPのC末端に付
加し、上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を観
察した。その結果R68 からQ111までをGFPのC末端に付加
した融合タンパク質がタンパク顆粒I(PB-I)に局在し
た。更に必要な領域を絞り込むためにR68 からQ111まで
を再び2分割し、L72 からS86まで、又は A92から S104
までをGFPのC末端に付加し、上記と同様に形質転換体を
作出し細胞内局在を観察した。その結果、L72 からS86
までの15アミノ酸残基をGFPのC末端に付加した融合タン
パク質がタンパク顆粒I(PB-I)に局在した（図１および
２）。
【００３５】この15アミノ酸残基の配列（LGLRMQCCQQLQ
DVS）（配列番号：５）は、相同タンパク質のひまわり
の2SアルブミンSFA-8 の立体構造の情報を基にすると、
78番目と79番目の2つの連続するシステイン残基はグロ
ブリン分子内の他の2つのシステイン残基とジスルフィ
ド結合を形成する。よって、78番目と79番目の2つのシ
ステイン残基が小胞体のルーメンで他のタンパク質とジ
スルフィド結合するために、GFP融合タンパク質がタン
パク顆粒I(PB-I)に局在すると推察した。この仮説を検
証するためにC78と C79を含む4つのアミノ酸残基(R75,
C78, C79, L82) をアラニンに置換した15アミノ酸残基
（LGLAMQAAQQAQDVS）（配列番号：６）をGFPのC末端に
付加し、上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を
観察した。この場合GFPはタンパク顆粒I(PB-I)には局在
しないことが判明した。また、本実施例において、シス
テイン残基が存在するだけではタンパク顆粒I(PB-I)に
局在しないことも判明した。例えば、G21から R59まで
のアミノ酸配列にはC36とC48の2つのシステイン残基が
存在するが、上述のようG21から R59までをGFPのC末端
に付加してもGFP融合タンパク質はタンパク顆粒I(PB-I)
での局在を示さなかった（図１）。このことから所望の
タンパク質をタンパク顆粒I(PB-I)で蓄積させるために
は、付加するアミノ酸配列がシステイン残基を含むこと
は必要条件であるが充分条件ではないことが分かる。即
ちシステイン残基の前後のアミノ酸配列が重要である。
DVS）（配列番号：５）は、相同タンパク質のひまわり
の2SアルブミンSFA-8 の立体構造の情報を基にすると、
78番目と79番目の2つの連続するシステイン残基はグロ
ブリン分子内の他の2つのシステイン残基とジスルフィ
ド結合を形成する。よって、78番目と79番目の2つのシ
ステイン残基が小胞体のルーメンで他のタンパク質とジ
スルフィド結合するために、GFP融合タンパク質がタン
パク顆粒I(PB-I)に局在すると推察した。この仮説を検
証するためにC78と C79を含む4つのアミノ酸残基(R75,
C78, C79, L82) をアラニンに置換した15アミノ酸残基
（LGLAMQAAQQAQDVS）（配列番号：６）をGFPのC末端に
付加し、上記と同様に形質転換体を作出し細胞内局在を
観察した。この場合GFPはタンパク顆粒I(PB-I)には局在
しないことが判明した。また、本実施例において、シス
テイン残基が存在するだけではタンパク顆粒I(PB-I)に
局在しないことも判明した。例えば、G21から R59まで
のアミノ酸配列にはC36とC48の2つのシステイン残基が
存在するが、上述のようG21から R59までをGFPのC末端
に付加してもGFP融合タンパク質はタンパク顆粒I(PB-I)
での局在を示さなかった（図１）。このことから所望の
タンパク質をタンパク顆粒I(PB-I)で蓄積させるために
は、付加するアミノ酸配列がシステイン残基を含むこと
は必要条件であるが充分条件ではないことが分かる。即
ちシステイン残基の前後のアミノ酸配列が重要である。
【００３６】また、15アミノ酸残基の配列（LGLRMQCCQQ
LQDVS）（配列番号：５）は、イネプロラミン遺伝子フ
ァミリーで保存された領域（Matsukawa et al. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 1999, 63, 1851-1858）と高い
相同性があることが判明した。特に2つの連続するシス
テイン残基とその前後のグルタミン残基（QCCQQ）（配
列番号：１４）が16.6 kDaプロラミン（λRP16）と13kD
aプロラミン（pProl17、λRM7）で保存されている。10k
Daプロラミン(λRP10)ではグルタミンがメチオニンに置
換した配列QCCMQ（配列番号：１５）となっている。ト
ウモロコシの種子貯蔵タンパク質15kDaゼインとエンバ
クの種子貯蔵タンパク質アベニンにも類似の配列、それ
ぞれ、QCCQQ（配列番号：１４）およびQCCRQ（配列番
号：１６）が存在する。それらの共通配列としてQCCXQ
（Xは任意のアミノ酸）（配列番号：１）を見いだした
（図３）。この保存された共通配列がグロブリンのタン
パク顆粒I(PB-I)での蓄積に必要であることが示唆され
た。
LQDVS）（配列番号：５）は、イネプロラミン遺伝子フ
ァミリーで保存された領域（Matsukawa et al. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 1999, 63, 1851-1858）と高い
相同性があることが判明した。特に2つの連続するシス
テイン残基とその前後のグルタミン残基（QCCQQ）（配
列番号：１４）が16.6 kDaプロラミン（λRP16）と13kD
aプロラミン（pProl17、λRM7）で保存されている。10k
Daプロラミン(λRP10)ではグルタミンがメチオニンに置
換した配列QCCMQ（配列番号：１５）となっている。ト
ウモロコシの種子貯蔵タンパク質15kDaゼインとエンバ
