JP2003310256A - Carrier for cell culture and method for culturing cell - Google Patents
Carrier for cell culture and method for culturing cellInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞培養担体およ
び細胞培養方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a cell culture carrier and a cell culture method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、細胞培養技術が、細胞組織工学、
医薬品等の安全性試験、治療や診断を目的としたタンパ
ク質の生産等、様々な産業、研究分野で応用されてい
る。2. Description of the Related Art In recent years, cell culture technology has been used in cell tissue engineering,
It is applied in various industries and research fields, such as safety tests for pharmaceuticals and protein production for treatment and diagnosis.
【０００３】現在、この細胞培養には、付着依存性細胞
を大量に効率よく培養するために、培養フラスコによる
平面培養ではなく、細胞の足場となる担体を用いた三次
元高密度培養（浮遊培養）が用いられている。At present, in order to efficiently and efficiently culture a large amount of adhesion-dependent cells, this cell culture is not a flat culture in a culture flask but a three-dimensional high-density culture (suspension culture) using a carrier serving as a scaffold for the cells. ) Is used.
【０００４】また、この三次元高密度培養には、ポリス
チレン製、ＤＥＡＥセルロース製、ポリアクリルアミド
製等の担体が用いられている。In addition, carriers such as polystyrene, DEAE cellulose, and polyacrylamide are used for this three-dimensional high-density culture.
【０００５】しかしながら、これらの担体には、細胞が
ほとんど付着しなかったり、細胞が付着してもほとんど
増殖しなかったり等するという問題がある。However, these carriers have a problem in that cells hardly adhere to the carrier, or even if the cells adhere to the carrier, the carrier hardly proliferates.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細胞
を効率よく増殖させ得る細胞培養担体を提供することに
ある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a cell culture carrier capable of efficiently growing cells.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】このような目的は、下記
（１）〜（１７）の本発明により達成される。The above objects are achieved by the present invention described in (1) to (17) below.
【０００８】（１） 表面に細胞を付着させ、該細胞を
増殖させる細胞培養担体であって、主として樹脂材料で
構成された粒状の基材の表面付近に、リン酸カルシウム
系化合物粒子の一部が貫入することにより、前記基材の
表面に前記リン酸カルシウム系化合物の被覆層が形成さ
れてなることを特徴とする細胞培養担体。(1) A cell culture carrier for adhering cells to the surface and proliferating the cells, in which a part of the calcium phosphate compound particles penetrates near the surface of a granular base material mainly composed of a resin material. By doing so, a coating layer of the calcium phosphate-based compound is formed on the surface of the base material, the cell culture carrier.
【０００９】これにより、細胞培養（特に、マイクロキ
ャリヤー培養）に要求される各種性質を併せ持つ細胞培
養担体とすることができる。As a result, a cell culture carrier having various properties required for cell culture (in particular, microcarrier culture) can be obtained.
【００１０】（２） 前記付着させる細胞の最大長さを
Ｌ１［μｍ］とし、前記細胞培養担体の平均粒径をＬ２
［μｍ］としたとき、Ｌ２／Ｌ１が２〜１００である上
記（１）に記載の細胞培養担体。これにより、細胞が付
着、増殖するのがより容易となる。(2) The maximum length of the cells to be attached is L1 [μm], and the average particle size of the cell culture carrier is L2.
The cell culture carrier according to (1) above, wherein L2 / L1 is 2 to 100 when expressed as [μm]. This makes it easier for cells to attach and proliferate.
【００１１】（３） 前記Ｌ２は、５０〜５００μｍで
ある上記（２）に記載の細胞培養担体。これにより、細
胞が付着、増殖するのがより容易となる。(3) The cell culture carrier according to (2) above, wherein L2 is 50 to 500 μm. This makes it easier for cells to attach and proliferate.
【００１２】（４） 前記細胞培養担体の密度は、０．
８〜１．４ｇ／ｃｍ３である上記（１）ないし（３）の
いずれかに記載の細胞培養担体。これにより、細胞培養
担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。(4) The density of the cell culture carrier is 0.
The cell culture carrier according to any one of (1) to (3) above, which has a concentration of 8 to 1.4 g / cm 3 . Thereby, the cell culture carrier can be suspended more uniformly in the culture medium.
【００１３】（５） 前記基材の平均粒径は、５０〜５
００μｍである上記（１）ないし（４）のいずれかに記
載の細胞培養担体。(5) The average particle size of the base material is 50 to 5
The cell culture carrier according to any one of (1) to (4) above, which has a size of 00 μm.
【００１４】これにより、好適な平均粒径を有する細胞
培養担体を容易に得ることができる。Thus, a cell culture carrier having a suitable average particle size can be easily obtained.
【００１５】（６） 前記基材の密度は、０．８〜１．
４ｇ／ｃｍ３である上記（１）ないし（５）のいずれか
に記載の細胞培養担体。これにより、好適な密度を有す
る細胞培養担体を容易に得ることができる。(6) The density of the substrate is 0.8-1.
The cell culture carrier according to any one of (1) to (5) above, wherein the carrier is 4 g / cm 3 . Thereby, a cell culture carrier having a suitable density can be easily obtained.
【００１６】（７） 前記被覆層の平均厚さは、０．１
〜５μｍである上記（１）ないし（６）のいずれかに記
載の細胞培養担体。(7) The average thickness of the coating layer is 0.1
The cell culture carrier according to any one of (1) to (6) above, wherein the cell culture carrier has a size of -5 μm.
【００１７】これにより、基材を好適に被覆することが
できるとともに、好適な密度を有する細胞培養担体を得
ることができる。As a result, the base material can be suitably coated and a cell culture carrier having a suitable density can be obtained.
【００１８】（８） 前記被覆層は、前記基材の表面
に、前記リン酸カルシウム系化合物の多孔質粒子を衝突
させることにより形成されたものである上記（１）ない
し（７）のいずれかに記載の細胞培養担体。これによ
り、容易かつ確実に、被覆層を形成することができる。(8) The coating layer is formed by causing porous particles of the calcium phosphate-based compound to collide with the surface of the base material, according to any one of the above (1) to (7). Cell culture carrier. Accordingly, the coating layer can be easily and reliably formed.
【００１９】（９） 前記多孔質粒子は、前記リン酸カ
ルシウム系化合物の一次粒子を凝集結合させることによ
り製造されたものである上記（８）に記載の細胞培養担
体。(9) The carrier for cell culture according to the above (8), wherein the porous particles are produced by aggregating and binding the primary particles of the calcium phosphate compound.
【００２０】これにより、多孔質粒子は、基材に衝突し
た際に、より効率よく破砕されるので、基材の表面をよ
り確実に被覆することができる。With this, the porous particles are more efficiently crushed when they collide with the base material, so that the surface of the base material can be more surely covered.
【００２１】（１０） マイクロキャリヤー培養に用い
られる上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の細胞
培養担体。(10) The cell culture carrier according to any one of the above (1) to (9), which is used for microcarrier culture.
【００２２】これにより、細胞培養には、各種方法があ
るが、本発明の細胞培養担体は、特に、マイクロキャリ
ヤー培養に用いるのに適している。Thus, although there are various methods for cell culture, the cell culture carrier of the present invention is particularly suitable for use in microcarrier culture.
【００２３】（１１） 前記細胞は、動物細胞である上
記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養担
体。(11) The cell culture carrier according to any one of (1) to (10) above, wherein the cells are animal cells.
【００２４】これにより、より広範な分野における用途
の拡大を図ることができるとともに、タンパク質の生産
を行う場合には、より複雑な構造を有するものの生産を
好適に行うことができる。As a result, it is possible to expand the application in a wider range of fields, and when producing a protein, it is possible to preferably produce a protein having a more complicated structure.
