JP2003245070A - 脂肪酸不飽和化酵素を有する形質転換動物およびその作製方法 - Google Patents
脂肪酸不飽和化酵素を有する形質転換動物およびその作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 健康上有用な食肉を生産するために、不飽和
脂肪酸が増加した形質転換動物を得る。 【解決手段】 本発明において、脂肪酸不飽和化酵素の
遺伝子を動物に導入して形質転換を行うことにより健康
に有用な不飽和脂肪酸の含量を増加させたことを特徴を
する、形質転換動物が与えられた。更に、動物において
不飽和脂肪酸の含量を増加させる方法もまた与えられ
た。
脂肪酸が増加した形質転換動物を得る。 【解決手段】 本発明において、脂肪酸不飽和化酵素の
遺伝子を動物に導入して形質転換を行うことにより健康
に有用な不飽和脂肪酸の含量を増加させたことを特徴を
する、形質転換動物が与えられた。更に、動物において
不飽和脂肪酸の含量を増加させる方法もまた与えられ
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、脂肪酸不飽和化酵
素の遺伝子を導入した形質転換動物及び形質転換動物細
胞、更には動物において不飽和脂肪酸含量を高める方法
に関する。
素の遺伝子を導入した形質転換動物及び形質転換動物細
胞、更には動物において不飽和脂肪酸含量を高める方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】脂肪はエネルギー源として非常に重要で
あるとともに、動物にとって正常な発育と機能維持に欠
くことのできない必須脂肪酸（リノール酸(18:2n-6) 、
α- リノレイン酸(18:3n-3) およびアラキドン酸(18:4n
-3) ）源でもある。Crawfordら（Am J Clin Nutr, 31,
2181-2185, 1978 ）は、上記の必須脂肪酸に加えてn-3
系多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA,
20:5n-3)やドコサヘキサエン酸(DHA, 22:6n-3)が学習能
力や視覚発達に必要であることから、n-3 系多価不飽和
脂肪酸も必須脂肪酸に含めている。また、疫学的調査に
よるとこれら多価不飽和脂肪酸を多く摂取すると冠動脈
疾患や血栓性疾患が少なくなることが知られている(Dye
rberg and Bang, Lancet, 433-435 (1979), Harris, J
Lipid Res, 30, 785-807, (1989), Kinsella et al.,
Am J Clin Nutr, 52, 1-28 (1990))。
あるとともに、動物にとって正常な発育と機能維持に欠
くことのできない必須脂肪酸（リノール酸(18:2n-6) 、
α- リノレイン酸(18:3n-3) およびアラキドン酸(18:4n
-3) ）源でもある。Crawfordら（Am J Clin Nutr, 31,
2181-2185, 1978 ）は、上記の必須脂肪酸に加えてn-3
系多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA,
20:5n-3)やドコサヘキサエン酸(DHA, 22:6n-3)が学習能
力や視覚発達に必要であることから、n-3 系多価不飽和
脂肪酸も必須脂肪酸に含めている。また、疫学的調査に
よるとこれら多価不飽和脂肪酸を多く摂取すると冠動脈
疾患や血栓性疾患が少なくなることが知られている(Dye
rberg and Bang, Lancet, 433-435 (1979), Harris, J
Lipid Res, 30, 785-807, (1989), Kinsella et al.,
Am J Clin Nutr, 52, 1-28 (1990))。
【０００３】我々ヒトを含むほとんど全ての動物は、こ
れら多価不飽和脂肪酸を合成する酵素を欠いている(Inn
is, Prog Lipid Res, 30, 39-103 (1991)) 。すなわ
ち、動物体内ではオレイン酸(18:1)をリノール酸(18:2n
-6) に、リノール酸をα- リノレン酸(18:3n-3) に変換
できない。一方、植物にはΔ12脂肪酸不飽和化酵素やΔ
15脂肪酸不飽和化酵素(FAD) が存在しこれら多価不飽和
脂肪酸を合成できるため、植物油脂中にはリノール酸や
α- リノレン酸さらにはEPA やDHA などの多価不飽和脂
肪酸が多く含まれている。なお、本願明細書中において
Δ12脂肪酸不飽和化酵素とは、脂肪酸の炭素鎖において
末端のカルボキシル基から数えて12位の位置に二重結合
をつくる反応を触媒する酵素を意味するものとする。ま
た同様にΔ15脂肪酸不飽和化酵素とは、脂肪酸の炭素鎖
において末端のカルボキシル基から数えて15位の位置に
二重結合をつくる反応を触媒する酵素を意味するものと
する。
れら多価不飽和脂肪酸を合成する酵素を欠いている(Inn
is, Prog Lipid Res, 30, 39-103 (1991)) 。すなわ
ち、動物体内ではオレイン酸(18:1)をリノール酸(18:2n
-6) に、リノール酸をα- リノレン酸(18:3n-3) に変換
できない。一方、植物にはΔ12脂肪酸不飽和化酵素やΔ
15脂肪酸不飽和化酵素(FAD) が存在しこれら多価不飽和
脂肪酸を合成できるため、植物油脂中にはリノール酸や
α- リノレン酸さらにはEPA やDHA などの多価不飽和脂
肪酸が多く含まれている。なお、本願明細書中において
Δ12脂肪酸不飽和化酵素とは、脂肪酸の炭素鎖において
末端のカルボキシル基から数えて12位の位置に二重結合
をつくる反応を触媒する酵素を意味するものとする。ま
た同様にΔ15脂肪酸不飽和化酵素とは、脂肪酸の炭素鎖
において末端のカルボキシル基から数えて15位の位置に
二重結合をつくる反応を触媒する酵素を意味するものと
する。
【０００４】近年の食事の北米化傾向により動物性脂肪
の過剰摂取が冠動脈疾患や血栓性疾患の罹患率を上昇さ
せている。アメリカの高コレステロール血症の食餌療法
指針(The Expert Panel, Arch Intern Med, 148, 36 (1
988)) によると、総脂肪、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪
酸および多価不飽和脂肪酸は、それぞれ、総摂取カロリ
ーの30% 以下、7%以下、10-15%および10% 以上とするこ
とが勧告されており、動物性脂肪の摂取量を下げ植物性
脂肪摂取量を増加させることが推奨されている。
の過剰摂取が冠動脈疾患や血栓性疾患の罹患率を上昇さ
せている。アメリカの高コレステロール血症の食餌療法
指針(The Expert Panel, Arch Intern Med, 148, 36 (1
988)) によると、総脂肪、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪
酸および多価不飽和脂肪酸は、それぞれ、総摂取カロリ
ーの30% 以下、7%以下、10-15%および10% 以上とするこ
とが勧告されており、動物性脂肪の摂取量を下げ植物性
脂肪摂取量を増加させることが推奨されている。
【０００５】
【非特許文献１】クロウフォード(Crawford), アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリッショ
ン(Am J Clin Nutr), 1978年, 31巻, p2181-2185
ン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリッショ
ン(Am J Clin Nutr), 1978年, 31巻, p2181-2185
【非特許文献２】ダイエルベルグ及びバング(Dyerberg
and Bang),ランセット (Lancet), 1979年, p433-435
and Bang),ランセット (Lancet), 1979年, p433-435
【非特許文献３】ハリス(Harris), ジャーナル・オブ・
リピッドリサーチ(J Lipid Res), 1989年, 30巻, p785-
807
リピッドリサーチ(J Lipid Res), 1989年, 30巻, p785-
807
【非特許文献４】キンセラら (Kinsella et al.), アメ
リカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリッ
ション (Am J Clin Nutr), 1990 年, 52巻, p1-28
リカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリッ
ション (Am J Clin Nutr), 1990 年, 52巻, p1-28
【非特許文献５】イニス(Innis),プログレッション・オ
ブ・リピッドリサーチ(Prog Lipid Res), 1991年, 30
巻, p39-103
ブ・リピッドリサーチ(Prog Lipid Res), 1991年, 30
巻, p39-103
【非特許文献６】ジ・エキスパートパネル・アチーブメ
ント・オブ・インターナルメディスン(The Expert Pane
l, Arch Intern Med), 1988 年, 148 巻, p36
ント・オブ・インターナルメディスン(The Expert Pane
l, Arch Intern Med), 1988 年, 148 巻, p36
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】現状の技術では、肉類
の摂取を控え、魚肉や植物性油の摂取を増やす以外に、
多価不飽和脂肪酸摂取割合を増加させることは不可能で
ある。動物体内では摂取したリノール酸はアラキドン酸
(20:4n-3/n-6) に、α- リノレン酸はEPA さらにはDHA
へと変換できる。したがって、動物とくに食肉家畜にΔ
12脂肪酸不飽和化酵素及び／又はΔ15脂肪酸不飽和化酵
素をコードする遺伝子を導入することにより、植物でし
か生合成できない必須脂肪酸とくにリノール酸及び／又
はα- リノレン酸を遺伝子導入技術で生合成できるよう
にすれば、多価不飽和脂肪酸含量の多い食肉生産が可能
となり、肉類の摂取量を考慮することなく健康上より有
利な食肉の生産に著しく貢献できると考えた。
の摂取を控え、魚肉や植物性油の摂取を増やす以外に、
多価不飽和脂肪酸摂取割合を増加させることは不可能で
ある。動物体内では摂取したリノール酸はアラキドン酸
(20:4n-3/n-6) に、α- リノレン酸はEPA さらにはDHA
へと変換できる。したがって、動物とくに食肉家畜にΔ
12脂肪酸不飽和化酵素及び／又はΔ15脂肪酸不飽和化酵
素をコードする遺伝子を導入することにより、植物でし
か生合成できない必須脂肪酸とくにリノール酸及び／又
はα- リノレン酸を遺伝子導入技術で生合成できるよう
にすれば、多価不飽和脂肪酸含量の多い食肉生産が可能
となり、肉類の摂取量を考慮することなく健康上より有
利な食肉の生産に著しく貢献できると考えた。
【０００７】なお、化学式１にパルミチン酸（炭素数16
で不飽和結合なし、16:0）の構造を、化学式２にステア
リン酸（炭素数18で不飽和結合なし、18:0）の構造を示
す。炭素数18でカルボキシル基から数えて9 位と10位の
炭素原子の間に2 重結合を有する脂肪酸がオレイン酸で
あり、化学式３にオレイン酸（炭素数18で不飽和結合一
つ、18:1）の構造を示す。Δ12脂肪酸不飽和酵素の作用
により、さらに12位の位置に2 重結合を有する脂肪酸が
リノール酸であり、化学式４にリノール酸（炭素数18で
不飽和結合二つ、18:2）の構造を示す。Δ15脂肪酸不飽
和酵素の作用により、さらに15位の位置に2 重結合を有
する脂肪酸がαリノレン酸であり、化学式５にαリノレ
ン酸（炭素数18で不飽和結合三つ、18:3）の構造を示
す。
で不飽和結合なし、16:0）の構造を、化学式２にステア
リン酸（炭素数18で不飽和結合なし、18:0）の構造を示
す。炭素数18でカルボキシル基から数えて9 位と10位の
炭素原子の間に2 重結合を有する脂肪酸がオレイン酸で
あり、化学式３にオレイン酸（炭素数18で不飽和結合一
つ、18:1）の構造を示す。Δ12脂肪酸不飽和酵素の作用
により、さらに12位の位置に2 重結合を有する脂肪酸が
リノール酸であり、化学式４にリノール酸（炭素数18で
不飽和結合二つ、18:2）の構造を示す。Δ15脂肪酸不飽
和酵素の作用により、さらに15位の位置に2 重結合を有
