JP2003334067A - Method and system for dilution cleaning of cell - Google Patents
Method and system for dilution cleaning of cellInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞浮遊液の洗浄
に関し、より詳しくは、培養細胞や凍結解凍された幹細
胞などの、比較的細胞濃度の低い細胞浮遊液の洗浄に関
する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to washing of cell suspension, and more particularly to washing of cell suspension having a relatively low cell concentration such as cultured cells and freeze-thawed stem cells.
【０００２】[0002]
【従来の技術】細胞浮遊液の洗浄は種々の状況において
行われる。例えばこれは外科手術時に、術野から回収さ
れた希釈された血液から、赤血球のみを濃縮、洗浄する
ために行うことができる。また細胞洗浄は、癌特異的キ
ラーＴ細胞（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（Ｎ
Ｋ）、リンホカイン活性キラー細胞（ＬＡＫ）などの培
養液を洗浄する場合や、凍結解凍された幹細胞を洗浄す
るといった目的でも行われる。2. Description of the Related Art Washing of cell suspension is performed in various situations. For example, this can be done during surgery to concentrate and wash only red blood cells from diluted blood collected from the surgical field. In addition, cell washing is performed using cancer-specific killer T cells (CTL) and natural killer cells (N
K), lymphokine-activated killer cells (LAK) and other culture solutions are washed, and freeze-thawed stem cells are also washed.
【０００３】細胞浮遊液の洗浄についての従来の方法
は、主として遠心分離を基礎としている。分離ボウルを
用いる例について図７を参照して説明すると、まず細胞
を含んだ細胞浮遊液が細胞バッグ１０１から、カセット
バルブ１０３を介して、遠心分離器１０４に装着された
分離ボウル１０５に注入される。これは蠕動ポンプ１０
６の回転を通じて行われる。分離ボウル１０５は所定の
速度で回転され、比重差に基づいて細胞浮遊液を細胞と
溶媒に分離する。細胞バッグ１０１から細胞浮遊液の流
入が継続されるにつれて、溶媒は分離ボウル１０５から
溢れて廃液バッグ１０７へと流出されるが、分離された
細胞は分離ボウル１０５内に残る。この操作は、分離ボ
ウル１０５内が細胞で満たされるまで継続される（濃縮
工程）。細胞浮遊液が濃縮された後、洗浄液バッグ１０
８から分離ボウル１０５内に、生理食塩水などの洗浄液
を連続的に注入する（洗浄工程）。このようにして分離
ボウル１０５内の細胞を洗浄した後、分離ボウル１０５
内に残った細胞液を回収バッグに回収する（回収工
程）。今述べた工程の流れを図８に示す。Conventional methods for washing cell suspensions are primarily based on centrifugation. An example using a separation bowl will be described with reference to FIG. 7. First, a cell suspension containing cells is injected from a cell bag 101 into a separation bowl 105 mounted on a centrifuge 104 via a cassette valve 103. It This is a peristaltic pump 10
It is performed through 6 rotations. The separation bowl 105 is rotated at a predetermined speed to separate the cell suspension into cells and a solvent based on the difference in specific gravity. As the cell suspension continues to flow from the cell bag 101, the solvent overflows from the separation bowl 105 and flows into the waste bag 107, but the separated cells remain in the separation bowl 105. This operation is continued until the separation bowl 105 is filled with cells (concentration step). Wash solution bag 10 after the cell suspension is concentrated
A washing solution such as physiological saline is continuously injected into the separation bowl 105 from 8 (washing step). After washing the cells in the separation bowl 105 in this manner, the separation bowl 105
The cell liquid remaining inside is collected in a collection bag (collection step). The flow of the process just described is shown in FIG.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】上記のような洗浄方法
は、分離ボウル内を細胞で満たすことができる程の、多
量の細胞を含んだ細胞浮遊液を洗浄分離する場合には極
めて有効である。これは例えば前述したように、外科手
術時に回収された希釈血液から赤血球のみを濃縮、洗浄
するような場合である。こうした場合の洗浄は、回収さ
れた細胞浮遊液内に含まれる溶媒液（例えばヘパリン）
や不要な溶質（例えばフリーヘモグロビン）を、濃度が
臨床的に使用できる値となるまで除去することが可能で
ある。The above-mentioned washing method is extremely effective in washing and separating a cell suspension containing a large amount of cells such that the separation bowl can be filled with cells. . This is a case where, for example, as described above, only red blood cells are concentrated and washed from the diluted blood collected during the surgical operation. In such a case, the washing should be performed with a solvent solution (eg, heparin) contained in the collected cell suspension.
Unnecessary solutes (eg, free hemoglobin) can be removed until the concentration reaches a clinically usable value.
【０００５】しかしながら、細胞浮遊液中の細胞が少な
く、濃縮後も分離ボウル内を細胞で満たすことができな
いような場合、例えば培養細胞や凍結解凍された幹細胞
などの細胞浮遊液を洗浄分離する場合は、従来の洗浄方
法は十分なものではない。例えば培養細胞は通常、１×
１０９／ｍｌを越える濃度まで培養されることはない
が、細胞数の少ない細胞浮遊液に対して従来の濃縮・洗
浄・回収工程を行っても、回収された細胞浮遊液中に含
まれる溶媒液や不要な溶質の濃度を、測定限界以下まで
下げることは困難である。これは、細胞数が少ない場合
は、細胞や培養液が濃縮時に分離ボウルの壁面に押し付
けられ、薄い層をなすためであると考えられる。培養液
などは比重が高いため、こうした場合に比重の低い洗浄
液を多量に流しても層内をうまく通過せず、十分な洗浄
を行うことができず、臨床的に使用することはできな
い。However, when there are few cells in the cell suspension and the separation bowl cannot be filled with cells even after concentration, for example, when washing and separating cell suspensions such as cultured cells and freeze-thawed stem cells. However, conventional cleaning methods are not sufficient. For example, cultured cells are usually 1 ×
Although it is not cultivated to a concentration exceeding 10 9 / ml, even if the conventional concentration, washing and recovery steps are performed on a cell suspension having a small number of cells, the solvent contained in the recovered cell suspension It is difficult to reduce the concentration of liquids and unnecessary solutes to below the measurement limit. It is considered that this is because when the number of cells is small, the cells and the culture solution are pressed against the wall surface of the separation bowl during the concentration to form a thin layer. Since the culture solution has a high specific gravity, in such a case, even if a large amount of a washing solution having a low specific gravity is passed, it does not pass through the layer well, sufficient washing cannot be performed, and it cannot be clinically used.