【００２５】（１２） 上記（１）ないし（１１）のい
ずれかに記載の細胞培養担体を用いることを特徴とする
細胞培養方法。(12) A cell culture method, which comprises using the cell culture carrier according to any one of (1) to (11) above.
【００２６】（１３） 上記（１）ないし（１１）のい
ずれかに記載の細胞培養担体と細胞とを懸濁させた培養
液を攪拌して、前記細胞を前記培養担体の表面に付着さ
せた状態で、増殖させることを特徴とする細胞培養方
法。(13) The culture medium in which the cell culture carrier according to any one of (1) to (11) above and cells are suspended is stirred to allow the cells to adhere to the surface of the culture carrier. A method for culturing cells, which comprises proliferating in a state.
【００２７】これにより、培養液を攪拌しつつ、細胞を
培養することにより、細胞の増殖効率を向上させること
ができる。Thus, the cell growth efficiency can be improved by culturing the cells while stirring the culture solution.
【００２８】（１４） 前記攪拌速度は、５〜１００ｒ
ｐｍである上記（１３）に記載の細胞培養方法。これに
より、細胞の増殖効率をより向上させることができる。(14) The stirring speed is 5 to 100 r
The cell culture method according to (13) above, which is pm. Thereby, the cell growth efficiency can be further improved.
【００２９】（１５） 前記細胞培養担体には、滅菌処
理が施されている上記（１２）ないし（１４）のいずれ
かに記載の細胞培養方法。(15) The cell culture method according to any one of (12) to (14), wherein the cell culture carrier is sterilized.
【００３０】これにより、微生物やカビ等による細胞へ
の悪影響が低減または除去され、細胞は、より効率よく
増殖することができる。As a result, adverse effects on the cells due to microorganisms and mold are reduced or eliminated, and the cells can grow more efficiently.
【００３１】（１６） 前記滅菌処理は、前記細胞培養
担体と滅菌液とを接触させることにより行われる上記
（１５）に記載の細胞培養方法。これにより、大量の細
胞培養担体を、より効率よく滅菌することができる。(16) The cell culture method according to (15) above, wherein the sterilization treatment is performed by bringing the cell culture carrier and a sterilizing solution into contact with each other. Thereby, a large amount of cell culture carriers can be sterilized more efficiently.
【００３２】（１７） 前記滅菌液は、アルカリ溶液で
ある上記（１６）に記載の細胞培養方法。アルカリ溶液
は、特に、微生物やカビ等の殺菌能（除去能）に優れて
いる。(17) The cell culture method according to the above (16), wherein the sterilized solution is an alkaline solution. The alkaline solution is particularly excellent in sterilizing ability (removing ability) of microorganisms and mold.
【００３３】[0033]
【発明の実施の形態】上記問題点に鑑み、本発明者は、
鋭意検討を重ねた結果、リン酸カルシウム系化合物は、
各種細胞との親和性が高く、細胞培養担体をリン酸カル
シウム系化合物で構成することにより、その表面に細胞
を好適に付着させることができ、細胞が増殖するのにも
適したものとすることができることを見い出した。In view of the above problems, the present inventor has
As a result of extensive studies, the calcium phosphate-based compound was
It has high affinity with various cells, and by constituting the cell culture carrier with a calcium phosphate-based compound, cells can be suitably attached to the surface thereof, and it can be made suitable for the cells to proliferate. Found out.
【００３４】また、リン酸カルシウム系化合物は、生物
学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるお
それが極めて低く好ましい。本発明は、かかる知見に基
づいてなされたものである。Calcium phosphate compounds are biologically inactive, and are extremely unlikely to damage cells, which is preferable. The present invention has been made based on such findings.
【００３５】以下、本発明の細胞培養担体の好適な実施
形態について、添付図面を参照しつつ詳細に説明する。Hereinafter, preferred embodiments of the cell culture carrier of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
【００３６】図１は、本発明の細胞培養担体の実施形態
を示す断面図である。図１に示すように、本発明の細胞
培養担体１は、主として樹脂材料で構成された粒状の基
材２と、この基材２の表面にリン酸カルシウム系化合物
の被覆層３が形成されてなるものである。このような細
胞培養担体１は、その表面に細胞（付着依存性細胞）を
付着させ、この細胞を増殖させる細胞培養、特に、三次
元高密度培養（浮遊培養）に用いられるものである。FIG. 1 is a sectional view showing an embodiment of the cell culture carrier of the present invention. As shown in FIG. 1, the cell culture carrier 1 of the present invention comprises a granular base material 2 mainly composed of a resin material, and a coating layer 3 of a calcium phosphate compound on the surface of the base material 2. Is. Such a cell culture carrier 1 is used for cell culture in which cells (adhesion-dependent cells) are attached to the surface and the cells are proliferated, particularly three-dimensional high-density culture (floating culture).
【００３７】三次元高密度培養には、例えばマイクロキ
ャリヤー培養、攪拌培養、回転振とう培養、旋回培養等
があるが、これらの中でも、細胞培養担体１は、特に、
マイクロキャリヤー培養に好適に使用し得るものであ
る。かかるマイクロキャリヤー培養によれば、細胞を大
量に、極めて効率よく培養することができる。The three-dimensional high-density culture includes, for example, microcarrier culture, stirring culture, rotary shaking culture, swirling culture, etc. Among these, the cell culture carrier 1 is particularly preferable.
It can be preferably used for microcarrier culture. According to such microcarrier culture, a large amount of cells can be cultured extremely efficiently.
【００３８】このマイクロキャリヤー培養は、培養液
（液体培地）中に懸濁され、緩やかに攪拌されている小
さな担体（細胞培養担体）の表面において、細胞を増殖
させる培養方法である。このため、マイクロキャリヤー
培養に用いる担体には、例えば、その大きさが細胞の増
殖に適するものであること、その比重が培養液中に均一
に懸濁され得るものであること、その強度が攪拌に耐え
得るものであること等の各種性質（特性）が求められ
る。This microcarrier culture is a culture method in which cells are grown on the surface of a small carrier (cell culture carrier) suspended in a culture medium (liquid medium) and gently stirred. Therefore, the carrier used for culturing the microcarrier is, for example, one whose size is suitable for cell growth, one whose specific gravity can be uniformly suspended in the culture medium, and whose strength is agitated. Various properties (characteristics) such as being capable of withstanding
【００３９】本発明の細胞培養担体１は、これらの性質
を満足するものである。すなわち、本発明者は、細胞培
養担体１を、樹脂材料を主材料とする基材２の表面をリ
ン酸カルシウム系化合物で被覆する構成とすることによ
り、容易かつ確実に、前記の各性質を有するものとし得
ることをも見い出した。The cell culture carrier 1 of the present invention satisfies these properties. That is, the present inventor has the above-mentioned properties easily and surely by arranging the cell culture carrier 1 so that the surface of the base material 2 mainly made of a resin material is coated with the calcium phosphate compound. I also found that
【００４０】例えば、基材２において、樹脂材料の占め
る割合、あるいは樹脂材料の種類等を変更することで、
その比重（密度）の調整が容易となる。For example, by changing the proportion of the resin material in the base material 2 or the type of the resin material,
It becomes easy to adjust the specific gravity (density).