クの種子貯蔵タンパク質アベニンにも類似の配列、それ
ぞれ、QCCQQ（配列番号：１４）およびQCCRQ（配列番
号：１６）が存在する。それらの共通配列としてQCCXQ
（Xは任意のアミノ酸）（配列番号：１）を見いだした
（図３）。この保存された共通配列がグロブリンのタン
パク顆粒I(PB-I)での蓄積に必要であることが示唆され
た。
【００３７】また、上記タンパク質が全て種子貯蔵タン
パク質であることを考慮に入れると、これらの遺伝子は
進化的に起源を同じくする遺伝子群であることが推察で
きる。またプロラミン、ゼイン、アベニンは小胞体由来
のタンパク顆粒（イネのPB-Iに相当）に輸送され蓄積す
るので、これらのタンパク質でも上記共通配列が、これ
らのタンパク質の輸送・蓄積で重要な役割を担っている
と考えられる。
パク質であることを考慮に入れると、これらの遺伝子は
進化的に起源を同じくする遺伝子群であることが推察で
きる。またプロラミン、ゼイン、アベニンは小胞体由来
のタンパク顆粒（イネのPB-Iに相当）に輸送され蓄積す
るので、これらのタンパク質でも上記共通配列が、これ
らのタンパク質の輸送・蓄積で重要な役割を担っている
と考えられる。
【００３８】[実施例２]本発明者らは、共通配列の中の
連続するシステイン残基が他のタンパク質とジスルフィ
ド結合することを見出した（図４）。配列番号：５に記
載の野性型、又は配列番号：６に記載の変異型の15アミ
ノ酸残基を付加したGFP融合タンパク質は、通常用いら
れるタンパク質抽出緩衝液（50mM Tris-HCl、 pH6.8、8
M 尿素、4% SDS、20% グリセロール、5% 2-メルカプト
エタノール）(Iida, S., Amano, E. and Nishio, T. 19
93 Theor. Appl. Genet. 87, 374-378)で、完熟種子か
ら可溶化することができる。ところが、この抽出緩衝液
から還元剤の2-メルカプトエタノールを除く抽出緩衝液
では、野性型の15アミノ酸残基を付加したタンパク質を
可溶化することはできなかった。一方、変異型の15アミ
ノ酸残基を付加したGFP融合タンパク質は還元剤を含ま
ない抽出緩衝液でも容易に可溶化された。これらの結果
は共通配列中の二つのシステイン残基が他のタンパク質
とジスルフィド結合によって架橋しているために、還元
剤を含まない緩衝液では可溶化されないことを示してい
る。これと関連して、システイン残基を含むプロラミン
を可溶化するためには、タンパク質抽出緩衝液に還元剤
の添加が必須であることが実証されている（Mitsukawa
et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999, 63, 1851
-1858）。
連続するシステイン残基が他のタンパク質とジスルフィ
ド結合することを見出した（図４）。配列番号：５に記
載の野性型、又は配列番号：６に記載の変異型の15アミ
ノ酸残基を付加したGFP融合タンパク質は、通常用いら
れるタンパク質抽出緩衝液（50mM Tris-HCl、 pH6.8、8
M 尿素、4% SDS、20% グリセロール、5% 2-メルカプト
エタノール）(Iida, S., Amano, E. and Nishio, T. 19
93 Theor. Appl. Genet. 87, 374-378)で、完熟種子か
ら可溶化することができる。ところが、この抽出緩衝液
から還元剤の2-メルカプトエタノールを除く抽出緩衝液
では、野性型の15アミノ酸残基を付加したタンパク質を
可溶化することはできなかった。一方、変異型の15アミ
ノ酸残基を付加したGFP融合タンパク質は還元剤を含ま
ない抽出緩衝液でも容易に可溶化された。これらの結果
は共通配列中の二つのシステイン残基が他のタンパク質
とジスルフィド結合によって架橋しているために、還元
剤を含まない緩衝液では可溶化されないことを示してい
る。これと関連して、システイン残基を含むプロラミン
を可溶化するためには、タンパク質抽出緩衝液に還元剤
の添加が必須であることが実証されている（Mitsukawa
et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999, 63, 1851
-1858）。
【００３９】以上をまとめると（１）野性型の15アミノ
酸残基がプロラミンのアミノ酸配列と相同性が高い。
（２）野性型の15アミノ酸残基を付加したGFP融合タン
パク質の局在はPB-I である。（３）PB-Iの含有するタ
ンパク質の殆どはプロラミンである。（４）野性型の15
アミノ酸残基を付加したGFP融合タンパク質はジスルフ
ィド結合によって他のタンパク質と架橋する。これらの
事実を総合すると、共通配列中の連続するシステイン残
基がプロラミンとジスルフィド結合するために、共通配
列を含むGFP融合タンパク質はPB-I に輸送・蓄積される
と推察することができる。
酸残基がプロラミンのアミノ酸配列と相同性が高い。
（２）野性型の15アミノ酸残基を付加したGFP融合タン
パク質の局在はPB-I である。（３）PB-Iの含有するタ
ンパク質の殆どはプロラミンである。（４）野性型の15
アミノ酸残基を付加したGFP融合タンパク質はジスルフ
ィド結合によって他のタンパク質と架橋する。これらの
事実を総合すると、共通配列中の連続するシステイン残
基がプロラミンとジスルフィド結合するために、共通配
列を含むGFP融合タンパク質はPB-I に輸送・蓄積される
と推察することができる。
【００４０】
【発明の効果】イネ胚乳組織には PB-I とPB-IIの2つの
異なるタンパク顆粒が存在し、どちらも外来ペプチドの
蓄積可能なオルガネラとして利用可能である。外来タン
パク質の PB-II への輸送・蓄積は、これまでにインゲ
ンマメ種子貯蔵タンパク質ベータファゼオリン（Zheng,
Z., Sumi, K., Tanaka, K., and Murai, N. 1995, Pla