する脂肪酸がαリノレン酸であり、化学式５にαリノレ
ン酸（炭素数18で不飽和結合三つ、18:3）の構造を示
す。
【０００８】
【化１】COOH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C
H2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
H2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
【０００９】
【化２】COOH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C
H2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
H2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
【００１０】
【化３】COOH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2
-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
【００１１】
【化４】COOH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2
-CH=CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
-CH=CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
【００１２】
【化５】COOH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2
-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH3
-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH3
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の観点は、
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子により動物を形質転換し、そ
の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物において発現させる
ことにより、動物において不飽和脂肪酸含量が増加して
いることを特徴とする、形質転換動物である。
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子により動物を形質転換し、そ
の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物において発現させる
ことにより、動物において不飽和脂肪酸含量が増加して
いることを特徴とする、形質転換動物である。
【００１４】本発明の第二の観点は、脂肪酸不飽和化酵
素遺伝子により動物細胞を形質転換し、その脂肪酸不飽
和化酵素遺伝子を動物細胞において発現させることによ
り、動物細胞において不飽和脂肪酸含量が増加している
ことを特徴とする、形質転換動物細胞である。
素遺伝子により動物細胞を形質転換し、その脂肪酸不飽
和化酵素遺伝子を動物細胞において発現させることによ
り、動物細胞において不飽和脂肪酸含量が増加している
ことを特徴とする、形質転換動物細胞である。
【００１５】本発明の第三の観点は、脂肪酸不飽和化酵
素遺伝子により動物を形質転換し、その脂肪酸不飽和化
酵素遺伝子を動物において発現させる過程よりなる、動
物において不飽和脂肪酸含量を増加させる方法である。
素遺伝子により動物を形質転換し、その脂肪酸不飽和化
酵素遺伝子を動物において発現させる過程よりなる、動
物において不飽和脂肪酸含量を増加させる方法である。
【００１６】本発明の第四の観点は、脂肪酸不飽和化酵
素遺伝子及びその脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を促
進させるための転写調節領域を有する発現プラスミドで
あるベクターを構築し、そのベクターを動物の初期胚、
体細胞、胚性幹細胞（ES細胞）に導入することにより形
質転換を行い、形質転換されたその動物の初期胚、体細
胞、胚性幹細胞より動物個体を発生させ、その動物個体
において前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させる過
程よりなる、動物において不飽和脂肪酸含量を増加させ
る方法である。
素遺伝子及びその脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を促
進させるための転写調節領域を有する発現プラスミドで
あるベクターを構築し、そのベクターを動物の初期胚、
体細胞、胚性幹細胞（ES細胞）に導入することにより形
質転換を行い、形質転換されたその動物の初期胚、体細
胞、胚性幹細胞より動物個体を発生させ、その動物個体
において前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させる過
程よりなる、動物において不飽和脂肪酸含量を増加させ
る方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明者らは、植物より得た小胞
体膜結合型の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を単離し、マウ
スとブタの受精卵に注入してその染色体上に安定的に導
入し、個体にまで発生させた。これらの個体を詳細に検
討したところ、動物の正常な発育や機能などに何ら影響
することなく、導入した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発
現し機能することにより脂肪酸組成を変更させ多価不飽
和脂肪酸含量が増すことを見出した。
体膜結合型の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を単離し、マウ
スとブタの受精卵に注入してその染色体上に安定的に導
入し、個体にまで発生させた。これらの個体を詳細に検
討したところ、動物の正常な発育や機能などに何ら影響
することなく、導入した脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発
現し機能することにより脂肪酸組成を変更させ多価不飽
和脂肪酸含量が増すことを見出した。
【００１８】すなわち、本発明は、脂肪酸不飽和化酵素
遺伝子が導入され発現し機能する動物個体および動物細
胞、ならびにその作出方法を提供するものである。な
お、本願発明の実施にあたり使用される好ましい脂肪酸
不飽和化酵素遺伝子として、植物には存在するが動物に
おいてには内在的に存在しない脂肪酸不飽和化酵素遺伝
子が挙げられる。そのより具体的な例としては、Δ12脂
肪酸不飽和化酵素遺伝子とΔ15脂肪酸不飽和化酵素遺伝
子が挙げられる。しかし、本発明の範囲はそれらに限定
されるものではなく、脂肪酸不飽和化酵素の発現量を増
加させるために有用であって動物において機能する限
り、他の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子や不飽和脂肪酸量を
高める遺伝子群を使用することもまた可能である。
遺伝子が導入され発現し機能する動物個体および動物細
胞、ならびにその作出方法を提供するものである。な
お、本願発明の実施にあたり使用される好ましい脂肪酸
不飽和化酵素遺伝子として、植物には存在するが動物に
おいてには内在的に存在しない脂肪酸不飽和化酵素遺伝
子が挙げられる。そのより具体的な例としては、Δ12脂
肪酸不飽和化酵素遺伝子とΔ15脂肪酸不飽和化酵素遺伝
子が挙げられる。しかし、本発明の範囲はそれらに限定
されるものではなく、脂肪酸不飽和化酵素の発現量を増
加させるために有用であって動物において機能する限
り、他の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子や不飽和脂肪酸量を
高める遺伝子群を使用することもまた可能である。
【００１９】上記で述べた様に、動物はΔ12脂肪酸不飽
和化酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素を欠いているため
に、リノール酸やα- リノレン酸を生合成することがで
きず、食物より摂取する必要がある。そこで植物由来の
Δ12脂肪酸不飽和化酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素を動
物に発現させることにより、健康上有用な不飽和脂肪酸
の含量を動物において増加させることが可能となる。本
発明において目的とする効果を達成するために、Δ12脂
肪酸不飽和化酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素のどちらか
一方のみを発現させることも可能であり、また両者を共
に発現させることもまた可能である。また脂肪酸不飽和
化酵素遺伝子を導入することにより、リノール酸やα-
リノレン酸のみならず、EPA やDHA の含量を増加させる
こともまた可能である。Δ12脂肪酸不飽和化酵素とΔ15
脂肪酸不飽和化酵素が機能するならば、理論的には現在
知られている有利な脂肪酸は全て生合成することができ
る。
和化酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素を欠いているため
に、リノール酸やα- リノレン酸を生合成することがで
きず、食物より摂取する必要がある。そこで植物由来の
Δ12脂肪酸不飽和化酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素を動
物に発現させることにより、健康上有用な不飽和脂肪酸
の含量を動物において増加させることが可能となる。本
発明において目的とする効果を達成するために、Δ12脂
肪酸不飽和化酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素のどちらか
一方のみを発現させることも可能であり、また両者を共
に発現させることもまた可能である。また脂肪酸不飽和
化酵素遺伝子を導入することにより、リノール酸やα-
リノレン酸のみならず、EPA やDHA の含量を増加させる
こともまた可能である。Δ12脂肪酸不飽和化酵素とΔ15
脂肪酸不飽和化酵素が機能するならば、理論的には現在
知られている有利な脂肪酸は全て生合成することができ
る。
【００２０】なお、下記の実施例で使用したホウレンソ
ウの根部由来のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を使用す
ることは特に好ましい。Δ12脂肪酸不飽和化酵素には小
胞体の膜に存在する小胞体膜結合型と葉緑体のストロマ
に存在する葉緑体型が知られているが、葉緑体型酵素の
不飽和化反応においては植物固有のフェレドキシンの電
子伝達系が用いられる。一方ホウレンソウの根部に由来
する当該酵素は小胞体膜結合型の酵素であり、動物にも
存在するシトクロムｂの電子伝達系を用いて不飽和化反
応を行う。本発明は脂肪酸不飽和化酵素を動物において
発現させるものであるために、動物が容易に利用できる
小胞体膜結合型の酵素をコードする遺伝子を使用するこ
とが好ましい。
ウの根部由来のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を使用す
ることは特に好ましい。Δ12脂肪酸不飽和化酵素には小
胞体の膜に存在する小胞体膜結合型と葉緑体のストロマ
に存在する葉緑体型が知られているが、葉緑体型酵素の
不飽和化反応においては植物固有のフェレドキシンの電
子伝達系が用いられる。一方ホウレンソウの根部に由来
する当該酵素は小胞体膜結合型の酵素であり、動物にも
存在するシトクロムｂの電子伝達系を用いて不飽和化反
応を行う。本発明は脂肪酸不飽和化酵素を動物において
発現させるものであるために、動物が容易に利用できる
小胞体膜結合型の酵素をコードする遺伝子を使用するこ
とが好ましい。
【００２１】また、本発明において使用できる脂肪酸不
飽和化酵素遺伝子は必ずしも植物に由来する遺伝子に限
られるものではない。従来、動物はΔ12脂肪酸不飽和化
酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素を有さないと考えられて
