JP2003259873A - Bulge base-detecting molecule - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ中のバルジ
塩基を特異的に認識することができるバルジ塩基認識分
子、バルジ塩基認識用組成物、及びそれを用いたバルジ
塩基を測定する方法に関する。また、本発明は、バルジ
塩基認識分子がバルジ塩基と水素結合を形成し、かつ近
傍の塩基対によりスタックされることによりバルジ塩基
が安定化されたＤＮＡに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a bulge base recognition molecule capable of specifically recognizing a bulge base in DNA, a composition for bulge base recognition, and a method for measuring the bulge base using the same. The present invention also relates to DNA in which a bulge base recognition molecule forms a hydrogen bond with a bulge base and is stacked by neighboring base pairs to stabilize the bulge base.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ＤＮＡ及びＲＮＡ中に存在するバルジ構
造は、蛋白質による核酸の認識に重要な役割を果たして
いる。これらの構造に特異的に結合する分子は、バルジ
構造を認識する蛋白質の阻害剤としての可能性を有して
いるため、医薬開発の見地からも注目されている。バル
ジＤＮＡ認識分子は、二本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩
基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異
的に結合し、安定化する分子である。この認識分子が標
的とするバルジＤＮＡは、ＤＮＡの複製エラーや、ＤＮ
Ａ損傷の結果として生じる。また、遺伝子の異常である
バルジ塩基の有無は、遺伝病などの診断に利用されてい
る。従って、このバルジＤＮＡ認識分子は、１）遺伝子
欠損の有無を調べる診断薬、２）ＤＮＡ損傷の検出薬、
３）遺伝子損傷の安定化剤、４）ＤＮＡ修復酵素の阻害
剤などへの利用が期待されているのみならず、遺伝子の
損傷や遺伝子の複製ミスなどの研究開発において重要な
物質である。The bulge structure present in DNA and RNA plays an important role in the recognition of nucleic acid by proteins. Molecules that specifically bind to these structures have the potential as inhibitors of proteins that recognize the bulge structure, and therefore have attracted attention from the viewpoint of drug development. The bulge DNA recognition molecule is a molecule that specifically binds to and stabilizes DNA (bulge DNA) having an unpaired base (bulge base) generated in double-stranded DNA. The bulge DNA targeted by this recognition molecule is DNA replication error or DN.
A result of A damage. In addition, the presence or absence of bulge base, which is a gene abnormality, is used for diagnosis of genetic diseases and the like. Therefore, this bulge DNA recognition molecule is 1) a diagnostic agent for examining the presence or absence of a gene defect, 2) a DNA damage detecting agent,
It is not only expected to be used as 3) a stabilizer for gene damage and 4) an inhibitor of a DNA repair enzyme, but it is also an important substance in research and development such as gene damage and gene replication error.
【０００３】図１にバルジ塩基の例を示す。この例で
は、グアニン（Ｇ）がバルジ塩基として塩基対を形成す
ることができない状態になっている。図１のバルジ塩基
となっているグアニン（Ｇ）は、いずれの塩基とも水素
結合をしておらず、図１に示されるように、バルジ塩基
のグアニン（Ｇ）が塩基対の内側に入ることもできる
し、また、図２に示すように塩基対の外側にくることも
できる。いずれの場合においても、塩基対の中にバルジ
塩基の存在による空間が生じることになる。図１及び図
２には、このような空間部分を斜線を入れた四角形で示
している。FIG. 1 shows an example of a bulge base. In this example, guanine (G) is in a state where it cannot form a base pair as a bulge base. Guanine (G), which is the bulge base in FIG. 1, does not form a hydrogen bond with any of the bases, and as shown in FIG. 1, guanine (G) of the bulge base is inside the base pair. It can also be located outside the base pair as shown in FIG. In either case, there will be a space in the base pair due to the presence of the bulge base. In FIG. 1 and FIG. 2, such a space portion is shown by a quadrangle with diagonal lines.
【０００４】このようなバルジ塩基を有するＤＮＡを検
出する方法として、平面構造を持ちかつＤＮＡをアルキ
ル化出来るＤＮＡインターカレーターがバルジに優先的
に結合することを利用する方法が知られているが、この
方法は図１又は図２に示されるバルジ塩基の存在により
生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタ
ッキング相互作用を利用してインターカーレーションす
るものである。しかしながら、このような方法では、ア
ルキル化を伴うものであり、かつ空間が生じた場合にイ
ンターカーレーションするもので、バルジ塩基の種類に
応じて作用するものでは無く、アルキル化できる空間の
存在によりインターカーレーションが起こりバルジ塩基
そのものを判定するものではなかった。さらに、この方
法による従来のものは、図３に示されるようにＤＮＡ対
の外側においてインターカーレーションを起こすものが
多く、バルジ内に存在する塩基を区別することはできな
かった。As a method for detecting DNA having such a bulge base, a method is known in which a DNA intercalator having a planar structure and capable of alkylating DNA is preferentially bound to the bulge. In this method, intercalation is performed in the space generated by the presence of the bulge base shown in FIG. 1 or 2 by utilizing stacking interaction between the aromatic ring and the base in the vicinity of the bulge. However, in such a method, alkylation is involved and intercalation occurs when a space is generated, and it does not act depending on the type of bulge base, and the presence of a space that can be alkylated Intercalation occurred and the bulge base itself was not judged. Furthermore, as shown in FIG. 3, many of the conventional methods by this method cause intercalation outside the DNA pair, and it was not possible to distinguish the bases present in the bulge.
【０００５】また、バルジ塩基を有するＤＮＡを検出す
る方法として、ＭｕｔＳ等のＤＮＡ修復蛋白が遺伝子損
傷箇所に選択的に結合することを利用する方法も知られ
ているが、この方法もバルジ塩基の種類に特異的なもの
ではなかった。本発明者らは、バルジ塩基を認識できる
バルジＤＮＡ認識分子のコンセプトを確立し、具体的な
バルジＤＮＡ認識分子として２−アルキルカルボニルア
ミノ−１，８−ナフチリジン誘導体を報告してきた（特
開２００１−８９４７８号）。しかし、この分子は塩基
に対する特異性が極めて強く、特定の塩基、例えばグア
ニン（Ｇ）に対しては強く結合するが、他の塩基に対し
てはほとんど結合能を示さなかった。このような塩基に
対する特異性が強いバルジＤＮＡ認識分子は、当該塩基
がバルジ塩基であることを知るためには有効であるが、
バルジ塩基を存在の有無を検出するためには、４種類の
塩基に応じたバルジＤＮＡ認識分子を用意しておかなけ
ればならず、バルジ塩基の存在の有無を判定するために
は必ずしも効率的なものではなかった。As a method for detecting DNA having a bulge base, a method utilizing selective binding of a DNA repair protein such as MutS to a gene-damaged site is known, and this method is also known. It was not kind-specific. The present inventors have established the concept of a bulge DNA recognition molecule capable of recognizing a bulge base, and reported a 2-alkylcarbonylamino-1,8-naphthyridine derivative as a specific bulge DNA recognition molecule (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-2001). 89478). However, this molecule has extremely strong specificity for a base, and strongly binds to a specific base, for example, guanine (G), but shows little binding ability to other bases. Although such a bulge DNA recognition molecule having high specificity for a base is effective for knowing that the base is a bulge base,
In order to detect the presence or absence of bulge bases, it is necessary to prepare bulge DNA recognition molecules corresponding to four types of bases, and it is not always efficient to judge the presence or absence of bulge bases. It wasn't something.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、二本鎖ＤＮ
Ａ鎖中のバルジ塩基の存在の有無を高感度で認識、検出
することができるバルジ塩基認識分子を提供する。より
詳細には、本発明は、いずれのバルジ塩基とも適度に結
合することができ、バルジ塩基の存在の有無を１種類の
バルジ塩基認識分子を用いることにより判定することが
できる改良されたバルジ塩基認識分子を提供することを
目的としている。さらに、本発明の目的は、各バルジ塩
基との結合の強弱の程度によりバルジ塩基の種類を判定
することも可能な改良されたバルジ塩基認識分子を提供
するものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention is directed to a double-stranded DN.