【０００６】本発明の課題は、細胞数の少ない細胞浮遊
液を好適に洗浄濃縮する方法、及びこれに用いる装置を
提供することである。別の課題は、特に培養細胞や凍結
解凍された幹細胞などの細胞浮遊液の洗浄分離に好適な
方法、及びそのための装置を提供することである。An object of the present invention is to provide a method for suitably washing and concentrating a cell suspension containing a small number of cells, and an apparatus used therefor. Another object is to provide a method particularly suitable for washing and separating cell suspensions such as cultured cells and freeze-thawed stem cells, and an apparatus therefor.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め本発明は、図８に関して上述したような従来法の装置
に対して蠕動ポンプを追加し、濃縮工程、洗浄工程の他
に、新たに稀釈撹拌工程を加え、これらの工程によって
サイクル即ち循環処理を構築し、これを任意の回数繰り
返すことを特徴とする。特に稀釈撹拌工程は、対象とす
る細胞浮遊液が当初収容されていた容器、典型的には可
撓性のプラスチックバッグに対して、分離ボウルから濃
縮物を戻す処理を包含する。但し、この場合に当初のも
のとは異なる容器を用いることも、本発明の範囲内にあ
る。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention adds a peristaltic pump to the conventional apparatus as described above with reference to FIG. The method is characterized in that a dilution stirring step is added to, a cycle, that is, a circulation process is constructed by these steps, and this is repeated any number of times. In particular, the dilution and agitation step involves returning the concentrate from the separation bowl to a container, typically a flexible plastic bag, that initially contained the cell suspension of interest. However, it is within the scope of the present invention to use a container different from the original one in this case.
【０００８】本発明によって稀釈洗浄される細胞浮遊液
は、対象細胞と、溶媒液と、溶質とを含む。対象細胞は
前述のＣＴＬ、ＮＫ、ＬＡＫ等の培養細胞又は幹細胞な
どであるが、特に限定するものではない。溶媒液は例え
ば培養液であり、ＲＰＭＩ培地や無血清培地などが含ま
れるが、これらに限定されるものではなく、任意に調製
されることができる。溶質についても限定はなく、一般
に培地中に添加される成分、例えば各種の成長因子、成
長誘導因子、サイトカイン、モノカイン、凍害防止剤な
どがある。具体的な例としては、培地に添加される薬剤
であるＩＬ−２、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＳＩＬ−６Ｒ、Ｆ
ｌｔ３、ＴＰＯ、ＤＭＳＯ、ＬＰＳなどが考えられる
が、これらの例示には何ら限定的な意図はない。The cell suspension to be diluted and washed according to the present invention contains target cells, a solvent solution, and a solute. The target cells are the above-mentioned cultured cells such as CTL, NK, and LAK, stem cells, and the like, but are not particularly limited. The solvent solution is, for example, a culture solution, and includes, but is not limited to, RPMI medium and serum-free medium, and can be arbitrarily prepared. The solute is also not limited, and there are components generally added to the medium, such as various growth factors, growth inducing factors, cytokines, monokines, and antifreezing agents. Specific examples include IL-2, IL-6, SCF, SIL-6R, and F which are drugs added to the medium.
Although lt3, TPO, DMSO, LPS, etc. are considered, these examples are not intended to be limiting in any way.
【０００９】洗浄液及び稀釈液には、生理食塩水やリン
酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いることができるが、他の任
意に調製された洗浄液及び／又は稀釈液を使用すること
も可能である。通常の場合、本発明によって処理される
細胞浮遊液の濃度は、１×１０９／ｍｌを越えない。ま
た必要に応じて、細胞浮遊液は最初の濃縮前に、稀釈液
で稀釈することができる。As the washing solution and the diluting solution, physiological saline or a phosphate buffer solution (PBS) can be used, but it is also possible to use other washing solutions and / or diluting solutions prepared arbitrarily. In the usual case, the concentration of the cell suspension treated according to the invention does not exceed 1 × 10 9 / ml. Also, if necessary, the cell suspension can be diluted with a diluent before the first concentration.
【００１０】濃縮に用いられる分離ボウルとしては、例
えば容積が３０〜３００ｍｌ程度、例えば１００ｍｌの
ものを用いることができる。通常、細胞浮遊液は第１の
容器、典型的には可撓性のプラスチックバッグから第１
のライン（導管）を介して、第１の蠕動ポンプによって
分離ボウルへと送り込まれる。濃縮に際しての細胞浮遊
液の流入速度は例えば５０〜１５０ｍｌ／分の範囲にあ
るが、細胞浮遊液の種類や濃度に応じて、これと異なる
範囲の流量を用いることもできる。また分離ボウルの回
転速度は、大きさによっても異なるが、一般には３００
０〜８０００ｒｐｍ程度である。細胞浮遊液を注入しな
がら分離ボウルを遠心回転させると、細胞浮遊液は比重
に応じてそれぞれの成分に分離され、比重の軽い溶媒液
や溶質は分離ボウルから溢れ出して排出され、比重の重
い細胞は分離されてボウル内に残存する。次いで洗浄工
程により、分離ボウル内の濃縮細胞浮遊液を洗浄する。
これは例えば、第１の蠕動ポンプとは異なる第２の蠕動
ポンプを用いて、分離ボウルに対して第２のラインから
洗浄液を５０〜１５０ｍｌ／分程度の流量で導入するこ
とによって行われる。また分離ボウルの容積や、対象と
する細胞浮遊液の種類によっても異なるが、洗浄液は例
えば洗浄工程一回当たり、２００〜３００ｍｌ程度供給
される。但し従来技術の項で述べたように、培養細胞や
凍結解凍された幹細胞のように細胞数が少ない細胞浮遊
液を対象とする場合、洗浄効率は高くない。The separating bowl used for the concentration may have a volume of, for example, about 30 to 300 ml, for example, 100 ml. Usually, the cell suspension will come from a first container, typically a flexible plastic bag.
