JP2003319784A - Ｗｎｔ（イ）の発現の亢進を検出することにより慢性関節リウマチを検出する方法 - Google Patents
Ｗｎｔ（イ）の発現の亢進を検出することにより慢性関節リウマチを検出する方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 簡易で、精度が高い予診性のヒト慢性関接リ
ウマチ（ＲＡ）特異的診断法の提供 【解決手段】 関節滑液または末梢血液におけるＷＮＴ
の発現の亢進及びＦＲＰの発現抑制を検出することによ
り慢性関節リウマチを検出する方法。
ウマチ（ＲＡ）特異的診断法の提供 【解決手段】 関節滑液または末梢血液におけるＷＮＴ
の発現の亢進及びＦＲＰの発現抑制を検出することによ
り慢性関節リウマチを検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、関節滑液または末
梢血液におけるＷＮＴ（イタリック）〔以下、遺伝子の
場合ＷＮＴ（イ）と表現する〕、特にＷＮＴ（イ）１０
Ｂの発現の更新を逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ法などにより検
出することによる慢性関節リウマチ（ＲＡ：rheumatoid
arthritis）の検出法に関する。更に、ＦＲＰ（イ）の
発現の抑制を並行的に検出することを特徴とする前記慢
性関節リウマチ（ＲＡ：rheumatoidarthritis）の検出
法に関する。
梢血液におけるＷＮＴ（イタリック）〔以下、遺伝子の
場合ＷＮＴ（イ）と表現する〕、特にＷＮＴ（イ）１０
Ｂの発現の更新を逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ法などにより検
出することによる慢性関節リウマチ（ＲＡ：rheumatoid
arthritis）の検出法に関する。更に、ＦＲＰ（イ）の
発現の抑制を並行的に検出することを特徴とする前記慢
性関節リウマチ（ＲＡ：rheumatoidarthritis）の検出
法に関する。
【０００２】
【従来技術】ＲＡ診断にはアメリカリウマチ学会の定め
た診断基準が本邦においても採用されている。該診断基
準は、１）１時間以上続く朝のこわばり、２）３個所以
上の関節の腫れ、３）手の関節の腫れ、４）対称性の関
節の腫れ、５）手のＸ線写真の異常、６）皮下結節、
７）血液検査でリウマチ反応が陽性、である。この基準
のうち４項目以上を満たし、更に１）−４）に関しては
６週間以上持続することを必要とする。この様に、診断
基準は臨床所見に依存し診断時には既に病態が進行して
いるため、治療開始時期が遅れ治療効果が得難く、患者
本人の精神的肉体的経済的負担が大きくなる。また、Ｒ
Ａの生化学的検査方法として、リウマトイド因子（ｒｈ
ｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ）を検出する方法も利
用されているけれども、該検出方法では擬陽性および擬
陰性の確立が高く信頼性に問題があった。従って、より
早期にＲＡ特異性の高い客観的診断技術を確立すること
が社会的急務である（http://www.rheuma-net.or.jp
/）。
た診断基準が本邦においても採用されている。該診断基
準は、１）１時間以上続く朝のこわばり、２）３個所以
上の関節の腫れ、３）手の関節の腫れ、４）対称性の関
節の腫れ、５）手のＸ線写真の異常、６）皮下結節、
７）血液検査でリウマチ反応が陽性、である。この基準
のうち４項目以上を満たし、更に１）−４）に関しては
６週間以上持続することを必要とする。この様に、診断
基準は臨床所見に依存し診断時には既に病態が進行して
いるため、治療開始時期が遅れ治療効果が得難く、患者
本人の精神的肉体的経済的負担が大きくなる。また、Ｒ
Ａの生化学的検査方法として、リウマトイド因子（ｒｈ
ｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ）を検出する方法も利
用されているけれども、該検出方法では擬陽性および擬
陰性の確立が高く信頼性に問題があった。従って、より
早期にＲＡ特異性の高い客観的診断技術を確立すること
が社会的急務である（http://www.rheuma-net.or.jp
/）。
【０００３】一方、ＷＮＴ（イ）ファミリーはヒトでは
１６種類の遺伝子配列が明らかになっており、ヒトゲノ
ム配列解読から更に３種類が存在すると考えられる。Ｗ
ＮＴ（イ）は癌原遺伝子として発見された遺伝子であ
り、Ｃ−ＭｙｃやサイクリンＤ１の発現を誘導すること
で細胞の過剰な増殖を招く。近年、ＲＡ関節滑膜におい
てＷＮＴ（イ）１、５Ａ、１０Ｂの発現が亢進し〔変形
性関節症（ＯＡ）関節滑膜では発現しない〕、滑膜細胞
による炎症性サイトカイン〔インターロイキン−６、
８、１５（ＩＬ−６、８、１５）〕の産生を促進するこ
とが報告された（Ｓｅｎ,Ｍ．,Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ,
Ｋ．,Ｅｌ−Ｇａｂａｗｙ,Ｈ．,Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ,
Ｇ．Ｓ.,Ｃｏｒｒ,Ｍ．ａｎｄ Ｃａｒｓｏｎ,Ｄ．Ａ．
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｗｉｎｇｌｅｓｓ ａｎｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄｈｏｍｏｌ
ｏｇｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ.Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
９７：２７９１−２７９６，２０００.）。また、ＷＮ
Ｔ（イ）は血管内皮細胞の増殖も促進することが知られ
ている（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，Ａｉｋａｗａ，Ｍ．Ｓｚ
