JP2003189849A - Hair follicle-reconstitution system and animal carrying the same - Google Patents
Hair follicle-reconstitution system and animal carrying the sameInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、毛包再構成系を担
持する実験動物、ならびにその作出のための細胞系およ
び使用に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an experimental animal carrying a hair follicle reconstitution system, and a cell line and its use for producing the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】特定の目的に向けられた動物反応を安定
に再現することのできる多種多様のキメラ動物またはト
ランスジェニック動物は、主として、特定の疾患のモデ
ルとして、または特定の疾患の病因を解明するために開
発されている。例えば、毛髪再構成アッセイ用として、
毛芽（特殊なケラチノサイト集塊として新生仔マウスの
皮膚に存在する毛包前駆細胞）が、毛髪誘発性の毛乳頭
細胞（ラットのヒゲ由来）と一緒に移植されたヌードマ
ウスが開発されている（Ｌｉｃｈｔｉ ｅｔ ａｌ，
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０１：１２４
−１２９，１９９３）。2. Description of the Related Art A wide variety of chimeric or transgenic animals capable of stably reproducing an animal reaction for a specific purpose are mainly used as a model for a specific disease or to elucidate the etiology of a specific disease. Is being developed to For example, for a hair reconstitution assay,
Nude mice have been developed in which hair buds (hair follicle progenitor cells that are present in the skin of newborn mice as special keratinocyte clumps) are transplanted together with hair-induced hair papilla cells (derived from rat mustache). (Lichti et al,
J. Invest Dermatol 101: 124
-129, 1993).
【０００３】また、新生仔マウスの毛芽に由来する培養
ケラチノサイトと毛乳頭細胞とが移植されたマウスで
は、その移植領域の組織学的な解析により完全に組織化
された上皮と毛包の再構成が確認されている（Ｋａｍｉ
ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ １０９：５３４−５４０，１９９７）。かよう
な再構成毛包はｉｎ ｖｉｖｏでの毛髪の誘発について
の信頼のおける機能性のアッセイに使用されうることが
示唆されている。Further, in mice in which cultured keratinocytes derived from hair buds of newborn mice and hair papilla cells were transplanted, a completely organized epithelium and hair follicles were reconstructed by histological analysis of the transplanted area. The configuration has been confirmed (Kami
mura et al. Invest Derma
tol 109: 534-540, 1997). It has been suggested that such reconstituted hair follicles can be used in a reliable assay of functionality for inducing hair in vivo.
【０００４】他方、毛髪の誘発と相俟って言及すること
のできる事象として毛の色調を挙げることができるであ
ろう。毛の色調は多くの場合、毛母細胞（ｈａｉｒ ｍ
ａｔｒｉｘ）の近傍に存在するメラノサイトによって産
生され、毛を形成する細胞に与えられるメラニンにより
もたらされるものとみなされている。白髪になるのは、
かようなメラノサイトがメラニンを産生しなくなるか、
メラニンを産生しても極めて少量であるか、またはメラ
ノサイトが減少ないしは消滅することが主要な原因であ
るといわれている。しかし、毛周期に関連して考慮する
場合、退行期（毛の増殖が止まり、毛包の短縮および棍
毛の形成）および休止期を通じて毛包から激減または消
失したメラノサイトは、次期成長期においてどのように
補充され、そして毛の色調を整えることができるのか
（どこから来るのか）、等については明らかでない。On the other hand, the color tone of the hair may be mentioned as an event that can be mentioned together with the induction of hair. Hair color is often hair matrix (hair m
atrix) and is considered to be brought about by melanin produced by melanocytes present in the cells forming hair. The gray hair is
Whether such melanocytes stop producing melanin,
It is said that the main cause is that the amount of melanin produced is extremely small, or that melanocytes decrease or disappear. However, when considered in the context of the hair cycle, melanocytes that were depleted or lost from the hair follicle during the catagen phase (hair growth stopped, hair follicle shortening and hair formation) and resting phase Is not clear as to where it can be replenished and toned (where it comes from) etc.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】したがって、毛の色調
を整えることのできる手段、換言すれば、ある一定の手
段が白髪の防止もしくは抗白髪作用を奏するか否かを評
価できるイン・ビボの評価系を提供することは価値があ
ろう。こうして、本発明の目的は、かかる評価系を提供
することにある。なお、本明細書にいう、「抗白髪性」
または「抗白髪作用」とは、例えば、メラノサイトの増
殖促進、遊走能力促進、分化能促進、生存能力の増進、
メラニン産生能等からなる群より選ばれる一種以上の活
性で評価できる白髪化を抑制しうる特性であり、毛の色
によりそれらの活性が示される性質を意味する。Therefore, an in-vivo evaluation capable of evaluating whether or not a means capable of adjusting the color tone of hair, in other words, a certain means exerts an effect of preventing gray hair or anti-grey hair. Providing a system would be worth it. Thus, an object of the present invention is to provide such an evaluation system. The term "anti-gray hair property" as used herein
Or "anti-hair graying action" means, for example, melanocyte proliferation promotion, migration ability promotion, differentiation ability promotion, survival ability enhancement,
It is a property capable of suppressing graying, which can be evaluated by one or more activities selected from the group consisting of melanin-producing ability, and means a property in which those activities are shown by the color of hair.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく検討してきたところ、上述の毛包の再構成
が確認されている、所謂、再構成毛包が、同種または異
種のいずれの外来のメラノサイトを加えても再構成で
き、しかもこうして構成された毛包のメラノサイトは活
性な状態に維持できることを見出した。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have studied to achieve the above-mentioned object, and as a result, it has been confirmed that the above-mentioned hair follicle is reconstructed. It was found that they can be reconstituted by adding any of the exogenous melanocytes, and that the melanocytes of the hair follicles thus constituted can be maintained in an active state.
【０００７】したがって、本発明によれば、毛乳頭細胞
および表皮細胞と、これらの細胞に対して外来のメラノ
サイトとの組み合わせからなる毛包を再構成するための
系が提供される。Therefore, according to the present invention, there is provided a system for reconstituting a hair follicle, which comprises a combination of dermal papilla cells and epidermal cells and melanocytes foreign to these cells.
【０００８】別の態様の本発明として、レシピエント動
物に上記系が移植され、こうして再構成毛包を担持する
キメラ動物が提供される。As another aspect of the present invention, there is provided a chimeric animal in which a recipient animal is transplanted with the above system and thus carries reconstituted hair follicles.
【０００９】また、別の態様の発明として、上記キメラ
動物を被験動物として用意し、該被験動物をある一定の
手段で処置し、こうして処置された被験動物の再構成毛
包におけるメラノサイトの活性をモニターし、未処置対
象に対する該活性の変化の程度を該手段のメラノサイト
の活性化能と関連付けることを特徴とする、ある一定の
手段のメラノサイトの活性化能の評価方法も提供され
る。In another aspect of the invention, the above-mentioned chimeric animal is prepared as a test animal, the test animal is treated by a certain means, and the activity of melanocytes in reconstructed hair follicles of the test animal thus treated is measured. Also provided is a method of assessing the ability of a certain means to activate melanocytes, which is monitored and correlates the extent of change in the activity relative to an untreated subject with the ability of the means to activate melanocytes.