Via a line (conduit) from the first peristaltic pump to the separation bowl. The inflow rate of the cell suspension during concentration is, for example, in the range of 50 to 150 ml / min, but a flow rate different from this range can be used depending on the type and concentration of the cell suspension. The rotation speed of the separation bowl varies depending on the size, but is generally 300
It is about 0 to 8000 rpm. When the separation bowl is spun and rotated while injecting the cell suspension, the cell suspension is separated into each component according to the specific gravity, and the solvent liquid or solute with a light specific gravity overflows from the separation bowl and is discharged. The cells are separated and remain in the bowl. Then, the concentrated cell suspension in the separation bowl is washed by a washing step.
This is performed, for example, by using a second peristaltic pump different from the first peristaltic pump and introducing the cleaning liquid into the separation bowl from the second line at a flow rate of about 50 to 150 ml / min. The washing liquid is supplied, for example, in an amount of about 200 to 300 ml per washing step, although it depends on the volume of the separation bowl and the type of the target cell suspension. However, as described in the section of the prior art, the washing efficiency is not high when a cell suspension containing a small number of cells such as cultured cells or freeze-thawed stem cells is targeted.
【００１１】そこで本発明によれば、洗浄工程に続いて
上述の稀釈撹拌工程が実施される。即ち稀釈撹拌工程に
おいては、典型的には洗浄された濃縮細胞浮遊液を第１
の容器に戻した後、この第１の容器に対し、稀釈液を収
容している容器（可撓性プラスチックバッグ）から第２
のラインを介して、稀釈液を高速で供給する。第２のラ
インは、分離ボウルと第１のポンプの間で第１のライン
に対して結合されている。従って稀釈液の供給は、第１
の蠕動ポンプと第２の蠕動ポンプを同じ方向に同じ速度
で回転させることによって実施することができる。これ
によって容器内の濃縮細胞浮遊液が有効に稀釈撹拌さ
れ、その後に行われるさらなる濃縮、洗浄、稀釈撹拌の
サイクルの繰り返しによって、細胞浮遊液中に含まれる
溶媒液及び溶質の残留濃度を、測定装置の測定限界以下
まで低下させることができるようになる。ここで高速と
は通常１００〜２５０ｍｌ／分、好ましくは１５０〜２
５０ｍｌ／分、最も好ましくは１８０〜２２０ｍｌ／分
程度であるが、これは必要とされる撹拌の程度によって
異なることは言うまでもない。例えば後述する装置にお
いては、稀釈流入量の設定は５ｍｌステップで、１０〜
２５０ｍｌ／分の範囲で変更可能である。また稀釈液は
第１の容器内の濃縮細胞浮遊液に対し、好ましくは２〜
４倍の量で供給される。Therefore, according to the present invention, the above-mentioned dilution stirring step is carried out following the washing step. That is, in the dilution stirring process, the washed concentrated cell suspension is typically used as the first solution.
After returning to the first container, the first container is replaced with the second container from the container (flexible plastic bag) containing the diluted solution.
The dilution liquid is supplied at high speed through the line. The second line is coupled to the first line between the separation bowl and the first pump. Therefore, the first
By rotating the peristaltic pump and the second peristaltic pump in the same direction at the same speed. This effectively dilutes and agitates the concentrated cell suspension in the container, and measures the residual concentration of the solvent solution and solute contained in the cell suspension by repeating the cycle of further concentration, washing, and dilution stirring performed after that. It becomes possible to lower the measurement limit of the device or less. The high speed here is usually 100 to 250 ml / min, preferably 150 to 2
It is about 50 ml / min, most preferably about 180 to 220 ml / min, but it goes without saying that this depends on the degree of stirring required. For example, in the device described below, the dilution flow rate is set in 5 ml steps from 10 to 10.
It can be changed in the range of 250 ml / min. The diluted solution is preferably 2 to the concentrated cell suspension in the first container.
Supplied in four times the amount.
【００１２】濃縮、洗浄、稀釈撹拌からなるサイクル
は、所望とする数だけ繰り返すことができ、この回数は
対象とする細胞の種類や量、溶媒液や溶質の種類や量に
よっても異なるが、例を挙げるならば２〜５回程度の範
囲にある。また１サイクルに要する時間は、５〜１０分
程度である。The cycle consisting of concentration, washing, and dilution stirring can be repeated as many times as desired, and this number varies depending on the type and amount of target cells, and the type and amount of solvent solution and solute. For example, it is in the range of about 2 to 5 times. The time required for one cycle is about 5 to 10 minutes.
【００１３】所望のサイクル数が完了した後、最後に行
われた洗浄工程の後に、分離ボウル内に残存する濃縮細
胞浮遊液は、回収用の容器に送られる。これは例えば、
回収用の容器を第１のポンプと第１の容器の間で第１の
ラインから分岐した第３のラインに接続し、第１のポン
プを動作させることによって達成される（回収工程）。
回収後、空になった分離ボウル内に洗浄液を注いで洗浄
を行い（リンス工程）、その残留液をさらに回収用容器
に集めることができる（最終回収）。こうした処理の流
れを図４及び図５に示す。図４では循環サイクルは最初
に細胞浮遊液に対して稀釈液を高速で注入して稀釈撹拌
を行うことから開始されており、他方図５は循環サイク
ルが濃縮工程から開始される場合を示している。なお分
離ボウルから流出される廃液は、分離ボウルから延びる
第４のラインに接続された廃液容器に収容することがで
きる。After the desired number of cycles has been completed, after the last washing step, the concentrated cell suspension remaining in the separation bowl is sent to a collection container. This is for example
This is achieved by connecting the collection container to the third line branched from the first line between the first pump and the first container and operating the first pump (collection step).
After the recovery, the cleaning liquid can be poured into the empty separation bowl for cleaning (rinsing step), and the residual liquid can be further collected in a recovery container (final recovery). The flow of such processing is shown in FIGS. 4 and 5. In FIG. 4, the circulation cycle is started by first injecting the diluting solution into the cell suspension at a high speed to carry out dilution stirring, while FIG. 5 shows the case where the circulation cycle is started from the concentration step. There is. The waste liquid flowing out from the separation bowl can be stored in the waste liquid container connected to the fourth line extending from the separation bowl.