【００４１】細胞培養担体１は、基材２が粒状（好まし
くはほぼ球状）とされ、これにより、その全体が粒状
（好ましくはほぼ球状）をなしている。このような細胞
培養担体１の表面には、細胞が高い均一性で付着、増殖
するのが容易となる。また、このような細胞培養担体１
は、培養液中へより均一に懸濁させることができる。In the cell culture carrier 1, the base material 2 has a granular shape (preferably substantially spherical shape), so that the whole has a granular shape (preferably substantially spherical shape). It becomes easy for cells to adhere and grow on the surface of such a cell culture carrier 1 with high uniformity. In addition, such a cell culture carrier 1
Can be more uniformly suspended in the culture medium.
【００４２】また、細胞培養担体１の大きさ（サイズ）
は、特に限定されないが、細胞（付着させる細胞）の最
大長さをＬ１［μｍ］とし、細胞培養担体１の平均粒径
をＬ２［μｍ］としたとき、Ｌ２／Ｌ１が２〜１００で
あるのが好ましく、５〜５０であるのがより好ましい。
具体的には、前記Ｌ２は、５０〜５００μｍ程度である
のが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより
好ましい。Further, the size (size) of the cell culture carrier 1
Is not particularly limited, but when the maximum length of cells (cells to be attached) is L1 [μm] and the average particle size of the cell culture carrier 1 is L2 [μm], L2 / L1 is 2 to 100. Is preferable, and 5 to 50 is more preferable.
Specifically, the L2 is preferably about 50 to 500 μm, more preferably about 100 to 300 μm.
【００４３】このような平均粒径の細胞培養担体１は、
その表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大
きくすることができるため、細胞が付着、増殖するのが
より容易となる。なお、細胞培養担体１の平均粒径が小
さ過ぎると、細胞が効率よく付着しないばかりでなく、
細胞培養担体１同士の間での凝集が容易に生じる場合が
ある。一方、細胞培養担体１の平均粒径が大き過ぎる
と、培養液中での細胞培養担体１の沈降速度が大きくな
るので、細胞培養の際の攪拌速度（後述参照）を大きく
しなければならず、この場合、細胞培養担体１同士が互
いに衝突し合い、その結果、細胞培養担体１の表面に付
着した細胞が破壊されるおそれがある。The cell culture carrier 1 having such an average particle size is
Since the surface area can be made sufficiently large with respect to the size of the cells, it becomes easier for the cells to attach and grow. If the average particle size of the cell culture carrier 1 is too small, not only the cells do not adhere efficiently, but
Agglutination may easily occur between the cell culture carriers 1. On the other hand, if the average particle size of the cell culture carrier 1 is too large, the sedimentation speed of the cell culture carrier 1 in the culture solution will increase, so the stirring speed during cell culture (see below) must be increased. In this case, the cell culture carriers 1 collide with each other, and as a result, the cells attached to the surface of the cell culture carrier 1 may be destroyed.
【００４４】また、細胞培養担体１を培養液中でより均
一に懸濁させる観点からは、細胞培養担体１の密度は、
水の密度に近いのものが好ましい。具体的には、細胞培
養担体１の密度を、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３程度とす
るのが好ましく、０．９〜１．２ｇ／ｃｍ３程度とする
のがより好ましい。細胞培養担体１の密度を前記範囲と
することにより、細胞培養担体１を培養液中でより均一
に懸濁させることができる。From the viewpoint of suspending the cell culture carrier 1 more uniformly in the culture medium, the density of the cell culture carrier 1 is
Those having a density close to that of water are preferable. Specifically, the density of the cell culture carrier 1, it is preferable to be 0.8 to 1.4 g / cm 3 or so, and more preferably, 0.9~1.2g / cm 3 order. By setting the density of the cell culture carrier 1 within the above range, the cell culture carrier 1 can be more uniformly suspended in the culture solution.
【００４５】このような細胞培養担体１の形状、大きさ
（平均粒径等）、物性（密度等）等は、基材２の形状、
大きさ、物性等を適宜設定することにより調整すること
ができる。The shape, size (average particle size, etc.), physical properties (density, etc.), etc. of the cell culture carrier 1 are determined by the shape of the base material 2,
It can be adjusted by appropriately setting the size, physical properties and the like.
【００４６】基材２は、主として樹脂材料で構成された
ものである。樹脂材料を主材料として基材２を構成する
ことにより、細胞培養担体１の形状、大きさ、物性等の
調整が容易となる。The base material 2 is mainly made of a resin material. By configuring the base material 2 using a resin material as a main material, it becomes easy to adjust the shape, size, physical properties and the like of the cell culture carrier 1.
【００４７】前述したような平均粒径の細胞培養担体１
を製造する場合、基材２の平均粒径は、５０〜５００μ
ｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度で
あるのがより好ましい。Cell culture carrier 1 having an average particle size as described above
The average particle size of the base material 2 is 50 to 500 μ when manufacturing
The thickness is preferably about m, more preferably about 100 to 300 μm.
【００４８】また、前述したような密度の細胞培養担体
１を製造する場合、基材２の密度は、０．８〜１．４ｇ
／ｃｍ３程度であるのが好ましく、０．９〜１．２ｇ／
ｃｍ ３程度であるのがより好ましい。Further, a cell culture carrier having the above-mentioned density
1 is manufactured, the density of the base material 2 is 0.8 to 1.4 g.
/ CmThreeIt is preferably about 0.9 to 1.2 g /
cm ThreeIt is more preferable that the degree is.
【００４９】本発明で用いられる樹脂材料としては、各
種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることがで
き、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリ
アミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレ
ン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン
等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フ
ェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエ
ステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナ
イド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上
を組み合わせて用いることができる。As the resin material used in the present invention, various thermosetting resins and various thermoplastic resins can be used. Specifically, examples of the thermoplastic resin include polyamide, polyethylene, polypropylene and polystyrene. Examples of the thermosetting resin such as polyimide, acrylic resin, and thermoplastic polyurethane include epoxy resin, phenol resin, melamine resin, urea resin, unsaturated polyester, alkyd resin, thermosetting polyurethane, and evanide. Of these, one kind or a combination of two or more kinds can be used.
【００５０】また、樹脂材料は、有機顔料、無機顔料、
酸性染料、塩基性染料等で着色されたものであってよ
い。The resin material is an organic pigment, an inorganic pigment,
It may be colored with an acid dye or a basic dye.
【００５１】このような基材２の表面には、リン酸カル
シウム系化合物の被覆層３が形成されている。この被覆
層３は、基材２の表面付近に、リン酸カルシウム系化合
物粒子３１の一部が貫入することにより、基材２の表面
がリン酸カルシウム系化合物で被覆されることにより形
成されたものである。A coating layer 3 of a calcium phosphate compound is formed on the surface of the base material 2. The coating layer 3 is formed by partially penetrating the calcium phosphate-based compound particles 31 in the vicinity of the surface of the base material 2 to coat the surface of the base material 2 with the calcium phosphate-based compound.
【００５２】このようにして、被覆層３を形成すること
により、被覆層３と基材２との密着性を優れたものとす
ることができる。このため、被覆層３の基材２の表面か
らの剥離を好適に防止すること、すなわち、細胞培養担
体１の強度を優れたものとすることができる。By forming the coating layer 3 in this way, the adhesion between the coating layer 3 and the base material 2 can be made excellent. Therefore, the peeling of the coating layer 3 from the surface of the base material 2 can be preferably prevented, that is, the strength of the cell culture carrier 1 can be made excellent.
【００５３】被覆層３の平均厚さは、特に限定されない
が、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜
２μｍ程度であるのがより好ましい。被覆層３の平均厚
さが前記下限値未満である場合、細胞培養担体１では、
部分的に基材２が露出してしまうおそれがある。一方、
被覆層３の平均厚さが前記上限値を超えた場合、細胞培
養担体１は、前述したような範囲の密度に調整するのが
困難となる。The average thickness of the coating layer 3 is not particularly limited, but is preferably about 0.1-5 μm, and 0.5-μm.