Provided is a bulge base recognition molecule capable of recognizing and detecting with high sensitivity the presence or absence of a bulge base in an A chain. More specifically, the present invention is an improved bulge base that can moderately bind to any bulge base and can determine the presence or absence of the bulge base by using one type of bulge base recognition molecule. The purpose is to provide a recognition molecule. Further, an object of the present invention is to provide an improved bulge base recognition molecule capable of determining the type of bulge base based on the strength of the bond with each bulge base.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、バルジ塩基と水素結合するインター
カレーターを用いて、バルジ塩基とインターカレーター
の水素結合複合体が、二本鎖ＤＮＡにスタックして安定
な複合体を形成することを見出してきた（特開２００１
−８９４７８号）。しかし、これらのバルジ認識分子は
特定の塩基との選択性が強く、１種類のバルジ認識分子
で全ての塩基に対するバルジを認識させることが困難で
あった。本発明者らは、この点を改良するために鋭意研
究してきたところ、いずれの塩基に対してもバルジとな
っていることを認識し得るバルジ認識分子をデザインす
ることができることを見出した。即ち、本発明は、一般
式（Ｉ）、[Means for Solving the Problems] In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have used an intercalator that hydrogen bonds with a bulge base, and a hydrogen bond complex of the bulge base and the intercalator has a double-stranded structure. It has been found to stack with DNA to form a stable complex (JP 2001
-89478). However, these bulge recognition molecules have strong selectivity with respect to a specific base, and it has been difficult to recognize bulges with respect to all the bases with one type of bulge recognition molecule. The present inventors have conducted extensive studies to improve this point, and have found that it is possible to design a bulge recognition molecule capable of recognizing a bulge for any base. That is, the present invention has the general formula (I):
【０００８】[0008]
【化４】 [Chemical 4]
【０００９】（式中、Ａは、＝Ｃ−又は＝Ｎ−を示し、
Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であっ
て当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸
素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭
素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基
中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原
子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜
１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該ア
ルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素
原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジア
ルキルアミノ基を示し、Ｒ２は、置換基を有してもよい
炭素数１〜２０のアルキル基を示す。）で表される化合
物であって、バルジ塩基と水素結合を形成することがで
きるバルジ塩基認識分子に関し、より詳細には、一般式
（Ｉ）で表されるバルジ塩基認識分子が、次式（II）、(In the formula, A represents = C- or = N-,
R 1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and an alkyl group in which one or more carbon atoms in the alkyl group may be substituted with an oxygen atom or a nitrogen atom; An alkoxy group having 15 alkoxy groups, in which one or more carbon atoms in the alkoxy group may be substituted with an oxygen atom or a nitrogen atom;
15 mono- or dialkylamino groups, which represent mono- or dialkylamino groups in which one or more carbon atoms in the alkylamino groups may be replaced by oxygen or nitrogen atoms, and R 2 represents a substituent Represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have. ) The compound represented by the formula (1), which is capable of forming a hydrogen bond with a bulge base, more specifically, the bulge base recognition molecule represented by the general formula (I) is II),
【００１０】[0010]
【化５】 [Chemical 5]
【００１１】で表されるＮ−１，８−ナフチリジン−尿
素誘導体である請求項１又は２に記載のバルジ塩基認識
分子、又は、一般式（Ｉ）で表されるバルジ塩基認識分
子が、次式（III）、The bulge base recognition molecule according to claim 1 or 2, which is an N-1,8-naphthyridine-urea derivative represented by the following, or the bulge base recognition molecule represented by the general formula (I), Formula (III),
【００１２】[0012]
【化６】 [Chemical 6]
【００１３】で表されるＮ−キノリン−尿素誘導体であ
る請求項１又は２に記載のバルジ塩基認識分子に関す
る。また、本発明は、前記した本発明のバルジ塩基認識
分子を含有してなるバルジ塩基認識用組成物、並びに前
記した本発明のバルジ塩基認識分子を用いて、ＤＮＡ中
のバルジ塩基を測定する方法及びそのための測定用キッ
トに関する。さらに、本発明は、バルジ塩基認識分子
が、特定のバルジ塩基と水素結合を形成し、当該バルジ
塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによ
りバルジ塩基が安定化されたＤＮＡに関する。The bulge base recognition molecule according to claim 1 or 2, which is an N-quinoline-urea derivative represented by: Further, the present invention provides a method for measuring a bulge base in DNA using the composition for bulge base recognition comprising the bulge base recognition molecule of the present invention, and the bulge base recognition molecule of the present invention. And a measurement kit therefor. Furthermore, the present invention relates to a bulge base-stabilized DNA in which a bulge base recognition molecule forms a hydrogen bond with a specific bulge base and is stacked on a base pair existing in the vicinity of the bulge base.
【００１４】本発明者らは、バルジ構造にインタカレー
トし、相補鎖側の塩基をワトソン−クリック（Watson-C
lick）型の塩基対形成により認識させることを考え、芳
香環と水素結合部位を合わせ持つ前記一般式（II）及び
（III）で示される芳香族尿素誘導体を合成した。以
下、本明細書においては前記一般式（II）で示される芳
香族尿素誘導体をナフチリジンウレアと呼び、前記一般
式（III）で示される芳香族尿素誘導体をキノリンウレ
アと呼ぶ。このナフチリジンウレア及びキノリンウレア
は、各々次の化学式で示されるように、シトシン（Ｃ）
とワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対を形
成すると考えられた。The present inventors have intercalated into the bulge structure and have Watson-Crick (Watson-C) bases on the complementary strand side.
Aromatic urea derivatives represented by the above general formulas (II) and (III) having an aromatic ring and a hydrogen bonding site were synthesized in consideration of recognition by lick) type base pair formation. Hereinafter, in the present specification, the aromatic urea derivative represented by the general formula (II) is referred to as naphthyridine urea, and the aromatic urea derivative represented by the general formula (III) is referred to as quinoline urea. The naphthyridine urea and the quinoline urea each have cytosine (C) as shown by the following chemical formulas.
And Watson-Click base pairing.