【００１０】[0010]
【発明の具体的な態様】本明細書において、「毛乳頭細
胞（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａｅ）」（以下、ＤＰ
という場合あり）は、本発明の目的に沿う限り、広く毛
包最下部にある毛乳頭細胞およびその周辺の細胞および
組織を包含する概念を表わすものとして使用されてい
る。このような組織としては毛乳頭細胞を含有する真皮
を挙げることができる。限定されるものでないが、この
ような細胞は、マウスに由来する細胞を例にすれば、バ
ーシカンプロモーターの下流に適当なレポーター遺伝子
（例えば、ＬａｃＺ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）の構造遺伝子）をつないだ発現ベクターを導
入したトランスジェニックマウス（Ｖｅｒ−ＬａｃＺ）
から生まれた新生仔（生後４日以内に使用）から、レポ
ーター遺伝子の発現を目印にして取得することができ
る。また、毛乳頭細胞を含有する真皮としては、皮膚か
ら通常の調製方法によって取得される真皮が、一般に、
毛乳頭細胞を含むので、そのまま、本発明の毛乳頭細胞
として使用することもできる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present specification, “hair papilla cells” (hereinafter, referred to as DP
In some cases, for the purpose of the present invention, the term encompasses a papilla cell at the lowermost part of the hair follicle and cells and tissues around it. Examples of such tissues include dermis containing dermal papilla cells. Although not limited thereto, such a cell is, for example, a mouse-derived cell, an appropriate reporter gene (eg, LacZ gene, green fluorescent protein (GFP) structural gene) downstream of the versican promoter. Transgenic mouse (Ver-LacZ) into which the expression vector ligated with the gene was introduced
Can be obtained by using the expression of the reporter gene as a marker from a newborn baby (used within 4 days after birth). Further, as the dermis containing hair papilla cells, the dermis obtained from the skin by a usual preparation method is generally,
Since it contains hair papilla cells, it can be used as it is as the hair papilla cells of the present invention.
【００１１】他方、「表皮細胞」は、皮膚の表皮または
上皮の大部分を構成する細胞であり、真皮に接する１層
の基底細胞から生じる。マウスを例にすると、かような
表皮細胞としては新生仔（もしくは胎児）に由来する表
皮細胞が好ましく使用できるが、ケラチノサイトの形態
にある細胞の培養物であってもよい。かような細胞は、
それ自体公知の方法により所望のドナー動物の皮膚から
調製することができる。On the other hand, "epidermal cells" are cells that make up most of the epidermis or epithelium of the skin and arise from a layer of basal cells in contact with the dermis. In the case of mice, for example, neonatal (or fetus) -derived epidermal cells are preferably used as such epidermal cells, but may be a culture of cells in the form of keratinocytes. Such cells are
It can be prepared from the skin of the desired donor animal by a method known per se.
【００１２】上記の毛乳頭細胞または毛乳頭細胞を含む
真皮細胞と表皮細胞は、レシピエント動物に移植可能で
あれば、それらのドナー動物の種を問うことなく使用で
きるが、レシピエント動物と同種の動物に由来するもの
が好ましい。限定されるものでないが、レシピエント動
物がマウスである場合、上記両細胞はいずれもマウス由
来であることができ、他方、両細胞が同じマウスの系統
に由来するものでなくてもよい。したがって、毛乳頭細
胞または毛乳頭細胞を含む真皮細胞を、その確認が容易
な上述のいずれかのトランスジェニックマウス（例え
ば、Ｖｅｒ−ＬａｃＺ系統）から取得し、他方、表皮細
胞を、例えば、アルビノ（チロシナーゼの遺伝的欠陥を
有する）の性質をもつＩＣＲ系統およびメラノサイト欠
損系統（例えば、Ｗsh／Ｗshマウス）からなる群より選
ばれるマウスから取得したものを使用してもよい。本発
明に従えば、かようなアルビノもしくはメラノサイト欠
損の性質をもつ動物由来の表皮細胞の使用が、後述する
外来のメラノサイトの挙動をより容易にモニターできる
ので好ましい。また、上記のトランスジェニックマウス
もＩＣＲ系統およびメラノサイト欠損系統からなる群よ
り選ばれるマウス由来であることもできる。The above dermal papilla cells or dermal cells and epidermal cells containing dermal papilla cells can be used regardless of the species of the donor animal as long as they can be transplanted into the recipient animal. Those derived from animals are preferred. Without limitation, when the recipient animal is a mouse, both of the above cells can be mouse-derived, while both cells need not be from the same mouse strain. Therefore, dermal papilla cells or dermal cells containing dermal papilla cells are obtained from any of the above-described transgenic mice whose confirmation is easy (for example, Ver-LacZ strain), while epidermal cells are separated by, for example, albino (albino). Those obtained from a mouse selected from the group consisting of an ICR strain having a tyrosinase genetic defect and a melanocyte-deficient strain (for example, W sh / W sh mouse) may be used. According to the present invention, the use of animal-derived epidermal cells having such albino- or melanocyte-deficient property is preferable because the behavior of the exogenous melanocytes described below can be more easily monitored. Further, the above transgenic mouse can also be derived from a mouse selected from the group consisting of an ICR strain and a melanocyte-deficient strain.
【００１３】本明細書の「外来のメラノサイト」におけ
る「外来」とは、毛乳頭細胞または表皮細胞の起源と起
源が異なることを意味する。したがって、メラノサイト
には、毛乳頭細胞または表皮細胞の起源と異種動物に由
来するもののみならず同種同系統であっても毛乳頭細胞
または表皮細胞を採取した個体と異なる個体に由来する
ものをも包含する。このことは、仮りに、毛乳頭細胞ま
たは表皮細胞調製物に生来のメラノサイトが混在する場
合であっても、かようなメラノサイト以外の追加のメラ
ノサイトが、目的の系に必ず含められることを意味す
る。The term “foreign” in the term “foreign melanocyte” as used herein means that hair papilla cells or epidermal cells have different origins. Therefore, the melanocytes include not only those derived from the origin of dermal papilla cells or epidermal cells and heterologous animals, but also those of the same species and syngeneic origin derived from individuals different from the individuals who collected dermal papilla cells or epidermal cells. Include. This means that even if dermal papilla cells or epidermal cell preparations are contaminated with native melanocytes, additional melanocytes other than such melanocytes are always included in the system of interest. .