ｔｏ，Ｗ．ａｎｄ Ｐａｐｋｏｆｆ,Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＷＮＴ−ｒｅｓｐｏｎｓ
ｉｖｅｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａ
ｔｈｗａｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ
ａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３：384-388, 1999.）。し
かしながら、ＷＮＴ（イ）、特にＷＮＴ（イ）１０Ｂの
ＲＡ特異的発現を検出して、ＲＡ特異的診断が可能であ
ることを説明する言及はない。
１６種類の遺伝子配列が明らかになっており、ヒトゲノ
ム配列解読から更に３種類が存在すると考えられる。Ｗ
ＮＴ（イ）は癌原遺伝子として発見された遺伝子であ
り、Ｃ−ＭｙｃやサイクリンＤ１の発現を誘導すること
で細胞の過剰な増殖を招く。近年、ＲＡ関節滑膜におい
てＷＮＴ（イ）１、５Ａ、１０Ｂの発現が亢進し〔変形
性関節症（ＯＡ）関節滑膜では発現しない〕、滑膜細胞
による炎症性サイトカイン〔インターロイキン−６、
８、１５（ＩＬ−６、８、１５）〕の産生を促進するこ
とが報告された（Ｓｅｎ,Ｍ．,Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ,
Ｋ．,Ｅｌ−Ｇａｂａｗｙ,Ｈ．,Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ,
Ｇ．Ｓ.,Ｃｏｒｒ,Ｍ．ａｎｄ Ｃａｒｓｏｎ,Ｄ．Ａ．
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｗｉｎｇｌｅｓｓ ａｎｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄｈｏｍｏｌ
ｏｇｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉ
ｓ.Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
９７：２７９１−２７９６，２０００.）。また、ＷＮ
Ｔ（イ）は血管内皮細胞の増殖も促進することが知られ
ている（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，Ａｉｋａｗａ，Ｍ．Ｓｚ
ｔｏ，Ｗ．ａｎｄ Ｐａｐｋｏｆｆ,Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＷＮＴ−ｒｅｓｐｏｎｓ
ｉｖｅｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａ
ｔｈｗａｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ
ａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３：384-388, 1999.）。し
かしながら、ＷＮＴ（イ）、特にＷＮＴ（イ）１０Ｂの
ＲＡ特異的発現を検出して、ＲＡ特異的診断が可能であ
ることを説明する言及はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、関節
滑液あるいは末梢血中のＷＮＴ（イ）の発現の亢進を検
出することにより、ＲＡを予防的に早期に発見する、Ｒ
Ａ特異的な診断方法を提供することである。先ず、発生
学的にＷＮＴ（イ）は様々な臓器に発現し、胎生期の器
官形態形成に極めて重要な役割を果たしていることが報
告されている（Moon, R. A., Brown, J. D. and Torre
s, M. WNTs modulate cell fate and behavior during
vertebrate development．Trends Genet.13:157-162,19
97.）。しかし、器官形成完了後において発現は停止す
ることから、成体の維持に積極的役割を持たないと考え
られる（Imai, K. and D'Armiento, J. 未発表）。この
ことと前記ＷＮＴ（イ）発現とを対比して考えると、Ｗ
ＮＴ（イ）発現はＲＡ関節滑膜異常を招く、あるいは、
促進する原因である可能性が考えられる。
滑液あるいは末梢血中のＷＮＴ（イ）の発現の亢進を検
出することにより、ＲＡを予防的に早期に発見する、Ｒ
Ａ特異的な診断方法を提供することである。先ず、発生
学的にＷＮＴ（イ）は様々な臓器に発現し、胎生期の器
官形態形成に極めて重要な役割を果たしていることが報
告されている（Moon, R. A., Brown, J. D. and Torre
s, M. WNTs modulate cell fate and behavior during
vertebrate development．Trends Genet.13:157-162,19
97.）。しかし、器官形成完了後において発現は停止す
ることから、成体の維持に積極的役割を持たないと考え
られる（Imai, K. and D'Armiento, J. 未発表）。この
ことと前記ＷＮＴ（イ）発現とを対比して考えると、Ｗ
ＮＴ（イ）発現はＲＡ関節滑膜異常を招く、あるいは、
促進する原因である可能性が考えられる。
【０００５】そこで、本発明者は関節破壊をきたす疾患
であり関節滑膜の異常を伴うＲＡと異常を伴わないＯＡ
に発現するＷＮＴ（イ）とその特異的阻害分子であるＦ
ＲＰ（イ）の発現プロファイルを明らかにした。その結
果、ＷＮＴ（イ）１０ＢがＲＡ特異的に発現する分子で
あり、他のＷＮＴ（イ）の発現率はＲＡ、ＯＡともに極
めて低いことを確認した。また、ＷＮＴ（イ）１０Ｂは
ＲＡ関節滑膜組織の滑膜表層細胞と血管内皮細胞に局在
していることも分かった。逆にＦＲＰ（イ）はＯＡ特異
的に発現し、特に全てのＯＡ症例で発現していたＦＲＰ
（イ）１はＷＮＴ（イ）１０Ｂと同様に滑膜表層細胞お
よび血管内皮細胞に認められた。従って、ＯＡにおいて