【００１５】[0015]
【化７】 [Chemical 7]
【００１６】[0016]
【化８】 [Chemical 8]
【００１７】そこで、本発明者らは、ナフチリジンウレ
ア及びキノリンウレアを用いて各塩基がバルジになって
いる次のオリゴヌクレオチド（１）〜（５）について、
それぞれの融解温度（Ｔｍ）を測定した。
オリゴヌクレオチド（１）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＧＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（２）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＣＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（３）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（４）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＴＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（５）
５’−ＴＣＣＡＧＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＣＧＴＴＧ−５’
前記したオリゴヌクレオチド（１）〜（４）における
「−」印は、その箇所においてバルジになっていること
を示し、オリゴヌクレオチド（５）はバルジの無いオリ
ゴヌクレオチドである。この結果を次の表１に示す。Therefore, the present inventors have proposed the following oligonucleotides (1) to (5) in which each base is a bulge using naphthyridine urea and quinoline urea:
Each melting temperature (Tm) was measured. Oligonucleotide (1) 5'-TCCAG-GCAAC-3 '3'-AGGTCGCGTGTG-5' Oligonucleotide (2) 5'-TCCAG-GCAAC-3 '3'-AGGTCCCGTGTG-5' Oligonucleotide (3) 5'- TCCAG-GCAAC-3 ′ 3′-AGGTCACGTTG-5 ′ Oligonucleotide (4) 5′-TCCAG-GCAAC-3 ′ 3′-AGGTCTCGTGTG-5 ′ Oligonucleotide (5) 5′-TCCAGGCAAC-3 ′ 3′-AGGTCCGTTG -5 'The "-" mark in the oligonucleotides (1) to (4) described above indicates that there is a bulge at that location, and the oligonucleotide (5) is an oligonucleotide without bulge. The results are shown in Table 1 below.
【００１８】 表１ バルジ認識分子の存在下又は非存在下におけるバルジ含有ヌクレオチド のＴｍ ヌクレオチド Ｔｍ(-)/℃ 分子の種類 Ｔｍ(+)/℃ ΔＴｍ／℃ （１）−Ｇ ３１．６ Ｎａｐｈ ３４．０ ２．４ Ｑｕｉ ３３．４ １．８ （２）−Ｃ ３２．６ Ｎａｐｈ ３７．４ ４．８ Ｑｕｉ ３７．５ ４．９ （３）−Ａ ３１．１ Ｎａｐｈ ３４．２ ３．１ Ｑｕｉ ３３．７ ２．６ （４）−Ｔ ２９．６ Ｎａｐｈ ３３．３ ３．７ Ｑｕｉ ３３．８ ４．２ （５）−− ４６．２ Ｎａｐｈ ４５．９ −０．３ Ｑｕｉ ４５．５ −０．７ [0018] Table 1 Bulge-containing nucleotides in the presence or absence of a bulge recognition molecule Tm Nucleotide Tm (-) / ℃ Molecule type Tm (+) / ℃ ΔTm / ℃ (1) -G 31.6 Naph 34.0 2.4 Qui 33.4 1.8 (2) -C 32.6 Naph 37.4 4.8 Qui 37.5 4.9 (3) -A 31.1 Naph 34.2 3.1 Qui 33.7 2.6 (4) -T 29.6 Naph 33.3 3.7 Qui 33.8 4.2 (5)-46.2 Naph 45.9-0.3 Qui 45.5 -0.7
【００１９】前記表１における「ヌクレオチド」の項の
番号は前記したオリゴヌクレオチドの番号であり、その
右側のアルファベットは当該オリゴヌクレオチドにおけ
るバルジ塩基の種類を示しており、オリゴヌクレオチド
（５）はバルジ塩基が存在しないことを示している。
「Ｔｍ(-)/℃」はバルジ認識分子の非存在下のＴｍ
（℃）を示し、「分子の種類」は存在させた本発明のバ
ルジ認識分子であり、「Ｎａｐｈ」はナフチリジンウレ
アを示し、「Ｑｕｉ」はキノリンウレアをそれぞれ示
す。「Ｔｍ(+)/℃」は前述した本発明のバルジ認識分子
の存在下におけるＴｍ（℃）を示す。「ΔＴｍ／℃」は
バルジ認識分子の存在下のＴｍ（℃）とバルジ認識分子
の非存在下のＴｍ（℃）の差を示す。表１は、１００ｍ
ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）中での、ヌクレオチド１００ｍＭを用
いた場合の測定値であり、バルジ認識分子の存在下にお
けるバルジ認識分子の存在量は１００ｍＭである。The number in the "nucleotide" section in Table 1 above is the number of the above-mentioned oligonucleotide, and the alphabet on the right side thereof indicates the type of bulge base in the oligonucleotide, and oligonucleotide (5) is the bulge base. Is not present.
"Tm (-) / ℃" is Tm in the absence of bulge recognition molecule
(° C.), “type of molecule” is the bulge recognition molecule of the present invention in the presence, “Naph” represents naphthyridine urea, and “Qui” represents quinoline urea. “Tm (+) / ° C.” indicates Tm (° C.) in the presence of the above-described bulge recognition molecule of the present invention. “ΔTm / ° C.” indicates the difference between Tm (° C.) in the presence of the bulge recognition molecule and Tm (° C.) in the absence of the bulge recognition molecule. Table 1 is 100m
It is a measurement value when using 100 mM of nucleotide in a 10 mM sodium cacodylate buffer (pH 7.0) containing M NaCl, and the abundance of the bulge recognition molecule in the presence of the bulge recognition molecule is 100 mM.
【００２０】正常な塩基対のみを有するオリゴヌクレオ
チド（５）の場合には本発明のバルジ認識分子を存在さ
せてもＴｍの値はほとんど変化しない（ΔＴｍはほぼ０
である。）が、バルジ塩基を含むオリゴヌクレオチド
（１）〜（４）の場合には大きな変化が見られた。これ
らのＴｍ値は大きく上昇し、本発明のバルジ認識分子の
存在により安定化されたことがわかる。本発明のナフチ
リジンウレア及びキノリンウレアは、当初の予測ドオリ
シトシン（Ｃ）塩基のバルジを強く安定化したが（ΔＴ
ｍが４．８〜４．９℃）、意外なことに他の塩基のバル
ジも同様に安定化していること（ΔＴｍが１．８〜４．
２℃）がわかった。このことは本発明のバルジ認識分子
が、強弱の差はあるもののいずれの塩基のバルジも安定
化する能力を有していることを示しているのであり、か
つバルジ塩基の種類に応じてΔＴｍの大きさに相違が生
じていることを示すものである。In the case of the oligonucleotide (5) having only normal base pairs, the Tm value hardly changes even when the bulge recognition molecule of the present invention is present (ΔTm is almost 0).
Is. ), A large change was observed in the case of oligonucleotides (1) to (4) containing a bulge base. It can be seen that these Tm values greatly increased and were stabilized by the presence of the bulge recognition molecule of the present invention. The naphthyridine ureas and quinoline ureas of the present invention strongly stabilized the initially predicted dolicytosine (C) base bulge (ΔT
m is 4.8 to 4.9 ° C.), and surprisingly, the bulges of other bases are similarly stabilized (ΔTm is 1.8 to 4.
2 ° C) was found. This indicates that the bulge recognition molecule of the present invention has the ability to stabilize the bulge of any base, although there are differences in strength and weakness, and ΔTm of This indicates that there is a difference in size.