【００１４】本発明の方法を実施するための装置は、必
要に応じてラインを開放又は閉鎖するバルブや、ライン
中の流れを監視するセンサー、圧力モニター、除菌フィ
ルターなどを含む。これらの配置や機能については当業
者には自明であるので、ここで詳述することはしない。
こうした装置はコンピュータ制御され、本発明の方法を
当初の設定に応じて完全に自動的に、また閉鎖系で実施
することができる。The apparatus for carrying out the method of the present invention includes a valve for opening or closing the line as necessary, a sensor for monitoring the flow in the line, a pressure monitor, a sterilization filter and the like. These arrangements and functions are obvious to those skilled in the art and will not be described in detail here.
Such a device is computer controlled and is able to carry out the method of the invention completely automatically depending on the initial settings and in a closed system.
【００１５】[0015]
【発明の実施の形態】本発明の装置の一実施形態を図１
から図３に示す。この装置は、対象細胞、溶媒液、及び
溶質を含む細胞浮遊液を収容する第１の容器１と、洗浄
液を収容する第２の容器２と、稀釈液を収容する第３の
容器３と、第１の容器１から分離ボウル４へ延びる第１
のライン５に配置された第１のポンプ（細胞液ポンプ）
６と、分離ボウル４を遠心回転させる手段としての遠心
器７と、第２の容器２及び／又は第３の容器３から分離
ボウルへ延びる第２のライン８に配置された第２のポン
プ（洗浄液ポンプ）９とを含む。第２のライン８は分離
ボウル４と第１のポンプ６の間で第１のライン５に接続
されている。１０から１５はクランプバルブ、１６は除
菌フィルター、１７はラインセンサー、１８は圧力モニ
ターフィルター、１９及び２０はそれぞれエアセンサー
である。また第１のポンプ６と第１の容器１の間で第１
のライン５からは第３のライン２１が分岐し、そこに細
胞回収用の第４の容器２２が接続されている。さらに分
離ボウル４から延びる第４のライン２３には、分離ボウ
ル４から流出される廃液を収容する第５の容器２４が接
続されている。ポンプ６及び９、遠心器７、バルブ１０
から１５、ラインセンサー１７、エアセンサー１９及び
２０を除く部分は、一体に結合された使い捨てのディス
ポーザブルを構成し、容器に所定の液を収容し回路を接
続した後、本発明を完全に自動的に、閉鎖系で行うこと
が可能になる。図２及び図３は明確化のために、ディス
ポーザブルを装着していない状態において、本発明の装
置を概略的に示している。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT FIG. 1 shows an embodiment of the device of the present invention.
To FIG. This apparatus comprises a first container 1 for containing a cell suspension containing target cells, a solvent solution, and a solute, a second container 2 for containing a washing solution, and a third container 3 for containing a diluting solution. First extending from first container 1 to separation bowl 4
First pump (cell fluid pump) placed on line 5 of
6, a centrifuge 7 as means for centrifuging the separation bowl 4, and a second pump (2) arranged in a second line 8 extending from the second container 2 and / or the third container 3 to the separation bowl ( Cleaning solution pump) 9. The second line 8 is connected to the first line 5 between the separation bowl 4 and the first pump 6. 10 to 15 are clamp valves, 16 is a sterilization filter, 17 is a line sensor, 18 is a pressure monitor filter, and 19 and 20 are air sensors. In addition, the first pump 6 and the first container 1 are connected between the first
A third line 21 branches off from the line 5 and the fourth container 22 for cell recovery is connected thereto. Further, to the fourth line 23 extending from the separation bowl 4, a fifth container 24 containing the waste liquid flowing out from the separation bowl 4 is connected. Pumps 6 and 9, centrifuge 7, valve 10
To 15, the line sensor 17, the air sensors 19 and 20 constitute a single-use disposable disposable, and after the predetermined liquid is contained in the container and the circuit is connected, the present invention is completely automatic. In addition, it becomes possible to perform it in a closed system. 2 and 3 schematically show the device of the invention without the disposable for clarity.
【００１６】なお遠心分離方式においては、対象とする
細胞は遠心負荷により、分離ボウルの壁面に対して押し
付けられるが、この場合に細胞の粘着性が高いと壁面に
対して付着しがちであり、これが回収される細胞数に影
響を及ぼしうる。そこで分離ボウル４はその内壁に、適
当な付着防止処理を施したものであることが好ましい。
例えば細胞付着防止コーティングとして、２−メタクリ
ロイルオキシエチルホスホリルコリン共重合体のような
ポリマーを塗布することができる。In the centrifugal separation method, the target cells are pressed against the wall surface of the separation bowl by the centrifugal load. In this case, if the cells are highly sticky, they tend to adhere to the wall surface. This can affect the number of cells recovered. Therefore, it is preferable that the inner wall of the separation bowl 4 is subjected to an appropriate anti-adhesion treatment.
For example, a polymer such as 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine copolymer can be applied as a cell adhesion preventing coating.
【００１７】本発明の装置は、第１のポンプ６によって
第１の容器１から第１のライン５を通して分離ボウル４
に細胞浮遊液を導入し、遠心器７により細胞浮遊液を分
離ボウル４で遠心分離して濃縮し、第２のポンプ９によ
って第２の容器２から第２のライン８を通して分離ボウ
ル４へと洗浄液を導入して洗浄し、第１のポンプ６によ
り分離ボウル４から第１のライン５を通して第１の容器
１へと濃縮細胞浮遊液を戻し、第１のポンプ６及び第２
のポンプ９によって第３の容器３から第２のライン８及
び第１のライン５を通して第１の容器１へと稀釈液を注
入して第１の容器１内で濃縮細胞浮遊液を稀釈撹拌し、
稀釈撹拌された濃縮細胞浮遊液を再度第１のポンプ６に
より第１の容器１から第１のライン５を通して分離ボウ
ル４に導入するよう動作可能に構成されている。一例を
挙げて、これら一連の動作をより詳しく説明する。The device of the present invention comprises a separation bowl 4 from a first container 1 through a first line 5 by means of a first pump 6.