はＦＲＰ（イ）が発現することでＷＮＴ（イ）を介した
関節滑膜の異常を防いでいる可能性が高い。ＷＮＴ
（イ）を標的分子とし、合成ペプチド、化学合成物質や
精製ＦＲＰタンパクを関節腔内あるいは血中に投与する
ことで、ＷＮＴ（イ）生物活性を阻害することは生体偽
害性や副作用の少ない生物学的治療法として有用である
可能性も高い。ＲＡ特異的ＷＮＴ（イ）、特にＷＮＴ
（イ）１０Ｂの発現が４／５の症例において確認された
ことから、関節滑液あるいは末梢血中のＷＮＴ、特にＷ
ＮＴ１０Ｂの存在を測定することでＲＡ特異的診断法を
確立できることを確認し、前記本発明の課題を解決する
ことができた。
であり関節滑膜の異常を伴うＲＡと異常を伴わないＯＡ
に発現するＷＮＴ（イ）とその特異的阻害分子であるＦ
ＲＰ（イ）の発現プロファイルを明らかにした。その結
果、ＷＮＴ（イ）１０ＢがＲＡ特異的に発現する分子で
あり、他のＷＮＴ（イ）の発現率はＲＡ、ＯＡともに極
めて低いことを確認した。また、ＷＮＴ（イ）１０Ｂは
ＲＡ関節滑膜組織の滑膜表層細胞と血管内皮細胞に局在
していることも分かった。逆にＦＲＰ（イ）はＯＡ特異
的に発現し、特に全てのＯＡ症例で発現していたＦＲＰ
（イ）１はＷＮＴ（イ）１０Ｂと同様に滑膜表層細胞お
よび血管内皮細胞に認められた。従って、ＯＡにおいて
はＦＲＰ（イ）が発現することでＷＮＴ（イ）を介した
関節滑膜の異常を防いでいる可能性が高い。ＷＮＴ
（イ）を標的分子とし、合成ペプチド、化学合成物質や
精製ＦＲＰタンパクを関節腔内あるいは血中に投与する
ことで、ＷＮＴ（イ）生物活性を阻害することは生体偽
害性や副作用の少ない生物学的治療法として有用である
可能性も高い。ＲＡ特異的ＷＮＴ（イ）、特にＷＮＴ
（イ）１０Ｂの発現が４／５の症例において確認された
ことから、関節滑液あるいは末梢血中のＷＮＴ、特にＷ
ＮＴ１０Ｂの存在を測定することでＲＡ特異的診断法を
確立できることを確認し、前記本発明の課題を解決する
ことができた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、関節骨膜、関
節滑液または末梢血液におけるＷＮＴ（イ）の発現の亢
進を検出することにより慢性関節リウマチを検出する方
法である。好ましくは、ＷＮＴ（イ）の発現の亢進をＲ
Ｔ−ＰＣＲ法により検出することを特徴とする前記慢性
関節リウマチを検出する方法であり、より好ましくは、
ＷＮＴ（イ）１０Ｂの発現の亢進を検出することを特徴
とする前記各慢性関節リウマチを検出する方法であり、
一層好ましくは、ＦＲＰ（イ）の発現の抑制を並行的に
検出することを特徴とする前記各慢性関節リウマチを検
出する方法である。
節滑液または末梢血液におけるＷＮＴ（イ）の発現の亢
進を検出することにより慢性関節リウマチを検出する方
法である。好ましくは、ＷＮＴ（イ）の発現の亢進をＲ
Ｔ−ＰＣＲ法により検出することを特徴とする前記慢性
関節リウマチを検出する方法であり、より好ましくは、
ＷＮＴ（イ）１０Ｂの発現の亢進を検出することを特徴
とする前記各慢性関節リウマチを検出する方法であり、
一層好ましくは、ＦＲＰ（イ）の発現の抑制を並行的に
検出することを特徴とする前記各慢性関節リウマチを検
出する方法である。
【０００７】
【本発明の実施の態様】本発明をより詳細に説明する。
Ａ 関節滑膜の異常を伴うＲＡと異常を伴わないＯＡに
発現するＷＮＴ（イ）とその特異的阻害分子であるＦＲ
Ｐ（イ）の発現プロファイルの作製。 （１）人口関節置換術により切除されたヒトＲＡ（５
例）あるいはＯＡ（４例）の関節滑膜組織に発現する全
ＲＮＡをChomczynski and Sacchiの方法に従い採取し
た。ゲノムＤＮＡの混入を防ぐため、ＲＮａｓｅ−ｆｒ
ｅｅ ＤＮａｓｅＩで３７℃３０分間処理を行い、ゲノ
ムＤＮＡを分解した。
Ａ 関節滑膜の異常を伴うＲＡと異常を伴わないＯＡに
発現するＷＮＴ（イ）とその特異的阻害分子であるＦＲ
Ｐ（イ）の発現プロファイルの作製。 （１）人口関節置換術により切除されたヒトＲＡ（５
例）あるいはＯＡ（４例）の関節滑膜組織に発現する全
ＲＮＡをChomczynski and Sacchiの方法に従い採取し
た。ゲノムＤＮＡの混入を防ぐため、ＲＮａｓｅ−ｆｒ
ｅｅ ＤＮａｓｅＩで３７℃３０分間処理を行い、ゲノ
ムＤＮＡを分解した。
【０００８】（２）５μｇ全ＲＮＡをオリゴｄ（Ｔ）プ
ライマー(Gibco BRL, Giathusberg,Germany)および逆転
写酵素（SuperScript II, Gibco BRL）を用いて１st st
rand cDNA (50μl)を合成した。その後、1 μlのcDNAを
鋳型として９４℃５分間加熱後、配列表および図１に示
すプライマーとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（GibcoBR
L）を用いてＰＣＲ反応を行った。一検体５０μＬにて
熱変性を９４℃３０秒、アニーリング温度〔前記図１〕
で３０秒、伸長反応１分間行い、これを１サイクルとし
て計３０サイクル繰り返した。反応終了後の試料を２％
アガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ増幅反応の有無を確
認した。
ライマー(Gibco BRL, Giathusberg,Germany)および逆転
写酵素（SuperScript II, Gibco BRL）を用いて１st st
rand cDNA (50μl)を合成した。その後、1 μlのcDNAを
鋳型として９４℃５分間加熱後、配列表および図１に示
すプライマーとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（GibcoBR
L）を用いてＰＣＲ反応を行った。一検体５０μＬにて
熱変性を９４℃３０秒、アニーリング温度〔前記図１〕
で３０秒、伸長反応１分間行い、これを１サイクルとし
て計３０サイクル繰り返した。反応終了後の試料を２％
アガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ増幅反応の有無を確