More preferably, it is about 2 μm. When the average thickness of the coating layer 3 is less than the lower limit value, in the cell culture carrier 1,
The base material 2 may be partially exposed. on the other hand,
When the average thickness of the coating layer 3 exceeds the upper limit value, it becomes difficult to adjust the density of the cell culture carrier 1 to the range as described above.
【００５４】このような被覆層３（細胞培養担体１）の
表面付近は、緻密質、多孔質のいずれであってもよい。The vicinity of the surface of the coating layer 3 (cell culture carrier 1) may be dense or porous.
【００５５】本発明で用いられるリン酸カルシウム系化
合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜
２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ
１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ
２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（Ｐ
Ｏ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨ
ＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いる
ことができる。The calcium phosphate-based compound used in the present invention is not particularly limited and has a Ca / P ratio of 1.0 to.
Various compounds of 2.0 can be used, for example, Ca
10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 , Ca 10 (PO 4 ) 6 F
2 , Ca 10 (PO 4 ) 6 Cl 2 , Ca 3 (P
O 4 ) 2 , Ca 2 P 2 O 7 , Ca (PO 3 ) 2 , CaH
One or more of PO 4 and the like can be mixed and used.
【００５６】これら中でも、リン酸カルシウム系化合物
としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（Ｐ
Ｏ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適であ
る。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いら
れるものであり、細胞が極めて効率よく付着することが
でき、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特
に低い。Among these, as the calcium phosphate compound, hydroxyapatite (Ca 10 (P
The one containing O 4 ) 6 (OH) 2 as a main component is optimal. Since hydroxyapatite is used as a biomaterial, cells can be attached very efficiently and the possibility of damaging cells is particularly low.
【００５７】また、フッ素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ
４）６Ｆ２）を用いる場合には、全リン酸カルシウム系
化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とするのが好
ましい。全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率
を、５重量％以下とすることにより、被覆層３（細胞培
養担体１）からのフッ素の溶出が防止または極めて少量
とされるので、細胞へのダメージは、無いかまたは極め
て小さいものとすることができ、その結果、細胞の増殖
効率が低下するのが防止される。Fluorapatite (Ca 10 (PO
When 4 ) 6 F 2 ) is used, the content of fluorine in the total calcium phosphate-based compound is preferably 5% by weight or less. By setting the fluorine content in the total calcium phosphate-based compound to 5% by weight or less, the elution of fluorine from the coating layer 3 (cell culture carrier 1) is prevented or made extremely small, so that damage to cells is It can be absent or very small, thus preventing the growth efficiency of the cells from decreasing.
【００５８】なお、これらのリン酸カルシウム系化合物
は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成す
ることができる。These calcium phosphate compounds can be synthesized by a known wet synthesis method, dry synthesis method or the like.
【００５９】また、この場合、リン酸カルシウム系化合
物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）また
は合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていて
もよい。Further, in this case, the calcium phosphate-based compound may contain a substance (raw material or the like) remaining during the synthesis, a secondary reaction product produced in the process of the synthesis, or the like.
【００６０】このような被覆層３は、例えば、基材２の
表面に、リン酸カルシウム系化合物の多孔質粒子（以
下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることに
より形成することができる。かかる方法によれば、容易
かつ確実に、被覆層３を形成することができる。Such a coating layer 3 can be formed, for example, by causing porous particles of a calcium phosphate compound (hereinafter simply referred to as "porous particles") to collide with the surface of the base material 2. . According to this method, the coating layer 3 can be formed easily and reliably.
【００６１】基材２の表面に多孔質粒子を衝突させる
と、多孔質粒子は、基材２に衝突する際に、破砕されて
比較的小さい粒径の粒子３１（以下、単に「粒子３１」
と言う。）となり、その一部が基材２に貫入する。この
とき、粒子３１の一部が基材２に貫入すると、基材２
は、自らの弾性力により粒子３１を掴み込むようにして
固定する。When the porous particles are made to collide with the surface of the base material 2, the porous particles are crushed at the time of colliding with the base material 2 and the particles 31 having a relatively small particle size (hereinafter, simply referred to as “particle 31”).
Say ), And a part thereof penetrates into the base material 2. At this time, if some of the particles 31 penetrate the base material 2, the base material 2
Fixes the particles 31 by grasping the particles 31 by their own elastic force.
【００６２】また、多孔質粒子は、リン酸カルシウム系
化合物の一次粒子を凝集結合させることにより製造され
たものを用いるのが好ましい。このような多孔質粒子
は、基材２に衝突した際に、より効率よく破砕されるの
で、基材２の表面をより確実に被覆することができる。As the porous particles, it is preferable to use those produced by agglomerating and binding the primary particles of the calcium phosphate compound. When such a porous particle collides with the base material 2, it is crushed more efficiently, so that the surface of the base material 2 can be more reliably covered.
【００６３】この場合、多孔質粒子の平均粒径は、特に
限定されないが、１００μｍ以下であるのが好ましい。
多孔質粒子の平均粒径が１００μｍを超えると、基材２
への衝突時の速度が低くなり、多孔質粒子が効率よく破
砕されない場合がある。In this case, the average particle size of the porous particles is not particularly limited, but is preferably 100 μm or less.
When the average particle diameter of the porous particles exceeds 100 μm, the base material 2
The velocity at the time of collision with the particles becomes low, and the porous particles may not be efficiently crushed.
【００６４】この基材２と多孔質粒子との衝突は、例え
ば、市販のハイブリダイゼーション装置を用いて、乾式
で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材
２と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜５
０：１程度、装置内の温度が、基材２の主材料として用
いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とさ
れる。The collision between the base material 2 and the porous particles can be carried out by a dry method using, for example, a commercially available hybridization device. The conditions at this time are, for example, a mixing ratio of the base material 2 and the porous particles of 400: 1 to 5 by weight.
The temperature inside the apparatus is set to about 0: 1 and below the softening temperature of the resin material used as the main material of the base material 2 (usually below 80 ° C.).
【００６５】また、被覆層３の形成に用いる多孔質粒子
は、例えば、次のような公知の方法で製造することがで
きる。The porous particles used for forming the coating layer 3 can be manufactured, for example, by the following known method.
【００６６】すなわち、多孔質粒子は、公知の方法で湿
式合成したリン酸カルシウム系化合物の結晶粒子（一次
粒子）を含むスラリーを、直接噴霧乾燥などにより二次
粒子に造粒するか、または、前記スラリーに粘度調整
剤、加熱により消失する有機化合物粒子または繊維等の
添加物を加えて、噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒す
る。なお、得られた二次粒子は、必要に応じて焼成する
ようにしてもよい。That is, as the porous particles, a slurry containing crystal particles (primary particles) of a calcium phosphate-based compound, which are wet-synthesized by a known method, is granulated into secondary particles by direct spray drying or the above slurry. Then, a viscosity modifier and additives such as organic compound particles or fibers that disappear by heating are added, and secondary particles are granulated by spray drying or the like. The obtained secondary particles may be fired if necessary.
【００６７】この二次粒子自体が多孔質粒子となってい
るので、この二次粒子をそのまま被覆層３の形成に使用
することができる。Since the secondary particles themselves are porous particles, the secondary particles can be used as they are for forming the coating layer 3.
【００６８】さらに、より高気孔率の多孔質粒子が好ま
しい場合には、例えば、次の方法で製造するようにす
る。Further, when porous particles having higher porosity are preferable, for example, they are produced by the following method.