The cell suspension is introduced into the column, the cell suspension is centrifugally concentrated in the separation bowl 4 by the centrifuge 7, and concentrated by the second pump 9 from the second container 2 through the second line 8 to the separation bowl 4. The washing liquid is introduced and washed, and the concentrated cell suspension liquid is returned from the separation bowl 4 to the first container 1 through the first line 5 by the first pump 6 and the first pump 6 and the second pump 6.
The diluted cell suspension is injected into the first container 1 from the third container 3 through the second line 8 and the first line 5 by the pump 9 of FIG. ,
The concentrated cell suspension that has been diluted and agitated is again operable to be introduced into the separation bowl 4 from the first container 1 through the first line 5 by the first pump 6. The series of operations will be described in more detail with an example.
【００１８】まず第１のポンプ６及び第２のポンプ９を
適宜動作させて、第１のライン５及び第２のライン８か
らのエアのパージ及びプライミングを行う。次いで、濃
縮工程から開始される循環処理を行う。図１を参照する
と、細胞浮遊液は細胞液ポンプ６により第１の容器即ち
細胞バッグ１から第１のライン５を通って、回転する遠
心器７に装着された分離ボウル４に注入される。細胞浮
遊液は分離ボウル４内で比重差に応じて細胞と溶媒液、
溶質に分かれ、そして分離ボウル４内が溶媒液で満たさ
れ一杯になると、分離ボウル４の出口より溶媒液上清が
第４のライン２３を通して第５の容器たる廃液バッグ２
４に排出される。細胞浮遊液の流入を継続すると、低比
重の成分は排出され、分離ボウル４内には細胞を含む高
比重の成分が残存することになる。分離ボウル４から排
出される成分は、ラインセンサー１７によって監視され
る。First, the first pump 6 and the second pump 9 are appropriately operated to purge and prime air from the first line 5 and the second line 8. Then, a circulation process starting from the concentration step is performed. Referring to FIG. 1, the cell suspension is injected from a first container or cell bag 1 by a cell liquid pump 6 through a first line 5 into a separation bowl 4 mounted on a rotating centrifuge 7. In the separation bowl 4, the cell suspension is divided into cells and a solvent solution according to the difference in specific gravity,
When the solute is separated and the inside of the separation bowl 4 is filled with the solvent liquid and becomes full, the solvent liquid supernatant is discharged from the outlet of the separation bowl 4 through the fourth line 23 to the waste container bag 2 serving as the fifth container.
It is discharged to 4. When the inflow of the cell suspension is continued, the low specific gravity component is discharged, and the high specific gravity component including cells remains in the separation bowl 4. The components discharged from the separation bowl 4 are monitored by the line sensor 17.
【００１９】次に洗浄工程に移る。細胞液ポンプ６は停
止され、洗浄液ポンプ９が回転されて、洗浄液が第２の
容器即ち洗浄液バッグ２から第２のライン８を通って分
離ボウル４に注入され、分離ボウル４内の溶媒液を洗浄
する。分離ボウル４からあふれた溶媒液、溶質を含む洗
浄液は、第４のライン２３を通して廃液バッグ２４に排
出される。次いで戻し工程を行う。遠心器７及び洗浄液
ポンプ９の回転は停止され、細胞液ポンプ６が濃縮工程
の場合と逆に回転されて、分離ボウル４内に残っている
濃縮され洗浄された細胞浮遊液は、第１のライン５を通
して細胞バッグ１に戻される。Next, the cleaning process is performed. The cell liquid pump 6 is stopped, the washing liquid pump 9 is rotated, and the washing liquid is injected from the second container, that is, the washing liquid bag 2 into the separation bowl 4 through the second line 8 to remove the solvent liquid in the separation bowl 4. To wash. The cleaning liquid containing the solvent liquid and the solute overflowing from the separation bowl 4 is discharged to the waste liquid bag 24 through the fourth line 23. Then, a returning process is performed. The rotation of the centrifuge 7 and the washing liquid pump 9 is stopped, and the cell liquid pump 6 is rotated in the opposite direction to the case of the concentration step, so that the concentrated and washed cell suspension remaining in the separation bowl 4 is It is returned to the cell bag 1 through the line 5.
【００２０】戻し工程の完了後、洗浄液ポンプ９と細胞
液ポンプ６が図１で同時に同じ流速で左回転されて、第
３の容器３から細胞バッグ１に稀釈液を注入し、細胞バ
ッグ１内で濃縮細胞浮遊液を稀釈撹拌する。これを稀釈
撹拌工程又は単に稀釈工程という。その後、細胞液ポン
プ６が再び逆転（右回転）され、細胞バッグ１内の稀釈
撹拌された濃縮細胞浮遊液は第１のライン５を通して分
離ボウル４内に注入され、濃縮工程が行われる。この様
に濃縮工程、洗浄工程、戻し工程、稀釈工程からなる一
連の循環処理工程を任意の回数繰り返した後、最終サイ
クルの洗浄工程の後に、最後に分離ボウル４内に残った
細胞浮遊液を、細胞液ポンプ６を左回転させて、第１の
ラインから分岐する第３のライン２１を介して第４の容
器たる回収バッグ２２に集める（回収工程）。その後、
洗浄工程の場合と同様にして、洗浄液ポンプ９が回転さ
れ、洗浄液が洗浄液バッグ２から第２のライン８を通っ
て、空になった分離ボウル４に注入され、分離ボウル４
内を洗う（リンス工程）。その残留液は、回収バッグ２
２に集められる（最終回収）。これら一連の動作は完全
に自動的に行うことができる。After completion of the returning step, the washing liquid pump 9 and the cell liquid pump 6 are rotated counterclockwise at the same flow rate in FIG. 1 at the same time to inject the diluting solution into the cell bag 1 from the third container 3 and Dilute and stir the concentrated cell suspension. This is called a diluting and stirring step or simply a diluting step. Thereafter, the cell liquid pump 6 is reversed (rotated right) again, and the concentrated and stirred concentrated cell suspension in the cell bag 1 is injected into the separation bowl 4 through the first line 5 to perform the concentration step. After repeating a series of circulation steps including the concentration step, the washing step, the returning step, and the diluting step as desired, the cell suspension remaining in the separation bowl 4 is finally removed after the final cycle of the washing step. , The cell fluid pump 6 is rotated counterclockwise and is collected in the collection bag 22 which is the fourth container via the third line 21 branched from the first line (collection step). afterwards,
In the same manner as in the cleaning step, the cleaning liquid pump 9 is rotated, and the cleaning liquid is injected from the cleaning liquid bag 2 through the second line 8 into the empty separation bowl 4 and the separation bowl 4
Wash the inside (rinse process). The residual liquid is collected in the collection bag 2
Collected in 2 (final recovery). These series of operations can be performed completely automatically.