nt Physiol. 109, 777-786）やダイズ種子貯蔵タンパク
質グリシニン(Katsube,T., Kurisaka, N., Ogawa, M.,
Maruyama, N., Ohtsuka, R., Utsumi, S., andTakaiwa,
F. 1999, Plant Physiol. 120, 1063-1073)等で証明さ
れている。一方、PB-I への外来ペプチドの輸送・蓄積
は実証例がない。従って、本発明の効果は外来ペプチド
を PB-I に輸送・蓄積させることが可能になった点にあ
る。また、プロラミンが集積するPB-I はヒトや動物で
消化性が非常に悪いことが知られている (Tanaka, Y.,
Hayashida, S., and Hongo, M. 1975, Agric. Biol. Ch
em. 39, 515-518)。これはプロラミンタンパク質同士の
分子間相互作用による結晶化と密接な関連が推測されて
いる。そのため外来ペプチドをPB-I に輸送・蓄積させ
ることによって、プロラミン同士の相互作用を阻害する
ことが可能となり、結果としてPB-I の物性が変わるこ
とが予想される。PB-I の物性の変化による利点として
は、プロラミンの消化性が向上することによる栄養特性
の改善、調理特性の改変、加工特性の改変等が考えられ
る。
異なるタンパク顆粒が存在し、どちらも外来ペプチドの
蓄積可能なオルガネラとして利用可能である。外来タン
パク質の PB-II への輸送・蓄積は、これまでにインゲ
ンマメ種子貯蔵タンパク質ベータファゼオリン（Zheng,
Z., Sumi, K., Tanaka, K., and Murai, N. 1995, Pla
nt Physiol. 109, 777-786）やダイズ種子貯蔵タンパク
質グリシニン(Katsube,T., Kurisaka, N., Ogawa, M.,
Maruyama, N., Ohtsuka, R., Utsumi, S., andTakaiwa,
F. 1999, Plant Physiol. 120, 1063-1073)等で証明さ
れている。一方、PB-I への外来ペプチドの輸送・蓄積
は実証例がない。従って、本発明の効果は外来ペプチド
を PB-I に輸送・蓄積させることが可能になった点にあ
る。また、プロラミンが集積するPB-I はヒトや動物で
消化性が非常に悪いことが知られている (Tanaka, Y.,
Hayashida, S., and Hongo, M. 1975, Agric. Biol. Ch
em. 39, 515-518)。これはプロラミンタンパク質同士の
分子間相互作用による結晶化と密接な関連が推測されて
いる。そのため外来ペプチドをPB-I に輸送・蓄積させ
ることによって、プロラミン同士の相互作用を阻害する
ことが可能となり、結果としてPB-I の物性が変わるこ
とが予想される。PB-I の物性の変化による利点として
は、プロラミンの消化性が向上することによる栄養特性
の改善、調理特性の改変、加工特性の改変等が考えられ
る。
【００４１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Institute of Agrobiological Sciences
<120> A method for targeting of a peptide to the protein bodies in plant
s
<130> MOA-A0112
<140>
<141>
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Consensus Sequence
<220>
<221> SITE
<222> (4)
<223> Xaa = any amino acid
<400> 1
Gln Cys Cys Xaa Gln
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Consensus Sequence
<220>
<221> SITE
<222> (4)
<223> Xaa = Gln, Met, or Arg
<400> 2
Gln Cys Cys Xaa Gln
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Consensus Sequence
<220>
<221> SITE
<222> (1)
<223> Xaa = Leu or Met
<220>
<221> SITE
<222> (2)
<223> Xaa = Arg or Gln
<220>
<221> SITE
<222> (3)
<223> Xaa = Met, Gln, or Arg
<220>
<221> SITE
<222> (7)
<223> Xaa = Gln, Met, or Arg
<220>
<221> SITE
<222> (9)
<223> Xaa = Leu, Met, or Gln
<220>
<221> SITE
<222> (10)
<223> Xaa = Gln, Arg, Met, or Ala
<220>
<221> SITE
<222> (11)
<223> Xaa = any amino acid
<220>
<221> SITE
<222> (12)
<223> Xaa = Val, Met, or Ile
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Gln Cys Cys Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 4
Leu Arg Met Gln Cys Cys Gln Gln Leu Gln Asp Val
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 5