【００６９】まず、前記二次粒子を再びスラリー状に懸
濁して、湿式成形または加圧による乾式成形等により、
ブロック体に成形する。なお、この際、後の焼成工程で
消散して、気孔を形成するための有機化合物を添加して
もよい。また、かかる有機化合物を添加せずに、例えば
焼成温度等の他の条件を調節することにより、気孔径を
制御することもできる。次いで、得られたブロック体を
４００〜１３００℃程度の温度範囲で焼成する。焼成温
度が４００℃未満では、有機化合物の熱消失、ブロック
体の焼結等が充分に行われないおそれがある。一方、焼
成を１３００℃を超える高温で行うと、焼結体が緻密化
し過ぎたり、リン酸カルシウム系化合物が分解を起こす
おそれがある。次いで、このように焼成したブロック体
を粉砕後、分級して所望の粒径のものとする。First, the secondary particles are resuspended in a slurry form and wet-molded or dry-molded by pressurization.
Mold into blocks. At this time, an organic compound for forming pores after being dispersed in the subsequent firing step may be added. Further, the pore diameter can be controlled by adjusting other conditions such as the firing temperature without adding such an organic compound. Then, the obtained block body is fired in a temperature range of about 400 to 1300 ° C. If the firing temperature is lower than 400 ° C., the heat of the organic compound may be lost and the block body may not be sufficiently sintered. On the other hand, if the firing is performed at a high temperature exceeding 1300 ° C., the sintered body may be excessively densified or the calcium phosphate-based compound may be decomposed. Next, the block thus fired is pulverized and then classified to obtain a desired particle size.
【００７０】この多孔質粒子の気孔径は、例えば、前記
一次粒子の大きさ、スラリーの粘度、添加物等を適宜設
定することによって、調整することができる。このよう
にして得られる多孔質粒子は、その比表面積が１０ｍ２
／ｇ以上、かつ、細孔径（気孔径）が５００〜１０００
Å程度であることが好ましい。かかる条件を満足する多
孔質粒子を用いて製造される細胞培養担体１は、その表
面への細胞の付着の効率、付着した細胞の増殖の効率を
より向上させることができる。The pore diameter of the porous particles can be adjusted, for example, by appropriately setting the size of the primary particles, the viscosity of the slurry, the additives and the like. The specific surface area of the porous particles thus obtained is 10 m 2
/ G or more, and the pore size (pore size) is 500 to 1000
It is preferably about Å. The cell culture carrier 1 manufactured by using the porous particles satisfying such conditions can further improve the efficiency of cell attachment to the surface thereof and the efficiency of growth of attached cells.
【００７１】なお、被覆層３の形成方法（細胞培養担体
１の製造方法）は、これに限定されるものではない。The method for forming the coating layer 3 (the method for producing the cell culture carrier 1) is not limited to this.
【００７２】次に、本発明の細胞培養方法、すなわち、
前述したような細胞培養担体１を用いた細胞培養方法に
ついて説明する。Next, the cell culture method of the present invention, that is,
A cell culture method using the above-mentioned cell culture carrier 1 will be described.
【００７３】［１］ まず、細胞培養担体１に滅菌処理
を施す。これにより、細胞培養担体１の表面に存在する
微生物やカビ等の数を低減、または、これらを完全に死
滅させることができる。このように、細胞培養担体１に
滅菌処理を施しておくことにより、微生物やカビ等によ
る細胞へのダメージが低減または除去され、細胞は、よ
り効率よく増殖することができる。[1] First, the cell culture carrier 1 is sterilized. As a result, it is possible to reduce the number of microorganisms, molds and the like existing on the surface of the cell culture carrier 1, or to completely kill them. As described above, by subjecting the cell culture carrier 1 to the sterilization treatment, damage to the cells due to microorganisms, molds and the like is reduced or eliminated, and the cells can grow more efficiently.
【００７４】この滅菌処理には、例えば、細胞培養担体
１と滅菌液とを接触させる方法、オートクレーブ滅菌、
ガス滅菌、放射線滅菌等を用いることができるが、これ
らの中でも、細胞培養担体１と滅菌液とを接触させる方
法が好適である。かかる方法によれば、大量の細胞培養
担体１を、より効率よく滅菌することができる。For this sterilization treatment, for example, a method of contacting the cell culture carrier 1 with a sterilizing solution, autoclave sterilization,
Although gas sterilization, radiation sterilization and the like can be used, among these, the method of contacting the cell culture carrier 1 with a sterilizing solution is preferable. According to this method, a large amount of cell culture carrier 1 can be sterilized more efficiently.
【００７５】ここで、リン酸カルシウム系化合物は、各
種滅菌液に対して不活性であり、本発明の細胞培養担体
１は、リン酸カルシウム系化合物の被覆層３を有するた
め、各種滅菌液による劣化が好適に防止される。換言す
れば、本発明の細胞培養担体１は、このような滅菌処理
に適用することができる。Here, the calcium phosphate-based compound is inactive to various sterilizing liquids, and since the cell culture carrier 1 of the present invention has the calcium phosphate-based compound coating layer 3, deterioration by various sterilizing liquids is preferable. To be prevented. In other words, the cell culture carrier 1 of the present invention can be applied to such a sterilization process.
【００７６】滅菌液としては、例えば、水酸化ナトリウ
ム水溶液、水酸化カリウム水溶液、次亜塩素酸ナトリウ
ム水溶液等のアルカリ溶液を好適に使用することができ
る。これらの滅菌液は、特に、微生物やカビ等の殺菌能
（除去能）に優れている。As the sterilizing solution, for example, an alkaline solution such as an aqueous solution of sodium hydroxide, an aqueous solution of potassium hydroxide or an aqueous solution of sodium hypochlorite can be preferably used. These sterilized liquids are particularly excellent in sterilizing ability (removing ability) of microorganisms and molds.
【００７７】次いで、滅菌処理後の細胞培養担体１を洗
浄して、細胞培養担体１の表面に付着した滅菌液を除去
する。Then, the sterilized cell culture carrier 1 is washed to remove the sterilized liquid adhering to the surface of the cell culture carrier 1.
【００７８】［２］ 次に、前記工程［１］終了後の細
胞培養担体１と、細胞（付着させる細胞）とが懸濁させ
た培養液を用意する。[2] Next, a culture medium in which the cell culture carrier 1 after the above step [1] and cells (cells to be attached) are suspended is prepared.
【００７９】ここで、細胞には、例えば、目的とするタ
ンパク質をコードする遺伝子を含むシャトルベクターを
移入しておくようにする。Here, for example, a shuttle vector containing a gene encoding a target protein is introduced into the cell.
【００８０】この細胞としては、例えば、動物細胞、植
物細胞、細菌、ウイルス等が挙げられるが、これらの中
でも、特に、動物細胞が好適である。細胞として動物細
胞を用いることにより、より広範な分野における使用の
拡大を図ることができるとともに、タンパク質の生産を
行う場合には、より複雑な構造を有するもの（例えば、
糖タンパク質等）の生産を好適に行うことができる。The cells include, for example, animal cells, plant cells, bacteria, viruses, etc. Among them, animal cells are particularly preferable. By using animal cells as cells, it is possible to expand the use in a wider range of fields and, in the case of protein production, those having a more complicated structure (for example,
Glycoprotein etc.) can be suitably produced.
【００８１】培養液としては、用いる細胞の種類等によ
り適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ダルベ
ッコＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等
が挙げられる。The culture solution is appropriately selected depending on the type of cells used and is not particularly limited, and examples thereof include Dulbecco's MEM medium, BME medium, MCDB-104 medium and the like.
【００８２】また、これらの培養液中には、必要に応じ
て、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各
種ビタミン類、アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するよ
うにしてもよい。If necessary, additives such as serum and serum proteins such as albumin, various vitamins, amino acids and salts may be added to these culture solutions.