【００１４】しかし、限定されるものでないが、毛乳頭
細胞または表皮細胞がマウス由来である場合、メラノサ
イトは、マウス以外の動物、例えばヒト由来であること
が好ましい。このような好ましい組み合わせを用いる
と、再構成毛包において、メラノサイトの分化状態に関
わりなくメラノサイトの分布をトレースすることができ
る（例えば、ヒトメラノサイトに対する抗体もしくはヒ
トに対する特異的抗体またはヒトの特異的遺伝子配列も
しくはヒトメラノサイトの特異的遺伝子配列の使用）。
本発明に従えば、毛乳頭細胞（マウス）、表皮細胞（マ
ウス）およびメラノサイト（ヒト）からなる、所謂、キ
メラ再構成毛包において、メラノサイトがその活性（例
えば、メラニン産生活性）を維持しうることにも特徴が
ある。また、後述する評価方法においてはヒトメラノサ
イトに作用しうる手段を探索できる点も本発明に備わる
特徴である。However, although not limited thereto, when the dermal papilla cells or epidermal cells are derived from a mouse, the melanocytes are preferably derived from an animal other than a mouse, for example, a human. When such a preferred combination is used, it is possible to trace the distribution of melanocytes in the reconstituted hair follicles regardless of the differentiation state of melanocytes (for example, an antibody to human melanocytes or a specific antibody to human or a specific gene for human). Use of sequences or specific gene sequences of human melanocytes).
According to the present invention, in so-called chimeric reconstructed hair follicles consisting of dermal papilla cells (mouse), epidermal cells (mouse) and melanocytes (human), melanocytes maintain their activity (for example, melanin production activity). There is also a feature in singing. Further, in the evaluation method described later, the fact that means capable of acting on human melanocytes can be searched for is a feature of the present invention.
【００１５】本発明で用いることのできるメラノサイト
は、本発明の目的に沿って、メラニン色素の産生能を有
するものであれば、いかなる種の動物に由来するもので
あってもよいが、上記のような特徴を活かすには、上述
のとおり、ヒト由来のメラノサイトが好ましい。メラノ
サイトは、適当な組織、例えば表皮、さらに包皮、等か
らそれ自体公知の方法で調製することができる。また、
市販品を使用することもできる。例えば、ヒト由来の培
養メラノサイトは、ＮＨＥＭ細胞の名称の下にＣａｓｃ
ａｄｅ社またはクラボウ社等から入手できる。The melanocytes that can be used in the present invention may be derived from animals of any species as long as they have the ability to produce a melanin pigment for the purpose of the present invention. In order to utilize such characteristics, human-derived melanocytes are preferable as described above. Melanocytes can be prepared from a suitable tissue such as epidermis, foreskin, etc. by a method known per se. Also,
A commercially available product can also be used. For example, human-derived cultured melanocytes have Casc under the name of NHEM cells.
It is available from Ade, Kurabo, etc.
【００１６】他方、以上の毛乳頭細胞および表皮細胞
は、上述のとおり、それらのレシピエント動物と同種の
動物に由来するものが好ましく、本発明の目的上、かか
る動物の具体的なものとしては、マウス、ラットを挙げ
ることができる。On the other hand, the above-described dermal papilla cells and epidermal cells are preferably derived from an animal of the same species as the recipient animal as described above. For the purpose of the present invention, specific examples of such animals are as follows. , Mice and rats.
【００１７】本発明の「毛包を再構成するための系」
は、上記の毛乳頭細胞および表皮細胞と、外来のメラノ
サイトとの組み合わせからなる。かような「組み合わせ
からなる・・・・・系」とは、上記の各細胞を一体とし
て含む場合だけでなく、将来一体として使用する目的で
各細胞が個別に保存されるように、例えば、個別の容器
に入れられている形態をも包含する意味を有する。した
がって、それらが上記の系を再構成する目的で使用され
る限り、本発明の範囲内にある。また、「毛包を再構成
する」とは、レシピエント動物において、発毛または育
毛を支持しうる器官として役立ちうる再構成毛包（また
はキメラ毛包）をもたらしうることを意味する。このよ
うな器官には、毛乳頭細胞、毛母細胞、毛包上皮系細胞
・組織（例えば、毛根鞘）、脂腺、毛包をとりまく結合
組織等が含まれるであろう。"System for reconstructing hair follicles" of the present invention
Consists of a combination of the above-described dermal papilla cells and epidermal cells, and exogenous melanocytes. Such a "system consisting of a combination" is not limited to the case where the above cells are included as one body, but is also stored so that each cell is individually stored for the purpose of being used as one body in the future. It is also meant to include forms contained in individual containers. Therefore, as long as they are used for the purpose of reconstituting the above system, they are within the scope of the invention. Also, "reconstructing hair follicles" means capable of providing reconstituted hair follicles (or chimeric hair follicles) that can serve as an organ capable of supporting hair growth or hair growth in the recipient animal. Such organs may include dermal papilla cells, hair matrix cells, hair follicle epithelial cells / tissues (eg, hair root sheath), sebaceous glands, connective tissues surrounding hair follicles, and the like.
【００１８】本発明に従う、上記の系は、適当なレシピ
エント動物に移植した場合に、再構成毛包を担持するキ
メラ動物を提供しうる。かかるキメラ動物は、毛包内に
活性な（好ましくは、異種動物由来）メラノサイトを有
するので、メラノサイトの機能またはメラノサイトの活
性に影響を及ぼしうる手段（薬物および環境等を含む）
の評価をする上で有用である。レシピエント動物は、該
動物に移植される系に含まれる各細胞の起源に拘わりな
く、免疫系が抑制された動物であることが好ましい。ま
た動物種としては、実験動物として使用しうるものであ
り、本発明の目的に沿うものである限り、いかなる動物
であってもよいが、好ましくは、マウス、ラット等を挙
げることができる。このような動物のうち、免疫系が抑
制されているものとしては、マウスを例にすれば、ヌー
ドマウスのように、胸腺欠損のごとき形質をもつものが
挙げられる。なお、本発明の目的を考慮すれば、特に好
ましいレシピエント動物としては、市販のヌードマウス
（例えば、Ｂａｌｂ−ｃｎｕ／ｎｕ系統）、スキッドマ
ウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ−ＳＣＩＤ）、ヌードラッ
ト（例えば、Ｆ３４４／Ｎ Ｊｃｌ−ｒｎｕ）を挙げる
ことができる。このようなレシピエント動物を使用し、
そして表皮細胞としてアルビノの性質を持つマウス（例
えば、ＩＣＲ系統）またはメラノサイト欠損マウス（例
えば、Ｗsh／Ｗsh）由来のものを使用して得られる再構
成毛包は、該毛包に含まれるメラノサイトの活性のトレ
ースが容易である点で特に好ましい。The above system according to the present invention can provide a chimeric animal carrying reconstituted hair follicles when transplanted into a suitable recipient animal. Such a chimeric animal has an active (preferably derived from a different animal) melanocyte in the hair follicle, and therefore has a means (including drug and environment) capable of affecting the function of melanocyte or the activity of melanocyte.
It is useful in evaluating. The recipient animal is preferably an animal whose immune system is suppressed, regardless of the origin of each cell contained in the system transplanted to the animal. As the animal species, any animal can be used as long as it can be used as an experimental animal and is in accordance with the object of the present invention, but preferably, mouse, rat and the like can be mentioned. Among such animals, examples of animals in which the immune system is suppressed include, in the case of mice, those having a trait such as athymic defect, such as nude mice. In consideration of the object of the present invention, as particularly preferable recipient animals, commercially available nude mice (for example, Balb-cnu / nu strain), skid mice (for example, Balb / c-SCID), nude rats (for example, , F344 / N Jcl-rnu). Using recipient animals like this,
Reconstructed hair follicles obtained by using, as epidermal cells, derived from an albino mouse (eg, ICR strain) or a melanocyte-deficient mouse (eg, W sh / W sh ) are included in the hair follicles. It is particularly preferable because the activity of melanocytes can be easily traced.