Leu Gly Leu Arg Met Gln Cys Cys Gln Gln Leu Gln Asp Val Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: An
Artificially Synthesized Peptide Sequence
<400> 6
Leu Gly Leu Ala Met Gln Ala Ala Gln Gln Ala Gln Asp Val Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 91
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 7
Gly Ala Gln Val Ser Glu Ser Glu Met Arg Phe Arg Asp Arg Gln Cys
1 5 10 15
Gln Arg Glu Val Gln Asp Ser Pro Leu Asp Ala Cys Arg Gln Val Leu
20 25 30
Asp Arg Gln Leu Thr Gly Arg Glu Arg Phe Gln Pro Met Phe Arg Arg
35 40 45
Pro Gly Ala Leu Gly Leu Arg Met Gln Cys Cys Gln Gln Leu Gln Asp
50 55 60
Val Ser Arg Glu Cys Arg Cys Ala Ala Ile Arg Arg Met Val Arg Ser
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Ser Met Pro Met Pro Leu Glu Gln
85 90
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 8
Gln Val Met Arg Gln Gln Cys Cys Gln Gln Met Arg Leu Met Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 9
Gln Val Met Gln Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Arg Met Ile Ala
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 10
Gln Val Met Gln Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Arg Leu Val Ala
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 11
Ala Leu Leu Gln Gln Gln Cys Cys Met Gln Leu Gln Gly Met Met
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 12
Gln Pro Leu Arg Gln Gln Cys Cys Gln Gln Gln Met Arg Met Met
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Avena sativa
<400> 13
His Val Met Arg Arg Gln Cys Cys Arg Gln Leu Ala Gln Ile Pro
1 5 10 15
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Consensus Sequence
<400> 14
Gln Cys Cys Gln Gln
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 15
Gln Cys Cys Met Gln
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Avena sativa
<400> 16
Gln Cys Cys Arg Gln
1 5
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: An Artificially
Synthesized Peptide Sequence
<400> 17
Lys Asp Glu Leu
1
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: An Artificially
Synthesized Peptide Sequence
<400> 18
His Asp Glu Leu
1
【図１】 イネグロブリン、グリシン21からグルタミン
111までの保存領域のアミノ酸配列と、実験に用いた6つ
のGFP融合タンパク質の模式図を示す。上から(G21-Q11
1), (G21-R59), (R68-Q111), (A92-S104), (L72-S86)の
配列をそれぞれGFPのC末端に付加し、融合タンパク質の
細胞内局在を解析した。また同様に、変異型配列である
15アミノ酸残基をGFPのC末端に付加し、融合タンパク質
の細胞内局在を解析した。これらの融合タンパク質のタ
ンパク顆粒（PB-I）での蓄積の有無を（＋）又は（−）
で右側に示す。イネグロブリン（アルファグロブリン）
はN末端にシグナルペプチドを有する。グリシン21から
グルタミン111までの領域と、グルタミン148から終止コ
ドンまでの領域はコムギの種子貯蔵タンパク質グルテニ
ンと相同性が高い保存領域である。この二つの保存領域
に挟まれた領域はコムギグルテニンとの相同性が低いの
で可変領域とした。
111までの保存領域のアミノ酸配列と、実験に用いた6つ
のGFP融合タンパク質の模式図を示す。上から(G21-Q11
1), (G21-R59), (R68-Q111), (A92-S104), (L72-S86)の
配列をそれぞれGFPのC末端に付加し、融合タンパク質の