認した。
【０００９】ＷＮＴ（イ）１０Ｂは極めて高率（４／５
例）にＲＡ組織に発現していたが、ＯＡでは１／４例に
陽性であった。他のＷＮＴ（イ）に関してはいずれも発
現率が低いか発現していなかった。ＦＲＰ（イ）１は全
てのＯＡで発現し、ＦＲＰ（イ）２とＦＲＰ（イ）４は
２／４例、ＦＲＰ（イ）３とＦＲＰ（イ）５は１／４例
にみられた。ＲＡではいずれのＦＲＰ（イ）遺伝子とも
に１／５例に陽性あるいは発現していなかった〔（図
２）〕。
例）にＲＡ組織に発現していたが、ＯＡでは１／４例に
陽性であった。他のＷＮＴ（イ）に関してはいずれも発
現率が低いか発現していなかった。ＦＲＰ（イ）１は全
てのＯＡで発現し、ＦＲＰ（イ）２とＦＲＰ（イ）４は
２／４例、ＦＲＰ（イ）３とＦＲＰ（イ）５は１／４例
にみられた。ＲＡではいずれのＦＲＰ（イ）遺伝子とも
に１／５例に陽性あるいは発現していなかった〔（図
２）〕。
【００１０】ホルマリンあるいはパラホルムアルデヒド
固定したヒトＲＡあるいはＯＡ関節滑膜組織のパラフィ
ン包埋切片を脱パラフィン後、エタノール系列で親水処
理、０．０１Ｍ（モル）クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）中で電子レンジ加熱処理（５００Ｗ、４分間
３回）を行った。次に、組織切片を正常ヤギ血清、正常
ロバ血清、正常ウサギ血清あるいは１％ウシ血清アルブ
ミンで３０分間室温処理し、ヤギ抗Ｗｎｔ１０ｂ抗体
（1μｇ/ｍｌ, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cru
z, CA, 米国）、ヤギ抗Ｆｒｐ１抗体（２μｇ/ｍｌ、Sa
nta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 米国）ある
いはウサギ抗 von Willbrand Factor（ｖＷＦ)抗体 (２
００倍希釈、ＤＡＣＯ、Carpinteria, CA, 米国)と反応
した。その後、Alexa Fluor 546抗ウサギ抗体、Alexa F
luor 546抗ヤギ抗体（Molecular Probes, Eugene, OR,
米国）あるいはＦＩＴＣ標識抗ヤギ抗体（Vector, Burl
ingame, CA, 米国）と９０分間室温でインキュベート
し、蛍光顕微鏡を用いて各抗原の組織内局在を同定し
た。ＲＡ関節滑膜においてＷＮＴ１０Ｂは滑膜表層細胞
および血管内皮細胞に局在していた。ＯＡ関節滑膜にお
いては反応はみられなかった。逆にＦｒｐｌはＯＡにお
いて滑膜表層細胞と血管内皮細胞に局在していたが、Ｒ
Ａ組織では陰性であった。ＷＮＴ１０ＢおよびＦＲＰ１
の血管内皮細胞への局在は、血管内皮細胞に特異的に反
応する抗ｖＷＦ抗体との二重染色法で確認された。
固定したヒトＲＡあるいはＯＡ関節滑膜組織のパラフィ
ン包埋切片を脱パラフィン後、エタノール系列で親水処
理、０．０１Ｍ（モル）クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）中で電子レンジ加熱処理（５００Ｗ、４分間
３回）を行った。次に、組織切片を正常ヤギ血清、正常
ロバ血清、正常ウサギ血清あるいは１％ウシ血清アルブ
ミンで３０分間室温処理し、ヤギ抗Ｗｎｔ１０ｂ抗体
（1μｇ/ｍｌ, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cru
z, CA, 米国）、ヤギ抗Ｆｒｐ１抗体（２μｇ/ｍｌ、Sa
nta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 米国）ある
いはウサギ抗 von Willbrand Factor（ｖＷＦ)抗体 (２
００倍希釈、ＤＡＣＯ、Carpinteria, CA, 米国)と反応
した。その後、Alexa Fluor 546抗ウサギ抗体、Alexa F
luor 546抗ヤギ抗体（Molecular Probes, Eugene, OR,
米国）あるいはＦＩＴＣ標識抗ヤギ抗体（Vector, Burl
ingame, CA, 米国）と９０分間室温でインキュベート
し、蛍光顕微鏡を用いて各抗原の組織内局在を同定し
た。ＲＡ関節滑膜においてＷＮＴ１０Ｂは滑膜表層細胞
および血管内皮細胞に局在していた。ＯＡ関節滑膜にお
いては反応はみられなかった。逆にＦｒｐｌはＯＡにお
いて滑膜表層細胞と血管内皮細胞に局在していたが、Ｒ
Ａ組織では陰性であった。ＷＮＴ１０ＢおよびＦＲＰ１
の血管内皮細胞への局在は、血管内皮細胞に特異的に反
応する抗ｖＷＦ抗体との二重染色法で確認された。
【００１１】該染色法により得られた免疫組織染色写真
像から、ＲＡ関節滑膜におけるＷＮＴ（イ）１０Ｂ陽性
細胞（ＲＡ組織）の局在発現、およびＯＡ関節滑膜にお
けるＦＲＰ１陽性細胞（ＯＡ組織）の局在発現を観察す
ることができた。
像から、ＲＡ関節滑膜におけるＷＮＴ（イ）１０Ｂ陽性
細胞（ＲＡ組織）の局在発現、およびＯＡ関節滑膜にお
けるＦＲＰ１陽性細胞（ＯＡ組織）の局在発現を観察す
ることができた。
【００１２】
【発明の効果】本発明者は、関節破壊をきたす疾患であ
り関節滑膜の異常を伴うＲＡと異常を伴わないＯＡに発
現するＷＮＴ（イ）とその特異的阻害分子であるＦＲＰ
（イ）の発現プロファイルを明らかにし、逆転写（Ｒ
Ｔ）−ＰＣＲプライマーを用いた逆転写（ＲＴ）−ＰＣ
Ｒ法、特に、ＷＮＴ（イ）１０ＢまたはＷＮＴ（イ）１
０ＢおよびＦＲＰ（イ）１のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝
子発現における遺伝子増幅の陰陽によりＲＡ特異的診断
法を確立したものであり、簡易で確実なＲＡ特異的診断
法を確立することができた、という優れた作用効果がも
たらされる。
り関節滑膜の異常を伴うＲＡと異常を伴わないＯＡに発
現するＷＮＴ（イ）とその特異的阻害分子であるＦＲＰ
（イ）の発現プロファイルを明らかにし、逆転写（Ｒ
Ｔ）−ＰＣＲプライマーを用いた逆転写（ＲＴ）−ＰＣ