いた。しかし近年、線虫（C.elegans ）から動物種とし
ては初めて、Δ12脂肪酸不飽和化酵素とΔ15脂肪酸不飽
和化酵素が単離された。その様な動物由来の酵素もま
た、健康上有用な不飽和脂肪酸の含量を増加させるとい
う本発明の目的に有用である限り使用ができ、かかる態
様もまた本発明の範囲内であると解されるべきである。
飽和化酵素遺伝子は必ずしも植物に由来する遺伝子に限
られるものではない。従来、動物はΔ12脂肪酸不飽和化
酵素とΔ15脂肪酸不飽和化酵素を有さないと考えられて
いた。しかし近年、線虫（C.elegans ）から動物種とし
ては初めて、Δ12脂肪酸不飽和化酵素とΔ15脂肪酸不飽
和化酵素が単離された。その様な動物由来の酵素もま
た、健康上有用な不飽和脂肪酸の含量を増加させるとい
う本発明の目的に有用である限り使用ができ、かかる態
様もまた本発明の範囲内であると解されるべきである。
【００２２】本発明において用いられる動物には、食用
として用いられる任意の動物が含まれるものとする。哺
乳類である食用動物は一般的に不飽和脂肪酸含量が低
く、また形質転換が比較的容易であるために、本発明の
目的に使用する動物として特に好ましい。中でもブタ、
ウシ、ヤギ、ヒツジ等は特に好ましい形質転換の対象動
物である。その他に、ニワトリ、ウズラ等の鳥類や、マ
グロ等の魚類も形質転換の対象動物として挙げられる。
しかし、本発明の形質転換動物の範囲はこれらに限られ
るものではなく、食用として用いられる動物を広範囲に
含有するものである。また、それら形質転換した動物の
個体のみならず、脂肪酸不飽和化酵素を導入した動物細
胞もまた、本発明の範囲内である。
として用いられる任意の動物が含まれるものとする。哺
乳類である食用動物は一般的に不飽和脂肪酸含量が低
く、また形質転換が比較的容易であるために、本発明の
目的に使用する動物として特に好ましい。中でもブタ、
ウシ、ヤギ、ヒツジ等は特に好ましい形質転換の対象動
物である。その他に、ニワトリ、ウズラ等の鳥類や、マ
グロ等の魚類も形質転換の対象動物として挙げられる。
しかし、本発明の形質転換動物の範囲はこれらに限られ
るものではなく、食用として用いられる動物を広範囲に
含有するものである。また、それら形質転換した動物の
個体のみならず、脂肪酸不飽和化酵素を導入した動物細
胞もまた、本発明の範囲内である。
【００２３】本発明の方法において、脂肪酸不飽和化酵
素の遺伝子の上流に、その遺伝子の発現を促進させるた
めの転写調節領域を連結させて、発現プラスミドである
ベクターを構築する。ここで脂肪酸不飽和化酵素の遺伝
子は、その酵素をコードするcDNAでもよいしgenomic DN
A でもよい。脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の
上流域にプロモーターなどの転写調節領域を連結させる
ことにより、生体の種々の部位において構成的にまた任
意あるいは特定の時期に酵素の遺伝子が発現するように
調節をすることができる。
素の遺伝子の上流に、その遺伝子の発現を促進させるた
めの転写調節領域を連結させて、発現プラスミドである
ベクターを構築する。ここで脂肪酸不飽和化酵素の遺伝
子は、その酵素をコードするcDNAでもよいしgenomic DN
A でもよい。脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の
上流域にプロモーターなどの転写調節領域を連結させる
ことにより、生体の種々の部位において構成的にまた任
意あるいは特定の時期に酵素の遺伝子が発現するように
調節をすることができる。
【００２４】ここで使用するのに好ましいプロモーター
には、下記の実施例で使用されているニワトリβ- アク
チンのプロモーター領域やadipocyteP2 (aP2) プロモー
ター、更にはUCP プロモーター、SV40プロモーター、サ
イトメガウイルスプロモーター等が挙げられるが、それ
らに限定されるものではなく、本技術分野で一般的に用
いられている種々のプロモーターを用いることができ
る。これらのプロモーターは目的とする発現部位や発現
時期に応じて、当業者により適宜に選択されることが可
能である。全身性の発現を目的とするならばβ- アクチ
ンプロモーターを選択することが好ましく、また脂肪組
織における特異的な発現を目的とするならば白色脂肪組
織と褐色脂肪組織で特異的に発現制御を行うaP2 プロモ
ーターが好ましいであろう。
には、下記の実施例で使用されているニワトリβ- アク
チンのプロモーター領域やadipocyteP2 (aP2) プロモー
ター、更にはUCP プロモーター、SV40プロモーター、サ
イトメガウイルスプロモーター等が挙げられるが、それ
らに限定されるものではなく、本技術分野で一般的に用
いられている種々のプロモーターを用いることができ
る。これらのプロモーターは目的とする発現部位や発現
時期に応じて、当業者により適宜に選択されることが可
能である。全身性の発現を目的とするならばβ- アクチ
ンプロモーターを選択することが好ましく、また脂肪組
織における特異的な発現を目的とするならば白色脂肪組
織と褐色脂肪組織で特異的に発現制御を行うaP2 プロモ
ーターが好ましいであろう。
【００２５】発現プラスミドもまた特に限定されるもの
ではなく、本技術分野で一般的に用いられている種々の
プラスミドを使用することができる。下記の実施例で使
用されているpUC118やpBluescript II KS は特に好まし
いが、その他にもpSV2,pβA,pZip,pCO12やpME18S等を使
用することもまた可能である。
ではなく、本技術分野で一般的に用いられている種々の
プラスミドを使用することができる。下記の実施例で使
用されているpUC118やpBluescript II KS は特に好まし
いが、その他にもpSV2,pβA,pZip,pCO12やpME18S等を使
用することもまた可能である。
【００２６】その様にして作製したベクターを動物の初
期胚、体細胞、胚性幹細胞（ES細胞）に導入することに
より形質転換を行い、その動物の初期胚、体細胞、胚性
幹細胞より動物個体を発生させる。下記の実施例におい
ては構築したベクターを初期胚に導入しているが、体細
胞やES細胞などの動物細胞に導入後クローン技術やキメ
ラ形成法などを用いて個体発生させることも可能であ
る。あるいは、生体の任意あるいは特定の組織や器官に
遺伝子を種々の方法で導入し、その組織や器官で導入遺
伝子が機能させることにより、その酵素が不飽和脂肪酸
を生合成させる様にすることもまた可能である。導入す
るべき外来遺伝子を含んでいるベクターを初期胚に導入
する技術は良く知られており、本分野の当業者は種々の
改変を加えて実施することが可能である。
期胚、体細胞、胚性幹細胞（ES細胞）に導入することに
より形質転換を行い、その動物の初期胚、体細胞、胚性
幹細胞より動物個体を発生させる。下記の実施例におい
ては構築したベクターを初期胚に導入しているが、体細
胞やES細胞などの動物細胞に導入後クローン技術やキメ
ラ形成法などを用いて個体発生させることも可能であ
る。あるいは、生体の任意あるいは特定の組織や器官に
遺伝子を種々の方法で導入し、その組織や器官で導入遺
伝子が機能させることにより、その酵素が不飽和脂肪酸
を生合成させる様にすることもまた可能である。導入す
るべき外来遺伝子を含んでいるベクターを初期胚に導入
する技術は良く知られており、本分野の当業者は種々の
改変を加えて実施することが可能である。
【００２７】
【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 （実施例1 ） （マウスへのΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入とそ
の発現）植物由来の小胞体膜結合型の脂肪酸不飽和化酵
素遺伝子が、動物個体内で機能して個体の脂肪中に含ま
れる脂肪酸を不飽和脂肪酸に変化するかについて調べる
目的で行った。
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。 （実施例1 ） （マウスへのΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入とそ
の発現）植物由来の小胞体膜結合型の脂肪酸不飽和化酵
素遺伝子が、動物個体内で機能して個体の脂肪中に含ま
れる脂肪酸を不飽和脂肪酸に変化するかについて調べる
目的で行った。
【００２８】（導入遺伝子の調整）動物個体の全ての組
織に構成的にこの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させ
る目的で、ニワトリβ- アクチンのプロモーター領域を
有する1.5kbpの直鎖状断片を、pSG5でサブクローニング
した1.7kbpのホウレンソウ根部より単離したΔ12脂肪酸
不飽和化酵素（以下fad2と称する）のcDNA断片(HindIII
-EcoRI) の上流に、また下流にはSV40スプライシング領
域およびsv40 poly (A) 付加シグナル領域を連結し、pU
C118ベクター内に挿入した。構築したプラスミドの4.3k
bp断片（PstI-BamHI, β-act/fad2 ）を1 % アガロース
ゲルで電気泳動し、Geneclean II (BIO 101 Inc.) で精
製し、TEバッファー（pH7.4 ）で4 μg/mlに溶解した。
このように構築した遺伝子をマウスに導入した。
織に構成的にこの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させ
る目的で、ニワトリβ- アクチンのプロモーター領域を
有する1.5kbpの直鎖状断片を、pSG5でサブクローニング
した1.7kbpのホウレンソウ根部より単離したΔ12脂肪酸
不飽和化酵素（以下fad2と称する）のcDNA断片(HindIII
-EcoRI) の上流に、また下流にはSV40スプライシング領
域およびsv40 poly (A) 付加シグナル領域を連結し、pU
C118ベクター内に挿入した。構築したプラスミドの4.3k
bp断片（PstI-BamHI, β-act/fad2 ）を1 % アガロース
ゲルで電気泳動し、Geneclean II (BIO 101 Inc.) で精
製し、TEバッファー（pH7.4 ）で4 μg/mlに溶解した。
このように構築した遺伝子をマウスに導入した。
【００２９】（遺伝子導入マウスの作製）マウス(ICR)
は、紀和実験動物（株）より購入した。これら動物の取
り扱いは、「動物実験に関する指針」（（社）日本実験
動物学会編、（株）ソフトサイエンス社、1991）に従っ
て行われた。マウス受精卵前核へのDNA 顕微注入と生存
胚の偽妊娠マウス卵管への移植はHogan et al. (Manipu
lating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual, 157-1
73, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1986) に従って行った。1219個の受精卵にβ-act/fad2
を顕微注入し受卵雌に移植したところ、111 頭の産子
が得られた。注入した遺伝子の生存産子の染色体への組
み込みを調べるため、これら産子の尾部組織より抽出し
たゲノムDNAのサザンブロット解析（Matsumoto et al.,
Mol. Reprod. Dev., 36, 53-58 (1993））を行ったと
ころ、7 頭のマウス（♀4 頭、♂3 頭）の染色体に1-20
コピーの遺伝子導入が認められた。
は、紀和実験動物（株）より購入した。これら動物の取
り扱いは、「動物実験に関する指針」（（社）日本実験
動物学会編、（株）ソフトサイエンス社、1991）に従っ
て行われた。マウス受精卵前核へのDNA 顕微注入と生存
胚の偽妊娠マウス卵管への移植はHogan et al. (Manipu
lating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual, 157-1
73, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1986) に従って行った。1219個の受精卵にβ-act/fad2
を顕微注入し受卵雌に移植したところ、111 頭の産子
が得られた。注入した遺伝子の生存産子の染色体への組
み込みを調べるため、これら産子の尾部組織より抽出し
たゲノムDNAのサザンブロット解析（Matsumoto et al.,