細胞内局在を解析した。また同様に、変異型配列である
15アミノ酸残基をGFPのC末端に付加し、融合タンパク質
の細胞内局在を解析した。これらの融合タンパク質のタ
ンパク顆粒（PB-I）での蓄積の有無を（＋）又は（−）
で右側に示す。イネグロブリン（アルファグロブリン）
はN末端にシグナルペプチドを有する。グリシン21から
グルタミン111までの領域と、グルタミン148から終止コ
ドンまでの領域はコムギの種子貯蔵タンパク質グルテニ
ンと相同性が高い保存領域である。この二つの保存領域
に挟まれた領域はコムギグルテニンとの相同性が低いの
で可変領域とした。
【図２】 15アミノ酸残基 (L72-S86)をGFPのC末端に付
加した融合タンパク質の模式図と該融合タンパク質の細
胞内局在を示す写真である。
加した融合タンパク質の模式図と該融合タンパク質の細
胞内局在を示す写真である。
【図３】 グロブリンがPB-I へ輸送されるために必要
な15アミノ酸残基と相同性の高いアミノ酸配列を示す図
である。イネプロラミンは比較的大きなマルチジーンフ
ァミリーを構成するため、ここに示した遺伝子は一部の
遺伝子である。プロラミン遺伝子の特徴の一つは共通配
列で示した配列、又はこれと類似の配列を有することで
ある。またトウモロコシ15kDa ゼインやエンバクアベニ
ンも類似のアミノ酸配列を有する。
な15アミノ酸残基と相同性の高いアミノ酸配列を示す図
である。イネプロラミンは比較的大きなマルチジーンフ
ァミリーを構成するため、ここに示した遺伝子は一部の
遺伝子である。プロラミン遺伝子の特徴の一つは共通配
列で示した配列、又はこれと類似の配列を有することで
ある。またトウモロコシ15kDa ゼインやエンバクアベニ
ンも類似のアミノ酸配列を有する。
【図４】 野生型および変異型の15アミノ酸残基をGFP
のC末端に付加した融合タンパク質の模式図とそれぞれ
のGFP融合タンパク質について可溶化を解析した結果を
示す写真である。完熟種子から全タンパク質を5％の2-
メルカプトエタノール（還元剤）を添加した緩衝液と添
加しない緩衝液で抽出した。通常のSDS-PAGE法で抽出タ
ンパク質を分離した後、抗GFP抗体を用いて、GFP融合タ
ンパク質（野性型、変異型）のそれぞれの抽出緩衝液で
の可溶化を解析した。還元剤を含む抽出緩衝液では野性
型と変異型の両方の融合タンパク質が可溶化されたが、
還元剤を含まない抽出緩衝液では野性型のGFP融合タン
パク質は可溶化されなかった。
のC末端に付加した融合タンパク質の模式図とそれぞれ
のGFP融合タンパク質について可溶化を解析した結果を
示す写真である。完熟種子から全タンパク質を5％の2-
メルカプトエタノール（還元剤）を添加した緩衝液と添
加しない緩衝液で抽出した。通常のSDS-PAGE法で抽出タ
ンパク質を分離した後、抗GFP抗体を用いて、GFP融合タ
ンパク質（野性型、変異型）のそれぞれの抽出緩衝液で
の可溶化を解析した。還元剤を含む抽出緩衝液では野性
型と変異型の両方の融合タンパク質が可溶化されたが、
還元剤を含まない抽出緩衝液では野性型のGFP融合タン
パク質は可溶化されなかった。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】 【提出日】平成１５年６月２４日（２００３．６．２
４） 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】特許請求の範囲 【補正方法】変更 【補正内容】 【特許請求の範囲】 【手続補正２】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】０００８ 【補正方法】変更 【補正内容】 【０００８】即ち、本発明は、任意のペプチドを植物の
胚乳組織へ蓄積させる方法に関し、より具体的には、 〔１〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意の
ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方法、（ａ）配列番号：１〜３のいずれか に記載のアミノ酸配
列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク
顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと任意のペプチ
ドとの融合ペプチドをコードするDNAを含むベクターを
植物細胞に導入する工程 （ｂ）該植物細胞を植物体に再生させる工程 〔２〕植物がイネである、〔１〕に記載の方法、〔３〕 配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸
配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパ
ク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドをコードする
DNA、 〔４〕 植物がイネである、〔３〕に記載のDNA、 〔５〕 配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸
配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパ
ク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと任意のペプ
チドとの融合ペプチドをコードするDNA、 〔６〕 植物がイネである、〔５〕に記載のDNA、 〔７〕 〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のDNAを含む
ベクター、 〔８〕 〔５〕または〔６〕に記載のDNAを含むベクタ
ーが導入された形質転換植物細胞、 〔９〕 〔８〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転