Ｒ法、特に、ＷＮＴ（イ）１０ＢまたはＷＮＴ（イ）１
０ＢおよびＦＲＰ（イ）１のＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝
子発現における遺伝子増幅の陰陽によりＲＡ特異的診断
法を確立したものであり、簡易で確実なＲＡ特異的診断
法を確立することができた、という優れた作用効果がも
たらされる。
【００１３】以下に、図１に記載のＰＣＲプライマーの
遺伝子配列を示す。
遺伝子配列を示す。
【配列表】<110>Ｊａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ <120>ＷＮＴ（イ）の発現の亢進を検出することにより
慢性関節リウマチを検出する方法 <160>44 <210>1 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>1 5'-tcctgctcag aaggttccat <210>2 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>2 5'-gctgtacgtg cagaagttgg <210>3 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>3 5'-ctgtatcagg gaccgagagg <210>4 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>4 5'-caaagagaac tcgccaggag <210>5 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>5 5'-actgagtgtg tgcagctgtg <210>6 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>6 5'-tgatgtcttg ctgcagacac <210>7 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>7 5'-acttcggcgt gttagtctcc <210>8 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>8 5'-atttttcctt ccgcttctcc <210>9 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>9 5'-ttgaggagtg ccactaccag <210>10 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>10 5'-ttgaactgtg cgttgcgtgg <210>11 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>11 5'-cagttcaaga ccgtgcagac <210>12 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>12 5'-tggaacctac ccatcccata <210>13 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>13 5'-gtgctgcttc gtcaggtgta <210>14 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>14 5'-cgaggttgaa gctgagttcc <210>15 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>15 5'-caactgcaca acaacgaggc <210>16 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>16 5'-gtactacgca gcaccagtgg <210>17 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>17 5'-gagaagcaag gccagtacca <210>18 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>18 5'-acagcacatg aggtcacagc <210>19 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>19 5'-acatgctatc agctctgctg <210>20 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>20 5'-aaagatcagt tccgcctctg <210>21 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>21 5'-gaaagtggca agctttggag <210>22 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>22 5'-gaaagtggca agctttggag <210>23 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>23 5'-aatgaggcttcacaacaacc <210>24 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>24 5'-tcatgtggtc caatctcctc <210>25 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>25 5'-cttcattgat acccacaacc <210>26 <211> 20 <212>ＤＮＡ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｆｉｃｉａｌ ＜４００＞２６ ５’−ａｔｔｇｔｔｇｇｇｇ ａｇａａｇｇｃｔａｃ ＜２１０＞２７ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ＤＮＡ <213> Artifificial <400>27 5'-tgacctcaag acccgatacc <210>28 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>28 5'-caagtgaagg caaagcacaa <210>29 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>29 5'-aagatggtgc caacttcacc <210>30 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>30 5'-taaggaacca gccaggacac <210>31 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>31 5'-gtgacaccac cttgcagaac <210>32 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>32 5'-accctctgat gtacggttgc <210>33 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>33 5'-cttgttcttg cagcattccc <210>34 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>34 5'-agagaaggca atgcctctcc <210>35 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>35 5'-aaagacagct tgcagtgcac <210>36 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>36 5'-tgttatgaca acctcagtgg <210>37 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>37 5'-cattgacttc cagcacgagc <210>38 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>38 5'-acgaagcttc atatcccagc <210>39 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>39 5'-agaggagtggctgcaatgag <210>40 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>40 5'-tggccttacataggctgtcc <210>41 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>41 5'-aagtggatgg acagctgctg <210>42 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>42 5'-tactttctga gaccctgagg <210>43 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>43 5'-gtcagtggtg gacctgacct <210>44 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>44 5'-aggggagctt cagtgtggtg
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ <120>ＷＮＴ（イ）の発現の亢進を検出することにより
慢性関節リウマチを検出する方法 <160>44 <210>1 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>1 5'-tcctgctcag aaggttccat <210>2 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>2 5'-gctgtacgtg cagaagttgg <210>3 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>3 5'-ctgtatcagg gaccgagagg <210>4 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>4 5'-caaagagaac tcgccaggag <210>5 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>5 5'-actgagtgtg tgcagctgtg <210>6 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>6 5'-tgatgtcttg ctgcagacac <210>7 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>7 5'-acttcggcgt gttagtctcc <210>8 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>8 5'-atttttcctt ccgcttctcc <210>9 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>9 5'-ttgaggagtg ccactaccag <210>10 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>10 5'-ttgaactgtg cgttgcgtgg <210>11 