【００２１】なお、先に図４及び図５に関して述べたよ
うに、上記の実施形態では、循環処理は濃縮工程、洗浄
工程、戻し工程、稀釈工程の順序でサイクルが構成され
ているが、他の実施形態では、特に細胞バッグ１内の細
胞浮遊液の量が少ないような場合、最初に細胞バッグ１
内の細胞浮遊液を稀釈撹拌し、循環処理を稀釈工程、濃
縮工程、洗浄工程、戻し工程の順序で構成してもよい。
また図１で示されるように、上記の例では第２のライン
８はバルブ１２から１４を用いて分岐し、洗浄液バッグ
２と稀釈液バッグ３をバルブ１３及び１２の先に接続し
ているが、さらにバルブ１４の先に培養液や置換液のバ
ッグ又は容器を繋ぐこともできる。置換液は、リンス工
程の終了後に細胞を保護する目的で洗浄液と置換される
細胞保護液であり、例えばアルブミンを加えた生理食塩
水である。培養液は、洗浄後にさらに培養を続ける場合
に、洗浄液と置換することを目的として装着される。As described above with reference to FIGS. 4 and 5, in the above embodiment, the circulation process has a cycle consisting of a concentration process, a washing process, a returning process and a dilution process. In the embodiment of the present invention, especially when the amount of cell suspension in the cell bag 1 is small, the cell bag 1
The cell suspension liquid may be diluted and stirred, and the circulation process may be constituted by a dilution process, a concentration process, a washing process, and a returning process.
Further, as shown in FIG. 1, in the above example, the second line 8 is branched by using valves 12 to 14, and the cleaning solution bag 2 and the diluting solution bag 3 are connected to the ends of the valves 13 and 12. Further, a bag or container of the culture solution or the replacement solution can be connected to the end of the valve 14. The replacement solution is a cell protection solution that is replaced with a washing solution for the purpose of protecting cells after the completion of the rinse step, and is, for example, physiological saline containing albumin. The culture solution is attached for the purpose of replacing with the wash solution when the culture is further continued after the washing.
【００２２】[0022]
【実施例】細胞浮遊液として、培養ＬＡＫ細胞を準備し
た。これは末梢血より採取した全血から分離したリンパ
球を、固相化ＣＤ３抗体とＩＬ−２を混合した培地の中
で１４日間培養して調製されたものである。主としてＲ
ＰＭＩ１６４０とＬＡＫ細胞からなるこの細胞浮遊液１
６００ｍｌを、図１に示すような回路を用いて濃縮洗浄
を行った。細胞浮遊液は１００ｍｌ／分の流量で、６０
００ｒｐｍで回転する容積１００ｍｌの分離ボウルに注
入し、濃縮した。次いで洗浄液として生理食塩水を用
い、分離ボウルへと１００ｍｌ／分の流量で供給し、洗
浄を行った。３００ｍｌの洗浄液を供給した後、分離ボ
ウル内に残っている濃縮され洗浄された細胞浮遊液を細
胞バッグに戻した。次いで稀釈液として生理食塩水を用
い、洗浄液ポンプと細胞液ポンプを２００ｍｌ／分の流
量で回転して細胞バッグに注入し、細胞バッグ内の濃縮
細胞浮遊液を稀釈撹拌した。供給した稀釈液は４倍稀釈
となる量であった。その後再度濃縮工程を開始した。濃
縮工程、洗浄工程、戻し工程、稀釈工程からなる一連の
循環処理工程を３回繰り返した。最終サイクルの洗浄工
程の後に、最後に分離ボウル内に残った細胞浮遊液を回
収バッグに集め、リンス工程及び最終回収工程を行っ
た。得られた細胞浮遊液中のＩＬ−２の濃度を測定して
除去率を求めた。測定機器はマイクロプレートリーダー
Ｍ−Ｍａｘ（和光純薬から販売）であった。一方、同じ
細胞浮遊液６００ｍｌを図８のような従来の回路を用い
て、図９のフローに従って同様に洗浄し、ＩＬ−２の濃
度を測定した。これらの結果を図６のデータ表に示す。
本発明の方法及び装置によれば、ＩＬ−２の濃度を測定
限界以下まで低減させることが可能であり、従来法と比
較して洗浄は極めて有効に行われる。Example: Cultured LAK cells were prepared as a cell suspension. This is prepared by culturing lymphocytes separated from whole blood collected from peripheral blood for 14 days in a medium in which immobilized CD3 antibody and IL-2 are mixed. Mainly R
This cell suspension 1 consisting of PMI1640 and LAK cells
600 ml was concentrated and washed using a circuit as shown in FIG. Cell suspension is 60 ml at a flow rate of 100 ml / min.
Pour into a 100 ml volume separation bowl rotating at 00 rpm and concentrate. Then, physiological saline was used as a cleaning solution, and the solution was supplied to the separation bowl at a flow rate of 100 ml / min for cleaning. After supplying 300 ml of the washing solution, the concentrated and washed cell suspension remaining in the separation bowl was returned to the cell bag. Then, using physiological saline as a diluting solution, the washing liquid pump and the cell liquid pump were rotated at a flow rate of 200 ml / min to be injected into the cell bag, and the concentrated cell suspension in the cell bag was diluted and stirred. The supplied diluted solution was a 4-fold diluted solution. Then, the concentration step was started again. A series of circulation treatment steps including a concentration step, a washing step, a returning step and a diluting step were repeated three times. After the washing step of the final cycle, the cell suspension finally remaining in the separation bowl was collected in a collection bag, and the rinse step and the final collection step were performed. The concentration of IL-2 in the obtained cell suspension was measured to determine the removal rate. The measuring instrument was a microplate reader M-Max (sold by Wako Pure Chemical Industries). On the other hand, 600 ml of the same cell suspension was washed in the same manner according to the flow of FIG. 9 using a conventional circuit as shown in FIG. 8, and the concentration of IL-2 was measured. The results are shown in the data table of FIG.