Mol. Reprod. Dev., 36, 53-58 (1993））を行ったと
ころ、7 頭のマウス（♀4 頭、♂3 頭）の染色体に1-20
コピーの遺伝子導入が認められた。
【００３０】（遺伝子導入マウスにおけるmRNAレベルで
の発現解析）これら系統のマウス(B1-7)を生産し、導入
遺伝子のmRNAレベルでの発現をRT-PCR解析およびノーザ
ンブロット解析により行った（図1 ）。図1 において、
NTは野生型マウス、 B1 はB1系統の遺伝子導入マウス、
B2はB2系統の遺伝子導入マウス、B6はB6系統の遺伝子導
入マウスを示す。
の発現解析）これら系統のマウス(B1-7)を生産し、導入
遺伝子のmRNAレベルでの発現をRT-PCR解析およびノーザ
ンブロット解析により行った（図1 ）。図1 において、
NTは野生型マウス、 B1 はB1系統の遺伝子導入マウス、
B2はB2系統の遺伝子導入マウス、B6はB6系統の遺伝子導
入マウスを示す。
【００３１】図1Aは3 系統の遺伝子導入マウス(B1, B2
およびB6) におけるfad2mRNAのRT-PCR法による解析の結
果であり、 RT-PCR 解析では、マウスの各組織（脳、心
臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋、卵巣、精巣および
白色脂肪、褐色脂肪）を採取し、トリゾール(Gibco/BR
L) により総RNA を抽出した。図1Aにおいて、Brは脳、H
eは心臓、Luは肺、Liは肝臓、Spは脾臓、Kiは腎臓、SM
は骨格筋、Ovは卵巣、Teは精巣、BAは褐色脂肪組織、WA
は白色脂肪組織をそれぞれ示す。矢印はfad2特異的転写
産物(378bps)を示す。G3PDH は陽性対照区である。
およびB6) におけるfad2mRNAのRT-PCR法による解析の結
果であり、 RT-PCR 解析では、マウスの各組織（脳、心
臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋、卵巣、精巣および
白色脂肪、褐色脂肪）を採取し、トリゾール(Gibco/BR
L) により総RNA を抽出した。図1Aにおいて、Brは脳、H
eは心臓、Luは肺、Liは肝臓、Spは脾臓、Kiは腎臓、SM
は骨格筋、Ovは卵巣、Teは精巣、BAは褐色脂肪組織、WA
は白色脂肪組織をそれぞれ示す。矢印はfad2特異的転写
産物(378bps)を示す。G3PDH は陽性対照区である。
【００３２】マウスの各組織（脳、白色脂肪、褐色脂肪
および肝臓）を採取し、トリゾール(Gibco/BRL) により
総RNA を抽出した。これらRNA をAMV 逆転写酵素および
ランダムプライマー（タカラ）により逆転写してcDNAを
得た。これらcDNAをfad2特異的プライマー(5'-CTCTCCAA
TCTACTCGGAC-3'および5'-ATTGGCTTTATAGCCTTGGT-3')を
用いてPCR により増幅した。増幅産物は、2%アガロース
ゲル内で電気泳動した。対照としてグリセリアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH) 遺伝子の特異的
プライマー(Clontech)を用いた増幅も行った。B1, B2お
よびB6の３系統の遺伝子導入マウスにおいて、fad2mRNA
をRT-PCR法により解析を行った結果を図1Aに示す。その
結果、B1、B2およびB6系統のマウスで全組織において構
成的にmRNAレベルでの発現が認められた。
および肝臓）を採取し、トリゾール(Gibco/BRL) により
総RNA を抽出した。これらRNA をAMV 逆転写酵素および
ランダムプライマー（タカラ）により逆転写してcDNAを
得た。これらcDNAをfad2特異的プライマー(5'-CTCTCCAA
TCTACTCGGAC-3'および5'-ATTGGCTTTATAGCCTTGGT-3')を
用いてPCR により増幅した。増幅産物は、2%アガロース
ゲル内で電気泳動した。対照としてグリセリアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH) 遺伝子の特異的
プライマー(Clontech)を用いた増幅も行った。B1, B2お
よびB6の３系統の遺伝子導入マウスにおいて、fad2mRNA
をRT-PCR法により解析を行った結果を図1Aに示す。その
結果、B1、B2およびB6系統のマウスで全組織において構
成的にmRNAレベルでの発現が認められた。
【００３３】さらに、fad2の全長が転写されていること
を確認するため、ノーザンブロット解析を行った。3 系
統の遺伝子導入マウス(B1, B2 およびB6) におけるfad2
mRNAのノーザンブロット解析の結果を図1Bに示す。図1B
において、Brは脳を、WAは白色脂肪組織を、BAは褐色脂
肪組織を、Liは肝臓をそれぞれ示す。矢印はfad2特異的
転写産物(1.4kbp)を示す。β-actinは陽性対照区であ
る。RT-PCR解析で発現が認められたB1、B2およびB6系統
のマウスの脳、白色脂肪、褐色脂肪および肝臓の各組織
よりトリゾールで総RNA を抽出した。
を確認するため、ノーザンブロット解析を行った。3 系
統の遺伝子導入マウス(B1, B2 およびB6) におけるfad2
mRNAのノーザンブロット解析の結果を図1Bに示す。図1B
において、Brは脳を、WAは白色脂肪組織を、BAは褐色脂
肪組織を、Liは肝臓をそれぞれ示す。矢印はfad2特異的
転写産物(1.4kbp)を示す。β-actinは陽性対照区であ
る。RT-PCR解析で発現が認められたB1、B2およびB6系統
のマウスの脳、白色脂肪、褐色脂肪および肝臓の各組織
よりトリゾールで総RNA を抽出した。
【００３４】これら総RNA から、さらにオリゴテックス
-dT （タカラ）でポリ(A) RNA を精製し、これらを1%ア
ガロース- ホルムアルデヒドで電気泳動した後20xSSCに
てナイロンメンブレン(Amersham)にブロッティングし
た。ブロッティングしたメンブレンは、ランダムプライ
マー法により32P-dCTPでラベルしたホウレン草由来FAD2
cDNA(1.7kbp)のプローブおよび対照としてマウスs-アク
チンのプローブでハイブリダイズした。その結果、全て
のマウスの全組織から1.4kb の全長FAD2転写産物が検出
され、構成的な発現が認められた（図1B）。しかしなが
ら、fad2遺伝子の発現レベルは組織間で異なっており、
脳と褐色脂肪組織に多く発現していた（図1B）。このよ
うな組織間での発現量の違いはニワトリs-アクチンをプ
ロモーターとして用いた他の報告(Matsumoto et al., M
ol Reprod Dev, 39-136-140 (1994), Matsumoto et a
l., Mem Res Inst BOST, Kinki Univ, 2, 11-18 (199
9)) と同様だった。これは、導入された脂肪酸不飽和化
酵素遺伝子がマウスの各組織内とくに褐色脂肪組織で強
く転写されていることを示す。発現量はB1およびB2系統
がB6系統より多く、B2系統は繁殖能力が低かったため、
B1系統をその後の解析に用いた。
-dT （タカラ）でポリ(A) RNA を精製し、これらを1%ア
ガロース- ホルムアルデヒドで電気泳動した後20xSSCに
てナイロンメンブレン(Amersham)にブロッティングし
た。ブロッティングしたメンブレンは、ランダムプライ
マー法により32P-dCTPでラベルしたホウレン草由来FAD2
cDNA(1.7kbp)のプローブおよび対照としてマウスs-アク
チンのプローブでハイブリダイズした。その結果、全て
のマウスの全組織から1.4kb の全長FAD2転写産物が検出
され、構成的な発現が認められた（図1B）。しかしなが
ら、fad2遺伝子の発現レベルは組織間で異なっており、
脳と褐色脂肪組織に多く発現していた（図1B）。このよ
うな組織間での発現量の違いはニワトリs-アクチンをプ
ロモーターとして用いた他の報告(Matsumoto et al., M
ol Reprod Dev, 39-136-140 (1994), Matsumoto et a
l., Mem Res Inst BOST, Kinki Univ, 2, 11-18 (199
9)) と同様だった。これは、導入された脂肪酸不飽和化
酵素遺伝子がマウスの各組織内とくに褐色脂肪組織で強
く転写されていることを示す。発現量はB1およびB2系統
がB6系統より多く、B2系統は繁殖能力が低かったため、
B1系統をその後の解析に用いた。
【００３５】（遺伝子導入マウスにおけるタンパクレベ
ルでの発現解析）導入したfad2のタンパクレベルでの発
現を検討するため、mRNAレベルで最も強い発現が認めら
れたB1系統の褐色脂肪組織からタンパク質を抽出しウエ
スタンブロット解析を行った。採取した褐色脂肪組織を
プロテアーゼインヒビター(Complete, Boehlinger Manh
eim)を含むショ糖-TM バッファー内でポリトロンホモジ
ェナイザーを用いて破砕した。懸濁液を4 ℃、10000 g
で10分間遠心し、その上清をさらに4 ℃、45000 g で60
分間遠心して沈さとしてミクロソーム画分を得た。この
沈さは、ショ糖-TM バッファーで再懸濁し、タンパク質
濃度を測定した。
ルでの発現解析）導入したfad2のタンパクレベルでの発
現を検討するため、mRNAレベルで最も強い発現が認めら
れたB1系統の褐色脂肪組織からタンパク質を抽出しウエ
スタンブロット解析を行った。採取した褐色脂肪組織を
プロテアーゼインヒビター(Complete, Boehlinger Manh
eim)を含むショ糖-TM バッファー内でポリトロンホモジ
ェナイザーを用いて破砕した。懸濁液を4 ℃、10000 g
で10分間遠心し、その上清をさらに4 ℃、45000 g で60
分間遠心して沈さとしてミクロソーム画分を得た。この
沈さは、ショ糖-TM バッファーで再懸濁し、タンパク質
濃度を測定した。
【００３６】タンパク量50μg 相当を10% SDS ポロアク
リルアミドゲルで電気泳動した後PVDFメンブレン（Mili
pore）に転写した。メンブレンは、0.2%トゥイーン20を
含むブロックエース（大日本製薬）で1 時間インキュベ
ートした。メンブレンは、3回0.5%トゥイーン20を含むP
BS （pH7.2 ）で洗浄した後、ウサギ抗FAD2抗血清(1:25
00)と、室温で1 時間インキュベートした。この抗血清
はほうれん草由来オレイン酸不飽和化酵素C 末端付近の
18アミノ酸残基に対応する合成オリゴペプチドをウサギ
に投与して得たものである。メンブレンはその後PBSTで
洗浄しロバ由来抗ウサギ酵素標識二次抗体(1:5000, Ame
rsham)で室温にて30分間インキュベートし、TBTSで洗浄
後化学発光(ECL, Amersham) により検出した。
リルアミドゲルで電気泳動した後PVDFメンブレン（Mili
pore）に転写した。メンブレンは、0.2%トゥイーン20を
含むブロックエース（大日本製薬）で1 時間インキュベ
ートした。メンブレンは、3回0.5%トゥイーン20を含むP
BS （pH7.2 ）で洗浄した後、ウサギ抗FAD2抗血清(1:25
00)と、室温で1 時間インキュベートした。この抗血清
はほうれん草由来オレイン酸不飽和化酵素C 末端付近の
18アミノ酸残基に対応する合成オリゴペプチドをウサギ
に投与して得たものである。メンブレンはその後PBSTで
洗浄しロバ由来抗ウサギ酵素標識二次抗体(1:5000, Ame
rsham)で室温にて30分間インキュベートし、TBTSで洗浄
後化学発光(ECL, Amersham) により検出した。
【００３７】その結果を図2 に示す。図2 において、Co
ntは陽性対照区であり、ホウレンソウ根部から抽出した
タンパク質を示す。NTは陰性対照区であり、野生型マウ
スから抽出したタンパク質を示す。B1はB1系統の遺伝子
導入マウスであり、B2はB2系統の遺伝子導入マウスであ
る。矢印はFAD2(45kDa) を示す。図2 に示すようにB1系
統マウスの褐色脂肪細胞より得たミクロソーム画分にホ
ウレンソウFAD2の予想分子量である約45kDa のタンパク
質を検出した。このことから導入したfad2をヘテロ接合
体で有するマウスのFAD2は小胞体に局在すると思われ
た。
ntは陽性対照区であり、ホウレンソウ根部から抽出した
タンパク質を示す。NTは陰性対照区であり、野生型マウ
スから抽出したタンパク質を示す。B1はB1系統の遺伝子
導入マウスであり、B2はB2系統の遺伝子導入マウスであ
る。矢印はFAD2(45kDa) を示す。図2 に示すようにB1系