換植物体、 〔１０〕 〔９〕に記載の形質転換植物体の子孫または
クローンである、形質転換植物体、 〔１１〕 〔９〕または〔１０〕に記載の形質転換植物
体の繁殖材料、 〔１２〕〔１〕に記載の方法に用いるためのキットであ
って、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含むキット、 （ａ）（i）配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミ
ノ酸配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタ
ンパク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと（ii）
任意のペプチドとの融合ペプチドをコードするDNA （ｂ）（i）のペプチドをコードするDNA （ｃ）（ａ）または（ｂ）のDNAを含むベクター 〔１３〕植物がイネである、〔１２〕に記載のキット、
を、提供するものである。
【手続補正書】 【提出日】平成１５年６月２４日（２００３．６．２
４） 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】特許請求の範囲 【補正方法】変更 【補正内容】 【特許請求の範囲】 【手続補正２】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】０００８ 【補正方法】変更 【補正内容】 【０００８】即ち、本発明は、任意のペプチドを植物の
胚乳組織へ蓄積させる方法に関し、より具体的には、 〔１〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、任意の
ペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方法、（ａ）配列番号：１〜３のいずれか に記載のアミノ酸配
列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク
顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと任意のペプチ
ドとの融合ペプチドをコードするDNAを含むベクターを
植物細胞に導入する工程 （ｂ）該植物細胞を植物体に再生させる工程 〔２〕植物がイネである、〔１〕に記載の方法、〔３〕 配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸
配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパ
ク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドをコードする
DNA、 〔４〕 植物がイネである、〔３〕に記載のDNA、 〔５〕 配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸
配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパ
ク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと任意のペプ
チドとの融合ペプチドをコードするDNA、 〔６〕 植物がイネである、〔５〕に記載のDNA、 〔７〕 〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のDNAを含む
ベクター、 〔８〕 〔５〕または〔６〕に記載のDNAを含むベクタ
ーが導入された形質転換植物細胞、 〔９〕 〔８〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転
換植物体、 〔１０〕 〔９〕に記載の形質転換植物体の子孫または
クローンである、形質転換植物体、 〔１１〕 〔９〕または〔１０〕に記載の形質転換植物
体の繁殖材料、 〔１２〕〔１〕に記載の方法に用いるためのキットであ
って、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含むキット、 （ａ）（i）配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミ
ノ酸配列を少なくとも含み、植物の胚乳組織におけるタ
ンパク顆粒Ｉに蓄積する活性を有するペプチドと（ii）
任意のペプチドとの融合ペプチドをコードするDNA （ｂ）（i）のペプチドをコードするDNA （ｃ）（ａ）または（ｂ）のDNAを含むベクター 〔１３〕植物がイネである、〔１２〕に記載のキット、
を、提供するものである。
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フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD08 CA14
4B024 AA08 BA80 CA01 CA07 DA01
GA11 GA17 HA01 HA20
4B065 AA88X AB01 AC14 BA02
BB40 BC50 BD50 CA24 CA53
4H045 AA20 BA13 BA16 BA41 DA75
EA05 EA20 FA74
Claims (8)
- 【請求項１】 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含
む、任意のペプチドを植物の胚乳組織へ蓄積させる方
法。 （ａ）（i）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少な
くとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに
蓄積する活性を有するペプチドと（ii）任意のペプチド
との融合ペプチドをコードするDNAを含むベクターを植