According to the method and apparatus of the present invention, it is possible to reduce the concentration of IL-2 to below the measurement limit, and cleaning is performed very effectively as compared with the conventional method.
【００２３】[0023]
【発明の効果】本発明によれば、洗浄液ポンプと細胞液
ポンプを用いて稀釈液を細胞バッグに高速で注入する稀
釈撹拌工程、稀釈された細胞浮遊液を分離ボウルへ注入
する濃縮工程、次に洗浄液を分離ボウル内に注入する洗
浄工程、ボウル内に残った細胞液を細胞バッグへ返す戻
し工程から構成される一連の循環処理工程を任意回数繰
り返すことにより、最終的に回収される細胞浮遊液の洗
浄効率の向上が図れる。この場合、回収された細胞浮遊
液中に含まれる溶媒液及び溶質の濃度を、それぞれにつ
いて測定機器で測定される値が、測定最小値以下となる
値まで下げることが出来る。こうした測定最小値は、例
えばＩＬ−２では０．８Ｕ／ｍｌ（マイクロプレートリ
ーダー）、エンドトキシンでは０．５ｐｇ／ｍｌ（ウエ
ルリーダーＳＫ００３（株）サイニクス）、アルブミン
で０．４ｍｇ／ｄｌ（全自動免疫科学分析装置ＬＸ６０
００（株）栄研化学）である。According to the present invention, a diluting and stirring step of injecting a diluted solution into a cell bag at a high speed using a washing solution pump and a cell solution pump, a concentration step of injecting a diluted cell suspension into a separation bowl, Cell suspension finally collected by repeating a series of circulation treatment steps consisting of a washing step of injecting the washing solution into the separation bowl and a returning step of returning the cell solution remaining in the bowl to the cell bag. The cleaning efficiency of the liquid can be improved. In this case, the concentrations of the solvent solution and the solute contained in the recovered cell suspension can be reduced to values at which the values measured by the measuring device for each are below the minimum measurement value. The minimum value of such measurement is, for example, 0.8 U / ml for IL-2 (microplate reader), 0.5 pg / ml for endotoxin (Wellreader SK003 Co., Ltd. Sinix), 0.4 mg / dl for albumin (fully automated immunization). Scientific analyzer LX60
00 (Eiken Chemical Co., Ltd.).
【００２４】また、本発明の装置を用いることで、クリ
ーンベンチや無菌室を使わなくても無菌的操作が可能と
なり、作業者の労力及び拘束時間を短縮でき、完全自動
で細胞浮遊液の稀釈・濃縮・洗浄・回収の処理作業を行
うことが出来る。By using the apparatus of the present invention, aseptic operation can be performed without using a clean bench or a sterile room, the labor and restraint time of the operator can be shortened, and the cell suspension can be diluted completely automatically.・ Concentration, washing, and recovery processing work can be performed.
【図１】本発明の１つの実施形態を示す回路図である。FIG. 1 is a circuit diagram showing one embodiment of the present invention.
【図２】図１の回路に用いられる装置の１つの実施形態
を示す平面図である。2 is a plan view showing one embodiment of an apparatus used in the circuit of FIG.
【図３】図２の装置の正面図である。FIG. 3 is a front view of the device of FIG.
【図４】本発明の方法の１つの実施形態を示すフロー図
である。FIG. 4 is a flow diagram illustrating one embodiment of the method of the present invention.
【図５】本発明の方法の別の実施形態を示すフロー図で
ある。FIG. 5 is a flow diagram showing another embodiment of the method of the present invention.
【図６】本発明の実施例の有効性を例証するためのデー
タ表である。FIG. 6 is a data table illustrating the effectiveness of the examples of the present invention.
【図７】従来技術を示す回路図である。FIG. 7 is a circuit diagram showing a conventional technique.
【図８】従来技術の方法によるフロー図である。FIG. 8 is a flow diagram according to a prior art method.
１ 第１の容器 ２ 第２の容器 ３ 第３の容器 ４ 分離ボウル ５ 第１のライン ６ 第１のポンプ ７ 遠心器 ２ 第２のライン ９ 第２のポンプ ２１ 第３のライン ２２ 第４の容器 ２３ 第４のライン ２４ 第５の容器 1 first container 2 Second container 3rd container 4 separate bowls 5 First line 6 First pump 7 Centrifuge 2 second line 9 Second pump 21 Third Line 22 Fourth Container 23 Fourth Line 24 Fifth Container
Claims (14)
浮遊液を容器中に準備するステップと、前記細胞浮遊液
を分離ボウルに導入するステップと、前記細胞浮遊液を
前記分離ボウルで遠心分離して濃縮し、濃縮細胞浮遊液
とするステップと、前記濃縮細胞浮遊液を洗浄液で洗浄
するステップと、洗浄された前記濃縮細胞浮遊液を稀釈
液で稀釈撹拌するステップと、前記濃縮、洗浄、及び稀
釈撹拌するステップからなるサイクルを所定回数繰り返
すステップと、最後に洗浄された濃縮細胞浮遊液を回収
するステップとからなる、細胞の稀釈洗浄方法。1. A step of preparing a cell suspension containing target cells, a solvent solution, and a solute in a container, introducing the cell suspension into a separation bowl, and centrifuging the cell suspension in the separation bowl. Separating and concentrating to obtain a concentrated cell suspension, washing the concentrated cell suspension with a washing solution, diluting and stirring the washed concentrated cell suspension with a diluting solution, concentrating and washing A method for diluting and washing cells, which comprises a step of repeating a cycle including a step of diluting and stirring for a predetermined number of times, and a step of collecting the finally washed concentrated cell suspension.