統マウスの褐色脂肪細胞より得たミクロソーム画分にホ
ウレンソウFAD2の予想分子量である約45kDa のタンパク
質を検出した。このことから導入したfad2をヘテロ接合
体で有するマウスのFAD2は小胞体に局在すると思われ
た。
【００３８】（食餌変化による遺伝子導入マウスにおけ
る脂肪酸組成の変化：リノール酸の新規生合成）食餌中
の脂肪酸は容易に体脂肪に取り込まれるため、食事中リ
ノール酸の増大は体脂肪中リノール酸量を増加させるこ
とが知られている（Hoy and Holmer, Lipids, 25, 455-
459 (1990)）。さらに、脂肪酸はリン脂質に多く取り込
まれることが知られている（Zevenbergen and Houtsmul
ler, Biochem Biophys Acta, 1002, 312-323 (1989)
）。さらに、通常飼料で飼育したマウスの褐色脂肪細
胞中のリノール酸含量は総脂肪酸の24.97%と非常に豊富
であるため、導入したfad2遺伝子により新規に生成され
たリノール酸が食餌由来のリノール酸により検出できな
くなることが予想される。そのため、脂肪源として5%オ
レイン酸のみを添加した無脂肪食を2 週間遺伝子導入マ
ウスに投与することで、ホウレン草由来FAD2によるマウ
ス生体内でのオレイン酸のリノール酸への変換を調べ
た。食餌投与後、褐色脂肪組織中の脂肪酸組成をガスク
ロマトグラフィーで調べた。
る脂肪酸組成の変化：リノール酸の新規生合成）食餌中
の脂肪酸は容易に体脂肪に取り込まれるため、食事中リ
ノール酸の増大は体脂肪中リノール酸量を増加させるこ
とが知られている（Hoy and Holmer, Lipids, 25, 455-
459 (1990)）。さらに、脂肪酸はリン脂質に多く取り込
まれることが知られている（Zevenbergen and Houtsmul
ler, Biochem Biophys Acta, 1002, 312-323 (1989)
）。さらに、通常飼料で飼育したマウスの褐色脂肪細
胞中のリノール酸含量は総脂肪酸の24.97%と非常に豊富
であるため、導入したfad2遺伝子により新規に生成され
たリノール酸が食餌由来のリノール酸により検出できな
くなることが予想される。そのため、脂肪源として5%オ
レイン酸のみを添加した無脂肪食を2 週間遺伝子導入マ
ウスに投与することで、ホウレン草由来FAD2によるマウ
ス生体内でのオレイン酸のリノール酸への変換を調べ
た。食餌投与後、褐色脂肪組織中の脂肪酸組成をガスク
ロマトグラフィーで調べた。
【００３９】マウスに投与した食餌は、通常飼料（MF,
オリエンタル酵母、表1 ）、無脂肪飼料（0.7%脂肪、オ
リエンタル酵母、表-2および3 ）および5%オレイン酸
（O1008, Sigma）を含むオレイン酸飼料（オリエンタル
酵母、表4 ）を投与した。なお、いずれの食餌も340kCa
l/100gと同カロリーとした。
オリエンタル酵母、表1 ）、無脂肪飼料（0.7%脂肪、オ
リエンタル酵母、表-2および3 ）および5%オレイン酸
（O1008, Sigma）を含むオレイン酸飼料（オリエンタル
酵母、表4 ）を投与した。なお、いずれの食餌も340kCa
l/100gと同カロリーとした。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
【００４３】
【表４】
【００４４】通常飼料で生育した野生型マウスおよび遺
伝子導入マウスを用いた。通常飼料、無脂肪飼料および
オレイン酸飼料で野生型マウスを、遺伝子導入マウスを
オレイン酸飼料で2 週間飼育した。飼育後、褐色脂肪組
織を採取し脂肪酸組成を調べた。褐色脂肪組織中の脂質
はクロロホルム- メタノールで抽出し(Bligh and Dyer,
Can J Biochem Physiol, 37, 911-917 (1959)) 、その
脂質中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで解析し
た（Wada and Murata, Plant Cell Physiol, 30, 971-9
78 (1989) ）。
伝子導入マウスを用いた。通常飼料、無脂肪飼料および
オレイン酸飼料で野生型マウスを、遺伝子導入マウスを
オレイン酸飼料で2 週間飼育した。飼育後、褐色脂肪組
織を採取し脂肪酸組成を調べた。褐色脂肪組織中の脂質
はクロロホルム- メタノールで抽出し(Bligh and Dyer,
Can J Biochem Physiol, 37, 911-917 (1959)) 、その
脂質中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで解析し
た（Wada and Murata, Plant Cell Physiol, 30, 971-9
78 (1989) ）。
【００４５】普通食で生育後2 週間無脂肪食あるいはオ
レイン酸食を投与した野生型マウスおよびB1系統遺伝子
導入マウスの褐色脂肪組織の総脂質における脂肪酸構成
比を図3 に示す。図3 において、縦棒は平均値、エラー
バーは標準誤差を示す。統計解析は、分散分析を行った
後フィッシャーのPLSDテストにより行った。
レイン酸食を投与した野生型マウスおよびB1系統遺伝子
導入マウスの褐色脂肪組織の総脂質における脂肪酸構成
比を図3 に示す。図3 において、縦棒は平均値、エラー
バーは標準誤差を示す。統計解析は、分散分析を行った
後フィッシャーのPLSDテストにより行った。
【００４６】褐色脂肪組織の脂肪酸組成を調べた結果、
図3 に示すようにオレイン酸食で飼育したB1系統マウス
の全脂肪酸におけるリノール酸(18:2n-6) 比率(Mol%)
は、無脂肪食およびオレイン酸食で飼育した野生型マウ
スの、それぞれ、1.6 および1.4 倍であった（P<0.0
5）。このリノール酸比率の増加にともなってオレイン
酸(18:1n-6) 比率が減少し、無脂肪食で飼育した野生型
マウスと同レベルであった。また、オレイン酸食で飼育
した遺伝子導入マウスの脂肪酸比率はリノール酸を除く
と、無脂肪食で飼育した野生型マウスと同レベルであっ
た。このことは、B1系統の遺伝子導入マウスにおいて
は、食餌性のオレイン酸がリノール酸に変換しているこ
とを示している。B1系統において基質となるオレイン酸
が減少し同時にリノール酸が上昇していることは、遺伝
子導入マウスにFAD2の酵素活性があることを示してい
る。
図3 に示すようにオレイン酸食で飼育したB1系統マウス
の全脂肪酸におけるリノール酸(18:2n-6) 比率(Mol%)
は、無脂肪食およびオレイン酸食で飼育した野生型マウ
スの、それぞれ、1.6 および1.4 倍であった（P<0.0
5）。このリノール酸比率の増加にともなってオレイン
酸(18:1n-6) 比率が減少し、無脂肪食で飼育した野生型
マウスと同レベルであった。また、オレイン酸食で飼育
した遺伝子導入マウスの脂肪酸比率はリノール酸を除く
と、無脂肪食で飼育した野生型マウスと同レベルであっ
た。このことは、B1系統の遺伝子導入マウスにおいて
は、食餌性のオレイン酸がリノール酸に変換しているこ
とを示している。B1系統において基質となるオレイン酸
が減少し同時にリノール酸が上昇していることは、遺伝
子導入マウスにFAD2の酵素活性があることを示してい
る。
【００４７】（実施例２）
（ブタへのΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入とその
発現）植物由来の小胞体膜結合型の脂肪酸不飽和化酵素
遺伝子が、家畜であるブタ個体内で機能して個体の脂肪
中に含まれる脂肪酸を目的の多価不飽和脂肪酸に変換す
るかについて調べる目的で行った。ここでは脂肪組織特
異的にΔ12脂肪酸不飽和化酵素が発現するようにadipoc
yteP2 (aP2) プロモーター(Ross et al., ProcNatl Aca
d Sci, USA, 87, 9590-9594, 1990, Ross et al., Gene
s & Dev, 7, 1318-1324, 1993) とホウレンソウ根部組
織より単離したΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(fad2)を
連結した融合遺伝子(aP2/fad2)を用いた。効率的に酵素
が脂肪酸組成の変換ができるように、基質となるオレイ
ン酸(18:1)を食餌中に添加して一定期間飼育した。これ
は、食餌中のオレイン酸含量を増加させると脂肪組織中
のオレイン酸含量が増加すること(Klingenberg et al.,
Comp Biochem Physiol, 110B, 183-192, 1995) が知ら
れているためである。オレイン酸飼料投与直前および8
週目に脂肪組織を採取して脂肪酸組成を調べた。
発現）植物由来の小胞体膜結合型の脂肪酸不飽和化酵素
遺伝子が、家畜であるブタ個体内で機能して個体の脂肪
中に含まれる脂肪酸を目的の多価不飽和脂肪酸に変換す
るかについて調べる目的で行った。ここでは脂肪組織特
異的にΔ12脂肪酸不飽和化酵素が発現するようにadipoc
yteP2 (aP2) プロモーター(Ross et al., ProcNatl Aca
d Sci, USA, 87, 9590-9594, 1990, Ross et al., Gene
s & Dev, 7, 1318-1324, 1993) とホウレンソウ根部組
織より単離したΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(fad2)を
連結した融合遺伝子(aP2/fad2)を用いた。効率的に酵素
が脂肪酸組成の変換ができるように、基質となるオレイ
ン酸(18:1)を食餌中に添加して一定期間飼育した。これ
は、食餌中のオレイン酸含量を増加させると脂肪組織中
のオレイン酸含量が増加すること(Klingenberg et al.,
Comp Biochem Physiol, 110B, 183-192, 1995) が知ら
れているためである。オレイン酸飼料投与直前および8
週目に脂肪組織を採取して脂肪酸組成を調べた。
【００４８】（導入遺伝子の調整）ブタ生体の脂肪細胞
特異的に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させる目的
で、導入遺伝子の構築を行った。ホウレンソウ根部より
単離したΔ12脂肪酸不飽和化酵素のcDNA断片（1.7kb ）
をベクターpBluescript II KS 上にクローニングした。
このcDNAの上流に、脂肪細胞特異的に遺伝子の発現を誘
導するマウスadipocyteP2 （aP2 ）プロモーター領域
（5kb ）を、下流にSV40スプライシング領域及びSV40 p
oly (A) 付加シグナル領域を連結した。構築したプラス
ミドを制限酵素SacII とXhoIを用いて切断した。切断DN
A を1 ％アガロースゲル電気泳動し、導入遺伝子（約7.
5kb ）のDNA 断片を単離した。単離された導入遺伝子
は、Geneclean II（BIO 101 Inc.）で精製後、TEバァフ
ァー（pH7.4 ）で4 μg/mlに溶解した。このように構築
した遺伝子をブタに導入した。
特異的に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させる目的
で、導入遺伝子の構築を行った。ホウレンソウ根部より
単離したΔ12脂肪酸不飽和化酵素のcDNA断片（1.7kb ）
をベクターpBluescript II KS 上にクローニングした。
このcDNAの上流に、脂肪細胞特異的に遺伝子の発現を誘
導するマウスadipocyteP2 （aP2 ）プロモーター領域
（5kb ）を、下流にSV40スプライシング領域及びSV40 p
oly (A) 付加シグナル領域を連結した。構築したプラス
ミドを制限酵素SacII とXhoIを用いて切断した。切断DN
A を1 ％アガロースゲル電気泳動し、導入遺伝子（約7.
5kb ）のDNA 断片を単離した。単離された導入遺伝子
は、Geneclean II（BIO 101 Inc.）で精製後、TEバァフ
ァー（pH7.4 ）で4 μg/mlに溶解した。このように構築
した遺伝子をブタに導入した。
【００４９】（遺伝子導入ブタの作製）融合遺伝子をブ
タ初期胚前核に顕微注入した。動物の取り扱いは、「動
物実験に関する指針」（（社）日本実験動物学会編、
（株）ソフトサイエンス社、1991）に従って行われた。
ブタ胚の採取・遺伝子注入・胚移植は、以下の通り行っ
た。約13月齢の食用豚（デュロック（♂） x F1 （♀；
ランドレース xラージホワイト）体重約100 kg）にeCG1
000 IUを筋肉内投与し、72時間後にhCG 500 IUを投与し
た。hCG 投与24時間後に発情を呈したブタを雄ブタと交
配した。hCG 投与26-30 時間後にストレスニル（アザペ
ロン製剤）投与による鎮静の後吸入麻酔を行い、正中線
切開により開腹し卵管を上向性に環流して胚を回収し
た。回収後、胚前核に融合遺伝子を4 μg/mlの濃度で顕
微注入した。
タ初期胚前核に顕微注入した。動物の取り扱いは、「動
物実験に関する指針」（（社）日本実験動物学会編、
（株）ソフトサイエンス社、1991）に従って行われた。
ブタ胚の採取・遺伝子注入・胚移植は、以下の通り行っ
た。約13月齢の食用豚（デュロック（♂） x F1 （♀；
ランドレース xラージホワイト）体重約100 kg）にeCG1
000 IUを筋肉内投与し、72時間後にhCG 500 IUを投与し
た。hCG 投与24時間後に発情を呈したブタを雄ブタと交
配した。hCG 投与26-30 時間後にストレスニル（アザペ
ロン製剤）投与による鎮静の後吸入麻酔を行い、正中線
切開により開腹し卵管を上向性に環流して胚を回収し
た。回収後、胚前核に融合遺伝子を4 μg/mlの濃度で顕
微注入した。
【００５０】遺伝子注入胚は、直ちに、発情を同期化し
た雌ブタあるいは排卵が良好な供卵雌ブタの卵管に移植
した。胚移植された受卵雌は分娩まで単飼した。遺伝子
を注入した464 個の前核期胚をあらかじめ性周期を同期
化した16頭の受卵雌ブタ移植したところ11頭が妊娠し、
70頭の産子が得られた。生まれた産子については、尾部
組織からゲノムDNA を抽出し、サザンブロット解析によ
り染色体への導入遺伝子の組み込みを検討した。サザン
ブロット解析により遺伝子導入の有無について検討した
ところ、最終的に6 頭のトランスジェニックブタが得ら
れた（図4 ）。
た雌ブタあるいは排卵が良好な供卵雌ブタの卵管に移植
した。胚移植された受卵雌は分娩まで単飼した。遺伝子
を注入した464 個の前核期胚をあらかじめ性周期を同期
化した16頭の受卵雌ブタ移植したところ11頭が妊娠し、
70頭の産子が得られた。生まれた産子については、尾部
組織からゲノムDNA を抽出し、サザンブロット解析によ
り染色体への導入遺伝子の組み込みを検討した。サザン
ブロット解析により遺伝子導入の有無について検討した
ところ、最終的に6 頭のトランスジェニックブタが得ら
れた（図4 ）。
【００５１】遺伝子導入ブタにおける導入遺伝子の染色
体への組み込みを、サザンブロット解析により解析を行
った結果を図4 に示す。遺伝子導入ブタの産子における
解析結果も併せて示すが、これについては後に詳しく述
べる。図４において、コントロールは陽性対照区であ
り、B-12は初期胚へのaP2/fad2遺伝子注入によって作製
した遺伝子導入ブタ（♂）である。なお、F1産子はB-12
と交配し作製した次世代ブタである。矢印はfad2遺伝子
を示す。遺伝子導入を行ったB-12において、染色体への
導入遺伝子の組み込みが認められる。このことは、導入
したホウレンソウ根部組織より単離したfad2遺伝子はブ
タ個体の染色体上に安定して組み込まれていることを示
す。しかし、これら6 頭のブタのうち2 頭は死産であ
り、1 頭は分娩後圧死した。
体への組み込みを、サザンブロット解析により解析を行
った結果を図4 に示す。遺伝子導入ブタの産子における
解析結果も併せて示すが、これについては後に詳しく述
べる。図４において、コントロールは陽性対照区であ
り、B-12は初期胚へのaP2/fad2遺伝子注入によって作製
した遺伝子導入ブタ（♂）である。なお、F1産子はB-12
と交配し作製した次世代ブタである。矢印はfad2遺伝子
を示す。遺伝子導入を行ったB-12において、染色体への
導入遺伝子の組み込みが認められる。このことは、導入
したホウレンソウ根部組織より単離したfad2遺伝子はブ
タ個体の染色体上に安定して組み込まれていることを示
す。しかし、これら6 頭のブタのうち2 頭は死産であ
り、1 頭は分娩後圧死した。
【００５２】（遺伝子導入ブタにおけるmRNAレベルでの
発現解析）残る3 頭の生存ブタについては、10-11 月齢
でアザペロン製剤にて沈静後、頚部よりやや尾方の背側
を毛刈りしイソジン・アルコールでよく消毒した後キシ
ロカインにて局所麻酔の後、内径約3mm のバイオプシー
ニードルを用いて皮膚から約30mm穿刺することによりニ
ードル内に白色脂肪組織を得た。これら脂肪細胞を実施
例1 と同様にRT-PCR- サザンブロット解析により、導入
遺伝子のmRNAレベルでの発現を検討した。遺伝子導入ブ
タ(B3, B12およびB19)の白色脂肪組織におけるfad2mRNA
のRT-PCR法による発現解析を行った結果を図5 に示す。
M はサイズマーカーを示す。また、B-23、B-10、B-10は
野生型ブタであり、B-12、B-19、B-3は遺伝子導入ブタ
である。矢印はfad2特異的転写産物(378bps)を示す。図
5 より、3 頭のトランスジェニックブタのうち2 頭(B-1
2 およびB-19) の白色脂肪組織において導入遺伝子のmR
NAレベルでの発現が認められた。
発現解析）残る3 頭の生存ブタについては、10-11 月齢
でアザペロン製剤にて沈静後、頚部よりやや尾方の背側
を毛刈りしイソジン・アルコールでよく消毒した後キシ
ロカインにて局所麻酔の後、内径約3mm のバイオプシー
ニードルを用いて皮膚から約30mm穿刺することによりニ
ードル内に白色脂肪組織を得た。これら脂肪細胞を実施
例1 と同様にRT-PCR- サザンブロット解析により、導入
遺伝子のmRNAレベルでの発現を検討した。遺伝子導入ブ
タ(B3, B12およびB19)の白色脂肪組織におけるfad2mRNA
のRT-PCR法による発現解析を行った結果を図5 に示す。
M はサイズマーカーを示す。また、B-23、B-10、B-10は
野生型ブタであり、B-12、B-19、B-3は遺伝子導入ブタ
である。矢印はfad2特異的転写産物(378bps)を示す。図
5 より、3 頭のトランスジェニックブタのうち2 頭(B-1
2 およびB-19) の白色脂肪組織において導入遺伝子のmR
NAレベルでの発現が認められた。
【００５３】さらに、fad2の全長が転写されていること
を確認するため、ノーザンブロット解析を行った。RT-P
CR解析で発現が認められたB12 については次世代の産子
から白色脂肪および肝臓の各組織よりトリゾールで総RN
A を抽出した。その後実施例1 と同様にノーザンブロッ
ト解析を行った。図6 に、B-12系統遺伝子導入ブタにお
けるfad2mRNAのノーザンブロット解析を行った結果を示
す。ポリA RNA(2 μg)を1%アガロース- ホルムアルデヒ
ドゲルで泳動しナイロンメンブレンにブロットした。矢
印はfad2特異的転写産物(1.4kbp)を示す。rRNAは陰性対
照区、 WA froma TG mouse は実施例1 で発現が確認さ
れた遺伝子導入マウスの白色脂肪組織(positive contro
l)、Liver は肝臓、WAは白色脂肪組織を示す。図6 よ
り、白色脂肪細胞特異的に導入遺伝子が転写しているこ
とが認められた。これは、導入されたfad2遺伝子がブタ
の脂肪組織特異的に転写されていることを示す。
を確認するため、ノーザンブロット解析を行った。RT-P
CR解析で発現が認められたB12 については次世代の産子
から白色脂肪および肝臓の各組織よりトリゾールで総RN
A を抽出した。その後実施例1 と同様にノーザンブロッ
ト解析を行った。図6 に、B-12系統遺伝子導入ブタにお
けるfad2mRNAのノーザンブロット解析を行った結果を示
す。ポリA RNA(2 μg)を1%アガロース- ホルムアルデヒ
ドゲルで泳動しナイロンメンブレンにブロットした。矢
印はfad2特異的転写産物(1.4kbp)を示す。rRNAは陰性対
照区、 WA froma TG mouse は実施例1 で発現が確認さ
れた遺伝子導入マウスの白色脂肪組織(positive contro
l)、Liver は肝臓、WAは白色脂肪組織を示す。図6 よ
り、白色脂肪細胞特異的に導入遺伝子が転写しているこ
とが認められた。これは、導入されたfad2遺伝子がブタ
の脂肪組織特異的に転写されていることを示す。
【００５４】（次世代の生産）2 頭の発現が確認された
植物由来のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を有するブタ
（トランスジェニックブタ、♂-1頭、♀-1頭）から産子
を生産した。これは、導入した遺伝子が安定的に子孫に
伝達するかどうかを確認するものである。それと同時
に、遺伝子が伝達されたブタについては、その遺伝子が
発現し新規に生合成されたタンパク質が酵素として機能
するかどうかについての検討を行うのに都合がよい。遺
伝子が導入された雌トランスジェニックブタは1 頭の野
生型雄ブタと交配させた。雌トランスジェニックブタよ
り、12頭（生存-3頭、死産-9頭）の産子を得たが、母ブ
タの無乳症のため全頭死亡した。雄トランスジェニック
ブタは、2 頭の野生型雌ブタと交配させたところ、14頭
（生存-9頭、死産-5頭）および18頭（生存-12 頭、死産
-6頭）の産子を得た。これら21頭の生存産子の尾部組織
由来ゲノムDNA を使ったサザンブロット解析の結果、8
頭(38%) で導入遺伝子が次世代へ伝達していることが確
認できた（図4 ）。図4 において、B-12の産子であるR-
12およびR-15で染色体への導入遺伝子の組み込みが認め
られる。
植物由来のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を有するブタ
（トランスジェニックブタ、♂-1頭、♀-1頭）から産子
を生産した。これは、導入した遺伝子が安定的に子孫に
伝達するかどうかを確認するものである。それと同時
に、遺伝子が伝達されたブタについては、その遺伝子が
発現し新規に生合成されたタンパク質が酵素として機能
するかどうかについての検討を行うのに都合がよい。遺
伝子が導入された雌トランスジェニックブタは1 頭の野
生型雄ブタと交配させた。雌トランスジェニックブタよ
り、12頭（生存-3頭、死産-9頭）の産子を得たが、母ブ
タの無乳症のため全頭死亡した。雄トランスジェニック
ブタは、2 頭の野生型雌ブタと交配させたところ、14頭
（生存-9頭、死産-5頭）および18頭（生存-12 頭、死産
-6頭）の産子を得た。これら21頭の生存産子の尾部組織
由来ゲノムDNA を使ったサザンブロット解析の結果、8
頭(38%) で導入遺伝子が次世代へ伝達していることが確
認できた（図4 ）。図4 において、B-12の産子であるR-
12およびR-15で染色体への導入遺伝子の組み込みが認め
られる。
【００５５】（遺伝子導入ブタにおける発現解析）ブタ
においてオレイン酸濃度を増加させた飼料を給餌するこ
とで、白色脂肪細胞中のオレイン酸濃度が上昇すること
が報告されている(Myer et al., J Anim Sci, 70:3734-
3741, 1992, Klingenberg et al., Comp Biochem Physi
ol, 110B,183-192, 1995)。今回、ブタ普通飼料に10%
オレイン酸サラダ油（78％オレイン酸）を添加した食餌
（オレイン酸食）を8 週間遺伝子導入ブタに投与するこ
とで、ホウレン草由来FAD2によるブタ白色脂肪組織内で
オレイン酸がリノール酸へ変換しているかどうかを調べ
た。食餌投与直前および8 週後に、実施例1 と同様に白
色脂肪組織中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで
調べた。
においてオレイン酸濃度を増加させた飼料を給餌するこ
とで、白色脂肪細胞中のオレイン酸濃度が上昇すること
が報告されている(Myer et al., J Anim Sci, 70:3734-
3741, 1992, Klingenberg et al., Comp Biochem Physi
ol, 110B,183-192, 1995)。今回、ブタ普通飼料に10%
オレイン酸サラダ油（78％オレイン酸）を添加した食餌
（オレイン酸食）を8 週間遺伝子導入ブタに投与するこ
とで、ホウレン草由来FAD2によるブタ白色脂肪組織内で
オレイン酸がリノール酸へ変換しているかどうかを調べ
た。食餌投与直前および8 週後に、実施例1 と同様に白
色脂肪組織中の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで
調べた。
【００５６】B-12由来遺伝子導入ブタ6 頭（雄-3頭、雌
-3頭）を実験に供した。5 ヶ月齢まで通常飼料（スパー
トG,日本農産工業、表-5）で飼育した。また、導入遺伝
子が伝達していなかった同腹子は野生型ブタとして同様
に飼育、実験を行うことで対照群とした。飼育環境は、
雌雄別飼で38 のコンクリート床の飼育室で12時間照
明、気温20-25 ℃の条件下で5-6 頭を不断給餌・給水で
飼育した。5 ヶ月齢からオレイン酸食（10％オレイン酸
添加スパートＧ, 日本農産工業、表6 ) で8 週間飼育し
た。また、B-19については産子が得られなかったため本
ブタに同様にオレイン酸飼料を投与して実験を行った。
脂肪組織は採取後直ちに液体窒素中で凍結し、脂肪酸組
成の解析まで-80 ℃で保存した。脂肪細胞の脂肪酸組成
解析は実施例1 と同様に行った。
-3頭）を実験に供した。5 ヶ月齢まで通常飼料（スパー
トG,日本農産工業、表-5）で飼育した。また、導入遺伝
子が伝達していなかった同腹子は野生型ブタとして同様
に飼育、実験を行うことで対照群とした。飼育環境は、
雌雄別飼で38 のコンクリート床の飼育室で12時間照
明、気温20-25 ℃の条件下で5-6 頭を不断給餌・給水で
飼育した。5 ヶ月齢からオレイン酸食（10％オレイン酸
添加スパートＧ, 日本農産工業、表6 ) で8 週間飼育し
た。また、B-19については産子が得られなかったため本
ブタに同様にオレイン酸飼料を投与して実験を行った。
脂肪組織は採取後直ちに液体窒素中で凍結し、脂肪酸組
成の解析まで-80 ℃で保存した。脂肪細胞の脂肪酸組成
解析は実施例1 と同様に行った。
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【００５９】（食餌変化による遺伝子導入ブタにおける
脂肪酸組成の変化：リノール酸の新規生合成）オレイン
酸食投与開始直前（0 週）および8 週目に遺伝子導入お
よび野生型ブタをアザペロン製剤にて沈静後、頚部より
やや尾方の背側を毛刈りしイソジン・アルコールでよく
消毒した後キシロカインにて局所麻酔の後、内径約3mm
のバイオプシーニードルを用いて皮膚から約30mm穿刺す
ることによりニードル内に白色脂肪組織を得た。脂肪組
織中の脂質における脂肪酸組成の測定は実施例1 と同様
に行った。
脂肪酸組成の変化：リノール酸の新規生合成）オレイン
酸食投与開始直前（0 週）および8 週目に遺伝子導入お
よび野生型ブタをアザペロン製剤にて沈静後、頚部より
やや尾方の背側を毛刈りしイソジン・アルコールでよく
消毒した後キシロカインにて局所麻酔の後、内径約3mm
のバイオプシーニードルを用いて皮膚から約30mm穿刺す
ることによりニードル内に白色脂肪組織を得た。脂肪組
織中の脂質における脂肪酸組成の測定は実施例1 と同様
に行った。
【００６０】普通食で5 ヶ月飼育後オレイン酸食で8 週
間飼育したしたaP2/fad2導入ブタ（B-12系統）の白色脂
肪組織の総脂質における脂肪酸構成比を図7 に示す。縦
棒は平均値、エラーバーは標準誤差を示す。統計解析
は、分散分析を行った後フィッシャーのPLSDテストによ
り行った。図7 より、B-12系統遺伝子導入ブタの全脂肪
酸におけるリノール酸(18:2n-6) 比率(Mol%)は、オレイ
ン酸食投与開始時および8 週目で野生型ブタに比べ、そ
れぞれ25および19％上昇していた（P<0.05）。また、オ
レイン酸比率は野生型ブタの方が、それぞれ、5 および
10％上昇していた（P<0.05）。
間飼育したしたaP2/fad2導入ブタ（B-12系統）の白色脂
肪組織の総脂質における脂肪酸構成比を図7 に示す。縦
棒は平均値、エラーバーは標準誤差を示す。統計解析
は、分散分析を行った後フィッシャーのPLSDテストによ
り行った。図7 より、B-12系統遺伝子導入ブタの全脂肪
酸におけるリノール酸(18:2n-6) 比率(Mol%)は、オレイ
ン酸食投与開始時および8 週目で野生型ブタに比べ、そ
れぞれ25および19％上昇していた（P<0.05）。また、オ
レイン酸比率は野生型ブタの方が、それぞれ、5 および
10％上昇していた（P<0.05）。
【００６１】また、オレイン酸食投与開始時のB-19のお
よび野生型雌ブタの白色脂肪組織におけるリノール酸構
成比を調べたところ、それぞれ、12.9および10.3％で、
B-19が高かった（P<0.05）。オレイン酸食投与開始前か
らリノール酸比率が上昇していたのは、普通食投与のブ
タの白色脂肪組織中脂質には元来オレイン酸含量が非常
に多く遺伝子導入ブタ白色脂肪組織で発現しているFAD2
がこれらオレイン酸をリノール酸に変換したためと考え
られる。また、オレイン酸食投与後もリノール酸比率が
上昇しなかったのは、生体内でリノール酸がアラキドン
酸を経てプロスタノイドへ代謝されたものと考えられ
た。以上のように、遺伝子導入ブタにおいて、リノール
酸比率が上昇していることは、これら動物にFAD2の酵素
活性があることを示している。
よび野生型雌ブタの白色脂肪組織におけるリノール酸構
成比を調べたところ、それぞれ、12.9および10.3％で、
B-19が高かった（P<0.05）。オレイン酸食投与開始前か
らリノール酸比率が上昇していたのは、普通食投与のブ
タの白色脂肪組織中脂質には元来オレイン酸含量が非常
に多く遺伝子導入ブタ白色脂肪組織で発現しているFAD2
がこれらオレイン酸をリノール酸に変換したためと考え
られる。また、オレイン酸食投与後もリノール酸比率が
上昇しなかったのは、生体内でリノール酸がアラキドン
酸を経てプロスタノイドへ代謝されたものと考えられ
た。以上のように、遺伝子導入ブタにおいて、リノール
酸比率が上昇していることは、これら動物にFAD2の酵素
活性があることを示している。
【００６２】（実施例３）
（体外で再分化させた遺伝子導入ブタ由来脂肪細胞にお
ける脂質中脂肪酸組成の変化）遺伝子導入ブタの脂肪細
胞におけるFAD2遺伝子の機能的発現を更に詳細に検討す
るために、体外培養した遺伝子導入ブタ脂肪細胞由来前
躯体脂肪細胞を体外で分化誘導することで新規に合成・
蓄積した脂肪における脂肪酸組成を調べた。哺乳動物の
単胞性成熟脂肪細胞を単離して天井培養法で培養する
と、蓄積した脂肪滴が除去され、形態的に線維芽細胞様
の前駆脂肪細胞となる（Sugihara et al.,Differentiat
ion 31,42-49 (1986))。この細胞を十分な細胞数になる
まで継代培養し、インスリン等で誘導すると再度脂肪細
胞へと分化し、細胞内に脂肪滴を蓄積することが知られ
ている（特開２０００−８３６５６号公報）。ブタにお
いて用いた遺伝子は、aP2 プロモーターを連結している
ので、脱分化した前躯脂肪細胞では発現せず、分化誘導
後にfad2が発現する。そのために、体外で分化誘導され
た遺伝子導入ブタ由来前駆脂肪細胞の蓄積脂肪における
脂肪酸組成を調べることで、導入したfad2の機能をより
詳細に検討できると考えた。
ける脂質中脂肪酸組成の変化）遺伝子導入ブタの脂肪細
胞におけるFAD2遺伝子の機能的発現を更に詳細に検討す
るために、体外培養した遺伝子導入ブタ脂肪細胞由来前
躯体脂肪細胞を体外で分化誘導することで新規に合成・
蓄積した脂肪における脂肪酸組成を調べた。哺乳動物の
単胞性成熟脂肪細胞を単離して天井培養法で培養する
と、蓄積した脂肪滴が除去され、形態的に線維芽細胞様
の前駆脂肪細胞となる（Sugihara et al.,Differentiat
ion 31,42-49 (1986))。この細胞を十分な細胞数になる
まで継代培養し、インスリン等で誘導すると再度脂肪細
胞へと分化し、細胞内に脂肪滴を蓄積することが知られ
ている（特開２０００−８３６５６号公報）。ブタにお
いて用いた遺伝子は、aP2 プロモーターを連結している
ので、脱分化した前躯脂肪細胞では発現せず、分化誘導
後にfad2が発現する。そのために、体外で分化誘導され
た遺伝子導入ブタ由来前駆脂肪細胞の蓄積脂肪における
脂肪酸組成を調べることで、導入したfad2の機能をより
詳細に検討できると考えた。
【００６３】実施例２と同様に、バイオプシーニードル
を用いて遺伝子導入ブタおよび非導入ブタの背側脂肪細
胞を採取した。脂肪組織はコラーゲナーゼ溶液を用いて
細胞を分散させた。濾過メッシュにより未消化組織を除
去し、単離した単胞性の成熟脂肪細胞を得た。細胞懸濁
液を培養フラスコに導入し、20％ウシ胎児血清を添加し
た25mM HEPES buffered Dulbecco's Eagle minimum ess
ential medium (FCS-DMEM)培養液を充満させ、上下逆に
して培養器内に置いた。このようにすると、単胞性脂肪
細胞は培養液上層に浮遊し、フラスコ上面に付着する。
を用いて遺伝子導入ブタおよび非導入ブタの背側脂肪細
胞を採取した。脂肪組織はコラーゲナーゼ溶液を用いて
細胞を分散させた。濾過メッシュにより未消化組織を除
去し、単離した単胞性の成熟脂肪細胞を得た。細胞懸濁
液を培養フラスコに導入し、20％ウシ胎児血清を添加し
た25mM HEPES buffered Dulbecco's Eagle minimum ess
ential medium (FCS-DMEM)培養液を充満させ、上下逆に
して培養器内に置いた。このようにすると、単胞性脂肪
細胞は培養液上層に浮遊し、フラスコ上面に付着する。
【００６４】一週間培養するとフラスコ上面の脂肪細胞
は油滴がなくなり、細胞は線維芽細胞様を呈する前駆脂
肪細胞となった。充満した培養液を棄て、フラスコの上
下を戻し、新鮮なFCS-DMEMを入れ、通常の細胞培養によ
り前駆脂肪細胞を増殖させた。数代継代後、 5μg/mlイ
ンスリン（和光純薬）、0.5mM イソブチルメチルザンチ
ン（和光純薬）および0.25μM デキサメサゾン（和光純
薬）を添加したFCS-DMEMで４日間分化誘導した。培養液
をFCS-DMEMに交換し、８日間培養して細胞内に脂肪蓄積
させた。培養終了後、上述の実施例２と同様に脂肪細胞
より脂質を抽出し脂肪酸組成を調べた。
は油滴がなくなり、細胞は線維芽細胞様を呈する前駆脂
肪細胞となった。充満した培養液を棄て、フラスコの上
下を戻し、新鮮なFCS-DMEMを入れ、通常の細胞培養によ
り前駆脂肪細胞を増殖させた。数代継代後、 5μg/mlイ
ンスリン（和光純薬）、0.5mM イソブチルメチルザンチ
ン（和光純薬）および0.25μM デキサメサゾン（和光純
薬）を添加したFCS-DMEMで４日間分化誘導した。培養液
をFCS-DMEMに交換し、８日間培養して細胞内に脂肪蓄積
させた。培養終了後、上述の実施例２と同様に脂肪細胞
より脂質を抽出し脂肪酸組成を調べた。
【００６５】その結果を表７にまとめた。なお表７にお
いて、脂肪酸組成の分析は、それぞれの細胞群の異なる
細胞サンプルを用いて３回行った。また、表７のa,b,c,
d については、同じ行内での異符号間で有意差が認めら
れる（a,b;P<0.001,c,d;P<0.01）。遺伝子導入脂肪細胞
におけるリノール酸比率は、27.7% と、野生型細胞（7.
2%, P<0.001 ）より大幅に上昇した。また、16:0の含量
は、遺伝子導入細胞で16.3% と野生型（34.2% ）の約1/
2 と大幅に減少した（P<0.001 ）。哺乳動物細胞では、
Δ９脂肪酸不飽和化酵素が存在するので、動物脂肪には
オレイン酸が多い。遺伝子導入ブタの脂肪細胞では、Δ
12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子fad2が機能的に発現したこ
とによりオレイン酸をリノール酸に変換したため、リノ
ール酸比率が大幅に上昇したと考えられる。このリノー
ル酸比率の上昇に伴い、減少したオレイン酸を補充する
ため、パルミチン酸比率が低下したと思われる。遺伝子
導入ブタ生体における脂肪組織においても、パルミチン
酸の減少とリノール酸の増加が観察されている（図７）
が、体外培養により脂肪細胞内に蓄積した脂肪における
脂肪酸組成を検討できるため、野生型ブタ由来細胞と比
較して、遺伝子導入ブタ由来細胞において大幅な脂肪酸
組成の相違が観察できたと考えられる。これらの結果
は、導入したFAD2cDNAが脂肪細胞において機能的に発現
し、リノール酸を生合成していることを示している。
いて、脂肪酸組成の分析は、それぞれの細胞群の異なる
細胞サンプルを用いて３回行った。また、表７のa,b,c,
d については、同じ行内での異符号間で有意差が認めら
れる（a,b;P<0.001,c,d;P<0.01）。遺伝子導入脂肪細胞
におけるリノール酸比率は、27.7% と、野生型細胞（7.