【００２１】したがって、本発明のバルジ認識分子を用
いることにより、二本鎖のＤＮＡ中のバルジ塩基の有無
を判定することができるし、さらにΔＴｍの値からバル
ジ塩基の種類を予測することも可能となる。例えば、あ
る遺伝子が１個又は数個の塩基を欠損しているか否かを
検定する場合には、欠損箇所を含む当該遺伝子の断片を
被検体遺伝子断片として用意し、当該断片を正常な塩基
配列を有する正常遺伝子断片とハイブリダイズさせて、
本発明のバルジ認識分子の存在下及び非存在下において
ハイブリダイズした遺伝子の融解温度（Ｔｍ）などを測
定することにより被検体遺伝子断片に塩基の欠損が有る
か無いかを判定することでき、また欠損塩基の種類を予
測することができる。Therefore, by using the bulge recognition molecule of the present invention, it is possible to determine the presence or absence of a bulge base in double-stranded DNA, and it is also possible to predict the type of bulge base from the value of ΔTm. Becomes For example, when assaying whether a gene lacks one or several bases, a fragment of the gene containing the defective site is prepared as a test gene fragment, and the fragment has a normal nucleotide sequence. By hybridizing with a normal gene fragment having
By measuring the melting temperature (Tm) of the hybridized gene in the presence and absence of the bulge recognition molecule of the present invention, it is possible to determine whether the gene fragment to be tested has a base defect or not. The type of missing base can be predicted.
【００２２】したがって、本発明の一般式（Ｉ）で表さ
れるバルジ塩基認識分子は、これをバルジ塩基認識剤と
して使用することができ、また、適当な担体又は測定用
の資材と組み合わせることによりバルジ塩基認識用組成
物とすることができる。また、本発明は、本発明の一般
式（Ｉ）で表されるバルジ塩基認識分子又は標識化若し
くは固定化されたバルジ塩基認識分子を使用してＤＮＡ
中のバルジ塩基を検出、同定又は定量するための測定方
法を提供するものである。本発明の測定方法としては、
前記してきた融解温度（Ｔｍ）の測定が簡便で好ましい
が、これに限定されるものではない。また、測定に使用
する遺伝子の断片としては特に制限はないが、好ましく
は１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基、
１０〜３０塩基程度の長さのものがよい。さらに、この
ようなバルジ塩基の検定の際に、本発明者らが開発きた
ミスマッチ認識分子（特開２００１−１４９０９６号参
照）を併せて使用することもできる。このようなミスマ
ッチ認識分子を併せて使用することにより、被検体遺伝
子断片における欠損塩基の有無及び種類を検定できると
同時に、ＳＮＰのような塩基の変化についても検定する
ことができる。Therefore, the bulge base recognizing molecule represented by the general formula (I) of the present invention can be used as a bulge base recognizing agent, and by combining it with a suitable carrier or measuring material. It can be a composition for bulge base recognition. In addition, the present invention uses a bulge base recognition molecule represented by the general formula (I) of the present invention or a labeled or immobilized bulge base recognition molecule to DNA.
The present invention provides a measuring method for detecting, identifying or quantifying a bulge base in the medium. As the measuring method of the present invention,
Although the above-mentioned measurement of the melting temperature (Tm) is simple and preferable, it is not limited to this. The gene fragment used for measurement is not particularly limited, but is preferably 10 to 100 bases, more preferably 10 to 50 bases,
The length is preferably about 10 to 30 bases. Furthermore, a mismatch recognition molecule developed by the present inventors (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-149096) can also be used in the assay of such a bulge base. By using such a mismatch recognition molecule in combination, the presence or absence and the type of the defective base in the test gene fragment can be assayed, and at the same time, the change of the base such as SNP can be assayed.
【００２３】また、本発明のバルジ塩基認識分子はこれ
を単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置
に放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する
分子種を導入するなどして、標識化して使用することも
できる。さらに、本発明のバルジ塩基認識分子の適当な
位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又は
リンカーなどを用いて結合させて、これを固定化して使
用することもできる。The bulge base recognition molecule of the present invention can be used alone, but a radioactive element is introduced at an appropriate position in the molecule, or a molecular species that emits chemiluminescence or fluorescence is introduced. Then, it can be labeled and used. Furthermore, the bulge base recognition molecule of the present invention may be used by being immobilized at a suitable position on a polymer material such as polystyrene directly or by using a linker or the like, and then being immobilized.
【００２４】本発明の一般式（Ｉ）で表されるバルジ塩
基認識分子は低分子有機化合物であり、通常の有機合成
法により適宜製造することができる。例えば、尿素誘導
体やウレタン誘導体から合成することもできるが、アミ
ノナフチリジン類又はアミノキノリン類と置換又は非置
換のカルボン酸をジ置換ホスホリルアジドの存在下に直
接尿素誘導体とする方法によっても製造することができ
る。例えば、前記した一般式（II）で表されるナフチリ
ジンウレアは、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は
２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンとＮ−
保護−４−アミノ−酪酸とを、ジフェニルホスホリルア
ジドの存在下に反応させてＮ−保護−尿素誘導体とし、
ついで末端のアミノ基の保護基を脱保護して製造するこ
とができる。また、同様な方法により一般式（III）で
表されるキノリンウレアを精巣することができる。この
際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカ
ルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミ
ノ保護基を使用することができる。The bulge base recognition molecule represented by the general formula (I) of the present invention is a low molecular weight organic compound, and can be appropriately produced by a usual organic synthesis method. For example, it can be synthesized from a urea derivative or a urethane derivative, but can also be produced by a method of directly converting an aminonaphthyridine or aminoquinoline and a substituted or unsubstituted carboxylic acid into a urea derivative in the presence of a disubstituted phosphoryl azide. You can For example, the naphthyridine urea represented by the general formula (II) is 2-amino-1,8-naphthyridine or 2-amino-7-methyl-1,8-naphthyridine and N-.
Reacting with protected-4-amino-butyric acid in the presence of diphenylphosphoryl azide to give an N-protected-urea derivative,
Then, it can be produced by deprotecting the terminal amino-protecting group. In addition, the quinoline urea represented by the general formula (III) can be tested by the same method. As the protecting group in this case, an amino protecting group used in peptide synthesis such as a hydrochloride, an acyl group or an alkoxycarbonyl group can be used.
【００２５】また、本発明の一般式（Ｉ）で表されるバ
ルジ認識分子における置換基Ｒ１は無くてもよいが（置
換基Ｒ１とが水素原子の場合）、置換基Ｒ１としてはバ
ルジ塩基を認識するために障害にならないものであれば
特に制限はなく、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは
１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のア
ルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好
ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からな
るアルコキシ基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０
より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基
でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルア
ミノ基などが挙げられる。これらのアルキル基、アルコ
キシ基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１
個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子又は窒素原子で
置換されていてもよい。置換基Ｒ １は、ナフチリジン又
はキノリン骨格のいずれの位置に存在してもよく、また
このような置換基が２個以上存在していてもよい。本発
明の一般式（Ｉ）で表されるバルジ認識分子における置
換基Ｒ２におけるアルキル基は、置換基を有してもよい
炭素数１〜２０、好ましくは２〜１０より好ましくは３
〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基を示し、当該アル
キル基は置換基を有していなくてもよいが、分子の親水
性を上げるためや、ＤＮＡなどとの親和性のためにある
程度の極性を有する官能基を置換基として有するものが
好ましい。このような置換基は当該アルキル基の末端に
位置していてもよいし、アルキル基の他の位置に存在し
ていてもよいし、また２個以上の置換基が存在していて
もよい。このような置換基としては、例えば、アミノ
基、水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。本発明
の一般式（Ｉ）で表されるバルジ認識分子の好ましい例
としては、一般式（II）や一般式（III）で表されるナ
フチリジンウレアやキノリンウレアが挙げられる。Further, the bar represented by the general formula (I) of the present invention is
Substituent R in the Luge recognition molecule1May be omitted (
Substituent R1And are hydrogen atoms), the substituent R1As
If it does not hinder the recognition of lusi base,
There is no particular limitation, for example, having 1 to 15 carbon atoms, preferably
1-10, more preferably 1-7 straight-chain or branched
Rualkyl group, preferably having 1 to 15 carbon atoms, more preferably 1 to 10 carbon atoms
It is preferably composed of 1 to 7 linear or branched alkyl groups.