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>11 5'-cagttcaaga ccgtgcagac <210>12 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>12 5'-tggaacctac ccatcccata <210>13 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>13 5'-gtgctgcttc gtcaggtgta <210>14 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>14 5'-cgaggttgaa gctgagttcc <210>15 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>15 5'-caactgcaca acaacgaggc <210>16 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>16 5'-gtactacgca gcaccagtgg <210>17 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>17 5'-gagaagcaag gccagtacca <210>18 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>18 5'-acagcacatg aggtcacagc <210>19 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>19 5'-acatgctatc agctctgctg <210>20 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>20 5'-aaagatcagt tccgcctctg <210>21 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>21 5'-gaaagtggca agctttggag <210>22 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>22 5'-gaaagtggca agctttggag <210>23 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>23 5'-aatgaggcttcacaacaacc <210>24 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>24 5'-tcatgtggtc caatctcctc <210>25 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>25 5'-cttcattgat acccacaacc <210>26 <211> 20 <212>ＤＮＡ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｆｉｃｉａｌ ＜４００＞２６ ５’−ａｔｔｇｔｔｇｇｇｇ ａｇａａｇｇｃｔａｃ ＜２１０＞２７ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ＤＮＡ <213> Artifificial <400>27 5'-tgacctcaag acccgatacc <210>28 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>28 5'-caagtgaagg caaagcacaa <210>29 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>29 5'-aagatggtgc caacttcacc <210>30 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>30 5'-taaggaacca gccaggacac <210>31 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>31 5'-gtgacaccac cttgcagaac <210>32 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>32 5'-accctctgat gtacggttgc <210>33 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>33 5'-cttgttcttg cagcattccc <210>34 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>34 5'-agagaaggca atgcctctcc <210>35 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>35 5'-aaagacagct tgcagtgcac <210>36 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>36 5'-tgttatgaca acctcagtgg <210>37 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>37 5'-cattgacttc cagcacgagc <210>38 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>38 5'-acgaagcttc atatcccagc <210>39 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>39 5'-agaggagtggctgcaatgag <210>40 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>40 5'-tggccttacataggctgtcc <210>41 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>41 5'-aagtggatgg acagctgctg <210>42 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>42 5'-tactttctga gaccctgagg <210>43 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>43 5'-gtcagtggtg gacctgacct <210>44 <211> 20 <212>ＤＮＡ <213> Artifificial <400>44 5'-aggggagctt cagtgtggtg