【００１９】本発明に従えば、上記のメラノサイトがヒ
ト由来であっても、上記の特に好ましいレシピエント動
物、表皮細胞を使用することによって、再構成毛包から
メラニン色素を含む毛が誘発および発育する。また、毛
包の周辺領域にもメラニン色素の産生が観察できる。さ
らに、移植後６週目の毛の実体顕微鏡観察によると、そ
の間に毛の色が、例えば灰色から白に変わることはな
く、メラニンを産生するメラノサイトが長期間、再構成
毛包に存在していることが確認されている。さらにま
た、移植に際して、ヒト由来のメラノサイトの混合量が
多いと毛の色が、一般に、濃くみえることから、再生さ
れた毛の色は毛乳頭細胞周囲のヒト由来のメラノサイト
のメラニン産生量に依存するものとみなされる。According to the present invention, even if the melanocytes are of human origin, hair containing a melanin pigment is induced and developed from reconstituted hair follicles by using the above-mentioned particularly preferred recipient animal, epidermal cells. To do. In addition, the production of melanin pigment can be observed in the peripheral area of the hair follicle. Furthermore, according to a stereoscopic microscopic observation of hair 6 weeks after the transplantation, the color of the hair did not change from gray to white during that time, and melanocytes producing melanin were present in the reconstituted hair follicle for a long time. Have been confirmed. Furthermore, at the time of transplantation, when the amount of human-derived melanocytes mixed is large, the hair color generally appears dark, so the regenerated hair color depends on the melanin production amount of human-derived melanocytes around the papilla cells. Is considered to do.
【００２０】かような、本発明に従う、毛包を再構成す
るため系をレシピエント動物に移殖する方法は、それ自
体公知の移殖方法によることができる。例えば、ヌード
マウスの背部に該系を移殖する場合、その背部の直径約
１ｃｍの円に対し、毛乳頭細胞は、約５０万〜１０００
万個、好ましくは約１００万〜約４００万個、マウス表
皮細胞は、約１００万〜４０００個、好ましくは約１０
００万〜約２０００万個使用し、培養ヒトメラノサイト
（ＤＡＲＫ）は、約５０万〜１０００万個、好ましく
は、約１００万個〜５００万個、使用することができ
る。The method for transplanting the system to a recipient animal for reconstructing hair follicles according to the present invention can be carried out by a method known per se. For example, when the system is transplanted to the back of a nude mouse, hair papilla cells are about 500,000 to 1,000 to a circle with a diameter of about 1 cm on the back.
10,000, preferably about 1,000,000 to about 4,000,000, and mouse epidermal cells are about 1,000,000 to 4000, preferably about 10
The amount of the cultured human melanocytes (DARK) may be about 500,000 to about 10 million, preferably about 1 to 5 million.
【００２１】以上のような再構成毛包を担持するキメラ
動物は、再構成毛包から、長期にわたってメラニンを含
む毛を誘発し、そして育成しうるので、毛の成長および
毛の色を濃くするのに関与する細胞もしくは組織、また
は器官、例えば、メラノサイト、毛乳頭、毛母細胞等が
正常に働いているものとみなされる。したがって、本発
明に従うキメラ動物は、
１）メラノサイトを活性化させることにより、毛の色を
濃くする作用のある薬物のスクリーニング、
２）毛乳頭を活性化させることにより、毛の成長を促
し、毛全体の色を濃くする作用のある薬物のスクリーニ
ング、
３）毛母細胞を刺激することにより毛の成長を促し、毛
全体の色を濃くする作用のある薬物のスクリーニング、
４）毛乳頭を刺激することにより毛包内のメラノサイト
を活性化させ、毛の色を濃くする作用のある薬物のスク
リーニング、
５）毛母細胞を刺激することにより毛包内のメラノサイ
トを活性化させ、毛の色を濃くする作用のある薬物のス
クリーニング、
６）上記の作用のうちいずれか、あるいは全体の組み合
わせにより、毛の色を濃くする作用のある薬物およびそ
の組み合わせ作用を有する薬物のスクリーニング、等に
使用できる。なお、本発明に従うメラノサイトの活性化
薬物または化学物質の範囲には、メラノサイトの成長、
分化、増殖、生存、運動能力のうちのいずれかまたは、
いずれかの活性のうちいくつか、あるいはすべてを刺激
し活性化することにより、毛の色を濃くする作用を持つ
薬物であり、毛の色によりその活性が示されるものが包
含される。Since the chimeric animal carrying the reconstructed hair follicles as described above can induce and grow hair containing melanin from the reconstructed hair follicles for a long period of time, the hair growth and hair color are deepened. It is considered that the cells or tissues or organs involved in the, for example, melanocytes, dermal papilla, hair matrix cells, etc. are functioning normally. Therefore, the chimeric animal according to the present invention comprises: 1) screening for a drug having an effect of darkening hair color by activating melanocytes, and 2) activating hair papilla, promoting hair growth, and Screening for drugs that have the effect of darkening the overall color, 3) Screening for drugs that have the effect of promoting hair growth by stimulating hair mother cells, and darkening the color of the entire hair, 4) Stimulating the papilla of the hair By activating melanocytes in hair follicles, thereby screening for drugs that have the effect of darkening hair color, 5) stimulating hair mother cells to activate melanocytes in hair follicles, and darkening hair color 6) Drugs that have the action of acting, and 6) Drugs that have the action of increasing the color of hair by any one of the above actions or a combination thereof, and a group thereof Screening of drugs having an effect combined, it can be used to equal. It should be noted that the range of melanocyte-activating drugs or chemical substances according to the present invention includes melanocyte growth,
One of differentiation, proliferation, survival, motor capacity, or
Drugs that have the effect of darkening the color of hair by stimulating and activating some or all of either activity, and those whose activity is shown by the color of hair are included.
【００２２】このような使用態様に係る発明の一態様と
しては、（Ａ）上述のキメラ動物を被験動物として用意
する段階、（Ｂ）該被験動物をある一定の手段で処置
し、こうして処置された被験動物の再構成毛包における
メラノサイトの活性をモニターする段階、（Ｃ）未処置
対象（例えば、段階（Ｂ）の処置を行っていない被験動
物の再構成毛包におけるメラノサイトの活性）に対する
段階（Ｂ）の活性の変化の程度を該手段によるメラノサ
イトの活性化能と関連付ける段階、を含んでなるメラノ
サイトの活性化能の評価方法が挙げられる。As one aspect of the invention relating to such a mode of use, (A) preparing the above-mentioned chimeric animal as a test animal, (B) treating the test animal with a certain means, and thus treating Monitoring the activity of melanocytes in the reconstituted hair follicles of the test animal, (C) the step for an untreated subject (for example, the activity of melanocytes in the reconstituted hair follicles of the test animal not treated in step (B)) And a step of associating the degree of change in the activity of (B) with the melanocyte activation ability by the means, and a method for evaluating the melanocyte activation ability.