【００８３】次いで、用意した培養液を攪拌する。これ
により、細胞培養担体１の表面には、細胞が付着し、こ
の細胞は、時間の経過とともに増殖する。すなわち、細
胞を培養する。このように、培養液を攪拌しつつ、細胞
を培養することにより、細胞の増殖効率を向上させるこ
とができる。Next, the prepared culture solution is stirred. As a result, cells adhere to the surface of the cell culture carrier 1, and the cells grow over time. That is, the cells are cultured. Thus, by culturing the cells while stirring the culture medium, the cell growth efficiency can be improved.
【００８４】培養液の攪拌速度は、特に限定されない
が、５〜１００ｒｐｍ程度とするのが好ましく、１０〜
５０ｒｐｍ程度とするのがより好ましい。攪拌速度が遅
すぎると、細胞培養担体１の密度、平均粒径（サイズ）
等によっては、細胞培養担体１を培養液中で均一に分散
することができない場合があり、この場合、細胞培養担
体１の表面で細胞が十分に増殖できない。一方、攪拌速
度が速すぎると、細胞培養担体１が攪拌され過ぎ、細胞
培養担体１同士が激しく衝突し合い、付着した細胞が破
壊されてしまうおそれがある。The stirring speed of the culture solution is not particularly limited, but is preferably about 5 to 100 rpm,
It is more preferable that the speed is about 50 rpm. If the stirring speed is too slow, the density and average particle size of the cell culture carrier 1
In some cases, the cell culture carrier 1 cannot be uniformly dispersed in the culture solution, and in this case, the cells cannot sufficiently grow on the surface of the cell culture carrier 1. On the other hand, if the stirring speed is too fast, the cell culture carriers 1 may be stirred too much, the cell culture carriers 1 may violently collide with each other, and the adhered cells may be destroyed.
【００８５】また、培養液の温度（培養温度）は、培養
する細胞の種類に応じて適宜設定され、特に限定されな
いが、通常、２０〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７
℃程度とされる。The temperature of the culture solution (culture temperature) is appropriately set depending on the type of cells to be cultured and is not particularly limited, but is usually about 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37.
Approximately ℃.
【００８６】そして、増殖した細胞は、目的とするタン
パク質を生産して、このタンパク質を、例えば培養液中
へ放出したり、細胞内に蓄積したり等する。Then, the proliferated cells produce the target protein and release the protein into, for example, the culture medium or accumulate in the cells.
【００８７】［３］ 次に、生産されたタンパク質を回
収する。例えば、培養液中に放出されたタンパク質を回
収する場合には、次のようにすることができる。すなわ
ち、前記工程［２］における培養液の攪拌を停止する
と、細胞培養担体１が培養液中で沈殿するので、上清を
採取して、この上清を処理（例えば、クロマトグラフィ
ー等）することにより容易に回収することができる。[3] Next, the produced protein is recovered. For example, when recovering the protein released into the culture medium, the following can be performed. That is, when the stirring of the culture solution in the step [2] is stopped, the cell culture carrier 1 is precipitated in the culture solution. Therefore, the supernatant should be collected and treated (for example, chromatography). Can be easily collected.
【００８８】なお、前述したように、細胞培養担体１
は、水に近い密度とされているので、細胞が付着、増殖
することにより、細胞が付着した細胞培養担体１は、全
体として密度が増大して、容易に培養液中で沈殿するよ
うになる。As described above, the cell culture carrier 1
Has a density close to that of water, so that when cells adhere and proliferate, the cell culture carrier 1 to which cells adhere increases the density as a whole and easily precipitates in the culture solution. .
【００８９】次に、本発明の具体的実施例について説明
する。
（実施例１）まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２
ｇ／ｃｍ３のナイロンビーズ（基材）５０ｇと、Ｃａ／
Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍのハイドロキシアパタ
イト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２
５ｇとを用意した。なお、ハイドロキシアパタイト粒子
は、その比表面積が１０ｍ２／ｇ以上、かつ、細孔径が
５００〜１０００Åであった。Next, specific examples of the present invention will be described. (Example 1) First, an average particle size of 150 μm and a density of 1.02
50 g of nylon beads (base material) of g / cm 3 and Ca /
Hydroxyapatite particles having a P ratio of 1.67 and an average particle diameter of 10 μm (porous particles in which primary particles are cohesively bonded) 0.2
5g and prepared. The hydroxyapatite particles had a specific surface area of 10 m 2 / g or more and a pore size of 500 to 1000Å.
【００９０】次に、これらナイロンビーズおよびハイド
ロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーショ
ンシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格
動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置
を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させ
た。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆
された細胞培養担体を得た。Next, the nylon beads and the hydroxyapatite particles were put into a NARA hybridization system NHS-1 (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd., rated power 5.5 kW, rated current 23 A), and this device was operated at 6400 rpm. Min, operated at 32-50 ° C. for 5 minutes. As a result, a cell culture carrier having a surface coated with hydroxyapatite was obtained.
【００９１】なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径
１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ
１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。The obtained cell culture carrier had an average particle size of 151 μm (average thickness of the hydroxyapatite coating layer was 1 μm) and a density of 1.03 g / cm 3 .
【００９２】（実施例２）まず、平均粒径４５０μｍ、
密度１．０４ｇ／ｃｍ３のポリスチレンビーズ（基材）
５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１００μｍの
ハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した
多孔質粒子）０．２ｇとを用意した。なお、ハイドロキ
シアパタイト粒子は、その比表面積が１０ｍ２／ｇ以
上、かつ、細孔径が５００〜１０００Åであった。Example 2 First, an average particle size of 450 μm,
Polystyrene beads with a density of 1.04 g / cm 3 (base material)
50 g and 0.2 g of hydroxyapatite particles having a Ca / P ratio of 1.67 and an average particle size of 100 μm (porous particles in which primary particles were cohesively bonded) were prepared. The hydroxyapatite particles had a specific surface area of 10 m 2 / g or more and a pore size of 500 to 1000Å.
【００９３】次に、これらポリスチレンビーズおよびハ
イドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼー
ションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、
定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この
装置を８０００回転／分、３６〜６４℃で５分間稼動さ
せた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被
覆された細胞培養担体を得た。Next, the polystyrene beads and the hydroxyapatite particles were mixed with NARA hybridization system NHS-1 (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.,
It was put into a rated power of 5.5 kW and a rated current of 23 A), and this device was operated at 8000 rpm for 36 minutes at 36 to 64 ° C. As a result, a cell culture carrier having a surface coated with hydroxyapatite was obtained.
【００９４】なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径
４５２μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ
１．５μｍ）、密度１．０５ｇ／ｃｍ３であった。The obtained cell culture carrier had an average particle diameter of 452 μm (average thickness of the hydroxyapatite coating layer was 1.5 μm) and a density of 1.05 g / cm 3 .
【００９５】（実施例３）まず、平均粒径５０μｍ、密
度０．９２ｇ／ｃｍ３のポリエチレンビーズ（基材）４
００ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．８、平均粒径８０μｍのリン
酸カルシウム粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒
子）４ｇとを用意した。なお、リン酸カルシウム粒子
は、その比表面積が１０ｍ２／ｇ以上、かつ、細孔径が
５００〜１０００Åであった。Example 3 First, polyethylene beads (base material) 4 having an average particle size of 50 μm and a density of 0.92 g / cm 3
00 g and 4 g of calcium phosphate particles having a Ca / P ratio of 1.8 and an average particle diameter of 80 μm (porous particles in which primary particles are aggregated and bonded) were prepared. The calcium phosphate particles had a specific surface area of 10 m 2 / g or more and a pore size of 500 to 1000Å.