【図１】 ＷＮＴ（イ）およびＦＲＰ（イ）のＲＴ−Ｐ
ＣＲプライマー塩基配列と増幅条件
ＣＲプライマー塩基配列と増幅条件
【図２】 図１のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現パター
ン
ン
【図３】 ＲＴ−ＰＣＲによるＷＮＴ（イ）３、ＷＮＴ
（イ）５Ａ、ＷＮＴ（イ）１０ＢおよびＷＮＴ（イ）１
４発現の検出
（イ）５Ａ、ＷＮＴ（イ）１０ＢおよびＷＮＴ（イ）１
４発現の検出
【図４】 ＲＴ−ＰＣＲによるＦＲＰ（イ）１〜５発現
の検出。
の検出。
Claims (4)
- 【請求項１】 関節滑液または末梢血液におけるＷＮＴ
（イ）の発現の亢進を検出することにより慢性関節リウ
マチを検出する方法。 - 【請求項２】 ＷＮＴ（イ）の発現の亢進をＲＴ−ＰＣ
Ｒ法により検出することを特徴とする請求項１に記載の
慢性関節リウマチを検出する方法。 - 【請求項３】 ＷＮＴ（イ）１０Ｂの発現の亢進を検出
することを特徴とする請求項１または２に記載の慢性関
節リウマチを検出する方法。 - 【請求項４】 ＦＲＰ（イ）の発現の抑制を並行的に検
出することを特徴とする請求項１、２または３に記載の
慢性関節リウマチを検出する方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP2002130883A JP2003319784A (ja) | 2002-05-02 | 2002-05-02 | Ｗｎｔ（イ）の発現の亢進を検出することにより慢性関節リウマチを検出する方法 |
| PCT/JP2003/005358 WO2003093508A1 (fr) | 2002-05-02 | 2003-04-25 | Technique de detection de d'arthrite rhumatoide par detection de la surexpression de wnt |
| EP03723207A EP1502960A4 (en) | 2002-05-02 | 2003-04-25 | TECHNIQUE FOR DETECTION OF RHEUMATOID ARTHRITIS BY DETECTION OF OVEREXPRESSION OF WNT |
| US10/511,910 US20050221321A1 (en) | 2002-05-02 | 2003-04-25 | Method of detecting rheumatoid arthritis by detecting overexpression of wnt |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2002130883A JP2003319784A (ja) | 2002-05-02 | 2002-05-02 | Ｗｎｔ（イ）の発現の亢進を検出することにより慢性関節リウマチを検出する方法 |
Publications (1)
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|---|---|
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Family
ID=29397334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP2003319784A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013174442A (ja) * | 2009-12-18 | 2013-09-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | リウマチ障害と非リウマチ障害とを識別するためのトリガーアッセイ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2390346A1 (en) * | 2010-05-28 | 2011-11-30 | Universiteit Twente | Osteoarthrosis markers |
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- 2002-05-02 JP JP2002130883A patent/JP2003319784A/ja not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-04-25 WO PCT/JP2003/005358 patent/WO2003093508A1/ja active Application Filing
- 2003-04-25 EP EP03723207A patent/EP1502960A4/en not_active Withdrawn
- 2003-04-25 US US10/511,910 patent/US20050221321A1/en not_active Abandoned
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