【００２３】かような評価方法でメラノサイトの活性化
能を、再構成毛包からの発毛のメラニン色素の多寡によ
って評価できる。また、発毛および毛の成長の程度によ
り、毛乳頭、毛母細胞のいずれか一方または両方に、段
階（Ｂ）の手段がいかに影響を及ぼしうるか、を評価で
きるであろう。かような手段としては、被験動物が置か
れる環境、例えば、ストレス環境、それに対立するリラ
クセーションが図れる環境等、ならびに、被験動物の再
構成毛包に塗布されるか皮下注入される薬物もしくはあ
らかじめメラノサイトを処理しておく薬物、あるいは経
口投与される薬物を挙げることができる。また、薬物は
再構成毛包を担持するキメラ動物を作出する際に、上記
の毛包を再構成するための系に添加してもよい。The activation ability of melanocytes can be evaluated by such an evaluation method based on the amount of melanin pigment in hair growth from reconstructed hair follicles. Also, depending on the extent of hair growth and hair growth, it will be possible to evaluate how the means of step (B) can affect either or both of the dermal papilla and / or hair matrix. Examples of such means include an environment in which the test animal is placed, for example, a stress environment, an environment in which a relaxation opposite to that can be achieved, and a drug or a melanocyte previously applied to the reconstructed hair follicle of the test animal or subcutaneously injected. Examples thereof include drugs that have been treated or drugs that are orally administered. Further, the drug may be added to the above-mentioned system for reconstituting the hair follicles when producing a chimeric animal carrying the reconstituted hair follicles.
【００２４】また、上記メラノサイトの活性のモニター
は、ヒト由来メラノサイトを使用して再構成毛包を確立
した場合には、メラニン生合成経路のいずれかの酵素そ
れら自体、またはそれらの酵素をコードするＤＮＡ、ｍ
ＲＮＡ等について、それ自体公知のアッセイを使用して
検出してもよい。別法として、キメラ動物の毛を抜去も
しくは剪毛した後、新たに生えてくるかまたは成長して
くる毛、あるいは毛の周期を繰り返して新たに生じた毛
におけるメラニン含量を測定してもよい。[0024] Further, the above-mentioned melanocyte activity monitors, when human-derived melanocytes are used to establish reconstituted hair follicles, encodes any one of the enzymes in the melanin biosynthetic pathway itself, or those enzymes. DNA, m
RNA and the like may be detected using an assay known per se. Alternatively, the hair of the chimeric animal may be removed or shaved, and then the melanin content in newly-grown or growing hair, or in the newly-formed hair by repeating the hair cycle may be measured.
【００２５】[0025]
【実施例】以下、具体例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の理解を容易にする目的で
提供するものであり、本発明の範囲を限定するものでな
い。The present invention will be described in more detail with reference to specific examples, but these are provided for the purpose of facilitating the understanding of the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
【００２６】Ｉ．各種細胞の調製例
例１：マウス由来毛乳頭細胞
（１−１） バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）プロモー
ター下流に適当なマーカータンパク（例；ＬａｃＺ）の
構造遺伝子をつないだ発現ベクターを導入したトランス
ジェニックマウスから生まれた新生仔（生後４日以内に
使用）のうち、ＬａｃＺ陽性の個体を選別する。
（１−２） 各個体をエタノールと適当な洗浄液（例；
リン酸緩衝生理食塩水。ＰＢＳと呼称）で洗浄後、背部
皮膚を剥離し、０.２５％トリプシン／ＰＢＳ中で４℃
下で一晩静置する。
（１−３） 翌日、ピンセットなどにより表皮と真皮を
分離し、真皮側を０.３５％コラゲナーゼ／ＤＭＥＭ
（ダルベッコ変法イーグル最少培地。以下ＤＭＥＭと呼
称。）などにより３７℃下で約１時間ほど処理する。
（１−４） （１−３）を念入りに懸濁操作を行なった
のち、７０μメーターのポアサイズを持つセルストレー
ナーに通し、次いで遠心分離器によって細胞を集める。
（１−５） 集めた細胞を適当なセルソーターを用い
て、ＬａｃＺ遺伝子の発現した細胞のみ回収し、適当な
培養液（例；ＤＭＥＭに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ
と呼称））で培養するか、使用前日まで通常の細胞凍結
溶液で凍結保存する。
（１−６） 使用前日までに細胞を適当な培養条件
（例；ＤＭＥＭ＋１０％中で５％ＣＯ2存在下、３７℃
など）におき、翌日手術直前にトリプシンなどにより調
製する。I. Examples of Preparation of Various Cells Example 1: Mouse-derived dermal papilla cells (1-1) Born from a transgenic mouse into which an expression vector in which a structural gene for an appropriate marker protein (eg, LacZ) is connected to the downstream of the Versican promoter is introduced. Among the newborns (used within 4 days after birth), LacZ-positive individuals are selected. (1-2) Ethanol and a suitable washing solution (eg, each;
Phosphate buffered saline. After washing with PBS), the back skin is peeled off, and the temperature is 4 ° C in 0.25% trypsin / PBS.
Let stand underneath overnight. (1-3) The next day, the epidermis and the dermis are separated by tweezers, etc., and the dermis side is 0.35% collagenase / DMEM.
(Dulbecco's modified Eagle's minimal medium; hereinafter referred to as DMEM) and the like at 37 ° C. for about 1 hour. (1-4) After carefully performing the suspension operation in (1-3), the cells are passed through a cell strainer having a pore size of 70 μm, and then the cells are collected by a centrifuge. (1-5) Collected cells were collected using an appropriate cell sorter, and only cells expressing the LacZ gene were collected. An appropriate culture solution (eg, DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) was collected.
Or)) or freeze-store in a normal cell freezing solution until the day before use. (1-6) By the day before use, the cells are cultured under appropriate culture conditions (eg, in DMEM + 10% in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C.).
Etc.) and prepare with trypsin etc. immediately before surgery the next day.