An alkoxy group having 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms
More preferably 1 to 7 linear or branched alkyl group
Mono- or di-alkyl-substituted by
Examples include mino group. These alkyl groups, arco
1 in xy group or mono- or dialkylamino group
One or more carbon atoms are oxygen or nitrogen atoms.
It may be substituted. Substituent R 1Is naphthyridine
May be located anywhere on the quinoline skeleton, and
Two or more such substituents may be present. Starting
The position in the bulge recognition molecule represented by the general formula (I)
Substituent RTwoThe alkyl group in may have a substituent
1 to 20 carbon atoms, preferably 2 to 10 carbon atoms, more preferably 3 carbon atoms
7 represents a linear or branched alkyl group of
The kill group may have no substituent, but the hydrophilicity of the molecule
It is for the purpose of improving sex and affinity with DNA etc.
What has a functional group with a degree of polarity as a substituent
preferable. Such a substituent is attached to the end of the alkyl group.
May be located, or may be located elsewhere on the alkyl group.
Or two or more substituents are present
Good. Such substituents include, for example, amino
Group, hydroxyl group, carboxyl group and the like. The present invention
Preferred examples of the bulge recognition molecule represented by the general formula (I)
Is represented by the general formula (II) or the general formula (III).
Examples include futrizine urea and quinoline urea.
【００２６】本発明のバルジ塩基認識分子を用いること
により、１個又は２個以上のバルジ塩基を有するＤＮＡ
において、いずれの塩基によるバルジ塩基とも水素結合
を形成させてこれを安定化させ、バルジ塩基を含有する
ＤＮＡを安定化させることができる。特に本発明のバル
ジ塩基認識分子は、特定のバルジ塩基と水素結合を形成
するのみならず、近傍、好ましくは隣接する塩基対にス
タックされ、バルジ塩基が存在しているにもかかわらず
比較的安定なＤＮＡを得ることができる。したがって、
本発明は、バルジ塩基認識分子が、特定のバルジ塩基と
水素結合を形成し、当該バルジ塩基の近隣に存在する塩
基対にスタックされることによりバルジ塩基が安定化さ
れたバルジ塩基を含有するＤＮＡを提供するものであ
る。本発明のＤＮＡは、バルジ塩基が本発明のバルジ塩
基認識分子と水素結合により塩基対と同様な「対」を形
成し、かつバルジ塩基と「対」を形成している本発明の
バルジ塩基認識分子が近傍、好ましくは隣接の塩基対を
形成している塩基にサンドイッチ状に挟まれてスタック
されているものと考えられる。By using the bulge base recognition molecule of the present invention, a DNA having one or more bulge bases
In the above, it is possible to stabilize the bulge base-containing DNA by forming a hydrogen bond with the bulge base by any base and stabilizing it. In particular, the bulge base recognition molecule of the present invention not only forms a hydrogen bond with a specific bulge base, but is also stacked in the vicinity, preferably adjacent base pairs, and is relatively stable despite the presence of the bulge base. DNA can be obtained. Therefore,
The present invention provides a bulge base-containing DNA in which a bulge base is stabilized by forming a hydrogen bond with a specific bulge base and stacking the bulge base in a base pair existing in the vicinity of the bulge base. Is provided. The DNA of the present invention has a bulge base recognition of the present invention in which the bulge base forms a “pair” similar to a base pair by hydrogen bonding with the bulge base recognition molecule of the present invention, and also forms a “pair” with the bulge base. It is considered that molecules are sandwiched and stacked in the vicinity of bases, preferably bases forming adjacent base pairs.
【００２７】本発明のバルジＤＮＡ認識分子を用いるこ
とにより、従来の技術では達成できないバルジＤＮＡ認
識分子を高感度で検出することが出来、１種類のバルジ
認識分子を用いるだけでいずれの塩基についてのバルジ
塩基をも安定化し、この安定化の程度を融解温度（Ｔ
ｍ）などの変化として測定することにより、バルジ塩基
の存在の有無やバルジ塩基の種類を予測できることか
ら、本発明のバルジ認識分子はＤＮＡ損傷に伴う各種疾
患の治療、予防又は診断に有用である。また、本発明の
ＤＮＡはバルジ塩基を有した状態で比較的安定に存在す
ることができることから、バルジ塩基を含有するＤＮＡ
の安定化や、バルジ塩基の発生原因やバルジ塩基の修復
機構の解明などの研究材料としても重要である。By using the bulge DNA recognition molecule of the present invention, it is possible to detect with high sensitivity a bulge DNA recognition molecule which cannot be achieved by conventional techniques, and it is possible to detect which base is present by using one kind of bulge recognition molecule. It also stabilizes the bulge base, and the extent of this stabilization depends on the melting temperature (T
The presence or absence of the bulge base and the type of the bulge base can be predicted by measuring the change in m) or the like, and thus the bulge recognition molecule of the present invention is useful for the treatment, prevention or diagnosis of various diseases associated with DNA damage. . Moreover, since the DNA of the present invention can exist relatively stably in the state of having a bulge base, it is a DNA containing a bulge base.
Is also important as a research material for the stabilization of bulge, elucidation of the cause of bulge base generation, and the mechanism of bulge base repair.
【００２８】[0028]
【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００２９】実施例１（ナフチリジンウレアの製造法） ナフチリジンウレアの製造における反応式を次に示す。Example 1 (Method for producing naphthyridine urea) The reaction formula in the production of naphthyridine urea is shown below.
【００３０】[0030]
【化９】 [Chemical 9]
【００３１】前記反応式において、Ｂｏｃはｔ−ブトキ
シカルボニル基を示し、ＤＰＰＡはジフェニルフォスフ
ォリルアジドを示し、Ａｃはアセチル基を示す。（１）
Ｂｏｃで保護した５−アミノペンタン酸 (798.9 mg, 3.
68 mmol)、ジフェニルフォスフォリルアジド (1114.6 m
g, 4.05 mmol) 、トリエチルアミン (398.9 mg, 3.94 m
mol) を無水ピリジン中(10 mL) に混合し、８０℃ で
３時間撹拌した。この溶液に、２−アミノ−７−メチル
−１，８−ナフチリジン(315.8 mg,1.98 mmol)を加え、
さらに８０ ℃ で４．５時間撹拌した。溶媒のピリジ
ンを減圧留去したのち、粗生成物をクロロホルムに溶解
し、食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。
カラムクロマトグラフィーで（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝
４０／１）精製して、目的のナフチリジンウレアのＢｏ
ｃ保護体(705.6 mg,95%) を淡黄色固体として得た。１
Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ：8.