凍された幹細胞を稀釈液で稀釈することによって準備さ
れる、請求項１の方法。2. The method of claim 1, wherein the cell suspension is prepared by diluting cultured cells or freeze-thawed stem cells with a diluent.
９／ｍｌ以下である、請求項１又は２の方法。3. The cell concentration in the cell suspension is 1 × 10.
The method according to claim 1 or 2, which is 9 9 / ml or less.
された濃縮細胞浮遊液に対して前記稀釈液を１００〜２
５０ｍｌ／分の流量で注入することによって行われる、
請求項１から３の何れか１の方法。4. The diluting and stirring step comprises adding 100 to 2 of the diluted cell suspension to the washed concentrated cell suspension.
By injecting at a flow rate of 50 ml / min,
The method according to any one of claims 1 to 3.
る、請求項４の方法。5. The method of claim 4, wherein the flow rate is 150-250 ml / min.
された濃縮細胞浮遊液を前記分離ボウルから前記容器に
戻し、この容器に対して前記稀釈液を注入することによ
って行われる、請求項１から５の何れか１の方法。6. The method according to claim 1, wherein the step of diluting and stirring is performed by returning the washed concentrated cell suspension from the separation bowl to the container, and injecting the diluting solution into the container. 5. Any one of 5 methods.
された濃縮細胞浮遊液に対して前記稀釈液を２〜４倍量
供給することによって行われる、請求項１から６の何れ
か１の方法。7. The method according to claim 1, wherein the step of diluting and stirring is performed by supplying the washed concentrated cell suspension with 2 to 4 times the volume of the diluted solution. .
浮遊液を収容する第１の容器と、洗浄液を収容する第２
の容器と、稀釈液を収容する第３の容器と、前記第１の
容器から分離ボウルへ延びる第１のラインに配置された
第１のポンプと、前記分離ボウルを遠心回転させる手段
と、前記第２の容器及び／又は前記第３の容器から前記
分離ボウルへ延びる第２のラインに配置された第２のポ
ンプとを含み、前記第２のラインが前記分離ボウルと前
記第１のポンプの間で前記第１のラインに接続されてな
り、 前記第１のポンプによって前記第１の容器から前記第１
のラインを通して前記分離ボウルに前記細胞浮遊液を導
入し、前記遠心回転させる手段により前記細胞浮遊液を
前記分離ボウルで遠心分離して濃縮し、前記第２のポン
プによって前記第２の容器から前記第２のラインを通し
て前記分離ボウルへと前記洗浄液を導入して洗浄し、前
記第１のポンプにより前記分離ボウルから前記第１のラ
インを通して前記第１の容器へと濃縮細胞浮遊液を戻
し、前記第１のポンプ及び前記第２のポンプによって前
記第３の容器から前記第２のライン及び前記第１のライ
ンを通して前記第１の容器へと前記稀釈液を注入して前
記第１の容器内で前記濃縮細胞浮遊液を稀釈撹拌し、稀
釈撹拌された前記濃縮細胞浮遊液を再度前記第１のポン
プにより前記第１の容器から前記第１のラインを通して
前記分離ボウルに導入するよう動作可能に構成された、
細胞の稀釈洗浄装置。8. A first container containing a cell suspension containing target cells, a solvent solution, and a solute, and a second container containing a washing solution.
A container, a third container containing a diluting solution, a first pump arranged in a first line extending from the first container to the separation bowl, means for centrifugally rotating the separation bowl, and A second pump disposed in a second line extending from a second container and / or the third container to the separation bowl, the second line of the separation bowl and the first pump Connected to the first line between the first container and the first container by the first pump.
The cell suspension is introduced into the separation bowl through the line, and the cell suspension is concentrated in the separation bowl by the centrifugal rotation means, and the cell suspension is concentrated from the second container by the second pump. The washing solution is introduced into the separation bowl through a second line for washing, and the concentrated cell suspension is returned from the separation bowl to the first container through the first line by the first pump, In the first container, the diluent is injected from the third container to the first container through the second line and the first line by the first pump and the second pump. The concentrated cell suspension is diluted and stirred, and the diluted and stirred concentrated cell suspension is again guided from the first container to the separation bowl through the first line by the first pump. Operably configured to,
Cell dilution washing device.
形成し、このサイクルを所定回数繰り返すよう構成され
てなる、請求項８の装置。9. The apparatus of claim 8 wherein said concentrating, washing and diluting agitation forms a cycle and is configured to repeat this cycle a predetermined number of times.
間で前記第１のラインから分岐した第３のラインに接続
された第４の容器を含み、前記第１のポンプが最後に洗
浄された濃縮細胞浮遊液を前記第４の容器に回収するよ
う動作可能に構成されている、請求項８又は９の装置。10. A fourth container connected between a third line diverging from the first line between the first pump and the first container, wherein the first pump is finally 10. The device of claim 8 or 9, which is operatively configured to collect washed concentrated cell suspension in the fourth container.
ンに接続され、前記分離ボウルから流出される廃液を収
容する第５の容器を含む、請求項８から１０の何れか１
の装置。11. The method according to claim 8, further comprising a fifth container connected to a fourth line extending from the separation bowl and containing a waste liquid flowing out from the separation bowl.
Equipment.
〜２５０ｍｌ／分の流量となるよう前記第１のポンプ及
び前記第２のポンプを作動させることによって行われ
る、請求項８から１１の何れか１の装置。12. The diluting agitation and the diluting solution are 150
The apparatus according to any one of claims 8 to 11, which is carried out by operating the first pump and the second pump so as to obtain a flow rate of ˜250 ml / min.
解凍された幹細胞を稀釈液で稀釈することによって準備
される、請求項８から１２の何れか１の装置。13. The device according to claim 8, wherein the cell suspension is prepared by diluting cultured cells or freeze-thawed stem cells with a diluting solution.
０９／ｍｌ以下である、請求項８から１３の何れか１の
装置。14. The cell concentration in the cell suspension is 1 × 1.
14. The device according to any one of claims 8 to 13, which is not more than 09 / ml.
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|---|---|---|---|
| JP2002145702A JP2003334067A (en) | 2002-05-21 | 2002-05-21 | Method and system for dilution cleaning of cell |
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- 2002-05-21 JP JP2002145702A patent/JP2003334067A/en active Pending
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