【００２７】例２：マウス由来表皮細胞
（２−１） 手術前日、アルビノの性質を持つマウス
（例；ＩＣＲ系統）の新生仔より（１−１）、（１−
２）と同様の方法により皮膚をトリプシン処理する。
（２−２） ピンセットなどにより表皮部分のみ剥離
し、細切後、適当な培養液（例；ケラチノサイト用培養
液、以下ＫＧＭと呼称。）中で４℃で約１時間懸濁処理
する。
（２−３） ７０μメーターのポアサイズを持つセルス
トレーナーを通した（２−２）を遠心分離器にかけて表
皮細胞を回収する。
（２−４） レシピエント動物１個体あたり、２匹の新
生仔由来に相当する量の表皮細胞を手術に用いる。相当
量の細胞をＫＧＭで懸濁して、使用直前まで氷上に静置
する。また、回収した細胞は凍結保存した後、使用前に
解凍して用いることもできる
例３：マウス由来真皮細胞
（３−１） 手術前日、アルビノの性質を持つマウス
（例；ＩＣＲ系統）の新生仔より（１−１）、（１−
２）と同様の方法により皮膚をトリプシン処理する。
（３−２） ピンセットなどにより表皮部分を剥離し、
残った真皮を細切後、０.３５％のコラゲナーゼを含ん
だ適当な培養液（例；ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳなど）中
で３７℃で約１時間懸濁処理する。
（３−３） １００μメーターのポアサイズを持つセル
ストレーナーを通した（２−２）を遠心分離器にかけて
真皮細胞を回収する。Example 2: Mouse-derived epidermal cells (2-1) From the neonatal day of the mouse (eg, ICR strain) having the property of albino on the day before the operation (1-1), (1-
Trypsinize the skin in the same manner as in 2). (2-2) Only the epidermis is peeled off with tweezers or the like, finely cut, and then suspended in an appropriate culture medium (eg, culture medium for keratinocytes, hereinafter referred to as KGM) at 4 ° C. for about 1 hour. (2-3) After passing through a cell strainer having a pore size of 70 μm, (2-2) is centrifuged to collect epidermal cells. (2-4) An amount of epidermal cells corresponding to two newborns per recipient animal is used for surgery. A considerable amount of cells are suspended in KGM and kept on ice until just before use. The collected cells can be frozen and stored and then thawed before use. Example 3: Mouse-derived dermal cells (3-1) On the day before surgery, newborn mice with albino properties (eg, ICR strain) From offspring (1-1), (1-
Trypsinize the skin in the same manner as in 2). (3-2) Peel off the skin using tweezers,
The remaining dermis is cut into small pieces, and then suspended in an appropriate culture medium containing 0.35% collagenase (eg, DMEM + 10% FBS) at 37 ° C. for about 1 hour. (3-3) The (2-2) that has passed through a cell strainer having a pore size of 100 μm is centrifuged to collect dermal cells.
【００２８】レシピエント動物１個体あたり、２匹の新
生仔由来に相当する量の真皮細胞を手術に用いる。これ
と単離毛乳頭細胞を同時に用いることはない。相当量の
細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳなどで懸濁して、使用直
前まで氷上に静置するか、または凍結保存する。An amount of dermal cells corresponding to two newborns per recipient animal is used for surgery. This and isolated dermal papilla cells are not used at the same time. A considerable amount of cells are suspended in DMEM + 10% FBS or the like and either left on ice until just before use or stored frozen.
【００２９】例４：ヒト由来培養メラノサイト
（４−１） 市販の包皮由来メラノサイトを（例；Ｃａ
ｓｃａｄｅ社の販売している、ＮＨＥＭ細胞など。）メ
ラノサイト用培養液（例Ｃａｓｃａｄｅ社のＭ１５４ｓ
培地など）で培養する。手術当日までにレシピエント動
物１個体あたり５０万から１０００万個に相当する量ま
で増殖させる。
（４−２） 使用直前に、０.０５％トリプシン処理に
より培養器からはがし、培養液中に懸濁して、使用直前
まで氷上に放置する。Example 4: Human-derived cultured melanocytes (4-1) Commercially available foreskin-derived melanocytes (example: Ca
NHEM cells etc. sold by Scade. ) Melanocyte culture medium (eg Cascade M154s)
Culture). By the day of surgery, the recipient animals are grown to an amount equivalent to 500,000 to 10 million per animal. (4-2) Just before use, it is peeled from the incubator by treatment with 0.05% trypsin, suspended in the culture solution, and left on ice until just before use.
【００３０】例５：マウス由来メラノサイト
（５−１） 手術一週間以上前に新生仔マウス（実施例
においては、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６系統を使用）より
（１−１）、（１−２）に準ずる方法により皮膚を単離
し、トリプシン処理する。
（５−２） 表皮を剥離後、０.０２％ＥＤＴＡを含ん
だＰＢＳ中に剥離表皮を浮かべる。
（５−３） 穏やかに混合した後、３７℃中で約８分間
振とうする。
（５−４） ７０μメーターのセルストレーナーに通し
た後、細胞を遠心分離器により回収し、メラノサイト用
の培養液中で培養する。培養条件は、細胞の状態によ
る。
（５−５） 使用直前に、０.０５％トリプシン処理に
より培養器からはがし、培養液中に懸濁して、使用直前
まで氷上に放置するか、または凍結保存する。Example 5: Mouse-derived melanocytes (5-1) According to (1-1) and (1-2) from a neonatal mouse (in the example, C57Black / 6 strain was used) one week or more before the operation. The skin is isolated by the method and trypsinized. (5-2) After peeling the epidermis, float the peeled epidermis in PBS containing 0.02% EDTA. (5-3) After gently mixing, shake at 37 ° C. for about 8 minutes. (5-4) After passing through a 70 μm cell strainer, cells are collected by a centrifuge and cultured in a culture solution for melanocytes. The culture conditions depend on the state of the cells. (5-5) Just before use, peel off from the incubator by treatment with 0.05% trypsin, suspend in culture medium, and leave on ice or store frozen until just before use.
【００３１】ＩＩ．毛包再構成方法（動物への移植方
法）
例ＩＩ−１：マウス由来毛乳頭細胞を用いる場合
用意するもの；下記ＩＩ−（１−１）、（１−２）、
（１−３）を適当量混合し、「再構成毛包作成手順」の
「細胞懸濁液」として用いる。
ＩＩ−（１−１） Ｖｅｒｓｉｃａｎプロモーター下流
に適当なマーカータンパク（例；ＬａｃＺ）の構造遺伝
子をつないだ発現ベクターを導入したトランスジェニッ
クマウスの新生仔真皮から調製した毛乳頭細胞（Ｄｅｒ
ｍａｌ Ｐａｐｉｌａ；以下ＤＰと呼称）。再構成手術
を行なう前日以前に調製し、手術当日にトリプシン処理
により回収する。
ＩＩ−（１−２） マウス由来表皮細胞。手術前日、ア
ルビノの性質を持つマウス（例；ＩＣＲ系統）の新生仔
より、皮膚を採取し、手術当日トリプシン処理により調
製。こうして調製された細胞は凍結保存後に使用するこ
ともできる。
ＩＩ−（１−３） 培養メラノサイト。（ＡまたはＢを
用いる）
Ａ．ヒト由来メラノサイト。市販の包皮由来メラノサイ
トを継代培養したもの（例；Ｃａｓｃａｄｅ社の販売し
ている、ＮＨＥＭ細胞など。）。手術当日トリプシン処
理により調製。こうして調製された細胞は凍結保存後に
使用することもできる。II. Method for reconstructing hair follicle (method for transplantation into animal) Example II-1: Preparation when using mouse-derived hair papilla cells; II- (1-1), (1-2) below:
An appropriate amount of (1-3) is mixed and used as the "cell suspension" in the "procedure for producing reconstituted hair follicles". II- (1-1) Versican dermal papilla cells prepared from neonatal dermis of transgenic mice into which an expression vector in which a structural gene for an appropriate marker protein (eg; LacZ) is ligated downstream thereof (Der
mal Papila; hereinafter referred to as DP). It is prepared before the day before reconstructive surgery, and collected by trypsinization on the day of surgery. II- (1-2) Mouse-derived epidermal cells. On the day before surgery, skin was collected from a newborn mouse (eg, ICR strain) having albino properties, and prepared by trypsin treatment on the day of surgery. The cells thus prepared can be used after cryopreservation. II- (1-3) Cultured melanocytes. (Use A or B) A. Human-derived melanocytes. A subculture of a commercially available melanocyte derived from foreskin (eg, NHEM cells sold by Cascade). Prepared by trypsinization on the day of surgery. The cells thus prepared can be used after cryopreservation.