17 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.16 (d, 1H, J = 8.8 Hz),
7.38 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 8.8 H
z),3.41 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.09 (t, 2H, J = 6.6
Hz), 2.73 (s, 3H), 1.70 (m, 2H), 1.57 (m, 2
H), 1.39 (s, 9H)
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ），ｍ／ｅ（％）： ３７４［（Ｍ
＋Ｈ）＋］（１００）， １８６（７０）
ＨＲＭＳ ：
計算値 Ｃ１９Ｈ２８Ｏ３Ｎ５ ［（Ｍ＋Ｈ）＋］ ２７４．１６６８
，
実測値 ２７４．１６７０In the above reaction formula, Boc represents a t-butoxycarbonyl group, DPPA represents diphenylphosphoryl azide, and Ac represents an acetyl group. (1)
Boc-protected 5-aminopentanoic acid (798.9 mg, 3.
68 mmol), diphenylphosphoryl azide (1114.6 m
g, 4.05 mmol), triethylamine (398.9 mg, 3.94 m
mol) in anhydrous pyridine (10 mL) and stirred at 80 ° C. for 3 hours. To this solution was added 2-amino-7-methyl-1,8-naphthyridine (315.8 mg, 1.98 mmol),
The mixture was further stirred at 80 ° C. for 4.5 hours. After the solvent pyridine was distilled off under reduced pressure, the crude product was dissolved in chloroform, washed with brine and dried over anhydrous magnesium sulfate.
By column chromatography (CHCl 3 / MeOH =
40/1) Purified and purified Bo of desired naphthyridine urea
The c-protected form (705.6 mg, 95%) was obtained as a pale yellow solid. 1 H-NMR (CD 3 OD, 400 MHz) δ: 8.
17 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.16 (d, 1H, J = 8.8 Hz),
7.38 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 8.8 H
z), 3.41 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.09 (t, 2H, J = 6.6
Hz), 2.73 (s, 3H), 1.70 (m, 2H), 1.57 (m, 2
H), 1.39 (s, 9H) FABMS (NBA), m / e (%): 374 [(M
+ H) + ] (100), 186 (70) HRMS: Calculated value C 19 H 28 O 3 N 5 [(M + H) + ] 274.1668, found 2741670.
【００３２】（２）前記（１）で得られた固体(134.6 m
g, 0.360 mmol)をクロロホルム(8 mL)に溶かした後、氷
冷下に４Ｍ塩酸の酢酸エチル溶液 (4.5 mL)を滴下し、
室温で１．５時間撹拌した。溶媒を留去した後、残査を
水とクロロホルムに分配した。水層を分離した後、２８
％アンモニアを加え、再度クロロホルムで抽出した。硫
酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去することにより目
的のナフチリジンウレア(79mg, 80%) を淡黄色固体とし
て得た。１
Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ：1
0.59 (br, 1H), 9.80 (br, 1H), 7.91 (d, 1H, J = 8.4
Hz),7.88 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.38 (br, 1H),7.16
(d, 1H, J = 8.0 Hz), 3.43 (m, 2H),2.70 (t, 2H, J =
7.0 Hz), 2.68 (s, 3H), 1.66 (m, 2H),1.53 (m, 2H)
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ），ｍ／ｅ（％）： ２７４［（Ｍ
＋Ｈ）＋］（４５），１８６（１００），１６０（３
８）
ＨＲＭＳ
計算値 Ｃ１４Ｈ２０ＯＮ５ ［（Ｍ＋Ｈ）＋］ ２７４．１６６８，
実測値 ２７４．１６７０(2) The solid (134.6 m) obtained in the above (1)
g, 0.360 mmol) in chloroform (8 mL), 4M hydrochloric acid in ethyl acetate (4.5 mL) was added dropwise under ice cooling.
Stir at room temperature for 1.5 hours. After evaporating the solvent, the residue was partitioned between water and chloroform. 28 after separating the water layer
% Ammonia was added, and the mixture was extracted again with chloroform. After drying over magnesium sulfate, the solvent was evaporated to obtain the target naphthyridine urea (79 mg, 80%) as a pale yellow solid. 1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ: 1
0.59 (br, 1H), 9.80 (br, 1H), 7.91 (d, 1H, J = 8.4
Hz), 7.88 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.38 (br, 1H), 7.16
(d, 1H, J = 8.0 Hz), 3.43 (m, 2H), 2.70 (t, 2H, J =
7.0 Hz), 2.68 (s, 3H), 1.66 (m, 2H), 1.53 (m, 2H) FABMS (NBA), m / e (%): 274 [(M
+ H) + ] (45), 186 (100), 160 (3
8) HRMS calculated value C 14 H 20 ON 5 [(M + H) + ] 274.1668, found value 274.1670.
【００３３】実施例２ （キノリンウレアの製造法） キノリンウレアの製造における反応式を次に示す。Example 2 (Method for producing quinoline urea) The reaction formula in the production of quinoline urea is shown below.
【００３４】[0034]
【化１０】 [Chemical 10]
【００３５】前記反応式において、Ｂｏｃはｔ−ブトキ
シカルボニル基を示し、ＤＰＰＡはジフェニルフォスフ
ォリルアジドを示し、Ａｃはアセチル基を示す。
（１）Ｂｏｃで保護した５−アミノペンタン酸 (367.7
mg, 1.69 mmol)、ジフェニルフォスフォリルアジド (49
5.4 mg, 1.80 mmol) 、トリエチルアミン (181.0mg, 1.
79 mmol) を無水ピリジン中(10 mL) に混合し、８０℃
で１時間撹拌した。この溶液に、２−アミノキノリン(1
95.8 mg, 1.36 mmol)を加え、さらに８０℃で３．５時
間撹拌した。溶媒のピリジンを減圧留去したのち、粗生
成物をクロロホルムに溶解し、食塩水で洗浄、無水硫酸
マグネシウムで乾燥した。カラムクロマトグラフィーで
（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝６０／１）精製して、目的の
キノリンウレアのＢｏｃ保護体(319.2 mg, 66%) を白色
固体として得た。１
Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ：1
0.11 (br 1H), 8.11 (br 1H), 7.80 (d, 1H, J = 8.8 H
z),7.74 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 7.8
Hz),7.63 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.38 (t, 1H, J = 7.8
Hz),6.85 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.48 (m, 2H), 3.20
(m, 2H),1.70 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 1.42 (s, 9H)
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ），ｍ／ｅ（％）： ３５９［（Ｍ
＋Ｈ）＋］（１００），３０３（２０），１７１（５
０），１４５（３５）
ＨＲＭＳ
計算値 Ｃ１９Ｈ２７Ｏ３Ｎ４ ［（Ｍ＋Ｈ）＋］ ３５９．２０８３
，
実測値 ３５９．２０９１In the above reaction formula, Boc represents a t-butoxycarbonyl group, DPPA represents diphenylphosphoryl azide, and Ac represents an acetyl group. (1) 5-aminopentanoic acid protected by Boc (367.7
mg, 1.69 mmol), diphenylphosphoryl azide (49
5.4 mg, 1.80 mmol), triethylamine (181.0 mg, 1.
79 mmol) in anhydrous pyridine (10 mL) and mix at 80 ° C.