2%, P<0.001 ）より大幅に上昇した。また、16:0の含量
は、遺伝子導入細胞で16.3% と野生型（34.2% ）の約1/
2 と大幅に減少した（P<0.001 ）。哺乳動物細胞では、
Δ９脂肪酸不飽和化酵素が存在するので、動物脂肪には
オレイン酸が多い。遺伝子導入ブタの脂肪細胞では、Δ
12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子fad2が機能的に発現したこ
とによりオレイン酸をリノール酸に変換したため、リノ
ール酸比率が大幅に上昇したと考えられる。このリノー
ル酸比率の上昇に伴い、減少したオレイン酸を補充する
ため、パルミチン酸比率が低下したと思われる。遺伝子
導入ブタ生体における脂肪組織においても、パルミチン
酸の減少とリノール酸の増加が観察されている（図７）
が、体外培養により脂肪細胞内に蓄積した脂肪における
脂肪酸組成を検討できるため、野生型ブタ由来細胞と比
較して、遺伝子導入ブタ由来細胞において大幅な脂肪酸
組成の相違が観察できたと考えられる。これらの結果
は、導入したFAD2cDNAが脂肪細胞において機能的に発現
し、リノール酸を生合成していることを示している。
【００６６】
【表７】
【００６７】
【発明の効果】本発明において、脂肪酸不飽和化酵素の
遺伝子を動物に導入して形質転換を行うことにより、健
康に有用な不飽和脂肪酸の含量を増加させたことを特徴
とする形質転換動物、および動物において不飽和脂肪酸
の含量を増加させる方法が与えられた。本発明の形質転
換動物および形質転換動物を作製する方法は、健康上有
用な食肉の生産するという目的において特に有用であ
る。
遺伝子を動物に導入して形質転換を行うことにより、健
康に有用な不飽和脂肪酸の含量を増加させたことを特徴
とする形質転換動物、および動物において不飽和脂肪酸
の含量を増加させる方法が与えられた。本発明の形質転
換動物および形質転換動物を作製する方法は、健康上有
用な食肉の生産するという目的において特に有用であ
る。
【００６８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> School juridical organization Kinki University,Japan Society for
the Promotion of Science
<120> A transgenic animal with fatty acid desaturase and a method for p
roduction of the animal
<130> GF 2002-461
<150> JP 2001-387638
<151> 2001-12-20
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1640
<212> DNA
<213> Spinatica oleracea L.
<400> 1
aagcttgtcg aaattcgcga gccggcgcac acttcggcct ctccttctcc ttcctcaaac 60
caaaaaaaaa gtctctctgt ttttatttaa ttttttaaaa ttaattaatt cagagagcaa 120
aaaaataaat cacagatttc gaggttgaag aagttcgcaa tttttgatgt accacttcga 180
gcggctggaa caatgggtgc aggtgggaga tctattcctc catcggcgag aaaggagaaa 240
tctgatgcat tgaacagagt accatacgaa aaaccaccat tcacactagg gcagataaaa 300
aaagccatcc cacctcattg cttcaaacgc tctgtgctac gctctttctc ctatgtggtt 360
tatgatttca ccattgcgtt cctcctctac tatgttgcta ctaactacat ccacctcctt 420
ccaaagcctt tcaactactt ggcttggcct gtgtatggat ttgtccaagg ctgtgttctt 480
accggtgttt gggttatagc ccatgaatgt ggccaccatg ccttcagtga ttaccagtgg 540
ctcgatgaca ctgttggctt agtcctccac tcgttccttc ttgtgccata tttctcatgg 600
aaatacagtc acaggcgcca tcactcaaac actggttcaa tggagaaaga tgaagttttt 660
gtaccaaaaa gaaaggaaaa tatgtcatgg ttttccaagt atcttagcaa cccacctgga 720
cgaatcctga cccttgttgt gacgctaacc cttggctggc ctttgtatct tctgtttaat 780
gtatcgggta ggaaatatga gcgttttgct tgccattatg acccatcctc tccaatctac 840
tcggaccgtg agaggcttca aatattcatt tctgatgttg ggatttcgtt agtggctttt 900
gggctttatc accttgcagc tgccaaagga atttcatggg tgttgtgtgt atatgggggt 960
ccattgcttg ttgtgaacgg atttcttgtc ctgattacct tccttcagca cacacaccct 1020
tcattgcccc attacgatac atctgaatgg gattggttga gaggtgcatt ggctaccgtg 1080
gaccgagact acgggatttt gaacaaggtg ttccacaaca ttactgatac tcacgtggct 1140
caccatctca tctcgaccat gccccattat catgctatgg aggcaaccaa ggctataaag 1200
ccaatattgg gcaaatatta tcggttggat tcaactccag tattcaaggc aatgtggagg 1260
gaggccaaag aatgtatgta tgtggaggct gatgaagacg accagaacaa aagtgtgctc 1320
tggtacagaa acaagcttgg aaaatcctgg tttctccttt agggattagc cttctcttat 1380
cctttaaaac cccctcccta ctagatttat aggttggttg tgtgtttgtc atgttttgta 1440
tttttgaacc gcggatttct ttaactacca ttccagtaat gttgatcatt gtgatagagc 1500
gagaatcact aggcgagttg ggggagttgt ttgttattgt tgtttttgca ataatctgta 1560
catccttgct gtgcccagat ttcttggcat atctacggat gggacacaat tatttgtgaa 1620
tttttgcggc ccgcgaattc 1640
【図１】 図１は、遺伝子導入マウスにおけるホウレン
ソウfad2遺伝子の発現を示す、RT-PCR解析とノーザンブ
ロット解析の写真である。
ソウfad2遺伝子の発現を示す、RT-PCR解析とノーザンブ
ロット解析の写真である。
【図２】 図２は、遺伝子導入マウスの褐色脂肪組織に
おけるホウレンソウFAD2の発現を示す、ウエスタンブロ
ッット解析の写真である。
おけるホウレンソウFAD2の発現を示す、ウエスタンブロ
ッット解析の写真である。
【図３】 図３は、普通食あるいはオレイン酸食を投与
した野生型マウスおよびB1系統マウスの、褐色脂肪組織
の総脂質における脂肪酸構成比を示すグラフである。
した野生型マウスおよびB1系統マウスの、褐色脂肪組織
の総脂質における脂肪酸構成比を示すグラフである。
【図４】 図４は、遺伝子導入ブタおよびその産子にお
ける導入遺伝子の染色体への組み込みを示す、サザンブ
ロットによる解析の写真である。
ける導入遺伝子の染色体への組み込みを示す、サザンブ
ロットによる解析の写真である。
【図５】 図５は、遺伝子導入ブタ(B3, B12およびB19)
の白色脂肪組織におけるfad2mRNAの発現を示す、RT-PCR
法による解析の写真である。
の白色脂肪組織におけるfad2mRNAの発現を示す、RT-PCR
法による解析の写真である。
【図６】 図６は、B-12系統遺伝子導入ブタにおけるfa
d2mRNAの発現を示す、ノーザンブロット解析の写真であ
る。
d2mRNAの発現を示す、ノーザンブロット解析の写真であ
る。
【図７】 図７は、普通食で飼育したしたaP2/fad2導入
ブタ（B-12系統）の白色脂肪組織の総脂質における脂肪
酸構成比を示すグラフである。
ブタ（B-12系統）の白色脂肪組織の総脂質における脂肪
酸構成比を示すグラフである。
フロントページの続き
(72)発明者 木下 幹朗
北海道帯広市稲田町西２線15番地 畜大宿
舎83−２
(72)発明者 鈴木 石根
愛知県岡崎市大西町字南ヶ原12−37番地
県営大西住宅304号
(72)発明者 田口 善智
和歌山県和歌山市北野544−３−Ｂ−106
(72)発明者 三上 浩司
愛知県岡崎市明大寺町字馬場東139 セン
トラル錦402
(72)発明者 上田 正次
埼玉県川越市今福1672の１の719
(72)発明者 細井 美彦
大阪府堺市赤坂台一丁９−２
(72)発明者 村田 紀夫
愛知県岡崎市不吹町14−64−602
(72)発明者 入谷 明
京都府京都市左京区岩倉長谷町１−24
(72)発明者 加野 浩一郎
神奈川県藤沢市亀井野891−44
Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA10 BA80 CA02 DA02
GA11 GA18 HA20
4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14
BA02 CA13 CA41
Claims (15)
- 【請求項１】 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物に導入
して当該動物を形質転換し、当該脂肪酸不飽和化酵素遺
伝子を当該動物において発現させることにより、前記動
物において不飽和脂肪酸の含量が増加していることを特
徴とする、形質転換動物。 - 【請求項２】 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ12脂
肪酸不飽和化酵素遺伝子及び／又はΔ15脂肪酸不飽和化
酵素遺伝子である、請求項１記載の形質転換動物。 - 【請求項３】 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がホウレ
ンソウの根部に由来するΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子
である、請求項２記載の形質転換動物。 - 【請求項４】 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がホウレ
ンソウの根部に由来するΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子
であって、当該遺伝子の発現がニワトリβ−アクチン
（β-actin）プロモーター又はadipocyteP2 (aP2) プロ
モーターにより促進されている、請求項１記載の形質転
換動物。 - 【請求項５】 前記不飽和脂肪酸がリノール酸、α- リ
ノレン酸、エイコサペンタエン酸(EPA) 又はドコサヘキ
サエン酸(DHA) である、請求項１記載の形質転換動物。 - 【請求項６】 前記動物が食肉となる動物である、請求
項１記載の形質転換動物。 - 【請求項７】 前記動物が哺乳類である、請求項６記載
の形質転換動物。 - 【請求項８】 前記哺乳類がブタ、ウシ、ヤギ又はヒツ
ジである、請求項７記載の形質転換動物。 - 【請求項９】 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物細胞に
導入して当該動物細胞を形質転換し、当該脂肪酸不飽和
化酵素遺伝子を当該動物細胞において発現させることに
より、前記動物細胞において不飽和脂肪酸の含量が増加
していることを特徴とする、形質転換動物細胞。 - 【請求項１０】 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物に導
入して当該動物を形質転換し、当該脂肪酸不飽和化酵素
遺伝子を当該動物において発現させる過程よりなる、動
物において不飽和脂肪酸含量を増加させる方法。 - 【請求項１１】 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び当該脂
肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を可能とするための転写
調節領域を有する発現プラスミドであるベクターを構築
する過程、当該ベクターを動物の初期胚、体細胞又は胚
性幹細胞（ES細胞）に導入することにより形質転換を行
う過程、当該動物の初期胚、体細胞、胚性幹細胞より動
物個体を発生させて当該動物個体において当該脂肪酸不
飽和化酵素遺伝子を発現させる過程よりなる、動物にお
いて不飽和脂肪酸含量を増加させる方法。 - 【請求項１２】 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ12
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び／又はΔ15脂肪酸不飽和
化酵素遺伝子である、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１３】 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がホウ
レンソウの根部に由来するΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝
子である、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がホウ
レンソウの根部に由来するΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝
子であり、前記転写調節領域がニワトリβ−アクチン
（β-actin）プロモーター又はadipocyteP2 (aP2) プロ
モーターである、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 前記不飽和脂肪酸がリノール酸、α-
リノレン酸、エイコサペンタエン酸(EPA) 又はドコサヘ
キサエン酸(DHA) である、請求項１０記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002357740A JP2003245070A (ja) | 2001-12-20 | 2002-12-10 | 脂肪酸不飽和化酵素を有する形質転換動物およびその作製方法 |
| PCT/JP2003/000930 WO2004066724A1 (ja) | 2001-12-20 | 2003-01-30 | 脂肪酸不飽和化酵素を有する形質転換動物およびその作製方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001387638 | 2001-12-20 | ||
| JP2001-387638 | 2001-12-20 | ||
| JP2002357740A JP2003245070A (ja) | 2001-12-20 | 2002-12-10 | 脂肪酸不飽和化酵素を有する形質転換動物およびその作製方法 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003245070A true JP2003245070A (ja) | 2003-09-02 |
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ID=33101864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002357740A Pending JP2003245070A (ja) | 2001-12-20 | 2002-12-10 | 脂肪酸不飽和化酵素を有する形質転換動物およびその作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003245070A (ja) |
-
2002
- 2002-12-10 JP JP2002357740A patent/JP2003245070A/ja active Pending
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