【００３２】Ｂ．マウス由来メラノサイト。新生仔マウ
ス（実施例においては、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６系統を使
用。）より手術一週間以上前に単離し、培養系に移して
継代培養したもの。手術当日トリプシン処理により調
製。こうして調製された細胞は凍結保存後に使用するこ
ともできる。B. Mouse derived melanocytes. A mouse isolated from a neonatal mouse (C57Black / 6 strain used in Examples) one week or more before surgery, transferred to a culture system, and subcultured. Prepared by trypsinization on the day of surgery. The cells thus prepared can be used after cryopreservation.
【００３３】例ＩＩ−２：マウス真皮を用いる場合
前記ＩＩ−（１−１）に変わり、手術前日アルビノの性
質を持つマウス（例；ＩＣＲ系統）の新生仔より、皮膚
を採取し、手術当日コラゲナーゼ処理により調製したも
のを用いて「細胞懸濁液」を作成する。こうして調製さ
れた細胞懸濁液は凍結保存後に使用することもできる。Example II-2: Using mouse dermis Skin was collected from a neonate of a mouse (eg, ICR strain) having the property of albino instead of II- (1-1) on the day before the surgery, and the day of surgery. A "cell suspension" is prepared using the one prepared by the collagenase treatment. The cell suspension thus prepared can also be used after cryopreservation.
【００３４】＜再構成毛包作成手順＞
用意するもの：レシピエント動物（例；Ｂａｌｂ−ｃ
ｎｕ／ｕｎ系統ヌードマウス。５週齢以上）、シリコン
製の直径１センチ程度のドーム状キャップ（以下バルブ
と呼称）、麻酔薬、手術用ハサミ、ピンセット、縫合器
マイクロピペッター
「細胞懸濁液」：メラノサイト、表皮細胞、真皮細胞あ
るいは毛乳頭細胞からなる。各細胞の調製方法は上述参
照。細胞を培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳなど）約１
５０μｌ程度に懸濁し氷上に静置したものまたは凍結保
存したものから手術直前に調製する。<Procedure for Reconstructed Hair Follicle> Items to be prepared: Recipient animal (eg, Balb-c)
Nu / un strain nude mice. 5 weeks or older), dome-shaped cap made of silicon with a diameter of about 1 cm (hereinafter referred to as valve), anesthetic, surgical scissors, tweezers, suture instrument micropipettor "cell suspension": melanocytes, epidermal cells, dermis It consists of cells or dermal papilla cells. See above for how to prepare each cell. Cell culture medium (DMEM + 10% FBS, etc.) About 1
It is prepared immediately before the operation from a suspension of about 50 μl and a suspension on ice or a frozen storage.
【００３５】＜手順＞
（ｉ） ヌードマウスを麻酔。
（ｉｉ） 背部皮膚を直径１センチ弱に切り取る。
（ｉｉｉ）傷口にバルブを挿入し、縫合器で固定する。
（ｉｖ） バルブ内に、細胞懸濁液をピペッターを用い
て注入する。
（ｖ） そのまま約１週間飼育し、バルブをはずす。
（ｖｉ） １〜２週間後、かさぶたが取れた跡に、再構
成毛包の生育を観察することができ、メラノサイトを懸
濁液に入れた場合には、本来アルビノの純白の毛色であ
るはずが灰色に変色することを観察できる。
（ｖｉｉ）この毛色がメラニン色素由来であることは、
組織学的観察により明確にされる。<Procedure> (i) Anesthetizing a nude mouse. (Ii) Cut back skin to a diameter of less than 1 cm. (Iii) Insert the valve into the wound and fix with a suture instrument. (Iv) Inject the cell suspension into the valve using a pipettor. (V) Keep the animal for about 1 week and remove the valve. (Vi) After 1 to 2 weeks, the growth of the reconstructed hair follicle can be observed in the trace of the scab, and when the melanocyte was put in the suspension, it should have a pure white color of albino. Can be observed to turn gray. (Vii) This hair color is derived from melanin pigment,
Clarified by histological observation.
【００３６】結果
以上、上記の各細胞および上記の手順に準じて作出した
再構成毛包担持動物の具体的な条件（毛包を再構成する
ための系；＋印が含まれる細胞である。）および毛の色
および移植皮膚色について下記表−１にまとめて記載す
る。また、実験番号２、５、６、７、８および１０で作
出された動物の背部の状態を表す図面に代わる写真を図
１として添付する。 Results As described above, specific conditions of the above-mentioned cells and the reconstructed hair follicle-carrying animal produced according to the above-mentioned procedure (system for reconstructing hair follicles; cells containing + symbol). ) And hair color and transplanted skin color are summarized in Table 1 below. In addition, a photograph replacing a drawing showing the condition of the back of the animals produced in Experiment Nos. 2, 5, 6, 7, 8 and 10 is attached as FIG. 1.
【００３７】[0037]
【表１】 [Table 1]
【００３８】例ＩＩＩ 抗白髪性薬物の評価
例ＩＩ−２の＜手順＞に従い実験番号７の毛包を再構成
するための系をヌードマウスへ移植し、約３〜４週後に
再構成された毛を抜去した。抜去後、それぞれ、幹細胞
因子（以下、ＳＣＦと略記する）、α−メラニン細胞刺
激ホルモン（以下、ＭＳＨと略記する）、およびｐ−ア
ミノ安息香酸（以下、ＰＡＢＡと略記する）を含有する
溶液（それぞれ、動物の体重１ｇ当たり、ＳＣＦの３０
ｎｇ、ＭＳＨの１ｐｍｏｌおよびＰＡＢＡの５０ｎ
ｇ）、またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：比較）を動物の
皮下に毎日注射し、これを１週間繰り返した。Example III Evaluation of anti-hair graying drug According to <Procedure> of Example II-2, a system for reconstructing hair follicles of Experiment No. 7 was transplanted to nude mice, and reconstructed after about 3 to 4 weeks. I removed my hair. After extraction, a solution containing stem cell factor (hereinafter abbreviated as SCF), α-melanocyte stimulating hormone (hereinafter abbreviated as MSH), and p-aminobenzoic acid (hereinafter abbreviated as PABA) ( 30 SCF / g animal weight
ng, 1 pmol of MSH and 50 n of PABA
g), or a phosphate buffer solution (PBS: comparison) was subcutaneously injected daily into the animals, and this was repeated for 1 week.