It was stirred for 1 hour. 2-aminoquinoline (1
(95.8 mg, 1.36 mmol) was added, and the mixture was further stirred at 80 ° C. for 3.5 hr. After the solvent pyridine was distilled off under reduced pressure, the crude product was dissolved in chloroform, washed with brine and dried over anhydrous magnesium sulfate. Purification by column chromatography (CHCl 3 / MeOH = 60/1) gave the desired Boc protected quinoline urea (319.2 mg, 66%) as a white solid. 1 H-NMR (CD 3 OD, 400 MHz) δ: 1
0.11 (br 1H), 8.11 (br 1H), 7.80 (d, 1H, J = 8.8 H
z), 7.74 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 7.8
Hz), 7.63 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.38 (t, 1H, J = 7.8
Hz), 6.85 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.48 (m, 2H), 3.20
(m, 2H), 1.70 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 1.42 (s, 9H) FABMS (NBA), m / e (%): 359 [(M
+ H) + ] (100), 303 (20), 171 (5
0), 145 (35) HRMS calculated value C 19 H 27 O 3 N 4 [(M + H) + ] 359.2083, found value 359.2091.
【００３６】（２）前記（１）で得られた固体(132.7 m
g, 0.370 mmol)をクロロホルム(8 mL)に溶かした後、氷
冷下に４Ｍ塩酸の酢酸エチル溶液 (4.0 mL) を滴下し、
室温で４５分撹拌した。溶媒を留去した後、残査を水と
クロロホルムに分配した。水層を分離した後、２８％ア
ンモニアを加え、再度クロロホルムで抽出した。硫酸マ
グネシウムで乾燥後、溶媒を留去することにより目的の
ナフチリジンウレア (82.7 mg, 86%) を白色固体として
得た。１
Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ：1
0.24 (br, 1H), 9.96 (br ,1H), 7.96 (d, 1H, J = 8.8
Hz),7.71 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.65 (d, 1H, J = 7.
6 Hz),7.59 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.34 (t, 1H, J =
7.6 Hz),7.05 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.50 (m, 2H),2.7
8 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.74 (m, 2H), 1.63 (m, 2H)
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ），ｍ／ｅ（％）： ２５９［（Ｍ
＋Ｈ）＋］（１００），１７１（９５）
ＨＲＭＳ
計算値 Ｃ１４Ｈ１９ＯＮ４ ［（Ｍ＋Ｈ）＋］ ２５９．１５５９，
実測値 ２５９．１５５９(2) The solid (132.7 m) obtained in the above (1)
g, 0.370 mmol) in chloroform (8 mL), and then 4M hydrochloric acid in ethyl acetate (4.0 mL) was added dropwise under ice cooling.
Stir for 45 minutes at room temperature. After evaporating the solvent, the residue was partitioned between water and chloroform. After separating the aqueous layer, 28% ammonia was added and the mixture was extracted again with chloroform. After drying over magnesium sulfate, the solvent was evaporated to obtain the target naphthyridine urea (82.7 mg, 86%) as a white solid. 1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ: 1
0.24 (br, 1H), 9.96 (br, 1H), 7.96 (d, 1H, J = 8.8
Hz), 7.71 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.65 (d, 1H, J = 7.
6 Hz), 7.59 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.34 (t, 1H, J =
7.6 Hz), 7.05 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.50 (m, 2H), 2.7
8 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.74 (m, 2H), 1.63 (m, 2H) FABMS (NBA), m / e (%): 259 [(M
+ H) + ] (100), 171 (95) HRMS calculated value C 14 H 19 ON 4 [(M + H) + ] 259.1559, found value 259.1559.
【００３７】実施例３ （バルジ塩基を含有するＤＮＡ
の融解温度（Ｔｍ）の測定）
次の（１）〜（５）の５種の１１塩基からなるヌクレオ
チドオリゴマーの各々１００ｍＭを、１００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含む１０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）に添加して、実施例１で製造した一般式（II）
のナフチリジンウレア又は実施例２で製造した一般式
（III）のキノリンウレアの存在下及び非存在下におけ
る融解温度（Ｔｍ）をそれぞれ測定した。
オリゴヌクレオチド（１）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＧＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（２）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＣＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（３）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（４）
５’−ＴＣＣＡＧ−ＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＴＣＧＴＴＧ−５’
オリゴヌクレオチド（５）
５’−ＴＣＣＡＧＧＣＡＡＣ−３’
３’−ＡＧＧＴＣＣＧＴＴＧ−５’
前記したオリゴヌクレオチド（１）〜（４）における
「−」印は、その箇所においてバルジになっていること
を示し、オリゴヌクレオチド（５）はバルジの無いオリ
ゴヌクレオチドである。Example 3 (DNA containing bulge base
(Measurement of melting temperature (Tm) of each) 100 mM of each of the following (1) to (5) nucleotide oligomers consisting of 11 kinds of 11 bases and 100 mM Na
10 mM sodium cacodylate buffer containing Cl (pH
7.0) and added with the general formula (II) prepared in Example 1.
The melting temperature (Tm) in the presence and absence of the naphthyridine urea of Example 1 or the quinoline urea of the general formula (III) produced in Example 2 was measured. Oligonucleotide (1) 5'-TCCAG-GCAAC-3 '3'-AGGTCGCGTGTG-5' Oligonucleotide (2) 5'-TCCAG-GCAAC-3 '3'-AGGTCCCGTGTG-5' Oligonucleotide (3) 5'- TCCAG-GCAAC-3 ′ 3′-AGGTCACGTTG-5 ′ Oligonucleotide (4) 5′-TCCAG-GCAAC-3 ′ 3′-AGGTCTCGTGTG-5 ′ Oligonucleotide (5) 5′-TCCAGGCAAC-3 ′ 3′-AGGTCCGTTG -5 'The "-" mark in the oligonucleotides (1) to (4) described above indicates that there is a bulge at that location, and the oligonucleotide (5) is an oligonucleotide without bulge.
【００３８】この結果を表１に示す。前記表１における
「ヌクレオチド」の項の番号は前記したオリゴヌクレオ
チドの番号であり、その右側のアルファベットは当該オ
リゴヌクレオチドにおけるバルジ塩基の種類を示してお
り、オリゴヌクレオチド（５）はバルジ塩基が存在しな
いことを示している。「Ｔｍ(-)/℃」はバルジ認識分子
の非存在下のＴｍ（℃）を示し、「分子の種類」は存在
させた本発明のバルジ認識分子であり、「Ｎａｐｈ」は
ナフチリジンウレアを示し、「Ｑｕｉ」はキノリンウレ
アをそれぞれ示す。「Ｔｍ(+)/℃」は前述した本発明の
バルジ認識分子の存在下におけるＴｍ（℃）を示す。
「ΔＴｍ／℃」はバルジ認識分子の存在下のＴｍ（℃）
とバルジ認識分子の非存在下のＴｍ（℃）の差を示す。The results are shown in Table 1. The number in the "nucleotide" section in Table 1 above is the number of the above-mentioned oligonucleotide, the alphabet on the right side thereof indicates the type of bulge base in the oligonucleotide, and the oligonucleotide (5) has no bulge base. It is shown that. “Tm (−) / ° C.” indicates Tm (° C.) in the absence of a bulge recognition molecule, “type of molecule” is the bulge recognition molecule of the present invention that was present, and “Naph” indicates naphthyridine urea. , "Qui" represent quinoline urea, respectively. “Tm (+) / ° C.” indicates Tm (° C.) in the presence of the above-described bulge recognition molecule of the present invention.