【００９６】次に、これらポリエチレンビーズおよびリ
ン酸カルシウム粒子をＨｉ−Ｘ２００（日清エンジニア
リング（株）製）に投入し、この装置を標準羽根４００
０回転／分、２５〜７５℃で２０分間稼動させた。これ
により、表面がリン酸カルシウムで被覆された細胞培養
担体を得た。Next, these polyethylene beads and calcium phosphate particles were charged into Hi-X200 (manufactured by Nisshin Engineering Co., Ltd.), and this device was used as standard blade 400.
It was operated at 0 revolutions / minute for 25 minutes at 25-75 ° C. As a result, a cell culture carrier whose surface was coated with calcium phosphate was obtained.
【００９７】なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径
５１μｍ（リン酸カルシウム被覆層の平均厚さ１μ
ｍ）、密度０．９４ｇ／ｃｍ３であった。The obtained carrier for cell culture had an average particle diameter of 51 μm (average thickness of the calcium phosphate coating layer was 1 μm).
m) and the density was 0.94 g / cm 3 .
【００９８】（実施例４）まず、平均粒径２００μｍ、
密度１．１９ｇ／ｃｍ３のポリメチルメタクリレートビ
ーズ（基材）５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．５、平均粒径２
０μｍのリン酸三カルシウム粒子（一次粒子が凝集結合
した多孔質粒子）０．２ｇとを用意した。なお、リン酸
三カルシウム粒子は、その比表面積が１０ｍ２／ｇ以
上、かつ、細孔径が５００〜１０００Åであった。Example 4 First, an average particle size of 200 μm,
50 g of polymethylmethacrylate beads (base material) having a density of 1.19 g / cm 3 , a Ca / P ratio of 1.5, and an average particle size of 2
0.2 g of 0 μm tricalcium phosphate particles (porous particles in which primary particles were aggregated and bonded) were prepared. The tricalcium phosphate particles had a specific surface area of 10 m 2 / g or more and a pore size of 500 to 1000Å.
【００９９】次に、これらポリメチルメタクリレートビ
ーズおよびリン酸三カルシウム粒子をＮＡＲＡハイブリ
ダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製
作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入
し、この装置を８０００回転／分、３８〜７１℃で５分
間稼動させた。これにより、表面がリン酸三カルシウム
で被覆された細胞培養担体を得た。Next, these polymethylmethacrylate beads and tricalcium phosphate particles were put into a NARA hybridization system NHS-1 (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd., rated power 5.5 kW, rated current 23 A), and this equipment was used. Was operated for 5 minutes at 38-71 ° C. at 8000 rpm. As a result, a cell culture carrier whose surface was coated with tricalcium phosphate was obtained.
【０１００】なお、得られた細胞培養担体は、平均粒径
２０４μｍ（リン酸三カルシウム被覆層の平均厚さ３μ
ｍ）、密度１．２ｇ／ｃｍ３であった。The obtained carrier for cell culture had an average particle size of 204 μm (the average thickness of the tricalcium phosphate coating layer was 3 μm).
m) and the density was 1.2 g / cm 3 .
【０１０１】（比較例）比較例の細胞培養担体として、
平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロ
ンビーズを用意した。(Comparative Example) As a cell culture carrier of Comparative Example,
Nylon beads having an average particle size of 150 μm and a density of 1.02 g / cm 3 were prepared.
【０１０２】（評価）次の評価試験Ｉおよび評価試験II
を実施するのに、先立って、実施例１で製造した細胞培
養担体には、オートクレーブ滅菌を、実施例２および比
較例で製造した細胞培養担体には、ＥＯＧガス滅菌を、
実施例３で製造した細胞培養担体には、放射線滅菌を、
実施例４で製造した細胞培養担体には、水酸化ナトリウ
ム水溶液（アルカリ溶液）による滅菌を、それぞれ施し
た。(Evaluation) Next Evaluation Test I and Evaluation Test II
Prior to carrying out the above, the cell culture carrier produced in Example 1 was subjected to autoclave sterilization, and the cell culture carriers produced in Example 2 and Comparative Example were subjected to EOG gas sterilization.
Radiation sterilization was applied to the cell culture carrier produced in Example 3,
Each of the cell culture carriers produced in Example 4 was sterilized with an aqueous sodium hydroxide solution (alkaline solution).
【０１０３】［評価試験Ｉ］実施例１〜実施例４、比較
例で製造した細胞培養担体１ｇと、１×１０５個／ｍＬ
のヒト骨肉腫由来細胞（Ｓａｏｓ２）懸濁液１０ｍＬと
を、ダルベッコＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加
した。[Evaluation Test I] 1 g of the cell culture carrier prepared in Examples 1 to 4 and Comparative Example and 1 × 10 5 cells / mL.
10 mL of the human osteosarcoma-derived cell (Saos2) suspension of was added to 100 mL of Dulbecco's MEM medium (culture medium).
【０１０４】なお、ダルベッコＭＥＭ培地中には、１０
ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。In Dulbecco's MEM medium, 10
Vol% fetal bovine serum was added for use.
【０１０５】各ダルベッコＭＥＭ培地を、温度３７℃、
攪拌速度３０ｒｐｍで３時間攪拌しつつ、ヒト骨肉腫由
来細胞（Ｓａｏｓ２）を培養した。このヒト骨肉腫由来
細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。Each Dulbecco's MEM medium was treated at a temperature of 37 ° C.
Human osteosarcoma-derived cells (Saos2) were cultured while stirring at a stirring speed of 30 rpm for 3 hours. The human osteosarcoma-derived cells have a maximum length of about 20 μm.
【０１０６】［評価試験II］実施例１〜実施例４、比較
例で製造した細胞培養担体１ｇと、１×１０５個／ｍＬ
のマウス頭蓋冠由来細胞（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１）懸濁液１０
ｍＬとを、ダルベッコＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬ
に添加した。[Evaluation Test II] 1 g of the cell culture carrier prepared in Examples 1 to 4 and Comparative Example and 1 × 10 5 cells / mL.
Mouse calvaria-derived cell (MC3T3E1) suspension 10
and 100 mL of Dulbecco's MEM medium (culture solution)
Was added to.
【０１０７】なお、ダルベッコＭＥＭ培地中には、１０
ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。[0107] In Dulbecco's MEM medium, 10
Vol% fetal bovine serum was added for use.
【０１０８】各ダルベッコＭＥＭ培地を、温度３７℃、
攪拌速度３０ｒｐｍで３時間攪拌しつつ、マウス頭蓋冠
由来細胞（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１）を培養した。このマウス頭
蓋冠由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。Each Dulbecco's MEM medium was treated at a temperature of 37 ° C.
Mouse calvaria-derived cells (MC3T3E1) were cultured while stirring at a stirring speed of 30 rpm for 3 hours. The mouse calvaria-derived cells have a maximum length of about 20 μm.
【０１０９】培養開始（攪拌開始）から６０分後、１２
０分後、１８０分後に、それぞれ、各培養液の所定量を
採取し、細胞培養担体の表面に付着している細胞の数を
計測した。After 60 minutes from the start of culture (start of stirring), 12
After 0 minutes and 180 minutes, a predetermined amount of each culture solution was collected, and the number of cells attached to the surface of the cell culture carrier was counted.
【０１１０】なお、細胞数の計測は、トリプシン処理し
た細胞をトリパンブルー染色することにより行った。そ
の結果を、表１に示す。The number of cells was measured by staining trypsin-treated cells with trypan blue. The results are shown in Table 1.