【００３９】その後、再び再生される毛が十分成長した
後（約３週間後）、再生毛を剪みにより刈り取り集め
た。毛を溶解後、吸光度によりメラニン含量を定量し
た。結果を図２に示す。図より、各種因子の添加により
再生毛中のメラニン含量が有意に増加することがわか
る。したがって、本発明のキメラ動物は、少なくとも抗
白髪性薬物のスクリーニングに使用できる。After that, after the hair to be regenerated again grew sufficiently (after about 3 weeks), the regenerated hair was cut and collected by shearing. After the hair was dissolved, the melanin content was quantified by absorbance. The results are shown in Figure 2. The figure shows that the addition of various factors significantly increases the melanin content in the regenerated hair. Therefore, the chimeric animal of the present invention can be used for screening at least anti-hair graying drugs.
【図１】例ＩＩ−２で作出されたキメラマウスの背部の
状態を表す図面に代わる写真である。図中の数字は、そ
れぞれ実験番号を表す。FIG. 1 is a photograph instead of a drawing, which shows the state of the back of the chimeric mouse produced in Example II-2. Each number in the figure represents an experiment number.
【図２】例ＩＩＩにより数種の因子の作用下における本
発明に従うキメラマウスの再生毛中のメラニン含量の変
化を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the change in the melanin content in the regenerated hair of the chimeric mouse according to the present invention under the action of several factors according to Example III.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 GA18 GA30 HA20 4B063 QA01 QA05 QA20 QQ02 QQ08 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR72 QR77 QS14 QX01 4B065 AA91X AA93X AB10 AC20 BA30 BB01 BC50 CA43 CA44 CA50 CA60 4C084 AA17 NA14 ZA922 ZB212─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C12Q 1/02 C12N 5/00 B // C12N 15/09 15/00 AF term (reference) 4B024 AA01 AA20 GA18 GA30 HA20 4B063 QA01 QA05 QA20 QQ02 QQ08 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR72 QR77 QS14 QX01 4B065 AA91X AA93X AB10 AC20 BA30 BB01 BC50 CA43 CA44 CA50 CA60 4C084 AA17 NA14 ZA922 ZB212
Claims (13)
細胞および表皮細胞と、これらの細胞に対して外来のメ
ラノサイトとの組み合わせからなる毛包を再構成するた
めの系。1. A system for reconstituting a hair follicle comprising a combination of dermal papilla cells or dermal cells and epidermal cells containing dermal papilla cells, and melanocytes foreign to these cells.
毛乳頭細胞を含む真皮細胞および表皮細胞とは異種の起
源に由来する請求項１記載の系。2. The system according to claim 1, wherein the exogenous melanocytes are derived from a source different from that of dermal papilla cells or dermal cells containing dermal papilla cells and epidermal cells.
そして毛乳頭細胞または毛乳頭細胞を含む真皮細胞およ
び表皮細胞が同一種の同一または異なる動物系統に由来
し、かつ、該動物がマウス、ラットからなる群より選ば
れる請求項１または２記載の系。3. The foreign melanocyte is of human origin,
The system according to claim 1 or 2, wherein the dermal papilla cells or the dermal cells and epidermal cells containing the dermal papilla cells are derived from the same or different animal strains of the same species, and the animal is selected from the group consisting of mice and rats. .
毛乳頭細胞を含む真皮細胞がＩＣＲ系統のアルビノマウ
スおよびメラノサイト欠損系統のマウスからなる群より
選ばれるマウス由来であり、そして表皮細胞がＩＣＲ系
統のアルビノマウスおよびメラノサイト欠損系統のマウ
スからなる群より選ばれるマウス由来である請求項１〜
３のいずれかに記載の系。4. The foreign melanocyte is of human origin,
Dermal cells including dermal papilla cells are derived from a mouse selected from the group consisting of ICR strain albino mice and melanocyte-deficient mice, and epidermal cells selected from the group consisting of ICR strain albino mice and melanocyte-deficient mice The mouse is derived from
The system according to any one of 3 above.
れかに記載の系が移植され、こうして再構成毛包を担持
することになったキメラ動物。5. A chimeric animal in which a system according to any one of claims 1 to 4 is transplanted to a recipient animal, and thus carries a reconstituted hair follicle.
動物であり、外来のメラノサイトがヒト由来である請求
項５記載のキメラ動物。6. The chimeric animal according to claim 5, wherein the recipient animal is an animal whose immune system is suppressed, and the exogenous melanocytes are of human origin.
ッドマウス、ヌードラットからなる群より選ばれる免疫
系が抑制された動物である請求項４または５記載のキメ
ラ動物。7. The chimeric animal according to claim 4 or 5, wherein the recipient animal is an animal with suppressed immune system selected from the group consisting of nude mice, skid mice and nude rats.
毛乳頭細胞を含む真皮細胞がＩＣＲ系統のアルビノマウ
スおよびメラノサイト欠損系統のマウスからなる群より
選ばれるマウス由来であり、そして表皮細胞がＩＣＲ系
統のアルビノマウスおよびメラノサイト欠損系統のマウ
スからなる群より選ばれるマウス由来である請求項７記
載のキメラ動物。8. The foreign melanocyte is of human origin,
Dermal cells including dermal papilla cells are derived from a mouse selected from the group consisting of ICR strain albino mice and melanocyte-deficient mice, and epidermal cells selected from the group consisting of ICR strain albino mice and melanocyte-deficient mice The chimeric animal according to claim 7, which is derived from a mouse.
動物を被験動物として用意し、該被験動物をある一定の
手段で処置し、こうして処置された被験動物の再構成毛
包におけるメラノサイトの活性をモニターし、未処置対
象に対する該活性の変化の程度（または差異）を該手段
によるメラノサイトの活性化能と関連付けることを特徴
とする、ある一定の手段のメラノサイトの活性化能の評
価方法。9. A chimeric animal according to any one of claims 5 to 8 is prepared as a test animal, the test animal is treated by a certain means, and the melanocytes in reconstructed hair follicles of the test animal thus treated are treated. Activity of melanocytes by monitoring the activity of melanocytes and correlating the degree (or difference) of the change in the activity with respect to an untreated subject with the activity of activating melanocytes by the means. .
ノサイトの活性の変化の程度が再構成毛包からの毛髪ま
たは該毛包近傍の表皮におけるメラニン色素量の多寡に
より決定される請求項９記載の評価方法。10. The evaluation according to claim 9, wherein the melanocytes are of human origin and the degree of change in the activity of the melanocytes is determined by the amount of melanin pigment in the hair from the reconstructed hair follicle or in the epidermis in the vicinity of the hair follicle. Method.
ある請求項１０記載の評価方法。11. The evaluation method according to claim 10, wherein the activation ability of melanocytes is anti-gray hair property.
求項９〜１１のいずれかに記載の評価方法。12. The evaluation method according to claim 9, wherein the means is a chemical substance or a drug.
サイトの活性化能を向上しうると評価された薬物を有効
成分とする抗白髪剤。13. An anti-hair graying agent comprising as an active ingredient a drug evaluated by the evaluation method according to claim 12 as capable of improving the melanocyte activation ability.
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