“ΔTm / ° C” is Tm (° C) in the presence of bulge recognition molecule
And the difference in Tm (° C) in the absence of the bulge recognition molecule.
【００３９】[0039]
【発明の効果】本発明の一般式（Ｉ）で示されるバルジ
認識分子は、いずれのバルジ塩基とも結合することがで
き、しかもバルジ塩基の種類により安定性に相違が生じ
るために、本発明のバルジ認識分子を用いることにより
バルジ塩基の存在の有無や種類を簡便に判定することが
できる。また、バルジ塩基の存在の有無や種類を判定す
るための測定方法として、融解温度（Ｔｍ）の測定とい
う簡便な手段により、迅速に、且つ確実に判定すること
ができる。したがって、本発明のバルジ認識分子を使用
することにより、遺伝子の断片における塩基の欠損の有
無や種類の判定を迅速にかつ大量に処理することが可能
となる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The bulge recognition molecule represented by the general formula (I) of the present invention can bind to any bulge base, and the stability of the bulge base varies depending on the type of bulge base. By using a bulge recognition molecule, it is possible to easily determine the presence and type of the bulge base. In addition, as a measuring method for determining the presence or absence and the type of the bulge base, it is possible to perform the determination quickly and reliably by a simple means of measuring the melting temperature (Tm). Therefore, by using the bulge recognition molecule of the present invention, it becomes possible to rapidly and in large quantities determine the presence or absence of a base deficiency in a gene fragment and determine the type.
【図１】図１は、塩基対の内側に向いているバルジ塩基
（図ではグアニン）を模式的に示したものである。FIG. 1 schematically shows a bulge base (guanine in the figure) facing inward of a base pair.
【図２】図２は、塩基対の外側に向いているバルジ塩基
（図ではグアニン）を模式的に示したものである。FIG. 2 is a schematic view showing a bulge base (guanine in the figure) that faces outside the base pair.
【図３】図３は、塩基対の外側に向いているバルジ塩基
（図ではグアニン）に、塩基対の外側からインターカー
レーションする様子を模式的に示したものである。FIG. 3 is a schematic diagram showing the intercalation of a bulge base (guanine in the figure) facing the outside of a base pair from the outside of the base pair.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ62 QR55 QR90 QS28 QS34 QX10 4C031 JA09 4C065 AA04 BB09 CC01 DD02 HH02 JJ07 KK02 LL07 PP01 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page F-term (reference) 4B024 AA11 CA01 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ62 QR55 QR90 QS28 QS34 QX10 4C031 JA09 4C065 AA04 BB09 CC01 DD02 HH02 JJ07 KK02 LL07 PP01
Claims (12)
て当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸
素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭
素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基
中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原
子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜
１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該ア
ルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素
原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジア
ルキルアミノ基を示し、 Ｒ２は、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキ
ル基を示す。）で表される化合物であって、バルジ塩基
と水素結合を形成することができるバルジ塩基認識分
子。1. A compound represented by the general formula (I): (In formula, A shows = C- or = N-, R < 1 > is a hydrogen atom, a C1-C15 alkyl group, and one or more carbon atoms in the said alkyl group are oxygen. An alkyl group which may be substituted with an atom or a nitrogen atom, an alkoxy group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkoxy group may be substituted with an oxygen atom or a nitrogen atom. Group or 1 to 1 carbon atoms
15 mono- or dialkylamino groups each representing a mono- or dialkylamino group in which one or more carbon atoms in the alkylamino group may be substituted with an oxygen atom or a nitrogen atom, and R 2 represents a substituent. Represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have. ) A compound represented by the formula (1), which is capable of forming a hydrogen bond with a bulge base.
ノ−ｎ−ブチル基である請求項１に記載のバルジ塩基認
識分子。2. The bulge base recognition molecule according to claim 1, wherein R 2 in the general formula (I) is a 4-amino-n-butyl group.
分子が、次式（II）、 【化２】 で表されるＮ−１，８−ナフチリジン−尿素誘導体であ
る請求項１又は２に記載のバルジ塩基認識分子。3. A bulge base recognition molecule represented by the general formula (I) is represented by the following formula (II): The bulge base recognition molecule according to claim 1 or 2, which is an N-1,8-naphthyridine-urea derivative represented by:
分子が、次式（III）、 【化３】 で表されるＮ−キノリン−尿素誘導体である請求項１又
は２に記載のバルジ塩基認識分子。4. A bulge base recognition molecule represented by the general formula (I) has the following formula (III): The bulge base recognition molecule according to claim 1, which is an N-quinoline-urea derivative represented by:
塩基認識分子を含有してなるバルジ塩基認識用組成物。5. A composition for bulge base recognition, comprising the bulge base recognition molecule according to any one of claims 1 to 4.
塩基認識分子を用いて、ＤＮＡ中のバルジ塩基を測定す
る方法。6. A method for measuring a bulge base in DNA using the bulge base recognition molecule according to claim 1.
ＮＡの融解温度の測定である請求項６に記載の方法。7. The measurement of bulge base in DNA is carried out by the method of D
The method according to claim 6, which is a measurement of a melting temperature of NA.
のＤＮＡをハイブリダイズさせて、請求項１〜４のいず
れかに記載のバルジ塩基認識分子の存在下又は非存在下
に前記したハイブリダイズしたＤＮＡの融解温度を測定
することからなる請求項７に記載の方法。8. A DNA having a normal base sequence is hybridized with a test DNA, and the hybridization is carried out in the presence or absence of the bulge base recognition molecule according to any one of claims 1 to 4. The method according to claim 7, which comprises measuring the melting temperature of the prepared DNA.
塩基認識分子が、バルジ塩基と水素結合を形成し、当該
バルジ塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされるこ
とによりバルジ塩基が安定化されたＤＮＡ。9. The bulge base recognition molecule according to any one of claims 1 to 4 forms a hydrogen bond with the bulge base and is stacked on a base pair existing in the vicinity of the bulge base, whereby a bulge base is formed. Stabilized DNA.
が、バルジ塩基に隣接する塩基対である請求項９に記載
のＤＮＡ。10. The DNA according to claim 9, wherein the base pair existing near the bulge base is a base pair adjacent to the bulge base.
tson-Click）型の塩基対を形成し得る水素結合である請
求項９又は１０に記載のＤＮＡ。11. The hydrogen bond is Watson-Crick (Wa
The DNA according to claim 9 or 10, which is a hydrogen bond capable of forming a tson-Click type base pair.
のいずれかに記載のバルジ塩基認識分子である請求項９
〜１１のいずれかに記載のＤＮＡ。12. A bulge base recognizing molecule as claimed in any one of claims 1 to 4.
The bulge base recognition molecule according to any one of claims 1 to 9.
The DNA according to any one of 1 to 11.
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| JP (1) | JP2003259873A (en) |
Cited By (2)
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| WO2008026582A1 (en) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Osaka University | Dna fragment used in the form attached to 5'-terminus of primer for use in amplification reaction of nucleic acid, and use thereof |
| JP2011182763A (en) * | 2010-03-11 | 2011-09-22 | Osaka Univ | Method for detecting single nucleotide polymorphism and reagent kit |
-
2002
- 2002-03-07 JP JP2002061945A patent/JP2003259873A/en active Pending
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