【０１１１】[0111]
【表１】 [Table 1]
【０１１２】表１に示すように、細胞がヒト骨肉腫由来
細胞、マウス頭蓋冠由来細胞のいずれの場合も、培養開
始６０分後において、実施例１〜実施例４で製造した細
胞培養担体（本発明の細胞培養担体）のいずれにも、絶
対数で、比較例で製造した細胞培養担体を上回る細胞が
付着していた。これは、実施例１〜実施例４で製造した
細胞培養担体には、好適に細胞が付着することを示唆す
るものである。また、実施例１〜実施例４で製造した細
胞培養担体には、培養開始１２０分後、１８０分後のい
ずれにおいても、比較例で製造した細胞培養担体を上回
る細胞が付着していた。また、実施例１〜実施例４で製
造した細胞培養担体に付着した細胞は、比較例で製造し
た細胞培養担体に付着した細胞と比較して、効率よく増
殖した。As shown in Table 1, regardless of whether the cells were human osteosarcoma-derived cells or mouse calvaria-derived cells, 60 minutes after the start of culture, the cell culture carriers prepared in Examples 1 to 4 ( The absolute number of cells adhered to any of the cell culture carriers of the present invention) exceeded that of the cell culture carriers produced in Comparative Examples. This suggests that cells are preferably attached to the cell culture carriers produced in Examples 1 to 4. In addition, the cell culture carriers produced in Examples 1 to 4 were found to have more cells attached than the cell culture carriers produced in Comparative Example 120 minutes and 180 minutes after the start of culture. The cells attached to the cell culture carrier produced in Examples 1 to 4 proliferated more efficiently than the cells attached to the cell culture carrier produced in Comparative Example.
【０１１３】すなわち、実施例１〜実施例４で製造した
細胞培養担体（本発明の細胞培養担体）では、いずれ
も、細胞の種類に依らず、細胞が効率よく付着および増
殖することが確認され、これに対し、比較例で製造した
細胞培養担体では、細胞の付着および増殖効率が極めて
劣ることが明らかとなった。That is, it was confirmed that the cell culture carriers produced in Examples 1 to 4 (cell culture carrier of the present invention) efficiently adhere and proliferate regardless of the type of cells. On the other hand, it was revealed that the cell culture carriers produced in Comparative Examples were extremely inferior in cell attachment and growth efficiency.
【０１１４】[0114]
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、細
胞培養（特に、マイクロキャリヤー培養）に要求される
各種性質を併せ持つ細胞培養担体とすることができる。
また、本発明の細胞培養担体は、安価に製造することも
できる。As described above, according to the present invention, a cell culture carrier having various properties required for cell culture (in particular, microcarrier culture) can be provided.
Further, the carrier for cell culture of the present invention can be manufactured at low cost.
【図１】本発明の細胞培養担体の実施形態を示す断面図
である。FIG. 1 is a cross-sectional view showing an embodiment of a cell culture carrier of the present invention.
１ 細胞培養担体
２ 基材
３ 被覆層
３１ 粒子（リン酸カルシウム系化合物粒
子）1 Cell Culture Carrier 2 Base Material 3 Coating Layer 31 Particles (Calcium Phosphate Compound Particles)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B033 NA16 NB02 NB15 NB22 NB34 NB35 NB36 NB62 NB68 NC06 ND20 NF03 NF06 NG05 NH04 4B065 AA91X AA93X BC09 BC24 BC42 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page F-term (reference) 4B033 NA16 NB02 NB15 NB22 NB34 NB35 NB36 NB62 NB68 NC06 ND20 NF03 NF06 NG05 NH04 4B065 AA91X AA93X BC09 BC24 BC42
Claims (17)
せる細胞培養担体であって、 主として樹脂材料で構成された粒状の基材の表面付近
に、リン酸カルシウム系化合物粒子の一部が貫入するこ
とにより、前記基材の表面に前記リン酸カルシウム系化
合物の被覆層が形成されてなることを特徴とする細胞培
養担体。1. A cell culture carrier for adhering cells to the surface thereof for propagating the cells, wherein a part of calcium phosphate compound particles penetrates near the surface of a granular base material mainly composed of a resin material. Thus, the carrier for cell culture is characterized in that the coating layer of the calcium phosphate compound is formed on the surface of the substrate.
［μｍ］とし、前記細胞培養担体の平均粒径をＬ２［μ
ｍ］としたとき、Ｌ２／Ｌ１が２〜１００である請求項
１に記載の細胞培養担体。2. The maximum length of the attached cells is L1.
[Μm], and the average particle size of the cell culture carrier is L2 [μ
m], L2 / L1 is 2 to 100, The cell culture carrier according to claim 1.
求項２に記載の細胞培養担体。3. The cell culture carrier according to claim 2, wherein the L2 is 50 to 500 μm.
１．４ｇ／ｃｍ３である請求項１ないし３のいずれかに
記載の細胞培養担体。4. The density of the cell culture carrier is 0.8 to
The cell culture carrier according to any one of claims 1 to 3, which has a concentration of 1.4 g / cm 3 .
ｍである請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞培養
担体。5. The average particle size of the base material is 50 to 500 μm.
The cell culture carrier according to any one of claims 1 to 4, which is m.
ｃｍ３である請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞
培養担体。6. The density of the base material is 0.8 to 1.4 g /
The cell culture carrier according to claim 1, which has a cm 3 .
ｍである請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞培養
担体。7. The average thickness of the coating layer is 0.1 to 5 μm.
The cell culture carrier according to any one of claims 1 to 6, which is m.
リン酸カルシウム系化合物の多孔質粒子を衝突させるこ
とにより形成されたものである請求項１ないし７のいず
れかに記載の細胞培養担体。8. The cell culture carrier according to claim 1, wherein the coating layer is formed by causing the porous particles of the calcium phosphate compound to collide with the surface of the base material. .
ム系化合物の一次粒子を凝集結合させることにより製造
されたものである請求項８に記載の細胞培養担体。9. The cell culture carrier according to claim 8, wherein the porous particles are produced by aggregating and binding primary particles of the calcium phosphate compound.
請求項１ないし９のいずれかに記載の細胞培養担体。10. The cell culture carrier according to claim 1, which is used for microcarrier culture.
ないし１０のいずれかに記載の細胞培養担体。11. The cell is an animal cell.
11. The cell culture carrier according to any one of 1 to 10.
の細胞培養担体を用いることを特徴とする細胞培養方
法。12. A cell culture method using the cell culture carrier according to any one of claims 1 to 11.
の細胞培養担体と細胞とを懸濁させた培養液を攪拌し
て、前記細胞を前記培養担体の表面に付着させた状態
で、増殖させることを特徴とする細胞培養方法。13. A culture medium in which the cell culture carrier according to any one of claims 1 to 11 and cells are suspended is agitated, and the cells are allowed to grow on the surface of the culture carrier. A cell culture method comprising:
ある請求項１３に記載の細胞培養方法。14. The cell culture method according to claim 13, wherein the stirring speed is 5 to 100 rpm.
されている請求項１２ないし１４のいずれかに記載の細
胞培養方法。15. The cell culture method according to claim 12, wherein the cell culture carrier is sterilized.
滅菌液とを接触させることにより行われる請求項１５に
記載の細胞培養方法。16. The cell culture method according to claim 15, wherein the sterilization treatment is performed by contacting the cell culture carrier with a sterilizing solution.
求項１６に記載の細胞培養方法。17. The cell culture method according to claim 16, wherein the sterilized solution is an alkaline solution.
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|---|---|---|---|
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- 2003-02-21 JP JP2003045201A patent/JP2003310256A/en active Pending
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