物細胞に導入する工程（ｂ）該植物細胞を植物体に再生
させる工程 - 【請求項２】 （i）のペプチドが配列番号：２に記載
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 （i）のペプチドが配列番号：３に記載
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 植物がイネである、請求項１〜３のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１の方法に用いるためのキットで
あって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含むキット。 （ａ）（i）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を少な
くとも含み、植物の胚乳組織におけるタンパク顆粒Ｉに
蓄積する活性を有するペプチドと（ii）任意のペプチド
との融合ペプチドをコードするDNA （ｂ）（i）のペプチドをコードするDNA （ｃ）（ａ）または（ｂ）のDNAを含むベクター - 【請求項６】 （i）のペプチドが配列番号：２に記載
のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のキット。 - 【請求項７】 （i）のペプチドが配列番号：３に記載
のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のキット。 - 【請求項８】 植物がイネである、請求項５〜７のいず
れかに記載のキット。
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|---|---|---|---|
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| AU2003235249A AU2003235249C9 (en) | 2002-05-15 | 2003-05-13 | Methods for accumulating arbitrary peptides in plant protein bodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002139836A JP3940793B2 (ja) | 2002-05-15 | 2002-05-15 | 任意のペプチドを植物のタンパク顆粒で蓄積させる方法 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002139836A Expired - Lifetime JP3940793B2 (ja) | 2002-05-15 | 2002-05-15 | 任意のペプチドを植物のタンパク顆粒で蓄積させる方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| EP2154252B1 (en) | 2008-07-16 | 2014-12-24 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Methods for producing secreted proteins |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE112314T1 (de) | 1988-05-17 | 1994-10-15 | Lubrizol Genetics Inc | Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem. |
| US5990384A (en) * | 1996-05-31 | 1999-11-23 | New Mexico State University | Co-expression of proteins |
| JP3141084B2 (ja) | 1999-07-21 | 2001-03-05 | 農林水産省農業生物資源研究所長 | 単子葉植物の超迅速形質転換法 |
-
2002
- 2002-05-15 JP JP2002139836A patent/JP3940793B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-05-13 AU AU2003235249A patent/AU2003235249C9/en not_active Ceased
- 2003-05-13 WO PCT/JP2003/005955 patent/WO2003097836A1/ja active Application Filing
- 2003-05-13 US US10/514,263 patent/US7368628B2/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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| AU2003235249B9 (en) | 2007-11-01 |
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| US20060090223A1 (en) | 2006-04-27 |
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| WO2003097836A1 (fr) | 2003-11-27 |
| AU2003235249B8 (en) | 2006-12-14 |
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| AU2003235249C9 (en) | 2008-06-26 |
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